CN101398417A - 一种中药复杂组分快速检出与结构鉴定的通用性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制药领域，涉及中药复杂组分的快速检出和结构鉴定。本发明提供了一种中药复杂组分快速检出与结构鉴定的通用性方法，步骤如下：1.全成分提取；2.质谱分析；3.确定主要成分；4.多级质谱数据采集；5.确定诊断离子并以此将成分分组；6.通过桥连成分将各组连接为成分网络；7.通过预测化学式进行数据库搜索，得到各成分的候选结构集；8.首先鉴定成分最多的组中候选结构最少的成分，并以此分析该组诊断离子的结构，然后以诊断离子为标准筛选该组其它成分的候选结构，再进行鉴定，最后通过桥连成分得到所有诊断离子的结构，进而鉴定成分网络中的所有成分；9.通过特定中性丢失的连续筛选，鉴定未归入和排出成分网络的成分。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，涉及中药复杂组分的快速检出和结构鉴定，特别是涉及脉络宁注射液中未知成分的结构鉴定方法。
背景技术
中药是中华民族的传统瑰宝，为中华民族的健康和繁衍做出巨大贡献，也是我国在世界自然科学领域最有优势、最有特色的学科。众所周知，中药成分分析是揭示其药效物质基础的关键步骤，对中药制剂质量控制具有极其重要的意义。但中药制剂的化学组成十分复杂，具有多组分、多靶点、多种途径整合调节等药效作用特点，而且绝大多数标准对照品难以获得，因此快速可靠的成分鉴定仍然是巨大的挑战。尽管近年来有不少关于中药制剂成分鉴定的方法报道，但是绝大多数研究是靶向性鉴定，依赖于标准对照品或者对照文献资料(质谱、光谱数据等)。
2007年12月，国家食品药品监督管理局出台了《中药、天然药物注射剂基本技术要求》，明确规定“注射剂中所含成份应基本清楚。应对注射剂总固体中所含成份进行系统的化学研究。有效成份制成的注射剂，其单一成份的含量应不少于90％；多成份制成的注射剂，总固体中结构明确成份的含量应不少于60％。”由此可见，国家开始加大力度监督管理中药制剂的质控标准，要求提供尽可能多的现代科学依据，尽可能清楚地阐明中药制剂所含成分及其体内动力学过程，确定科学合理的质控方法与标准，为临床合理化用药提供切实的科学依据，从而提高中药的疗效、降低毒性，这是今后中药制剂研发的必然趋势和要求。
考虑到众多标准对照品难以获得，中药制剂成分的数据库信息比较匮乏，目前报道的鉴定方法对于中药制剂未知成分的整体分析具有极大的局限性。而且先前报道的大多数研究只是针对某一药材的单一组分群(如水溶性酚类成分)，并非着眼于全方，但是仅仅一味中药就含有几十乃至上百种成分，且中药制剂大多数由多味药材配伍组成，因此，建立具有普遍适用性的中药制剂未知成分分析与结构鉴定方法对于其质量控制和药效物质基础研究具有极其重要的意义。近年来，离子阱质谱(LC/IT-MSn)和飞行时间质谱(LC/TOF-MS)连用技术因可以同时提供未知化合物鉴定所不可缺少的重要信息(高分辨率、高质量精确度、高速检测，提供多级碎裂信息和精确分子量)而倍受重视，并成功应用于中药成分靶向性鉴定、杀菌剂代谢物分析等多个领域。基于LC/IT-MSn和LC-TOF/MS连用技术的未知化合物鉴定途径已经被建立并成功应用于多项研究：基于精确分子量预测各未知化合物的化学式，然后通过数据库搜索得到候选结构集，最后从候选结构集中挑选出能够产生所有实测碎片离子的结构。从理论上讲，如果相关数据库信息充足，这种方法可以适用于任何未知化合物的鉴定。但在研究中发现，通过化学式搜索可以得到某一中药未知化合物数十乃至上百种候选结构，要从中筛选出真实的结构非常耗时，大大增加研究难度，不利于普遍推广。因此，采取一定的方法缩小候选结构集，从而实现快速筛选，对于中药制剂未知化合物的鉴定具有极其重要的意义。
鉴于此，本发明应用液相/离子阱飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)技术建立了一种中药复杂组分快速检出与结构鉴定的通用性方法，对于中药制剂的质量控制和药效物质基础研究具有重要意义和普遍适用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药复杂组分快速检出与结构鉴定的通用性方法。这种方法的核心思路是某些中药成分通过质谱碎裂可以得到相同的碎片离子(即诊断离子)，以此为基础可以将中药制剂所含成分分成若干组，且各组间有共有成分(即桥连成分)出现，进而通过桥连成分将各成分组连接成成分网络。通过如下步骤完成(见图1)：
1、全成分提取中药制剂：
既要尽可能多的提取主要成分，又要尽量去除辅料干扰，根据中药制剂自身特性选择适宜的提取方法。提取方法通常包括液液萃取、固相萃取、过滤等(非液体制剂需先溶解)，其中溶解试剂包括水、甲醇等，液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷、环己烷等，固相萃取可以根据实际情况选择不同填料的固相小柱，过滤则根据实际情况选择不同型号、孔径的滤膜、滤纸。
2、应用LC/MS-IT-TOF分析中药制剂提取物：
根据中药制剂自身特性选择色谱(包括色谱柱的长度、内径、填料，柱温，流速，流动相组成，洗脱梯度等)、质谱条件(仪器的各设定参数)，应用LC/MS-IT-TOF在正、负离子模式下全扫描得到其总离子流色谱图。
3、确定主要成分：
根据实际情况，从总离子流中提取、检出、确定具有较高强度和适宜保留时间的离子作为主要目标成分。
4、多级质谱数据采集：
通过碰撞诱导解离，可以得到各主要成分的碎片离子、分子离子和碎片离子的精确分子量等多级质谱信息，且每级质谱图都能同时做到高分辨率、高质量精确度和高灵敏度。
5、确定诊断离子并以此将主要成分分组：
应用Matlab等软件编程，将通过碰撞诱导解离得到的各主要成分的分子离子和碎片离子组成一个集合，在0—10mDa的误差范围内寻找分子量相同的共有离子，即诊断离子，然后将含有相同诊断离子的成分归为一组，这样便将主要成分分为若干组，每组内的成分都含有一个相同的诊断离子。
6、通过桥连成分将各组连接为成分网络：
在两个或者两个以上组中有相同的成分出现，即桥连成分，以桥连成分为枢纽可以将各组连接为成分网络。含有成分最多的一组为成分网络的核心组。
7、通过预测化学式进行化合物数据库搜索，得到各主要成分的候选结构集：
基于精确分子量(精确到0.0001Da)，应用化学式预测软件在0—5ppm的误差范围内，预测各分子离子和碎片离子的化学式。然后应用ChemExper Chemical Directory、PubchemCompound、Combined Chemical Dictionary等化合物库，以各成分预测化学式为关键词进行搜索，得到其所有候选结构，即候选结构集。
8、通过诊断离子和桥连成分鉴定成分网络中各成分的结构：
首先对核心组中候选结构最少的成分(即核心成分)进行鉴定：从候选结构集内逐一寻找能够产生其所有实测碎片离子的结构，不能产生的候选结构被排除，符合要求的候选结构即为推测结构。然后分析此成分的裂解途径，此成分可以裂解为该组的诊断离子，进而鉴定出该组诊断离子的结构。接着以此诊断离子为标准，对该组其它成分的候选结构集进行筛选，不能裂解为此诊断离子的候选结构被排除，这大大减少了候选数量，再参照核心成分的分析方法鉴定核心组内其它成分的结构。最后以连接核心组和其它组的桥连成分为基础，得到成分网络中其它组诊断离子的结构，参照核心成分的分析方法对网络中所有成分进行鉴定。
9、通过特定中性丢失的连续筛选，鉴定不适用上述方法的成分：
不适用上述方法的成分分为两类：其一为缺少共有诊断离子而未归入成分网络的成分；其二为经过诊断离子筛选，未找到候选结构而排出成分网络的成分，这是由于各成分间预测化学式相同的碎片离子具有不同的结构(即同分异构体)。
对于这些成分，采取以下方法进行鉴定：在碎片离子信息充足的条件下，观察母离子和各碎片离子的预测化学式差异，可以很容易推测出先导离子及其碎片离子间发生的特定化学基团(如水(H2O)、羰基(CO)、羧基(COOH)、苯基等)的中性丢失，然后以此为基础连续筛选候选结构集，最后参照核心成分的分析方法进行鉴定。
本发明具有以下优点：
1、对中药复方制剂进行快速检出和全成分分析，符合中药的整体作用特点；
2、不依赖于标准品，应用多级质谱碎裂信息和精确质量测定进行未知成分的结构鉴定；
3、巧妙地利用中药成分的自身特点和成分间的普遍联系，通过诊断离子和桥连成分将未知化合物分组并连接为成分网络；
4、本发明所使用的LC/MS-IT-TOF是连接离子阱和飞行时间质谱的串级质谱技术，同时具备了高分辨率、高质量精确度、高速检测等特点，从而实现既可以做多级质谱，又能达到高质量精度的强大功能。它具有以下优点：(1)每级的MSn都能保证高质量精确度；(2)每级的MSn质谱图都能同时做到高分辨率、高质量精确度和高灵敏度；(3)极好的质量稳定性；(4)高速切换于正、负离子模式之间，且确保高质量准确度；(5)自动地MS/MS分析功能，在测定过程中可以自动切换从MS到MSn的测定；(6)自动进行MS运转情况的校正，并进行MS轴的最优化校正。
5、本发明快速可行，一次进样分析(通常可在1h内完成)即可获得丰富的化学成分结构信息，同时本发明具有普遍适用性的特点，不局限于特定中药或特定类别中药成分的分析。
附图说明
图1：方法流程图。
图2：脉络宁注射液在负离子模式下的总离子流色谱图。(a)MAX柱提取物，(b)HLB柱提取物。
具体实施方式
实施例一：脉络宁注射液未知成分的快速检出和结构鉴定
1、全成分提取脉络宁注射液：
前期研究表明，脉络宁注射液中酸性成分浓度较高，在同时检测时严重干扰了低浓度的非酸性成分的响应。鉴于此，本发明采用串联固相萃取法提取脉络宁注射液，先使用MAX柱提取酸性成分，再使用HLB柱提取非酸性成分，以期尽可能多地提取制剂成分。
将脉络宁注射液(No.200611032，南京金陵药业股份有限公司生产)用超纯水稀释10倍后，先后上样到活化好的MAX柱和HLB柱，然后分别用50％氨水、甲醇和5％甲醇清洗，接着分别用90％甲醇(含5％甲酸)和甲醇洗脱。待洗脱液挥干后，分别用90％甲醇(含有5％甲酸)和甲醇溶解，高速离心后待分析。
2、应用LC/MS-IT-TOF，全扫描得到脉络宁注射液的总离子流色谱图：
仪器：LC/MS-IT-TOF(岛津，日本)。
色谱参数如下：柱型，Synergi C18 Hydro-RP 80A，250mm×4.6mmi.d.，4μm(Phenomenex，USA)；柱温，35℃；进样量，5μl；流速，0.8ml/min；流动相组成，水(含0.025％甲酸，A)和甲醇(B)；洗脱梯度，0-15min：8-12％(B)、15-40min：12-60％(B)、40-50min：60％(B)、50-55min：60-8％(B)、55-65min：8％(B)。柱后分流后，0.4ml/min的流动相进入质谱检测器。
质谱参数如下：离子化模式(Ionization mode)，ESI(-)；喷雾气体流速(Nebulizinggas flow rate)，1.5L/min；干燥气压力(Drying gas pressure)，0.1Mpa；应用电压(Appliedvoltage)，-3.5KV；CDL电压(CDL voltage)，Constant mode；CDL温度(CDL temperature)，200℃；分析型(Analysis mode)，MS measurement；测定范围(Measurement range)，AutoMS/MS mode(MS：m/z100-1500；MSn：m/z50-1500)；离子累积时间(Ion accumulation time)，30ms；轰击能量，30％，80％和150％。
在以上条件下，全扫描得到脉络宁注射液在负离子模式下的总离子流色谱图，见图2(a)、(b)。
3、从总离子流色谱图中确定主要成分：
在图2(a)、(b)中，确定了87个强度大于1,000,000、保留时间在3—50min之间的离子峰作为脉络宁注射液的主要成分，其保留时间、实测精确分子量([M-H]-)见表1。
表1：基于LC/MS-IT-TOF的脉络宁注射液主要成分结构鉴定
4、多级质谱数据采集：
各成分的脱氢离子([M-H]-)可以作为二级碎裂的先导离子，而二级碎裂中的高强度主要离子亦可以作为三级碎裂的先导离子，以此类推，逐级碎裂。在本发明中，三级碎裂的碎片离子信息就足以完成成分分析，尽管LC/MS-IT-TOF能够完成十级碎裂。为了尽可能多的获得碎片离子信息，采用三个不同的轰击能量(30％、80％和150％)进行分析。
5、确定诊断离子并以此将主要成分分组：
应用Matlab 7.0软件编程，将通过碰撞诱导解离得到的各主要成分的分子离子、碎片离子组成一个集合，在5mDa的误差范围内确定分子量相同的共有离子(即诊断离子)，然后将含有相同诊断离子的成分归为一组，从而将53个成分分为17组，每组内的成分都含有一个相同的诊断离子，其中每组至少含有4个成分(见表2)。
表2：基于诊断离子的成分分组及各成分筛选前后的候选结构数量对比
“/”：桥连成分的候选结构数量已在成分网络前一级成分组中显示。
6、通过桥连成分将各组连接为成分网络：
如表2所示，各成分组间有共有成分出现，如第68号成分同时出现在组6、15和17，因此它可以作为连接以上三组的桥连成分。通过这种策略，可以将各组连接成如下的成分网络：(F：组；P：桥连成分；其中组6因为含有成分最多而作为核心组)。
7、通过预测化学式，得到各主要成分的候选结构集：
应用LC/MS solution工作站中的Formula Predictor软件，基于精确分子量(精确到0.000l Da)，预测了87种成分及其碎片离子的化学式，各成分的预测分子量、预测化学式和误差值见表1。参数设定如下：C[0-60]，H[0-120]，O[0-30]，N[0-10]；双键当量，[0-20]；氢碳比，[0-3]；因中药制剂很少含有P、S、Cl和Br等元素，所以不作考虑。除第15号成分外，其余86种成分的误差值均在5ppm以内，说明预测化学式准确可靠。
然后应用ChemExper Chemical Directory、Pubchem Compound、Combined ChemicalDictionary等化合物数据库，以各主要成分预测化学式为关键词进行搜索，统计其所有候选结构，即候选结构集，见表2。
8、通过诊断离子和桥连成分，鉴定成分网络中各成分的结构：
因为组6含有的成分最多，故先做分析。首先对该组中候选结构最少(2个)的第69号成分进行鉴定，通过对照实测碎片离子，它被推测为secolonitoside，其裂解途径如下(Ara：阿拉伯糖)：
如表3所示，其碎片离子的质谱误差值均5ppm(除一个离子为9.31ppm)，进一步说明推测准确。然后通过分析secolonitoside的裂解途径，鉴定出组6的诊断离子(m/z161.0440)为脱水葡萄糖。接着以脱水葡萄糖的结构为标准对该组其它成分的候选结构集进行筛选，不能裂解为此诊断离子的候选结构被排除，候选数量大大减少。如第47号成分的候选结构数量从42个减少至9个，随后的鉴定步骤参照第69号成分，其裂解途径如下(Glc：葡萄糖)：
表3：第69号成分在不同轰击能量下的碎片离子信息
当核心组组6中所有成分被鉴定之后，相关成分组(如组2、4、8、11、12、15、16和17)的诊断离子结构可以通过分析桥连成分(第47、53、68、82号成分)的裂解途径获得。如第47号成分同时出现在组6、8和12，通过分析其结构(Theveside)可以得到组8和12的诊断离子结构。以桥连成分为基础，成分网络中其它组的诊断离子均被鉴定出(结构如下)，进而鉴定出各组成分的结构。
通过诊断离子进行筛选，网络中各成分候选结构的平均数量从45±61(范围为2-227)减少至7±9(范围为1-72)，约为原来的七分之一，极大降低了研究难度，提高了工作效率。
9、通过特定中性丢失的连续筛选，鉴定不适用上述方法的成分：
脉络宁注射液中不适用上述方法的成分分为两类：其一为缺少共有诊断离子而未归入网络的34种成分(如第19号成分)；其二为由于同分异构体的原因，经过诊断离子筛选，未找到候选结构而排出网络的10种成分，如组4中的第16号成分，其35种候选结构均不能产生该组诊断离子(4-Vinyl-1，2-benzenediol)。这种失误不会对未知化合物的鉴定产生严重局限，而且这种方法在本研究中的成功率达到80％以上(43/53)，证明其对未知化合物的鉴定具有普遍适用性。
表4：第19号成分在不同轰击能量下的碎片离子信息
通过特定中性丢失的连续筛选，鉴定出这44种成分的结构。如第19号成分，其碎片离子信息见表4，第一步通过中性丢失H2O而将候选结构的数量从99减少至84，第二步通过中性丢失CO而减少至47，第三步通过进一步中性丢失CO而减少至7。
最后通过实测碎片离子对照，第19号成分被鉴定为Kigelinone，其裂解途径如下：
综上所述，在脉络宁注射液中共检出87种成分，并鉴定了其中82种，结构如下(Glc：葡萄糖；Rha：鼠李糖；Xyl：木糖；Ara：阿拉伯糖)：
但由于同分异构体的存在，不能鉴定出第32、33、36、39和75号成分的确切结构。
Claims (4)
1、一种中药复杂组分快速检出与结构鉴定的通用性方法，包括：提取中药成分；通过质谱分析，得到提取物的总离子流色谱图；从总离子流色谱图中确定主要成分；通过碰撞诱导解离，得到各主要成分的多级质谱数据；鉴定各主要成分的结构。其中鉴定结构的特征在于：
a：将通过碰撞诱导解离得到的各主要成分的分子离子和碎片离子组成一个集合，在0—10mDa的误差范围内寻找分子量相同的共有离子，即诊断离子，然后将含有相同诊断离子的成分归为一组，这样便将主要成分分为若干组，每组内的成分都含有一个相同的诊断离子；
b：在两个或者两个以上组中有相同的成分出现，即桥连成分，以桥连成分为枢纽可以将各组连接为成分网络，含有成分最多的一组为成分网络的核心组；
c：以各主要成分的预测化学式为搜索对象，查询化合物数据库，得到各主要成分的候选结构集；
d：首先对核心组中候选结构最少的成分进行鉴定，然后分析此成分的裂解途径，此成分可以裂解为该组的诊断离子，进而鉴定出该组诊断离子的结构；
e：接着以此诊断离子为标准，对核心组其它成分的候选结构集进行筛选，不能裂解为此诊断离子的候选结构被排除，再鉴定核心组内其它成分的结构；
f：待鉴定完核心组内所有成分的结构，以连接核心组和其它组的桥连成分为基础，得到所有诊断离子的结构，进而鉴定成分网络中所有成分的结构。
2、如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于不依赖于标准对照品以及文献资料报道的化合物质谱、色谱、理化性质信息。
3、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于包括溶解、液液萃取、固相萃取、过滤，其中溶解试剂包括水、甲醇，液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷、环己烷，固相萃取包括各种型号的固相小柱，过滤包括各种型号的滤膜、滤纸。
4、如权利要求1所述的质谱分析，其特征在于应用日本岛津公司生产的液相/离子阱飞行时间质谱，或者由其它公司生产的离子阱质谱和飞行时间质谱组合应用而成。其色谱条件的特征在于色谱柱，柱长100—300mm，内径2-16mm，填料粒度2—7μm；柱温，10—70℃；进样量，1—50μl；流速，0.01—1.50ml/min；流动相组成，水和甲醇或者乙腈；进行梯度洗脱或者等度洗脱。其质谱条件的特征在于所使用仪器各参数所允许的设定范围。
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