CN108037208A - 实时直接分析-质谱法测定生药材中阿魏酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种实时直接分析‑质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，本发明测定方法无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离，其分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间，具有简单、快速、高效的特点，可以推广到阿魏酸的含量测定领域，实际应用价值高，对中药材的质量控制具有深远的意义。

Description

实时直接分析-质谱法测定生药材中阿魏酸含量的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种实时直接分析-质谱法(DART-MS)快速测定生药材(如：川芎、当归、藁本)中阿魏酸含量的方法。
(二)背景技术
阿魏酸的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(Ferulic acid)，是植物界普遍存在的一种酚酸，在植物体内很少以游离态存在，主要与低聚糖、多胺、脂类和多糖形成结合态。现已发现，阿魏酸至少具有以下功能：抗动脉粥样硬化；抗血小板凝集和血栓；清除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化哑硝基；抗菌消炎；抗肿瘤；抗突变；增加免疫功能、人体精子活力和运动性等。阿魏酸能为人体吸收并易于从尿中排出，不会在体内累积，因此是一种安全性极高的药物。它在当归、川芎、藁本等中药材中的含量较高，是这些中药的有效成分之一，已经作为中成药的质量指标之一。
《中华人民共和国药典》(2015版)中规定川芎、当归、藁本等中药材都是以阿魏酸作为生药材的质量控制指标。川芎中按干燥品计算，含阿魏酸(C10H10O4)不得少于0.10％。当归和藁本中按干燥品计算，含阿魏酸(C10H10O4)不得少于0.050％。
现有的文献对生药材中阿魏酸含量的检测方法，常用的有高效液相色谱法、薄层扫描法、薄层分光光度计法、高效毛细管电泳法等，这些方法前处理都较复杂。而本发明中用的DART-MS法无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离，其分析速度为秒级。
实时直接分析技术(Direct Analysis in Real Time，DART)是一种新型的敞开式非表面接触型解析/离子化分析技术，于2002年被美国军方首次应用于化学战剂的测试，并于2005年首次进行文献报道，同年申请专利且商品化的DART面世。该方法将样品放置于DART离子源气体出口和质谱的采样锥口间，在大气压下，气体(如氮气、氦气或氩气)经放电产生的激发态原子瞬间解析并离子化样品表面的化合物分子，直接进入质谱分析。样品可以是气态、液态、固态，或任何几何形状，无需耗时的前处理和冗长的色谱分离，并实现定性定量，在样品的高通量筛选和检测方面正发挥越来越大的优势。
(三)发明内容
本发明提供了一种实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法。
本发明的技术方案如下：
一种实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，所述方法为：
(1)绘制标准曲线
称取阿魏酸标准品，用70％(体积分数，下同)甲醇水溶液配制成浓度范围在5～100mg/L梯度浓度的标准溶液，然后进样进行实时直接分析-质谱法测定，得到标准溶液质谱图，以阿魏酸m/z 193的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，进而计算得到标准曲线方程；
所述实时直接分析-质谱法的测定条件为：
实时直接分析条件：负离子模式采集数据，气体温度为350℃，采用Dip-it进样方式进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，待机气体为高纯氮气；
质谱条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-250，sim模式下m/z 193，锥孔电压为12V；
进样采用石英玻璃管蘸取的方式；
进一步，所述梯度浓度的标准溶液的配制方法为：称取阿魏酸标准品，用70％甲醇水溶液配制成1000mg/L的溶液，再逐级稀释成100、50、20、10、5mg/L的标准溶液；
(2)试样检测
将生药材试样研磨、过筛，用70％甲醇回流提取，制得试样溶液，所得试样溶液在步骤(1)实时直接分析-质谱法的测定条件下，测得试样溶液质谱图，将试样溶液质谱图中阿魏酸m/z 193的特征峰面积代入步骤(1)得到的标准曲线方程中，获得试样溶液中阿魏酸的浓度，进而计算得出生药材试样中阿魏酸的含量；
所述生药材试样选自：川芎、当归或藁本，生药材可通过常规途径商购获得；
所述生药材试样研磨、过筛，用70％甲醇回流提取的具体操作方法为：将生药材试样研磨过四号筛，得到试样粉末，将所得试样粉末按料液比1：90～110(w/v，g/mL)加入70％甲醇中，密塞，称定重量，然后加热回流20～40min，降至室温后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，过滤(使用中速、定量滤纸，孔径在30-50微米)，收集滤液，即得试样溶液。
与现有技术相比，本发明的优点主要体现在：无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离，其分析速度为秒级，能够有效的节省实验时间。本发明的测定方法具有简单、快速、高效的特点，可以推广到阿魏酸的含量测定领域，实际应用价值高，对中药材的质量控制具有深远的意义。
(四)附图说明
图1：正离子模式扫描质谱图；
图2：负离子模式扫描质谱图；
图3：川芎全扫模式质谱图；
图4：当归全扫模式质谱图；
图5：藁本全扫模式质谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中用到的仪器如下：
实时直接分析离子源DART SVP(美国Ion Sense公司)；ACQUITY QDa质谱检测器(美国Waters公司)；分析天平，BP211D，德国Sartorius；集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S，巩义市予华仪器有限公司。
实施例1正负离子模式的选择
精密称取0.01g阿魏酸标准品，用70％甲醇水溶液定容到10mL，得到1000mg/L的标准储备液，然后取200ul该溶液到10ml容量瓶中，用70％甲醇水溶液定容，得到20mg/L的标准储备液。用2mL离心管取1mL的20mg/L的标准液，分别在正离子，负离子模式下进样。由图1-2可以看到在正离子模式下背景干扰较大，响应也比负离子模式要低。因此，选择负离子模式对中药材进行定性定量分析。
实施例2离子化气体温度的选择
气体温度对阿魏酸离子化效率的影响很重要，温度过低，离子化不完全，温度过高，可导致阿魏酸部分受热分解。考察了负离子模式下，温度分别为300℃、350℃、400℃、450℃、500℃时的离子化效率，发现在350℃时阿魏酸的响应最大。因此，选择350℃作为离子化气体温度。
实施例3方法学的考察
(1)仪器与试剂
DART SVP离子源、Waters QDa质谱仪。
从杭州华东武林大药房购买川芎、当归、藁本。剔除肉眼可见的树枝、木屑等杂物，研磨成粉末状备用。
(2)实验方法
标准品溶液的制备：精密称定阿魏酸标准品，加70％甲醇水溶液配制成1000mg/L的标准溶液。再逐级稀释配成100、50、20、10、5mg/L的标准储备液。用石英玻璃管蘸取进样，进行实时直接分析-质谱法测定。以阿魏酸m/z 193的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。计算回归方程为：Y＝1474.9X-7867.3，R2＝0.9694。表明阿魏酸在5-100mg/L范围内与峰面积线性关系良好。
供试品溶液的制备：取生药材粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量。加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，过滤，取滤液，即得。
用2mL离心管量取1mL的供试品提取液，用石英玻璃管蘸取进样，蘸取的时候不要碰到离心管的壁和底部，待溶液挥干后进样。待气体温度达到合适的温度，让DART开始运行，待信号稳定后开始移动载样器。
DART条件：负离子模式采集数据，气体温度为350℃，采用Dip-it进样管进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，流速为3L/min，待机气体为高纯氮气。栅极电压为-200V，离子源出口距质谱进口约2.4cm。
Waters QDa质谱条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-250，sim模式下m/z 193，锥孔电压为12V。
(3)结果与讨论
考察该方法的线性、检出限和定量限等参数，结果见表1。从表1中可以看到，阿魏酸在5-100mg/L范围内线性良好，r为0.9846，RSD小于13.39％，因此认为该方法准确性良好，可以用来测定阿魏酸。
表1：阿魏酸的线性、检出限和定量限结果
分别对川芎、当归、藁本中的阿魏酸含量、精密度以及回收率进行测定。图3-5为3种中药材扫描总离子质谱图，采用外标法对样品中的阿魏酸含量进行定量，RSD均小于14.72％，结果见表2。
表2：实际样品中阿魏酸的定量结果
对比例
按照中国药典2015年版中测定川芎中阿魏酸的含量方法：本品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％甲醇50ml，密塞，称定重量.加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤a性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％醋酸溶液(30：70)为流动相；检测波长为321nm。测得的结果是0.170％。
按照中国药典2015年版中测定当归中阿魏酸的含量方法：取本品粉末(过三号筛)约0.lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取得。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硓烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(20:80)为流动相；检测波长为238nm。测得的结果是0.093％。
按照中国药典2015年版中测定藁本中阿魏酸的含量方法：本品粗粉约0.1g，精密称定，10mL具塞离心管中，精密加入甲醇5mL，称定重量，冷浸过夜，超声处理(功率250W，频率40kHz)2分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，吸取上清液，即得。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(40：60)(用磷酸调节pH值至3.5)为流动相；检测波长为320nm。测得的结果是0.089％。

Claims (5)

1.一种实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)绘制标准曲线
称取阿魏酸标准品，用70％甲醇水溶液配制成浓度范围在5～100mg/L梯度浓度的标准溶液，然后进样进行实时直接分析-质谱法测定，得到标准溶液质谱图，以阿魏酸m/z 193的特征峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，进而计算得到标准曲线方程；
所述实时直接分析-质谱法的测定条件为：
实时直接分析条件：负离子模式采集数据，气体温度为350℃，采用Dip-it进样方式进样，载样器滑动速度为0.5mm/s，离子化气体为高纯氦气，待机气体为高纯氮气；
质谱条件：扫描方式为Full Scan，扫描范围m/z 50-250，sim模式下m/z 193，锥孔电压为12V；
(2)试样检测
将生药材试样研磨、过筛，用70％甲醇回流提取，制得试样溶液，所得试样溶液在步骤(1)实时直接分析-质谱法的测定条件下，测得试样溶液质谱图，将试样溶液质谱图中阿魏酸m/z 193的特征峰面积代入步骤(1)得到的标准曲线方程中，获得试样溶液中阿魏酸的浓度，进而计算得出生药材试样中阿魏酸的含量。
2.如权利要求1所述实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述进样采用石英玻璃管蘸取的方式。
3.如权利要求1所述实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述梯度浓度的标准溶液的配制方法为：称取阿魏酸标准品，用70％甲醇水溶液配制成1000mg/L的溶液，再逐级稀释成100、50、20、10、5mg/L的标准溶液。
4.如权利要求1所述实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生药材试样选自：川芎、当归或藁本。
5.如权利要求1所述实时直接分析-质谱法快速测定生药材中阿魏酸含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生药材试样研磨、过筛，70％甲醇回流提取的操作方法为：将生药材试样研磨过四号筛，得到试样粉末，将所得试样粉末按料液比1：90～110加入70％甲醇中，密塞，称定重量，然后加热回流20～40min，降至室温后再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，过滤，收集滤液，即得试样溶液。
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