CN110632223A - 一种中药多糖结构特征指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药多糖结构特征指纹图谱及其构建方法和应用。本发明将从中药材中提取并纯化的多糖进行高碘酸氧化和Smith降解之后采用GC‑MS检测降解产物及未降解产物,建立不同来源的中药多糖结构特征指纹图谱,通过特征峰的峰面积比值和相似度值实现对未知样品进行区分;依据降解产物和未降解产物的种类和含量,反向演绎中药多糖糖残基的连接位置和顺序。本发明对中药多糖采用Smith降解,降解条件温和、重现性好,具有结构特异性;所建立的降解产物和未降解产物指纹图谱,能够反映中药多糖的结构信息,具有专属性强,重复性好,结果可靠等优点。
Description
技术领域
本发明涉及多糖指纹图谱及其构建方法和应用,尤其涉及不同中药材来源的多糖结构指纹图谱及其构建方法,本发明进一步涉及将所构建的中药多糖结构指纹图谱应用于不同来源的中药材多糖的结构分析或鉴别,属于中药多糖结构特征指纹图谱的构建及其应用领域。
背景技术
碘酸氧化和Smith降解技术是一种常用的多糖单体化合物结构分析技术,具有灵敏度高,结构特征性强,可实现多糖结构预判等特点,碘酸氧化和Smith降解技术的具体反应原理如图1所示。
多年来,高碘酸氧化和Smith降解技术仅被应用于多糖单体结构分析,与甲基化分析技术一起被称为多糖结构研究中不可或缺的技术,然而,该项技术并没有应用于中药或多糖提取物的鉴别和质量评价。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种中药多糖结构特征指纹图谱;
本发明的目的之二是提供一种构建所述中药多糖结构特征指纹图谱的方法;
本发明的目的之三是将所构建的中药多糖结构特征指纹图谱应用于不同来源的中药多糖的鉴别。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
一种中药多糖结构特征指纹图谱,其通过以下方法构建得到:
(1)从中药材中提取并纯化得到多糖;
(2)将多糖采用高碘酸氧化后再采用Smith降解方法进行解聚;
(3)将所得的产物经衍生化反应采用GC-MS分析检测中药材多糖的降解产物和未降解产物信息(数据);
(4)将步骤(3)通过GC-MS分析所得到降解产物信息(数据)以及未降解产物信息(数据)导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版分别建立不同中药材来源的多糖降解产物的标准结构指纹图谱和未降解产物的标准结构指纹图谱,并计算标准指纹图谱。
本发明中所述的中药材包括但不限于人参属、五味子属或黄芪属等中药材;其中,所述的人参属药材包括但不限于人参、三七或西洋参。
步骤(1)中提取多糖的方法优选采用超声辅助热水浸提法从中药材中提取多糖;进一步优选的,所述的提取温度为70℃,超声功率为100Hz,超声时间为30min。
所述的纯化方法优选是:将提取浸提液浓缩后用75%乙醇沉淀析出中药多糖,采用Savage法除去蛋白质,最后采用流水透析法除去小分子杂质,冷冻干燥。
步骤(2)中所述的高碘酸氧化包括:向多糖中加入高碘酸钠及蒸馏水,闭光反应至光密度值不在变化,采用乙二醇中和过量高碘酸,流水透析,透析液浓缩至干;作为参考,所述的高碘酸氧化的反应条件优选为:10mg中药多糖,50mM高碘酸钠,8ml蒸馏水;完全酸水解条件为2M三氟乙酸,110℃,4h。
步骤(2)中所述的Smith降解包括四氢硼纳还原和酸水解这两步反应,使中药多糖产生稳定的降解产物和未降解单糖;其中,所述中药多糖降解产物主要包括:乙二醇、甘油、赤藓醇和其异构体;中药多糖非降解产物主要包括:阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
作为参考,所述的四氢硼纳还原的条件优选为:每1ml样品溶液中,加入10mg四氢硼钠和10μL氨水,室温静置一宿。
本发明中所述盐酸甲醇溶液优选为1%(v)的盐酸甲醇溶液。
步骤(3)中所得产物经糖醇硅醚化衍生化反应后采用GC-MS分析;采用,GC-MS检测技术可以一次色谱同时检测降解产物和未降解产物,也可以通过两次色谱分别检测降解产物和未降解产物。
步骤(4)中通过《中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)专业软件进行分析产生相应的标准指纹图谱并计算相似度。
将本发明所建立的标准结构指纹图谱代入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版,计算相似度值,确定特征峰的峰面积比值或依据降解产物和未降解产物的种类和含量能够对未知样品进行区分和辨别:
特征峰峰面积的比值是一个有价值的鉴别参数,可以用于直观的多糖辨别;通过比较中药多糖降解产物和未降解产物的标准结构指纹图谱,可以直观的确定特征峰,通过特征峰的峰面积比值可以更加快速的得到中药多糖的辨别。譬如,对比南北五味子属多糖的降解产物结构指纹图谱,北五味子中峰2(甘油)和3(赤藓醇)的比值范围为1.2-1.7,而南五味子中峰2(甘油)和3(赤藓醇)的比值范围为0.7-0.9,特征峰的比值可以作为一个更加简单、直观的鉴别参数。
将所建立的标准结构特征指纹图谱与单糖组成指纹图谱对比,依据降解产物和未降解产物的种类和含量,反向演绎中药多糖糖残基的连接位置和顺序,能够应用于不同来源的人参属多糖、黄芪属多糖和五味子多糖的鉴别:如果降解产物中存在乙二醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位和1→6位的糖苷连接;如果降解产物中存在甘油,则说明中药多糖结构中存在1→2位和1→6位的糖苷连接;如果降解产物中存在赤藓醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位的糖苷连接;如果未降解产物中存在大量的或微量单糖,则说明中药多糖结构中该单糖存在大量或微量的1→3位的糖苷连接。
本发明通过对多糖进行高碘酸氧化和Smith降解,经四氢硼钠还原-六甲基二硅胺烷-三甲基氯硅烷进行衍生化,采用GC-MS检测降解产物及未降解产物,建立基于降解产物和未降解产物的中药多糖结构特征指纹图谱。采用高碘酸氧化技术解聚中药多糖,只要多糖化学结构中存在邻二羟基和邻三羟基,一定能够发生高碘酸氧化反应,不同中药多糖高碘酸氧化到达终点可能需要时间不同;依据降解产物和未降解产物的种类和含量,可以反向演绎中药多糖糖残基的连接位置和顺序,并应用于不同来源的人参属多糖、黄芪属多糖和五味子多糖的鉴别。与单糖组成指纹图谱相比,本发明所采取的多糖降解条件温和、重现性好,具有结构特异性,所建立的降解产物和未降解产物指纹图谱,在一定程度上能够反映中药多糖的结构信息。
本发明首次通过中药多糖高碘酸氧化和Smith降解技术的GC-MS指纹图谱鉴定不同来源的中药多糖提取物,本发明方法具有专属性强,重复性好,结果可靠等优点,为不同来源的中药多糖进一步深入研究奠定理论基础,为今后系统完整的不同来源中药多糖鉴别研究工作打下基础。同时,亦为不同来源中药多糖鉴别研究和质量评价提供了一个新的发展方向。
附图说明
图1高碘酸氧化和Smith降解技术的反应原理图。
图2结合SESCF-TCM-2004A得到人参、三七和西洋参多糖的Smith降解产物GC-MS结构指纹图谱,分别为(A)、(B)和(C);峰1→3分别为乙二醇、丙三醇和赤藓醇。
图3结合SESCF-TCM-2004A得到人参、三七和西洋参多糖的Smith衍生未降解产物GC-MS结构指纹图谱,分别为(A)、(B)和(C);峰2、4、8、9和10分别为阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
图4结合SESCF-TCM-2004A得到北五味子和南五味子多糖的Smith衍生降解产物GC-MS结构指纹图谱,分别为(A)和(B);峰1→3分别为乙二醇、丙三醇、赤藓醇和异赤藓醇。
图5结合SESCF-TCM-2004A得到北五味子和南五味子多糖的Smith衍生未降解产物GC-MS结构指纹图谱,分别为(A)和(B);峰1-9分别为木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
图6结合SESCF-TCM-2004A得到膜荚黄芪和蒙古黄芪多糖的Smith衍生降解和未降解产物GC-MS结构指纹图谱,分别为(A)和(B)。峰1-8分别为乙二醇、甘油、赤藓醇、木糖、阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1人参属多糖Smith降解结构指纹图谱的建立与应用
1.仪器与试药
Agilent7890A-5975C气质联用仪,配备DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm),高碘酸钠(天津市光复精细化工研究所);三氟乙酸(天津市光复精细化工研究所);六甲基二硅胺烷(上海试一化学试剂有限公司);三甲基氯硅烷(上海化学试剂采购供应五联化工厂));吡啶(天津市光复科技发展有限公司);乙二醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);四氢硼钠(天津市科密欧化学试剂有限公司);选用人参、三七、西洋参三种人参属中药。
2.实验方法
2.1人参属(人参、三七和西洋参)多糖的提取纯化
采用超声辅助热水浸提法,分别对人参属药材进行提取,浸提液浓缩后用75%乙醇沉淀析出中药多糖,采用Savage法除去蛋白质,最后采用流水透析法除去小分子杂质,冷冻干燥。
2.2 Smith降解
将人参属多糖溶于适量高碘酸钠中,置于暗处7天。用乙二醇还原过量的高碘酸钠后,对反应混合物进行水透析24h。用硼氢化钠还原氧化多糖,过量的硼氢化钠经冰乙酸分解,再透析24h。然后将透析液蒸发至干燥。将产物溶于适量TFA,在110℃条件下,水解4h。水解后,用甲醇洗涤水解产物,蒸发干燥几次,除去TFA的残渣。蒸发干燥。原理:如果降解产物中存在乙二醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在甘油,则说明中药多糖结构中存在1→2位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在赤藓醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位键合的寡糖;如果未降解产物中存在大量的葡萄糖被降解,则说明中药多糖结构中存在1→3位键合的寡糖。
2.3硅醚化衍生物的制备
精密称取三种人参属多糖(人参、三七和西洋参)Smith降解产物,各5mg,加入水溶解,然后加入四氢硼钠和适量氨水,室温静置1.5h,加入适量冰乙酸,浓缩至干,加入1%(v/v)盐酸甲醇溶液中和,浓缩至干,重复几次,直至无酸味。加入100μL吡啶溶解,再加入330μL六甲基二硅胺烷和110μL三甲基氯硅烷,60℃水浴,反应30min。反应后,加入100μL水,离心,去上层溶液,可直接进行GC-MS分析。
2.4 GC-MS分析
采用Agilent 7890A-5975C气质联用仪,采用DB-5毛细管柱,程序升温,柱温180℃,以4℃/min至190℃,以1℃/min至200℃,以2℃/min至230℃,以20℃/min至310℃,氦气作载气,进样口温度250℃,柱流速1.2mL/min,EI(70eV),接口温度250℃,离子源温度230℃,扫描范围:m/z50-550,扫描率:2.5scan/s。
2.5建立Smith降解的中药多糖结构指纹图谱
所有样品的GC-MS数据由中国药典委员会发布的中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)和(2004B版)专业软件进行分析。将峰匹配和生产参考(R)色谱,计算相似度。然后,利用夹角余弦值计算所有输入色谱图相对于标准色谱图的相似度值。
本发明通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)专业软件建立人参、三七和西洋参等三种不同来源人参属多糖中Smith降解产物的结构指纹图谱,计算相似度可知,人参Cr=0.986~0.997,三七Cr=0.985~0.998,西洋参Cr=0.986~0.997;根据Smith未降解产物的结构指纹图谱,计算相似度可知,人参Cr=0.986~0.998,三七Cr=0.981~0.999,西洋参Cr=0.984~0.999。Smith降解产物的三七的结构指纹图谱与人参多糖的标准R相比较,经中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004B版)计算,Cr值在0.552~0.749之间。人参的结构指纹图谱与西洋参的标准R相比较,Cr值在0.637~0.891之间。人参样品结构指纹图谱与三七的标准R相比较,Cr值在0.564~0.761之间。西洋参样品的Cr值与三七的标准R相比在0.602~0.739之间;人参样品的结构指纹图谱与西洋参的标准R相比较,Cr值在0.638~0.822之间;三七样品的结构指纹图谱与西洋参的标准R相比较,Cr值在0.601~0.739之间。
由上述表明,通过人参属多糖的Smith降解的和未降解的结构指纹图谱可知,同源相似度较高,异种相似度较低。完全能够实现人参、三七和西洋参等三种法定基源人参属多糖的辨别。除此之外,可通过对比三种人参属多糖的降解产物结构指纹图谱,可知,三七中乙二醇的含量高于丙三醇,人参和西洋参中乙二醇的含量均低于丙三醇,只能鉴别人参和西洋参与三七之间的区别。
进一步,对比三种人参属多糖的未降解产物结构指纹图谱,人参和西洋参中含有鼠李糖,而三七中没有。人参中阿拉伯糖:葡萄糖≈1:1,西洋参中阿拉伯糖:葡萄糖≈1:3,亦可鉴别三种人参属多糖。通过Smith降解产物的GC-MS指纹图谱可知,只有3个常见的多醇峰,即乙二醇、甘油和赤藓醇。事实表明,人参属多糖中单糖的糖苷连接有可能发生1→1→2、1→4或1→6。降解产物以赤藓醇为主,其次为少量乙二醇和甘油。这说明人参属多糖的骨架结构中存在1→4糖苷键,而不是1→6糖苷键。
实施例2五味子属多糖Smith降解结构特征指纹图谱的建立与应用
1.仪器与试药
Agilent7890A-5975C气质联用仪,配备DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm),高碘酸钠(天津市光复精细化工研究所);三氟乙酸(天津市光复精细化工研究所);六甲基二硅胺烷(上海试一化学试剂有限公司);三甲基氯硅烷(上海化学试剂采购供应五联化工厂));吡啶(天津市光复科技发展有限公司);乙二醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);四氢硼钠(天津市科密欧化学试剂有限公司);选用30批北五味子、20批南五味子两种五味子属中药。
2.实验方法
2.1五味子属(北五味子和南五味子)多糖的提取纯化
采用超声辅助热水浸提法,分别对五味子属药材进行提取,浸提液浓缩后用75%乙醇沉淀析出中药多糖,采用Savage法除去蛋白质,最后采用流水透析法除去小分子杂质,冷冻干燥。
2.2 Smith降解
将五味子属多糖溶于适量高碘酸钠中,置于暗处7天。用乙二醇还原过量的高碘酸钠后,对反应混合物进行水透析24h。用硼氢化钠还原氧化多糖,过量的硼氢化钠经冰乙酸分解,再透析24h。然后将透析液蒸发至干燥。将产物溶于适量TFA,在110℃条件下,水解4h。水解后,用甲醇洗涤水解产物,蒸发干燥几次,除去TFA的残渣。蒸发干燥。原理:如果降解产物中存在乙二醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在甘油,则说明中药多糖结构中存在1→2位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在赤藓醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位键合的寡糖;如果未降解产物中存在大量的葡萄糖被降解,则说明中药多糖结构中存在1→3位键合的寡糖。
2.3硅醚化衍生物的制备
精密称取三种五味子属多糖(北五味子和南五味子)Smith降解产物,各5mg,加入水溶解,然后加入四氢硼钠和适量氨水,室温静置1.5h,加入适量冰乙酸,浓缩至干,加入1%(v/v)盐酸甲醇溶液中和,浓缩至干,重复几次,直至无酸味。加入100μL吡啶溶解,再加入330μL六甲基二硅胺烷和110μL三甲基氯硅烷,60℃水浴,反应30min。反应后,加入100μL水,离心,去上层溶液,可直接进行GC-MS分析。
2.4 GC-MS分析
采用Agilent 7890A-5975C气质联用仪,采用DB-5毛细管柱,程序升温,柱温180℃,以4℃/min至190℃,以1℃/min至200℃,以2℃/min至230℃,以20℃/min至310℃,氦气作载气,进样口温度250℃,柱流速1.2mL/min,EI(70eV),接口温度250℃,离子源温度230℃,扫描范围:m/z50-550,扫描率:2.5scan/s。
2.5建立Smith降解的中药多糖结构指纹图谱
所有样品的GC-MS数据由中国药典委员会发布的中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)和(2004B版)专业软件进行分析。将峰匹配和生产参考(R)色谱,计算相似度。然后,利用夹角余弦值计算所有输入色谱图相对于标准色谱图的相似度值。
本发明通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)专业软件建立30批北五味子和20批南五味子等两种不同来源五味子属多糖中Smith降解产物的结构指纹图谱,计算相似度可知,北五味子Cr=0.907~0.988,南五味子Cr=0.921~0.989;根据Smith未降解产物的结构指纹图谱可知,北五味子Cr=0.906~0.999,南五味子Cr=0.938~0.997。通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004B版)专业软件,20批南五味子与30批北五味子多糖生成的标准R相比较,以及30批北五味子与20批南五味子生成的标准R相比较,计算相似度可知,Cr均小于0.919。
由上述表明,通过五味子属多糖的Smith降解的和未降解的结构指纹图谱可知,同源相似度较高,异种相似度较低。完全能够实现30批北五味子和20批南五味子两种法定基源五味子属多糖的辨别。除此之外,可通过对比两种五味子属多糖的衍生产物结构指纹图谱,可知,含有大量的甘油、赤藓醇及其异构体,表明在五味子多糖的结构骨架中存在大量1→4、1→6糖苷键;除此之外,可明显地观察到,北五味子中甘油的含量最高,南五味子异赤藓醇含量最高,能简单鉴别南北五味子之间的区别。
进一步,对比两种五味子属多糖的未降解产物结构指纹图谱,南北五味子未降解产物结构指纹图谱显示大量半乳糖降解,可能存在1→3;1→2,3;1→3,4;1→2,4;1→2,3,4糖苷键。同种药材具有良好的相似度的同时,降解产物图谱中峰2和3的比值使鉴别程序更加简单、直观(北五味子2/3=1.7/1.2,南五味子2/3=0.7/0.9)。
实施例3黄芪属多糖Smith降解结构指纹图谱建立与应用
1.仪器与试药
Agilent7890A-5975C气质联用仪,配备DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm),高碘酸钠(天津市光复精细化工研究所);三氟乙酸(天津市光复精细化工研究所);六甲基二硅胺烷(上海试一化学试剂有限公司);三甲基氯硅烷(上海化学试剂采购供应五联化工厂));吡啶(天津市光复科技发展有限公司);乙二醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);四氢硼钠(天津市科密欧化学试剂有限公司);选用7批膜荚黄芪、8批蒙古黄芪两种黄芪属中药。
2.实验方法
2.1黄芪属(膜荚黄芪和蒙古黄芪)多糖的提取纯化
采用超声辅助热水浸提法,分别对黄芪属药材进行提取,浸提液浓缩后用75%乙醇沉淀析出中药多糖,采用Savage法除去蛋白质,最后采用流水透析法除去小分子杂质,冷冻干燥。
2.2 Smith降解
将黄芪属多糖溶于适量高碘酸钠中,置于暗处7天。用乙二醇还原过量的高碘酸钠后,对反应混合物进行水透析24h。用硼氢化钠还原氧化多糖,过量的硼氢化钠经冰乙酸分解,再透析24h。然后将透析液蒸发至干燥。将产物溶于适量TFA,在110℃条件下,水解4h。水解后,用甲醇洗涤水解产物,蒸发干燥几次,除去TFA的残渣。蒸发干燥。原理:如果降解产物中存在乙二醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在甘油,则说明中药多糖结构中存在1→2位和1→6位键合的寡糖;如果降解产物中存在赤藓醇,则说明中药多糖结构中存在1→4位键合的寡糖;如果未降解产物中存在大量的葡萄糖被降解,则说明中药多糖结构中存在1→3位键合的寡糖。
2.3硅醚化衍生物的制备
精密称取三种黄芪属多糖(膜荚黄芪和蒙古黄芪)Smith降解产物,各5mg,加入水溶解,然后加入四氢硼钠和适量氨水,室温静置1.5h,加入适量冰乙酸,浓缩至干,加入1%(v/v)盐酸甲醇溶液中和,浓缩至干,重复几次,直至无酸味。加入100μL吡啶溶解,再加入330μL六甲基二硅胺烷和110μL三甲基氯硅烷,60℃水浴,反应30min。反应后,加入100μL水,离心,去上层溶液,可直接进行GC-MS分析。
2.4 GC-MS分析
采用Agilent 7890A-5975C气质联用仪,采用DB-5毛细管柱,程序升温,柱温180℃,以4℃/min至190℃,以1℃/min至200℃,以2℃/min至230℃,以20℃/min至310℃,氦气作载气,进样口温度250℃,柱流速1.2mL/min,EI(70eV),接口温度250℃,离子源温度230℃,扫描范围:m/z50-550,扫描率:2.5scan/s。
2.5建立Smith降解的中药多糖结构指纹图谱
所有样品的GC-MS数据由中国药典委员会发布的中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)和(2004B版)专业软件进行分析。将峰匹配和生产参考(R)色谱,计算相似度。然后,利用夹角余弦值计算所有输入色谱图相对于标准色谱图的相似度值。
本发明通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004A版)专业软件一次色谱建立7批膜荚黄芪和8批蒙古黄芪等两种不同来源黄芪属多糖中Smith降解产物和未降解产物的结构指纹图谱,计算相似度可知,膜荚黄芪Cr=0.957~0.996;蒙古黄芪Cr=0.966~0.999。通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统(2004B版)专业软件分析,7批膜荚黄芪和8批蒙古黄芪生成的标准R相比较,计算相似度可知,Cr=0.573~0.743;8批蒙古黄芪和7批膜荚黄芪生成的标准R相比较,Cr=0.611~0.711。
由上述表明,通过黄芪属多糖的Smith降解的和未降解的结构指纹图谱可知,同源相似度较高,异种相似度较低。完全能够实现7批膜荚黄芪和8批蒙古黄芪两种法定基源黄芪属多糖的辨别。除此之外,可通过对比两种黄芪属多糖的衍生产物结构指纹图谱,可知,蒙古黄芪和膜荚黄芪中的甘油含量最高,但膜荚黄芪的甘油比例相对更高,因此可以直观鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪。
进一步,对比两种黄芪属多糖的不可降解产物,膜荚黄芪中产生的Man/Gal比值从0.18到0.48,而蒙古黄芪产生的Man/Gal值从1.13到1.84,这能清晰地鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪。事实表明,蒙古黄芪和膜荚黄芪中单糖的糖苷连接有可能发生1→1→2、1→4或1→6。降解产物以甘油含量为主,这说明黄芪属多糖的骨架结构中存在1→6糖苷键,而不是1→4糖苷键。
Claims (10)
1.一种中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,其构建方法包括:
(1)从中药材中提取并纯化得到多糖;
(2)将多糖采用高碘酸氧化后再采用Smith降解方法进行解聚;
(3)将步骤(3)所得的产物经衍生化反应后采用GC-MS分析检测降解产物和未降解产物信息,确定特征峰的峰面积比值参数;
(4)将步骤(3)通过GC-MS分析所得到降解产物信息以及未降解产物信息导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版分别建立不同中药材来源的多糖降解产物的标准结构指纹图谱和未降解产物的标准结构指纹图谱,并计算标准指纹图谱。
2.按照权利要求1所述的中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,所述的中药材包括但不限于人参属、五味子属或黄芪属中药材。
3.按照权利要求1所述的中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,步骤(1)中提取多糖的方法采用超声辅助热水浸提法从中药材中提取多糖;所述的多糖纯化方法是:将提取浸提液浓缩后用75%乙醇沉淀析出中药多糖,采用Savage法除去蛋白质,最后采用流水透析法除去小分子杂质,冷冻干燥。
4.按照权利要求1所述的中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,步骤(2)中所述的高碘酸氧化包括:向多糖中加入高碘酸钠及蒸馏水,闭光反应至光密度值不在变化,采用乙二醇中和过量高碘酸,流水透析,透析液浓缩至干;步骤(2)中所述的Smith降解包括四氢硼纳还原和酸水解这两步反应;其中,所述中药多糖降解产物主要包括:乙二醇、甘油、赤藓醇和其异构体;所述中药多糖非降解产物主要包括:阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
5.按照权利要求1所述的中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,步骤(3)中将所得产物经糖醇硅醚化衍生化反应后采用GC-MS分析,确定特征峰的峰面积比值参数。
6.按照权利要求1所述的中药多糖结构特征指纹图谱,其特征在于,步骤(4)中通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统2004A版专业软件进行分析产生相应的标准指纹图谱并计算相似度。
7.权利要求1-6任何一项所述的中药多糖结构特征指纹图谱在鉴别不同来源的中药材多糖中的应用。
8.按照权利要求7所述的应用,其特征在于,将所建立的标准结构指纹图谱代入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版,计算相似度值,依据相似度值和特征峰的峰面积比值对未知样品进行区分和辨别。
9.权利要求1-6任何一项所述的中药多糖结构特征指纹图谱在分析不同来源的中药材多糖的结构中的应用。
10.按照权利要求7所述的应用,其特征在于,依据降解产物和未降解产物的种类和含量,反向演绎中药多糖糖残基的连接位置和顺序。
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