CN106053623A - 质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，具体涉及以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC‑QTOF‑MS/MS技术，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC‑QQQ‑MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的分离方法，公开了一种质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法。
背景技术
环巴胺(Cyclopamine)是一种介藜芦类异甾体类生物碱，主要存在百合科植物伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)、加州藜芦(Veratrum californicum)、毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum)中。二十世纪60年代至80年代对环巴胺的研究仅限于致畸作用，但90年代中期的研究表明，环巴胺是一种hedgehog信号通路抑制剂，由于hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联，因此环巴胺作为一种潜在的抗肿瘤新药在世界范围内掀起了研究热潮。近些年研究人员对环巴胺进行了更深入的研究，发现它对髓母细胞癌、胆管癌、卵巢癌、胰腺癌均显示出良好的抑制活性，并且美国Infinity制药公司开发的抗肿瘤药物环巴胺衍生物IPI-926已在2012年完成Ⅱ期临床试验。
由于环巴胺、介芬胺等异甾体生物碱结构特殊，其全合成步骤长达20步总反应得率也仅为1％(Giannis,A.,Heretsch,P.,Sarli,V.,Stüβel,A.,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,7911–7914.)，所以目前主要是用苯等有机溶剂提取再经柱层析、萃取除杂等步骤从加州藜芦中提取环巴胺，然而环巴胺在植物中含量低微，不到万分之一，且常规提取分离操作繁琐，得率较低，大量使用苯这种有毒试剂对环境、对研究人员也都有一定伤害，这在很大程度上限制了这一极具发展前景的抗肿瘤药物的继续深入研究。为提高产率，通常采用半合成的方式，先从植物中提取环巴胺类似物再半合成得到环巴胺，然后对得到的环巴胺进行结构修饰以期得到抗肿瘤活性较好的环巴胺衍生物。
贝母属(Fritillaria)中最具代表性的环巴胺类似物是贝母辛(peimisine)，几乎每一种贝母都含有。目前从贝母属分离到的环巴胺类似物还包括：环巴胺(cyclopamine)、环坡素(cycloposine)、伊贝辛(yibeissine)、贝母辛-3-O-β-D-葡萄糖苷(peimisine-3-O-β-D-glucopyranoside)等等，这些类似物可以通过氧化还原反应或者去糖基化等反应半合成环巴胺。虽然异甾体生物碱在贝母属中种类繁多，但是对贝母属植物中介藜芦类异甾体生物碱的研究还远未开展。
在天然产物化学研究领域，常规的“提取—分离—结构鉴定”仍然是主流的研究模式，对不同结构类型、不同含量分布的化合物缺乏与之相适应的“个性化”的技术手段与研究路线，分离过程常因周期长、缺乏导向性而导致具有重要生理活性和新颖骨架结构类型化合物发现的效率与几率偏低。
针对这一问题，国内外研究人员当前的主要工作思路是：①开发新型分离介质以提高分离效率，如小粒子填料、微孔树脂、离子交换树脂等；②引入新的分离技术以适应特殊分离任务，如分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT)用于手性化合物的分离、疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography,HIC)用于强极性成分的分离等；③发展各种联用技术，如高速逆流色谱-蒸发光散射检测(HSCCC-ELSD)、离心分配色谱-蒸发光散射检测(CPC-ELSD)等联用技术用于弱紫外吸收成分的制备分离。但是，如何增强分离过程的导向性和灵敏度，仍然没有切实可行的解决方案。因此，突破新化合物发现的传统研究模式，建立新颖结构类型天然产物的高效、快速、灵敏的分离分析方法，以提高新天然产物发现过程的效率、灵敏度和资源利用效率，是现今天然产物化学研究领域需要解决的重要科学问题之一。
发明内容
本发明针对介藜芦类异甾体生物碱在我国贝母属药用植物中“结构多样，含量低微”的分布特点，提出质谱快速表征-目标导向分离的研究方法。
本发明首先采用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS/MS)联用技术对环巴胺类似物进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子；然后，根据诊断离子采用高效液相色谱-三重四级杆质谱(LC-QQQ-MS/MS)联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物；接着，采用LC-QTOF-MS/MS验证贝母属中的环巴胺类似物；最后，根据筛选结果，选择资源量大、目标生物碱含量较高或含有新颖结构的品种，使用自动纯化系统导向分离环巴胺类似物。
LC-QTOF-MS/MS可以通过四级杆质谱(MS1)预筛出一个母离子(precursor ion orparent ion)，然后以全扫描的方式记录产物离子(product ion)的质谱图，用飞行时间质谱(MS2)进行检测，母离子和产物离子均可获得准确分子量(质量准确度可小于2ppm，分辨率在10000以上)，可以用于天然产物中母离子和碎片离子的化学结构式推导。LC-QTOF-MS/MS集成液相色谱高分离效率、串联四级杆飞行时间质谱高灵敏度、高分辨率的功能为一体，在复杂天然产物的成分鉴定中正发挥着重要作用。LC-QQQ-MS/MS的母离子扫描(precursorion scan)模式中的第一个四级杆Q1测定母离子，第三个四级杆Q3测定某个或几个特定的碎片离子，因此可以在非常复杂的混合物或药材提取液中检测到某种特定的分子。自动纯化系统以质谱作为引导制备目标化合物，抗干扰能力强，制备准确性高，可以针对药材中的目标分子量进行跟踪制备，快速获得目标化合物。
该方法快速、精确、自动化程度高、适用性强，适合于结构特殊但丰度极低的天然产物的快速发现、目标导向分离。
本发明包括以下内容：
(1)介藜芦类异甾体生物碱的质谱表征：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术对介藜芦类异甾体生物碱进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子。
在液相色谱参数和其他质谱参数固定的前提下，在25～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化。通过比较不同介藜芦类异甾体生物碱对照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和丰度变化，分子中不含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为35～45V，此时前体母离子已经碎裂，特征子离子(如m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 85.06，m/z 109.10，m/z114.09)的丰度达到最大；同样地，含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为45～55V；另外，随着碰撞能量的加大(50～60V或更大)，所有生物碱二级质谱的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09转移为m/z 67.05。综合以上信息，选择40V作为不含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，50V作为含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，在此电压下，m/z67.05，m/z 84.08，m/z 109.10，m/z 114.09的离子丰度百分比均在20％以上，并且基峰离子是m/z 109.10或m/z 114.09，将这四种离子作为介藜芦类异甾体生物碱的诊断碎片离子。
(2)贝母属植物中环巴胺类似物的化学筛选：采用LC-QQQ-MS/MS联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物。
以5种介藜芦类异甾体生物碱混合对照品溶液在ESI正离子模式下进行裂解电压、碰撞能量的优化。使用多反应监测(MRM)模式，在100～180V区间内，以20V为间隔对裂解电压进行优化；使用子离子扫描(product ion scan)模式，在40～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化。最终确定裂解电压为120V，碰撞能量为45V。并对母离子进行全扫描，确定5种介藜芦类异甾体生物碱的准分子离子分别为CAm/z 412.3、CS m/z 574.4、JV m/z426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z 428.3。然后以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，测得主要的子离子均为m/z 67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1和m/z114.1，且这6个子离子的丰度均在20％以上，其中m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1的丰度在50％以上。
在采用母离子扫描模式(precursor ion scan)扫描母离子时，软件中设置的产物离子不能超过4个。以15种异甾体生物碱对照品为对象优化母离子扫描模式的参数，将丰度最高的m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1固定为产物离子，再从m/z 81.07、m/z 84.08和m/z 85.06中选择1个最合适的产物离子。当扫描路径为m/z 67.05、m/z 109.1、m/z 114.1和m/z 84.08时，介藜芦类异甾体生物碱全部被检出，还扫描出一个藜芦胺类异甾体生物碱。QQQ-MS/MS在母离子扫描模式下，只要母离子的碎片中含有PreIS模式设置的子离子，无论丰度高低，检测器都会采集到信号，所以会采集到假阳性母离子。最终确定母离子扫描状态下的4个产物离子参数为m/z 67.05、m/z84.08、m/z109.10、m/z114.09。应用母离子扫描模式对不同品种不同批次的贝母属药材进行分析检测，可以得到一系列可能的环巴胺类似物。
(3)环巴胺类似物的验证：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术验证贝母属中存在的环巴胺类似物。
借助QTOF Auto MS/MS模式去除QQQ-MS/MS母离子扫描模式假阳性母离子。将QQQ-MS/MS扫描出来的母离子设为需要被“preferred”离子，样品碰撞能量设定为40V和50V(分子量在500Da以下的碰撞电压为40V，分子量在500Da以上的碰撞电压为40V和50V)。根据QTOF Auto MS/MS模式的扫描结果进行筛选，当化合物满足m/z 67.05、m/z 84.08、m/z109.10和m/z 114.09这4个离子峰的丰度均在20％以上并且m/z 109.10或者m/z 114.09为基峰(分子量大于500Da的化合物以50V时为准)时可以确定为环巴胺类似物。
(4)根据筛选结果，选取资源量大、介藜芦类异甾体生物碱含量相对较高或含有新颖结构的贝母用自动纯化系统分离制备环巴胺类似物。
收集方法的设置:根据质谱响应信号触发收集。首先采集一针总生物碱的色谱图，使目标化合物与周围杂质有尽量好的分离度，根据目标化合物m/z 460.4的提取色谱图确定目标化合物的起始收集位置，以该位置的质谱响应响度作为收集方法中质谱响应强度阈值。
以常规的含盐体系0.1％甲酸和10mM甲酸铵溶液(A)–乙腈溶液(B)作为流动相分离制备时，色谱图重复性不好、背景高。经优化后，确定分离目标生物碱m/z460.4的液相条件为：色谱柱为Waters SunFireTM Prep C18OBD(9×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱：0～45min，9％B；流速：10ml/min。当流动相流速为10ml/min时，相应的延迟时间设置为17s。在进样量约为50mg的贝母总生物碱的质谱图中，目标化合物m/z 460.4在两个位置出峰，出峰时间段分别为12.4-13.4min、33.0-35.0min，对两处目标化合物分别进行收集得到目标化合物馏分。
其中贝母总生物碱的制备方法如下：
将贝母药材干燥的鳞茎粉碎，过20目筛。取约400g粗粉，提取按固液比1：8的比例用95％乙醇在70℃回流提取2h，连续提取3次。合并3次提取液，滤过，减压蒸干溶剂。残渣用0.1mol/L盐酸溶解，滤过。滤液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水层，用10％氢氧化钠调pH至9～10。用二氯甲烷萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，减压蒸干溶剂，供自动纯化系统上样用。
本发明以具有抗肿瘤活性的介藜芦类异甾体生物碱为目标，针对其独特的分子结构以及含量低微的特点，以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC-QTOF-MS/MS技术，充分发挥了其在复杂体系中的高分离效率、高灵敏度、高分辨率的技术优势，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC-QQQ-MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。该方法快速、精确、自动化程度高、产品纯度好，尤其适合于结构特殊但丰度极低的天然产物的快速发现、目标导向分离。
附图说明
图1是介藜芦类异甾体生物碱的二级质谱图(碰撞能量＝40V)
图2是贝母药材LC-QQQ-MS/MS母离子模式扫描图谱
图3是自动纯化系统分离平贝母总生物碱的色谱图
图4是自动纯化系统二次分离平贝母中m/z460.4(A)的色谱图
图5是自动纯化系统二次分离平贝母中m/z460.4(B)的色谱图
图6是自动纯化系统分离平贝母总生物碱的色谱图
图1中的解释：(A)cyclopamine，(B)jervine，(C)peimisine，(D)cycloposine，(E)pseudojervine
图2中的解释：(A)GS,(B)LB,(C)JY,(D)AZ,(E)TB,(F)WB,(G)PB,(H)HB,(I)XJ,(J)YL,(K)ZB,(L)WANBEI
图3中的解释：(A)m/z460.4的提取离子色谱图(B)总生物碱的总离子流图
图4中的解释：(A)m/z460.4(A)的提取离子色谱图(B)m/z460.4(A)的总离子流图
图5中的解释：(A)m/z460.4(B)的提取离子色谱图(B)m/z460.4(B)的总离子流图
图6中的解释：(A)m/z428.4的提取离子色谱图(B)总生物碱的总离子流图
实施例1
1.实验部分
1.1试剂与材料
试剂：色谱纯乙腈和色谱纯甲醇(Merck,德国)，色谱纯甲酸(纯度99％，ROC，美国)，分析纯甲酸铵(上海凌峰化学试剂有限公司，中国上海)。双蒸水(18MΩ·cm-1)由Milli-Q纯水仪制。
对照品：15个异甾体类生物碱，包括5个介藜芦胺类异甾体生物碱(jervine-typeisosteroidal alkaloids)：cyclopamine(CA)、jervine(JV)、peimisine(PS)、cycloposine(CS)和pseudojervine(PJV)；5个瑟文类异甾体生物碱(cevanine-type isosteroidalalkaloids)：puqiedine、puqiedinone、hupehenine、verticine和verticinone；5个藜芦胺类异甾体生物碱(veratramine-type isosteroidal alkaloids)：veratrosine(VS)、puqienine A、puqienine B、puqienine C和puqienine D。
实验材料：MCX小柱(Waters Oasis@，混合型强阳离子交换固相萃取小柱)
药材:12种不同贝母的鳞茎，包括太白贝母(TB)，暗紫贝母(AZ)，梭砂贝母(LB)，甘肃贝母(GS)，卷叶贝母(JY)，瓦布贝母(WB)，浙贝母(ZB)，湖北贝母(HB)，伊犁贝母(YL)，新疆贝母(XJ)，平贝母(PB)，皖贝母(WANBEI)
1.2分析仪器和检测条件
LC-QTOF-MS/MS质谱表征：色谱分析采用安捷伦1200液相系统(Agilent,Germany)，含在线真空脱气机、高压二元泵、自动进样器、柱温箱。色谱分离采用AglientZorbax SB C18柱(4.6×150mm,5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1％甲酸和10mM甲酸铵溶液(A)–乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序：0～10min，15％～25％B；10～32min，25％～30％B；32～37min，30％～50％B；37～42min，50％～60％B；42～45min，60％～100％B；柱后运行时间15min回到起始梯度；流速：1.0ml/min。进样体积：1μl。检测器采用Agilent 6530QTOF/MS系统(Agilent Corp，USA)，电喷雾(ESI)离子源。
质谱检测条件为：干燥气体温度，325℃；干燥气流速，5.0L/min；雾化气(nebulizer)，45psig；鞘气温度(sheath gas temperature)，350℃；鞘气流速，10L/min；毛细管电压，4000V；锥孔电压(skimmer)，65V；OCT 1RF Vpp，750V；裂解电压(fragmentorvoltage)，120V。正离子模式为全程监测模式，一级离子扫描范围设置为m/z 100～1000，二级离子扫描范围设置为m/z 50～1000。数据采集模式：Target MS/MS,待测成分的[M+H]+离子选做母离子用于获取碎片离子。
数据采集及处理分别采用Agilent LC-MS-QTOF Mass Hunter AcquisitionSoftware Version.A.01.00Agilent Technologies)及Mass Hunter WorkstationSoftware Version B.02.00(Agilent Technologies)分析软件。
LC-QQQ-MS/MS：液相色谱分析采用安捷伦1290液相系统(Agilent,Germany)，含在线真空脱气机、高压二元泵、自动进样器、柱温箱。色谱柱和色谱条件同LC-QTOF-MS/MS部分。流速：1.0ml/min，柱后分流使50％的洗脱液流入QQQ-MS进行检测。进样体积：5μl。
检测器采用Agilent 6460QQQ/MS系统(Agilent Corp，USA)，电喷雾(ESI)离子源。质谱检测条件为：干燥气体温度，325℃；干燥气流速，5.0L/min；雾化气(nebulizer)，45psig；鞘气温度(sheath gas temperature)，350℃；鞘气流速，10L/min；毛细管电压，4000V；锥孔电压(skimmer)，65V；OCT 1RF Vpp，750V；碎片电压(fragmentor voltage)，120V，碰撞电压，45V。正离子模式为全程监测模式，一级离子扫描范围设置为m/z 100～1000，二级离子扫描范围设置为m/z 50～1000。数据采集模式：子离子扫描(product ionscan)、多反映监测扫描(multi-reactions monitoring,MRM)、母离子扫描(precursor ionscan)。
数据采集及处理分别采用Agilent Mass Hunter Acquisition SoftwareVersion.A.01.00(Agilent Technologies)及Mass Hunter Workstation SoftwareVersion B.02.00(Agilent Technologies)分析软件。
LC-QTOF-MS/MS结构验证：鞘气温度(sheath gas temperature)，400℃；数据采集模式：Auto MS/MS。其他条件同LC-QTOF-MS/MS质谱表征部分。
自动纯化系统：Waters 2535四元梯度泵，SHIMADZU LC-10AD补偿泵，Waters2767自动进样器和收集器，Waters分流器(8-30ml/min，1000:1)，Waters2489双波长紫外检测器，Waters QDa检测器(美国Waters公司)
自动纯化系统条件：色谱柱为Waters SunFireTM Prep C18OBD(19×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱程序：0～45min，9％B；流速10mL/min；进样量：300μL；QDa检测条件：离子扫描范围设置为m/z 100～1100，正离子模式，锥孔电压，15V。
自动纯化系统数据采集采Waters MassLynx4.1软件。
1.3对照品溶液的制备
对照品溶液1：称取cyclopamine、jervine、peimisine、cycloposine和pseudojervine对照品适量，加甲醇溶解配置终浓度为20μg/ml的对照品溶液。
对照品溶液2：称取15个异甾体生物碱对照品适量，加甲醇溶解配置终浓度为50μg/ml的对照品溶液。
1.4供试品溶液的制备
将药材的干燥鳞茎粉碎至粉末状，过60目筛，并在60℃下干燥2小时。取干燥粉末500mg，用3mL氨水(25％)碱化1小时，用50mL氯仿:甲醇混合溶液(4:1,v/v)超声提取1小时，提取液用滤纸过滤，取续滤液10mL于蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，蒸干后用1mL 0.1M HCl溶解并过0.22μm微孔滤膜备用。将MCX小柱用1mL甲醇，1mL纯水活化后上样，然后依次用1ml0.1M HCl，1mL甲醇除杂，最后用1mL 5％二乙胺甲醇溶液洗脱。洗脱液氮吹吹干之后定容至1mL，将该溶液在13,000rpm下离心10min，取上清放置于进样小瓶。按照此法依次处理12种贝母药材，制备成供试品溶液。
1.5平贝母总生物碱的制备
将平贝母干燥的鳞茎粉碎，过20目筛。取约8.2kg粗粉，提取按固液比1：8的比例用95％乙醇在70℃回流提取2h，连续提取3次。合并3次提取液，滤过，减压蒸干溶剂。残渣用0.1mol/L盐酸溶解，滤过。滤液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水层，用10％氢氧化钠调pH至9～10。用二氯甲烷萃取4次，合并二氯甲烷萃取液，减压蒸干溶剂，制得4.7g总生物碱提取物(得率0.06％)。
2.实验结果
2.1环巴胺类似物的LC-QTOF-MS/MS质谱表征
2.1.1液相色谱和质谱条件
为了达到良好的分离度并获得对称的峰形，最终确定液相色谱条件为0.1％甲酸和10mM甲酸铵溶液–乙腈，不含糖介藜芦异甾体生物碱的碰撞能量设置为40V，含糖介藜芦胺类异甾体生物碱的碰撞能量设置为50V。
2.1.2介藜芦类异甾体生物碱的裂解碎片研究
对5个介藜芦类异甾体生物碱进行QTOF-MS/MS分析，总结其裂解规律。从图1中可以看出，在碰撞能量为40V时，5个标准品的共有子离子峰为m/z 67.05、m/z 81.07、m/z84.08、m/z 85.06、m/z 109.10和m/z 114.09，其中m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 109.10，m/z114.09的离子丰度百分比均在20％以上，并且基峰离子是m/z 109.10或m/z 114.09，这为后期采用QTOF-MS/MS法验证通过QQQ-MS/MS法初步筛选发现的环巴胺类似物的真实性提供了依据。
2.2基于LC-QQQ-MS/MS技术筛选贝母属植物中环巴胺类似物
2.2.1异甾体生物碱全扫描和子离子扫描模式分析
利用仪器自动优化的功能，以5种介藜芦类异甾体生物碱混合对照品溶液(“1.3”项下对照品溶液1)优化的裂解电压为120V，碰撞能量为45V。在此条件下，对母离子进行全扫描，确定5种介藜芦类异甾体生物碱的准分子离子分别为CAm/z 412.3、CS m/z 574.4、JVm/z426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z 428.3。然后以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，在上述已优化的质谱条件下测得主要的子离子均为m/z 67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1和m/z 114.1，且这6个子离子的丰度均在20％以上，其中m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1的丰度在50％以上。
2.2.2异甾体生物碱的母离子扫描模式分析
2.1.2中的结果显示，5个介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有子离子峰为m/z67.05、m/z81.07、m/z 84.08、m/z 85.06、m/z 109.10及m/z 114.09，其中m/z 109.10或者m/z 114.09是基峰，m/z 67.05是除了m/z 109.10和m/z 114.09离子之外丰度较高的离子。在采用母离子扫描模式扫描母离子时，软件中设置的产物离子不能超过4个，以1.3项下的对照品溶液1、2为对象优化母离子扫描模式的参数，最终确定母离子扫描模式中设置为扫描参数的子离子是m/z67.05、m/z 84.1、m/z 109.1和m/z 114.1。在此条件下，五种介藜芦类异甾体生物碱能够全部被检出，还扫描出一个藜芦胺类异甾体生物碱。
2.2.3贝母属植物中环巴胺类似物的快速检出
基于上述优化好的质谱条件和选定的产物离子，应用母离子扫描模式分析12种贝母属植物药材，图2为贝母药材的母离子模式扫描图谱。在这些被扫描出来的母离子中只有少数母离子有对照品可以对比鉴定出来，对于没有对照品的母离子是否属于环巴胺类似物尚需通过QTOF-MS/MS检测结果确定。
2.3贝母属植物中环巴胺类似物的验证
QQQ-MS/MS母离子扫描模式初步筛选出的母离子中存在假阳性母离子，通过QTOFAuto MS/MS模式去除这部分假阳性母离子。将QQQ-MS/MS母离子扫面模式扫描出的母离子设为需要被“Preferred”(优先裂解)的离子；为了兼顾分子量大小不同的母离子，样品碰撞能量设定为40V和50V(分子量在500Da以下的碰撞电压为40V，分子量在500Da以上的碰撞电压为40V和50V)。根据QTOF Auto MS/MS模式的扫描结果进行筛选，当化合物满足m/z67.05、m/z 84.08、m/z 109.10和m/z 114.09这4个离子峰的丰度均在20％以上并且m/z109.10或者m/z 114.09为基峰(分子量大于500Da的化合物以碰撞能量50V时为准)时可以确定为环巴胺类似物。
2.4自动纯化系统分离平贝中环巴胺类似物m/z460.4
2.4.1自动纯化系统分离目标化合物
根据QTOF-MS/MS验证结果，选取资源量大、含有新颖结构的平贝母用自动纯化系统导向分离环巴胺类似物。2.3项下验证结果显示，平贝母中存在2个未知环巴胺类似物：
①5.5min，m/z460.3058
②7.5min，m/z460.3053
以这两个化合物作为分离对象，建立其自动纯化系统的总离子流图图3(B)。
根据目标化合物m/z 460.4的提取色谱图图3(A)确定目标化合物的起始收集位置，以该位置的质谱响应响度作为质谱响应强度阈值。最终确定当进样量为500μL(浓度约100mg/mL)时，分离效果较好，相应的响应强度阈值设定为7000000。此时m/z 460.4的出峰时间段分别为12.4-13.4min、33.0-35.0min，对两处目标化合物分别进行收集依次得到馏分m/z460.4(A)，m/z 460.4(B)。
2.4.2自动纯化系统二次分离目标组分
对2.4.1中分离得到的目标化合物进行纯度测定，结果表明，所得两个目标化合物纯度均达不到要求。为了保证目标化合物段的纯度，在之后的分离中继续使用自动纯化系统进行分离收集。
m/z460.4(A)：经优化后，确定分离m/z460.4(A)的液相条件为：色谱柱为WatersSunFireTM Prep C18OBD(19×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱：0～60min，5％B；当进样量为110μL时，对应的响应强度阈值设置为2600000。此时m/z460.4(A)在51.0-55.0min处出峰，目标生物碱二次分离的图谱见图4。
m/z460.4(B)：经优化后，确定分离m/z460.4(B)的液相条件为：色谱柱为WatersSunFireTM Prep C18OBD(19×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱：0～75min，8％B；当进样量为250μL时，对应的响应强度阈值设置为800000。此时m/z460.4(B)在45.0-58.0min处出峰，目标生物碱二次分离的图谱见图5。
2.4.3纯度测定
经LC-MS检测，由“2.4.2”富集出来的目标生物碱m/z 460.4(A)、m/z 460.4(B)经面积归一化法检测纯度分别为为92.5％、97.0％。
实施例2
1.自动纯化系统分离平贝母中的贝母辛
质谱筛选结果显示，介藜芦类异甾体生物碱贝母辛m/z 428.4在14.0min处出峰，并且含量很高，以贝母辛作为目标化合物用自动纯化系统分离。首先建立贝母辛m/z 428.4自动纯化系统的总离子流图见图6(B)，根据目标化合物m/z 428.4的提取色谱图见图6(A)确定起始收集位置，以该位置的质谱响应响度作为质谱响应强度阈值(MIT)。最终确定当进样量为400μL(浓度约92mg/mL)时，分离效果较好，相应的响应强度阈值设定为1600000，此时m/z 428.4在18.0-19.5min处出峰，对目标化合物进行收集得到馏分m/z 428.4。
m/z428.4：经优化后，确定分离m/z 428.4的液相条件为：色谱柱为WatersSunFireTM Prep C18OBD(19×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱：0～40min，14％B。
2.纯度测定
经LC-MS检测，由“1”富集出来的目标生物碱m/z 428.4经面积归一化法检测纯度为95.3％。
Claims (4)
1.质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：
以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC-QTOF-MS/MS技术，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC-QQQ-MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。
2.根据权利要求1的质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：
介藜芦类异甾体生物碱的质谱表征：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术对介藜芦类异甾体生物碱进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子；
在液相色谱参数和其他质谱参数固定的前提下，在25～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化；通过比较不同介藜芦类异甾体生物碱对照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和丰度变化，分子中不含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为35～45V，此时前体母离子已经碎裂，特征子离子m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 85.06，m/z 109.10，m/z 114.09的丰度达到最大；
同样地，含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为45～55V；另外，随着碰撞能量加大到50～60V，所有生物碱二级质谱的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09转移为m/z67.05；综合以上信息，选择40V作为不含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，50V作为含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，在此电压下，m/z 67.05，m/z 84.08，m/z109.10，m/z 114.09的离子丰度百分比均在20％以上，并且基峰离子是m/z 109.10或m/z114.09，将这四种离子作为介藜芦类异甾体生物碱的诊断碎片离子；
贝母属植物中环巴胺类似物的化学筛选：采用LC-QQQ-MS/MS联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物；
以5种介藜芦类异甾体生物碱混合对照品溶液在ESI正离子模式下进行裂解电压、碰撞能量的优化；使用多反应监测模式，在100～180V区间内，以20V为间隔对裂解电压进行优化；使用子离子扫描模式，在40～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化；最终确定裂解电压为120V，碰撞能量为45V；并对母离子进行全扫描，确定5种介藜芦类异甾体生物碱的准分子离子分别为CA m/z 412.3、CS m/z 574.4、JV m/z 426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z428.3；然后以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，测得主要的子离子均为m/z67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1和m/z 114.1，且这6个子离子的丰度均在20％以上，其中m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1的丰度在50％以上；
在采用母离子扫描模式扫描母离子时，软件中设置的产物离子不能超过4个；以15种异甾体生物碱对照品为对象优化母离子扫描模式的参数，将丰度最高的m/z 67.05、m/z109.1和m/z 114.1固定为产物离子，再从m/z 81.07、m/z 84.08和m/z 85.06中选择1个最合适的产物离子；当扫描路径为m/z 67.05、m/z 109.1、m/z 114.1和m/z 84.08时，介藜芦类异甾体生物碱全部被检出，还扫描出一个藜芦胺类异甾体生物碱；QQQ-MS/MS在母离子扫描模式下，只要母离子的碎片中含有PreIS模式设置的子离子，无论丰度高低，检测器都会采集到信号，所以会采集到假阳性母离子；最终确定母离子扫描状态下的4个产物离子参数为m/z 67.05、m/z84.08、m/z109.10、m/z114.09；应用母离子扫描模式对不同品种不同批次的贝母属药材进行分析检测，可以得到一系列可能的环巴胺类似物；
环巴胺类似物的验证：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术验证贝母属中存在的环巴胺类似物；
借助QTOF Auto MS/MS模式去除QQQ-MS/MS母离子扫描模式中的假阳性母离子；将QQQ-MS/MS扫描出来的母离子设为需要被“preferred”离子，样品碰撞能量设定为40V和50V，分子量在500Da以下的碰撞电压为40V，分子量在500Da以上的碰撞电压为40V和50V，根据QTOFAuto MS/MS模式的扫描结果进行筛选，当化合物满足m/z 67.05、m/z 84.08、m/z 109.10和m/z 114.09这4个离子峰的丰度均在20％以上并且m/z 109.10或者m/z 114.09为基峰时(分子量大于500Da的化合物以50V时为准)，可以确定为环巴胺类似物；
根据筛选结果，选取资源量大、介藜芦类异甾体生物碱含量相对较高或含有新颖结构的贝母用自动纯化系统分离制备环巴胺类似物。
3.根据权利要求1的质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：
收集方法的设置:根据质谱响应信号触发收集；首先采集一针总生物碱的色谱图，使目标化合物与周围杂质有尽量好的分离度，根据目标化合物m/z 460.4的提取色谱图确定目标化合物的起始收集位置，以该位置的质谱响应响度作为收集方法中质谱响应强度阈值；
经过条件优化，最终确定分离目标生物碱m/z460.4的液相条件为：色谱柱为WatersSunFireTM Prep C18OBD(19×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸溶液(A)–乙腈溶液(B)；等度洗脱：0～45min，9％B；流速：10ml/min；当流动相流速为10ml/min时，相应的延迟时间设置为17s；在进样量约为50mg的贝母总生物碱的质谱图中，目标化合物m/z 460.4在两个位置出峰，出峰时间段分别为12.4-13.4min、33.0-35.0min，对两处目标化合物分别进行收集得到目标化合物馏分。
4.根据权利要求1的质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：
其中贝母总生物碱的制备方法如下：
将贝母药材干燥的鳞茎粉碎，过20目筛；取约400g粗粉，提取按固液比1：8的比例用95％乙醇在70℃回流提取2h，连续提取3次；合并3次提取液，滤过，减压蒸干溶剂；残渣用0.1mol/L盐酸溶解，滤过；滤液用二氯甲烷萃取3次，分取酸水层，用10％氢氧化钠调pH至9～10；用二氯甲烷萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，减压蒸干溶剂，供自动纯化系统上样用。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20201106 |