CN104316630A - 苦碟子注射液糖类成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药注射液的鉴别方法，特别是涉及一种利用GC-MS测定苦碟子注射液糖类成分的测定方法。其步骤如下：（a）样品的制备，样品前处理方法。（b）标准品的制备，醛糖类成分衍生化方法，酮糖类成分衍生化方法。(c)色谱条件气质分析仪，GC-MS-QP2010SE毛细管柱。(d)测定分别精密吸取标准品与样品，注入气相色谱仪，用气相色谱法测定，制定苦碟子注射液糖类成分指纹图谱。本方法采用衍生化法使苦碟子中难以检测的糖类成分更加准确的检测出来。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药注射液的鉴别方法，特别是涉及一种利用GC-MS测定苦碟子注射液糖类成分的测定方法。
背景技术
苦碟子为菊科苦荬菜属多年生草本植物。近年来随着中药越来越受重视，苦碟子的化学成分、药理活性和临床研究应用等方面的研究都取得了重大进展。苦碟子注射液为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体，临床上用于冠心病、心绞痛、脑血栓、脑梗塞等。
苦碟子的化学成分比较复杂，据文献报道其成分主要有萜类、黄酮类和香豆素类、甾醇等。其中主要活性成分，由于受产地、气候和生态环境等因素的影响，不同产地苦碟子所制成的注射液所含成分诧异很大。研究报道，从各种动植物中提取的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗病毒、抗辐射、降血脂、降血糖、美容等广泛的作用。
苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。
处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。
制法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3－4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药4g，置-5℃以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1－0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0－7.5，滤过，灌封，灭菌即得。性状：本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。
含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C10H12N5O4）计，不得少于0.025mg。
功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。
用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。
规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。
据文献报道，苦碟子中含有糖类成分，但是在现有的文献和报道中却并没有有关此物质的质量检测方法。本发明就提供了一种苦碟子注射液中糖类物质的含量测定的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的现状，提供一种苦碟子注射液中糖类成分的含量测定方法，该方法为苦碟子注射中糖类成分的检测提供了样品前处理方法以及糖类成分GC-MS的检测方法，通过该方法的分析，不仅可以明确苦碟子注射液中糖类成分的组成，还能对其含量进行测定，该方法的建立可为苦碟子注射液质量控制提供依据。
本发明的技术解决方案是：苦碟子注射液糖类成分的含量测定方法，其步骤如下：
（a）样品的制备
样品前处理方法：取苦碟子注射液过HyperSep C18柱后，置于具塞圆底烧瓶中，1M HCl调pH为1，减压抽真空后70℃水浴3h，冷却后加入10% NaOH 调pH至中性，精密量取每5ml于每支离心管中，冷冻干燥备用。而苦碟子注射液中富含有黄酮苷和核苷类成分，为避免其中糖配基的干扰，建立了苦碟子注射液进行前处理方法，除去其中的苷类成分，使该方法能够专一性的分析苦碟子注射液中的糖类成分。本方法中样品前处理步骤简单易于操作，所得样品的重复性良好，适用于成批药物的大量检测。
称取上述干燥物置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物。
称取冷冻干燥物2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3ml六甲基二硅胺，在90℃下继续反应30min 加入0.1ml三甲基氯硅烷，10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析。
（b）标准品的制备
醛糖类成分衍生化方法：分别称取市面上购买的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物。
酮糖类成分衍生化方法：分别称取果糖标准品2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3ml六甲基二硅胺，在90℃下继续反应30min 加入0.1ml三甲基氯硅烷，10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析。
(c)色谱条件
气质分析仪：GC-MS-QP2010SE毛细管柱：Rtx-5 MS 0.25 mm×30 m，0.25 μm；载气：高纯氦气He，99.999%；进样口温度：280℃；柱流速：1.0mv/min；进样量：1μl；分流比：30:1；气化室温度：280℃；柱前压73.0kPa气-质接口温度：270℃；离子源：EI源；离子源温度200℃；电子能量：70ev；溶剂延迟时间5min，质量扫描范围45－550amu。
(d)测定
分别精密吸取标准品与样品，注入气相色谱仪，用气相色谱法测定，制定苦碟子注射液糖类成分指纹图谱。
本发明优点是： 1、整体性、宏观性和模糊性。本发明克服了使用GC-MS测定苦碟子中糖类成分难以检测的缺点。在以往对苦碟子注射液的研究中，对其核苷类、黄酮类、以及有机酸类成分研究较多，而这些类型成分含量只占苦碟子注射液干重的60%，为了更加全面的分析苦碟子注射液中的化学成分，进一步提升苦碟子注射液的质量标准，对其中含量高于干重20%的糖类成分进行了分析。而苦碟子注射液中富含有黄酮苷和核苷类成分，为避免其中糖配基的干扰，建立了苦碟子注射液进行前处理方法，除去其中的苷类成分，使该方法能够专一性的分析苦碟子注射液中的糖类成分。2、本方法采用衍生化法使苦碟子中难以检测的糖类成分更加准确的检测出来。3、本方法中样品前处理步骤简单易于操作，所得样品的重复性良好，适用于成批药物的大量检测。衍生化操作简便、适用，衍生化产物稳定性良好；GC-MS检测参数的设置能够保证该方法精密度，适用于苦碟子注射液中糖类成分的测定。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1是苦碟子注射液醛糖类成分的GC-MS指纹图谱及色谱峰指认。
图2是苦碟子注射液醛糖类成分GC-MS指纹图谱空白对照。
图3是苦碟子注射液酮糖类成分的GC-MS指纹图谱及色谱峰指认。
图4是苦碟子注射液酮糖类成分GC-MS指纹图谱空白对照。
图5是10批苦碟子注射剂醛糖类成分GC-MS指纹图谱。
具体实施方式
苦碟子注射液糖类成分的含量测定方法：
1、仪器与试药
1.1仪器
GC-MS-QP2010SE（SHIMADZU公司，日本）。
HH-S8数显恒温水浴锅（金坊市盛蓝仪器制造有限公司）。
SHZ-95B型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
冷冻干燥机（FD5-2.5，日本）。
BT125D型分析天平（德国Sartorius公司）。
高速离心机（TG16-WS 长沙湘仪离心机仪器有限公司）。
1.2材料
D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所 110833-200904）。
D-阿洛糖对照品（天津一方科技有限公司 101205003）。
D-半乳糖对照品（中国药品生物检定所 100226-200404）。
D-甘露糖对照品（中国药品生物制品检定所 140651-200602）。
D-阿拉伯糖对照品（天津一方科技有限公司）。
肌醇对照品（天津市光复精细化工研究所）。
D-果糖对照品（天津市元立化工有限公司）。
吡啶（天津市光复精细化工研究所）。
乙酸酐（天津市江天化工有限公司）。
盐酸羟胺（天津市光复科技发展有限公司）。
六甲基二硅胺（天津市光复精细化工研究所）。
三甲基氯硅烷（成都市科龙化工试剂厂）。
NaOH(分析纯,天津化学试剂批发公司)。
HCl(分析纯,天津化学试剂批发公司)。
pH试纸（天津市鹏达化学试剂有限公司）。
HyperSep C18固相萃取小柱（Thermo 公司）。
苦碟子注射液（吉林通化华夏药业有限公司，批号：110601，111011，111105，111218，120109，120209，120312，120438，120532，120625）。
2、方法与结果
指纹图谱测定
（a）样品的制备：
样品前处理方法：取苦碟子注射液过HyperSep C18柱（Thermo 公司）后，置于具塞圆底烧瓶中，1M HCl调pH约为1，减压抽真空后70℃水浴3h，冷却后加入10% NaOH 调pH至中性，精密量取每5ml于每支离心管中，冷冻干燥备用。用C18柱除去注射液中黄酮苷等苷类成分，避免糖配基类对糖类成分的干扰；HCl水解多糖成为单糖，便于分析多糖的单糖组成；取适量冻干以便于精密量取供试品溶液保证取样的精密度，便于样品储存不易变质，利于后续衍生化反应的进行。
称取上述干燥物置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物。
称取冷冻干燥物2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3mlHMDS（六甲基二硅胺），在90℃下继续反应30min 加入0.1mlTMCS（三甲基氯硅烷），10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析。
（b）标准品的制备
醛糖类成分衍生化方法：分别称取市面上购买的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物。
酮糖类成分衍生化方法：分别称取果糖标准品2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3mlHMDS（六甲基二硅胺），在90℃下继续反应30min 加入0.1mlTMCS（三甲基氯硅烷），10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析。
为增强质谱响应值，更加可靠的分析苦碟子注射液中糖类成分的含量，本方法选用衍生化法增强单糖类成分的质谱相应。单糖分为醛糖和酮糖，由于其结构的差异，在衍生化过程中对衍生化试剂的反应有所差异，醛糖所含种类较多，酮糖主要为果糖，因此在检测过程中分别对苦碟子注射液中的醛糖和酮糖进行反应，分别进行GC-MS分析及含量测定，保证对糖类成分分析的完整性。
(c)色谱条件
气质分析仪：GC-MS-QP2010SE（SHIMADZU）毛细管柱：Rtx-5 MS 0.25 mm×30 m，0.25 μm （SHIMADZU）；载气：高纯He（99.999%）；进样口温度：280℃；柱流速：1.0mv/min；进样量：1μl；分流比：30:1；气化室温度：280℃；柱前压73.0kPa气-质接口温度：270℃；离子源：EI源；离子源温度200℃；电子能量：70ev；溶剂延迟时间5min，质量扫描范围45－550amu。GC-MS条件的设置适用于多种单糖类成分衍生物的分析，能够全面反应苦碟子注射液中糖类成分的组成。
(d)测定
分别精密吸取标准品与样品，注入气相色谱仪，用气相色谱法测定，制定苦碟子注射液糖类成分指纹图谱。见图1－4。图1中：A表示对照品醛糖的色谱峰图谱， B表示样品中醛糖成分色谱峰谱图。图3中：A表示对照品果糖的色谱峰谱图，B表示样品中果糖成分色谱峰谱图。
对10批苦碟子注射液（110601，111011，111105，111218，120109 ，120209，120312，120438，120532，120625）进行分析，得到指纹图谱（参见图5），以葡萄糖为参照各个共有峰相对保留时间和相对峰面积如表2和3所示，其相似度结果如表4所示。
表 2 10批苦碟子注射液醛糖类成分GC-MS指纹图谱共有峰相对保留时间(以葡萄糖的色谱峰作为参照)
表3 10批苦碟子注射液醛糖类成分GC-MS指纹图谱共有峰相对峰面积(以葡萄糖的色谱峰作为参照)
表4 10批苦碟子注射液醛糖类成分GC-MS指纹图谱相似度
结果表明，10批苦碟子注射液醛糖类成分共有峰相对保留时间一致，而相对峰面积存在差异，10批注射液醛糖类成分指纹图谱相似度均达到0.95以上。
表5苦碟子注射液糖类成分GC-MS含量测定结果
Claims (1)
1.一种苦碟子注射液糖类成分的含量测定方法，其特征在于步骤如下：
（a）样品的制备
样品前处理方法：取苦碟子注射液过HyperSep C18柱后，置于具塞圆底烧瓶中，1M HCl调pH为1，减压抽真空后70℃水浴3h，冷却后加入10% NaOH 调pH至中性，精密量取每5ml于每支离心管中，冷冻干燥备用；
称取上述干燥物置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物；
称取冷冻干燥物2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3ml六甲基二硅胺，在90℃下继续反应30min 加入0.1ml三甲基氯硅烷，10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析；
（b）标准品的制备
醛糖类成分衍生化方法：分别称取市面上购买的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品置于10 ml 具塞试管中，加入100 mg 盐酸羟胺和500μl吡啶，在90℃水浴中振荡反应30min，取出冷至室温，加入500μl乙酸酐，于90℃水浴中继续进行乙酰化反应30min，冷却后即得衍生物；
酮糖类成分衍生化方法：分别称取果糖标准品2mg定溶于10ml容量瓶中，然后稀释到0.04mg/ml和0.5mg/ml，精密移取1ml，冷冻干燥，加入0.6ml吡啶、100mg盐酸羟胺，混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min，取出后冷却至室温，加入0.3ml六甲基二硅胺，在90℃下继续反应30min 加入0.1ml三甲基氯硅烷，10000r/min离心15min，取上清液直接进样分析；
(c)色谱条件
气质分析仪：GC-MS-QP2010SE毛细管柱：Rtx-5 MS 0.25 mm×30 m，0.25 μm；载气：高纯氦气He，99.999%；进样口温度：280℃；柱流速：1.0mv/min；进样量：1μl；分流比：30:1；气化室温度：280℃；柱前压73.0kPa气-质接口温度：270℃；离子源：EI源；离子源温度200℃；电子能量：70ev；溶剂延迟时间5min，质量扫描范围45－550amu；
(d)测定
分别精密吸取标准品与样品，注入气相色谱仪，用气相色谱法测定，制定苦碟子注射液糖类成分指纹图谱。
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Granted publication date: 20160302 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA HUAXIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023220000098 |
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Denomination of invention: Method for determining the content of carbohydrate components in Kudiezi injection Granted publication date: 20160302 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA HUAXIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2024220000076 |
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Granted publication date: 20160302 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA HUAXIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2024220000076 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for determining the content of carbohydrate components in Kudiezi injection Granted publication date: 20160302 Pledgee: Tonghua Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: TONGHUA HUAXIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2024220000083 |