CN117990732A - 一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测分析技术领域，具体提供一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，所述方法包括分离同源多糖，绘制洗脱曲线，选出n种多糖构建分段同源多糖组，测定所述分段同源多糖组中每种多糖的纯度和分子量，对每种多糖进行均一性分析，测定每种多糖的单糖组成、糖苷键和官能团判断每种多糖的结构相似性，利用特定的分段同源多糖组中每种多糖之间的结构相似性进行核磁解析，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，从而达到准确、快速的一次性解析多个多糖的完整化学结构的目的，显著提高了弱信号峰的解析程度和解析准确性、多糖的解析完整性，对解析人员的要求低。
Description
技术领域
本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法。
背景技术
多糖 (polysaccharide)是由十个单糖通过糖苷键连接形成，构成生物的重要的大分子物质之一，被证明具有丰富的生物活性，包括免疫活性，抗糖尿病，抗癌，抗炎等。常见多糖结构如图12所示（以香菇多糖示例）（Ankaj Kumar, Rishi Paliwal, ArvindGulbake,Lentinan: An unexplored novel biomaterial in drug and gene deliveryapplications, Journal of Controlled Release, 2023, Volume 356, 316-336），多糖结构决定其活性，多糖结构与活性的关系是多糖应用快速发展的指导。明确多糖结构，一是研究多糖构效关系的基础，进而为多糖的应用提供依据；二是多糖药理学以及毒理学研究的基础，对于医学多糖应用具有里程碑式的意义。但是多糖解析目前仍存在较大困难，多糖结构复杂，它由十个及以上的单糖通过糖苷键连接形成，相对分子质量从几万到几千万不等，具有丰富的分支结构，并折叠形成不同的空间结构。由于单糖类型丰富，连接位置以及连接顺序的不同使得多糖结构复杂，导致多糖的组合可能性多，结构解析十分困难（叶立斌,张劲松,潘迎捷.食药用菌多糖结构解析中的核磁共振技术[J].食用菌学报,2007(04):68-75.DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2007.04.012.；刘玉红,王凤山.核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用[J]. 食品与药品, 2007(08):39-43.）。
多糖结构解析的方法主要有四大类包括色谱法，质谱法，波谱法以及光谱法。波谱法中的核磁共振波谱法（NMR）是目前研究多糖结构的主流方法（杜秀菊,张劲松,潘迎捷.核磁共振技术在食用菌多糖结构分析中的作用[J].中国食用菌,2010,29(01):3-6+19.DOI:10.13629/j.cnki.53-1054.2010.01.005.）。NMR能够得到较为全面的多糖结构信息，包括单糖组成，糖苷键，糖苷键连接顺序（刘玉红,王凤山.核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用[J].食品与药品,2007(08):39-43.）。目前常用于多糖结构解析的NMR的类型主要包括一维图谱，1H NMR谱，13C NMR谱，二维图谱包括HSQC谱、HMBC谱、COSY谱、NOESY谱。一般来说，解析NMR图谱首先需要利用1H NMR谱，13C NMR谱获得简单的多糖结构信息，之后根据HSQC谱一一对应端基氢与端基碳，再利用COSY, NOESY图谱从端基氢出发寻找其它位置的氢，等到氢全部归属完后，再利用HSQC谱归属所有的碳信号，最后利用HMBC、NOESY验证归属的碳氢信号峰，并确认各个糖残基的连接位置和顺序。并结合单糖组成，糖苷键，分子量等信息便可解析多糖结构。
但是，现有技术利用NMR解析多糖结构的方法仍存在三个明显的问题：
（1）一次性只能解析一个多糖的结构：现有技术的方法一次性只能解析一个多糖的结构是指在一次NMR检测后得到一个多糖的各种NMR图谱，然后根据一个多糖的图谱分析这一个多糖的结构，如果要解析多个多糖的结构只能将每个多糖依次按照上述步骤分析，解析效率低，如李雪琴、张军银、曹长靓等人的研究中虽然文中有制备多个多糖，但在结构解析时均是利用一个多糖的甲基化分析、核磁共振波谱进行信号峰的归属分析，多个多糖之间的分析都是独立的、无相互比较分析；（李雪琴. 不同分子量柴胡多糖的结构解析及体外生物活性研究[D]. 山西:山西大学,2022.张军银. 多花黄精果聚糖和半乳聚糖的结构及其在益生菌中的应用[D]. 四川:成都中医药大学,2021.曹长靓. 海蒿子多糖的分离纯化、降血糖活性及其体外消化酵解研究[D]. 广东:华南理工大学,2021.）。
（2）弱信号峰的糖残基解析不准确甚至无法解析：由于核磁共振灵敏度低，检出限高，导致糖链中含量低的糖残基以及糖苷键等只能在核磁图谱中出弱信号峰或者不出峰。现有技术人员解析弱信号峰只能基于自身知识水平进行估计解析，或者直接舍弃该弱信号峰，因此导致弱信号峰对应的糖残基结构解析不准确甚至无法解析，进而使得多糖结构解析不完整。目前针对多糖结构的解析包括分子量，单糖组成，官能团，糖残基以及糖苷键连接方式等，主要解析多糖的主链以及含量丰富的侧链结构，但侧链结构因为含量低导致在检测图谱中表现为弱信号峰，在结构解析时解析不准确或无法解析导致多糖结构解析不完整。完整的多糖结构是指在分子量，单糖组成，官能团，糖残基以及糖苷键连接方式等解析的主链结构基础上，进一步解析多糖的侧链结构，并基于分子量，对重复单元数进行合理判断，如果只是解析了上述部分结构信息则得到的是不完整的多糖结构。例如李雪琴在利用核磁解析柴胡多糖结构时，因为部分核磁信号太弱，而未出峰，因此没有得到该部分的糖苷键连接方式（李雪琴. 不同分子量柴胡多糖的结构解析及体外生物活性研究[D]. 山西:山西大学,2022.）；在Dong Yu-Hao等人对桑葚多糖的研究中（Yu-Hao D, Chun C, Qiang H,Xiong F. Study on a novel spherical polysaccharide from Fructus Mori withgood antioxidant activity. Carbohydr Polym. 2021 Mar 15;256:117516. ），可以看到氢谱中的信号峰5.07 ppm，4.99 ppm，4.60 ppm等和碳谱中的信号峰101.70ppm，77.51ppm等因信号太弱，而无法解析，所以被舍弃。国家标准GB/T 27417—2017中指出仪器检出限是指用仪器可靠地将目标分析物信号从背景（噪音）中识别出来时，分析物的最低浓度或量（陈雷,刘红兵,刘惠丽. 定量NMR中多种检出限评估方法的比较[J]. 波谱学杂志,2022,39(2):230-242. DOI:10.11938/cjmr20212944.）；王东云的研究中记载，在分析天然产物中，核磁共振仪的检出限较其它波谱分析仪器高，这对于产率较低的天然产物化合物来说无疑是一种瓶颈制约因素；同样的，刘雅琴等人的研究中记载，低灵敏度一直是(并将继续是)核磁共振生物分析应用的致命弱点，而提高核磁共振灵敏度一直是过去四十年来大多数技术发展的焦点。另外，由于多糖有结构复杂且分支结构丰富，各成分之间相互干扰导致核磁共振检出限高；（刘雅琴,余明新,何玲.核磁共振技术在药物检测中的应用进展[J].天然产物研究与开发,2022,34(11):1971-1977.DOI:10.16333/j.1001-6880.2022.11.018.；王东云.核磁共振技术及应用研究进展[J].科技信息(学术研究),2008(27):353-354.）；因此在检测条件的限制下，由于多糖分子量大，溶解度低，使得核磁出峰信号中，多糖中某些含量低的糖残基出峰信号弱，导致无法解析弱信号峰对应的结构，因此目前的多糖结构解析技术往往只解析了多糖中强信号部分，即多糖主链部分，而无法获得准确的多糖侧链信息。
（3）NMR信号峰解析困难，对解析人员的专业技术依赖性高：现有技术的多糖结构解析方法仅依赖待解析的一个多糖的所有图谱的信号峰进行结构解析，核磁图谱的信号峰量大复杂，包含诸多弱信号峰、重合峰增大了解析难度，因此对于解析人员的专业知识要求非常高，影响解析效率和解析准确性，无法广泛适用于常规技术人员的工作；具体的，尽管二维图谱已经极大的改善了一维图谱中的多糖信号峰重叠的问题，但是多糖结构复杂，仍然不可规避的存在信号峰重叠的问题，导致能够被解析的信号峰数量减少而增大解析难度、降低解析的完整性和准确性，如李雪琴的研究中记载，对柴胡多糖大分子进行核磁共振波谱分析，由于分子量大，有些信号会有重叠，导致核磁波谱法得到的糖苷键连接方式较少。（李雪琴. 不同分子量柴胡多糖的结构解析及体外生物活性研究[D]. 山西:山西大学,2022.屠鹏飞主编.(2013). 天然糖化学. 北京: 化学工业出版社.；景永帅,马云凤,李明松等.植物多糖结构解析方法研究进展[J].食品工业科技, 2022, 43(03):411-421.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2021010181.）；而且通过NMR解析多糖结构需要根据1H NMR谱、13C NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、COSY谱、NOESY谱等归属氢、碳、各个糖残基的连接位置和顺序，这些图谱的核磁信息量大且复杂，单纯依赖一个多糖的所有NMR出峰信号进行判断结构需要具备丰富的化学专业知识以及丰富的糖结构解析经验，解析难度大门槛高、解析不准确，对于解析人员的专业要求很高，普通科技工作者无法有效利用。
综上所述，现有技术解析多糖的方法仍存在一次性只能解析一个多糖的结构造成解析效率低、对解析人员的专业技术依赖性高的问题，尤其是针对弱信号峰对应的糖残基解析不准确或者无法解析导致多糖结构的解析是不完整的，极大的影响了多糖构效关系网的建立，限制了多糖的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，首次将将现有技术中解析不准确或者舍弃的弱信号峰有效利用得到了完整的多糖结构，本发明创造性的首次分离并构建了特定的分段同源多糖组，对所述分段同源多糖组中每种多糖进行均一性分析，测定每种多糖的单糖组成、糖苷键和官能团判断每种多糖的结构相似性，利用特定的分段同源多糖组中每种多糖之间的结构相似性进行核磁解析，基于同源比较，尤其是将现有技术中解析不准确或者舍弃的弱信号峰有效利用，即利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，使得多糖结构含量高的主链和含量低的侧链结构均能解析，从而达到准确、快速的一次性解析多个多糖的完整结构的目的，所述一次性解析多个多糖是指同时根据多个多糖的图谱分析多个多糖的结构，多个多糖的核磁信号进行互相比较分析，最终同时得到多个多糖的结构；基于特定的分段同源多糖组中每种多糖的结构相似性，对于弱信号峰的解析可以借助于同源多糖的强信号峰辅助比较解析，相比于现有技术单纯根据一个多糖的出峰信号依赖技术人员的专业知识判断结构，本发明的方法显著提高了弱信号峰的解析程度和解析准确性，进而显著提高了多糖的解析完整性，对于解析人员的技术要求明显降低。
本发明所述的强信号峰和弱信号峰是相对的概念，弱信号峰通常认为是信号强度低、出峰面积小或无法与噪声和干扰信号区分的信号峰，本发明定义所述弱信号峰是指核磁信号峰面积绝对值小于1000的信号峰，例如附图5中的B中 RH1, GH1的信号峰面积分别为291，677，均属于弱信号峰；所述强信号峰是指峰面积绝对值大于等于1000的信号峰。
本发明提供一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，包括以下步骤：
（1）分离出同源多糖，绘制洗脱曲线；所述同源多糖是指绘制的同一条洗脱曲线上的所有多糖；
（2）从所述洗脱曲线上选出任意n种多糖，其中n为正整数且n≥2，构建分段同源多糖组；
（3）分别测定所述分段同源多糖组中每种多糖的纯度和分子量；
（4）分别对每种多糖的纯度进行均一性分析，判断分段同源多糖组的均一性；若为均一性多糖，则进行步骤（5），若不是均一性多糖，则进行步骤（2）；所述均一性分析是指分析多糖的纯度，所述均一性多糖是指在渗透色谱图中具有单一高斯分布的多糖；
（5）多糖结构相似性判断，利用核磁解析得到完整的多糖结构：
（5-1）：对所述分段同源多糖组中的每种多糖进行结构分析，测定其单糖组成、糖苷键和官能团；
（5-2）：根据测得的单糖组成、糖苷键和官能团判断所述分段同源多糖组是否结构相似，若结构不相似，则进行步骤（2）；若结构相似，则对所述分段同源多糖组进行核磁解析，得到所述分段同源多糖组中所有多糖的结构解析结果。所述结构相似指的是分段同源多糖组中的每种多糖之间有至少30%相同的单糖组成，糖苷键以和官能团。
本发明通过所述的基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，得到了包括分子量，单糖组成，官能团，糖残基以及糖苷键连接方式等的主链结构以及多糖的侧链结构的信息的完整的多糖结构。
优选的，步骤（5）中，所述核磁解析包括将具有相似结构的同源多糖组内的多糖进行核磁分析，利用核磁信号的相似性，互相辅助解析完整的多糖结构，所述互相辅助解析的步骤如下：
1）根据分段同源多糖组中的每种多糖的一维图谱，包括碳谱和氢谱，相互对比分析同源多糖的相似性，所述同源多糖的相似性指的是分段同源组中的每种多糖的核磁信号谱图中有相同化学位移的出峰信号；
2）分别分析所述分段同源多糖组中的每种多糖核磁图谱中的强信号峰，解析强信号峰的糖残基；
3）根据同源多糖的相似性，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，并结合分子量，单糖组合和官能团信息，解析得到完整的多糖结构。
优选的，在步骤（1）分离出同源多糖之前，还包括粗多糖提取的步骤；更优选的，所述粗多糖分离提取，具体包括：采用热水提取法提取粗多糖。
优选的，在步骤（1）分离出同源多糖之前，还包括纯化粗多糖的步骤，所述纯化粗多糖包括去除色素和去除蛋白质的步骤，所述去除色素的物质选自丙酮、甲醇、AB-8大孔树脂或活性炭中的任意一种或多种；所述去除蛋白质采用Sevag法去除蛋白质，其中Sevag试剂的配制为V氯仿∶V正丁醇= 3∶1～5∶1，Sevag试剂与粗多糖液体积比为3∶1～5∶1，重复操作，直至中间层无白色絮状物，取上清液冻干，采用Bradford法测定纯化后的粗多糖中的蛋白质含量，根据蛋白质含量判断是否重复操作直至蛋白质含量低于5%。
优选的，步骤（1）中，所述分离出同源多糖的步骤为采用NaCl全浓度（0-1M）或多浓度洗脱；所述多浓度是指根据实验要求，在0-1 M范围内，选取合适的NaCl终浓度进行连续梯度洗脱。更优选的，所述洗脱的方法为粗多糖利用离子层析柱或进一步采用凝胶色谱柱进行洗脱分离。
优选的，步骤（1）中，所述绘制洗脱曲线的方法为利用苯酚硫酸法测定碳水化合物含量，从而绘制洗脱曲线。
优选的，步骤（2）中，所述构建分段同源多糖组可以任意选取多段洗脱曲线范围内的n种多糖，透析，冻干样品。
优选的，步骤（3）中，所述纯度和分子量采用凝胶渗透色谱测定；更优选的，采用凝胶渗透色谱搭配示差折光检测器测定所述分子量和纯度，流动相为0.1 M NaNO3。所述均一性多糖的判断方法是按照渗透色谱图出峰确定，如果所述分段同源多糖组中的每种多糖都出单一的信号峰，说明所述分段同源多糖组中的每种多糖均为均一性多糖；
优选的，步骤（5）中，所述单糖组成的测定方法为首先采用三氟乙酸将多糖酸解为单糖，之后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）对单糖进行衍生。更优选的，采用柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成，分析其单糖组成，比较其单糖组成；更优选的，所述高效液相色谱法的条件为：流动相乙腈（A相），0.1 M 乙酸铵溶液（B相）；洗脱程序0～50 min, 19%A相，检测波长为254 nm；
优选的，步骤（5）中，所述糖苷键的分析采用酶解法；更优选的，所述酶解法的条件为将1～2 mg/ml的同源多糖糖液分别与α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶，β-1,4-半乳聚糖内切酶，α-1,4-半乳聚糖内切酶混合，37～40 ℃反应16～24 h。
优选的，步骤（5）中，所述官能团的分析采用红外光谱法；所述红外光谱法的条件为称取适量同源多糖样品，以KBr压片，在4000～400 cm-1的范围内进行红外光谱扫描得到红外光谱图；
优选的，步骤（5）中，所述核磁解析的方法包括对同源多糖用D2O溶解后，冷冻干燥，再溶解于D2O中，进行核磁共振波谱（NMR）分析，所述核磁共振波谱（NMR）包括1H,13C,1H/1H COSY,1H/1H NOSEY,1H/13C HSQC 和1H/13C HMBC的任意一种或多种；更优选的，所述核磁共振波谱（NMR）分析中，利用丙酮（δ 30.89）作为内标，对碳谱的化学位移进行校准；
优选的，步骤（5）中，所述核磁解析的步骤具体包括：1）核磁共振波谱（NMR）分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的结构信息；2）分析比较所述分段同源多糖组中的每种多糖的1H NMR图谱以及13C NMR图谱，确定所述分段同源多糖组中的每种多糖重合的信号峰，根据每种多糖之间的比较，确定重合的信号峰对应的糖残基；3）分别分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰，解析强信号峰的糖残基；根据同源多糖的相似性，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，解析得到完整的多糖结构；4）根据所述分段同源多糖组中的每种多糖的分子量，单糖组成，糖苷键，官能团、糖残基以及糖苷键连接顺序信息，判断多糖结构。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明创造性的首次分离并构建了特定的分段同源多糖组，对所述分段同源多糖组中每种多糖进行均一性分析，测定每种多糖的单糖组成、糖苷键和官能团判断每种多糖的结构相似性，利用特定的分段同源多糖组中每种多糖之间的结构相似性进行核磁解析，基于同源比较，根据所述分段同源多糖组中的每种多糖的NMR图谱，互相辅助解析完整的多糖结构，使得多糖结构含量高的主链和含量低的侧链结构均能解析，从而达到准确、快速的一次性解析多个多糖的完整结构的目的，相比于现有技术的方法一次性只能解析一个多糖的结构，本发明解析效率显著提高，有望解析该洗脱曲线上所有的多糖，扩大了多糖研究者对于多糖的选择范围。
（2）本发明的解析方法利用特定的分段同源多糖组中每种多糖的结构相似性，基于同源比较，将现有技术中解析不准确或者舍弃的弱信号峰有效利用，即利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，在多个多糖的出峰信号比对中解析弱信号峰、重合信号峰，显著提高了弱信号峰的解析程度和解析准确性，进而显著提高了多糖的解析完整性，解决了现有技术中含量低的弱信号峰对应的糖残基解析不准确或者无法解析的问题。
（3）本发明的解析方法基于特定的分段同源多糖组中每种多糖的结构相似性，对于弱信号峰的解析可以借助于同源多糖的强信号峰辅助比较解析，相比于现有技术单纯根据一个多糖的出峰信号依赖技术人员的专业知识判断结构，对于解析人员的技术要求明显降低。
（4）由于完整、准确、数量更多的同源多糖解析，对应的同源结构与其活性差异的研究更加清晰，可以更加准确的定位与单一差异结构变化的关系，进一步为多糖构效关系提供更加可靠丰富的数据资源。
附图说明
图1为一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法图，多糖1…n指的是在多糖洗脱曲线上任意选择进行互相辅助解析的多糖，横坐标代表苯酚硫酸法检测多糖的浓度，纵坐标代表洗脱时间；
图2为枇杷叶多糖分离图，其中图2中的A为枇杷叶多糖DE-52洗脱图，图2中的B为葡聚糖凝胶洗脱图；图2中的A与图2中的B的横纵坐标一致，横坐标为洗脱管数目，纵坐标为吸光度；
图3为多糖的液相色谱图，其中图3中的A为多糖1凝胶渗透色谱图；图3中的B为多糖2凝胶渗透色谱图，图3中的C为多糖1和多糖2糖苷酶酶解产物液相图，1～4代表多糖1的不同酶解处理，4～8代表多糖2的不同酶解处理，具体如下：1，不酶解、2，β-1,4-半乳糖苷酶酶解、3，α-1,5-阿拉伯糖苷酶酶解、4，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶; 5：不酶解、6：β-1,4-半乳糖苷酶酶解、7：α-1,5-阿拉伯糖苷酶酶解、8：多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶；图3中的A，图3中的B和图3中的C的横纵坐标均一致，横坐标为时间，纵坐标为响应值；
图4 为单糖高效液相色谱图，其中图4中的A为单糖标准品高效液相图，图4中的B为多糖1的单糖组成高效液相色谱图，图4中的C为多糖2的单糖组成高效液相色谱图；图4中的A，图4中的B和图4中的C的横纵坐标均一致，横坐标为时间，纵坐标为响应值；
图5为1H NMR谱图，其中图5中的A是多糖11H NMR谱图，图5中的B是多糖2 1H NMR谱图；图5中的A与图5中的B的横纵坐标一致，横坐标代表化学位移，纵坐标代表吸收峰强度；
图6为13C NMR谱图，其中图6中的A是多糖1的13C NMR谱图，图6中的B是多糖2的13CNMR谱图；图6中的A与图6中的B的横纵坐标一致，横坐标代表化学位移，纵坐标代表吸收峰强度；
图7为 1H/1H COSY谱图，其中图7中的A是多糖1的1H/1H COSY谱图，图7中的B是多糖2的1H/1H COSY谱图；图7中的A与图7中的B的横纵坐标一致，横坐标与纵坐标均代表化学位移；
图8为 1H/1H NOESY谱图，其中图8中的A是多糖1的1H/1H NOESY谱图，图8中的B是多糖2的1H/1H NOESY谱图；图8中的A与图8中的B的横纵坐标一致，横坐标与纵坐标均代表化学位移；
图9 为1H/13C HSQC谱图，其中图9中的A是多糖1的1H/13C HSQC谱图，图9中的B是多糖2的1H/13C HSQC谱图；图9中的A与图9中的B的横纵坐标一致，横坐标与纵坐标均代表化学位移；
图10 为1H/13C HMBC谱图，其中图10中的A是多糖1的1H/13C HMBC谱图，图10中的B是多糖2的1H/13C HMBC谱图；图10中的A与图10中的B的横纵坐标一致，横坐标与纵坐标均代表化学位移；
图11为多糖的主要化学结构图，其中图11中的A是多糖1的主要化学结构图，图11中的B是多糖2的主要化学结构图。
图12为香菇多糖结构示意图，红框标记的部分代表多糖的主链，蓝框标记的部分代表多糖的侧链。
具体实施方式
下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明所用的枇杷叶购买于杭州胡庆余堂国药号。
在本发明解析方法的框架中，柱层析分离后的多糖洗脱液采用苯酚硫酸法测定碳水化合物含量，绘制洗脱曲线；如图1所示，在该洗脱曲线上，任意选取n种洗脱液构建分段同源多糖组，分别命名为多糖1，多糖2…多糖n，进行分子量和均一性分析；根据分析结果保留均一性多糖，根据单糖组成，糖苷键和官能团判断多糖的相似性；基于同源多糖的相似性，比较解析每种多糖的NMR信号，获得完整的多糖结构。以下实施例以一次性解析两个多糖为例，具体阐述本发明的解析方法，一次性进行两个以上的多糖解析同样适用于本发明的解析方法。
实施例1： 枇杷叶多糖的分离提取
利用热水法提取枇杷叶粗多糖。称取一定量的不同枇杷叶，按照1∶20的比例加入蒸馏水，煮沸提取，提取1h，重复两次，获得粗多糖溶液。将提取液减压浓缩加入4倍体积无水乙醇，4 ℃过夜，离心干燥，得到粗多糖。热水提取法提取枇杷叶多糖后，采用Sevag法去除粗多糖中的蛋白，冷冻干燥获得粗多糖。称取200 mg粗多糖上样于DE-52纤维素层析柱中，采用0～1M NaCl进行梯度洗脱，苯酚硫酸法检测结果表明枇杷叶粗多糖主要集中在0.4M NaCl洗脱液中（图2 中的A）。将0.4 M NaCl洗脱得到的粗多糖采用葡聚糖凝胶色谱柱进一步分离纯化，获得多糖1和多糖2（图2中的 B）。
实施例2：多糖1和多糖2分子量比较
利用凝胶渗透色谱法测定多糖1和多糖2的分子量：首先取相对分子质量依次为12000Da、25000Da、50000Da、150000Da、 270000Da、410000Da的葡聚糖标准品，分别溶于ddH2O 配成1 mg/mL溶液，用凝胶渗透色谱测定出峰时间，TSKgel G4000PWXL色谱柱（Tosoh，日本）；洗脱液为0.1 mol/L硝酸钠溶液；上样量10 μL；柱温设置为30 ℃，以横坐标为log·Mw，纵坐标为出峰时间T，得到葡聚糖标准曲线：Log MW=-0.5976T+10.062（R2=0.996）。将精制多糖溶于ddH2O配成1 mg/mL溶液，凝胶渗透色谱测定其出峰时间（图3），多糖1和多糖2的出峰时间分别为8.533 min和9.761 min，代入标准曲线，计算得到多糖1和多糖2相对分子质量分别为91748Da和16935Da，多糖1的分子量小于多糖2。
实施例3：多糖1和多糖2单糖组成比较
单糖组成分析采用柱前衍生高效液相色谱法，单糖组成分析主要包括两个步骤：一是将多糖酸解，二是将酸解后的多糖进行衍生化。准确称取1 mg精制多糖，加入1 mL 3mol/L 三氟乙酸，100 ℃ 密闭反应2 h，然后30 ℃ 旋转蒸干，得到酸解产物，往酸解产物中依次加入0.25 mL ddH2O、0.25 mL氨水、0.25 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，70 ℃密闭反应1 h，冷却至室温，加入1 mL ddH2O，30 ℃过夜旋转蒸干，加入0.25 mL ddH2O和0.25 mL氯仿，12000 g 离心5 min，取上层水相，进行HPLC分析。HPLC条件：Water 2695-2998 液相色谱系统；Silgreen C18色谱柱；柱温25 ℃；流动相为乙腈（A相）、0.1 mol/L乙酸铵溶液（B相）；洗脱程序：0～50 min，19 % A；上样量2 μL；流速1 mL/min；检测波长245 nm。样品多糖的单糖组成分析首先需要对标准品包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖和阿拉伯糖8种单糖标准品进行定量检测，以摩尔浓度对应峰面积分别得到标准曲线，从而计算样品多糖的单糖组成比例。标准品以及多糖1和多糖2的单糖出峰顺序如图4所示，多糖1和多糖2中的单糖类型相似，但是单糖组成比例不同。多糖1的主要单糖是半乳糖醛酸和鼠李糖，分别占比40.71.%和38.98 %，且含有少量阿拉伯糖和半乳糖，属于鼠李半乳糖醛酸聚糖RG-I果胶的主链；多糖2主要单糖是阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖分别占比49.62 %、22.83 %和13.86 %，含有少量鼠李糖和半乳糖醛酸，属于鼠李半乳糖醛酸聚糖RG-I果胶的侧链。
实施例4：多糖1和多糖2糖苷键比较
多糖1和多糖2的糖苷键分析采用酶解法，选取酶液（α-1,5-阿拉伯糖内切酶（EC3.2.1.99）、β-1,4-半乳糖内切酶（EC 3.2.1.89）、多聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚内切糖（EC3.2.1.15））与糖液混合，金属浴50 ℃反应16 h。然后将酶解液90 ℃，加热30 min，使体系中的酶失活。冷却至室温后，12000 rpm 离心15 min，取上清液，采用凝胶渗透法检测分子量。酶解产物的相对分子量变化如图3中的C所示，多糖1和多糖2经过β-1,4-半乳糖苷酶、α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶和多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶酶解，相对分子量均减少，表明多糖1和多糖2均含有β-1,4-半乳糖、α-1,5-阿拉伯糖和α-1,4-半乳糖醛酸。根据酶解产物分子量变化量，多糖1经过β-1,4-半乳糖苷酶、α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶和多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶，相对分子量分别减少22483Da、58996Da和74471Da，分别占多糖1的24.35%，64.03%，80.82%，说明多糖1主要以α-1,4-半乳糖醛酸为主；多糖2经过β-1,4-半乳糖苷酶、α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶和多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶酶解产物分子量减少的量分别为4429Da、4936Da和7187Da，分别占多糖2的26.12%，29.11%，42.38%，说明多糖2中以半乳糖醛酸含量为主，并含有较大比例的以α-1,5-阿拉伯聚糖组成的侧链。多糖1和多糖2经过多聚-α-1,4-半乳糖醛酸酶酶解后的产物分子量均为各自三种酶解产物中最小，但是多糖1酶解后变化量80.82%远大于多糖2酶解后产物分子变化量42.38%，说明多糖1中的α-1,4-半乳糖醛酸糖苷键含量远大于多糖2。
实施例5：多糖1和多糖2 NMR信号比较
（1）对多糖1和多糖2进行氘代处理后，进行一维和一维和二维核磁共振检测，包括1H，13C，1H/1H COSY，1H/1H NOESY，1H/13C HSQC 和1H/13C HMBC。实验中采用WEFT脉冲序列压制水峰，丙酮（δ 30.89）作为内标，对碳谱化学位移进行校准
（2）多糖1和多糖2的1H谱中，可以反应出多糖2中具有更多信号峰，根据化学位移及耦合常数，从多糖2开始标峰。多糖21H-NMR图谱中（图5中的 B），端基氢区域出现12个信号峰，分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和R。根据多糖2中已标注的信号峰，多糖1信号峰包括有A、B、C、D、E、G、H、I、R（图5 中的A）
（3）多糖1中主要的残基为R和G，R1和G1的化学位移分别在5.15 ppm和4.90 ppm（图5 中的A），13C-NMR图谱（图6 中的A） 中有端基碳范围内出现两个峰，化学位移分别是100.98 ppm和100.12 ppm。从HSQC谱（图9 中的A）中可以看到，残基R和残基G的H1与C1在对应的异头H-C信号区表现出相关性，可知RH1/RC1和GH1/GC1分别为5.15/100.98 ppm和4.90/100.12 ppm。多糖2中的主要残基为A、B、C、D、E、F、H、I、J和K，AH1、BH1、CH1、DH1、EH1、FH1、HH1、IH1、JH1和KH1的化学位移分别5.14 ppm、5.10 ppm、5.07 ppm、5.04 ppm、4.98ppm、4.93 ppm、4.91 ppm、4.59 ppm、4.42 ppm和4.36 ppm（图5中的 B）。13C-NMR图谱中，端基碳范围内出现10个主要信号，从HSQC谱（图9中的 B）中可看到H1/C1关联信号，分别是5.15/100.68 ppm、5.14/109.07 ppm、5.10/109.06 ppm、5.07/109.53 ppm、5.04/109.82ppm、4.98/110.15 ppm、4.92/102.28 ppm、4.91/110.05 ppm、4.59/103.42 ppm、4.42/105.80 ppm，可依次归属于残基A、B、C、D、E、F、H、I、J和K。
（3）由于1H-NMR谱中δH4.5-3.0 范围内信号峰复杂，难以准确判断糖残基R和G中其它氢原子的化学位移，借助1H-1H COSY谱（图7中的 A）提供的单糖残基内相邻两个氢原子的偶合关系，对其它的H质子进行归属。以残基R为例，在1H-1H COSY谱中可获得5.15/3.99 ppm对角峰，RH1化学位移为5.15 ppm，推得RH1的相邻氢原子RH2的化学位移为3.99 ppm。依次类推，通过1H-1H COSY谱，可获得3.99/3.75 ppm、3.75/3.28 ppm、3.28/3.65和3.65/1.11ppm对角峰，得到残基R中的H3、H4、H5和H6化学位移依次为3.75 ppm、3.28 ppm、3.65 ppm和1.11 ppm。同理可得，残基G的H2-H5化学位移依次3.77 ppm、3.99 ppm、4.28 ppm和4.54ppm，无H6信号。残基R与残基G的氢原子信号已得到全部归属。
HSQC图谱（图9 中的A）能够提供相连碳氢之间的相关信号，可对氢谱和碳谱中的化学位移一一对应。以残基R为例，残基R中的H1和C1在对应的H-C信号区表现出相关性（5.15/100.98 ppm）。根据其它氢原子化学位移，在HSQC谱中获得相关的碳化学位移，H2/C2（3.99/78.79 ppm）、H3/C3（3.75/71.62 ppm）、H4/C4（3.28/74.45 ppm）、H5/C5（3.65/71.98ppm）和H6/C6（1.11/19.2 ppm）。同理可得，残基G中碳氢化学位移依次为H1/C1（4.90/100.12 ppm）、H2/C2（3.77/70.45 ppm）、H3/C3（3.99/72.83 ppm）、H4/C4（4.28/79.57 ppm）和H5/C5（4.54/74.07 ppm）。
所有的碳氢信号得到归属后，对残基R和残基G的连接方式和排列顺序作进一步分析。从1H/1H NOESY图谱（图8中的 A）中，得到残基RH1与残基GH4，残基GH1与残基RH2具有明显关联性，1H/13C HMBC 图谱（图10 中的A）中，残基RH1和残基GC4，残基GH4和残基RC1具有明显关联性。可得到残基RH1和残基GC4具有明显关联性。由此可知，残基R在C1和C2处有连接，残基G在C1和C4处有连接，结合多糖1单糖组成、酶解结果，以及参考文献中的信号归属（Zhao, J., Zhang, F., Liu, X., Ange, K. S., Zhang, A., Li, Q.,&Linhardt, R.J. (2017a). Isolation of a lectin binding rhamnogalacturonan-I containingpectic polysaccharide from pumpkin. Carbohydrate Polymers, 163, 330-336.）， 解析R对应为→2)-α-L-Rhap-(1→糖残基单元，G对应为1,4-α-L-GalpA糖残基单元。
表1. 多糖1 的1H和13C信号归属
同多糖1解析过程可得,由二维图谱1H/1H COSY（图7中的 B），HSQC（图9中的 B），1H/1H NOESY （图8 中的B），1H/13C HMBC（图10中的 B）推测得到，A、B、C、D和E分别归属于→2,3,5)-α-L-Araf-(1→、→2,5)-α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→和→5)-α-L-Araf-(1→（表2）。根据多糖2的单糖组成，单糖连接方式以及参考文献中的信号归属，推测弱信号峰的残基F、H、I、J、和K分别对应β-D-Galf-(1→、→4)-β-D-Galf-(1→、→4)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、和→4,6)-β-D-Galp-(1→（表3）。
表2. 残基A-E的1H和13C信号归属
表3. 残基F~K的1H和13C部分信号归属
（4）1H-NMR图谱中显示，多糖1中的残基信号峰，主要有A、B、C、D、E、G、H、I和R，多糖2中的残基包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和R。多糖1与多糖2有众多的重合残基，包括A、B、D、E、 G、H、I和R。两种多糖的信号峰强弱不尽相同，多糖1中主要的强信号峰R，G，是多糖2中的弱信号峰，因此可以根据多糖1的R G残基的解析结果辅助多糖2结构解析，以及文献中的信号归属（Zhao, X., Li, J., Liu, Y., Wu, D., Cai, P.,&Pan, Y. (2017b).Structural characterization and immunomodulatory activity of a water solublepolysaccharide isolated fromBotrychium ternatum. Carbohydrate Polymers, 171,136-142.；李建炫. 远志、骆驼刺中多糖的分离纯化与结构鉴定[D].广东药科大学,2021.DOI:10.27690/d.cnki.ggdyk.2020.000168.；杨菲菲. 白薇多糖的分离纯化，结构解析及其生物活性研究[D].上海中医药大学,2021.DOI:10.27320/d.cnki.gszyu.2019.000145.；Niu, Y., Yan, W., Lv, J., Yao, W.,&Yu, L. (2013).Characterization of a novel polysaccharide from tetraploidGynostemma pentaphyllummakino. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(20), 4882-4889.），因而可以得到多糖2主要的糖残基结构为：→2,3,5)-α-L-Araf-(1→、→2,5)-α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→，→5)-α-L-Araf-(1→，β-D-Galf-(1→、→4)-α-L-GalpA-(1→、→4)-β-D-Galf-(1→、→4)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→4,6)-β-D-Galp-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→；而多糖1中的弱信号峰包括A，B，D，E，F，H和I可以由多糖2的结构信息进行补充，多糖1主要的糖残基结构为：→2,3,5)-α-L-Araf-(1→、→2,5)-α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、β-D-Galf-(1→、→4)-α-L-GalpA-(1→、→4)-β-D-Galf-(1→、→4)-β-D-Manp-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→。
（5）基于EJp1-1和EJp2-1的单糖组成、连接方式和核磁共振数据彼此互为参考，推测出多糖1和多糖2的主要结构如图11所示，多糖1和多糖2结构相似，但是多糖1以主链为主，而多糖2以侧链为主。两个多糖的主链均为鼠李半乳糖醛酸聚糖，多糖1的结构单位重复数值m大于多糖2的主链重复单元数n。多糖1侧链是以α-1,5-连接的阿拉伯聚糖和β-1,4连接的半乳聚糖为主，连接于主链鼠李糖残基的4位；多糖2的侧链是以α-1,5-连接的阿拉伯聚糖和β-1,4连接的甘露半乳聚糖为主，连接于主链鼠李糖的4位。
综上，本发明提供一种完整的多糖结构解析方式，首次将将现有技术中解析不准确或者舍弃的弱信号峰有效利用得到了完整的多糖结构，通过分离并构建分段同源多糖组，基于同源多糖比较的方式，准确完整的解析出弱信号峰所对应的糖残基及糖苷键。以两个多糖解析为例，如果对多糖1和多糖2进行独立的结构解析，多糖2氢谱中的RH1, GH1,HH1的信号弱，峰面积绝对值小于1000，现有技术单独依靠每个弱信号无法进行结构解析，只能获得多糖2中的1,2,3,5-α-L-Araf，1,2,5-α-L-Araf，1-α-L-Araf，1-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf的主链结构，而无法获得1,2-α-L-Rhap，1,4-α-L-GalpA等侧链结构。在本发明中，通过对多糖1和多糖2的相互辅助解析以后，多糖1的侧链结构被多糖2补充，而多糖2的主链结构也由多糖1进行补充，最后得到更为完整的多糖1和多糖2结构：多糖1和多糖2结构相似，但是多糖1以主链为主，多糖2以侧链为主。多糖1和多糖2的主链均为鼠李半乳糖醛酸聚糖，多糖1的结构单位重复数值m大于多糖2的主链重复单元数n，多糖1侧链是以α-1,5-连接的阿拉伯聚糖和β-1,4连接的半乳聚糖为主，连接于主链鼠李糖残基的4位；多糖2的侧链是以α-1,5-连接的阿拉伯聚糖和β-1,4连接的甘露半乳聚糖为主，连接于主链鼠李糖的4位。
上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的解析方法适用于所有天然产物多糖，多糖分子量大，是高度聚合的物质，因此聚合度不同，使多糖成为不同程度聚合的物质的混合物，而层析柱或色谱柱洗脱对于具有不同的电荷数或者是不同分子量的多糖进行分离，如通过NaCl洗脱、苯酚硫酸法检测，就能获得粗多糖的洗脱曲线。通过选择粗多糖上的任意的两个或者是多个同源多糖，构建分段同源多糖组，对所述分段同源多糖组中的每种多糖进行单糖组成，分子量，官能团，糖苷键分析，红外光谱分析等，通过对其单糖组成，分子量，糖苷键，官能团等的分析，明确选择的同源多糖的具有结构相似性。因此根据选择的同源多糖具有结构相似性的特点，对同源多糖进行核磁解析。通过明确图谱中同源多糖具有出峰信号上的相似性，最终同源多糖中强信号峰辅助解析另一多糖中相同的弱信号峰，最终使得同源多糖的结构均被更为完整和准确的解析。此外，天然产物多糖都具有包含多糖、蛋白质、色素等的共性，在天然多糖中，提取粗多糖是获取多糖的第一步，由于天然产物中，除了大分子碳水化合物多糖以外，蛋白质，核酸，脂质等都是其中主要的组成成分，因此纯化粗多糖是获得纯净多糖的重要步骤。因此本发明适用于所有的天然产物多糖，其中蛋白质去除或者是色素去除等，以及柱色谱的选择均按照实际情况合理选择，最后多糖结构解析的完整度，取决于根据洗脱曲线选择的多糖的互补性高低，通过多次重复洗脱曲线同源多糖的选择，构建分段同源多糖组，可以提高多糖解析的完整度和精确度。
此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）分离出同源多糖，绘制洗脱曲线；所述同源多糖是指绘制的同一条洗脱曲线上的所有多糖；
（2）从所述洗脱曲线上选出任意n种多糖，其中n为正整数且n≥2，构建分段同源多糖组；
（3）分别测定所述分段同源多糖组中每种多糖的纯度和分子量；
（4）分别对每种多糖的纯度进行均一性分析，判断分段同源多糖组的均一性；若为均一性多糖，则进行步骤（5），若不是均一性多糖，则进行步骤（2）；
（5）多糖结构相似性判断，利用核磁解析得到完整的多糖结构：
（5-1）：对所述分段同源多糖组中的每种多糖进行结构分析，测定其单糖组成、糖苷键和官能团；
（5-2）：根据测得的单糖组成、糖苷键和官能团判断所述分段同源多糖组是否结构相似，若结构不相似，则进行步骤（2）；若结构相似，则对所述分段同源多糖组进行核磁解析，得到所述分段同源多糖组中所有多糖的结构解析结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述核磁解析包括将具有相似结构的同源多糖组内的多糖进行核磁分析，利用核磁信号的相似性，互相辅助解析完整的多糖结构，所述互相辅助解析的步骤如下：
1）根据分段同源多糖组中的每种多糖的一维图谱，包括碳谱和氢谱，相互对比分析同源多糖的相似性；
2）分别分析所述分段同源多糖组中的每种多糖核磁图谱中的强信号峰，解析强信号峰的糖残基；
3）根据同源多糖的相似性，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，并结合分子量，单糖组合和官能团信息，解析得到完整的多糖结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）分离出同源多糖之前，还包括纯化粗多糖的步骤，所述纯化粗多糖包括去除色素和去除蛋白质的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离出同源多糖的步骤为采用NaCl全浓度或多浓度洗脱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述绘制洗脱曲线的方法为利用苯酚硫酸法测定碳水化合物含量，从而绘制洗脱曲线。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述构建分段同源多糖组可以任意选取多段洗脱曲线范围内的n种多糖，透析，冻干样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述纯度和分子量采用凝胶渗透色谱测定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述糖苷键的分析采用酶解法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶解法的条件为将1～2 mg/ml的同源多糖糖液分别与α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶，β-1,4-半乳聚糖内切酶，α-1,4-半乳聚糖内切酶混合，37～40 ℃反应16～24 h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述核磁解析的步骤具体包括：1）核磁共振波谱（NMR）分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的结构信息；2）分析比较所述分段同源多糖组中的每种多糖的1H NMR图谱以及13C NMR图谱，确定所述分段同源多糖组中的每种多糖重合的信号峰，根据每种多糖之间的比较，确定重合的信号峰对应的糖残基；3）分别分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰，解析强信号峰的糖残基；根据同源多糖的相似性，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，解析得到完整的多糖结构；4）根据所述分段同源多糖组中的每种多糖的分子量，单糖组成，糖苷键，官能团、糖残基以及糖苷键连接顺序信息，判断多糖结构。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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