一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法
技术领域
本发明涉及多糖结构分析技术领域,具体涉及一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法。
背景技术
多糖是一类10个以上单糖分子缩合而成的天然大分子物质,由醛糖和/或酮糖通过糖苷键连接而成,是构成生命的四大基本物质之一。多糖广泛的存在于动物、植物、微生物细胞中,但是由于多糖的复杂性,以及过去低估了多糖对生命过程的贡献,多糖的研究一直落后于核酸和蛋白质。直至1958年Brander证明了酵母细胞壁多糖具有明显的抗肿瘤功效,人们才逐渐认识到多糖不仅仅具有营养生理功能,更具有特殊的生物学活性。1970年,日本研究者千原报道香菇多糖具有抗肿瘤作用,这一发现轰动了整个医药界,在世界范围内掀起了一股研究多糖的热潮。近年来,随着科学技术水平的发展和研究的不断深入,越来越多的实验证明多糖有着极高的药用价值,普遍具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保护肝脏、降血糖、降血脂、抗辐射等广泛的生物学功效,并且多糖类药物对机体的干扰非常小,几乎没有毒副作用。这一优良特性使得多糖不仅可以应用于疾病的治疗,而且广泛的渗透到了保健品、食品、饲料、化妆品等领域,多糖的资源开发有着广阔的应用前景,对于多糖基础理论的研究必然会推进多糖的进一步开发利用。
结构分析在多糖的研究中具有举足轻重的地位,是糖生物学的核心。研究表明,多糖的生物学活性依赖于其特定的化学结构,准确分析多糖的结构是揭示多糖构效关系和活性机制的前提,也是进一步改造多糖,提高其生物学活性的基础。
由于多糖的结构具有复杂性,多糖结构的表征是多糖分析的难点。首先,多糖在合成的过程中没有特定的合成模版,不能通过解析合成模版获得多糖的结构信息;其次,多糖的结构比蛋白质和核酸更为复杂,如,核酸分子只能以3′,5′磷酸二脂键连接,肽链只能通过氨基酸残基的羧基和另一氨基酸残基的氨基脱水缩合形成的肽键连接,而多糖中的每个单糖上的羟基都可以与另一个单糖相连接;最后,多糖存在主链及支链结构,主链及支链信息难以区别,更增加了多糖结构表征的复杂性。目前,分析多糖结构的方法有过碘酸氧化法、Smith降解法、甲基化反应等化学方法,以及气质联用法、核磁共振法、红外光谱法、高效液相色谱法等物理方法。多糖结构的研究需要采用多种化学和物理分析方法进行联合分析,将多种结构信息进行整合后才能推断出多糖的结构,并且上述分析方法存在实验步骤繁琐、实验条件难以实现、实验结果分析困难、实验结论难以重复等困难,导致多糖结构的分析往往需要花费大量的人力和时间。
公开号为CN 102253167 A的中国专利(一种基于水解过程的水溶性多糖分析方法)公开了一种通过传感器记录多糖水解过程中还原糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的水解图谱,形成该多糖标准水解图谱,但是由于传感器的构建需要对应的专一性酶,因此甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等多种多糖中普遍存在的单糖残基种类无法实现传感器测定,导致该专利仅仅能够实现多糖的鉴别,并不能够对多糖结构进行整体分析。
因此,寻找简单、有效、准确的多糖结构分析方法迫在眉睫,寻找多糖主链及支链信息的分析方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法,本发明提供的方法能够直观、快速、准确的分析单糖残基在多糖主链及支链结构中的分布。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法,包括以下步骤:
(1)将多糖与酸溶液混合后进行水解,通过控制所述水解条件,控制水解强度由低到高逐渐增强,得到不同水解程度的逐级部分酸水解液;
(2)将所述步骤(1)中逐级部分酸水解液进行第一离心,调节所得第一清液的pH值为6.5~7.5,将得到的调节液与水混合后进行第二离心,得到的第二清液为逐级部分酸水解液样品;
(3)采用柱前衍生高效液相色谱法对所述步骤(2)中逐级部分酸水解液样品进行分析,根据得到的色谱图分析所述步骤(1)中逐级部分酸水解液中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,以单糖残基种类为一级横坐标、水解程度为二级横坐标、以摩尔百分含量为纵坐标,绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,根据所述单糖残基的摩尔百分含量解离过程图分析所述单糖残基在多糖主链及支链中的分布规律。
优选地,所述步骤(1)中水解条件包括:所述酸溶液包括硫酸溶液、三氟乙酸溶液或盐酸溶液,所述酸溶液的浓度为0.01~2mol/L,所述多糖与酸溶液的用量比为(0.01~1)g:(1~20)mL,所述水解的温度为90~100℃,所述水解的时间为0.1~8h。
优选地,将所述步骤(1)中水解强度由低到高依次划分为4~11个水解级数,对应所述不同水解程度的逐级部分酸水解液;所述水解级数包括1~5个低强度水解级数、2~4个中强度水解级数和1~2个高强度水解级数。
优选地,所述步骤(1)具体为:
将4~11份多糖分别与酸溶液混合后进行水解,固定所述酸溶液的种类、多糖与酸溶液的用量比,通过控制所述酸溶液的浓度、水解的温度和水解的时间,控制水解强度由低到高逐渐增强,得到4~11份逐级部分酸水解液。
优选地,所述步骤(1)具体为:
将多糖与酸溶液混合后进行水解,固定所述酸溶液的种类、酸溶液的浓度、多糖与酸溶液的用量比、水解的温度,取4~11份水解时间递增条件下所得水解液作为逐级部分酸水解液。
优选地,所述步骤(1)中多糖包括微生物多糖、植物多糖或动物多糖。
优选地,所述步骤(1)中水解在保护气氛中进行。
优选地,所述步骤(2)中第一离心和第二离心的转速独立地为5000~20000r/min;时间独立地为5~15min;温度独立地为0~4℃。
优选地,所述步骤(2)中调节第一清液的pH值所采用的pH值调节剂为NaOH溶液,所述NaOH溶液的浓度为0.1~4mol/L。
优选地,所述步骤(3)中柱前衍生高效液相色谱法中,衍生化试剂为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮;
高效液相色谱条件包括:流速为0.5~2mL/min;检测波长为230~260nm;进样量为5~50μL;流动相为醋酸铵缓冲溶液和乙腈,所述醋酸铵缓冲溶液和乙腈的体积比为76:24~80:20,其中,所述醋酸铵缓冲溶液的浓度为0.05~0.15mol/L,pH值为5.5;或者,所述流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈,所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为81:19~83:17,其中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02~0.1mol/L,pH值为6.5~6.8。
本发明提供了一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法,本发明提供的方法具有以下有益效果:
1、本发明通过绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,推断单糖残基在多糖主链及支链结构中的分布,为多糖主链及支链的结构分析提供了一种直观、快速、准确的方法。
2、由于柱前衍生高效液相色谱法只能检测游离单糖,水解产物中未降解的多糖及寡糖对测定结果没有影响,因此,本发明的逐级部分酸水解液中和后可以直接进行分析,实验流程简单,测定结果易于分析、重复性好。
3、比较实施例中的单糖残基的摩尔百分含量解离过程图可以发现,同种多糖的图谱基本一致,而不同多糖的图谱明显不同。每种多糖图谱都带有与其结构特征密切相关的图谱特征,这种特征使单糖残基的摩尔百分含量解离过程图具有唯一性,从而可以作为鉴别多糖的依据。进一步地,标准化酸水解级数、酸溶液种类、酸溶液浓度等水解条件,将多种多糖在标准酸水解条件下获得的单糖残基的摩尔百分含量解离过程图录入到数据库中,并开发对比分析软件,利用软件对比分析未知多糖的解离过程图,可以实现多糖的快速鉴别。
4、多糖的生物活性与其结构密切相关,具有相似解离过程图的多糖具有相似的结构特征,其生物活性具有相似性。多糖的单糖残基摩尔百分含量解离过程图可以为多糖的生物活性推断提供理论参考。
附图说明
图1为实施例1中单糖残基的摩尔百分含量解离过程图;
图2为实施例2中单糖残基的摩尔百分含量解离过程图;
图3为实施例3中单糖残基的摩尔百分含量解离过程图;
图4为实施例4中第一次重复性验证时单糖残基的摩尔百分含量解离过程图;
图5为实施例4中第二次重复性验证时单糖残基的摩尔百分含量解离过程图;
图6为实施例5中单糖残基的摩尔百分含量解离过程图。
具体实施方式
本发明提供了一种分析多糖结构中单糖残基分布规律的方法,包括以下步骤:
(1)将多糖与酸溶液混合后进行水解,通过控制所述水解条件,控制水解强度由低到高逐渐增强,得到不同水解程度的逐级部分酸水解液;
(2)将所述步骤(1)中逐级部分酸水解液进行第一离心,调节所得第一清液的pH值为6.5~7.5,将得到的调节液与水混合后进行第二离心,得到的第二清液为逐级部分酸水解液样品;
(3)采用柱前衍生高效液相色谱法对所述步骤(2)中逐级部分酸水解液样品进行分析,根据得到的色谱图分析所述步骤(1)中逐级部分酸水解液中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,以单糖残基种类为一级横坐标、水解程度为二级横坐标、以摩尔百分含量为纵坐标,绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,根据所述单糖残基的摩尔百分含量解离过程图分析所述单糖残基在多糖主链及支链中的分布规律。
本发明将多糖与酸溶液混合后进行水解,通过控制所述水解条件,控制水解强度由低到高逐渐增强,得到不同水解程度的逐级部分酸水解液。本发明对于所述多糖没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的多糖即可;在本发明中,所述多糖优选包括微生物多糖、植物多糖或动物多糖;所述微生物多糖优选包括食用真菌多糖,更优选为干巴菌胞内多糖、干巴菌胞外多糖或滑菇胞内多糖。在本发明中,所述水解优选在水浴条件下进行,通过水浴温度控制所述水解的温度。在本发明中,所述水解优选在保护气氛中进行;本发明对于提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的保护气体即可,具体如氮气。
在本发明中,所述水解条件优选包括:酸溶液的种类、酸溶液的浓度、多糖与酸溶液的用量比、水解的温度和水解的时间;所述酸溶液优选包括硫酸溶液、三氟乙酸溶液或盐酸溶液,更优选为硫酸溶液;所述酸溶液的浓度优选为0.01~2mol/L,更优选为0.05~1.5mol/L,进一步优选为0.05~1mol/L,再进一步优选为0.05~0.6mol/L;所述多糖与酸溶液的用量比优选为(0.01~1)g:(1~20)mL,更优选为(0.05~0.5)g:(5~15)mL,进一步优选为(0.1~0.3)g:(8~12)mL;所述水解的温度优选为90~100℃,更优选为95~100℃;所述水解的时间优选为0.1~8h,更优选为0.5~6h。
本发明优选将所述水解强度由低到高依次划分为4~11个水解级数,更优选为5~8个水解级数,对应所述不同水解程度的逐级部分酸水解液;所述水解级数优选包括1~5个低强度水解级数、2~4个中强度水解级数和1~2个高强度水解级数,更优选为包括2~4个低强度水解级数、2~3个中强度水解级数和1个高强度水解级数。
本发明对于控制所述水解条件以得到不同水解程度的逐级部分酸水解液的方式没有特殊的限定,具体的可以包括如下两种方式:
第一种方式为:将4~11份多糖分别与酸溶液混合后进行水解,固定所述酸溶液的种类、多糖与酸溶液的用量比,通过控制所述酸溶液的浓度、水解的温度和水解的时间,控制水解强度由低到高逐渐增强,得到4~11份逐级部分酸水解液。
当采用所述第一种方式时,本发明优选固定所述酸溶液的种类、多糖与酸溶液的用量比和水解的温度,通过控制所述酸溶液的浓度和水解的时间,控制所述水解强度;具体的,如,当所述酸溶液为硫酸溶液,所述多糖与硫酸溶液的用量比为0.3g:10mL,所述水解的温度为100℃时,所述硫酸溶液的浓度和所述水解的时间优选按表1中所示水解条件进行设置:
表1逐级部分酸水解过程中酸溶液浓度和水解时间的设置方式
在本发明的实施例中,具体的可以根据表1从所述低水解强度条件中选取1~5个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液,从中水解强度条件中选取2~4个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液,从高水解强度条件中选取1~2个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液。
第二种方式为:将多糖与酸溶液混合后进行水解,固定所述酸溶液的种类、酸溶液的浓度、多糖与酸溶液的用量比、水解的温度,取4~11份水解时间递增条件下所得水解液作为逐级部分酸水解液。
在本发明中,当采用所述第二种方式时,具体的,当所述酸溶液为硫酸溶液,所述硫酸溶液的浓度为0.3mol/L,所述多糖与硫酸溶液的用量比为0.3g:10mL,所述水解的温度为100℃时,所述水解的时间优选按表2中所示水解条件进行设置:
表2逐级部分酸水解过程中水解时间的设置方式
在本发明的实施例中,具体的可以根据表2从所述低水解强度条件中选取1~5个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液,从中水解强度条件中选取2~4个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液,从高水解强度条件中选取1~2个水解条件得到相应的逐级部分酸水解液。
得到所述逐级部分酸水解液后,本发明将所述逐级部分酸水解液进行第一离心,调节所得第一清液的pH值为6.5~7.5,将得到的调节液与水混合后进行第二离心,得到的第二清液为逐级部分酸水解液样品。在本发明中,所述第一离心和第二离心的转速优选独立地为5000~20000r/min,更优选独立地为10000~15000r/min;时间优选独立地为5~15min,更优选独立地为8~12min,温度优选独立地为0~4℃,更优选独立地为1~3℃。
本发明优选将所述第一清液的pH值调节为7;本发明对于调节所述第一清液的pH值所采用的pH值调节剂的种类及浓度没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的pH值调节剂、能够将所述第一清液的pH值调节至所需范围即可;本发明优选采用浓度为0.1~4mol/L的NaOH溶液作为pH值调节剂。本发明将所述第一清液的pH值调节至6.5~7.5,是为了便于进行后续柱前衍生高效液相色谱分析。
本发明对于与所述调节液混合的水的添加量没有特殊的限定,是为了对所述调节液进行定容,便于后续通过柱前衍生高效液相色谱法计算单糖的摩尔百分含量。在本发明中,所述水优选为去离子水。
得到逐级部分酸水解液样品后,本发明采用柱前衍生高效液相色谱法对所述逐级部分酸水解液样品进行分析,根据得到的色谱图分析所述逐级部分酸水解液中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,以单糖残基种类为一级横坐标、水解程度为二级横坐标、以摩尔百分含量为纵坐标,绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,根据所述单糖残基的摩尔百分含量解离过程图分析所述单糖残基在多糖主链及支链中的分布规律。
本发明对于所述柱前衍生高效液相色谱法的操作条件没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的操作条件即可。在本发明中,对样品溶液进行柱前衍生所采用的衍生化试剂优选为为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP);所述柱前衍生的方法优选包括以下步骤:
将50μL样品溶液、50μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的浓度为0.5mol/L)与50μL浓度为0.3mol/L的NaOH溶液混合均匀,50~90℃水浴20~50min,冷却至室温,加入50μL浓度为0.3mol/L的HCl溶液进行中和,并加入100μL去离子水进行稀释;向所得混合液中加入500~1000μL氯仿,涡旋混匀10~60s随后静置3~5min,吸取下层液弃去;从“加入500~1000μL氯仿”起重复操作3~5次,即得衍生化样品。
在本发明中,进行高效液相色谱分析所采用的高效液相色谱条件优选包括:流速为0.5~2mL/min;检测波长为230~260nm;进样量为5~50μL;流动相为醋酸铵缓冲溶液和乙腈,所述醋酸铵缓冲溶液和乙腈的体积比为76:24~80:20,其中,所述醋酸铵缓冲溶液的浓度为0.05~0.15mol/L,pH值为5.5;或者,所述流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈,所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为81:19~83:17,其中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02~0.1mol/L,pH值为6.5~6.8。
在本发明中,所述单糖残基的摩尔百分含量(%)的计算公式具体为:
单糖残基的摩尔百分含量(%)=水解液中某种单糖的物质的量/水解液中所有单糖的物质的量×100。
本发明根据得到的色谱图分析所述逐级部分酸水解液中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,以单糖残基种类(根据逐级酸水解结果按照单糖残基种类聚集成簇)为横坐标、以摩尔百分含量为纵坐标,绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图(簇状图),能够将单糖残基在多糖中分布的结构特征转变为图谱特征,从而实现所述单糖残基在多糖主链及支链中分布规律的分析以及多糖的鉴别。
本发明提供的方法能够分析多糖结构中单糖残基分布规律的原理为:随着水解强度的增加,部分酸水解产物中游离出的单糖逐渐增多,并呈现出一定的规律性,这种单糖水解游离的规律性与多糖的空间结构密切相关,处于空间结构外侧的支链末端及支链外侧的单糖残基更容易被水解游离出来,反之处于空间结构内侧的主链及支链内侧中包含的单糖残基较难水解游离。根据水解游离出的单糖顺序及其摩尔百分含量关系可以推断出支链及主链的单糖组成信息,具体的,低水解强度条件下最先解离出来的单糖残基为支链末端残基;低水解强度条件下较早开始解离出来并且随着水解程度的逐渐提高其摩尔百分含量逐渐下降的单糖残基主要分布于支链末端及支链外侧;中、高水解强度条件下开始解离出来并且随着水解程度的逐渐提高其摩尔百分含量逐渐上升的单糖残基主要分布于支链内侧及主链结构中;随着水解程度的逐渐提高,摩尔百分含量先上升后下降的单糖残基主要分布于支链内侧。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)水解处理
分别称取0.3g干巴菌胞内多糖置于7只安培瓶(编号依次为1~7号)中,1~6号安培瓶分别加入10mL硫酸溶液,充入氮气并封口,在水浴条件下进行水解,其中,1~6号安培瓶按表3进行处理,水解温度为100℃,分别记为AIPS-1~AIPS-6;作为空白对照,7号安培瓶加入10mL去离子水,50℃处理2h(记为IPS)。
上述处理结束后,离心(15000r/min,10min,4℃),取4.5mL上清液用NaOH溶液(2mol/L)调节pH至7,加水定容至10mL,离心(15000r/min,15min,4℃),取上清液,即为逐级部分酸水解液样品(包括一个空白对照样品)。
表3 1~6号样品水解时硫酸溶液的浓度及水解时间
(2)逐级部分酸水解产物单糖组成分析
采用柱前衍生高效液相色谱法分析逐级部分酸水解液样品中的单糖组成,具体如下:
(a)准确配制2mmol/L的单糖标准品溶液(甘露糖、鼠李唐、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)。
(b)将50μL单糖标准品溶液、50μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的浓度为0.5mol/L)与50μL浓度为0.3mol/L的NaOH溶液混合均匀,70℃水浴30min,冷却至室温,加入50μL浓度为0.3mol/L的HCl溶液进行中和,并加入100μL去离子水进行稀释;向所得混合液中加入900μL氯仿,涡旋混匀30s随后静置5min,吸取下层液弃去;从“加入900μL氯仿”起重复操作3次,即得衍生化标准品。
(c)按照步骤(b)的方法,对所述逐级部分酸水解液样品进行衍生,得到衍生化待测样品。
(d)将所述步骤(b)中衍生化标准品和所述步骤(c)中衍生化待测样品进行高效液相色谱分析,根据得到的色谱图分析所述逐级部分酸水解液中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,以单糖残基种类为一级横坐标、水解程度为二级横坐标、以摩尔百分含量为纵坐标,绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,根据所述单糖残基的摩尔百分含量解离过程图分析所述多糖结构中单糖残基的分布规律;其中,高效液相色谱条件包括:
流速为1mL/min;检测波长为245nm;进样量为20μL;流动相为醋酸铵缓冲溶液-乙腈(77:23,V/V;其中,所述醋酸铵缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为5.5)。
根据衍生化标准品和衍生化待测样品的柱前衍生高效液相色谱图的出峰时间及峰面积分析所述逐级部分酸水解液样品中的单糖种类,并得到每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,结果显示IPS中几乎未检出游离单糖,AIPS-1~AIPS-6的相关数据列于表4中;绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,结果见图1。
表4逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
从图1和表4可知,低强度水解时,半乳糖和甘露糖最先游离出来,说明半乳糖和甘露糖构成多糖的支链末端残基。随着水解强度增大,半乳糖在所有单糖中所占的摩尔百分含量逐渐降低,由93.03%下降到17.91%,说明半乳糖主要分布于支链外侧;葡萄糖的摩尔百分含量由61.57%上升到68.84%,说明葡萄糖是干巴菌胞内多糖的主要单糖成分,并且葡萄糖更多的分布于支链内侧及主链核心位置;甘露糖随着水解强度的增加表现出先上升后下降的趋势,由6.97%上升到16.62%然后下降到11.83%,说明甘露糖更多的分布于支链内侧位置。另外,干巴菌胞内多糖还含有微量鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及阿拉伯糖,这些单糖残基零星的分布于支链内侧及主链结构中。
实施例2
(1)水解处理
按照实施例1中步骤(1)的方法进行水解处理,得到逐级部分酸水解液样品(包括一个空白对照样品);不同之处在于,以干巴菌胞外多糖为多糖样品(分别记为AEPS-1~AEPS-6,空白对照样品记为EPS)。
(2)逐级部分酸水解产物单糖组成分析
按照实施例1中步骤(a)~(d)的方法进行柱前衍生高效液相色谱法分析,结果具体如下:
根据衍生化标准品和衍生化待测样品的柱前衍生高效液相色谱图的出峰时间及峰面积分析所述逐级部分酸水解液样品中的单糖种类,并得到每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,结果显示EPS中几乎未检出游离单糖,AEPS-1~AEPS-6的相关数据列于表5中;绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,结果见图2。
表5逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
由图2和表5可知,低强度酸水解时,半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖最先游离出来,构成多糖的支链末端残基,并且末端残基的主要单糖组成为半乳糖。随着水解强度增大,半乳糖在所有单糖中所占的摩尔比例逐渐降低,由73.36%下降到10.9%,说明半乳糖主要分布于支链外侧;葡萄糖的摩尔比例由15.74%快速上升到78.47%,说明葡萄糖是干巴菌胞外多糖的主要单糖成分,并且葡萄糖更多的分布于支链内侧及主链核心位置;阿拉伯糖含量较低并且摩尔比例逐步下降,由7.52%逐步下降到0.81%,说明阿拉伯糖主要分布于支链的末端;甘露糖表现出先上升后下降的趋势,由3.37%上升到8.79%然后下降到6.43%,说明甘露糖更多的分布于支链内侧。另外,干巴菌胞外多糖还含有微量鼠李糖、半乳糖醛酸,这些单糖残基零星的分布于糖链结构中。
实施例3
(1)水解处理
按照实施例1中步骤(1)的方法进行水解处理,得到逐级部分酸水解液样品(包括一个空白对照样品);不同之处在于,以滑菇胞内多糖为多糖样品(分别记为AIPS-1~AIPS-6,空白对照样品记为IPS)。
(2)逐级部分酸水解产物单糖组成分析
按照实施例1中步骤(a)~(d)的方法进行柱前衍生高效液相色谱法分析,结果具体如下:
根据衍生化标准品和衍生化待测样品的柱前衍生高效液相色谱图的出峰时间及峰面积分析所述逐级部分酸水解液样品中的单糖种类,并得到每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量,结果显示IPS中几乎未检出游离单糖,AIPS-1~AIPS-6的相关数据列于表6中;绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,结果见图3。
表6逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
由图3和表6可知,低强度酸水解时,甘露糖、葡萄糖和半乳糖最先游离出来,构成多糖的支链末端残基,并且末端残基的主要单糖组成为葡萄糖和甘露糖。葡萄糖在低强度酸水解时的摩尔百分含量为63.17%,水解强度提高后稳定在80.77~82.45%,说明葡萄糖是构成主链和支链的主要单糖成分,并且更多的分布于支链内侧及主链中。甘露糖在低强度酸水解时的摩尔百分含量较高为32.77%,水解强度提高后稳定在7.15~8.8%,表明甘露糖在支链及支链末端分布较多。半乳糖在低强度酸水解时的摩尔百分含量为4.06%,水解强度提高后稳定在7.23~8.19%左右,表明半乳糖主要分布于支链内侧及主链中。另外,滑菇胞内多糖还含有葡萄糖醛酸和阿拉伯糖,葡萄糖醛酸和阿拉伯糖零星分布于糖链结构中。
实施例4
实验方法的重复性验证,具体如下:
将干巴菌胞内多糖按照实施例1中的方法重复测定两次,结果见表7~8和图4~5(图4为第一次重复性验证时单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,图5为第二次重复性验证时单糖残基的摩尔百分含量解离过程图)。
表7第一次重复性验证时逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
表8第二次重复性验证时逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
由表7~8和图4~5可见,同种多糖在相同的水解条件下,测得的单糖的摩尔百分含量值相对稳定,表明同种多糖单糖残基的解离过程具有很好的重复性。
实施例5
实验方法的准确性验证,具体如下:
目前,蛹虫草多糖结构的解析较为清楚。RongminYu等(RongminYu,Yin Yin,WeiYang,et al.Structural elucidation andbiological activity ofa novelpolysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris[].Carbohydrate Polymers,2009,75(1):166-171)运用Smith降解、气质联用(GC-MS)、核磁共振(NMR)、脉动电流探测法(HPAEC-PAD)和傅立叶红外光谱(FT-IR)等多种物理、化学方法分析蛹虫草多糖结构,实验结果表明,蛹虫草多糖主链中含有大量甘露糖残基,支链主要由葡萄糖残基和半乳糖残基构成,支链末端为半乳糖残基。
为验证本发明方法可以准确反应多糖的结构,取蛹虫草多糖进行逐级部分酸水解实验,并绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,具体如下:
(1)水解处理
分别称取0.3g蛹虫草胞内多糖置于5只安培瓶(编号依次为1~5号)中,1~4号安培瓶分别加入10mL硫酸溶液,充入氮气并封口,在水浴条件下进行水解,其中,1~4号安培瓶按表9进行处理,水解温度为100℃,分别记为AIPS-1~AIPS-4;作为空白对照,5号安培瓶加入10mL去离子水,50℃处理2h(记为IPS)。
上述处理结束后,离心(15000r/min,10min,4℃),取4.5mL上清液用NaOH溶液(2mol/L)调节pH至7,加水定容至10mL,离心(15000r/min,15min,4℃),取上清液,即为逐级部分酸水解液样品(包括一个空白对照样品)。
表9 1~4号样品水解时硫酸溶液的浓度及水解时间
(2)逐级部分酸水解产物单糖组成分析
按照实施例1中步骤(a)~(d)的方法进行柱前衍生高效液相色谱法分析,根据逐级部分酸水解液样品中的单糖种类以及每种单糖占所有单糖物质的量的摩尔百分含量(数据列于表10中),绘制单糖残基的摩尔百分含量解离过程图,结果见图6。
表10逐级部分酸水解液样品中单糖的摩尔百分含量
由表10和图6可知,低强度酸水解时,半乳糖、葡萄糖最先游离出来,构成多糖的支链末端残基,并且末端残基的主要单糖残基组成为半乳糖。随着水解强度增大,半乳糖在所有单糖中所占的摩尔百分含量逐渐降低,由91.91%下降到14.04%,说明半乳糖主要分布于支链末端及支链外侧;葡萄糖的摩尔百分含量由8.09%快速上升到59.98%随后下降为58.46%,说明葡萄糖是蛹虫草胞内多糖的主要单糖成分,并且葡萄糖更多的分布于支链内侧及主链中;甘露糖较晚解离并且摩尔百分含量逐步升高,由8.96%逐步上升到25.02%,说明甘露糖主要分布于主链核心位置;另外,蛹虫草胞内多糖还含有微量葡萄糖醛酸,这些单糖残基零星的分布于糖链结构中。
上述蛹虫草胞内多糖的分析结果与文献报道的多糖结构相一致,说明本发明所述分析方法测定结果准确,可行性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。