CN103760219A - 一种基于dart/q-tof法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法 - Google Patents

一种基于dart/q-tof法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种龙血竭药材分析鉴定方法，取样品溶液置于DART传输模块上的筛孔，室温晾干后，采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品，DART离子源参数的气体流速为2.5～3.5L·min-1，气体温度为150～450℃，样品传输速度为0.2～0.6mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000～1500V，RF电压为220～260V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为5～35V。本发明方法对样品直接分析，具有原位、直接、快速、简便的优势，检测准确、灵敏度高、专属性强。

Description

一种基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法
技术领域
本发明涉及一种龙血竭药材分析鉴定方法，具体涉及一种基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法。
背景技术
龙血竭是百合科龙血树属植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen含脂木材的乙醇提取物，为名贵中药材之一，具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效。
刘芳等人关于龙血竭化学成分研究进展的综述中可见，龙血竭化学成分复杂，主要含有酚酸类、萜类、甾体及甾体皂苷类成分，以酚酸类化合物为特征，酚酸类成分也是其主要的生理活性成分。《国家药品监督管理局国家标准》[WS3-082(Z-016)-99(Z)]项下收载了对龙血竭药材的性状、薄层鉴别、龙血素B的含量测定等检测方法，国家标准中未收载对总酚和7，4’-二羟基黄酮的含量测定项；ZL200510010851.1提供了一种检测龙血竭药材中龙血素A和龙血素B含量的质量控制方法，但是该方法也没有对龙血竭药材中的总酚的含量、7，4’-二羟基黄酮的含量进行检测；ZL200910006122.0提供了一种对龙血竭药材中总酚、7，4’-二羟基黄酮、龙血素B三种指标成分进行含量测定的方法，以及龙血竭药材的指纹图谱的检测方法。综上所述，龙血竭酚酸类成分检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和液质联用法等，但是这些方法均需对样品进行前处理和色谱分离，不够简便快捷和环保节约。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种龙血竭药材分析鉴定方法，基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分。
一种龙血竭药材分析鉴定方法，具体包括：取样品溶液置于DART传输模块上的筛孔，室温晾干后，采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品，DART离子源参数的气体流速为2.5～3.5L·min-1，气体温度为150～450℃，样品传输速度为0.2～0.6mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000～1500V，RF电压为220～260V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为5～35V。
所述气体为氦气；所述DART离子源参数的气体流速优选为3.1L·min-1，气体温度优选为250℃。
所述样品传输速度优选为0.2mm·s-1。
所述Q-TOF质谱选择负离子模式。
所述Q-TOF毛细管电压优选为1000V，RF电压优选为250V。
所述碰撞能量优选为25V。
所述样品溶液的制备：取龙血竭粉末0.20～0.30g，加甲醇50mL超声提取15min，量取5mL甲醇提取液至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得样品溶液。
本发明所述龙血竭药材分析鉴定方法，以甲醇空白溶液作为对照。
DART电离样品时，得到复杂混合物的总离子，其质谱图是多种化合物的加合图，采用单级全扫描时，可能会出现假阳性结果，为提高检测的专属性，本发明采用高分辨质谱对母离子进行准确质量数的测定，然后选择母离子进行子离子全扫描方式采集数据，既降低了背景干扰，提高了灵敏度，又保证了鉴定结果的准确度。
本发明的有益效果体现在：
(1)、本发明方法对样品直接分析，没有前处理或只需对样品进行简单的制备，无需进行色谱分离，减少了试剂的耗费，缩短了样品检测周期；对大批量的样品进行检测时，可以大大缩短检验周期，减少化学试剂和劳力的消耗，适用于龙血竭的高通量鉴别；(2)、本发明方法具有原位、直接、快速、简便的优势，检测准确、灵敏度高、专属性强。
附图说明
图1为7，4’-二羟基黄酮RDA裂解途径示意图。
图2为龙血素B裂解途径示意图。
图3为白藜芦醇裂解途径示意图。
图4为对照品的DART-MS-MS图(A为7，4’-二羟基黄酮，B为龙血素A，C为龙血素B，D为白藜芦醇，E为紫檀茋)。
图5为4批龙血竭药材的DART-MS图。
图6为其中1批龙血竭药材的DART-MS-MS图。
具体实施方式
一种基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分的方法，取样品溶液置于DART传输模块上的筛孔，室温晾干后，采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品，DART离子源参数的气体流速为2.5～3.5L·min-1，气体温度为150～450℃，样品传输速度为0.2～0.6mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000～1500V，RF电压为220～260V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为5～35V。
所述气体为氦气；所述DART离子源参数的气体流速优选为3.1L·min-1，气体温度优选为250℃。
所述样品传输速度优选为0.2mm·s-1。
所述Q-TOF质谱选择负离子模式。
所述Q-TOF毛细管电压优选为1000V，RF电压优选为250V。
所述碰撞能量优选为25V。
本发明将对照品、供试样品分别溶于甲醇中，得到对照品溶液和样品溶液，并以稀释溶剂甲醇作为空白对照。
以下实施例中应用的仪器与试药包括：
DART实时分析离子源（美国IonSense公司）；Agilent6538Q-TOF质谱仪(美国Agilent公司)；筛网（直径0.0019英寸，美国IonSense公司提供）；甲醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)。
对照品：龙血素A（批号：111660-200402）、龙血素B（批号：111558-200303）均购自中国药品生物制品检定所；7，4’-二羟基黄酮（批号：111787-201002）购自中国食品药品检定研究院；紫檀茋（批号：20110723，含量>99%），购自杭州广林生物医药科技有限公司；白藜芦醇（含量>99%），购自陕西永健制药有限公司。
实验用4批药材均产自云南，由江苏康缘药业股份有限公司质量部鉴定为龙血竭。
质谱条件：DART离子源参数：氦气流速：3.1L·min-1；气体温度：250℃；样品传输速度：0.2mm·s-1；负离子采集模式；毛细管电压：1000V；RF电压：250V；一级质谱扫描质量数范围：50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围：30～500amu，碰撞能量：25V。
实施例1
对照品溶液的制备：
取龙血素A、龙血素B、7，4’-二羟基黄酮、白藜芦醇和紫檀茋对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含10μg的溶液。
样品溶液的制备：
取龙血竭粉末0.25g，加甲醇50mL超声提取15min，再量取5mL甲醇提取液至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
测定方法：
对照品溶液、样品溶液、甲醇空白溶液均取10μL分别置DART传输模块上（模块上带10个孔，将筛网置该模块中）每个筛网孔的中心，室温晾干后置于DART离子源以0.2mm·s- 1前行检测。
测定时，每个孔放置一个样品，任意放置，样品溶液、对照品溶液和甲醇可以一起同时测定，每块筛网上均需有甲醇空白溶液作为对照。本试验中，先测定对照品溶液，以甲醇空白溶液作为对照，进行DART-MS及DART-MS-MS分析；再测定样品溶液，同时以甲醇空白溶液作为对照，对样品进行DART-MS及DART-MS-MS分析。
实施例2DART-MS及DART-MS-MS试验条件的优化
2.1本发明方法通过对比正负离子扫描模式，结果表明相同量的对照品在正离子模式下[M+H]+离子强度较弱且存在[2M+H]+离子，负离子模式下能获得较强的[M-H]-离子，因此本发明方法选择负离子模式进行分析。
2.2试验用气体的选择：试验中分别采用高纯氮气和氦气作为载气来产生等离子体，对比发现：采用氮气作为载体，样品电离弱，检测灵敏度低，而采用氦气作为载体能够达到较强的离子丰度，因此选用氦气来产生等离子体。
2.3样品传递速度的选择：DART检验方法是对样品直接分析，没有前处理或只需进行简单的前处理，样品在DART进样口停留的时间影响其灵敏度。在试验中考察了0.2mm·s-1和0.6mm·s-1的样品传递速度，结果表明样品传递速度为0.2mm·s-1时，能获得较高的灵敏度。
2.4DART气体温度的选择：由于载气温度的不同会影响DART对目标化合物的离子化效率，因此试验中在其他参数保持一致的条件下分别采用150℃、250℃、350℃和450℃对5个对照品进行了考察，结果表明气体温度为250℃时，5个对照品均能获得较强的[M-H]-离子，温度较低时离子化效果较差，而温度太高时样品可能被分解，[M-H]-离子强度也较弱。因此干燥气温度优选为250℃。
2.5碰撞能量的优化：为了获得较好的特征碎片离子，在进行DART-MS-MS分析时，考察了5V、15V、25V和35V，结果碰撞能量为25V时能得到较好的碎片离子信息。
实施例3对照品的DART-MS及DART-MS-MS分析
取龙血素A、龙血素B、7，4’-二羟基黄酮、白藜芦醇和紫檀茋对照品适量，分别加甲醇制成每1mL含10μg的对照品溶液，上述对照品溶液取10μL置DART传输模块上筛网孔的中心，以等量甲醇空白溶液作对照，室温晾干后置于DART离子源，采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品。
质谱条件具体为：DART离子源参数的气体流速为3.1L·min-1，气体温度为250℃，样品传输速度为0.2mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000V，RF电压为250V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为25V。
3.1黄酮类化合物的DART-MS及DART-MS-MS分析
分别对7，4’-二羟基黄酮、龙血素A和龙血素B三个龙血竭中主要的黄酮类成分进行研究，其中7，4’-二羟基黄酮具有典型的黄酮母核，龙血素A和龙血素B为二氢查耳酮类化合物。在负离子模式下，均产生高丰度的[M-H]-离子，因此，选择[M-H]-离子做母离子用于获取碎片离子。
7，4’-二羟基黄酮具有典型黄酮母核，负离子模式下极容易发生Retro-Diels-Alder（RDA）裂解，产生高丰度的m/z253.05[M-H]-，将此离子作为母离子进行MS/MS的碰撞诱导裂解，发现该离子可进一步发生RDA裂解产生碎片离子峰m/z135.01和m/z117.04，其RDA裂解路径见图1，DART-MS-MS见图4A。
龙血素B在负离子模式下产生高丰度的m/z315.12[M-H]-，主要碎片离子为m/z147.04,134.04,120.02,92.03，其裂解路径见图2，DART-MS-MS见图4C。龙血素A为类似的裂解过程，其DART-MS-MS见图4B。
3.2二苯乙烯类化合物的DART-MS及DART-MS-MS分析
分别对白藜芦醇和紫檀茋两个龙血竭中主要的二苯乙烯类成分进行研究。在负离子模式下，均产生高丰度的[M-H]-离子，因此，选择[M-H]-做母离子用于获取碎片离子。白藜芦醇在二级碎裂过程中，两环依次丢失一单元的C2H2O基团而出现高丰度的碎片离子峰m/z185.06，m/z143.05，其裂解路径见图3，其DART-MS-MS见图4D；紫檀茋也是类似的裂解过程，但是由于其含有间位甲氧基，故同时易丢失·CH3基团，产生特征碎片离子峰m/z240.08，其DART-MS-MS见图4E。
表1对照品通用名称、分子式和质谱数据
Figure BDA0000457721690000051
Figure BDA0000457721690000061
实施例4样品的DART-MS及DART-MS-MS分析
4批龙血竭，分别取龙血竭粉末0.25g，加甲醇50mL超声提取15min，再量取5mL甲醇提取液至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得样品溶液，4批龙血竭样品溶液、甲醇空白溶液均取10μL，分别置DART传输模块上每个筛网孔的中心，室温晾干后采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品，进行DART-MS分析，见图5，在4批龙血竭样品溶液的全扫描图中均可见5个离子峰m/z253.05、285.11、315.12、227.07和255.10。把这5个离子作为母离子进行DART-MS-MS分析，其裂解碎片分别与7，4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、白藜芦醇和紫檀茋对照品的特征碎片离子相同，故鉴定其分别为7，4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、白藜芦醇和紫檀茋。
质谱条件具体为：DART离子源参数的气体流速为3.1L·min-1，气体温度为250℃，样品传输速度为0.2mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000V，RF电压为250V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为25V。

Claims (9)

1.一种龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：基于DART/Q-TOF法分析鉴定龙血竭中多种酚酸类成分。
2.根据权利要求1所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：取样品溶液置于DART传输模块上的筛孔，室温晾干后，采用DART离子源结合Q-TOF质谱法检测样品，DART离子源参数的气体流速为2.5～3.5L·min-1，气体温度为150～450℃，样品传输速度为0.2～0.6mm·s-1；Q-TOF毛细管电压为1000～1500V，RF电压为220～260V，一级质谱扫描质量数范围为50～800amu，二级质谱子离子扫描质量数范围为30～500amu，碰撞能量为5～35V。
3.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述气体为氦气；所述DART离子源参数的气体流速为3.1L·min-1，气体温度为250℃。
4.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述样品传输速度为0.2mm·s-1。
5.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述Q-TOF质谱选择负离子模式。
6.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述Q-TOF毛细管电压为1000V，RF电压为250V。
7.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述碰撞能量为25V。
8.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述样品溶液的制备：取龙血竭粉末0.20～0.30g，加甲醇50mL超声提取15min，量取5mL甲醇提取液至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得样品溶液。
9.根据权利要求2所述的龙血竭药材分析鉴定方法，其特征在于：所述龙血竭药材分析鉴定方法，以稀释溶剂甲醇作为空白对照。
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