CN101460066A - 含肉桂物种的提取物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过超临界CO2提取方法制备的肉桂物种植物材料的提取物。
Description
相关申请
本申请要求美国临时申请序列号60/785,012,2006-03-23提交,以及60/873,475,2006-12-07提交,的优先权,在此将它们收作参考。
发明领域
本公开内容部分地涉及具有提高的香精油含量、提高的酚酸(phenolicacid)含量、提高的原花色素(proanthocyanidin)含量和/或提高的多糖(polysaccharide)含量的由肉桂物种(cinnamon species)衍生的提取物,制备此种提取物的方法以及此种提取物的用法。
背景技术
肉桂(cinnamon,锡兰肉桂(Cinnamomum zeylanicum或verum),C.aromaticum,和C.cassia)是一种10-15m高的小常青树,原产于印度南部的热带和斯里兰卡,从海平面到900米的海拔高度都有生长。它具有粗糙厚实的树皮和强壮的树枝。嫩枝为带斑点、泛绿的橙色。叶子具柄,当成熟时似皮革,具有亮绿的上叶面和较浅背面。叶子气味芳香并具有辣味。果实为椭圆形浆果,比黑莓大;酷似橡子坐落在其花托上。果实当成熟时发蓝,带有白点,吃起来味道似刺柏(Juniper),闻起来如芸香(terebine)。煮时,它释放出被称作肉桂油(cinnamonsuet)的油状物。根-树皮的气味像肉桂,味道像樟脑(camphor)似的,可通过蒸馏离析。“肉桂”,这种樟属(cinnamonum)物种的药用部分由从樟属(cinnamoum)物种的嫩枝芽的木栓层(cork)和下面的薄壁组织(parenchyma)上分离下来的干树皮组成。
肉桂物种曾被引入到遍及印度洋和东南亚的岛屿,目前广泛种植于斯里兰卡和印度沿海地区。斯里兰卡是主要生产国,尽管相当一部分肉桂产品来自印度、马来西亚、马达加斯加和塞舌耳群岛。肉桂树皮已在传统东西方医药中使用了几百年。根据传统中医(TCM)的能量理论(energeticstheory),肉桂起到补充身体之火(supplement the body fire)的作用,以温暖和调理脾和肾;因而使它能有效医治胸腹痛、因虚弱引起的腹泻以及肾亏。肉桂的盖仑制剂(galenical preparation)在TCM、传统希腊-欧洲医药和传统印度Ayurvedic和Unani医药中被用作祛风、消化或胃药的化合物成分。德国医药(E)委员会批准了肉桂用于食欲损失以及消化不良症状患者,例如,胃肠道轻度痉挛、胃气胀和肠胃气胀等的内用药。在美国和德国,肉桂被用作草药化合物的祛风和胃药成分,以包括水剂灌注或煎煮、醇类流体提取物或酊剂,以及香精油在内的各种配剂形式使用。它也以多种草药咳嗽、感冒和发烧药方的成分出现。最近的科学证据支持肉桂用于2型糖尿病(NIDDM-非胰岛素依赖型糖尿病)、抗氧化剂活性、抗血小板粘着活性、抗炎症活性、抗菌和真菌活性以及改善脑功能。参见Khan A等.DiabetesCare 26:3215-3218,2003;Anderson RA等.J Agric Food Chem 52:65-70,2004;Jarville-Taylor等.J Am Coll Nutri 20:327-336,2001;Qin R等.HormMetab Res 36:119-123,2004;Vespohl EJ等.Phytother Res 19:203-206,2005;Lee SH等Biochem Pharmacol 69:791-9,2005;Chericoni S等.J Agric FoodChem 53:4762-4765,2005;Lin CC等.Phytother Res 17:7260730,2003;Jayaprakasha GK等.J Agric Food Chem 51:4344-4348,2003;Huss U等.JNat Prod 65:1517-21,2002;Nagai H等.Jpn J Pharmacol 32:813-822,1982;Su MJ等.J Biomed Sci 6:376-386,1999;Shimada Y等.Phytomed11:404-410,2004;Taher M等.Med J Malayia 59B:97-98,2004;Kamath JV等.Phytother Res 17:970-972,2003;Kurokawa M等.Eur J Pharmacol348:45-51,1998;Simic A等.Phytother Res 18:713-717,2004;Tabak M等.J Ethnopharmacol 67:269-277,1999;Kong LD等.J Ethnopharmacol73:199-207,2000;Kwon BM等.Arch Pharm Res 21:147-152,1998;Ka H等.Cancer Lett 196:143-152,2003。
桂皮(cinnamon bark)的化学成分包括香精油(挥发和非挥发性的)、多酚酸、香豆素(coumarin)、树胶(gum)、muscilage、树脂、碳水化物(淀粉、多糖)以及灰分(表1)。从商业和生物学的角度,香精油(特别是肉桂醛(cinnamaldehyde)和萜烯(terpene)类)和多酚酸(特别是黄酮醇(flavonol)糖苷(glycoside)-原花色素和类黄酮(flavonoid)),传统上被认为比其他成分更重要。多酚化合物含有1个以上位于1或多个芳环上的羟基基团(OH)。多酚,特别是类黄酮的物理和化学性质、分析以及生物学活性已经研究多年了。然而,其他化学成分如多糖也可能具有重要的生物学有益的功效。像所有植物一样,桂皮的化学组成随着品种、采伐年龄、气候、土壤和园艺手法之不同而不同。
表1.桂皮的重要化学成分
化学成分 | wt%(干基) |
香精油 | 1-4% |
挥发性油 | |
反式肉桂醛 | (60-80%) |
苯甲醛 | |
2′-羟基肉桂醛 | |
2-甲氧基肉桂醛 | |
2′-苯甲酰氧基肉桂醛 | |
丁子香酚(eugenol) | (最高10%) |
反式-肉桂酸(cinnamic acid) | (5-10%) |
乙酸肉桂酯 | |
肉桂醇(cinnamyl alchohol) | |
芳樟醇(linalool) | |
1,8-桉油精(cineole) | |
单萜烯和倍半萜烯类 | (1-3%) |
α-蒎烯 | |
β-蒎烯 | |
冰片(borneol) | |
多酚 | 5-10% |
黄酮醇糖苷 | |
山柰苷 | |
山柰酚3-O-β-D-吡喃葡糖(glucopyranosyl)-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷(rhamnopyranoside) | |
山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖(apiofuranosyl)-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖苷 | |
山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷 |
类黄酮 | |
羟甲基查耳酮 | |
儿茶素 | |
表儿茶素 | |
花色素 | |
儿茶素/表儿茶素低聚物 | |
3-(2-羟苯基)-丙酸 | |
3-(2-羟苯基)-O-糖苷 | |
原花色素 | |
缩合丹宁 | |
单萜烯草酸钙 | |
树胶 | |
Muscilage | |
树脂 | |
碳水化物 | 80-90% |
淀粉 | |
多糖 | |
灰分 |
发明概述
本发明一个方面涉及一种肉桂物种提取物,它包含具有图6-85中任何一项的实时直接分析(DART,Direct Analysis in Real Time)质谱图的级分。
在另一种实施方案中,该级分包含选自肉桂醛、苯甲醛、肉桂醇、反式-肉桂酸、乙酸肉桂酯、香精油、多酚、多糖及其组合的化合物。
在又一种实施方案中,该级分包含数量大于约2wt%的肉桂醛。在另一种实施方案中,该级分包含数量大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95wt%的肉桂醛。在又一种实施方案中,该级分包含数量介于约65%-约95wt%的肉桂醛。
在另一种实施方案中,该级分包含选自丁子香酚、2′-羟基肉桂醛、2-甲氧基肉桂醛、2′-苯甲酰氧基肉桂醛、芳樟醇、1,8-桉油精、α-蒎烯、β-蒎烯及其组合的香精油。在又一种实施方案中,该级分包含数量介于约1%-约5wt%的香精油。在另一种实施方案中,该级分包含合计为约5%-约40wt%的肉桂醛和香精油。
在进一步的实施方案中,该级分包含选自类黄酮、黄酮醇糖苷及其组合的多酚。在又一种实施方案中,类黄酮选自3-(2-羟苯基)-丙酸、3-(2-羟苯基)-O-糖苷、花色素、表儿茶素、儿茶素、甲基羟基查耳酮、儿茶素低聚物、表儿茶素低聚物、低聚原花色素、聚合原花色素及其组合。在另一种实施方案中,黄酮醇糖苷选自山柰苷、山柰酚3-O-β-D-吡喃葡糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷、山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖苷、山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷及其组合。在进一步的实施方案中,该级分包含约20%-约70wt%多酚。在另一种实施方案中,该级分包含约6wt%肉桂醛和约70wt%多酚。在进一步的实施方案中,该级分包含约40wt%肉桂醛和约20wt%多酚。
在进一步的实施方案中,该级分包含选自葡萄糖、阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、木糖(xylose)、糖醛酸(uronic acid)及其组合的多糖。在另一种实施方案中,该级分包含约30wt%多糖。
本发明另一个方面涉及包含本发明肉桂物种提取物的食品或药物。
在另一个方面,本发明涉及一种制造肉桂提取物的方法,包括顺序地提取肉桂物种植物材料以获得香精油级分、非-丹宁多酚级分和多糖级分,具体包括:a)通过超临界二氧化碳提取来提取肉桂物种植物材料,从而生成香精油级分和第一残余物;b)用热水提取肉桂物种植物材料或来自步骤a)的第一残余物,从而生成多糖级分和第二残余物;以及c)用水醇溶液(hydro-alcoholic solution)提取肉桂物种植物材料、来自步骤a)的第一残余物和/或来自步骤b)的第二残余物,并利用亲和吸附剂方法提纯该提取物,从而获得非丹宁多酚级分。
在进一步的实施方案中,步骤a)包括1)在提取容器中装入磨碎的肉桂物种植物材料;2)在超临界状态下加入二氧化碳;3)令磨碎的桂皮与二氧化碳接触一段时间;以及4)将香精油级分收集在收集容器中。在另一种实施方案中,超临界状态(或条件)包括在35℃-90℃下的60bar-800bar的压力。在另一种实施方案中,超临界状态包括40℃-80℃下的60bar-500bar的压力。在另一种实施方案中,时间是30min-2.5h。在另一种实施方案中,时间是1h。在另一种实施方案中,采用一种超临界二氧化碳分级系统实施对香精油级分的分级、提纯和调整分布型/调型(profiling)。
在另一种实施方案中,步骤b)包括1)令磨碎的肉桂物种植物材料或来自步骤a)的第一残余物与水溶液接触一段足以提取多糖化学成分的时间;以及2)通过醇沉淀从溶液中分离并提纯固态多糖。在另一种实施方案中,水溶液处于80℃-100℃。在另一种实施方案中,水溶液处于80℃-90℃。在进一步的实施方案中,时间是1-5h。在另一种实施方案中,时间是2-4h。在进一步的实施方案中,时间是2h。在又一种实施方案中,醇是乙醇。
在进一步的实施方案中,步骤c)包括:1)令肉桂物种植物材料、来自步骤a)的第一残余物和/或来自步骤b)的第二残余物与水醇溶液接触一段足以提取多酚化学成分的时间;2)将从水醇溶剂混合物中提取的多酚化学成分浓缩醇溶液送过亲和吸附剂树脂塔,在此多酚酸被吸附;以及3)从亲和吸附剂树脂上洗脱提纯的非丹宁多酚化学成分级分,留下丹宁多酚类仍旧吸附在亲和吸附剂树脂上。
在另一种实施方案中,水醇溶液包含乙醇和水,其中乙醇浓度介于10-95wt%。在另一种实施方案中,水醇溶液包含乙醇和水,其中乙醇浓度是25wt%。在进一步的实施方案中,步骤1)在30℃-100℃实施。在进一步的实施方案中,步骤1)在60℃-100℃实施。在另一种实施方案中,时间是1-10h。在又一种实施方案中,时间是1-5h。在进一步的实施方案中,时间是2h。
本发明另一个方面涉及按本发明方法制备的肉桂物种提取物。
在另一种实施方案中,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、(占)肉桂醛重量的1-5wt%肉桂酸、肉桂醛重量的5-15wt%甲基肉桂酸、肉桂醛重量的1-5wt%肉桂醇、肉桂醛重量的20-30wt%β-gualenen/顺式-γ-双ababolene,以及肉桂醛重量的1-5wt%连苯三酚。
本发明另一个方面涉及一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的80-90wt%肉桂酸、连苯三酚的85-95wt%甲基肉桂酸、连苯三酚的20-30wt%香豆酸(coumaric acid)、连苯三酚的15-25wt%高香草酸(homovanillic acid)、连苯三酚的85-95wt%肉桂醛和连苯三酚的10-15wt%苯甲酸苄酯。
本发明另一个方面涉及一种肉桂物种提取物,它包含儿茶素、儿茶素的5-15wt%肉桂酸、儿茶素的5-15wt%甲基肉桂酸、儿茶素的5-15wt%香豆酸、儿茶素的1-10wt%阿魏酸(ferulic acid)、儿茶素的1-5wt% 2-甲氧基苯酚、儿茶素的5-15wt%高香草酸、儿茶素的20-30wt%香草酸(vanillicacid)、儿茶素的1-5wt%苯甲醛、儿茶素的35-45wt%肉桂醛、儿茶素的85-95wt%连苯三酚,以及儿茶素的-15wt%咖啡酸(caffeic acid)。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含β-gualenen/顺式-γ-双ababolene和β-gualenen/顺式-γ-双ababolene的5-15wt%肉桂醛。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛和肉桂醛的10-20wt%β-gualenen/顺式-γ-双ababolene。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、肉桂醛的30-40wt%连苯三酚和肉桂醛的1-10wt%儿茶素/表儿茶素。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、肉桂醛的1-5wt%肉桂酸、肉桂醛的0.5-5wt%甲氧基肉桂醛、肉桂醛的0.1-5wt%丁子香酚、肉桂醛的1-5wt%对-伞花烃(p-cymene)、肉桂醛的0.1-5wt%樟脑、肉桂醛的0.5-5wt%香芹酚(carvacrol)、肉桂醛的25-35wt%石竹烯/草烯(caryophyllene/humulene)、肉桂醛的0.1-5wt%连苯三酚,以及肉桂醛的40-50wt%肉桂酸肉桂酯。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含肉桂酸肉桂酯、肉桂酸肉桂酯的0.5-5wt%甲氧基肉桂醛、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%肉桂醇、肉桂酸肉桂酯的1-5wt%对-伞花烃、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%芳樟醇、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%樟脑、肉桂酸肉桂酯的0.5-5wt%香芹酚、肉桂酸肉桂酯的70-80wt%肉桂醛、肉桂酸肉桂酯的45-55wt%石竹烯/草烯,和肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%连苯三酚。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的5-10wt%肉桂酸、连苯三酚的60-70wt%香豆酸、连苯三酚的1-10wt%阿魏酸、连苯三酚的5-15wt% 2-甲氧基苯酚、连苯三酚的1-10wt%香草酸、连苯三酚的30-40wt%儿茶素/表儿茶素、连苯三酚的1-5wt%苯甲醛、连苯三酚的5-15wt%阿夫儿茶精(afzelechin)/表阿夫儿茶精(epiafzelechin)、连苯三酚的1-10wt%白藜芦醇(resveratrol),和连苯三酚的1-5wt%香兰素(vanillin)。
在另一个方面,本发明涉及一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的0.5-5wt%肉桂酸、连苯三酚的10-20wt%香豆酸、连苯三酚的0.5-5wt%阿魏酸、连苯三酚的1-5wt%2-甲氧基苯酚、连苯三酚的0.5-5wt%高/异香草酸、连苯三酚的1-10wt%香草酸、连苯三酚的25-35wt%儿茶素/表儿茶素、连苯三酚的1-5wt%苯甲醛、连苯三酚的1-5wt%肉桂醛、连苯三酚的0.1-5wt%阿夫儿茶精/表阿夫儿茶精,和连苯三酚的65-75wt%香兰素。
本公开的提取物可用于提供生理学和医学效应,包括但不限于,抗氧化剂活性、氧自由基清除、亚硝化抑制、抗诱变活性(防癌)、抗癌活性(癌症治疗)、皮肤保护、抗老化、抗心血管病、抗中风疾病及疗法、大脑保护、抗高血脂病、抗牙周病、抗骨质疏松、提高免疫力、抗病毒、抗-HIV和抗菌活性,抗真菌活性、抗病毒活性、体重控制及产热、抗糖尿病以及减轻焦虑、提高情绪和改进认知。
本公开的这些实施方案、其他实施方案及其特征和特性在研读了下面的说明和附图以及权利要求之后将会了然。
附图简述
图1表示肉桂提取方法的范例示意图。
图2表示香精油级分制备的范例方法。
图3表示多糖级分制备的范例方法。
图4表示溶剂浸提提取的范例方法。
图5表示提纯多酚级分制备的范例方法。
图6表示肉桂多糖的AccuTOF-DART Mass Spectrum(质谱图)(正离子模式)。
图7表示肉桂多糖的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图8表示桂皮的AccuTOF-DART Mass Spectrum(质谱图)(正离子模式)。
图9表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的桂皮粗提取物的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图10表示采用75%乙醇提取溶剂的桂皮HS#147粗提取物的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图11表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F3的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图12表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F4的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图13表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F5的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图14表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F6的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图15表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F7的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图16表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F8的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图17表示桂皮的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图18表示采用75%乙醇提取溶剂的桂皮HS#147粗提取物的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图19表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的桂皮粗提取物的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图20表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法分离的级分F3的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图21表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法的级分F4的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图22表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法的级分F5的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图23表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法的级分F6的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图24表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法的级分F7的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图25表示用Sephadex LH-20填料的柱色谱法的级分F8的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图26表示从Mountain Rose Herbs购买的肉桂棒的AccuTOF-DARTMass Spectrum(正离子模式)。
图27表示采用SCCO2方法在40℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图28表示采用SCCO2方法在40℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图29表示采用SCCO2方法在40℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图30表示采用SCCO2方法在60℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图31表示采用SCCO2方法在60℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图32表示采用SCCO2方法在60℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图33表示采用SCCO2方法在80℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图34表示采用SCCO2方法在80℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图35表示采用SCCO2方法在80℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图36表示粗肉桂的80%乙醇浸提提取的AccuTOF-DART MassSpectrum(正离子模式)。
图37表示来自粗肉桂的SCCO2提取残余物的80%乙醇浸提提取的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图38表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F4的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图39表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F5的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图40表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F6的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图41表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F7的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图42表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F8的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图43表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F9的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图44表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F10的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图45表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F11的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图46表示从HS114提取的肉桂粗提取物的AccuTOF-DART MassSpectrum(正离子模式)。
图47表示从HS114(SCCO2)提取的肉桂粗提取物的AccuTOF-DARTMass Spectrum(正离子模式)。
图48表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F4在硫解(thiolytic degradation)之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图49表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F5在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图50表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F6在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图51表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F7在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图52表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F8在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图53表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F9在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图54表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F10在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图55表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F11在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(正离子模式)。
图56表示从Mountain Rose Herbs购买的肉桂棒的AccuTOF-DARTMass Spectrum(负离子模式)。
图57表示采用SCCO2方法在40℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图58表示采用SCCO2方法在40℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图59表示采用SCCO2方法在40℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图60表示采用SCCO2方法在60℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图61表示采用SCCO2方法在60℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图62表示采用SCCO2方法在60℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图63表示采用SCCO2方法在80℃和100bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图64表示采用SCCO2方法在80℃和300bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图65表示采用SCCO2方法在80℃和500bar提取的肉桂香精油的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图66表示粗肉桂的80%乙醇浸提提取物的AccuTOF-DART MassSpectrum(负离子模式)。
图67表示来自粗肉桂的SCCO2提取残余物的80%乙醇浸提提取的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图68表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F4的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图69表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F5的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图70表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F6的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图71表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F7的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图72表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F8的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图73表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F9的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图74表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F10的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图75表示HS114 SCCO2残余物采用Sephadex LH-20填料的肉桂乙醇洗脱液级分F11的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图76表示从HS114提取的肉桂粗提取物的AccuTOF-DART MassSpectrum(负离子模式)。
图77表示从HS114(SCCO2)提取的肉桂粗提取物的AccuTOF-DARTMass Spectrum(负离子模式)。
图78表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F4在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图79表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F5在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图80表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F6在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图81表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F7在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图82表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F8在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图83表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F9在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图84表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F10在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
图85表示来自Sepadex LH-20的肉桂乙醇洗脱液级分F11在硫解之后的AccuTOF-DART Mass Spectrum(负离子模式)。
发明详述
定义
这里所使用的术语肉桂指的是源自肉桂物种植物的树皮植物材料。术语“肉桂”也与肉桂物种可互换使用,并涉及所述植物、无性繁殖系(clone)、变体(variants),以及变种(sports)等。
这里所使用的术语“1或多种化合物”是指至少一种化合物,例如但不限于,反式-肉桂醛(肉桂物种的脂溶性香精油化学成分)和甲基羟基查耳酮(一种肉桂物种的水溶性多酚)或肉桂物种的多糖分子,或者指1种以上化合物,例如,反式-肉桂醛和甲基羟基查耳酮。
这里所使用的术语“级分”是指包含以某些物理和/或化学性质为特征的特定化学化合物类别的提取物。
这里所使用的术语“香精油级分”是指包含由肉桂和相关化学物种获得或衍生的溶于脂、不溶于水的化合物,包括但不限于,被划分为反式-肉桂醛的化学化合物。
这里所使用的术语“香精油亚级分”指的是包含由肉桂和相关化学物种获得或衍生的溶于脂、不溶于水的化合物,包括但不限于,被划分为反式-肉桂醛的化学化合物,具有较高浓度存在于肉桂物种的香精油中的特定化合物。
这里所使用的术语“多酚级分”是指包含由肉桂和相关物种获得或衍生的水溶性和乙醇-溶解性多酚酸化合物的级分,还包含但不限于,化合物,例如,甲基羟基查耳酮,和儿茶素和表儿茶素低聚物。
这里所使用的术语“多糖级分”是指包含溶于(水)-不溶于乙醇的、由肉桂和相关物种获得或衍生的级分。
肉桂的其他化学成分也可能存在于这些提取级分中。
这里所使用的术语“提纯的”级分,是指一种级分,它包含被浓缩到了大于该级分的诸化学成分的20%的、以某些物理-化学性质或者物理或化学性质为特征的特定类别化合物。换句话说,提纯的级分包含小于80%不是以定义该级分的某些要求的物理-化学性质或物理或化学性质为特征的化学成分化合物。
这里所使用的术语“分布型(profile)”是指提取级分或亚级分内化学化合物的物质重量百分比的比例,或最终肉桂提取物中3种肉桂级分化学成分中每一种所占物质重量百分比的比例。
这里所使用的术语“原料”一般指生的植物材料,包含单单是整个植物,或与1或多个植物的组成部分的组合,包括叶、根、包括但不限于主根、尾根(tail roots)和须根(fiber roots)、茎、树皮、叶、种子和花,其中植物或组成部分可包括生的、干的、蒸过的、加热过的或以其他物理方法加工过以促进加工的材料,其还可进一步包括原封、剁碎、切片、磨碎、研磨或用其他方式处理过以影响植物材料的尺寸和物理完整性的材料。有时,术语“原料”可用于表征准备用作附加提取处理用的进料源的提取产物。
这里所使用的术语“肉桂成分”应理解为存在于肉桂物种中的化学化合物并应包括所有上面提到的此类化学化合物以及其他存在于肉桂物种中的化合物,包括但不限于,香精油化学成分、多酚酸和多糖。
肉桂的化学成分具有广泛药用价值。最近的科学研究和临床研究展示肉桂的各种化学化合物、化学级分和粗提取产物的下列疗效,包括:NIDDM-2型糖尿病(原花色素、甲基羟基查耳酮、儿茶素和表儿茶素低聚物、类黄酮、水溶性提取物);改进胆固醇代谢,包括降低低密度脂蛋白(酚酸,包括原花色素、甲基羟基查耳酮、儿茶素、表儿茶素低聚物、类黄酮、水溶性提取物);抗动脉损伤性自由基和改进小血管功能(香精油、肉桂醛、2′-羟基肉桂醛、2′-甲氧基肉桂醛、酚酸、类黄酮糖苷、原花色素、类黄酮、儿茶素、表儿茶素低聚物,提取物);抗血栓和抗血小板凝聚(香精油、肉桂醛);抗炎活性(香精油、肉桂醛、丁子香酚、1,8-桉油精、α-蒎烯、β-蒎烯、冰片、黄酮醇糖苷,提取物);抗氧化剂(酚酸、黄酮醇糖苷、原花色素、类黄酮、水溶性提取物);抗过敏(酚酸、黄酮醇糖苷、原花色素、类黄酮、水溶性提取物);神经学保护剂(水溶性提取物);心血管保护剂(香精油、水溶性提取物);提高脑功能(香精油,特别是挥发性油);祛风剂、胃口不佳、消化不良的主诉患者、抗呕吐、抗胃肠鼓胀、促进肠道蠕动、促进增重(类黄酮、3-(2-羟苯基)-丙酸、3-(2-羟苯基)-O-糖苷,水溶性提取物);镇咳、抗普通感冒发烧(香精油、乙酸肉桂酯);抗菌及抗真菌活性(香精油、肉桂醛、丁子香酚、1,8-桉油精、β-蒎烯、冰片);脂解及改善伤口愈合(乙醇提取物);以及抗癌及抗痛风(香精油、肉桂醛、2′-羟基肉桂醛、2′-苯甲酰氧基肉桂醛,甲醇提取物);参见Khan A等Diabetes Care26:3215-3218,2003;Anderson RA等J Agric Food Chem 52:65-70,2004;Jarville-Taylor等J Am Coll Nutri 20:327-336,2001;Qin R等Horm Metab Res 36:119-123,2004;Vespohl EJ等Phytother Res19:203-206,2005;Lee SH et al Biochem Pharmacol 69:791-9,2005;Chericoni S等J Agric Food Chem 53:4762-4765,2005;Lin CC等Phytother Res 17:7260730,2003;Jayaprakasha GK等J Agric FoodChem 51:4344-4348,2003;Huss U等J Nat Prod 65:1517-21,2002;Nagai H等Jpn J Pharmacol 32:813-822,1982;Su MJ等J Biomed Sci6:376-386,1999;Shimada Y等Phytomed11:404-410,2004;Taher M等Med J Malayia 59B:97-98,2004;Kamath JV等Phytother Res17:970-972,2003;Kurokawa M等Eur J Pharmacol 348:45-51,1998;Simic A等Phytother Res 18:713-717,2004;Tabak M等JEthnopharmacol 67:269-277,1999;Kong LD等J Ethnopharmacol73:199-207,2000;Kwon BM等Arch Pharm Res 21:147-152,1998;KaH等Cancer Lett 196:143-152,2003。
花色素是一类造成许多水果、蔬菜、谷物和花卉呈红、紫和蓝颜色的特定天然类黄酮化合物。例如,水果如蓝莓(blueberries)、越桔(bilberries)、草莓(strawberries)、树莓(raspberries)、波森莓(boysenberries)、马里恩莓(marionberries)、蔓越橘(cranberries)、接骨木果(elderberries)等的颜色是因为有许多不同的花色素所致。近来,对于花色素颜料的兴趣有所增长,因为它们可能具有作为食用抗氧化剂的保健效果。例如,越桔(Vaccinium myrtillus)的花色素颜料长期以来被用于改善视力和治疗循环障碍。实验证据表明,某些花色素和其他类黄酮具有抗炎性能。另外,据报道,口服花色素具有治疗糖尿病和溃疡的功效并可能具有抗病毒和抗微生物活性。这些类黄酮的可心性能的化学基础据信与其抗氧化剂能力有关。因此,与浆果和其他水果和蔬菜相联系的抗氧化剂特性一直被归因于其花色素内容物。
原花色素(proanthocyanidin),亦称作“低聚原花色素”,"OPC",或“原花色素(procyanidin)”,是另一类自然界中广泛存在的类黄酮化合物,存在于水果、蔬菜、坚果、种子、花和树皮中。原花色素属于被称作缩聚丹宁的一类。它们是水果和蔬菜中最常见的丹宁类型,大量存在于种子和表皮中。在自然界,不同原花色素的混合物常常共存一体,从单个的单元到多个单元连接而成的复杂分子(低聚物或聚合物)。聚合原花色素的一般化学结构包括类黄酮3-醇单元通过共同C(4)-C(6)和/或C(4)-C(8)键连接在一起的线型链。原花色素是含儿茶素和/或表儿茶素单元通过C4-C8和/或C4-C6键连接的低聚物和聚合物的混合物。这些黄烷-3-醇还可由C4-C8键和附加的C7-C2之间的醚键双重连接。13C NMR可用于识别聚合原花色素的结构,最近的工作已揭示二-、三-和四聚原花色素的化学。类黄酮-3醇单元的较大低聚物在大多数植物中占主导地位,并以高于2,000道尔顿的平均分子量存在,且包含6或更多个单体单元。(Newman,等,Mag.Res.Chem.,25:118(1987))。最近相当多的研究开拓了原花色素的治疗学应用,主要以其抗氧化剂活性而著称。然而,这些化合物,据报道,还展示了抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗过敏和血管舒张作用。另外,它们据发现还抑制脂的过氧化、血小板凝聚、毛细血管渗透和脆性,并影响酶体系,包括磷脂酶A2、环氧合酶、脂氧合酶。例如,原花色素单体(即,花色素)和二聚体已被用于治疗与毛细血管脆性增加相联系的疾病并还证明在动物中具有抗炎效果(Beladi,I.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,284:358(1977))。根据这些报道的发现,低聚原花色素(OPC)可能是治疗多种病症的有用成分(Fine,A.M.,Altern.Med.Rev.5(2):144-151(2000))。
原花色素也可具有防病毒保护作用。在体外研究中,来自金缕梅(Hamamelis virginiana)的原花色素杀灭了单纯性疱疹(Herpes simplex)1(HSV-1)病毒(Erdelmeier,C.A.,Cinatl,J.,Plant Med.June:62(3):241-5(1996);DeBruyne,T.,Pieters,L.,J.Nat.Prod.Jul:62(7):954-8(1999))。实施的另一项研究旨在确定各种不同丹宁的抗病毒活性的结构-活性关系。据发现,化学结构缩合程度越高,抗病毒作用越大(Takechi,M.,等,Phytochemistry,24:2245-50(1985))。在另一些研究中,原花色素表现出具有抗单纯性疱疹活性,其中减少单纯性疱疹斑形成所需要的50%有效剂量比50%细胞毒性剂量小2-3个数量级(Fukuchi,K.,等,Antiviral Res.,11:285-298(1989))。
环氧合酶(COX-1、COX-2)或前列腺素内过氧化物H合酶(PGHS-1,PGHS-2)被广泛用于测量植物产物的抗炎效应(Bayer,T.,等,Phytochemistry,28:2373-2378(1989);和Goda,Y.,等,Chem.Pharm.Bull.,40:2452-2457(1992))。COX酶是非类固醇抗炎药剂的药理学标靶部位(Humes,J.L.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:2053-2056(1981);和Rome,L.H.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72:4863-4865(1975))。前列腺素合成中涉及到的环氧合酶的2个同功酶是环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)(Hemler,M.,等,J.Biol.Chem.,25:251,5575-5579(1976))。有人假定,选择性COX-2抑制剂是抗炎活性的主要贡献因素(Masferrer,J.L.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:3228-3232(1994))。目前正在研究类黄酮作为抗炎物质及其环氧合酶(COX)抑制活性的结构特征。
虽然肉桂一般是安全和无毒的,即便以高剂量给药,但它可能在对肉桂或秘鲁轻木(Peruvian balsa)敏感的个体上诱发过敏反应。不建议在怀孕和哺乳期间服用。目前尚无已知的与其他药物之间的相互作用。
目前,需要一种新颖和可重复肉桂提取物,它结合了提纯的香精油、具有高黄酮醇糖苷和类黄酮的提纯的多酚、和多糖化学成分级分,其能以标准和可靠数量的这些协同作用的、生理学和医学上有益的肉桂化学成分的形式制造。Williamson EM.Phtomedicine 8:401-409,2001。
提取物
香精油级分
桂皮富含香精油并提供各种不同油,取决于使用的植物的部位。据报道,在桂皮中有1-2wt%香精油。桂皮油的主要组分是芳族醛-3-苯基-2(E)-丙烯醛,亦称作肉桂醛(约占香精油的60wt%)。
桂皮被用作本研究的原料。超临界二氧化碳提取和分级技术被选择用于提取,由于它对于脂溶性化学品的加工具有众所周知的优越性。它之所以对提取很有用是因为兼备气体似的传质性质和液体似的溶剂化特性,其扩散系数大于液体溶剂的。提取出来的香精油成分利用气相色谱-质谱法进行分析。从通过超临界CO2提取出的桂皮油总共认出71种化合物。除了主要肉桂醛的同类物(congeners),例如,苯甲醛(P1)、肉桂醛(P10和P14)、肉桂醇(P16)、反式-肉桂酸(P23)、乙酸肉桂酯(P25)之外,其他次要化合物,包括:4种单萜烯、16种倍半萜烯、9种脂肪酸及其衍生物,以及6种类固醇(P64和P67-P71)也被查出。脂肪酸和类固醇此前未见报道过存在于肉桂油中。
据发现,超临界CO2是一种提纯和调型(profiling)香精油级分的极佳工具。这些级分的提取收率随着加工温度、压力和溶剂/进料比而变化。最高提取收率是1.76wt%,在80℃的温度和100-500bar的压力以及溶剂/进料比等于114的条件下。在粗提取桂皮香精油中,肉桂醛占到提纯的级分的58%-69wt%。据发现,在提取物级分中,在约40℃的低温下提取物中的最高20%类固醇化合物可提取出来。高纯度肉桂醛的同类物(大于90%)可在60-90℃的高温和约100bar的低压下获得。高的压力和温度有利于脂肪酸化合物的加工,在提取物级分中最高纯度可达约10%。
粗提取的桂皮香精油还可通过在固定温度下顺序地提高加工压力利用多级加工进行分级。结果示于表2。发现,主要化合物肉桂醛同类物可调型在67.1-93.1%之间。其他次要化合物,例如,倍半萜烯,可调型在1.1-2.7%;脂肪酸可调型在0.9-9.9%;类固醇只能在40℃的温度才能提取出来,并调型在占级分重量的0.0-20.3wt%(相对丰度)。肉桂醛的最高纯度可达91.13%,这相当于桂皮原料中的76倍。
表2.在不同条件下获得的肉桂香精油化合物在提取物中的分布型
酚酸级分
肉桂的抗氧化剂活性与酚酸化学成分的含量有关。在肉桂中发现的具体抗氧化剂植物化学品包括以下酚酸:表儿茶素、莰烯(camphene)、丁子香酚、γ-萜品烯(terpinene)、苯酚、水杨酸和丹宁。最近,美国农业部的科学家发现一种类型的类黄酮、A-型原花色素,由水提取、具有类似于胰岛素的效应。该化合物能增强胰岛素在离析的脂肪组织细胞中的作用。体内研究也显示,肉桂的水提取物通过增加葡萄糖的摄取改善胰岛素的作用,部分地通过改善骨骼肌中的胰岛素-信号通路(insulin-signaling pathway)来起作用。本发明这一节的目的是通过去除丹宁酸来提纯酚酸。因其低血糖活性令人感兴趣的酚酸是原花色素。原花色素是包含通过C4-C8和/或C4-C6键连接的(+)-儿茶素和/或(-)-表儿茶素单元的低聚物和聚合物(B-型)。这些黄烷-3-醇也可由C4-C8键和C7-C2键之间的附加醚键双重连接(A-型)。由于缺乏市售供应的HPLC参照标准(物),故采用Folin-Ciocalteu方法来分析总酚酸含量并采用可蛋白沉淀的酚类方法来分析总丹宁酸含量。总酚酸中的各个酚酸则由按实时直接分析(DART)质谱法加以识别和半定量化。
在桂皮原料中,有约4.87%总酚酸,其中约2.27%是非丹宁酚酸,约2.61%是丹宁酸。总酚酸提取条件通过研究不同溶剂、温度、pH值以及多级加工的效果加以优化。据发现,含水乙醇(25-75%乙醇)是最佳提取溶剂。最高提取收率据发现为约17.6%,采用25%乙醇作为提取溶剂,在40℃的温度采用2级处理,溶剂/进料比分别为10和5。加工期间不需要改变pH值。
Sephadex LH-20葡聚糖(dextran)珠据发现是从丹宁酸中分离非丹宁酚酸的极佳介质。结果示于表3。据发现,丹宁酸被大大去除,同时非丹宁酚酸被提纯到最高100%(原料中的44倍)。
表3.Sephadex LH-20处理期间肉桂酚类重量百分率的改变。
多糖级分
肉桂多糖-糖蛋白级分是通过水提取和80%乙醇沉淀获得的。提纯的肉桂多糖-糖蛋白级分的收率为约3.5%。肉桂多糖的纯度为0.29-0.47g葡聚糖当量/g多糖。(葡聚糖被用作参照标准是因为手头没有肉桂多糖的标准物)。肉桂多糖的平均分子量是约2500KDa。AccuTOF-DART质谱法被用来鉴定肉桂多糖,结果示于图6和7。
提取物,相对于天然肉桂物种而言
本公开内容包括从1或多种肉桂物种中离析和提纯的香精油级分(或香精油亚级分)、多酚酸和多糖的提取物。这些各个级分可按照特定比例(分布型)组合以提供效用的组合并可提供目前公知提取产物中没有的可靠或可重复的提取产物。例如,来自1个物种的香精油级分或亚级分可与来自相同或不同物种的香精油级分或亚级分组合,或者与来自相同或不同物种的多酚酸级分组合,而这样的组合可以或未必与来自相同或不同肉桂物种的多糖级分组合。
本公开内容的提取物也可用相对于天然肉桂物种中存在的那些的浓度而论来定义。实施方案还包括这样的提取物,其中1或多种级分,包括香精油、多酚酸或多糖以比大于在天然肉桂物种植物材料中存在的浓度存在。实施方案还包括这样的提取物,其中1或多种级分,包括香精油、多酚酸或多糖以比小于在天然肉桂物种中存在的浓度存在。肉桂物种的生物-活性化学成分级分的公知数量(表1)作为本公开内容的例子使用。例如,本公开内容的提取物包括这样的级分,其中香精油的浓度是天然肉桂物种的0.001-50倍,和/或这样的组合物,其中要求的多酚酸的浓度是天然肉桂物种的0.001-50倍,和/或这样的组合物,其中溶于水-不溶于乙醇的多糖的浓度是天然肉桂物种浓度的0.001-20倍。
本公开内容的提取物包括这样的级分,其中香精油的浓度是天然肉桂物种浓度的0.01-50倍,和/或这样的组合物,其中要求的多酚酸浓度是天然肉桂物种浓度的0.01-50倍,和/或这样的组合物,其中多糖浓度是天然肉桂物种浓度的0.01-20倍。而且,本公开内容的提取物包含这样的香精油化学成分的亚级分,它具有至少1或多种天然植物材料香精油中存在的化学化合物,其含量大于或小于天然肉桂植物材料香精油化学成分中存在的。例如,化学化合物,反式-肉桂醛,在一种香精油亚级分中的浓度可从其在天然肉桂植物材料中总香精油化学成分的60wt%的浓度增加到(占)亚级分的80wt%。相比之下,反式-肉桂醛在一种香精油亚级分中的浓度可从其天然植物材料中总香精油化学成分的约60wt%的浓度降低至约占亚级分的6wt%,10倍的浓度缩小。本公开内容提取物包括这样的级分,其中特定化学化合物在此种新颖香精油亚级分中的浓度或者相对于天然肉桂香精油化学成分中存在的浓度增加约1.1-约10倍,或者缩小约0.1-约10倍。
另一些实施方案包括这样的提取物,其包括分布型(分布比例)改变的肉桂物种的化学成分,相对于天然植物材料中存在的或目前现有的肉桂物种提取产物而言。例如,香精油级分可相对于多酚酸和/或多糖浓度而言增加或降低。类似地,多酚酸或多糖可相对于其他提取成分级分增加或降低,以便允许新颖成分化学分布型提取物发挥特定生物学效应。通过香精油、多酚和/或多糖之一或多种的离析和提纯的级分的组合,可制成提供新颖香精油组合的提取物。
本公开内容的方法包括提供一种用于治疗和预防人类疾病的新颖肉桂提取物。例如,一种用于治疗2型糖尿病的新颖肉桂物种提取物可具有,与肉桂物种天然植物材料或传统公知提取产物中存在的相比,重量百分数提高的多酚级分浓度和降低的香精油和多糖级分浓度。一种抗氧化剂、抗血管损伤和缺血性脑血管疾病用的新颖肉桂物种提取物可具有,与天然肉桂物种植物材料或传统公知提取产物中存在的相比,重量百分数提高的香精油和多酚酸级分和降低的多糖级分。另一种新颖的用于治疗过敏性疾病的肉桂物种提取物包括这样的级分,与天然肉桂物种植物材料或传统公知提取产物中存在的相比,其具有提高的多酚级分浓度、提高的多糖级分以及降低的香精油级分。
提取方法
下面所讲的方法可单独也可与本领域技术人员公知的已公开方法组合使用。用于提取的起始材料是来自1或多种肉桂物种的植物材料。该植物材料可以是植物的任何部分,虽然树皮是最优选的起始材料。
肉桂物种植物材料可接受预提取步骤处理以便将材料转变为任何特定形式,以及任何可用于本公开内容所考虑的提取的形式。此种预提取步骤包括但不限于,其中将材料剁碎、切碎、绞碎、磨碎、粉碎、切削或撕碎,然后该起始材料,在预提取步骤之前,进行干燥或是新鲜植物材料。优选的预提取步骤包括将肉桂物种树皮材料研磨和/或粉碎成为细粉末。起始材料或预提取步骤后的材料可进行干燥或给它加湿。一旦肉桂物种植物材料为用于提取的形式,本公开内容就考虑提取方法。
本公开内容的提取方法包括这里所公开的方法。一般而言,本公开内容方法包括,部分地,这样的方法,其中肉桂物种植物材料利用以二氧化碳为溶剂的超临界流体提取(SFE)进行提取(SCCO2),随后是1或多个溶剂提取步骤,例如但不限于,水、水醇,以及亲和聚合物吸收剂提取步骤。本公开内容考虑的其他附加方法包括肉桂物种植物材料利用其他有机溶剂、冷冻剂化学品、可压缩气体、超声处理、加压液体提取、高速逆流色谱法、分子印迹聚合物的提取,以及其他公知的提取方法。此类技术乃是本领域技术人员公知的。在一个方面,本公开内容的提取物可采用包括图1-5所图示的步骤的方法制备。
本公开内容包括采用SCCO2技术从肉桂植物材料浓缩(提纯)并调型香精油或其它脂溶性化合物的方法。本公开内容包括将肉桂的脂溶性化学成分分级为,例如,高纯度香精油级分(高香精油化学成分浓度)。另外,本公开内容包括一种SCCO2方法,其中提取级分内的各个化学成分可改变其化学成分的比例或分布型。例如,香精油级分内化学成分的SCCO2分级分离允许相对于其他香精油化合物择优地提取某些香精油化合物,结果可生产出一种香精油提取物亚级分,其中某些化合物的浓度大于其他化合物的浓度。肉桂物种香精油化学成分按本公开内容以SCCO2的提取避免了有毒有机溶剂的使用并提供各种提取物的同时分级。二氧化碳是天然和安全的生物产品和多种食品和饮料中的成分。
在实施上面所述提取方法的过程中发现,可以大于80wt%的收率将纯度大于95%的肉桂物种原干燥桂皮原料中香精油化学成分提取到香精油SCCO2提取物级分中(步骤1A)。采用步骤1B中所述方法(SCCO2提取和分级方法),香精油收率由于香精油化学成分被分级为高度提纯(>90%)的香精油亚级分而下降。另外,本公开内容所教导的SCCO2提取和分级方法允许改变含香精油化学成分级分的各个化学化合物的比例(分布型),因此可创造出用于特殊医药目的的独特香精油亚级分分布型。例如,类固醇香精油化学成分的浓度可提高,而同时降低脂肪酸化合物的浓度,反之亦然。
采用本公开内容步骤2所教导的方法,从总酚酸浓度26.0%的原肉桂物种原料中获得一种水溶性级分,收率4.8wt%,天然桂皮原料中存在的酚酸化学成分的约10wt%的收率。然而,该水溶剂提取物不含宝贵的溶于水-不溶于乙醇的多糖化学成分。另外,该提取步骤达到约100%在天然肉桂物种植物材料中存在的溶于水-不溶于乙醇的多糖的收率。在该水溶性提取物级分中,该水溶性提取级分中的多糖浓度为约27wt%干基。采用95%乙醇沉淀该多糖,可从该水浸提提取物中收集提纯的多糖级分。该多糖级分的收率为约1.3wt%,以肉桂根茎原料为基准计。基于比色分析方法,以葡聚糖作为参照标准,可获得>95%肉桂多糖化合物的纯度。
采用如本公开内容步骤3所教导的方法,从原肉桂物种原料中获得一种水醇浸提级分,收率17.6wt%,酚酸浓度达64%,约1/3酚酸为非生物活性的丹宁。这进而相当于天然肉桂物种植物材料中存在的酚酸相关化学成分的约90%的收率。
采用如本公开内容步骤4所教导的方法(亲和吸附剂提取方法或工艺色谱法)、可获得纯度大于(占)提取级分的95wt%(干基)的多酚酸级分,其中丹宁含量小于0.1wt%。可能从水醇浸提提取物进料中提取出约77%非丹宁多酚酸。这相当于天然肉桂物种植物材料中存在的多酚酸化学成分的69%的收率。根据平均聚合度,提纯的多酚酸级分基本上由有益的生物活性多酚低聚物构成。
另外,可调型提纯的多酚级分的多酚化学成分。例如,可获得含高浓度多酚三聚体或四聚体的提纯的多酚亚级分。此种新颖提纯的多酚亚级分可具有针对特定医学症状的巨大价值。
最后,本公开内容所教导的方法允许将肉桂物种香精油化学成分级分、新颖的多酚级分或亚级分以及新颖的多糖级分提纯(浓缩)至高达99wt%香精油级分中要求的化学成分,高达97wt%的多酚酚级分,以及高达98wt%的多糖级分。采用的具体提取环境、提取速率、溶剂和提取技术取决于原材料的起始化学成分分布型,以及对最终提取产物中所要求的提纯程度。本公开内容所教导的具体方法可由本领域技术人员利用不外乎常规实验的手续方便地确定,这些实验通常用于调节某方法以考虑被加工成具有特定属性的输出材料的起始材料的属性的样品变化。例如,在特定批次的肉桂物种植物材料中,采用本领域技术人员公知的如本公开内容所教导的技术确定香精油化学成分、多酚酸和多糖的初始浓度。本领域技术人员能够确定,为达到最终肉桂物种提取产物要求的浓度和/或化学分布型,采用提取方法,如本文中公开的,从香精油化学成分的初始浓度变为,例如,最终提取产物的香精油化学成分的预定量或分布(分布型)的改变量。
在图1-5中画出肉桂生物活性化学成分的提取方法的示意图。该提取方法典型地但不限于4个步骤。
步骤1:肉桂香精油的超临界流体二氧化碳提取
鉴于香精油的疏水本性,非极性溶剂,包括但不限于,SCCO2、己烷、石油醚和乙酸乙酯可用于该提取方法。鉴于香精油的某些成分具有挥发性,故也可采用水蒸气蒸馏作为提取方法。
香精油化学成分利用SCCO2从肉桂物种树皮中提取的一般性描述图示于图2-步骤2A和2B。原料10是干燥磨碎的桂皮(约140目)。提取溶剂210是纯二氧化碳。乙醇可用作助溶剂。原料被装入到SFE提取容器20中。吹洗并做泄漏实验后,该方法包括液化CO2从储罐经冷却器流到CO2泵。该CO2被压缩至要求的压力并流经提取容器中的原料,在此,压力和温度维持在要求的水平。提取压力从约60bar到800bar,温度从约35℃到约90℃。这里教导的SCCO2提取优选地在至少100bar的压力和至少35℃的温度,更优选在介于约60bar-500bar的压力和约40℃-约80℃的温度实施。单级提取用的提取时间介于约30min-约2.5h,到约1h。溶剂对进料之比(溶剂-进料比)一般介于约60-1,对每级SCCO2提取而言。CO2循环使用。提取、提纯并调型的香精油化学成分30随后被收集在收集器或分离器中,并放在遮光保护的玻璃瓶中,存放在4℃黑暗冰箱内。肉桂原料10材料可在一步法(图2,步骤2A)中进行提取,其中所获提取并提纯的肉桂香精油级分30被收集在1个收集器SFE或SCCO2系统20中,或在多级(图2,步骤2B)中提取,其中提取、提纯并调型的肉桂香精油亚级分50、60、70、80分别并顺序地被收集在1个收集器SFE系统20中。替代地,正如在分级SFE系统中那样,可将SCCO2提取的肉桂原料材料隔离放在各个收集容器(分离器)中,以便在每一个收集器内,在所收集的提纯的香精油亚级分中的每一个中,存在不同相对百分比的香精油化学成分级分(分布型)。残余物(剩余部分)40被收集起来,存放并用于进一步加工以获得提纯的肉桂物种酚酸和多糖的级分。本公开内容的实施方案包括在60bar-500bar的压力和35℃-90℃的温度采用多级SCCO2提取方法对肉桂物种原料进行提取,并在每一级之后收集所提取的肉桂材料。本公开内容的第二实施方案包括在60bar-500bar的压力和35℃-90℃的温度采用分级SCCO2提取方法对肉桂物种原料进行提取,并将提取的肉桂材料按规定间隔(时间)并且在规定条件(压力、温度和密度)下收集在不同收集容器中。所获来自多级提取器中每一个或者在不同收集容器(分级系统)中的提取的肉桂提纯的香精油亚级分,可取出并独立地使用,或者可合并形成1或多个含有预定香精油化学成分浓度的肉桂香精油级分,该浓度高于或低于天然植物材料中或传统肉桂提取产物中存在的浓度。就典型而言,采用单一步骤最大限度SCCO2提取,从肉桂物种得到的香精油级分的总收率为约0.4-约1.8wt%(>85%的香精油化学成分),具有大于提取物的95wt%的香精油化学成分纯度。此种提取方法的结果载于下表4。该程序可见诸于实施例1。
表4.单级SFE肉桂香精油提取的HPLC分析
T(℃) | P(bar) | 密度(g/cc) | S/F | 收率(%) | CND纯度(%) | CND收率(%) |
40 | 80 | 0.293 | 57 | 0.46 | 69.1 | 0.32 |
40 | 100 | 0.64 | 57 | 0.87 | 60.2 | 0.53 |
40 | 120 | 0.723 | 57 | 0.87 | 61.5 | 0.53 |
40 | 300 | 0.915 | 57 | 1.27 | 58.0 | 0.74 |
60 | 80 | 0.195 | 38 | 0.34 | 65.4 | 0.22 |
60 | 100 | 0.297 | 38 | 0.34 | 68.1 | 0.23 |
60 | 120 | 0.448 | 38 | 0.43 | 67.1 | 0.29 |
60 | 300 | 0.834 | 38 | 1.14 | 58.7 | 0.67 |
80 | 100 | 0.226 | 19 | 0.49 | 68.0 | 0.33 |
80 | 300 | 0.751 | 19 | 1.14 | 59.6 | 0.68 |
该结果展示压力对提取动力学的影响。较高提取压力使系统以较少量CO2消耗在较短时间内达到平衡。总提取收率随着提取压力的提高而增加,因为密度随压力增加而增加。有趣的是,在例如100-300bar的较低压力下,温度越低,收率越高,还是与较高密度有关。在较高压力,例如,300-500bar,温度对提取收率的影响小得多。虽然采用大于200bar的压力可实现较高收率和较高提取效率,但采用小于300bar的压力和介于约40-80℃的温度可达到95%的香精油化学成分纯度。
在所考察的实验范围内可以清楚地看出,在温度与密度之间存在着竞争效应。这方面在文献中做了充分定义和记载,其中在恒温下,压力提高导致收率提高,因为超临界和近临界流体溶剂化能力的改善。提高温度促使有利于提取的化合物蒸汽压的提高。另外,扩散系数的增加和溶剂粘度的降低,随着温度升高到较高数值,也有助于化合物从草本多孔基质中提取。另一方面,在恒定系统压力下,温度升高导致溶剂密度的降低。
采用GC-MS分析,在桂皮香精油中分离并识别出71种化合物。通过比较样品的质谱数据与科学文献中的数据,识别出肉桂醛、香豆素和乙酸肉桂酯。(表3和4)除肉桂醛及其同类物如苯甲醛(P1)、肉桂醛(P10和P14)、肉桂醇(P16)、反式-肉桂酸(P23),以及乙酸肉桂酯(P25)外,4种单萜烯(P6、P8和P9)、16种倍半萜烯(P20-22、P26、P29、P31-2、P35-42和P46)以及9种脂肪酸衍生物被认出。其他少量芳族和脂族化合物也存在。从识别出的化合物当中,SFE能够提取出以前从未在肉桂香精油中查出的脂肪酸和类固醇化合物。这些化合物占到香精油化学成分的约90wt%。肉桂醛是肉桂香精油的主要化学成分,占约70-91wt%。在40℃和120bar条件下从提取物中识别出更多种类化合物,纯度达近100%,高于在较高温度和压力的SFE提取条件下的纯度。采用60℃的SFE温度和100bar达到大于90wt%的肉桂醛纯度,同时损失类固醇化合物和低级脂肪酸和倍半萜烯的纯度。类固醇化合物只有在40℃的低温才能提取出来。在40℃的SFE温度和80bar,类固醇化合物化学成分纯度高达20wt%。相比之下,较高SFE温度(60-80℃)和压力(500bar)有利于脂肪酸化合物的提取。这些数据指出,SCCO2具有调节肉桂香精油化学成分的分布型的能力。
步骤2.水浸提方法及多糖沉淀
肉桂物种化学成分的多糖提取物级分在科学文献中被定义为“溶于水、不溶于乙醇的提取级分”。采用水溶剂浸提和乙醇沉淀方法从肉桂物种提取物中提取多糖级分的一般描述示意地图示在图3-步骤2中。原料10或40是天然磨碎的肉桂物种植物材料或来自步骤1的SFE提取方法的固体残余物。这些原料分2级进行浸提提取。溶剂是蒸馏水220。在该方法中,肉桂物种原料10或40以及提取溶剂220被装入到提取容器100、110中并进行加热和搅拌。它可被加热到100℃,到约80℃,或到约80-90℃。提取进行约1-5h,约2-4h,或约2h。2-级的提取溶液300+320合并,然后该淤浆进行过滤120,离心130并收集上层清液和蒸发140以去除水,直至溶液中的化学品浓度提高至约8倍,330。然后,用无水乙醇230恢复至原来的溶液体积,使最终乙醇浓度达到95%。观察到大沉淀物150。溶液进行离心处理160,滗析170,上层清液残余物340可留待进一步加工。沉淀产物350是提纯多糖级分,可采用比色法以葡聚糖,5,000-410,000分子量,作为参照标准分析其多糖。实际步骤可见诸于实施例3。用3种不同分子量葡聚糖作为标准物,该提取的多糖级分的纯度分别为约29、35和47%,总收率为原天然桂皮原料重量的1.3wt%。汇总这3个葡聚糖标准的纯度测定值得出大于95%的非常高水平的纯度。另外,利用AccuTOF-DART质谱法(见实施例一节)进一步调型包括该提纯的多糖级分的化合物的分子量。实际程序可见诸于实施例一节。
步骤3.用于粗多酚酸级分提取的水醇浸提方法
在一个方面,本公开内容包括生物活性多酚酸化学成分的提取和浓缩。该步骤的一般描述图示于图4-步骤3。该步骤2提取方法是溶剂浸提方法。该提取用的原料是肉桂物种磨碎的干桂皮材料10或分别来自香精油化学成分的SCCO2提取的残余物40或步骤2多糖提取-沉淀的330+340。提取溶剂240是含水乙醇。提取溶剂可以是10-95%含水乙醇,25%含水乙醇是优选的。在该方法中,肉桂原料和提取溶剂被装入到被加热和搅拌的提取容器400中。它可加热至100℃,至约90℃,至约80℃,至约70℃,至约60℃,或至约30-50℃。提取进行约1-10h,约1-5h,约2h。获得的提取物溶液进行过滤410并离心420。滤液(上层清液)500、520、540作为产物收集,测量其体积以及溶剂蒸发之后的固体干物质含量。提取残余物料530可保持不动或储存起来留待进一步加工或丢弃。该提取可重复进行多次,根据需要和/或要求。它可重复2或更多次,3或更多次,4或更多次等等。例如,图1-步骤2表示一种3-级过程,其中第二级和第三级采用相同方法和条件。
有趣的是,残余肉桂醛用该水醇浸提提取方法提取的结果表明,采用上面的SFE条件,并非所有香精油化学成分都达到相对穷尽的提取程度。而且,相当数量的丹宁被提取,占到提取产物的20%以上。再有,为达到多酚的高提取收率(约18wt%,以生原料为基准计)优选2-级水醇浸提方法,总酚酸浓度为约64wt%,同时丹宁酸浓度为约20wt%。为开发一种含高浓度的生物活性多酚类的提纯多酚级分,需要额外的加工步骤(步骤4),以便从粗步骤3多酚级分中除掉丹宁。
步骤4.亲和吸附剂多酚提取和提纯方法
有益的生物活性多酚酸是原花色素。原花色素被称作缩合丹宁。它们到处都是,并且是仅次于木质素存在的第二最丰富天然植物多酚。Dubois M等Analytical Chem 28:350-356,1956.原花色素是由主要通过C4-C8和/或C4-C6键连接的(+)-儿茶素和/或(-)-表儿茶素单元组成的低聚物和聚合物的混合物(B-型)。这些黄烷-3-醇可由C4-C8键和O7-C2之间的附加醚键双重连接(A型)。原花色素的分子量,用聚合度(DPn)表示,是最重要的性质之一。正如在科学文献中定义的,DP1是单体,DP2-10是低聚物,DP>10是聚合物。
在有关肉桂多酚的生物医药文献中(见上面),DP4-5(低聚物)表现出医药有益的生物活性。因此,在步骤4的加工中,通过跟踪每一加工步骤中总酚酸浓度和DPn,对丹宁去除和原花色素提取及提纯曾做过研究。
正如本文所教导的,来自肉桂和相关物种提纯的多酚酸级分的提取物可这样获得,通过令肉桂原料的水醇提取物与固体亲和聚合物吸附剂树脂进行接触,以将包含在水醇提取物内的多酚酸吸附到亲和吸附剂上。所结合的化学成分随后用这里所教导的方法洗脱。在洗脱多酚酸级分化学成分之前,可采用任何传统方式将其上吸附了所要求的化学成分的亲和吸附剂从提取物的其余部分中分离出来,优选的是与吸附剂接触并分离的过程是通过将含水提取物送过提取柱或吸附剂材料的床层实现的。
可采用各种不同亲和吸附剂来提纯肉桂物种的酚酸化学成分,例如但不限于,Sephadex LH-20(Sigma Aldrich Co.),“Amberlite XAD-2”(Rohm&Hass),“Duolite S-30”(Diamond Alkai Co.),“SP207”(Mitsubishi Chemical),ADS-5(Nankai University,Tianj in,China),ADS-17(Nankai University,Tianj in,China),Dialon HP 20(Mitsubishi,Japan),和Amberlite XAD7 HP(Rohm & Hass)。
Sephadex LH020被优选用于工艺色谱法,因为其对多酚酸化学成分的高亲和性,及其将丹宁多酚与非丹宁多酚分离开来的能力。丹宁多酚被吸附在醇中的Sephadex LH-20上。相比之下,非丹宁多酚则可利用醇从树脂珠上洗脱,而丹宁则依旧吸附在珠上。丹宁随后可用含水丙酮洗脱。该方法允许将丹宁多酚与要求的肉桂中的非丹宁多酚分离开来。因此,不同的洗脱溶剂可用于多酚化合物的分离和非丹宁生物活性肉桂多酚的提纯。采用Folin-Ciocalteu方法和蛋白-可沉淀酚类方法,可测定粗提取级分和洗脱级分中的丹宁和非丹宁多酚浓度。
虽然,可采用各种不同洗脱剂从吸附剂中回收非丹宁多酚酸化学成分,但在本公开内容的一个方面,洗脱剂包含低分子量醇,包括但不限于,甲醇、乙醇或丙醇。在第二个方面,该洗脱剂包含低分子量醇与水的混合物。在另一个方面,洗脱剂包含低分子量醇、第二有机溶剂和水。
虽然可采用各种不同洗脱剂来回收丹宁多酚酸化学成分,但在本公开内容的一个方面,洗脱剂包含含水丙酮。
优选的是,在令含提取物的含水酚酸化学成分与亲和吸附剂材料接触之前,肉桂物种原料先经受过1或多个初步提纯加工,例如,但不限于,在步骤1和3中描述的方法。
采用如本公开内容所教导的亲和吸附剂获得了高度提纯的肉桂物种的生物活性多酚低聚物(DP 2-10)酸化学成分,它明显不含天然植物材料或市售供应提取产物中通常存在的其他化学成分。例如,本公开内容所教导的方法可生产出这样的提纯多酚酸提取物,它包含超过95wt%(干基)总酚酸化学成分,仅含痕量丹宁多酚。
采用聚合物亲和吸附剂树脂珠从肉桂物种树皮中提取和提纯生物活性多酚酸的过程图示于图1-步骤4中。用于该提取过程的原料可以是来自步骤3水醇浸提提取500+/-520+/-540的含酚酸的含水乙醇溶液。在充填到柱620中之前,适当重量的吸附剂树脂珠(22mg多酚酸每克(gm)吸附剂树脂)以4-5BV95%乙醇250洗涤。含有多酚酸的水溶液500+520通过蒸发被浓缩到其原来体积的1%。随后,向被浓缩的样品中加入无水乙醇260,直至使体积增加至20倍,从而使多酚溶解在95%乙醇溶液中。该溶液进行离心640,以去除任何不溶解的物质,并收集上层清液作为加载样品550。将加载样品550加载到柱650上。一旦柱被注满,用95%乙醇270以2-3BV/h的流率洗脱660该柱,从而以无梯度(isocratic)洗脱方式将生物活性非丹宁多酚从亲和吸附柱上洗脱。将洗脱剂700收集在1BV级分中。采用UV分光光度计在280nm(多酚酸吸收波长)测试各个多酚级分,直至在分级样品中不再探测到吸收,此时便停止洗脱。一般需要7-10BV 95%乙醇来将非丹宁多酚从柱上洗脱(约3-4h)。洗脱后的柱670以3BV 70%含水丙酮280洗涤680,从而以5BV/h(3h)的流率将吸附到树脂珠上的丹宁多酚洗脱。洗脱下来的丹宁多酚洗涤液710被丢弃730。洗涤后的柱730随后以4-5(倍)95%乙醇250、以5BV/h的流率洗涤,以便除掉任何残留在柱中的化学品,从而使洗涤的柱为进一步的工艺色谱处理740做好准备。洗涤液720被丢弃730。大约每1BV可收集洗脱级分体积700,对这些样品进行总多酚分析(Folin-Ciocalteu方法),丹宁多酚(蛋白-沉淀法),DPn(硫解降解HPLC)分析,并测试固体含量和纯度。
低聚和聚合原花色素多酚化合物是在宽停留时间窗口(停留时间12-30min)洗脱的,从而造成,当计算儿茶素和表儿茶素浓度时基线的偏离和色谱图峰值精确积分的困难。大多数原花色素的此种HPLC行为已在科学文献中得到确认。然而,在硫解后,该HPLC色谱图显著地表现出色谱分辨率改善的证据。借助硫解,原花色素被转化为单体单元,从而在HPLC色谱图上产生清晰分辨的峰。按照科学文献(参见Guyot,2001),苄基硫醚由原花色素结构的延伸单元产生。DPn可用P1、P2、P3和P4的总面积以及儿茶素和表儿茶素的总面积来计算。
Sephadex LH-20已表明是将肉桂水醇提取物中的丹宁与非丹宁多酚化合物分离用的高效亲和吸附剂。合并洗脱级分F2-F8,可回收约77.4%非丹宁多酚化学成分,其中仅有0.2%丹宁被回收到了该合并提取级分中。合并洗脱级分F2-F8的收率是加载溶液的21.5wt%,和以生肉桂原料为基准计的3.78wt%。非丹宁多酚纯度是65wt%(干重),这是步骤3的粗多酚提取产物的3倍。再有,通过合并洗脱级分F6-F8,可测定到大于95wt%的纯度。
平均聚合度(DPn)展示每种洗脱级分中的多酚低聚物的大小。在粗提取物(加载溶液)中,聚合度是6.9,因为存在大丹宁多酚聚合物。在多酚洗脱级分中,基本上检测不到丹宁多酚。因此,提纯的多酚洗脱级分主要由多酚低聚物,二聚体-DPn=2;三聚体-DPn=3;四聚体-DPn=4;等等,的混合物构成。如表5所示,较多三聚体被洗脱到洗脱级分F3-F5中,较多四聚体被洗脱到洗脱级分F6-F8中。洗脱级分中DPn的范围为2.7-4.2,证实这些级分含有高纯度肉桂的有益生物活性原花色素多酚化学成分。另外,通过合并不同洗脱级分,可获得如表7和8所示,具有不同非丹宁多酚纯度和收率的不同提取产物。
表7.来自Sephadex LH-20工艺色谱法的多酚级分的95%乙醇洗脱液的分析结果
*洗脱液1没有列入,因为(没)有化学成分,仅溶剂
表8.不同非丹宁多酚洗脱级分的收率和纯度结果
级分 | 总固体(mg) | 总酚酸(mg)* | 总酚酸纯度(%) | 收率,以原料为基准计(%) | DPn |
F2-F7 | 28.4 | 18.5 | 65.1 | 3.8 | 3.6 |
F3-F7 | 18.6 | 15.6 | 83.7 | 2.5 | 3.8 |
F4-F7 | 11.8 | 11.0 | 93.8 | 1.6 | 3.9 |
F5-F7 | 7.5 | 7.3 | 97.2 | 1.0 | 4.1 |
F6-F7 | 4.4 | 4.4 | 100.0 | 0.6 | 4.2 |
*在这些合并的级分中,总酚酸没有可测出的丹宁酸。
技术上公知多种从溶液中去除醇的方法。如果要求醇维持循环使用,可在提取后,通过常或减压蒸馏从溶液中移出醇。该醇可重复使用。另外,技术上还有多种已知用于从溶液,或者水溶液或者从中移出醇的溶液,中移出水的方法。此类方法包括但不限于,将水溶液喷雾干燥到适当载体,例如但不限于,碳酸镁或麦芽糖糊精,上去,或者替代地,可通过冻干或折射率窗干燥(refractive window drying)将液体变干。
食品及药物
作为本发明食品的形式,可配制成任何任选的形式,例如,丸粒状、颗粒状、糊状、凝胶状、固态,或液态。以这些形式,传统上公知允许本领域技术人员加入到食品中的各类物质,例如,粘结剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、调味剂、缓冲剂、表面活性剂、溶解助剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂等,可任选地加入。加入到食品中的接骨木果提取物,其数量不受具体限制,例如,它可以为约10mg-5g,优选50mg-2g每日,作为体重约60kg的成人的摄入量。
具体地说,当它被用作保健食品、功能食品等时,它优选地包含本发明的有效成分,其用量充分显示本发明的预定效果。
本发明药物可任选地按照传统公知的方法制备,例如,制成固体药剂如片剂、丸剂、粉末、胶囊等,或制成液体药剂,例如,注射液等。向这些药物中,可配入任何通常使用的材料,例如,粘结剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、调味剂、缓冲剂、表面活性剂、溶解助剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂或pH控制剂。
该有效成分(肉桂提取物)在药物中的给药量可随着种类、剂型、待给药的患者年龄、体重或适应症之类而变化,例如,当它口服给药时,它可每日给药1或多次,就体重约60kg的成人而言,并每日服用的数量为约10mg-5g,优选约50mg-2g。有效成分可以是肉桂提取物的1或多种成分。
方法还包括每日给予此种提取物1次以上,每日2次以上,每日3次以上,并介于1-15次每日。这样的给药可以是连续的,作为几日、几周、几个月或几年之内的每日,或者可发生在特定时间,以治疗或预防特定症状。例如,某人服用肉桂物种提取物每日至少一次持续数年以改善注意力集中、认知和记忆,或预防并治疗2型糖尿病,预防心血管疾病中风,或治疗胃肠道疾病,或治疗发炎疾病以及关节炎,包括痛风,或治疗普通感冒、细菌和真菌感染。
以上描述包括实施本公开内容目前想到的最佳模式。这些描述旨在说明本公开内容的一般原理,不应理解为限制意义的。本公开内容将由下面的实施例进一步说明,它们从任何意义上都不应构成对本公开内容范围的限制。相反,应清楚地理解,还可举出各种不同其他实施方案、修改及其等价物,它们,在本领域技术人员阅读了本说明之后在不偏离本发明精神的条件下将自动浮现。
这里使用的所有术语都应被本领域技术人员按通常接受的用法来理解。本文援引的专利和专利申请或参考文献在此一律全文收作参考。
实施例
材料
丙酮(67-64-1),≥99.5%,ACS试剂(179124);乙腈(75-05-8),用于HPLC,梯度等级≥99.9%(GC)(000687);己烷(110-54-3),95+%,分光光谱级(248878);乙酸乙酯(141-78-6),99.5+%,ACS级(319902);乙醇,以4.8%异丙醇(02853)变性;乙醇(64-17-5),无水,(02883);甲醇(67-56-1),99.93%,ACS HPLC级,(4391993);以及水(7732-18-5),HPLC级,(95304)。全部购自Sigma-Aldrich。
甲酸(64-18-6),50%溶液(09676);乙酸(64-19-7),99.7+%,ACS试剂(320099);盐酸(7647-01-0),容量标准1.0N溶液在水中(318949);氢氧化钙(7789-78-8),粉末,CA0-2mm,90-95%(213268);无水氯化铁(7705-08-0),97%,试剂级(157740);Folin-Clocalteu酚试剂(2N)(47641);苯酚(108-95-2)(P3653);硫酸(7664-93-9),ACS试剂,95-97%(44719);三乙醇胺(102-71-6),三乙醇胺游离碱(T1377);十二烷基硫酸钠(151-21-3),最小98.5%GC(L4509);全部购自Sigma-Aldrich。碳酸钠(S263-1,批次#:037406)购自Fisher公司。
血清白蛋白(9048-46-8),牛白蛋白级分V粉末细胞培养物试验过的(A9418);(+)-儿茶素水合物(88191-48-4),纯度≥98%(C1251);鞣酸(149-91-7),ACS试剂,≥98%(HPLC);苄基硫醇(100-53-8),99%(B25401);反式-肉桂醛(14371-10-9),99+%纯度;丹宁酸(1401-55-4),粉末(T0125);全部购自Sigma-Adrich。(-)-表儿茶素93.6%(05125-550,CAS#490-46-0)购自Chromadex。根据DIN发照的葡聚糖标准物5000(00269),50,000(00891)和410,000(00895),购自Fluka。本公开内容中使用的化学参照标准物的结构示于下面:
反式-肉桂醛 鞣酸
(+)-儿茶素 (-)-表儿茶素
Sephadex LH-20:Sephadex TM LH-20(批次#:308822,包167600,产品#:17-0090-01)购自Ambersham Bioscience AB Uppsala瑞典。它是由sephadex G-25的羟丙基化制备的,sephadex G-25是一种成珠的葡聚糖介质,专门开发用于天然产物如类固醇、萜类、脂类和低分子量肽在有机溶剂中的凝胶过滤用。
HPLC方法
色谱系统:Shimadzu高效液相色谱LC-10AVP系统,配备LC10ADVP泵,带有SPD-M 10AVP发光二极管阵列检测器。获得的提取产物在反相Jupiter C18柱(250×4.6mm I.D.,5μ,300 )(Phenomenex,部件#:00G-4053-E0,序列号:2217520-3,批号No.:5243-17)上进行测定。注入体积是10μl,移动相流率是1ml/min.柱温是50℃。移动相由A(0.5%含水甲酸,v/v)和B(乙腈)组成。梯度按以下编程:头6min,维持在100%,6-10min,溶剂B线性地从0%增加至12%,在10-35min,B线性地从12%至21%,然后在35-40min,B线性地从21%至25%,随后40-50min,B线性地至100%。
3种参照标准(儿茶素,表儿茶素和反式-肉桂醛)的甲醇储备溶液通过以1mg/ml将称重数量的标准化合物溶解到甲醇中而制成。随后,逐步稀释该混合的参照标准溶液分别配制成0.75,0.5,0.1,0.05mg/ml最终浓度的一系列溶液。所有这些储备溶液和工作溶液都在7日内使用并存储在+4℃冰箱内直至在使用前再调整到室温。这些溶液被用来鉴别和定量肉桂中的化合物。(+)-儿茶素(C),(-)-表儿茶素(EC),和反式-肉桂醛(CAN)的停留时间分别为14.02,15.22,和34.00min。发现一条从0.01到10μg的拟合直线。回归方程和相关系数如下:(+)-儿茶素:峰值面积=465303×C(μg)-5701.4,R2=0.9996(N=6);(-)-表儿茶素:峰值面积=124964×C(μg)-215.88,R2=0.9998(N=6);反式-肉桂醛:峰值面积/100=69657×C(μg)-1162.1,R2=0.9997(N=6)。HPLC的结果示于表9。每个样品中的参照标准含量通过根据峰值面积从相应的标定曲线上的内插算出。
表9.在1mg/ml甲醇中的浓度下肉桂标准的HPLC分析结果
名称 | 停留时间(min) | 面积(mAu·min) | 高度(mAu) | 宽度(min) | 开始时间(min) | 停止时间(min) | 理论板 |
(+)-儿茶素 | 14.016 | 1479356 | 234337 | 0.46 | 13.83 | 14.29 | 14854 |
(-)-表儿茶素 | 15.221 | 164706 | 23537 | 0.64 | 15 | 15.64 | 9050 |
反式-肉桂醛 | 33.984 | 22590251 | 1029700 | 1.66 | 33.3 | 34.97 | 6706 |
[1]理论板按下式计算:N=16×(tR/w)2。tR是停留时间,w是峰值宽度,https://www.mn-net.com/web%5CMN-WEB-HPLCKatalog.nsf/WebE/GRUND LAGEN
GC-MS分析
GC-MS分析采用Shimadzu GCMS-QP2010系统实施。该系统包括高效气相色谱,直接耦合GC/MS界面,带独立温控的电冲击(EI)离子源,四极质量过滤器等。该系统靠GCMS方案(版本2)的软件控制其数据采集和后运转分析。分离是在AgilentJ & W DB-5熔凝硅石毛细柱(30m×0.25mm i.d.,0.25μm膜厚)(目录:1225032,序列号:US5285774H)上实施的,采用以下温度程序。初始温度是60℃,保持2min,然后以4℃/min的速率升高至120℃,维持15min,然后它以4℃/min的速率升高至240℃,维持15min,总运行时间77min。样品注入温度是250℃。1μl样品由自动注射器以不间断的模式注入1min。载体气体是氦气,流率由60KPa的压力来控制。在这样的压力下,流率是1.03ml/min,而线速度是37.1cm/min。MS离子源温度是230℃,GC/MS界面温度是250℃。MS检测器在m/z 50-500之间进行扫描,扫描速度1000AMU/s。溶剂截止温度是3.5min。
用于总酚酸的Folin-Ciocalteu方法(Markar 1993)
使用Shimazu UV-Vis分光光度计(UV 1700,带UV探头:S/N:A1102421982LP)。
标准:
制备鞣酸/水溶液,浓度1mg/ml。取适量鞣酸溶液在试管中,以蒸馏水充至0.5mL的体积,加入0.25mL Folin Ciocalteu试剂,随后加入1.25mL20wt%碳酸钠溶液。充分摇动试管(超声波浴(untrasonicbath))40min,并记录在725nm的吸收度。数据载于表10。
表10.鞣酸标定曲线的准备
*鞣酸溶液的数量依赖于吸收信息
实时直接分析(DART)质谱法,用于多糖分析
仪器:JOEL AccuTOF DART LC飞行时间质谱仪(Joel USA,Inc.,Peabody,Massachusetts,USA)。该飞行时间(TOF)质谱仪技术不要求任何样品制备并且给出的质量精确至0.00001质量单位。
方法:用于捕捉和分析级分的仪器设定值如下。就阳离子模式而言,DART针电压是3000V,加热元件250℃,电极1在100V,电极2在250V,氦气流率7.45L/min。关于质谱仪,小孔1是10V,环形透镜5V,小孔2是3V。峰值电压设定在600V,以便从约60m/z开始提供分辨能力,而在较大质量范围还能提供充分的分辨率。微通道板检测器(MCP)电压设定在2450V。每天早晨引入样品之前进行标定,采用0.5M咖啡因溶液标准(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,USA)。标准允差维持在≤5mmu。
样品由消毒尾铗引入到DART氦气等离子体中,以保证样品以最大表面面积暴露于氦气等离子束。为将样品引入到束中,采用吹扫动作。这一动作使样品得以在往返行程中得到约0.5s/每次吹扫的反复暴露,并防止了样品热解。重复该运动直至在检测器观察到明显的总离子电流(TIC,Total Ion Current),然后取出样品,从而提供基线/背景的归一化。
在阴离子模式的情况下,DART和AccuTOF MS被切换至负离子模式。针电压是3000V,加热元件250℃,电极1100V,电极2在250V,以及氦气流率7.45L/min。关于质谱仪,小孔1是-20V,环形透镜是-13V,小孔2是-5V。峰值电压是200V。MCP电压设定在2450V。样品的引入方式与阳离子模式完全一样。所有数据分析利用随仪器配备的MassCenterMain Suite软件完成。
实施例1
步骤1A的实施例:肉桂香精油的单步骤SFE最大提取和提纯
所有SFE提取都是在SFT 250(Supercritical Fluid Technologies,Inc.,Newark,Delaware,USA)上完成的,设计压力和温度分别为最高至690bar和200℃。该仪器能在超临界状态简单而高效地提取,并有兼具动态和静态模式操作的灵活性。该仪器主要由3个模块组成;炉子、泵和控制部分,以及收集模块。炉子具有1个预热柱和1个100mL提取容器。泵模块配备压缩空气驱动泵,具有恒定流量容量300mL/min。收集模块是40mL玻璃管形瓶,带盖密封和用于回收提取产物的间隔。该设备配备微米阀和流量计。提取容器的压力和温度被监控在±3bar和±1℃之内。
在典型实验实施例中,每次实验,30g粒度高于105μm,经140目筛网过筛的桂皮粉末被装入到100mL提取容器内。在柱的两端放入玻璃棉以避免任何可能的固体材料的夹带。炉子预热到要求的温度,然后向充填的容器内进料。在将容器连接到炉子上以后,通过以CO2给系统充压(-850psig)对提取系统试漏,并吹洗。封闭系统并利用气动液体泵将其加压至要求的提取压力。随后,让系统平衡约3min。取样管形瓶(40mL)经称重后连接到取样口上。通过令CO2以约10SLPM(19g/min)的流率流过开始提取过程,流率由计量阀控制。计算溶剂/进料比,其定义为CO2的总用量与装入的原料重量的重量比。提取处理期间,每5min称取提取的样品重量。当样品的重量在2次称重测定之间相差不超过5%时就认为提取完成了。收率被定义为提取的香精油占装入到提取容器中的原料初始总重量的重量百分数。采取了一种变温40-89℃、80-500bar的全工业提取设计。
在该实验实施例中,提取条件设定为,温度介于40-80℃,压力介于80-500bar。CO2流率是19g/min。结果载于表11。
表11.单级SFE肉桂香精油提取的HPLC分析
T(℃) | P(bar) | 密度(g/cc) | S/F | 收率(%) | CND纯度(%) | CND收率(%) |
40 | 80 | 0.293 | 57 | 0.46 | 69.1 | 0.32 |
40 | 100 | 0.64 | 57 | 0.87 | 60.2 | 0.53 |
40 | 120 | 0.723 | 57 | 0.87 | 61.5 | 0.53 |
40 | 300 | 0.915 | 57 | 1.27 | 58.0 | 0.74 |
60 | 80 | 0.195 | 38 | 0.34 | 65.4 | 0.22 |
60 | 100 | 0.297 | 38 | 0.34 | 68.1 | 0.23 |
60 | 120 | 0.448 | 38 | 0.43 | 67.1 | 0.29 |
60 | 300 | 0.834 | 38 | 1.14 | 58.7 | 0.67 |
80 | 100 | 0.226 | 19 | 0.49 | 68.0 | 0.33 |
80 | 300 | 0.751 | 19 | 1.14 | 59.6 | 0.68 |
实施例2
步骤1B的:肉桂香精油的多级SCCO2分级
采用SFT 250(Supercritical Fluid Technologies,Inc.,Newark,Delaware,USA)实施多级SCCO2提取/分级。在典型多级提取中,30g粒度大于105μm的磨碎的桂皮被装入到内容积100mL的提取容器中。提取溶液收集在40mL连接到提取容器出口的收集容器中。CO2的流率设定在19g/min。第一提取步骤在80bar的压力和40℃的温度(CO2密度=0.29g/mL)下实施。该提取步骤进行1h。第二提取步骤在100bar的压力和40℃的温度(CO2密度=0.64g/ml)下实施。第二提取步骤持续1h。第三提取步骤在120bar的压力和40℃的温度(CO2密度=0.72g/ml)进行1h。随后,第四提取步骤在40℃的温度和300bar的压力(CO2密度=0.92g/ml)进行1h。还实施了采用在60℃和80℃的3级的多级提取。给出的分析结果示于表12,该表内容可与同样SFE状态下的粗提取物和多级GC-MS数据比较。
表12.肉桂香精油的多级SFE提取收率
级 | T(℃) | P(bar) | 密度(g/cc) | S/F | 收率(%) |
1 | 40 | 80 | 0.293 | 38 | 0.55 |
2 | 40 | 100 | 0.64 | 38 | 0.55 |
3 | 40 | 120 | 0.723 | 38 | 0.24 |
4 | 40 | 300 | 0.915 | 38 | 0.26 |
1 | 60 | 100 | 0.297 | 38 | 0.60 |
2 | 60 | 300 | 0.835 | 38 | 0.35 |
3 | 60 | 500 | 0.938 | 38 | 0.32 |
1 | 80 | 100 | 0.227 | 38 | 0.75 |
2 | 80 | 300 | 0.751 | 38 | 0.86 |
3 | 80 | 500 | 0.88 | 38 | 0.14 |
在40、60和80℃的多级提取的总收率分别为约1.6%、1.3%和1.8wt%,以原来原料为基准计,通过每一级的收率相加获得。这些收率高于单级粗提取中的收率,因为在多级工艺中采用了较高的溶剂-进料比。其他方面,数据是一致的。正如从数据中看出的,化学成分化学化合物如反式-肉桂醛的浓度在这些亚级分提取产物中可以改变,从而证实SFE调节肉桂香精油的化学成分的分布型的能力。
表13.不同条件下获得的提取物中肉桂香精油化合物的分布型
实施例3
步骤2的实施例:多糖级分提取
肉桂物种的溶于水、不溶于乙醇的提纯多糖级分化学成分的溶剂提取和沉淀的典型实验实施例如下:20g来自在60℃和300bar的SFE提取的固体残余物,使用400mL蒸馏水在85℃分2级提取2h。将2股提取溶液合并,然后采用Fisherbrand P4滤纸(孔径4-8μm)过滤该淤浆,并以2,000rpm离心20min。收集上层清液。采用旋转蒸发将上层清液提取溶液从800mL浓缩至80mL。随后,加入1520mL无水乙醇,配成最终乙醇浓度95%。让溶液静置30min,并观察到沉淀的发生。提取溶液在2,000rpm下离心20min,滗析上层清液并将其或者留待进一步加工或者丢弃。做出沉淀前后的物料平衡以算出多糖的收率。沉淀经收集并在50℃烘箱内干燥12h。干燥的多糖级分经称重,然后溶解在水中以便用比色法来分析多糖的纯度,葡聚糖被用作参照标准。另外,采用AccuTOF-DART质谱法进一步鉴定多糖级分。结果示于图6和7以及表14和15。
表14.采用水浸提并采用95%乙醇沉淀得到的沉淀多糖级分的分析
SFE60℃和300bar残余物 | |
原料(g) | 20 |
水浸提收率(%) | 4.8 |
沉淀前浸提提取物(g) | 0.96 |
沉淀后浸提提取物(g) | 0.71 |
沉淀(pcp)(g) | 0.25 |
沉淀收率(%) | 1.3 |
沉淀前总酚酸(g) | 0.25 |
沉淀后总酚酸(g) | 0.26 |
葡聚糖5K(mg/mg pcp) | 0.47 |
葡聚糖50K(mg/mg pcp) | 0.35 |
葡聚糖410K(mg/mg pcp) | 0.29 |
表15.肉桂多糖的DART分析
肉桂多糖收率是1.3wt%,以原来桂皮原料为基准计。多糖级分的纯度是290-470mg/g葡聚糖标准当量,表明在该级分中>95%的肉桂多糖化学成分的纯度。比较沉淀前后溶液中的总酚酸分析,沉淀似乎对酚酸没有影响。根据大量和各种不同试验方法的结果,得出以下结论是相当合理的,即,1.3%的收率几乎是天然肉桂物种原料中溶于水、不溶于乙醇的多糖的100%。
实施例4
步骤3的实施例:水醇浸提提取
一种肉桂物种酚酸化学成分的3级溶剂提取的典型实施例如下:原料是2g来自步骤1香精油的SCCO2提取(40℃,300bar)的磨碎桂皮SFE残余物。溶剂是40mL 25%含水乙醇。在该方法中,原料和40mL含水乙醇被分别装入到100mL提取容器中并在40℃的加热水浴中混合4h。提取溶液利用截留颗粒尺寸4-8μm的Fisherbrand P4滤纸进行过滤,在2000rpm下离心20min,粒状残余物被用于进一步提取。收集滤液(上层清液)以便计算收率和做HPLC分析。级1的残余物进行2h提取(级2),然后来自级2的残余物利用上面提到的方法进行2h提取。收集上层清液以便就提取物中的肉桂醛(CND)、儿茶素(C)和表儿茶素(EC)进行物料平衡、HPLC分析。采用Folin-Ciocalteu检验测定总酚酸浓度(纯度),并用蛋白沉淀法测定丹宁酸纯度。结果载于表16。
表16.多级水醇浸提对提取收率的影响
注:
1.CND=反式-肉桂醛;C=(+)-儿茶素;EC=(-)-表儿茶素;TPA=总酚酸;TA=丹宁酸.
2.CND,C,EC是由HPLC分析的;TPA是由Folin-Ciocalteu法以鞣酸为标准物分析的;TA采用蛋白-沉淀法分析。
为确认Folin-Ciocalteu法,试验了1mg/ml浓度的已知酚酸、山柰酚、咖啡酸、儿茶素。测定山柰酚和儿茶素的实验误差在2-4%左右,而咖啡酸的实验误差为约10%。另外,测试了一种参照物(Sindhu2006)在其方法提取物中的总酚酸,结果是289±2.2mg鞣酸/g提取物,这相当接近本公开内容的结果。
实施例5
步骤4的实施例:提纯多酚酸级分的亲和吸收剂提取
在典型实验中,工作溶液是步骤3中的肉桂物种含水乙醇浸提提取物的透明水醇溶液。亲和吸附剂聚合物树脂是Sephadex LH-20。6mg亲和吸附剂以95%乙醇预洗涤(4-5BV),然后再充填到内径1.5cm、长100cm的柱中。充填柱的体积是25mL。100mL肉桂25%乙醇级I+级II的提取溶液(样品溶液,2.4mg/ml)利用旋转蒸发移出溶剂被浓缩至1mL。随后,在浓缩的溶液中加入19mL无水乙醇以溶解化学成分。该溶液在2000rpm下离心10min,然后收集上层清液作为最终多酚加料溶液(11mg/ml)。12mL加料溶液被注入到柱中。加满液的柱以240mL95%乙醇以2.4BV/h(1ml/min)进行洗脱,洗脱时间100min。洗脱期间,收集到8种非丹宁多酚级分(标为洗脱级分F1-F8),每种洗脱液30mL。每个级分利用UV分光光度法在280nm试验直至在收集的级分中不再能测到吸收。以5BV/h(2.1mL/min)的流率、70mL 70%含水丙酮洗涤该柱,以除掉吸附在亲和吸附上的丹宁多酚。丢弃该丹宁洗涤溶液。最后,该柱以4-5BV 95%乙醇洗涤以除掉任何残余化学杂质,以便使柱准备好下一次的处理。收集并分析每个多酚洗脱级分,并将结果示于表17。
表17.来自Sephadex LH-20工艺色谱法的多酚级分的95%乙醇洗脱液分析
*洗脱1未列入,因为不含化学成分,只有溶剂。
实施例6
将下列成分混合作为制剂:
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
桂皮提取物 150.0mg
香精油级分(10mg,6.6%干重)
多酚级分(100mg,66.7%干重)
多糖(40mg,26.6%干重)
甜菊苷(甜菊提取物) 12.5mg
羧甲基纤维素 35.5mg
乳糖 77.0mg
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
合计 275.0mg
该肉桂物种的新型提取物包含香精油级分、酚酸-香精油级分和多糖级分的重量百分率大于天然根茎物质或传统提取产物中存在的。该制剂可制成任何口服剂量形式并日服或至每日15次,根据所要求的生理学和心理学效果的需要(改善脑功能和镇痛)以及药效(非胰岛素依赖型糖尿病、抗血小板凝聚和抗血栓、心血管和脑血管疾病预防和治疗,抗动脉粥样硬化、抗高胆固醇血症、心脏保护、神经系统保护、抗炎、抗过敏、抗关节炎、抗风湿、抗痛风、抗胃肠道疾病、咳嗽、普通感冒、发烧、脂肪分解、改进伤口愈合、抗菌、抗真菌和抗癌)。
实施例7
将下列成分混合作为制剂:
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
桂皮提取物 150.0mg
香精油级分(60mg,40%干重)
多酚级分(30mg,20%干重)
多糖(60.0mg,40%干重)
维生素C 15.0mg
蔗糖 35.0mg
绿豆粉10:1 50.0mg
咖啡香料 40.0mg
巧克力香料 10.0mg
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
合计 300.0mg
肉桂川芎的新型提取物所含香精油、酚酸-香精油和多糖化学成分的重量百分率高于天然植物材料或传统提取产物中存在的。该制剂可制成任何口服剂量形式并安全地最多每日服用15次,根据所要求的生理学和心理学效果的需要(参见上面实施例1)。
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Claims (50)
1.一种肉桂物种提取物,包括具有图6-85中任何一种实时直接分析(DART)质谱色谱图的级分。
2.权利要求1的肉桂物种提取物,其中该级分包括选自肉桂醛、苯甲醛、肉桂醇、反式-肉桂酸、乙酸肉桂酯、香精油、多酚、多糖及其组合的化合物。
3.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括数量大于约2wt%的肉桂醛。
4.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括数量大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95wt%的肉桂醛。
5.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括数量介于约65%-约95wt%的肉桂醛。
6.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括选自丁子香酚、2′-羟基肉桂醛、2-甲氧基肉桂醛、2′-苯甲酰氧基肉桂醛、芳樟醇、1,8-桉油精、α-蒎烯、β-蒎烯及其组合的香精油。
7.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括数量介于约1%-约5wt%的香精油。
8.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括结合数量为约5%-约40wt%的肉桂醛和香精油。
9.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括选自类黄酮、黄酮醇糖苷及其组合的多酚。
10.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括数量介于约20%-约70wt%的多酚。
11.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括约6wt%肉桂醛和约70wt%多酚。
12.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括约40wt%肉桂醛和约20wt%多酚。
13.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括选自葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖糖醛酸及其组合的多糖。
14.权利要求2的肉桂物种提取物,其中该级分包括约30wt%多糖。
15.权利要求9的肉桂物种提取物,其中类黄酮选自3-(2-羟苯基)-丙酸、3-(2-羟苯基)-O-糖苷、花色素、表儿茶素、儿茶素、甲基羟基查耳酮、儿茶素低聚物、表儿茶素低聚物、低聚原花色素、聚合原花色素及其组合。
16.权利要求9的肉桂物种提取物,其中黄酮醇糖苷选自山柰苷、山柰酚3-O-β-D-吡喃葡糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷、山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖-(1→2)-α-L-鼠李吡喃糖苷、山柰酚3-O-β-D-芹呋喃糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷及其组合。
17.包含权利要求1的肉桂物种提取物的食品或药物。
18.一种制备肉桂提取物的方法,包括顺序地提取肉桂物种植物材料以获得香精油级分、非-丹宁多酚级分和多糖级分,包括:
a)通过超临界二氧化碳提取来提取肉桂物种植物材料,从而生成香精油级分和第一残余物;
b)用约70℃-约90℃的水提取而提取肉桂物种植物材料或来自步骤a)的第一残余物,并且用醇沉淀多糖,从而生成多糖级分和第二残余物;以及
c)用水醇溶液提取肉桂物种植物材料、来自步骤a)的第一残余物和/或来自步骤b)的第二残余物,并利用亲和吸附剂方法提纯该提取物,从而获得非丹宁多酚级分。
19.权利要求18的方法,其中步骤a)包括
1)在提取容器中装入磨碎的肉桂物种植物材料;
2)在超临界状态下加入二氧化碳;
3)令磨碎的桂皮与二氧化碳接触一段时间;以及
4)将香精油级分收集在收集容器中。
20.权利要求19的方法,其中超临界状态包括在35℃-90℃下的60bar-800bar的压力。
21.权利要求19的方法,其中超临界状态包括在40℃-80℃下的60bar-500bar的压力。
22.权利要求19的方法,其中时间是30min-2.5h。
23.权利要求19的方法,其中时间是1h。
24.权利要求19的方法,其中超临界二氧化碳分级分离系统被用于香精油级分的分级、提纯和分布型调节。
25.权利要求18的方法,其中步骤b)包括
1)令磨碎的肉桂物种植物材料或来自步骤a)的第一残余物与水溶液接触一段足以提取多糖化学成分的时间;以及
2)通过醇沉淀从溶液中分离并提纯固态多糖。
26.权利要求25的方法,其中水处于70℃-90℃。
27.权利要求25的方法,其中水处于80℃-90℃。
28.权利要求25的方法,其中时间是1-5h。
29.权利要求25的方法,其中时间是2-4h。
30.权利要求25的方法,其中时间是2h。
31.权利要求25的方法,其中醇是乙醇。
32.权利要求18的方法,其中步骤c)包括:
1)令肉桂物种植物材料、来自步骤a)的第一残余物和/或来自步骤b)的第二残余物与水醇溶液接触一段足以提取多酚化学成分的时间;
2)将从水醇溶剂混合物中提取的多酚化学成分浓缩醇溶液送过亲和吸附剂树脂塔,在此多酚酸被吸附;以及
3)从亲和吸附剂树脂上洗脱提纯的非丹宁多酚化学成分级分,留下丹宁多酚类仍旧吸附在亲和吸附剂树脂上。
33.权利要求32的方法,其中水醇溶液包含乙醇和水,其中乙醇浓度是10-95wt%。
34.权利要求32的方法,其中水醇溶液包含乙醇和水,其中乙醇浓度是25wt%。
35.权利要求32的方法,其中步骤1)在30℃-100℃进行。
36.权利要求32的方法,其中步骤1)在60℃-100℃进行。
37.权利要求32的方法,其中时间是1-10h。
38.权利要求32的方法,其中时间是1-5h。
39.权利要求32的方法,其中时间是2h。
40.由权利要求18的方法制备的肉桂物种提取物。
41.一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、肉桂醛重量的1-5wt%肉桂酸、肉桂醛重量的5-15wt%甲基肉桂酸、肉桂醛重量的1-5wt%肉桂醇、肉桂醛重量的20-30wt%β-gualenen/顺式-γ-双ababolene,以及肉桂醛重量的1-5wt%连苯三酚。
42.一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的80-90wt%肉桂酸、连苯三酚的85-95wt%甲基肉桂酸、连苯三酚的20-30wt%香豆酸、连苯三酚的15-25wt%高香草酸、连苯三酚的85-95wt%肉桂醛和连苯三酚的10-15wt%苯甲酸苄酯。
43.一种肉桂物种提取物,它包含儿茶素、儿茶素的5-15wt%肉桂酸、儿茶素的5-15wt%甲基肉桂酸、儿茶素的5-15wt%香豆酸、儿茶素的1-10wt%阿魏酸、儿茶素的1-5wt%2-甲氧基苯酚、儿茶素的5-15wt%高香草酸、儿茶素的20-30wt%香草酸、儿茶素的1-5wt%苯甲醛、儿茶素的35-45wt%肉桂醛、儿茶素的85-95wt%连苯三酚,以及儿茶素的-15wt%咖啡酸。
44.一种肉桂物种提取物,它包含β-gualenen/顺式-γ-双ababolene,和β-gualenen/顺式-γ-双ababolene的5-15wt%肉桂醛。
45.一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛,和肉桂醛的10-20wt%β-gualenen/顺式-γ-双ababolene。
46.一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、肉桂醛的30-40wt%连苯三酚和肉桂醛的1-10wt%儿茶素/表儿茶素。
47.一种肉桂物种提取物,它包含肉桂醛、肉桂醛的1-5wt%肉桂酸、肉桂醛的0.5-5wt%甲氧基肉桂醛、肉桂醛的0.1-5wt%丁子香酚、肉桂醛的1-5wt%对-伞花烃、肉桂醛的0.1-5wt%樟脑、肉桂醛的0.5-5wt%香芹酚、肉桂醛的25-35wt%石竹烯/草烯、肉桂醛的0.1-5wt%连苯三酚,以及肉桂醛的40-50wt%肉桂酸肉桂酯。
48.一种肉桂物种提取物,它包含肉桂酸肉桂酯、肉桂酸肉桂酯的0.5-5wt%甲氧基肉桂醛、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%肉桂醇、肉桂酸肉桂酯的1-5wt%对-伞花烃、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%芳樟醇、肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%樟脑、肉桂酸肉桂酯的0.5-5wt%香芹酚、肉桂酸肉桂酯的70-80wt%肉桂醛、肉桂酸肉桂酯的45-55wt%石竹烯/草烯,和肉桂酸肉桂酯的0.1-5wt%连苯三酚。
49.一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的5-10wt%肉桂酸、连苯三酚的60-70wt%香豆酸、连苯三酚的1-10wt%阿魏酸、连苯三酚的5-15wt%2-甲氧基苯酚、连苯三酚的1-10wt%香草酸、连苯三酚的30-40wt%儿茶素/表儿茶素、连苯三酚的1-5wt%苯甲醛、连苯三酚的5-15wt%阿夫儿茶精/表阿夫儿茶精、连苯三酚的1-10wt%白藜芦醇,和连苯三酚的1-5wt%香兰素。
50.一种肉桂物种提取物,它包含连苯三酚、连苯三酚的0.5-5wt%肉桂酸、连苯三酚的10-20wt%香豆酸、连苯三酚的0.5-5wt%阿魏酸、连苯三酚的1-5wt%2-甲氧基苯酚、连苯三酚的0.5-5wt%高/异香草酸、连苯三酚的1-10wt%香草酸、连苯三酚的25-35wt%儿茶素/表儿茶素、连苯三酚的1-5wt%苯甲醛、连苯三酚的1-5wt%肉桂醛、连苯三酚的0.1-5wt%阿夫儿茶精/表阿夫儿茶精,和连苯三酚的65-75wt%香兰素。
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