CN108896681A - 一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用 - Google Patents

一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对安神补脑液中化学成分进行分析鉴别、含量测定及质量控制，具体涉及一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用。本发明建立方法包括对照溶液的制备、供试样品的制备、高效液相色谱法测定、建立指纹图谱、确定定量检测指标和质量控制步骤。本发明通过多指标成分的定量分析和指纹图谱技术建立安神补脑液HPLC多指标定量指纹图谱，对其进行综合的质量评价，为安神补脑液的质量控制提供了科学依据和技术支持。

Description

一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及对安神补脑液中化学成分进行分析鉴别、含量测定及质量控制，具体涉及一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用。
背景技术
安神补脑液是由淫羊藿、制何首乌、鹿茸、干姜、甘草、大枣、维生素B1七味药通过现代工艺精制而成的复方制剂，具有安神健脑、生精补髓、益气养血的功效，临床上常用于肾精不足、气血两亏所致的头晕、乏力、健忘、失眠及神经衰弱等症。近年来，随着现代工作节奏的加快，失眠、神经衰弱等各种亚健康现象呈增加趋势，安神补脑液在临床上的应用亦呈现增加趋势。2015版《中国药典》(一部)采用高效液相色谱法(HPLC)测定淫羊藿中淫羊藿苷和维生素B1的含量用于其质量控制。
中药指纹图谱是整体评价多维组分复杂基质中药质量的有效控制方法。将能够标识中药材或制剂特征成分的光谱图或色谱图结合现代数理统计软件进行分析处理，得到的指纹图谱信息能全面、综合地反映所含成分的相对关系，较好地体现中药成分的复杂性和相关性，在中药质量评价和控制方面得到了大量应用。为了更全面地控制该制剂的质量，保证其临床疗效，应建立准确可靠的方法来量化其中的化学成分，对多种活性成分进行研究，并结合中药色谱指纹图谱对其进行质量控制。
目前，对安神补脑液质量标准的研究也主要采用分析单个或两个化学成分的含量作为主要评价指标，质量控制指标比较少。李卓明等对安神补脑液进行了指纹图谱的研究，但没有进行化学成分定量测定。鉴于该制剂极其复杂的化学成分和中药多成分多靶点的特点，较少指标的质控体系不能很好的反应复方制剂的整体质量。因此，需要建立一种系统的质量评价方法对安神补脑液进行较全面的质量控制。
发明内容
本发明主要目的是，提供一种安神补脑液多指标定量指纹图谱建立方法及其应用。本发明通过HPLC-DAD-ESI-TOF/MS联用技术测定分析安神补脑液中的化学成分，结合中药配伍原则以及2015版《中国药典》中单味药质控指标选择该复方制剂质控指标，通过多指标成分的定量分析和指纹图谱技术建立安神补脑液HPLC多指标定量指纹图谱，对其进行综合的质量评价，以期为安神补脑液的质量控制提供了科学依据和技术支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一，提供一种安神补脑液多指标定量指纹图谱的建立方法，所述安神补脑液包括：由鹿茸、制何首乌、淫羊藿、干姜、甘草、大枣、维生素B1，所述安神补脑液多指标定量指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素，分别加入甲醇溶解各稀释成浓度为100-200μg·mL-1的溶液，即得；
(2)供试样品的制备
取安神补脑液样品，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，备用；
(3)高效液相色谱法测定
将步骤(1)对照品溶液、步骤(2)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters XELECTTM HSS T3色谱柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈-0.4％甲酸水溶液；检测波长为230-280nm；
柱温：20-35℃；进样量为10μL；
(4)建立指纹图谱、确定定量检测指标
取10批次安神补脑液按步骤(2)方法制备得到10个供试样品溶液，按步骤(3)分别进行高效液相色谱分析，记录色谱图；依据10批次次安神补脑液的指纹图谱，确定40个特征峰，其中1号峰为维生素B1、3号峰为次黄嘌呤、25号峰为甘草苷、27号峰为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷，35号峰为淫羊藿苷，37号峰为甘草酸，38号峰为6-姜辣素，40号峰为大黄素；并确定定量检测指标；
(5)质量控制
以步骤(4)确定的定量检测指标为检测指标，按步骤(3)对样品中相应指标进行定量检测，检测结果与步骤(4)所得指标平均值进行比较，即得。
为了能够建立完整的指纹图谱，本发明在实验过程中优化选择了WatersXELECTTM HSS T3(3.0mm×150mm,3.5μm)色谱柱进行分析，该色谱柱对安神补脑液中各化学成分分离效果较好。并通过优化，样品在乙腈-0.4％甲酸水体系下分离效果比较好，且峰数多。针对色谱峰拖尾现象，本发明在水相中加0.4％甲酸能较好改善拖尾现象，峰形尖锐。
0.4％甲酸水是指甲酸的质量分数为0.4％的甲酸水溶液。
优选的，梯度洗脱条件为：0-5min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；5-20min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；20-45min，乙腈0-7％，0.4％甲酸水100-93％；45-50min，乙腈7-9％，0.4％甲酸水93-91％；50-75min，乙腈9-12％，0.4％甲酸水91-88％；75-95min，乙腈12-18％，0.4％甲酸水88-82％；95-135min，乙腈18-24％，0.4％甲酸水82-76％；135-140min，乙腈24-25％，0.4％甲酸水76-75％；140-150min，乙腈25-35％，0.4％甲酸水75-65％；150-160min，乙腈35-45％，0.4％甲酸水65-55％；160-170min，乙腈45-70％，0.4％甲酸水55-30％；170-180min，乙腈70-90％，0.4％甲酸水30-10％。由于安神补脑液成分比较复杂，采用等度洗脱不能实现对其化学成分的有效分离，所以本发明采用梯度洗脱进行分析。在本发明梯度洗脱条件下，安神补脑液中各成分能够完全分离，从而克服了安神补脑液上述成分难分离的问题。
优选的，步骤(3)中的色谱条件还包括：流速：初始流速为0.2ml/min，在洗脱时间为5min时，将流速调整为0.3ml/min，梯度洗脱时间为8min时，将流速调整为0.5ml/min且保持该流速至洗脱结束。安神补脑液中的VB1成分极性很大，出峰时间太快，受其他极性成分影响较大，本实验采用初始低流速的方法实现了VB1的较好分离，而且方法简单易操作。
优选的，步骤(3)检测波长为278nm。在该检测波长下，安神补脑液的化学成分可以较全面的反应，且峰形较好，基线稳定。
优选的，步骤(3)柱温为25℃。本发明发现当柱温为25℃时，色谱峰分离度和峰型较好。
优选的，步骤(4)定量检测指标为：维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素。在本发明检测条件下，上述八种成分可以充分分离。
本发明目的之二，提供一种安神补脑液产品真伪鉴别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.待测样品进行高效液相色谱分析，
色谱检测条件为：
色谱柱：Waters XELECTTM HSS T3色谱柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈-0.4％甲酸水溶液；
柱温为25℃；检测波长为278nm；进样量为10μL；采用梯度洗脱；
梯度洗脱条件为：0-5min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；5-20min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；20-45min，乙腈0-7％，0.4％甲酸水100-93％；45-50min，乙腈7-9％，0.4％甲酸水93-91％；50-75min，乙腈9-12％，0.4％甲酸水91-88％；75-95min，乙腈12-18％，0.4％甲酸水88-82％；95-135min，乙腈18-24％，0.4％甲酸水82-76％；135-140min，乙腈24-25％，0.4％甲酸水76-75％；140-150min，乙腈25-35％，0.4％甲酸水75-65％；150-160min，乙腈35-45％，0.4％甲酸水65-55％；160-170min，乙腈45-70％，0.4％甲酸水55-30％；170-180min，乙腈70-90％，0.4％甲酸水30-10％；初始流速为0.2ml/min，在洗脱时间为5min时，将流速调整为0.3ml/min，梯度洗脱时间为8min时，将流速调整为0.5ml/min且保持该流速至洗脱结束；
S2.精密称取维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素标准品，分别加入甲醇溶解各稀释成不同浓度为的溶液，按步骤S1色谱条件进行分析，以各化合物质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，计算步骤S1样品中各指标的含量。
本发明目的之三，提供所述安神补脑液多指标定量指纹图谱在安神补脑液质量控制中的应用。
本发明目的之四，提供所述安神补脑液多指标定量指纹图谱在监控安神补脑液生产中的应用。
本发明目的之五，提供所述安神补脑液多指标定量指纹图谱和/或所述安神补脑液产品真伪鉴别的方法在鉴别安神补脑液产品真伪中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
(1)本发明安神补脑液多指标定量指纹图谱，精密度高、重复性、稳定性好；本发明多指标定量检测结果，与指纹图谱相似度评价所得结果相同。
(2)本发明安神补脑液多指标定量指纹图谱检测方法，既可对安神补脑液中有效成分实现定性检测又能进行定量检测，可有效用于安神补脑液质量控制和产品真伪的鉴别。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为对照品(A)和样品(B)的色谱图。
图2为10批样品的HPLC指纹图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
1实验仪器与材料
1.1仪器与设备
华谱S6000高效液相色谱仪，配有自动进样器、四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器；Agilent 6520 Q-TOF液质联用仪(Agilent Technologies,USA)；电子分析天平(十万分之一)(SARTOURIUS BSA)、指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹相似度评价系统”(国家药典委员会2004A)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2材料与试剂
乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific)，无水乙醇(分析纯，天津市广成化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)，甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，实验用水为密理博超纯水(18MΩ)。对照品VB1(LOT:SLBG9093V)、甘草苷(LOT:P25J7F18328)、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷(LOT:P25D5S1)、淫羊藿苷(LOT:T09N6B5664)、大黄素(LOT:P19A7F13264)，纯度均大于98％，购于上海源叶生物科技有限公司；次黄嘌呤(生产批号：F20100102),纯度大于98％，购于国药集团化药试剂有限公司；甘草酸、6-姜辣素为实验室自制，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一法质量分数均大于98％。10批样品(均为鲁南厚普有限公司生产)全部购置于济南市各大药店，样品信息见表1。
表1样品来源
Tab.1 The source of the samples
2方法与结果
2.1实验条件
2.1.1供试品溶液的制备
取安神补脑液样品(S1：07115003)，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，备用。
2.1.2标准品溶液的制备
分别精密称取1.0mg的VB1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素、大黄素对照品，置于1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成各化合物质量浓度为1mg·mL-1的标准储存液。精密吸取各对照品储备液适量于2mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成含500μg·mL-1的VB1，100μg·mL-1的次黄嘌呤，200μg·mL-1的甘草苷，200μg·mL-1的二苯乙烯苷，300μg·mL-1的淫羊藿苷，100μg·mL-1的甘草酸，100μg·mL-1的6-姜辣素和100μg·mL-1大黄素的标准混合对照品溶液，保存备用。
2.1.3色谱条件
Waters XELECTTM HSS T3色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈(A)-0.4％甲酸水溶液(B)；柱温为25℃；检测波长为278nm；进样量为10μL。采用梯度洗脱洗脱模式见表2，对照品及样品色谱图见图1。
表2梯度洗脱模式
Table 2 Gradient elution mode
2.1.4质谱条件
进入高分辨飞行时间质谱的流动相采用三通分流至0.4mL·min-1。分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100-1000；毛细管电压：4.0kV；喷雾气压：310.28Kpa；干燥气流速：10.0L·min-1；干燥气温度：325℃；裂解电压：100V；锥孔电压：60V。
2.1.5 ESI-TOF/MS鉴别
在优化好的色谱条件下，采用高分辨电喷雾飞行时间质谱技术，对指纹图谱的各共有峰进行指认。根据获得的化合物的精确分子量信息，DAD检测器获得的紫外吸收信息，并参考以往安神补脑液与单味药的相关文献及中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库，对各化合物进行鉴别，推断出可能的分子式。鉴别结果与标准对照品进行了对比，以保证结果的准确性。
表3样品中40个化合物的ESI-TOF/MS精确质量测量结果
Tab.3 ESI-TOF/MS accurate mass measurements of 8compounds in samples
2.2多指标含量测定
2.2.1标准曲线及检出限
将“2.1.2”项下的混合对照品溶液稀释到不同的浓度(见表3中的线性范围)，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，测定各不同浓度的混合标准液中各化合物的峰面积，以各化合物质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程(见表4)。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比为检出限(LOD)，以10倍信噪比为定量限(LOQ)，结果见表3。从表3可以看出，各标准曲线的相关系数良好，方法灵敏度较高，可以满足安神补脑液中各成分的含量测定。
表4 8种化合物的回归方程、线性范围及检测限、定量限
Tab.4 Regressive equations,linear ranges,LOD and LOQ of the 8components
2.2.2精密度试验
取S1号供试品溶液，连续进样6次，测得其中8个特征峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差(RSD)，其特征峰保留时间RSD依次是0.32％、0.14％、0.29％、0.31％、0.20％、0.09％、0.09％、0.06％，均小于1％，峰面积RSD依次是1.05％、1.90％、3.50％、2.31％、1.29％、4.71％、1.84％、3.92％，均小于5％，结果表明仪器精密度良好。
2.2.3重复性试验
取S1号样品6份，按“2.1.1”项下处理方法制成供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件进样测定，测得8个特征峰的峰面积和保留时间，并计算其相对标准偏差。结果8个特征峰保留时间RSD依次是0.33％、0.24％、0.45％、0.46％、0.27％、0.14％、0.12％、0.12％，均小于1％，峰面积RSD依次是1.89％、2.56％、3.38％、2.87％、3.90％、4.52％、2.08％、2.72％，均小于5％，结果表明方法重现性良好。
2.2.4稳定性试验
取S1号供试品溶液按照“2.1.3”项下色谱条件，分别在0、4、8、16、24h进样分析，记录色谱图。结果8个特征峰保留时间RSD依次是0.32％、0.81％、0.31％、0.38％、0.14％、0.09％、0.12％，0.65％，均小于1％，峰面积RSD依次是3.21％、2.72％、3.54％、2.10％、3.76％、4.52％、4.06％、2.72％，均小于5％，表明样品在24h内化学性质稳定。
2.2.5加标回收率试验
精密量取已知各目标化合物含量的安神补脑液样品1mL(6等份)，分别准确加入VB1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素、大黄素对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，测定各目标化合物的峰面积，计算平均加样回收率分别为96.50％、94.29％、95.94％、97.48％、91.10％、95.27％、91.47％、107.50％；RSD分别为2.78％、6.36％、6.64％、2.43％、3.91％、5.01％、4.60％、4.91％。从实验结果可知，本方法的回收率良好。
2.2.6样品测定
按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别进样分析，获得10批安神补脑液样品中8种化合物色谱峰面积，将测得结果带入表2线性回归方程，计算安神补脑液样品中8种化合物的含量(见表5)。
表5样品中8种成分含量(μg·mL-1)测定结果(n＝10)
Table 5 Contents(μg·mL-1)of 8 compounds in samples
从表中可以看出，不同批次样品中各化合物含量平均值在4.10～452.36μg·mL-1之间，其RSD在2.2％～5.45％之间，其中维生素B1含量最高，大黄素含量最低。2015版《中国药典》规定维生素B1和淫羊藿作为安神补脑液的质量控制指标。
2.3指纹图谱的建立
采用“2.1.2”项供试品处理方法对10批安神补脑液样品进行处理，按“2.1.3”项色谱条件进样分析，运用“中药指纹图谱相似度软件”(2004A版)对10批不同批次的安神补脑液指纹图谱数据进行处理，建立安神补脑液的HPLC指纹图谱(图2)。
2.4相似度评价
通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2004A版)对10批安神补脑液的指纹图谱进行相似度分析。将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述40个共有峰进行谱峰匹配，采用共有模式作为对照指纹图谱，用于10批安神补脑液相似度评价，分别采用夹角余弦法和相关系数法用于其相似度计算，结果见表6。
表6相似度评价结果
Table 6 similarity evaluation and analysis
从表6中可以看出，不同批次安神补脑液的相似度较为接近，所得结果与多指标含量测定结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种安神补脑液多指标定量指纹图谱的建立方法，所述安神补脑液包括：由鹿茸、制何首乌、淫羊藿、干姜、甘草、大枣、维生素B1，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
精密称取维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素，分别加入甲醇溶解各稀释成浓度为100-200μg·mL-1的溶液，即得；
(2)供试样品的制备
取安神补脑液样品，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，备用；
(3)高效液相色谱法测定
将步骤(1)对照品溶液、步骤(2)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters XELECTTM HSS T3色谱柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈-0.4％甲酸水溶液；检测波长为230-280nm；
柱温：20-35℃；进样量为10μL；
(4)建立指纹图谱、确定定量检测指标
取10批次安神补脑液按步骤(2)方法制备得到10个供试样品溶液，按步骤(3)分别进行高效液相色谱分析，记录色谱图；依据10批次次安神补脑液的指纹图谱，确定40个特征峰，其中1号峰为维生素B1、3号峰为次黄嘌呤、25号峰为甘草苷、27号峰为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷，35号峰为淫羊藿苷，37号峰为甘草酸，38号峰为6-姜辣素，40号峰为大黄素；并确定定量检测指标；
(5)质量控制
以步骤(4)确定的定量检测指标为检测指标，按步骤(3)对样品中相应指标进行定量检测，检测结果与步骤(4)所得指标平均值进行比较，即得。
2.如权利要求1所述的建立方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0-5min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；5-20min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；20-45min，乙腈0-7％，0.4％甲酸水100-93％；45-50min，乙腈7-9％，0.4％甲酸水93-91％；50-75min，乙腈9-12％，0.4％甲酸水91-88％；75-95min，乙腈12-18％，0.4％甲酸水88-82％；95-135min，乙腈18-24％，0.4％甲酸水82-76％；135-140min，乙腈24-25％，0.4％甲酸水76-75％；140-150min，乙腈25-35％，0.4％甲酸水75-65％；150-160min，乙腈35-45％，0.4％甲酸水65-55％；160-170min，乙腈45-70％，0.4％甲酸水55-30％；170-180min，乙腈70-90％，0.4％甲酸水30-10％。
3.如权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(3)中的色谱条件还包括：流速：初始流速为0.2ml/min，在洗脱时间为5min时，将流速调整为0.3ml/min，梯度洗脱时间为8min时，将流速调整为0.5ml/min且保持该流速至洗脱结束。
4.如权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(3)检测波长为278nm。
5.如权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(3)柱温为25℃。
6.如权利要求1所述建立方法，其特征在于，步骤(4)定量检测指标为：维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素。
7.一种安神补脑液产品真伪鉴别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.待测样品进行高效液相色谱分析，
色谱检测条件为：
色谱柱：Waters XELECTTM HSS T3色谱柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；
流动相：乙腈-0.4％甲酸水溶液；
柱温为25℃；检测波长为278nm；进样量为10μL；采用梯度洗脱；
梯度洗脱条件为：0-5min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；5-20min，乙腈0％，0.4％甲酸水100％；20-45min，乙腈0-7％，0.4％甲酸水100-93％；45-50min，乙腈7-9％，0.4％甲酸水93-91％；50-75min，乙腈9-12％，0.4％甲酸水91-88％；75-95min，乙腈12-18％，0.4％甲酸水88-82％；95-135min，乙腈18-24％，0.4％甲酸水82-76％；135-140min，乙腈24-25％，0.4％甲酸水76-75％；140-150min，乙腈25-35％，0.4％甲酸水75-65％；150-160min，乙腈35-45％，0.4％甲酸水65-55％；160-170min，乙腈45-70％，0.4％甲酸水55-30％；170-180min，乙腈70-90％，0.4％甲酸水30-10％；初始流速为0.2ml/min，在洗脱时间为5min时，将流速调整为0.3ml/min，梯度洗脱时间为8min时，将流速调整为0.5ml/min且保持该流速至洗脱结束；
S2.精密称取维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、6-姜辣素和大黄素标准品，分别加入甲醇溶解各稀释成不同浓度为的溶液，按步骤S1色谱条件进行分析，以各化合物质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，计算步骤S1样品中各指标的含量。
8.如权利要求1所述安神补脑液多指标定量指纹图谱在安神补脑液质量控制中的应用。
9.如权利要求1所述安神补脑液多指标定量指纹图谱在监控安神补脑液生产中的应用。
10.如权利要求1所述安神补脑液多指标定量指纹图谱和/或权利要求7所述安神补脑液产品真伪鉴别的方法在鉴别安神补脑液产品真伪中的应用。
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