CN112326832A - 一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沙棘中5‑羟色胺和白藜芦醇的检测方法。具体包括以下步骤：以沙棘果肉、叶片和枝条为原料，采用超声提取法提取沙棘样品中5‑羟色胺和白藜芦醇并初步纯化后，进行硅烷化处理，利用全扫描模式下特征离子定量气相色谱质谱联用技术(GC‑MS)进行测定。本发明的一种沙棘中5‑羟色胺和白藜芦醇的检测方法具有检测方法灵敏度高、定量准确、可同时检测两种活性物质、检测速度快及成本低廉等特点，为快速、准确、同时检测沙棘中5‑羟色胺和白藜芦醇提供了方法，对沙棘资源的开发利用具有指导作用。

Description

一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法
技术领域
本发明涉及沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇检的测技术方法的领域，具体涉及一种利用柱前衍生化特征离子定量气相色谱质谱联用技术检测沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的方法。
背景技术
5-羟色胺(5-HT)，又名血清素(serotonin)，是一种单胺类神经递质，由色氨酸合成，并且是体内合成褪黑素的前体物质。其分子式为C10H12N2O。5-羟色胺参与人体内许多生理活动的调节，如情绪行为、睡眠、血压、体温、摄食和肠道功能等方面调节，同时，也有助于造血、免疫调节和胚胎发育，这些功能的实现发现与体内不同类型的5-HT受体有关。5-HT也参与植物中许多生理变化的调控，如植物开花、形态建成、保护和适应环境变化。
白藜芦醇，即3,4'，5-三羟基二苯乙烯，是一种天然多酚，是植物产生的用来保护自己免受紫外线照射和真菌攻击等伤害的植物抗毒素化合物。其分子式为C14H12O3。大量研究证明白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、抗真菌、抗衰老、抗炎症、保护心脏、保护神经、降低肥胖风险和化学预防等多种生物活性及免疫调节作用。
沙棘作为药食同源植物，于1977年被列入《中国药典》。沙棘以其独特的生物学、生态学等特征，受到人们的广泛关注。沙棘除具有水土保持、减少泥沙和绿化沙漠的生态学价值外，其果实、叶片等含有丰富的维生素、多糖、甾醇、类胡萝卜素、酚类化合物以及脂肪酸等生物活性成分。但沙棘的相关产品和研究多集中于沙棘果实，沙棘叶片和枝条则通常作为废料被处理，造成资源浪费。近年来有研究表明，沙棘叶和枝条中含有5-羟色胺和酚类化合物等活性成分。
目前，对沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的研究主要集中在提取条件的优化，对于沙棘中5-羟色胺的检测技术方法研究鲜有报道。且在开发利用沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇之前，需要对目标成分进行检测。因此，开发一种具有高灵敏度、准确定量、快速、同时检测的测试方法，在有效提高工作效率和对沙棘枝条的综合利用和深度开发等方面有指导意义。本发明利用柱前衍生化特征离子定量气相色谱质谱联用技术检测沙棘枝条中的5-羟色胺，具有高灵敏度、定量准确、检测速度快及可同时检测两种活性物质等优点，并且相较于常用的液相色谱质谱联用技术成本更为低廉，更适合应用于实际中。
发明内容
本发明旨在提供一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，能够快速检测、准确定量，用于解决上述技术问题。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，以沙棘果肉、叶片和枝条为原料，采用超声提取法提取沙棘样品中5-羟色胺和白藜芦醇并初步纯化后，对样品进行硅烷化处理，利用全扫描模式下特征离子定量气相色谱质谱联用技术(GC-MS)进行测定。
本发明中，优选的，采用Rtx-5MS(0.25mmx30mx0.25μm)毛细管色谱柱进行检测；载气为高纯氦气，流速为0.8mL/min，分流比为25:1，进样口温度为280℃；质谱接口温度为280℃，电离方式为电子轰击源(EI)，离子能量70eV，离子源温度200℃。
本发明中，优选的，GC-MS的升温程序：初温180℃，保持2min，以每分钟6℃升到200℃，保持6min，以每分钟25℃升到280℃，保持16min。监测方式选取全扫描模式(FullScan)，质核比33-500，通过选择离子定量，5-羟色胺硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z248，白藜芦醇硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z444。
本发明中，优选的，采用外标法，分别吸取5-羟色胺和白藜芦醇标准品溶液以及样品注入气相色谱质谱联用仪，以峰面积计算相应样品中5-羟色胺和白藜芦醇的含量。
本发明中，优选的，所述样品的提取制备步骤如下：
(1)将沙棘样品粉碎后，加入乙醇水溶液室温放置一段时间，使沙棘样品粉充分浸泡；
(2)将沙棘样品粉溶液超声提取，得到超声提取物后过滤，得到沙棘样品提取液；
(3)将沙棘样品提取液进行减压浓缩，加入乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，得到沙棘样品萃取液；
(4)将沙棘样品萃取液减压浓缩，得到沙棘样品提取物；
(5)向沙棘样品提取物加入吡啶溶解，再加入硅烷化试剂进行衍生化处理后，离心，取上清液，得到最终沙棘样品；
本发明中，优选的，
步骤(1)中，所述沙棘样品与乙醇水溶液体积比值为1:100-1:200，所述沙棘样品质量单位为克，所述乙醇水溶液体积分数为70-90％，所述室温放置一段时间为8-12小时。
步骤(2)中超声提取次数为两次。
步骤(3)、(4)中所述减压浓缩的条件为40-45℃，0.05MPa～0.1MPa。
步骤(5)中所述硅烷试剂为六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷；衍生化具体为：加入1mL吡啶溶解沙棘枝条提取物，超声5min使其溶解，置于冰水浴中，依次加入0.4mL六甲基二硅胺烷、0.2mL三甲基氯硅烷(总体积1.6mL)，20℃静置30min；离心具体操作为8000rpm离心10min，取上清液用于GC-MS分析。
本发明的有益效果是
第一，具有高灵敏度，检测准确，样品无需经过树脂纯化，即可检测到样品中含有的5-羟色胺和白藜芦醇，不受其他物质干扰，达到了高灵敏度、检测准确的目的。
第二，定量准确，采用的监测方式为全扫描模式，可分别通过5-羟色胺和白藜芦醇硅烷化物质的特征离子m/z248和m/z444进行定量，不受其他物质的干扰，达到了定量准确的目的。
第三，同时检测两种活性物质，省时省力，通过同一GC-MS色谱条件可同时检测5-羟色胺和白藜芦醇两种活性物质，且相互不干扰检测结果，也不受其他物质的干扰。
第四，成本低廉，在保证较高的灵敏度和定量准确的前提下，利用气相色谱质谱联用技术进行检测的成本远低于利用液相色谱质谱联用技术进行检测，成本更低廉。
附图说明
图1为本发明的含量测定流程图。
图2为5-羟色胺标准品经硅烷化处理后在特征离子m/z248定量下的质量色谱图。
图3为沙棘样品经硅烷化处理后在特征离子m/z248定量下的质量色谱图。
图4为白藜芦醇标准品经硅烷化处理后在特征离子m/z444定量下的质量色谱图。
图5为沙棘样品经硅烷化处理后在特征离子m/z444定量下的质量色谱图。
图6为5-羟色胺标准曲线。
图7为白藜芦醇标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式，对本发明沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于所述内容。
实施例：
本实施例所述沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的提取方法，具体包括以下步骤：
(1)准确称取0.5克沙棘样品，粉碎后置于三角瓶中，分2次加入70-90％乙醇水溶液是料液比在1:100-1:200，在60℃下超声60min，抽滤，取上清液。在制备过程中，保持处于黑暗或者避光条件下。将收集到的提取液在4℃下保存用于后续的含量测定。
(2)在40℃下使用旋转浓缩仪将提取液浓缩至1mL。向浓溶液中加入蒸馏水和乙酸乙酯，萃取15min。使用旋转浓缩仪在40℃的条件下，将乙酸乙酯萃取液蒸发至干。
本实施例所述沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)硅烷化处理
向旋干后的样品中，加入1mL吡啶，超声5min使其溶解，置于冰水浴中，依次加入0.4mL六甲基二硅胺烷、0.2mL三甲基氯硅烷(总体积1.6mL)，8000rpm离心10min，取上层清液用于GC-MS分析。
(2)GC-MS测试条件
采用岛津GCMS-2010Ultra气质联用仪，Rtx-5MS(0.25mmx30mx0.25μm)毛细管色谱柱；载气为高纯氦气，流速为0.8mL/min，分流比为25:1，进样口温度为280℃；质谱接口温度为280℃，电离方式为电子轰击源(EI)，离子能量70eV，离子源温度200℃，柱温箱的升温程序：初温180℃，保持2min，以每分钟6℃升到200℃，保持6min，以每分钟25℃升到280℃，保持16min。监测方式选取全扫描模式(Full Scan)，质核比33-500，通过选择离子定量，5-羟色胺硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z248，白藜芦醇硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z444。
本实施例所述沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法的方法学评价，具体包括以下步骤：
(1)线性范围
用上述色谱条件进行实验，分别对0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL5个不同浓度水平的5-羟色胺标准液和0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL 5个不同浓度水平的白藜芦醇标准液进行测定，每个水平点重复进样2次，分别建立以5-羟色胺、白藜芦醇的浓度C(mg/mL)为横坐标X，以峰面积A为纵坐标Y的标准曲线。
5-羟色胺标准曲线回归方程为y＝355422x-9139.6，R2＝0.9901。白藜芦醇标准曲线回归方程为y＝79382x-6776.3，R2＝0.994。结果表明5-羟色胺和白藜芦醇的浓度分别在0.05-1mg/mL、0.05-2.5μg/mL的范围内呈现良好的线性关系，结果见表1-2和图6-7。
表1 5-羟色胺的线性关系试验结果
Figure BDA0002760370410000041
表2白藜芦醇的线性关系试验结果
Figure BDA0002760370410000042
(2)准确度
采用计算添加回收率的方法评价检测方法的准确度。取4份含有5-羟色胺的沙棘枝条浓缩提取液，每份1.0mL，1份为空白样品，另外3份分别加入低、中、高不同浓度的5-羟色胺标准液后，得到5-羟色胺的添加浓度分别为提取液中5-羟色胺浓度的0.5、1、2倍的提取液，用上述测定方法测试5-羟色胺含量，计算添加回收率。
取4份含有白藜芦醇的沙棘枝条浓缩提取液，每份1.0ml，1份为空白样品，另外3份分别加入低、中、高不同浓度的白藜芦醇标准液后，得到白藜芦醇的添加浓度分别为提取液中白藜芦醇浓度的0.5、1、2倍的提取液，用较优的测定方法测试白藜芦醇含量，计算添加回收率。
该检测方法对5-羟色胺的添加回收率在100.30％-107.68％，对白藜芦醇的添加回收率在73.25％-98.80％，结果说明该方法准确度符合实验要求。结果如表3。
表3 5-羟色胺的添加回收率
Figure BDA0002760370410000051
(3)精确度
分别以5-羟色胺和白藜芦醇的峰面积和保留时间评价方法的精确度，按照上述色谱条件进行实验，连续进样5次，以峰面积和保留时间的相对偏差(RSD，n＝5)来评价该方法的精确度。
5-羟色胺的保留时间的RSD在0.1％以内，峰面积的RSD在0.6％以内；白藜芦醇的保留时间的RSD在0.005％以内，峰面积的RSD在3％以内。表明该测试方法具有良好的稳定性，满足定量的需要。结果如表4。
表4 5-羟色胺的保留时间和峰面积的精确度
Figure BDA0002760370410000052
(4)检测限(LOD)和定量限(LOQ)
分别将浓度为0.1mg/g、0.1μg/mL的5-羟色胺和白藜芦醇标准溶液用乙醇水溶液逐级稀释，对样品按照上述色谱条件进行实验，以信噪比(S/N)≥3的检测量为检测限LOD，以信噪比(S/N)≥10的检测量为定量限LOQ。
5-羟色胺的LOD和LOQ分别为25μg/mL和75μg/mL。白藜芦醇的LOD和LOQ分别为0.01μg/mL和0.03μg/mL。结果表明该测试方法满足定量的需要。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，以沙棘果肉、叶片和枝条为原料，采用超声提取法提取沙棘样品中5-羟色胺和白藜芦醇并初步纯化后，对样品进行硅烷化处理，利用全扫描模式下特征离子定量气相色谱质谱联用技术(GC-MS)进行测定。
2.根据权利要求1所述的一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，采用Rtx-5MS(0.25mmx30mx0.25μm)毛细管色谱柱进行检测；载气为高纯氦气，流速为0.8mL/min，分流比为25:1，进样口温度为280℃；质谱接口温度为280℃，电离方式为电子轰击源(EI)，离子能量70eV，离子源温度200℃。
3.根据权利要求1所述的一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，GC-MS的升温程序：初温180℃，保持2min，以每分钟6℃升到200℃，保持6min，以每分钟25℃升到280℃，保持16min；监测方式选取全扫描模式(Full Scan)，质核比33-500，通过选择离子定量，5-羟色胺硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z248，白藜芦醇硅烷化物质用于定量的特征离子为m/z444。
4.根据权利要求1所述的一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，采用外标法，分别吸取5-羟色胺和白藜芦醇标准品溶液以及样品注入气相色谱质谱联用仪，以峰面积计算相应样品中5-羟色胺和白藜芦醇的含量。
5.根据权利要求1所述的一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，所述样品的提取制备步骤如下：
(1)将沙棘样品粉碎后，加入乙醇水溶液室温放置一段时间，使沙棘样品粉充分浸泡；
(2)将沙棘样品粉溶液超声提取，得到超声提取物后过滤，得到沙棘样品提取液；
(3)将沙棘样品提取液进行减压浓缩，加入乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，得到沙棘样品萃取液；
(4)将沙棘样品萃取液减压浓缩，得到沙棘样品提取物；
(5)向沙棘样品提取物加入吡啶溶解，再加入硅烷化试剂进行衍生化处理后，离心，取上清液，得到最终沙棘样品。
6.根据权利要求5所述的一种沙棘中5-羟色胺和白藜芦醇的检测方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述沙棘样品与乙醇水溶液体积比值为1:100-1:200，所述沙棘样品质量单位为克，所述乙醇水溶液体积分数为70-90％，所述室温放置一段时间为8-12小时；
步骤(2)中超声提取次数为两次；
步骤(3)、(4)中所述减压浓缩的条件为40-45℃，0.05MPa～0.1MPa；
步骤(5)中所述硅烷试剂为六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷；衍生化具体为：加入1mL吡啶溶解沙棘枝条提取物，超声5min使其溶解，置于冰水浴中，依次加入0.4mL六甲基二硅胺烷、0.2mL三甲基氯硅烷(总体积1.6mL)，20℃静置30min；离心具体操作为8000rpm离心10min，取上清液用于GC-MS分析。
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