CN103675168B - 一种养心中药制剂指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种养心中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该方法采用超高压液相色谱法测定一种养心中药组合物制剂的指纹图谱，该方法符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制该养心中药组合物制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及到一种中药组合物制剂指纹图谱的测定方法。
背景技术
专利ZL02146572.X公开了一种治疗冠心病室性早搏的药物组合物及其制备方法，该药物组合物由人参、麦冬、山茱萸、丹参、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、土鳖虫、甘松、黄连、南五味子、龙骨组成，由于中药成分非常复杂，制成制剂后，在进行产品质量控制时，只有对尽量多的成分进行鉴别和含量的测定，才更有利于保证药品的安全有效，质量的稳定可控。
超高效液相色谱（UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
与传统的HPLC相比，UPLC具有高压、高速、高灵敏度的特点。UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。
中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。指纹图谱应该具备指纹性，即：（1）专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该中药所独有的、能与其它中药相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的；（2）稳定性好。即中药的指纹图谱应该是从某中药的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定；（3）重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征（如共有峰数目、大小、位置等），其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值，才可以有效控制药品的质量。
采用UPLC指纹图谱方法控制药品质量具有灵敏、快速、简便、准确等特点，通过优选色谱条件测定药品制剂的指纹图谱，可以很好控制药品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份，
其特征在于该方法采用超高压液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为C18柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8ml.min-1，检测波长203nm，流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入60-85%的甲醇50ml，称重，超声45-60min，放置室温，称重，用60-85%的甲醇补足重量，混匀后离心，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液0.5-1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
本发明指纹图谱测定方法色谱条件优选如下：所述色谱柱为AcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃；流速为0.4ml.min-1；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
本发明指纹图谱测定方法，还同时对芍药苷、丹酚酸B、五味子酯甲进行了含量测定。其中，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法，适用的中药组合物制剂原料药的重量比例优选为：
人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
或者优选为：
人参45份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参225份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、赤芍89份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
或者优选为：
人参90份、麦冬135份、山茱萸270份、丹参200份、炒酸枣仁150份、桑寄生150份、赤芍100份、土鳖虫100份、甘松95份、黄连60份、南五味子75份、龙骨150份。
本发明中药组合物的指纹图谱测定方法中，该中药组合物制剂的活性成分可由下列步骤制成：
a)人参加70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，浓缩，烘干，粉碎成细粉;
b)南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松共同加70%乙醇回流提取3次，合并提取液，滤过，浓缩成浸膏;
c)土鳖虫粉碎成细粉;
d)麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮2次，合并提取液，浓缩成浸膏；
e)将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉，烘干，粉碎成细粉，加入步骤a)所得药物细粉，混匀即得该中药组合物活性成分。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法中，适用该中药组合物制剂的剂型优选为片剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂。
本发明中药组合物制剂的指纹图谱测定方法，适用的该中药组合物胶囊剂的制备方法优选为：
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成80目粉;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳌虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，与步骤(1)、(3)粉混匀，烘干，粉碎成80目粉，装胶囊即得。
上述中药组合物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。
本发明方法测定该中药组合物指纹图谱从多个方面评价该方法的可行性，评价方法如下：
1、仪器与试药
美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站（ACQUITYUPLCHCLASS）；KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平（AG135，METTLERTO-LEDO）；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）。
磷酸（色谱级，批号20120104，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，批号20120110，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（色谱级，Fisher）；实验用水为超纯水。
本发明中药组合物胶囊剂由石家庄以岭药业股份有限公司提供（按照实施例1的方法制备），共十批（批号S1:1201005；2,S2:1203031；S3:1101042；S4:1201002；S5:1106042；S6:1107006；S7:1106047；S8:1103003；S9:1111018；S10:1109017）；丹酚酸B（111562-201111）、芍药苷（110736-201136）、五味子酯甲（111529-200604）均购于中国药品生物制品鉴定所。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为WatersAcquityUPLCHSST3C18（2.1mm×100mm，1.8um），柱温35℃，流速0.4ml.min-1，检测波长203nm，进样1ul，流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸，梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B。
2.2对照品溶液制备
采用外标法，称取芍药苷适量，精密称定，用25%甲醇配制成芍药苷浓度为0.15mg.ml-1的溶液；称取丹酚酸B适量，精密称定，用水配制成丹酚酸B浓度为0.6mg.ml-1的溶液；称取五味子酯甲适量，精密称定，用甲醇配制成浓度为0.05mg.ml-1的溶液。
2.3供试品溶液制备
取本发明药物组合物胶囊内容物0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
2.4方法学考察
2.4.1标准曲线及线性关系
芍药苷（0.15mg.ml-1）、丹酚酸B（0.6mg.ml-1）、五味子酯甲（0.05mg.ml-1）被分别稀释成一系列浓度，UPLC分析，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，得到3个标准曲线。
表1线性方程和线性范围
| 标准品 | 线性方程 | 线性关系 | 线性范围(mg/ml) |
| 芍药苷 | y=1648934.01x-3023.76 | 1.0000 | 0.0293-0.1173 |
| 丹酚酸B | y=845392.74x-1714.44 | 1.0000 | 0.1229-0.4916 |
| 五味子酯甲 | y=7032716.99x+1979.17 | 1.0000 | 0.0043-0.0173 |
2.4.2精密度试验
标准品溶液芍药苷（0.15mg.ml-1）、丹酚酸B（0.6mg.ml-1）、五味子酯甲（0.05mg.ml-1）和样品液（1201005）UPLC连续进样5次，芍药苷（230nm）、丹酚酸B（286nm）、五味子酯甲（221nm）相对峰面积的RSD为0.41%,0.33%,0.54%，样品液（203nm）的相对保留时间及相对峰面积的RSD小于0.67%、1.21%，结果表明本方法具有好的精密度。
2.4.3稳定性试验
样品液（1201005）分别在0,6,12,24,36,48h进样分析，芍药苷（230nm）、丹酚酸B（286nm）、五味子酯甲（221nm）相对峰面积的RSD为1.51%1.48%,1.65%,样品液（203nm）的相对保留时间及相对峰面积的RSD小于2.15%和2.87%，结果表明样品在48h内稳定。
2.4.3重复性试验
称取12010056批次样品6份，按样品制备方法制备样品液，分别进样分析，芍药苷（230nm）、丹酚酸B（286nm）、五味子酯甲（221nm）相对峰面积的RSD为1.03%,0.78%,0.95%。样品液（203nm）的相对保留时间及相对峰面积的RSD小于1.45%和2.67%。结果表明方法有好的重现性。
2.4.4加样回收率考察
称取1201005批次样品6份，0.5g/份，分别加入适量的标准品芍药苷、丹酚酸B、五味子酯甲，按样品制备方法制备样品液，分别进样分析，计算加样回收率，芍药苷（230nm）、丹酚酸B（286nm）、五味子酯甲（221nm）的加样回收率分别为99.12%(RSD=2.65%),99.40%(RSD=2.23%)、98.33%(RSD=2.84%)
表2三种成分加样回收结果(n=6)
| 化合物 | 样品中的量/mg | 加入量/mg | 检出量/mg | 平均回收率/% | RSD/% |
| 芍药苷 | 1.74 | 1.70 | 3.425 | 99.12 | 2.65 |
| 丹酚酸B | 5.44 | 5.00 | 10.41 | 99.40 | 2.23 |
| 五味子酯甲 | 0.25 | 0.30 | 0.545 | 98.33 | 2.84 |
2.5指纹图谱的建立及相似度分析
2.5.1指纹图谱的建立
取10批本发明药物组合物样品，按2.3要求制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到10批本发明药物组合物的指纹图谱见图1，并采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对10批样品的指纹图谱进行分析，以S5为参照指纹图谱见图2，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，其中共有色谱峰41个，用标准品指认了其中3个共有峰，分别为芍药苷（10号峰）、丹酚酸B（19号峰）、五味子酯甲（34号峰），以出峰稳定，峰面积较大的19号色谱峰-丹酚酸B为参照峰。
2.5.2指纹图谱相似度分析
采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对10批本发明药物组合物的指纹图谱进行分析，以S6为参照指纹图谱见图2，采用平均数相关系数法对各指纹图谱色谱峰进行了多点校正和自动匹配，生成本发明药物组合物共有模式的对照指纹图谱（R），然后进行了相似度计算，10批本发明药物组合物与对照指纹图谱的相似度见表3。
表3十批本发明药物组合物指纹图谱相似度表
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | R | |
| S1 | 1.000 | 0.957 | 0.985 | 0.994 | 0.995 | 0.973 | 0.972 | 0.997 | 0.996 | 0.955 | 0.989 |
| S2 | 0.957 | 1.000 | 0.980 | 0.979 | 0.977 | 0.988 | 0.997 | 0.969 | 0.946 | 0.996 | 0.986 |
| S3 | 0.985 | 0.980 | 1.000 | 0.995 | 0.995 | 0.997 | 0.982 | 0.993 | 0.987 | 0.986 | 0.998 |
| S4 | 0.994 | 0.979 | 0.995 | 1.000 | 1.000 | 0.990 | 0.987 | 0.998 | 0.990 | 0.980 | 0.999 |
| S5 | 0.995 | 0.977 | 0.995 | 1.000 | 1.000 | 0.989 | 0.986 | 0.998 | 0.991 | 0.979 | 0.998 |
| S6 | 0.973 | 0.988 | 0.997 | 0.990 | 0.989 | 1.000 | 0.986 | 0.985 | 0.973 | 0.994 | 0.995 |
| S7 | 0.972 | 0.997 | 0.982 | 0.987 | 0.986 | 0.986 | 1.000 | 0.980 | 0.959 | 0.991 | 0.991 |
| S8 | 0.997 | 0.969 | 0.993 | 0.998 | 0.998 | 0.985 | 0.980 | 1.000 | 0.995 | 0.971 | 0.996 |
| S9 | 0.996 | 0.946 | 0.987 | 0.990 | 0.991 | 0.973 | 0.959 | 0.995 | 1.000 | 0.950 | 0.986 |
| S10 | 0.955 | 0.996 | 0.986 | 0.980 | 0.979 | 0.994 | 0.991 | 0.971 | 0.950 | 1.000 | 0.988 |
| R | 0.989 | 0.986 | 0.998 | 0.999 | 0.998 | 0.995 | 0.991 | 0.996 | 0.986 | 0.988 | 1.000 |
2.5.3三个活性成份的同时测定
10批本发明药物组合物，0.5g/批，按样品制备方法制备，UPLC分析，结果见表4
表4十批本发明药物组合物中芍药苷、丹酚酸B、五味子酯甲含量
3其他研究：
发明人考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.15%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.2%磷酸7个流动相系统，结果表明乙腈-0.1%磷酸流动相系统的色谱图中出峰较多，各峰分离度较好，基线平稳，且条件温和有利于指纹图谱的分析，因此最终采用乙腈-0.1%磷酸流动相系统。
发明人还分别考察了提取溶剂60%甲醇、80%甲醇、纯甲醇，结果表明采用80%甲醇提取的样品色谱图中出峰较多，峰面积较大，故提取溶剂确定为80%甲醇；考察了超声、回流两种提取方式，结果表明二者提取效率相当，但超声提取操作简便，故选择超声提取；本发明药物组合物别用25ml、50ml、75ml80%甲醇提取，结果表明50ml与75ml提取的色谱图基本一致，所以确定提取溶剂用量为用50ml80%甲醇超声；考察了超声10min、30min、50min，结果表明超声50min效果最好，因此确定超声时间为50min.
发明人还考察了201-205nm的色谱图，结果表明203nm的色谱图中色谱峰较多，故确定检测波长为203nm；本实验还考察不同色谱柱温度：20-50℃，不同分析流速：0.2-0.8ml·min-1，结果表明色谱柱温度为35℃，流速为0.4ml·min-1时色谱图中出峰较多，各峰分离度及峰形较好，分析时间适中，但不不限制在这些参数范围，因为在这些参数范围内，也可能实现本发明的目的。
本发明建立了本发明中药组合物的UPLC指纹图谱，共标定了41个共有峰，指认了其中3个共有峰，并对其中的芍药苷、丹酚酸B、五味子酯甲同时进行了含量测定，其中芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm。本方法具有良好的精密度和稳定性，以及重复性，为提高该中药组合物的质量控制提供一种新方法。
附图说明
图110批本发明中药组合物胶囊UPLC指纹图谱。
图2本发明中药组合物胶囊参照指纹图谱。
图3本发明中药组合物片剂指纹图谱(实施例2)。
图4本发明中药组合物口服液指纹图谱(实施例3)。
图5本发明中药组合物颗粒剂指纹图谱(实施例4)。
具体实施方式
实施例1
原料药配方为：
人参89g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参224g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、土鳖虫75g、甘松89g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
制备方法为：
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成80目粉;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳖虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，与步骤(1)、(3)粉混匀，烘干，粉碎成80目粉，装胶囊,制成1000粒，即得。
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温35℃；流速0.4ml.min-1；指纹图谱检测波长203nm，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm；流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
对照品溶液的配置：精密称取芍药苷对照品14.9859mg，用25%甲醇定容至100ml容量瓶中；精密称取丹酚酸B对照品30.0004mg，用水定容至50ml容量瓶中；精密称取五味子酯甲对照品10.0542mg，加甲醇定容至5ml容量瓶中，用时稀释成浓度为0.05mg.ml-1的溶液。
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后离心15min，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
| 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 2.5 | 2.7 | 2.9 |
含量测定：
| 芍药苷（mg/g） | 丹酚酸B（mg/g） | 五味子酯甲（mg/g） | |
| 结果 | 3.45 | 10.98 | 0.47 |
结论：该方法用于测定上述胶囊剂指纹图谱，图谱见图2，结果令人满意可以用于控制上述胶囊剂的质量。
实施例2
原料药配方为：
人参45g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参225g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
制备方法：
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次1小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成80目粉;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳖虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，第一次3小时，第二次1小时，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，与步骤(1)、(3)粉混匀，烘干，粉碎成80目粉，
（4）按常规制剂方法制成片剂；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温40℃，流速0.5ml.min-1，指纹图谱检测波长203nm，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm；流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
对照品溶液的配置：精密称取芍药苷对照品14.9859mg，用25%甲醇定容至100ml容量瓶中；精密称取丹酚酸B对照品30.0004mg，用水定容至50ml容量瓶中；精密称取五味子酯甲对照品10.0542mg，加甲醇定容至5ml容量瓶中，用时稀释成浓度为0.05mg.ml-1的溶液。
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后离心15min，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
| 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 2.5 | 2.1 | 2.7 |
含量测定：
| 芍药苷（mg/g） | 丹酚酸B（mg/g） | 五味子酯甲（mg/g） | |
| 结果 | 3.37 | 11.03 | 0.51 |
结论：该方法用于测定上述片剂指纹图谱，见图3，结果令人满意可以用于控制上述片剂的质量。
实施例3
原料药配方为：人参89g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参224g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、土鳖虫75g、甘松89g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳖虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，
(5)、按常规制剂方法制成口服液；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温36℃；流速0.4ml.min-1；指纹图谱检测波长203nm，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm；流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
对照品溶液的配置：精密称取芍药苷对照品14.9859mg，用25%甲醇定容至100ml容量瓶中；精密称取丹酚酸B对照品30.0004mg，用水定容至50ml容量瓶中；精密称取五味子酯甲对照品10.0542mg，加甲醇定容至5ml容量瓶中，用时稀释成浓度为0.05mg.ml-1的溶液。
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入60%的甲醇50ml，称重，超声60min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后离心15min，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
| 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 2.9 | 2.8 | 2.6 |
含量测定：
| 芍药苷（mg/g） | 丹酚酸B（mg/g） | 五味子酯甲（mg/g） | |
| 结果 | 3.37 | 10.63 | 0.39 |
结论：该方法用于测定上述口服液指纹图谱，图谱见图4，结果令人满意可以用于控制上述口服液的质量。
实施例4
人参45g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参225g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
制备方法为：
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次1小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成80目粉;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳖虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，第一次3小时，第二次1小时，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，与步骤(1)、(3)粉混匀，烘干，粉碎成80目粉，
（4）按常规制剂方法制成颗粒剂型；
指纹图谱测定方法：
色谱条件：色谱柱为WatersAcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温35℃，流速0.4ml.min-1，指纹图谱检测波长203nm，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm；流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
对照品溶液的配置：精密称取芍药苷对照品14.9859mg，用25%甲醇定容至100ml容量瓶中；精密称取丹酚酸B对照品30.0004mg，用水定容至50ml容量瓶中；精密称取五味子酯甲对照品10.0542mg，加甲醇定容至5ml容量瓶中，用时稀释成浓度为0.05mg.ml-1的溶液。
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后离心15min，移取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
评价结果：
评价结果表
| 精密度RSD(%) | 重复性RSD(%) | 溶液稳定性RSD(%) | |
| 结果 | 2.4 | 2.1 | 2.3 |
含量测定：
| 芍药苷（mg/g） | 丹酚酸B（mg/g） | 五味子酯甲（mg/g） | |
| 结果 | 3.25 | 10.29 | 0.49 |
结论：该方法用于测定上述颗粒剂指纹图谱，见图5，结果令人满意可以用于控制上述颗粒剂的质量。
Claims (9)
1.一种中药组合物制剂指纹图谱测定方法，该中药组合物制剂是由如下重量份的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份，其特征在于该方法采用超高压液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为C18柱，柱温20-50℃，流速0.2-0.8ml·min-1，检测波长201-205nm，流动相B为乙腈，A为0.1%磷酸；梯度洗脱：0～2min，1%～1%B，2～7min，1%～10%B，7～9min，10%～12%B，9～26min，12%～28%B，26～36min，28%～60%B，36～42min，60%～80%B，42～45min，80%～80%B；
供试品溶液的配制：取所述中药组合物制剂0.5g，精密称定，加入60-85%的甲醇50ml，称重，超声45-60min，放置室温，称重，用60-85%的甲醇补足重量，混匀后离心，移取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液0.5-1.5μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述色谱柱为AcquityUPLCHSST3C18，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃；流速为0.4ml·min-1；检测波长为203nm；
供试品溶液的配制：取本发明药物组合物制剂0.5g，精密称定，加入80%的甲醇50ml，称重，超声50min，放置室温，称重，用80%的甲醇补足重量，混匀后在4500rpm离心15分钟，移取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，注入超高压液相色谱仪，记录色谱图，即得。
3.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于同时对芍药苷、丹酚酸B、五味子酯甲进行了含量测定，芍药苷的检测波长为230nm、丹酚酸B的检测波长为286nm、五味子酯甲的检测波长为221nm。
4.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂是由如下重量的原料药制成：
人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
5.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：
人参45份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参225份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、赤芍89份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
6.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂由下列重量的原料药制成：
人参90份、麦冬135份、山茱萸270份、丹参200份、炒酸枣仁150份、桑寄生150份、赤芍100份、土鳖虫100份、甘松95份、黄连60份、南五味子75份、龙骨150份。
7.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂的活性成分由下列步骤制成：
a)人参加70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，浓缩，烘干，粉碎成细粉;
b)南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松共同加70%乙醇回流提取3次，合并提取液，滤过，浓缩成浸膏;
c)土鳖虫粉碎成细粉;
d)麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮2次，合并提取液，浓缩成浸膏；
e)将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉，烘干，粉碎成细粉，加入步骤a)所得药物细粉，混匀即得该中药组合物活性成分。
8.如权利要求1或2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂。
9.根据权利要求8所述的指纹图谱测定方法，其特征在于所述胶囊剂的制剂方法由以下步骤组成：
(1)、人参加8倍量70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成80目粉;
(2)、五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松加8倍量70%乙醇回流提取3次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过，回收乙醇;
(3)、土鳖虫粉碎成80目粉;
(4)、麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水9倍量煎煮2次，合并提取液，滤过，与步骤(2)的提取液合并，浓缩，与步骤(1)、(3)粉混匀，烘干，粉碎成80目粉，装胶囊即得。
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