CN102507786A

CN102507786A - 一种中药成分结构鉴定的方法

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Publication number: CN102507786A
Application number: CN2011103577676A
Authority: CN
Inventors: 吴志军; 陈建中; 李娜; 方冬梅; 张国林
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2012-06-20

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及复杂中药体系中未知的、特别是微量的未知成分准确、快速的结构鉴定。本发明方法包括以下步骤：中药提取；主要成分分离鉴定；主要成分的二级质谱图分析；仪器同位素性能的评估；液质连用分析；低浓度化合物二级质谱的获得；未知化合物的结构鉴定。本发明具有高效、准确、操作简单等特点。

Description

一种中药成分结构鉴定的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及复杂中药体系中未知的、特别是微量的未知成分准确、快速的结构鉴定，特别是涉及传统中药鸡屎藤的未知成分结构鉴定。

背景技术

中医学是中国传统文化宝库中一颗璀璨的明珠，具有数千年的历史，对于中华民族的繁衍发挥了重要的作用。即使在现代医学飞速发展的今天，中医药仍然发挥了不可替代的作用，中药是中医学的重要的组成部分，中药成分的快速分析是现代中药研究的前提。

指纹图谱技术是中药分析的重要手段，但传统的色谱技术由于灵敏度、分辨率以及检测方式等方面的缺陷，难以达到理想的分析效果。核磁和质谱逐渐成为了中药复杂成分分析最主要的两个分析手段，尽管核磁已经大大提高了分辨率和灵敏度，但对于混合物的分析受到了很大的局限，而质谱则由于其快速、灵敏以及广泛的适用范围等特点成为了中药成分分析的标准技术之一。

气质联用(GC/EI-MS)可以为挥发性的中药成分提供高选择性、高色谱分离效果以及准确的定量分析。此外，在NIST 08标准库中提供了192108张标准的EI化合物图谱，一般而言通过气质联用，在一个植物提取物的分析中，大约一半检测到的峰是可以确认结构的。和气质联用不同的是，大气压电离质谱(API-MS)并没有标准的谱库，主要原因是碰撞诱导裂解(CID)图谱的重现性相对较低，对于相同的化合物，不同的仪器获得的图谱可能存在较大的差异。因此，这对研究复杂的中药成分提出了新的挑战。

随着质谱技术的进一步发展，高分辨质谱特别是超高分辨质谱显示出了很高的分辨率以及质量准确度，这可以帮助我们确定化合物的元素组成，进一步结合多级质谱的数据，来确定化合物的结构。典型的用于分析复杂成分中的化合物结构的步骤如下：1.通过高分辨或超高分辨质谱来获得希望确定的化合物的单同位素的精确质量，这为唯一确定化合物的分子式提供了可能，仪器的精度越高，则唯一确定待测化合物分子式的可能性越大。2.获得化合物的碰撞裂解图谱，化合物的二级图谱特别是一些特征的碎片离子代表了化合物的结构。此外，再进行一些互补实验例如多级质谱、H/D交换等，这些信息结合色谱的保留时间可以帮助缩小可能结构的范围。3.合成或购买可能的标准化合物，和被测的化合物进行保留时间以及二级质谱的对比，从而确定化合物的结构。

从上面的步骤可以发现，获得化合物唯一的分子式是整个分析的关键，而仪器的质量准确度决定了仪器确定唯一分子式的能力。傅立叶离子回旋共振质谱(FT-ICR)拥有超高的分辨率(1000000)，其质量精度可控制在1ppm以内，轨道阱质谱仪(Orbitrap)的分辨率可达100000，质量准确度可达2ppm以内，并且质量准确度的维持时间较长。然而，只依赖精确质量难以完成对化合物的分子式的唯一确定，特别是对于分子量大于500Da的化合物。因此需要寻找其它的途径来完成对分子式的确定，相对同位素分布则是确定分子式的另一个重要指标。有报道显示，结合同位素性能和精确质量可以排除95％以上的候选分子。构成天然产物中主要的元素是C、H、O、N、S、P、Cl，结合M+1/M以及M+2/M离子强度比的值用于确定Cl、S和P的组成有着重要的意义。Xu等以及Erve等研究了轨道阱质谱的同位素性能，发现I_M+1/M的误差一般小于20％，而I_M+2/M的误差相对较大，这对于确定化合物是否含有硫等杂原子非常不利。

和FT-ICR以及Orbitrap质谱仪相比，传统的四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱的分辨率相对较低，一般在10000左右，仪器的质量准确度一般可控制在10ppm以内。由于飞行管受温度的影响比较大，精确质量的稳定时间与FT-ICR以及Orbitrap质谱仪相比明显逊色很多。这对利用液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱来分析中药中的复杂成分特别是未知成分提出了很大的挑战。尽管如此，电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪因其较高的性价比(价格便宜、速度快、高分辨)而广泛应用到了中药研究领域。因此，与前面的质谱相比，尽可能的发挥这类质谱仪的优势，避免其缺点显然更加迫切。

Bocker等发现飞行时间质谱同位素的性能比FT-ICR更优。Grange等报道了使用单飞行时间质谱分析时，利用同位素来对化合物分子式进行确认，然而，仪器同位素误差的可靠性并不知道。因此，本发明对四极杆-飞行时间质谱仪相对同位素分布的评估，建立一种更全面、可靠的方法用于复杂中药成分分析，对于确定这些成分中化合物的结构特别是未知物的结构有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可靠、快速的方法用于复杂中药体系中未知的、特别是微量未知成分的结构鉴定。本方法通过对电喷雾-四级杆-飞行时间质谱同位素性能的评估，使同位素成为确定分子式的另一个量化指标，通过独立控制色谱和质谱来获得低信噪比离子的二级质谱，并系统建立已知化合物的二级质谱裂解规律，从而完成对微量未知物的结构鉴定。具体通过如下步骤完成：

1.主要活性成分的提取

对中药中的活性成分进行针对性的提取，既要尽可能获得多的活性成分，又要尽量去掉其它成分例如色素、糖等的干扰。浸提包括使用不同的溶剂，例如水、甲醇、乙氰、丙酮、氯仿。分离包括液液萃取、固相萃取、过滤等。液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、正己烷、水，固相萃取包括各种型号的固相萃取小柱，过滤包括各种型号的滤膜、滤纸。

2.高含量已知化合物的分离鉴定

对高含量已知化合物，通过普通柱层析以及制备色谱分离制备，普通柱层析包括硅胶柱(100-400目)，石油醚、丙酮、氯仿洗脱体系。对制备色谱，通过摸索条件来完成对高含量已知化合物的纯化分离，其中柱长100-300mm，内径5-50mm，填料粒度5-20μm；柱温15-60℃；进样量5-100μl；流速1-20ml/min；流动相由水、甲醇或乙氰组成，进行梯度或等度洗脱。分离得到的化合物通过质谱、核磁、红外、紫外来确定结构。

3.建立已知化合物的二级质谱的裂解规律

系统建立已知化合物的质谱裂解规律，包括质子化母离子质谱裂解规律，钠加成母离子裂解规律，铵加成母离子裂解规律以及钾、钙、铜、银加成离子的质谱裂解规律。

4.仪器同位素性能的评估

系统地评估仪器一级质谱同位素置信区间以及相应的影响因素，影响因素包括仪器的分辨率、离子电荷数、峰强度、峰面积、化合物性质、采样速度、仪器的正负离子模式、样品流速、基质效应。系统地评估仪器二级质谱同位素置信区间以及相应的影响因素，影响因素包括碰撞能大小、选择窗口的宽度、峰强度、峰面积、离子的特点、采样速度、仪器的正负离子模式、样品流速、基质效应、分辨率、离子电荷数。

5.液质连用分析含有活性成分的粗提物

根据活性成分的结构特点来选择合适的色谱柱以及相应的分离条件(包括色谱柱的长度、内径、填料、流速、流动相组成、洗脱梯度、不同的电解质)、质谱条件(仪器的参数)。应用LC-ESI-Q-TOF，根据化合物特点在正离子或负离子模式下进行全扫描分析。

6.二级质谱数据的采集

通过自动采样来获得高信噪比离子的二级质谱，通过独立控制色谱和质谱来获得低信噪比离子的二级质谱。

7.鉴定未知化合物

通过综合所测的未知化合物的精确质量、同位素分布、二级质谱以及已知化合物二级质谱的数据，来完成对未知化合物的结构鉴定。

本发明具有以下优点：

1.针对复杂中药成分中的未知成分特别是微量未知成分进行分析，有助于更全面的了解中药的物质基础。

2.系统的评估仪器相对同位素分布，能够弥补四极杆-飞行时间质谱在精确质量测试方面的不足，提高其对化合物分子式的鉴定能力，从而大大提高四极杆-飞行时间质谱分析复杂中药成分的效率。

3.对二级质谱中子离子的相对同位素分布、质量准确度以及中性丢失部分精确质量的评估，可以提高四极杆-飞行时间质谱对化合物结构鉴定的能力。

4.系统建立已知化合物的质谱裂解规律，为这类成分的快速分析提供了更可靠的依据。

5.通过独立控制色谱和质谱，巧妙地获得了高质量的低信噪比离子的二级质谱。

6.综合了精确质量、同位素分布以及二级质谱数据，使得鉴定结果更加准确、可靠。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明方法的同位素误差分布图，其中(a)一级质谱误差分布；(b)二级质谱误差分布。

具体实施方式

鸡屎藤提取物中未知成分的结构鉴定

1.鸡屎藤含活性成分粗提物的获得(环烯醚萜苷类化合物的提取)

鸡屎藤采自四川安岳，100％甲醇浸泡一小时后低压浓缩，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取。将正丁醇部分通过固相萃取小柱(硅胶柱)后，样品直接进入液质连用系统。

2.含量较高的成分分离鉴定

鸡屎藤中鸡屎藤苷酸和鸡屎藤苷的含量较大，先通过柱层析进行粗分，后利用制备色谱进行制备来获得鸡屎藤苷酸和鸡屎藤苷。制备色谱条件如下：色谱柱为waters C18柱(Bondapak C18Cartridge，15-20um，8x 100mm)；柱温：30℃；进样量：50μl；流速：5ml/min；流动相组成：水(A)和甲醇(B)；梯度洗脱，0-10min：8-15％(B)、10-35min：15-80％(B)。化合物通过质谱、核磁、红外、紫外来确定结构。

3.建立已知化合物二级质谱裂解规律

对铵加成的母离子(鸡屎藤苷和鸡屎藤甘酸)进行了系统的二级质谱分析，其裂解途径见上图。从上图我们可以把这类化合物的裂解分成几个部分，第一个部分是羧基失水(如果没有羧酸部分则没有响应的碎片离子)，第二个是糖基丢失(丢失C₆H₁₂O₆或C₆H₁₀O₅)，第三部分是环烯醚萜含硫部分发生丢失。

4.仪器同位素性能的评估

附图2给出了仪器一级质谱和二级质谱同位素误差分布。

5.液质连用对粗提物进行分析

仪器：布鲁克公司HPLC-ESI-Q-TOF(micrOTOF Q)

表1液质连用检测的代表性成分

色谱条件：安捷伦C18色谱柱(2.1×150，3.5μm)；进样量：10μl；流速：0.2ml/min；流动相组成：水(A)和乙氰(B)；梯度洗脱，0-10min：8-15％(B)、10-35min：15-80％(B)。

质谱条件：离子化模式，正离子模式(+)；喷雾气压力，30psi；氩气为碰撞气，碰撞能，0-50eV；干燥气温度，180℃；毛细管端口电压，-4500V，金属盖电压，-4000V。

表1提供了通过液质连用检测到的代表性的化合物，从表1也可以看出只通过精确质量是不能确定未知化合物的分子式，结合同位素分布可以进一步排除一些可能性较大的分子式，例如化合物3，只通过精确质量不能排除分子式C₁₈H₂₅O₁₂S，通过同位素分布可以发现，这个分子式M+2同位素误差远远超过了仪器误差范围，因此很快就可以被排除。

6.二级质谱数据采集

表2部分代表性的化合物的二级质谱数据

通过自动采样来获得高信噪比离子的二级质谱，通过独立控制色谱和质谱来获得低信噪比离子的二级质谱。部分代表性的化合物二级质谱数据见表2。

7.鉴定未知化合物

通过综合所测的未知化合物的精确质量、同位素分布、二级质谱以及已知化合物二级质谱的数据，来完成对未知化合物的结构鉴定。以化合物5为例，来阐述未知化合物的鉴定过程。通过精确质量，可以获得几个最可能分子式(例如C₂₅H₃₂NO₁₃和C₂₂H₃₆NO₁₃S)，对比化合物1和5的二级质谱，可以发现它们的特征离子十分相似(都有碎片离子m/z 193，m/z 175以及m/z 147)，重要的中性丢失也一样，例如首先发生水的丢失，糖基的丢失，推测化合物1和5结构非常类似，主要差异在环烯醚萜的侧链部分，下图给出化合物5最可能的两种结构的裂解图。从表1和下图可以发现，如果只通过精确质量以及二级质谱最终不论化合物5属于哪个结构，进一步通过同位素误差，可以非常明确的确定化合物5不含有硫元素，因此，化合物5应该是下图右边的结构。通过相同的方法，进一步将检测到的其他的未知化合物进行了结构鉴定，其他的化合物结构与化合物1非常类似。

综上所述，中药中含有非常多未被发现的未知物，包括许多低浓度的化合物，通过不同的采样方式来获得高质量的二级图谱，在结合精确质量和二级质谱对化合物结构进行确认的同时，增加同位素分布置信区间后，对未知化合物的结构鉴定更加准确、可靠。因此，本方法是复杂中药体系中未知的、特别是微量的未知成分准确、快速的结构鉴定的一种新型实用方法。

Claims

1.一种中药成分结构鉴定的方法，其特征是：包括中药提取；主要成分分离鉴定；主要成分的二级质谱图分析；仪器同位素性能的评估；液质连用分析；低浓度化合物二级质谱的获得；未知化合物的结构鉴定。

2.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的中药提取为浸提或液液萃取或固相萃取或过滤，其中浸提溶解试剂为水或甲醇或乙氰，液液萃取溶剂为正丁醇或乙酸乙酯或乙醚或氯仿或正己烷或水。

3.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的主要成分分离鉴定方法为色谱或普通柱层析，制备色谱的色谱柱柱长100-300mm，内径5-50mm，填料粒度5-20μm；柱温15-60℃；进样量5-100μl；流速1-20ml/min；流动相由水、甲醇或乙氰组成，进行梯度或等度洗脱；普通柱层析为100-400目硅胶柱，洗脱体系为石油醚、丙酮、氯仿；成分鉴定方法为核磁或质谱或红外或紫外。

4.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的主要成分的二级质谱图分析为建立已知化合物的质子化母离子质谱裂解规律或铵加成母离子裂解规律或钾、钙、铜、银加成离子的质谱裂解规律。

5.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的仪器同位素性能的评估为一级和二级质谱同位素评估，其中标样选择为普通药品、天然产物、化学合成的样品，其中天然产物为生物碱、黄酮、帖类、苯丙素类、糖类、甾体；一级质谱同位素评估分为分布置信区间的确定和影响因素评估，影响因素评估为仪器的分辨率、离子电荷数、峰强度、峰面积、化合物性质、采样速度、仪器的正负离子模式、样品流速、基质效应评估；二级质谱同位素评估分为同位素置信区间的确定和影响因素评估，影响因素评估为碰撞能大小、选择窗口的宽度、峰强度、峰面积、离子的特点、采样速度、仪器的正负离子模式、样品流速、基质效应、分辨率、离子电荷数评估。

6.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的液质联用分析为电喷雾-四级杆-飞行时间质谱和液相色谱，色谱柱长50-300mm，内径1-5mm，填料粒度1.0-5.0μm；柱温15-60℃；进样量2-50μl；流速0.01-1ml/min；流动相由水、甲醇或乙氰组成，在流动相中增加甲酸、乙酸、三氟醋酸、氨水、乙酸铵或氯化铵，浓度为0.01％-10％；进行梯度或等度洗脱；质谱的扫描速度为50-0.1Hz；碰撞能为0-50eV；选择离子的窗口为1-20u；分辨率设为10000-20000。

7.根据权利要求1所述的中药成分结构鉴定的方法，其特征是：所述的低浓度化合物二级质谱的获得为独立控制色谱和质谱来获得低信噪比的离子。