CN103698425B - 一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法包括如下步骤：(1)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖；(2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；(3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。本发明化学降解法可将生物来源糖胺聚糖完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到二糖的结构信息；降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法。
背景技术
糖胺聚糖是一类由含氨基己糖重复二糖单元(氨基己糖和己糖糖醛组成的线性高分子多糖。其中透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素的重复二糖单元为氨基己糖和糖醛酸。硫酸角质素较为特殊，其重复二糖单元为氨基葡萄糖和半乳糖。糖胺聚糖以蛋白聚糖的形式存在于细胞表面和细胞内，并亦是所有细胞的胞外基质的主要组成成分。糖胺聚糖在胞外形成了细胞外的亲水环境，在细胞膜上和细胞内的糖胺聚糖是许多细胞生长因子及细胞与病毒的受体，它介导细胞内外的信号传导。
研究发现，几乎所有的动物细胞都合成糖胺聚糖。细胞是生命的基本单元，细胞中合成与降解糖胺聚糖很容易受到环境影响，于是检测细胞中糖胺聚糖在生物环境变化下的改变就变得尤为重要。如肿瘤组织和正常组织的硫酸乙酰肝素的组成及含量不同。在药物对细胞的影响实验中，常常会发现加药组细胞中的硫酸乙酰肝素结构及含量与正常细胞中的硫酸乙酰肝素不同。常用的分析糖胺聚糖二糖组成的方法为酶解二糖分析法，既将糖胺聚糖用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、硫酸软骨素酶、透明质酸酶、硫酸角质素酶等逐一降解，得到二糖，再用离子交换柱分离并比对二糖标准品，从而确定二糖组成及含量。但是传统方法中所用到的每种酶所需要的降解条件不同，酶、二糖标准品、离子交换柱等价格昂贵、酶的活性容易受到样品中的杂质抑制，使得方法的重复性和准确性不高，操作步骤复杂，因此至今还没有用酶进行糖胺聚糖混合物二糖组成与结构鉴定的分析报道。除此之外，由于糖胺聚糖的结构类似性，将每一种糖胺聚糖，如来源于猪、羊、牛、鼠、斑马鱼等的组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼等)及细胞中的糖胺聚糖的提取纯化相当困难，并且有一些生物，如于小鼠、斑马鱼等细胞中的糖胺聚糖含量非常少，这使将每一种糖胺聚糖提取纯化并进行二糖组成分析几乎成为不可能因此，新的糖胺聚糖二糖组成测定方法对推进其研究、开发与应用至关重要。
发明内容
针对以上存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的同时化学降解生物来源的全部糖胺聚糖的方法，本发明的另一目的是提供一种检测所有降解所得糖胺聚糖二糖的方法。
实现上述发明的技术方案是：
一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，包括如下步骤：
(1)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖；
(2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；
(3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生
取步骤(2)所得糖胺聚糖二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
2.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91-114℃，反应4-20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
3.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括：
将脱乙酰糖胺聚糖浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得糖胺聚糖二糖。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明方法可将生物来源糖胺聚糖完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到糖胺聚糖二糖的结构信息。
(2)化学降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。
(3)适用范围广，适合所有生物来源的糖胺聚糖。
(4)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定性定量检测。
(5)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，检测限为ng级别。
附图说明
图1猪肺来源糖胺聚糖化学降解所得二糖D3PMP衍生LC图谱。
图2细胞来源糖胺聚糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)和质谱图(B)。
具体实施方式
实例1猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
(1)将1mg本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于500uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应8小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实例2猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
(1)将1mg本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到114℃，反应20小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实例3猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
(1)将1mg本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91℃，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
计算实施例1-3糖胺聚糖二糖得率，结果见表1。
表1施例1-3糖胺聚糖二糖得率
结果表明，实施例1和实施例2都可将猪肠黏膜来源的样品完全降解，降解产物中没有聚合度大于2的寡糖存在，且实施例1所用的时间比实施例2节省了60％。实施例2中还有聚合度大于2的寡糖存在，比例为8％。
实施例4-10涉及的化学降解产物结构：
实施例4-10涉及的化学降解产物衍生产物的质量数：
表2
实施例4猪肺来源糖胺聚糖化学降解所得二糖的D3PMP衍生及LC检测
(1)将20ug本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于10uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应8小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；将所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
(2)将步骤(1)中的降解产物浓缩至干，用50uL水溶解，调节pH值为9，然后加入1.4uL 0.5mol／LD3PMP于70℃条件下密封反应60min，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(3)LC分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B 15min，12％B 30min线性增加到20％B，20％B 15min，紫外检测器DAD245nm检测。结果见图1。
由图1知，猪肺糖胺聚糖的化学降解产物在LC上分离得到10种组分，其中G0M9，I2M6，I0M6，I2M0，G0M0，I0M0，M6是硫酸类肝素二糖，说明猪肺中含有硫酸类肝素；G0T4，G0T6，G0T0是硫酸软骨素二糖，说明猪肺中含有硫酸软骨素。G0T4的含量大大高于G0T6，说明猪肺中的硫酸软骨素主要是硫酸软骨素A。该实验说明本发明可以用于生物来源糖胺聚糖的定性分析。
实例5人血液来源糖胺聚糖化学降解所得二糖的PMP、D3PMP衍生及LC-MS检测
(1)分别从两个人的血浆中提取糖胺聚糖，各取20ug，用样品1和样品2表示，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)按实施例4步骤(2)对样品衍生，样品1用14uL 0.5mol／LPMP衍生，样品2用14uL 0.5mol／LD3PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B 15mm，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表3。
表3
结果显示，从人血浆中提取的糖胺聚糖主要是硫酸软骨素，设样品1中各二糖含量为100％，样品2中G0T4含量为85％，G0T0含量为80％。该实验说明本发明可以用于生物来源糖胺聚糖的定性及定量分析。
实施例6猪肺、猪心来源糖胺聚糖化学降解所得二糖的D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
(1)取20ug猪肺、猪心来源糖胺聚糖(本实验室提取)，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)按实施例4步骤(2)对样品衍生，猪肺来源糖胺聚糖用14uL 0.5mol／LD3PMP衍生、猪心来源糖胺聚糖用14uL 0.5mol／LD8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B 15min，12％B 30min线性增加到20％B，20％B 15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表4。
表4
表中---表示未检测到该种质量数；N表示无结果。
表中所示，由于只有一种生物来源的糖胺聚糖含有某一种二糖，而其他来源的不含有该二糖，导致该二糖的相对比值不能计算(用N表示)。由表可知，从LC-MS质谱中的糖质量数一栏可以看出，猪肺、猪心来源糖胺聚糖所含糖胺聚糖二糖种类不同，猪肺来源糖胺聚糖中不含有G0T10、G0M6和I0T4；猪心来源糖胺聚糖中不含有I2M6、G0M3、I2M0、G0T0、G0M0和I0M0。从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，猪肺、猪心来源糖胺聚糖的各种二糖的比例不同。由此可以说明本方法可以对不同生物来源糖胺聚糖进行定性及定量检测，并且可以同时对两种样品进行分析。
实施例7细胞来源糖胺聚糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
(1)取20ug的空白组，低浓度加药组，中浓度加药组和高浓度加药组的人类结肠癌细胞来源糖胺聚糖(由本实验室提取)，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)用PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP按照实施例4步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，空白组用14uL0.5mol／LPMP衍生，低浓度加药组用14uL0.5mol／LD3PMP衍生，中浓度加药组用14uL0.5mol／LD5PMP衍生，高浓度加药组用14uL0.5mol／L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B 15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将四种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表5和图2。
表5
由表可知，从LC-MS质谱中的糖质量数一栏可以看出，空白组，低浓度加药组，中浓度加药组和高浓度加药组的人类结肠癌细胞来源的糖胺聚糖所含的二糖种类相同，都含有G0T4、G0T6、I2M0，G0T0、G0M0，说明加药前后糖胺聚糖种类没有发生变化。从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，空白组，低浓度加药组，中浓度加药组和高浓度加药组糖胺聚糖所含的各种二糖的比例不同，说明加药处理后HCT116细胞中G0T4、I2M0、G0T0、G0M0的含量降低，并随着加药浓度的升高，降低的程度逐渐增大；G0T6的含量升高，随着加药浓度的升高，升高的程度增大。图2A为总离子流图，图2B为各个二糖的质谱图，每个质谱图都有四组峰，从左到右分别代表空白组，低浓度加药组，中浓度加药组和高浓度加药组。由此可以说明本方法可以对不同生物来源的糖胺聚糖进行定性及定量，可以同时分析四种样品。实施例8猪肝、猪肺、猪肾来源糖胺聚糖化学降解所得二糖的PMP、D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
(1)各取20ug猪肝、猪肺、猪肾来源糖胺聚糖(本实验室提取)，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)用PMP、D3PMP、D8PMP按照实施例4步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，猪肝来源糖胺聚糖用7uL 0.5M PMP衍生，猪肺来源糖胺聚糖用7uL 0.5mol/LD3PMP衍生，猪肾来源糖胺聚糖用7uL0.5mol／L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表6。
表6
表中---表示未检测到该种质量数；N表示无结果。
如表所示，由于只有一种生物来源的糖胺聚糖含有某一种二糖，而其他来源的不含有该二糖，导致该二糖的相对比值不能计算(用N表示)。由表可知，从LC-MS质谱中的糖质量数一栏可以看出，猪肝、猪肺、猪肾来源糖胺聚糖的二糖种类不同，猪肝来源糖胺聚糖中不含有G0M3，G0T0和I0M0，猪肺来源糖胺聚糖中不含有G0M9和G0M6，猪肾来源糖胺聚糖中不含有G0M6，G0T0和I0M0。从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，猪肝、猪肺、猪肾来源糖胺聚糖所含的各种二糖的比例不同。由此可以说明本方法可以对不同生物来源糖胺聚糖进行定性及定量检测，可以同时对三种样品进行分析。
实施例9猪心、猪肠黏膜、猪肝来源的糖胺聚糖化学降解所得二糖的D3PMP、D8PMP、D5PMP衍生及LC-MS检测
(1)取20ug猪心、猪肠黏膜、猪肝来源的糖胺聚糖(本实验室提取)，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)用D3PMP，D8PMP，D5PMP按照实施例4步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，猪心来源的糖胺聚糖用7uL 0.5mol／LD3PMP衍生，猪肠黏膜来源的糖胺聚糖用7uL 0.5mol／L D5PMP衍生，猪肝来源的糖胺聚糖用7uL 0.5M D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B 15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B 15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表7。
表7
表中---表示未检测到该种质量数；N表示无结果。
如表所示，由于只有一种生物来源的糖胺聚糖含有某一种二糖，而其他来源的不含有该二糖，导致该二糖的相对比值不能计算(用N表示)。由表可知，从LC-MS质谱中的糖质量数一栏可以看出，猪心、猪肠黏膜、猪肝来源的糖胺聚糖所含二糖种类不同，猪心来源的糖胺聚糖中不含有G0M9，I2M6，G0M3，I0M6，I2M0，G0M0和I0M0，猪肠黏膜来源的糖胺聚糖中不含有G0T10，G0M9，G0T4，G0T6和I0T0，猪肝来源的糖胺聚糖中不含有G0T10，G0M3，I0M6，I0T4和I0M0，说明猪心来源的糖胺聚糖样品中主要含有硫酸软骨素，猪肠黏膜来源的糖胺聚糖主要含有肝素，猪肝来源的糖胺聚糖中含有硫酸软骨素和硫酸类肝素。从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，猪心、猪肠黏膜、猪肝来源的糖胺聚糖所含的各种二糖的比例是不同的。由此可以说明本方法可以对不同生物来源的糖胺聚糖进行定性及定量检测，可以同时对三种样品进行分析。
实施例10肿瘤组织来源的糖胺聚糖化学降解所得二糖的PMP，D8PMP衍生及LC-MS检测
(1)取20ug肿瘤组织来源的糖胺聚糖(本实验室提取)，分别用肿瘤组织1和肿瘤组织2表示，按实施例4步骤(1)进行化学降解。
(2)用PMP，D8PMP按照实施例4步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，肿瘤组织1用7uL0.5mol／LPMP衍生，肿瘤组织2用7uL0.5mol／LD8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B 15min，12％B 30min线性增加到20％B，20％B 15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表8。
表8
表中---表示未检测到该种质量数；N表示不能进行计算。
如表所示，由于只有一种生物来源的糖胺聚糖含有某一种二糖，而其他来源的不含有该二糖，导致该二糖的相对比值不能计算(用N表示)。由表可知，从LC-MS质谱中的糖质量数一栏可以看出，肿瘤组织1，2来源的糖胺聚糖所含的二糖种类是不同的，肿瘤组织1来源的糖胺聚糖中不含G0M3，肿瘤组织2来源的糖胺聚糖中不含G0M9和G0T0。从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，肿瘤组织1，2来源的糖胺聚糖中每种二糖的含量是不同的。由此可以说明本方法可以对不同来源的糖胺聚糖定性及定量检测，可以用于两种样品的同时分析。
Claims (8)
1.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖；
(2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；
(3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生
取步骤(2)所得糖胺聚糖二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖，液相质谱条件，液相柱：Agilent 0.3mm×250mm×5μm SB-C18柱，流速15μL/min；流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B 15min；上样量为0.02μL；紫外检测器DAD 245nm检测或MS检测器；质谱为负离子检测模式。
2.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91-114℃，反应4-20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
3.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应8h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
4.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括：
将脱乙酰糖胺聚糖浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得糖胺聚糖二糖。
5.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰反应步骤中生物来源糖胺聚糖与N2H4·H2O溶液的质量体积比mg/mL为1∶0.5-1，N2H4·H2O溶液中含10％N2H4·H2SO4。
6.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤中脱乙酰糖胺聚糖水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1∶1∶1∶0.6。
7.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的糖胺聚糖二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量比为1∶6-60。
8.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)中的一种或任意几种联用。
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