CN111595983A - 一种测定藜芦中化学成分含量的方法 - Google Patents

一种测定藜芦中化学成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测定藜芦中化学成分含量的方法，采用超高效液相色谱‑质谱联用，同时测定藜芦中8种化学成分的含量；所述8种化学成分包括：藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇。采用本申请的方法，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以同时测定藜芦中8种化学成分的含量，且所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而可用于藜芦药材的质量控制。

Description

一种测定藜芦中化学成分含量的方法
技术领域
本发明涉及中药成分测定技术领域，具体涉及一种测定藜芦中化学成分含量的方法。
背景技术
藜芦作为一味中国传统中药，现代药理研究发现其具有降压、杀虫的作用，又因其中含有生物碱类成分，具有强刺激性，故而口服能催吐祛痰。藜芦中含有不同种类的成分，包括甾体类生物碱，茋类化合物，二肽类化合物，二苯乙烯类化合物、黄酮类化合物及其他类型化合物等。近些年，研究者对藜芦的化学成分进行了较多探究，对芥芬胺、藜芦胺等含量较高的成分进行了测定，而对于其他活性成分并未进行过系统的含量分析，因此需要建立一种全新的藜芦中化学成分含量测定方法，以能够更加可信、全面地对藜芦进行质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定藜芦中化学成分含量的方法，用以同时测定藜芦药材中藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇8种化学成分的含量，可用于藜芦药材的质量控制。
本申请提供了一种测定藜芦中化学成分含量的方法，采用超高效液相色谱-质谱联用，同时测定藜芦中8种化学成分的含量；所述8种化学成分包括：藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇，所述方法包括：
(1)建立8种化学成分的标准曲线
以体积分数为60-100％的甲醇为溶剂，配制5-10个含有不同已知浓度的8种化学成分的混合对照品溶液；其中，环巴胺浓度为0.1-250ng/mL，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素的浓度分别为0.1-450ng/mL，芹菜素的浓度为0.2-450ng/mL，白藜芦醇浓度为0.1-2000ng/mL，藜芦胺浓度为0.1-3500ng/mL，虎杖苷浓度为0.2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数53-85％A相，15-47％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/分钟；柱温：15-25℃；进样量V1:3-8μL；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积为V2的体积分数为60-80％乙醇水溶液进行回流提取，取上清液过滤后作为待测样品溶液，其中，M/V2为1：(10-20)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中8种化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测样品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，并按照下列公式分别计算出待测样品中8种化学成分的含量C；
C＝C1×V2/M。
本发明提供的一种测定藜芦中化学成分含量的方法，采用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以同时测定藜芦中8种化学成分的含量，且所述方法具有简便，灵敏度高，分析速度快，专属性强等优势，从而可用于藜芦药材的质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1的A图为8种化学成分的对照品的多反应离子检测图谱(MRM图)；
图1的B图为藜芦样品(批次1)中8种化学成分的多反应离子检测图谱(MRM图)；
图1中，各数字标号分别代表：1.藜芦托素；2.芥芬胺；3.环巴胺；4.藜芦胺；5.白藜芦醇；6.虎杖苷；7.槲皮素；8.芹菜素。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请提供了一种测定藜芦中化学成分含量的方法，采用超高效液相色谱-质谱联用，同时测定藜芦中8种化学成分的含量；所述8种化学成分包括：藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇，所述方法包括：
(1)建立8种化学成分的标准曲线
以体积分数为60-100％的甲醇为溶剂，配制5-10个含有不同已知浓度的8种化学成分的混合对照品溶液；其中，环巴胺浓度为0.1-250ng/mL，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素的浓度分别为0.1-450ng/mL，芹菜素的浓度为0.2-450ng/mL，白藜芦醇浓度为0.1-2000ng/mL，藜芦胺浓度为0.1-3500ng/mL，虎杖苷浓度为0.2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数53-85％A相，15-47％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/分钟；柱温：15-25℃；进样量V1:3-8μL；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积为V2的体积分数为60-80％乙醇水溶液进行回流提取，取上清液过滤后作为待测样品溶液，其中，M/V2为1：(10-20)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中8种化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测样品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，并按照下列公式分别计算出待测样品中8种化学成分的含量C；
C＝C1×V2/M。
本申请中，所述体积分数为60-100％的甲醇是指体积分数≥60％的甲醇水溶液或甲醇。
在本申请的一些实施方式中，所述混合对照品溶液中，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素、芹菜素的浓度分别为2-400ng/mL，环巴胺浓度为1-200ng/mL，藜芦胺浓度为15-3000ng/mL，虎杖苷浓度为35-7000ng/mL，白藜芦醇浓度为8-1600ng/mL。
在本申请的一些实施方式中，优选地，步骤(1)中，以甲醇为溶剂，配制所述混合对照品溶液。
在本申请的一些实施方式中，在步骤(1)中，以体积分数为60-100％的甲醇为溶剂，配制含有8种化学成分的混合对照品储备液，其中，环巴胺浓度为200-250ng/mL，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素、芹菜素的浓度分别为400-450ng/m L，白藜芦醇浓度为1600-2000ng/mL，藜芦胺浓度为3000-3500ng/mL，虎杖苷浓度为7000-8000ng/mL；
以体积分数为60-100％的甲醇稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-10个含有不同已知浓度的8种化学成分的对照品溶液。
其中，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂可以相同，也可以不同，优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂相同，更优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂为甲醇。
发明人在研究中发现，采用本申请的色谱条件，能够使所述8种化学成分获得更好的分离效果，优选地，在本申请的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-2分钟，15％-47％B；2-5分钟，47％-47％B。
本申请中对质谱的种类不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以采用三重四级杆联用质谱。为了有效获得色谱分离后的化学成分的分子离子峰以及特征碎片，以便于获得更准确的化学成分的鉴定结果，在本申请的一些实施方式中，所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：采用电喷雾离子源，以多反应离子检测作为检测模式，正负离子全扫描模式；毛细管温度设为250-350℃，干燥气流速8-15L/min；雾化器压力30-40psi。
质谱检测中8种化学成分的特征离子峰包括：
Figure BDA0002568472860000051
下面对本发明所需的仪器与试剂进行说明。
1、仪器
Agilent 6470型三重四级杆质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 1290型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent MassHunter分析软件(美国Agilent公司)；AX205型十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli Q超纯水制(Millipore公司)；3K15型高速离心机(美国Sigma公司)；XW 80A型旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)。
2、试剂
甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)均购自Merck公司(美国)；甲酸(色谱纯)购自美国ROE公司。
3、材料
对照品环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇均购自购自成都曼斯特生物科技有限公司；藜芦托素购自成都克洛玛生物科技有限公司。藜芦分别产自云南、江西、福建、山西，安徽等地。
实施例1
1、确定色谱条件
色谱柱：
Figure BDA0002568472860000062
柱(2.1mm×100mm，1.6μm)；流动相：A相0.1％甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度为：0-2min,15-47％B；2-5min,47-47％B；流速：0.3mL/min；柱温：20℃；进样体积：5μL。
2、确定质谱条件
离子源为ESI离子源，采用多反应离子检测(MRM)模式进行正负离子扫描。毛细管温度为300℃；干燥气流速为11L/min；雾化器压力为35psi。8种化学成分的质谱参数如表1所示。
表1 藜芦中8种成分的质谱参数
Figure BDA0002568472860000061
Figure BDA0002568472860000071
3、混合对照品储备液的制备
精密称取对照品藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇各1mg加甲醇定容至10mL，配制成100μg/mL的对照品储备液，均置于4℃冰箱储存备用。
取不同体积的各对照品储备液，用甲醇配制成白藜芦醇浓度为1.6μg/mL，环巴胺浓度为0.2μg/mL，槲皮素、芥芬胺、藜芦托素、芹菜素浓度为0.4μg/mL，虎杖苷浓度为7μg/mL，藜芦胺浓度为3μg/mL的混合对照品储备液。
4、待测样品溶液的制备
称取15个批次的藜芦样品粉碎后过2号筛，精密称取10g置入250mL圆底烧瓶中，加入70％乙醇150mL，回流提取3次，每次2h，合并滤液，放置室温，补足失重，取上清液用0.45μm有机微孔滤膜过滤即得待测样品溶液，将待测样品溶液放在4℃冰箱储存备用。15个批次藜芦的来源见表2。
表2 15个批次藜芦来源
Figure BDA0002568472860000072
实施例2建立标准曲线
精确量取实施例1的混合对照品储备液适量，以甲醇为溶剂，依次稀释2、2、2.5、2、2.5、2、2倍得8个浓度的混合对照品溶液，取各个浓度上述溶液，进样5μL分析，得到各对照品在不同浓度下的多反应离子检测图谱，其中，第3次稀释后的多反应离子检测图谱如图1中A图所示。以待测物峰面积(Y)为纵坐标，待测物的浓度(X)为横坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为1/X，求得各化合物的回归方程及相关系数，以S/N(信噪比)10时各对照品的浓度作为最低定量限(LLOQ)，结果见表3。
表3 8种成分标准曲线回归方程、定量限
Figure BDA0002568472860000081
实施例3精密度实验
日内精密度：精密称取藜芦样品(批次1)10g，按实施例1的方法制备待测样品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，记录8种化合物的峰面积，计算其相对标准偏差(RSD)值，结果见表4，表明日内精密度良好。
日间精密度：精密称取藜芦样品(批次1)10g，按实施例1的方法制备待测样品溶液，按上述的色谱条件连续进样2次，连续进样3天，记录8种化合物的峰面积，计算RSD值，结果见表5，表明日间精密度良好。
表4 8种成分的日内精密度(n＝6)
Figure BDA0002568472860000082
表5 8种成分的日间精密度(n＝6)
Figure BDA0002568472860000083
Figure BDA0002568472860000091
实施例4重复性实验
精密称取藜芦样品(批次1)6份，每份10g，按实施例1的方法制备待测样品溶液，分别进样5μL，记录8种成分峰面积，计算其RSD值，结果见表6，表明该方法重复性较好。
表6 8种成分的重复性(n＝6)
Figure BDA0002568472860000092
实施例5稳定性实验
精密称取藜芦样品(批次1)5份，每份10g，按实施例1的方法制备待测样品溶液，分别于0、2、4、8、12h进样5μL，记录8种成分的峰面积，考察室温条件下各成分的稳定性，计算其RSD值，结果见表7，表明样品中8种成分在室温放置12h条件下均稳定。
表7 8种成分的稳定性(n＝5)
Figure BDA0002568472860000093
实施例6加样回收率实验
精密称取藜芦样品(批次1)6份，每份5g，加入一定量混合对照品储备液，用70％乙醇补足体积至150mL，按实施例1的待测样品溶液的制备方法平行制备，进样5μL，计算加样回收率，结果见表8。
表8 8种成分的加样回收率(n＝6)
Figure BDA0002568472860000101
实施例7藜芦样品测定
取表2中的15个批次的藜芦样品(过二号筛)，精密称取10g，依照实施例1的方法制备待测样品溶液，依照实施例1的色谱条件与质谱条件测定，获得藜芦样品中各化学成分的多反应离子色谱图，其中，藜芦样品(批次1)的多反应离子色谱图如图1中B图所示；从表3中各化学成分的标准曲线中分别确定藜芦样品中各化学成分的峰面积对应的浓度C1，并按照下列公式分别计算出待测样品中8种化学成分含量；结果记录于表9-1和表9-2。
Figure BDA0002568472860000102
表9-1 不同批次藜芦中8种成分含量(μg/g)
Figure BDA0002568472860000103
表9-2 不同批次藜芦中8种成分含量(μg/g)
Figure BDA0002568472860000111
本申请建立UPLC-MS/MS分析方法，同时测定藜芦中藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇8种成分含量，此方法简便，灵敏度高，分析速度快，专属性强。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种测定藜芦中化学成分含量的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱联用，同时测定藜芦中8种化学成分的含量；所述8种化学成分包括：藜芦托素、环巴胺、芥芬胺、藜芦胺、虎杖苷、槲皮素、芹菜素、白藜芦醇，所述方法包括：
(1)建立8种化学成分的标准曲线
以体积分数为60-100％的甲醇为溶剂，配制5-10个含有不同已知浓度的8种化学成分的混合对照品溶液；其中，环巴胺浓度为0.1-250ng/mL，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素的浓度分别为0.1-450ng/mL，芹菜素的浓度为0.2-450ng/mL，白藜芦醇浓度为0.1-2000ng/mL，藜芦胺浓度为0.1-3500ng/mL，虎杖苷浓度为0.2-8000ng/mL；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数53-85％A相，15-47％B相，梯度洗脱；流速：0.2-0.4mL/分钟；柱温：15-25℃；进样量V1:3-8μL；
以各化学成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各化学成分的浓度为横坐标，分别建立各化学成分的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积为V2的体积分数60-80％乙醇水溶液进行回流提取，取上清液过滤后作为待测样品溶液，其中，M/V2为1：(10-20)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测确定各色谱峰的化学成分，并获得各化学成分的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中8种化学成分的含量；
根据已建立的各化学成分的标准曲线，由待测样品溶液中各化学成分的色谱峰面积，分别获得各化学成分的浓度C1，并按照下列公式分别计算出待测样品中8种化学成分的含量C；
C＝C1×V2/M。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素、芹菜素的浓度分别为2-400ng/mL，环巴胺浓度为1-200ng/mL，藜芦胺浓度为15-3000ng/mL，虎杖苷浓度为35-7000ng/mL，白藜芦醇浓度为8-1600ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，以甲醇为溶剂，配制所述混合对照品溶液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，以体积分数为60-100％的甲醇为溶剂，配制含有8种化学成分的混合对照品储备液，其中，环巴胺浓度为200-250ng/mL，藜芦托素、芥芬胺、槲皮素、芹菜素的浓度分别为400-450ng/mL，白藜芦醇浓度为1600-2000ng/mL，藜芦胺浓度为3000-3500ng/mL，虎杖苷浓度为7000-8000ng/mL；
以体积分数为60-100％的甲醇稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-10个含有不同已知浓度的8种化学成分的混合对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：0-2分钟，15％-47％B；2-5分钟，47％-47％B。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：采用电喷雾离子源，以多反应离子检测作为检测模式，正负离子全扫描模式；毛细管温度设为250-350℃，干燥气流速8-15L/min；雾化器压力30-40psi；
质谱检测中8种化学成分的特征离子峰包括：
Figure FDA0002568472850000021
Figure FDA0002568472850000031
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