CN103575819B - 一种强心中药制剂指纹图谱的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中药组合物制剂指纹图谱测定方法。该中药组合物是由人参、黄精、苍术、苦参、茯苓、麦冬、制何首乌、地黄、山茱萸、黄连、佩兰等药味组成，可有效治疗糖尿病。该方法采用超高压液相色谱法，该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制该中药组合物的质量。

Description

一种强心中药制剂指纹图谱的测定方法
技术领域
本发明涉及到一种中药组合物制剂指纹图谱的测定方法。
背景技术
ZL02146570.3公开了一种以补气通络、辛温通络、活血通络、利水通络的药物组合物，该药物组合物具有治疗慢性充血性心力衰竭的作用，其组成包括黄芪或白术、附子、人参或党参、丹参、葶苈子、香加皮或南五加皮、泽泻、玉竹、桂枝、红花、陈皮组成，由于成分较为复杂，制成制剂以后，控制产品质量时，对该中药组合物中尽量多的成分进行鉴别，有利于该药品的安全有效，质量稳定可靠。
超高效液相色谱（UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。
中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。指纹图谱应该具备指纹性，即：（1）专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该中药所独有的、能与其它中药相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的；（2）稳定性好。即中药的指纹图谱应该是从某中药的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；（3）重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征（如共有峰数目、大小、位置等），其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值，才可以有效控制药品的质量。
采用UPLC指纹图谱方法控制药品质量具有灵敏、快速、简便、准确等特点，通过优选色谱条件测定药品制剂的指纹图谱，可以很好控制药品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药组合物制剂的指纹图谱测定方法，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：黄芪150-450、附子40-120、人参或党参75-225、丹参75-225、葶苈子50-150、香加皮或南五加皮60-180、泽泻75-225、玉竹25-75、桂枝30-90、红花30-90、陈皮25-75；本发明指纹图谱测定方法采用超高压液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为C18柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8mL.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸；梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5-2.0g，精密称定，加入60-85%的甲醇25mL，称重，超声15-40min，放置室温，称重，用60-85%的甲醇补足重量，混匀后离心，移取上清液10-15mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液0.5-1.5μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
本发明指纹图谱测定方法色谱条件优选如下：色谱柱优选为AcquityUPLCBEHC18，规格优选为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温优选为40℃；流速优选为0.5mL.min-1；供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂1.0g，精密称定，加入80%的甲醇25mL，称重，超声30min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液13mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂XAD7HP的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法，适用的中药组合物制剂原料药的重量比例优选为：
黄芪450、附子112.5、人参或党参225、丹参225、葶苈子150、香加皮或南五加皮180、泽泻225、玉竹75、桂枝90、红花90、陈皮75。
或者优选为：
黄芪150、附子40、人参或党参225、丹参225、葶苈子50、香加皮或南五加皮180、泽泻75、玉竹75、桂枝30、红花90、陈皮25。
或者优选为：
黄芪250、附子112.5、人参或党参200、丹参120、葶苈子135、香加皮或南五加皮150、泽泻200、玉竹60、桂枝75、红花75、陈皮60。
或者优选为：
黄芪255、附子115、人参或党参180、丹参115、葶苈子145、香加皮或南五加皮158、泽泻190、玉竹68、桂枝80、红花80、陈皮68。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用该中药组合物制剂的剂型优选为片剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法，适用的该中药组合物胶囊剂的制备方法优选为：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮按照比例量称取加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30(60℃热测)的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度为1.25-1.30(60℃热测)清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30(60℃热测)清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）将步骤（3）所得干膏粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，即得。
上述中药组合物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。
本发明方法测定该中药组合物指纹图谱从多个方面评价该方法的可行性，评价方法如下：
1、仪器与试药
美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站（ACQUITYUPLCHCLASS）；KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平（AG135，METTLERTO-LEDO）；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）。
磷酸（色谱级，批号20120104，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，批号20120110，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（色谱级，Fisher）；实验用水为超纯水。
本发明中药组合物胶囊剂由石家庄以岭药业股份有限公司提供（按照实施例1的方法制备），共十批（批号S1:100102,S2:111201,S3:110803,S4:110303,S5:101002,S6:100106,S7:111103,S8:110301S9:110901,S10:111203）；丹参素钠（110855-200809）、丹参酚酸B（111562-200605）、人参皂苷Rb1（110704-201122）、人参皂苷Rd（111818-201001）、人参皂苷Rb2（111715-200802）均购于中国药品生物制品鉴定所，人参皂苷Rc（11021-14-0）均购于上海源叶生物科技有限公司。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHC18（2.1mm×100mm，1.7um），柱温40℃，流速0.5mL.min-1，检测波长203nm，进样1uL，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸，梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B。
2.2对照品溶液制备
分别取丹参素钠、丹参酚酸B、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2适量，精密称定，用80%甲醇配制成含丹参素钠0.12mg.mL-1，丹参酚酸B0.09mg.mL-1，人参皂苷Rb10.17mg.mL-1，人参皂苷Rd0.1mg.mL-1，人参皂苷Rc0.15mg.mL-1，人参皂苷Rb20.18mg.mL-1的溶液，其中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd为混标溶液，其余标准品溶液均为单独配制。
2.3供试品溶液制备
取本发明药物胶囊剂内容物1.0g，精密称定，加入80%甲醇25mL，称重，超声30min，放置室温，称重，用80%甲醇补足重量，混匀后离心4500rpm，15min，移取上清液13mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至25mL大孔吸附树脂XAD7HP的层析柱中，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
按2.3要求取110803批样品制备供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样5次，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于2.8%，相对峰面积的RSD小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.4.2稳定性试验
按2.3要求取110803批样品制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别在0，2，4，8，12，16，20，24h进样分析，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于2.7%，相对峰面积的RSD小于2.9%，表明样品在24h内稳定。
2.4.3重复性试验
取110803批样品5份，按2.3要求分别制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于1.6%，相对峰面积的RSD小于2.7%，表明方法重现性良好。
2.5指纹图谱的建立及相似度分析
2.5.1指纹图谱的建立
取10批芪苈强心胶囊样品，按2.3要求制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到10批芪苈强心胶囊的指纹图谱，见图1，并采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对10批样品的指纹图谱进行分析，以S5为参照指纹图谱，见图2，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，其中共有色谱峰43个，用标准品指认了其中6个共有峰，分别为丹参素钠（2号峰）、丹参酚酸B（25号峰）、人参皂苷Rb1（32号峰）、人参皂苷Rc（33号峰）、人参皂苷Rb2（34号峰）、人参皂苷Rd（35号峰），以出峰稳定，峰面积较大的25号色谱峰-丹参酚酸B为参照峰。
2.5.2指纹图谱相似度分析
采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对10批芪苈强心胶囊的指纹图谱进行分析，以S5为参照指纹图谱，见图2，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，生成芪苈强心胶囊共有模式的对照指纹图谱（R），然后进行了相似度计算，10批芪苈强心胶囊与对照指纹图谱的相似度见表1。
表1十批芪苈强心胶囊指纹图谱相似度表
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R
S1 1.000 0.995 0.991 0.995 0.997 0.996 0.997 0.992 0.997 0.998 0.998
S2 0.995 1.000 0.979 0.989 0.990 0.996 0.999 0.983 0.991 0.992 0.993
S3 0.991 0.979 1.000 0.996 0.995 0.987 0.985 0.998 0.995 0.995 0.996
S4 0.995 0.989 0.996 1.000 0.999 0.995 0.991 0.999 0.999 0.998 0.999
S5 0.997 0.990 0.995 0.999 1.000 0.996 0.992 0.998 0.999 0.997 0.999
S6 0.996 0.996 0.987 0.995 0.996 1.000 0.997 0.991 0.997 0.997 0.997
S7 0.997 0.999 0.985 0.991 0.992 0.997 1.000 0.986 0.994 0.995 0.995
S8 0.992 0.983 0.998 0.999 0.998 0.991 0.986 1.000 0.997 0.996 0.997
S9 0.997 0.991 0.995 0.999 0.999 0.997 0.994 0.997 1.000 1.000 1.000
S10 0.998 0.992 0.995 0.998 0.997 0.997 0.995 0.996 1.000 1.000 0.999
R 0.998 0.993 0.996 0.999 0.999 0.997 0.995 0.997 1.000 0.999 1.000
3其他研究：
发明人考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.15%磷酸、甲醇-0.15%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.2%磷酸7个流动相系统，结果表明乙腈-0.15%磷酸流动相系统的色谱图中出峰较多，各峰分离度较好，基线平稳，且条件温和有利于指纹图谱的分析，因此最终采用乙腈-0.15%磷酸流动相系统。
发明人还分别考察了提取溶剂60%甲醇、80%甲醇、纯甲醇，结果表明采用80%甲醇提取的样品色谱图中出峰较多，峰面积较大，故提取溶剂确定为80%甲醇；考察了超声、回流两种提取方式，结果表明二者提取效率相当，但超声提取操作简便，故选择超声提取；考察了1.0g芪苈强心胶囊分别用25mL、50mL、75mL80%甲醇提取，结果表明50mL与75mL提取的色谱图基本一致，所以确定提取溶剂用量为1.0g芪苈强心胶囊用50mL80%甲醇超声；考察了超声10min、30min、50min，结果表明超声30min与50min提取效率相当，因此确定超声时间为30min；考察了AB-8，XAD7HP大孔吸附树脂对芪苈强心胶囊的富集效果，结果表明，采用XAD7HP大孔吸附树脂吸附，水洗脱除杂，95%乙醇洗脱部位分析，能有效去除大量有色物质干扰，同时能最大限度的保留芪苈强心胶囊中化学成份。
发明人还考察了203nm、254nm、280nm、330nm的色谱图，结果表明203nm的色谱图中色谱峰较多，故确定检测波长为203nm；本实验还考察不同色谱柱温度：40℃、50℃，不同分析流速：0.3mL.min-1、0.4mL.min-1、0.5mL.min-1，结果表明色谱柱温度为40℃，流速为0.5mL.min-1时色谱图中出峰较多，各峰分离度及峰形较好，分析时间适中。
本发明建立了本发明中药组合物的UPLC指纹图谱，共标定了43个共有峰，指认了其中6个共有峰，为提高该中药组合物的质量控制提供一种新方法。
附图说明
图110批本发明中药组合物胶囊UPLC指纹图谱。
图2本发明中药组合物胶囊参照指纹图谱。
图3本发明中药组合物片剂指纹图谱(实施例2)。
图4本发明中药组合物口服液指纹图谱(实施例3)。
图5本发明中药组合物颗粒剂指纹图谱(实施例4)。
具体实施方式
实施例1
原料药配方为：
黄芪450g、附子112.5g、人参225g、丹参225g、葶苈子150g、南五加皮180g、泽泻225g、玉竹75g、桂枝90g、红花90g、陈皮75g。
制备方法为：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.28的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，68℃烘干；
（4）干膏混合粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，制成1000粒，即得；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为AcquityUPLCBEHC18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流速为0.5mL.min-1检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸；梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂1.0g，精密称定，加入80%的甲醇25mL，称重，超声30min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液13mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂XAD7HP的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
精密度RSD(%) 重复性RSD(%) 溶液稳定性RSD(%)
结果 3.0 2.7 2.9
结论：该方法用于测定上述胶囊剂指纹图谱，图谱见图2，结果令人满意可以用于控制上述胶囊剂的质量。
实施例2
原料药配方为：
黄芪150g、附子40g、人参225g、丹参225g、葶苈子50g、香加皮180g、泽泻75g、玉竹75g、桂枝30g、红花90g、陈皮25g；
制备方法：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65℃烘干；
（4）按常规制剂方法制成片剂；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为FortisUPLCC18柱，规格为2.1mm×150mm，1.7μm，柱温20℃，流速0.2mL.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸，梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取上述片剂细粉2.0g，精密称定，加入60%甲醇25mL作为溶剂，称重，超声15min，放置室温，称重，用60%甲醇补足重量，混匀后离心(4000rpm,10分钟)，取上清液10mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂D101的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液0.5μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
精密度RSD(%) 重复性RSD(%) 溶液稳定性RSD(%)
结果 2.5 2.1 2.7
结论：该方法用于测定上述片剂指纹图谱，见图3，结果令人满意可以用于控制上述片剂的质量。
实施例3
原料药配方为：黄芪250g、附子112.5g、党参200g、丹参120g、葶苈子135g、南五加皮150g、泽泻200g、玉竹60g、桂枝75g、红花75g、陈皮60g；
制备方法为：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，70℃烘干；
（4）按常规制剂方法制成口服液；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为HypersilGoldC18柱，规格为2.1mm×100mm，1.9μm，柱温50℃，流速0.8mL.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸，梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取上述口服液2g，精密称定，加入85%甲醇25mL作为溶剂，称重，超声40min，放置室温，称重，用85%甲醇补足重量，混匀后在5000rpm离心5分钟，取上清液15mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂H-20的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1.5μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
精密度RSD(%) 重复性RSD(%) 溶液稳定性RSD(%)
结果 2.5 2.8 2.6
结论：该方法用于测定上述口服液指纹图谱，见图4，结果令人满意可以用于控制上述口服液的质量。
实施例4
黄芪255g、附子115g、党参180g、丹参115g、葶苈子145g、香加皮158g、泽泻190g、玉竹68g、桂枝80g、红花80g、陈皮68g；
制备方法为：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮按照上述处方加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照处方量蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.30的清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，70℃烘干；
（4）按常规制剂方法制成颗粒剂；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：AcquityUPLCBEHC18柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温46℃，流速0.8mL.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸，梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取上述颗粒剂1.8g，精密称定，加入85%甲醇25mL作为溶剂，称重，超声40min，放置室温，称重，用85%甲醇补足重量，混匀后在5000rpm离心5分钟，取上清液15mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂H-20的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1.5μL，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得；
评价结果：
评价结果表
精密度RSD(%) 重复性RSD(%) 溶液稳定性RSD(%)
结果 2.1 0.8 1.5
结论：该方法用于测定上述颗粒剂的指纹图谱，见图5，结果令人满意可以用于控制上述颗粒剂的质量。

Claims (6)

1.一种中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成：黄芪150-450、附子40-120、人参或党参75-225、丹参75-225、葶苈子50-150、香加皮或南五加皮60-180、泽泻75-225、玉竹25-75、桂枝30-90、红花30-90、陈皮25-75；所述中药组合物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂，所述胶囊剂由以下步骤组成：
（1）将黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮按照比例量称取加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25-1.30的清膏，备用；
（2）桂枝、陈皮按照比例蒸馏提取挥发油，提油后的水溶液滤过，备用，残渣再加8倍量水煎煮1小时，滤过，合并水煎液，备用；
（3）附子、丹参、玉竹、红花加水9倍量煎煮2次，每次2小时，合并提取液，滤过，与步骤（2）中桂枝、陈皮水煎液合并，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25-1.30清膏，搅拌中加入乙醇，至醇浓度70%，4℃以下静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度在60℃测定为1.25-1.30清膏，与步骤（1）的醇提清膏混合，65-70℃烘干；
（4）将步骤（3）所得干膏粉碎成100目粉，加70%乙醇适量制粒，喷入桂枝、陈皮挥发油，混匀，装胶囊，即得，
其特征在于该方法采用超高压液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为C18柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8mL.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，D为0.15%磷酸；梯度洗脱：0～1min，1%～1%B，1～2.5min，1%～5%B，2.5～10min，5%～10%B，10～13min，10%～12%B，13～29min，12%～21%B，29～42min，21%～40%B，42～55min，40%～80%B，55～56min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5-2.0g，精密称定，加入60-85%的甲醇25mL，称重，超声15-40min，放置室温，称重，用60-85%的甲醇补足重量，混匀后离心，移取上清液10-15mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液0.5-1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述色谱柱为AcquityUPLCBEHC18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为40℃；流速为0.5mL.min-1；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂1.0g，精密称定，加入80%的甲醇25mL，称重，超声30min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液13mL蒸干，用10mL去离子水混悬，上样至装有25mL大孔吸附树脂XAD7HP的层析柱，先用200mL去离子水洗脱，再用200mL95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液蒸干，干膏用80%甲醇溶解定容至25mL，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
3.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，所述中药组合物制剂是由如下重量的原料药制成：
黄芪450、附子112.5、人参或党参225、丹参225、葶苈子150、香加皮或南五加皮180、泽泻225、玉竹75、桂枝90、红花90、陈皮75。
4.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：
黄芪150、附子40、人参或党参225、丹参225、葶苈子50、香加皮或南五加皮180、泽泻75、玉竹75、桂枝30、红花90、陈皮25。
5.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：
黄芪250、附子112.5、人参或党参200、丹参120、葶苈子135、香加皮或南五加皮150、泽泻200、玉竹60、桂枝75、红花75、陈皮60。
6.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：
黄芪255、附子115、人参或党参180、丹参115、葶苈子145、香加皮或南五加皮158、泽泻190、玉竹68、桂枝80、红花80、陈皮68。
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