CN108226325B - 葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法,属于中药制药分析技术领域。本发明方法采用高效液相色谱法,色谱条件为:流速1.00ml/ml;柱温:30℃;检测仪器采用紫外‑可见分光检测器,流动相以乙腈‑0.1%磷酸溶液为系统进行梯度洗脱。本发明指纹图谱全面反映出葶苈生脉口服液组合物的质量信息,从而可更加全面、有效地控制葶苈生脉口服液组合物制剂产品质量。
Description
技术领域
本发明属于中药制药分析技术领域,具体涉及葶苈生脉口服液的指纹图谱建立。
背景技术
充血性心力衰竭(简称CHF),是指心血管疾病发展到一定的严重程度,心脏失代偿的一种临床综合征。据世界卫生组织调查,心血管疾病是当今全世界死亡率最高的疾病,占总死亡人数的40%。葶苈生脉组方是全国名老中医邢月朋根据多年临床经验总结出的治疗气虚血瘀、阳虚水停型CHF的经验方,经过临床验证能有效缓解患者症状,改善生活质量,减少住院时间。
产品标准方面,国外植物药产品主要采用指纹图谱技术控制产品质量,该项技术特别适用于成分复杂的中成药产品质量控制。在我国,国家食品药品监督管理局只要求中药注射剂必须采用指纹图谱技术控制产品质量,在中药其他制剂方面还是空白。本项目在药品质量评价指标的选择上应用指纹图谱,采用多成分和特征色谱峰群综合控制质量的方法,突破单一成分控制质量的模式。既充分考虑、强调了中医药理论的整体观念,符合传统中医理论,同时应用现代科学技术,质量控制手段先进、可行。
关于葶苈生脉方的口服药物如葶苈生脉口服液的组合物确认及图谱的建立目前还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法,实现或得到的葶苈生脉口服液组合物指纹图谱。
一种葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法,其特征在于,采用高效液相色谱法,建立葶苈生脉口服液指纹图谱,包括以下步骤:
(1)选料:红参、黄芪、麦冬、五味子、葶苈子、桂枝、茯苓、白术、猪苓、泽泻、丹参、红花、川芎饮片,鉴定符合2015版药典一部相关项下规定;
(2)口服液的制备,以下所述的份数为质量份,包括以下步骤:①取上述黄芪20-30份、麦冬10-20份药材,加10倍重量80%的乙醇水溶液,回流提取两次,每次1.5小时,得到提取液A,取药渣,晾干;另取茯苓10-20份、猪苓10-20份,与上述药渣A合并,加入8倍重量的水,回流提取1.5小时,将提取液浓缩至每1ml清膏中含生药量(黄芪、麦冬、茯苓、猪苓总药量)为0.6-1.0g,调节温度至65℃,加入清膏体积1/4的质量百分含量1%壳聚糖水溶液,边加边匀速搅拌10分钟,静置24小时;离心,取上清液,加入5倍重量的质量95%的乙醇,搅拌均匀,再离心,分取沉淀得多糖;②取上述红参10-20份、五味子10-20份、川芎10-20份、葶苈子10-20份、泽泻30-40份五味药材,加入4倍重量75%的乙醇,回流提取3次,第一次3h,第二次2h,第三次1h,收集得到提取液B,回收乙醇至溶液无醇味,备用;③取上述丹参10-20份、红花10-20份两味药材,加入10倍重量60%乙醇超声提取4次,每次50min;收集得到提取液C,回收乙醇至溶液无醇味,备用;④取上述桂枝10-20份、白术10-20份药材药材投入装有提油装置的提取-共沸精馏,加入8倍重量水,浸泡3小时后,煮沸提油6小时,收集挥发油;⑤挥发油包合:取上述步骤④收集的挥发油至挥发油滴加器中,研钵中加入2倍重量水,加入羟丙基倍他环糊精,搅拌溶解,包合2h;⑥混合药液,即混合步骤①的提取液A、步骤②提取液B、步骤③提取液C混合浓缩,然后加入步骤①多糖、和步骤⑤包合的挥发油;提取液A、B、C混合浓缩时一般对应葶苈生脉方中的每黄芪20-30g最后浓缩到100ml,加防腐剂适量,加蔗糖适量如40份,调节口感;
(3)高效液相色谱条件:YMC J’sphere ODS-H80-C18(4.6mm×250mm,4μm),流动相为乙腈(A)-质量百分含量0.5%磷酸(B),梯度洗脱即:0-15min,15%-21%A;15-35min,21%-26%A;35-50min,26%-34%A;50-70min,34%-61%A;70-85min,61%-75%A;85-90min,75%-95%A;90-100min,95%-100%A,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,进样量30μL。检测波长203nm,270nm,上述梯度洗脱过程中每个时间段内的乙腈占总流动相的体积百分含量是匀速提升的,如0-15min,15%-21%A表示:在0-15min内,流动相中乙腈(A)的体积百分含量从15%逐渐提高的21%;得到相应的葶苈生脉口服液指纹图谱。
(4)然后采用人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B、羟基红花色素A、五味子甲素、黄芪甲苷对照品的高效液相色谱分别指代步骤(3)中对应的物质峰;即得最后的指纹图谱。
取10批相同组成的葶苈生脉口服液样品,在上述色谱条件下进样分析,得到10批葶苈生脉口服液的指纹图谱,并采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件对10批样品的指纹图谱进行分析,以第一批样品的图谱为参照指纹图谱,采用平均数相关系数法和时间宽度0.1对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配,生成葶苈生脉口服液共有模式的指纹图谱,然后进行了相似度计算,相似度基本为99%,说明本发明的方法重复性好,比较精确。
本发明优选指纹图谱的检测波长为203nm、270nm;理论板数按参照物丹酚酸B峰计算,应不低于3000;参照物溶液为丹酚酸B的甲醇溶液。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
中药指纹图谱技术是评价中药优劣、鉴别真伪、区分物种和确保其一致性和稳定性的有效方法。中药指纹图谱分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学指纹图谱是测定中药各种化学成分而得到的光谱或色谱图,其相应的分析技术包括红外光谱法、紫外光谱法、核磁共振波谱法、电化学法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等。
中药是中华民族的瑰宝,具有标本同治、安全、副作用小的优点,因此中药在治疗人类疾病中发挥着极大的作用。由于其本身的特殊性,仅靠外观、气味以及显微观察鉴定中药材的真假、优劣有一定的不准确性。中药化学指纹图谱相当于中药的化学DNA图谱,运用各种光谱、色谱和波谱分析技术的质量控制模式。中药指纹图谱具有整体性的特点,突出中药的完整面貌。同时同类药材指纹图谱具有相似性的特点,依靠该图谱实现了对中药内在化学成分的综合评价和整体质量的全面控制,使中药能够可控地运用到临床。
本发明指纹图谱全面反映出葶苈生脉口服液组合物的质量信息,从而可更加全面、有效地控制葶苈生脉口服液组合物制剂产品质量。
附图说明
图1为对照品图谱(A)与(B)-203nm和(C)-270nm对照指纹图谱。
203nm:3.人参皂苷Rg1(峰3)、5.人参皂苷Rb1(峰5)、6.黄芪甲苷(峰6)
270nm:1.羟基红花色素A、4.丹酚酸B、15.隐丹参酮、16.五味子甲素、17.丹参酮ⅡA.
图2为10批葶苈生脉口服液的指纹图谱;(A)-203nm、(B)-270nm。
图3为7种对照药材的HPLC图谱;
S1-对照药材人参(203nm)、S2-对照药材黄芪(203nm)、S3-对照药材白术,S4-对照药材丹参、S5-对照药材桂枝、S6-对照药材红花、S7-对照药材五味子.
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1指纹图谱的建立
高效液相色谱条件:YMC J’sphere ODS-H80-C18(4.6mm×250mm,4μm),流动相为乙腈(A)-质量百分含量0.5%磷酸(B),梯度洗脱即:0-15min,15%-21%A;15-35min,21%-26%A;35-50min,26%-34%A;50-70min,34%-61%A;70-85min,61%-75%A;85-90min,75%-95%A;90-100min,95%-100%A,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,进样量30μL。检测波长203nm,270nm,上述梯度洗脱过程中每个时间段内的乙腈占总流动相的体积百分含量是匀速提升的。即如下表:
1.1对照品溶液的制备
分别精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B、羟基红花色素A、五味子甲素、黄芪甲苷对照品适量,置5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,分别得到0.56mg.mL-1、0.24mg.mL-1、0.28mg.mL-1、0.3mg.mL-1、0.44mg.mL-1、0.52mg.mL-1、0.28mg.mL-1、0.22mg.mL-1的对照品溶液,备用。1.2对照药材的制备(葶苈生脉中有13味药物,用7种药物作为对照药,其他几味药的含量较少,并且不太适合液相检测,所以选择了7种具有代表性的)。
分别精密称取对照药材人参、对照药材丹参、对照药材红花、对照药材五味子、对照药材黄芪、对照药材桂枝、对照药材白术1g,置50mL锥形瓶中,加甲醇10mL,超声1h,将10mL甲醇置于蒸发皿中蒸发近干,加1mL甲醇溶解,置于5mL量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,分别得到各个对照药材溶液,备用。
1.3供试品溶液即葶苈生脉口服液的制备
称取黄芪,麦冬,醇提回流两次,得提取液1保存备用。剩余药渣加茯苓,猪苓,水提煎煮。将提取液离心,分取上清液,加水稀释,水浴加热至65℃,加壳聚糖,边加边匀速搅拌10分钟,静置24小时。离心,取上清液,加95%乙醇,离心,分取沉淀得多糖。取人参、五味子、川芎、葶苈子、泽泻,醇提回流三次,得提取液2保存备用。取丹参、红花加乙醇超声提取4次,得提取液3保存备用。采用旋转蒸发仪对提取液1、提取液2、提取液3、进行浓缩回收乙醇,合并所得浓缩液,在浓缩液中加入上述所得多糖与白术、桂枝混合挥发油羟丙基包合物(挥发油与HP-β-CD比值为1:10,2倍量的水,包合2h),得到葶苈生脉口服液样品,取样品中1mL置10mL量瓶中,加甲醇溶解定容,摇匀,备用。
1.4方法学考察
1.4.1精密度试验
取样品葶苈生脉口服液,按上述色谱条件连续进样6次,记录色谱图,以丹酚酸B为参照峰,计算共有峰相对保留时间及相对峰面积,结果各峰相对保留时间的RSD均<1%;相对峰面积的RSD均<2.9%,表明仪器精密度良好。
1.4.2重复性试验
按上述方法制备供试品溶液6份,按上述色谱条件连续进样6次,以丹酚酸B为参照峰,计算共有峰相对保留时间及相对峰面积,结果各峰相对保留时间的RSD均<1%;相对峰面积的RSD均<3%,说明方法重复性较好。
1.4.3稳定性试验
取样品的葶苈生脉口服液,分别在0,3,8,13,18,24h进样测定,以丹酚酸B为参照峰,计算共有峰相对保留时间及相对峰面积,结果各峰相对保留时间的RSD均<2%;相对峰面积的RSD均<3%,表明供试品溶液在24h内保持稳定。
1.5指纹图谱的建立
1.5.1相似度评价:取10批葶苈生脉口服液样品,在上述色谱条件下进样分析,得到10批葶苈生脉口服液的指纹图谱(图2),并采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件对10批样品的指纹图谱进行分析,以S1(可以认为第一批)号样品的图谱为参照指纹图谱,采用平均数相关系数法和时间宽度0.1对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配,其中203nm下共有色谱峰21个,270nm下共有色谱峰17个,用对照品指认了其中7个共有峰,分别203nm下为人参皂苷Rg1(峰3)、人参皂苷Rb1(峰5)、黄芪甲苷(峰6)、270nm下为羟基红花色素A(峰1)、丹酚酸B(峰4)、隐丹参酮(峰15)、五味子甲素(峰16)、丹参酮ⅡA(峰17)。以出峰稳定,峰面积较大的8号色谱峰(丹酚酸B峰)为参照峰;同时生成葶苈生脉口服液共有模式的指纹图谱见图2,然后进行了相似度计算,10批葶苈生脉口服液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.98。
图1中,共有峰的标定:在上述色谱条件下,测定对照药材与葶苈生脉口服液指纹图谱,将两者进行比较,发现葶苈生脉口服液指纹图谱中:在203nm下,1、2、3、4、5、7、8、15、16、19、20、21号峰为人参药材特征峰;3、5、6、19、20、21号峰为黄芪药材特征峰。其中,3、5、19、20、21号峰为人参和黄芪药材共有特征峰。在270nm下,2、6、11、13、15号峰为白术药材特征峰;3、4、15、17号峰为丹参药材特征峰;6号峰为桂枝药材特征峰;1、2、5、6、7、8、9、10、14号峰为红花药材特征峰;6、11、12、13、14、16号峰为五味子药材特征峰。其中,6号峰为白术、桂枝、红花及五味子药材共有特征峰;2号峰为白术与红花药材共有特征峰;11、13号峰为白术与五味子药材共有特征峰;14号峰为红花与五味子药材共有特征峰;15号峰为白术与丹参药材特征峰。
Claims (1)
1.一种葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法,其特征在于,采用高效液相色谱法,建立葶苈生脉口服液指纹图谱,包括以下步骤 :
(1)选料 :红参、黄芪、麦冬、五味子、葶苈子、桂枝、茯苓、白术、猪苓、泽泻、丹参、红花、川芎饮片;
(2)口服液的制备,以下所述的份数为质量份,包括以下步骤:①取上述黄芪20-30份、麦冬10-20份药材,加10倍重量80%的乙醇水溶液,回流提取两次,每次1.5小时,得到提取液A,取药渣,晾干;另取茯苓10-20份、猪苓10-20份,与上述药渣A合并,加入8倍重量的水,回流提取1.5小时,将提取液浓缩至每1ml清膏中含生药量为0.6-1.0g,所述的生药量为黄芪、麦冬、茯苓、猪苓总药量,调节温度至65℃,加入清膏体积1/4的质量百分含量1%壳聚糖水溶液,边加边匀速搅拌10分钟,静置24小时;离心,取上清液,加入5倍重量的质量95%的乙醇,搅拌均匀,再离心,分取沉淀得多糖;②取上述红参10-20份、五味子10-20份、川芎10-20份、葶苈子10-20份、泽泻30-40份五味药材,加入4倍重量75%的乙醇,回流提取3次,第一次3h,第二次2h,第三次1h,收集得到提取液B,回收乙醇至溶液无醇味,备用;③取上述丹参10-20份、红花10-20份两味药材,加入10倍重量60%乙醇超声提取4次,每次50 min;收集得到提取液C,回收乙醇至溶液无醇味,备用;④取上述桂枝10-20份、白术10-20份药材投入装有提油装置的提取-共沸精馏,加入8倍重量水,浸泡3小时后,煮沸提油6小时,收集挥发油;⑤挥发油包合:取上述步骤④收集的挥发油至挥发油滴加器中,研钵中加入2倍重量水,加入羟丙基倍他环糊精,搅拌溶解,包合2 h;⑥混合药液,即混合步骤①的提取液A、步骤②提取液B、步骤③提取液C 混合浓缩,然后加入步骤①多糖、和步骤⑤包合的挥发油;提取液A、B、C混合浓缩时对应葶苈生脉方中的每20-30g黄芪最后浓缩到100ml,加防腐剂适量,加蔗糖适量,调节口感;
(3)高效液相色谱条件:YMC J’sphere ODS-H80-C18,流动相为乙腈即A-质量百分含量0.5%磷酸即B,梯度洗脱即:0-15min,15%-21%A;15-35min,21%-26%A;35-50min,26%-34%A;50-70min,34%-61%A;70-85min,61%-75%A;85-90min,75%-95%A;90-100min,95%-100%A,流速 1.0 mL•min-1,柱温 30 ℃,进样量 30 μL;检测波长 203 nm,270nm,上述梯度洗脱过程中每个时间段内的乙腈占总流动相的体积百分含量是匀速提升的;
(4)然后采用人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B、羟基红花色素A、五味子甲素、黄芪甲苷对照品的高效液相色谱分别指代步骤(3)中对应的物质峰;即得最后的指纹图谱。
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