CN111458447A - 一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法。包括有以下步骤：(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立；(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究；(3)枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立；(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量。本发明具有将枸杞的指纹图谱与其抗疲劳及提高免疫进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗疲劳及提高免疫活性，从而用于判断枸杞质量优劣的有益效果。

Description

一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种枸杞质量检测方法，特别是一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法。

背景技术

枸杞，是茄科、枸杞属植物。枸杞是商品枸杞子、植物宁夏枸杞、中华枸杞等枸杞属物种的统称。人们日常食用和药用的枸杞子多为宁夏枸杞的果实“枸杞子”，且宁夏枸杞是唯一载入《2010年版中国药典》的品种。药理作用：对免疫功能有影响作用；性味：枸杞子：甘，平。枸杞叶：苦、甘；性凉；功能：枸杞子：养肝，滋肾，润肺。枸杞叶：补虚益精，清热明目。同时,现有针对枸杞质量检测众多,但这些质量标准大多仅着眼于枸杞中枸杞多糖、甜菜碱、枸杞色素等活性成分的定量检测。事实上,中药为多组分复杂体系,其疗效的发挥为多成分、多靶点、多途径协同作用的结果,化学成分的简单定量难以全面评价中药质量优劣。

中药谱效学是在中医药理论现代研究的基础上,以中药指纹图谱为基础,以药效研究为主要内容,应用生物信息学方法建立中药指纹图谱与中药质量疗效内在关系的一门学科。目前,针对枸杞谱效关系的研究较少,而基于枸杞谱效关系而制定的质量标准才更能全面说明枸杞品质。故而,目前尚缺乏对枸杞药材优劣性的有效科学的质量评估方法,尤其是检测枸杞的优劣性的方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法。本发明具有将枸杞的指纹图谱与其抗疲劳及提高免疫进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗疲劳及提高免疫活性，从而用于判断枸杞质量优劣的特点。

本发明的技术方案：一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法，包括有以下步骤：

(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立：

(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究：

(3)枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立：

(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(1)中，枸杞药材HPLC指纹图谱建立包括以下步骤：

对照品溶液的制备为：分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸与容量瓶中，摇匀，取上清液置离心管中，分别加入1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液、氢氧化钠溶液，充分摇匀，水浴反应，冷却至室温，加盐酸溶液，加入三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复3-5次，离心，收集上清液，过滤膜，即得；

供试品溶液的制备为：精密称取枸杞于锥形瓶中，精密量取蒸馏水，称重，回流提取，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液置离心管中，分别加入1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液、氢氧化钠溶液，充分摇匀，水浴反应，冷却至室温，加盐酸溶液，加入三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复3-5次，离心，收集上清液，过滤膜，即得；

枸杞药材HPLC指纹图谱建立中色谱条件为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(A)-乙腈(B)；其中乙腈(B)占比为5％-95％，进样量5-15μL，体积流量0.5-1.5mL/min；柱温28-32℃；检测波长250nm。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述对照品溶液的制备为：分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸适量与10mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得；

所述供试品溶液的制备为：精密称取枸杞0.5g于锥形瓶中，精密量取蒸馏水20mL，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(1)中，枸杞药材HPLC指纹图谱建立中色谱条件为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脱梯度0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B；进样量10μL，体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长250nm。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(2)中，枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究：枸杞的抗疲劳试验研究对BUN、LDH、LA及肝糖原的影响，枸杞的免疫提高试验研究对细胞因子及脏器比、迟发型变态反应、血清溶血素的影响。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(3)中，枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立：采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把枸杞各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作为比较数列，选择药效指标为参考数列，记为Y(k),k＝1,2,3,...,m，选择特征峰的峰面积为比较数列，记为Xi(k)，i＝1,2,3,...,n；

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

PLSR分析枸杞抗疲劳及免疫提高的谱效关系：

以枸杞的指纹图谱中各共有峰的峰面积为X，以枸杞的抗疲劳总药效及免疫提高总药效相加成综合药效为Y，采用软件SIMCA 14.1进行偏最小二乘回归法谱效相关性分析；计算出各X对应Y的回归系数，其中回归系数代表各X对Y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

PLSR回归方程的建立：

Y＝61.5423-0.0045X₁+0.0819X₂+0.0205X₃+0.0116X₄+0.0813X₅+0.0812X₆+0.0701X₇+0.0213X₈+0.0052X₉-0.1030X₁₀-0.1148X₁₁-0.0197X₁₂+0.0154X₁₃-0.0380X₁₄+0.0505X₁₅+-0.0318X₁₆+0.0535X₁₇-0.0842X₁₈-0.0104X₁₉-0.0852X₂₀-0.0476X₂₁。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：结合枸杞抗疲劳总药效及免疫提高总药效的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果，选择灰色关联度分析结果中关联度大于0.7，且偏最小二乘法分析结果中对综合药效呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定枸杞质量评价方法。

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(A)-乙腈(B)，其中乙腈(B)占比为5％-95％，进样量5-15μL，体积流量0.5-1.5mL/min；柱温28-32℃；检测波长250nm，采用高效液相色谱仪检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于74-76％

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm，采用高效液相色谱仪检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于75％

前述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法中，所述特征峰是以D-葡萄糖醛酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17号特征峰的相对保留时间分别为0.114、0.123、0.179、0.21、0.222、0.241、0.275、0.549、0.869、0.965、1。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以枸杞指纹图谱为基础，以枸杞枸杞抗疲劳及提高免疫的药效为主要内容，结合枸杞抗疲劳总药效及免疫提高总药效的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果分析枸杞的谱效关系，并由此建立科学、完善的枸杞质量标准。本发明具有方便简洁、客观性强、重现性强等优点，使枸杞的质量控制更科学完善，建立与药效明显关联并具体量化的枸杞质量评估方法。

发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究

实验例。基于谱效关系的枸杞质量检测方法：

第一节枸杞药材HPLC指纹图谱研究

1仪器设备与试验材料

1.1仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；

1.2材料

阿拉伯糖(中国药品生物制品鉴定所，批号：1506-200202)，盐酸氨葡萄糖(乐美天医药/德思特生物，批号：DST190625)，D-葡萄糖醛酸(中国食品药品检定研究院，批号：140648-201804)，鼠李糖(中国食品药品检定研究院，批号：111683-201502)，D-甘露糖(中国食品药品检定研究院，批号：140651-201805)，D-木糖(中国食品药品检定研究院，批号：111508-201605)，三氯甲烷(上海申博化工有限公司，批号：1809101)，1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮(简称“PMP”，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160317)；10批枸杞样品来源信息见表1，经贵州中医药大学生药学教研室孙庆文教授鉴定为茄科植物枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实。

表1枸杞药材来源

2试验方法

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备

分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸适量与10mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液(PMP甲醇溶液)240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.1.2供试品溶液的制备

精密称取枸杞0.5g于锥形瓶中，精密量取蒸馏水20mL，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液(PMP甲醇溶液)240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2色谱条件

采用ZORBAX SB-Aq色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脱梯度(0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B)；进样量10μL，体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长250nm。

2.3方法学考察

2.3.1精密度考察

精密吸取同一份枸杞药材(S8)供试品溶液10μL，连续进样6次，以D-葡萄糖醛酸为参照峰，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.00％～0.16％之间和0.00％～0.09％之间，表明仪器精密度良好。

2.3.2重复性考察

精密称取枸杞药材(S8)粉末6份，按“2.1.2”项下方法供试品溶液，分别进样10μL，以D-葡萄糖醛酸为参照峰，测得供试品溶液各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.00％～0.09％之间和0.00％～0.14％之间，表明该方法重复性良好。

2.3.3稳定性考察

精密吸取同一份枸杞药材(S8)供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20、24h进样10μL，以D-葡萄糖醛酸为参照峰，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.00％～0.17％之间和0.00％～0.16％之间。表明供试品在24h内稳定。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

分别取不同来源的枸杞药材(S1～S10)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，比较10批枸杞的色谱图，确定21个共有峰。通过对照品比对确定其中11号峰为盐酸氨基葡萄糖，12号峰为甘露糖，14号峰为鼠李糖，17号峰为D-葡萄糖醛酸，18号峰为阿拉伯糖/木糖。由于D-葡萄糖醛酸在个批次中均有出现，分离度良好且峰面积较大，故选择D-葡萄糖醛酸作为参照峰(S)。指纹图谱匹配、共有峰模式、样品与对照品叠加图及混合对照品图谱见图1-3。10批枸杞样品主要共有峰的相对保留时间见表2；10批枸杞样品主要共有峰的相对峰面积见表3：

表2 10批枸杞样品主要共有峰的相对保留时间

表3 10批枸杞样品主要共有峰的相对峰面积

2.5相似度评价

将10批枸杞样品指纹图谱AIA数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件进行相似度分析，结果表明，各批样品相似度在0.722～1.000，表明各批次枸杞质量基本稳定，个别相似度较低的批次，可能与季节、栽培方式、采收加工等有关。十批枸杞的相似度见表4。

表4十批枸杞的相似度

2.6不同产地枸杞药材HPLC指纹图谱聚类分析

将10个产地的枸杞HPLC色谱图样品的21个特征峰相对峰面积导入SPSS软件，采用类内均锁链法(Average Linkage)，以欧式距离平方(Cosine)法为度量标准，建立样品间特征峰相似性聚类，结果如图所示。10个产地的金枸杞可以分为六大类，S1、S2、S3、S7、S9样品为一类，S4为一类，S5为一类，S6为一类，S8为一类，S10为一类，此结果与程度相似度一致。结果见图4。

第二节枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究

1仪器设备与实验材料

1.1仪器

酶标仪(型号：SpectraMAX Plus384，美谷分子仪器有限公司生产)；优普超纯水制造系统(型号：UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司生产)；电子恒温水浴锅(型号：DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司生产)；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(型号：SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂生产)；

1.2药品与试剂

Mouse IFN-αELISA KIT(货号：ZC-37863，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse IFN-γELISA KIT(货号：ZC-37905，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse IgA ELISA KIT(货号：ZC-38494，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse IgG ELISA KIT(货号：ZC-38497，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；MouseIL-2 ELISAKIT(货号：ZC-37976，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse IL-6 ELISA KIT(货号：ZC-37988，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse TNF-αELISA KIT(货号：ZC-39024，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse BUN ELISA KIT(货号：ZC-38534，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse LDH ELISA KIT(货号：ZC-38621，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse LA ELISA KIT(货号：ZC-38618，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；Mouse Glouse ELISA KIT(货号：ZC-38154，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)；移液枪(规格：1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司生产)；枪头(规格，1000μL、200μL、20μL，美国Axygen公司生产)；EP管(规格：1.5mL、0.2mL、100μL，美国Axygen公司生产)。

1.3试验动物

SPF级KM小鼠，雌性，体重20±2g，订购于长沙市天勤生物技术有限公司，使用许可证号为SCXK(湘)2014-0011。

1.4动物试验供试药液的制备

称取枸杞适量(9.6mg/g)，10倍量的水回流提取三次，每次2h，合并滤液，浓缩，即得浓度为480mg/mL的药液，备用。

2方法

2.1抗疲劳试验研究

2.1.1游泳时间

取KM小鼠156只，随机分为13组，每组12只，即空白对照组(生理盐水)、中药阳性组(黄芪多糖80mg/g)、西药阳性组(盐酸左旋咪唑80mg/g)、十批枸杞提取液治疗组。灌胃给药每日1次，每次小鼠0.2mL/10g，连续30天。末次给药30min以后，将小鼠放置游泳箱中，记录自游泳开始至小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面作为小鼠力竭的判断标准，将此时间记做小鼠力竭游泳时间。待小鼠力竭后立即取出，摘眼球取血后取出小鼠的肝脏，将取出的血液放置于放有冰块的密闭箱内静置以使血液凝固，以3000r/min离心10min，分离得到各组小鼠血清样本，置于-20℃冰箱保存待测。

2.1.2小鼠BUN、LDH、LA及肝糖原(Glouse)水平测定

2.1.2.1实验原理

将目标抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的目标连接于固相载体上的抗体结合，然后加入微生物化的目标抗体，将未结合的生物素抗体洗净后，加入HRP标记和亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB(四甲基联苯胺)底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

2.1.2.2实验步骤

(1)复温：将所有试剂平衡至室温。

(2)加样：空白孔，空白对照孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于凋零；标准品孔，加入配好的标准品50μL，然后加入辣根过氧化物酶100μL；待测样品孔，加入样本50μL，然后辣根过氧化物酶100μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60min。

(3)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1min后弃去，如此重复5次，拍干。

(5)显色：每孔先加入底物液A50μL，再加入底物液B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

(6)终止：每孔加终止液50μL，终止反应。

(7)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

2.1.2.3标准曲线的制备

标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的线性回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2.1.3实验结果与结论

与空白对照组相比，各枸杞组能够延长小鼠的游泳耗竭时间，差异具统计学意义(P＜0.01)。实验结果表明，各枸杞组均可延长小鼠游泳时间，有明显的抗运动耐力下降的作用。由表5可知，阳性对照组与各枸杞水提物组的尿素氮及乳酸均明显低于空白对照组，说明枸杞可增强小鼠机体的负荷的适应能力。肝糖原与乳酸脱氢酶含量显著高于空白对照组。对于尿素氮，与空白对照组相比，各枸杞水提物均具有极显著性差异(P＜0.01)；对于乳酸脱氢酶，青海西宁组与空白对照组具有显著性差异(P＜0.05)，其余各给药组与空白对照组均具有极显著性差异(P＜0.01)；对于乳酸，各组枸杞水提物组与空白对照组均具有极显著性差异(P＜0.01)；对于肝糖原，中药阳性组与空白对照组具有显著性差异(P＜0.05)，其余各给药组与空白对照组均具有极显著性差异(P＜0.01)。试验结果说明，枸杞能明显延迟小鼠力竭状态的出现，各枸杞组均能显著降低因运动疲劳产生的BUN、LA在机体的蓄积，且提高小鼠机体内肝糖原、LDH的含量，提高运动能力以延长小鼠游泳耗竭时间。枸杞对小鼠抗疲劳的影响(n＝10，

)见表5。

表5枸杞对小鼠抗疲劳的影响(n＝10，

)

注：空白对照组相比^#P＜0.05，^##P＜0.01。

2.1.4讨论

运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，游泳时间的长短可以反映动物的疲劳程度，疲劳产生的重要原因是能源物质的消耗和代谢物质的积累^[26]。常用的疲劳评价方法主要有两个：运动耐力实验和生化指标检测。在反应疲劳的生化指标中，尿素(BUN)、乳酸(LA)、肝糖原(GL)、乳酸脱氢酶(LDH)等生化指标的改变具有代表性，也是检测疲劳最常用的指标。BUN作为蛋白质和氨基酸的代谢产物，是评定机体对运动适应能力的重要指标之一，当机体长时间活动不能通过糖和脂肪分解代谢得到足够的能量时，机体蛋白质和氨基酸分解代谢随之增强，血清BUN含量随运动负荷的增加而增加。乳酸脱氢酶(LDH)通常存在于肌细胞中并释放入血液中，LDH氧化释放乳酸并改变pH值，导致肌肉损伤。因此，LDH可以作为检测疲劳的指标。LA是碳水化合物在厌氧条件下糖酵解的产物，持续运动会导致过量LA的生成和积累，诱导身体产生疲劳。LA的积累会导致血液pH值降低，危害各种器官进而导致疲劳。肝糖原的储备是机体抗疲劳的重要物质基础，可直接影响机体体能及运动性疲劳出现的快慢和程度^[26]，运动需要消耗糖原来为机体提高能力量，提高肝糖原的储备量或减少其消耗有利于提高机体耐力和运动能力，有助于抵抗疲劳。

试验结果显示，枸杞能明显延迟小鼠力竭状态的出现，各枸杞组均能显著降低BUN、LA含量，提高肝糖原、LDH的含量。表明使用枸杞后，小鼠的抗疲劳能力增强，枸杞可通过增加肝糖原储备以提供运动所需的能量，降低因运动疲劳产生的BUN在机体的蓄积，提高运动能力以延长小鼠游泳耗竭时间。

2.2枸杞的免疫提高试验研究

2.2.1免疫提高试验-细胞因子及脏器比

取KM小鼠168只，随机分为14组，每组12只，即空白对照组(生理盐水)、模型对照组(生理盐水)、西药阳性组(盐酸左旋咪唑80mg/g)、中药阳性组(黄芪多糖80mg/g)、十批枸杞提取液治疗组(9.6mg/g)。灌胃给药每日1次，每次小鼠0.2mL/10g，连续36天。给药结束前5天，模型组和枸杞各组动物腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)制造免疫功能低下模型，对照组腹腔注射同等体积的生理盐水，连续5d。第35d时对小鼠禁食不禁水。灌胃36天在灌胃30min后，对其进行摘眼球取血，离心，取血清放置于-80℃备检(检测方法同2.1.2.2，标准曲线的制备同2.1.2.3)。对采血后的小鼠进行颈椎脱臼处死，剪开腹部皮肤，分离出脾脏、胸腺，用生理盐水清洗脏器，滤纸吸干表面水分，剔除脏器表面脂肪、筋膜后用电子天平精确称量脏器质量。计算各组小鼠的脏体比。脏/体(％)＝脏器湿重/动物体重×100％。

2.2.2免疫提高试验-迟发型变态反应

小鼠分组、给药周期、给药剂量及造模同“2.2.1”。实验结束前6天将小鼠腹部皮肤用8％的硫化钠脱毛约3×3cm²范围，用50μL的2,4-二硝基氟苯溶液均匀涂抹致敏，5天后将10μL2,4-二硝基氟苯均匀涂抹于右耳两面进行攻击，24h后处死小鼠，剪下左右耳朵，用简易打孔器取下8mm直径的耳片，称重，以左右耳片重量之差为肿胀度，表示DTH的程度。

2.2.3免疫调节试验-血清溶血素试验

小鼠分组、给药周期、给药剂量及造模同“2.2.1”。每只小鼠经腹腔注射2％SRBC(v/v，用生理盐水配制)0.2mL进行免疫，4天后摘除眼球取血于离心管内，放置约3h，取血清并稀释20倍，取1mL于试管内，依次加入10％SRBC0.5mL，补体1mL。另设不加血清的对照管。摇匀，37℃放置30min后，立即放进冰水浴终止反应，离心取上清液，用酶标仪于540nm波长下测定光密度值。血清溶血素含量以半数溶血值(HD₅₀)表示：HD50＝样品光密度值A×稀释倍数(200倍)/SRBC半数溶血时的A值。

2.2.4结果与结论

2.2.4.1免疫提高试验-细胞因子及脏器比

由表7可知，与空白对照组相比，模型对照组的胸腺指数和脾脏指数均呈极显著性差异(P＜0.01)，胸腺指数及脾脏指数指标数值明显降低，表明模型组免疫器官受损，由此说明各组小鼠的免疫抑制模型指标成功。与模型对照组相比，各枸杞组均有极显著性差异(P＜0.01)，胸腺指数和脾脏指数均明显增强(P＜0.01)，表明各枸杞组能缓解免疫器官受损，改善免疫功能。结果表7-8显示，相比于空白对照组，模型组免疫低下小鼠血清中细胞因子IFN-α、IFN-γ、Ig-A、Ig-G、IL-2、IL-6、TNF-α水平均有明显降低，差异具有显著性意义(P＜0.05)，说明环磷酰胺会抑制细胞因子的正常分泌；与模型对照组相比较，各枸杞水提物给药组在各个细胞因子数值上均具有明显恢复，且基本都恢复至于空白对照组水平，说明枸杞可以明显改善细胞因子的分泌障碍。各检测指标的标准曲线图见图5-6。各检测指标标准品浓度对应表见表6；枸杞对免疫低下小鼠胸腺和脾脏脏器指数的影响(n＝10，

)见表7；枸杞对免疫低下细胞因子的影响(n＝10，

)见表8。

表6各检测指标标准品浓度对应表

表7枸杞对免疫低下小鼠胸腺和脾脏脏器指数的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；与空白对照组相比^#P＜0.05，^##P＜0.01

表8枸杞对免疫低下细胞因子的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；与空白对照组相比^#P＜0.05，^##P＜0.01

2.2.4.2免疫提高试验-迟发型变态反应(DTH)

由表9可以看出，与空白对照组相比，模型对照组小鼠出现的肿胀反应显著降低(P＜0.01)，说明小鼠免疫抑制模型制备成功。与模型对照组相比，宁夏银川组、甘肃酒泉组、新疆巴州组、河北巨鹿组、甘肃靖远组、宁夏C181010组、青海诺木洪组、青海西宁组、甘肃张掖组及内蒙古组小鼠出现的肿胀反应显著增加(P＜0.01，P＜0.05)，说明其可促进小鼠对2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发的DTH反应，具有增强细胞免疫功能的作用。枸杞对小鼠迟发型变态反应的影响(n＝10，

)见表9。

表9枸杞对小鼠迟发型变态反应的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；与空白对照组相比^#P＜0.05，^##P＜0.01。

2.2.4.3免疫调节试验-血清溶血素试验

表10结果显示，与空白对照组相比，模型对照组小鼠的半数溶血值(HD₅₀)含量明显降低(P＜0.01)；与模型对照组比较，各枸杞组HD₅₀显著增加(P＜0.01)，表明各组枸杞均可显著增加免疫低下小鼠的血清溶血素含量。枸杞对免疫低下小鼠半数溶血值(HD50)的影响(n＝10，

)见表10。

表10枸杞对免疫低下小鼠半数溶血值(HD₅₀)的影响(n＝10，

)

注：与模型对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；与空白对照组相比^#P＜0.05，^##P＜0.01。

第三节枸杞抗疲劳及免疫提高“谱-效”关系及多指标活性成分评价方法的建立

1层次分析法

1.1计算各药效指标的初始权重系数

为了使得药效评价指标更清楚明了，对5个抗疲劳药效指标及11个提高免疫药效指标进行综合评价，其中1表示两者同等重要，3表示其中一个略为重要,5表示一个比另一个更加重要。基于以上对药效指标进行主观性评分，分别得表11、12的矩阵。根据计算公式①-1、①-2计算初始权重系数，结果见表分别13、14。

表11枸杞抗疲劳5个药效指标成对比较判断优先矩阵

表12枸杞提高免疫11个药效指标成对比较判断优先矩阵

表13枸杞抗疲劳5个药效指标初始权重系数

表14枸杞提高免疫11个药效指标初始权重系数

1.2归一化权重系数的计算

根据公式②计算归一化权重系数，结果见表15、16。根据归一化权重系数分别得到枸杞抗疲劳总药效数据及免疫提高总药效数据，结果见表17、18。

表15枸杞抗疲劳归一化权重系数

表17枸杞抗疲劳总药效数据

表18枸杞提高免疫总药效数据

2灰色关联分析方法

2.1确定分析数列

本研究把枸杞总药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作为比较数列。选择药效指标为参考数列，记为Y(k),k＝1,2,3,...,m。选择特征峰的峰面积为比较数列，记为Xi(k)，i＝1,2,3,...,n。

2.2变量的无量纲化

表19 10批枸杞水提物峰面积均值化结果

表20药效数值均值化结果

2.3计算灰色关联系数

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5。

△i(k)＝∣Y(k)-Xi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值。 ③

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值。

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值。

2.4计算关联度

2.5数据处理结果与结论

2.5.1枸杞抗疲劳关联度结果

结果表明，枸杞与抗疲劳和免疫提高之间具有较高的关联度，各峰的关联度均大于0.680，表明各色谱峰代表的化学成分与枸杞抗疲劳的药效指标有关联性；大多数峰的关联度均大于0.700，表明各峰与枸杞药效活性的关联度较大，结果见表21、22，说明枸杞抗疲劳和免疫提高药效是多个成分共同作用的结果。抗疲劳关联度顺序为：峰12(甘露糖)>峰17(D-葡萄糖醛酸)>峰6>峰9>峰7>峰15>峰20>峰4>峰19>峰16>峰2>峰3>峰5>峰1>峰18(阿拉伯糖/木糖)>峰8>峰13>峰10>峰11(盐酸氨基葡萄糖)>峰14(鼠李糖)>峰21；免疫提高关联度顺序为：峰17(D-葡萄糖醛酸)>峰12(甘露糖)>峰4>峰6>峰19>峰7>峰9>峰20>峰16>峰5>峰2>峰15>峰3>峰1>峰18(阿拉伯糖/木糖)>峰8>峰10>峰11(盐酸氨基葡萄糖)>峰14(鼠李糖)>峰13>峰21。

表21枸杞抗疲劳总药效关联度

表22枸杞免疫提高总药效关联度

3 PLSR分析枸杞抗疲劳及免疫提高的谱效关系

以枸杞的指纹图谱中各共有峰的峰面积为X，以枸杞的抗疲劳总药效与免疫提高总药效相加成综合药效为Y，采用软件SIMCA 14.1进行偏最小二乘回归法谱效相关性分析。计算出各X对应Y的回归系数。其中回归系数代表各X对Y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

Y＝61.5423-0.0045X₁+0.0819X₂+0.0205X₃+0.0116X₄+0.0813X₅+0.0812X₆+0.0701X₇+0.0213X₈+0.0052X₉-0.1030X₁₀-0.1148X₁₁-0.0197X₁₂+0.0154X₁₃-0.0380X₁₄+0.0505X₁₅+-0.0318X₁₆+0.0535X₁₇-0.0842X₁₈-0.0104X₁₉-0.0852X₂₀-0.0476X₂₁

偏最小二乘法分析结果显示，21个自变量X对Y的回归系数有正也有负，即存在正相关和负相关，因为综合药效数据与药效呈正相关，所以回归系数为正值的峰是对药效有贡献的峰，其中，“X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₃、X₁₅”这些自变量在综合药效指标下呈正相关，为枸杞的药效成分组。枸杞综合药效PLSR回归模型系数及VIP贡献见图7。

4基于谱效关联的枸杞多指标活性成分评价方法的建立

结合枸杞抗疲劳总药效及免疫提高总药效的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果，选择灰色关联度分析结果中关联度大于0.7且偏最小二乘法分析结果中对综合药效呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定枸杞质量评价方法。根据分析结果，选择色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17为特征峰，其峰面积之和记为A。结合药效数据，枸杞A越大其药效作用越好。为减少色谱峰峰面积的重现性问题引起的系统误差，引入“峰占比-A％”，即A占总峰面积的百分比。各批次枸杞药材A及其占比情况见表23。

表23 10批枸杞药材A及其占比情况

由表23可以看出，十批枸杞中A占色谱峰总面积的92.52％～95.52％，平均值为94.02％。按质量评价研究方法惯例，设定均值下浮20％为其质量评价的下限，即特征峰峰面积占比不得低于75.22％。综上所述，设定枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B)，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm，采用高效液相色谱仪(Agilent1260)检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比(色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17之和占色谱峰总面积的百分比)不得低于75％。

综上所述，本发明具有将枸杞的指纹图谱与其抗疲劳及提高免疫进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗疲劳及提高免疫活性，从而用于判断枸杞质量优劣的有益效果。

附图说明

图1是本发明HPLC指纹图谱的建立中的A.10批枸杞样品叠加图；

图2是本发明HPLC指纹图谱的建立中的B枸杞对照图谱；

图3是本发明HPLC指纹图谱的建立中的C.混合对照品HPLC指纹图谱(11.盐酸氨基葡萄糖；12.甘露糖；14.鼠李糖；17.D-葡萄糖醛酸；18.阿拉伯糖/木糖)；

图4是本发明不同产地枸杞药材HPLC指纹图谱聚类分析中基于HPLC的十个产地枸杞的聚类分析图；

图5是本发明抗疲劳与免疫提高试验-各检测指标的标准曲线图；

图6是本发明抗疲劳与免疫提高试验-各检测指标的标准曲线图；

图7是本发明PLSR回归方程的建立中枸杞综合药效PLSR回归模型系数及VIP贡献图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例：一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法，包括有以下步骤：

(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立：包括以下步骤：

对照品溶液的制备为：分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸适量与10mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得；

供试品溶液的制备为：精密称取枸杞0.5g于锥形瓶中，精密量取蒸馏水20mL，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得；

色谱条件为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脱梯度0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B；进样量10μL，体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长250nm。

(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究：

枸杞的抗疲劳试验研究对BUN、LDH、LA及肝糖原的影响，枸杞的免疫提高试验研究对细胞因子及脏器比、迟发型变态反应、血清溶血素的影响。

(3)枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立：

采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把枸杞各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作为比较数列，选择药效指标为参考数列，记为Y(k),k＝1,2,3,...,m，选择特征峰的峰面积为比较数列，记为Xi(k)，i＝1,2,3,...,n；

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

PLSR分析枸杞抗疲劳及免疫提高的谱效关系：

以枸杞的指纹图谱中各共有峰的峰面积为X，以枸杞的抗疲劳总药效及免疫提高总药效相加成综合药效为Y，采用软件SIMCA 14.1进行偏最小二乘回归法谱效相关性分析；计算出各X对应Y的回归系数，其中回归系数代表各X对Y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

PLSR回归方程的建立：

Y＝61.5423-0.0045X₁+0.0819X₂+0.0205X₃+0.0116X₄+0.0813X₅+0.0812X₆+0.0701X₇+0.0213X₈+0.0052X₉-0.1030X₁₀-0.1148X₁₁-0.0197X₁₂+0.0154X₁₃-0.0380X₁₄+0.0505X₁₅+-0.0318X₁₆+0.0535X₁₇-0.0842X₁₈-0.0104X₁₉-0.0852X₂₀-0.0476X₂₁。

(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量。

基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：结合枸杞抗疲劳总药效及免疫提高总药效的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果，选择灰色关联度分析结果中关联度大于0.7，且偏最小二乘法分析结果中对综合药效呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定枸杞质量评价方法。

步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm，采用高效液相色谱仪检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于75％

所述特征峰是以D-葡萄糖醛酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17号特征峰的相对保留时间分别为0.114、0.123、0.179、0.21、0.222、0.241、0.275、0.549、0.869、0.965、1。

指纹图谱是评价中药质量的重要方法，能从整体上定性评价药材质量优劣。该发明在指纹图谱的基础上，更进一步的明确了哪些指纹峰与抗疲劳、提高免疫有密切正相关性，并以此指纹峰为特征峰，计算特征峰在指纹图谱所有共有峰的占比值高低，评价药材优劣，即：特征峰占比值越高，影响药效指标的有效成分越多，药材抗疲劳、提高免疫的作用越强。并通过10批不同产地枸杞的实验数据，确定了特征峰占比不得低于75％，作为评价药材是否合格的最低限，在此限度以上，数值越高，表明有效成分越多，药效越强，质量更优。

Claims (10)

1.一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：包括有以下步骤：

(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立；

(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究；

(3)枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立；

(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量。

2.根据权利要求1所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，枸杞药材HPLC指纹图谱建立包括以下步骤：

对照品溶液的制备为：分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸与容量瓶中，摇匀，取上清液置离心管中，分别加入1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液、氢氧化钠溶液，充分摇匀，水浴反应，冷却至室温，加盐酸溶液，加入三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复3-5次，离心，收集上清液，过滤膜，即得；

供试品溶液的制备为：精密称取枸杞于锥形瓶中，精密量取蒸馏水，称重，回流提取，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液置离心管中，分别加入1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液、氢氧化钠溶液，充分摇匀，水浴反应，冷却至室温，加盐酸溶液，加入三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复3-5次，离心，收集上清液，过滤膜，即得；

枸杞药材HPLC指纹图谱建立中色谱条件为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(A)-乙腈(B)；其中乙腈(B)占比为5％-95％，进样量5-15μL，体积流量0.5-1.5mL/min；柱温28-32℃；检测波长250nm。

3.根据权利要求2所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述对照品溶液的制备为：分别精密称取对照品甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸适量与10mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得；

所述供试品溶液的制备为：精密称取枸杞0.5g于锥形瓶中，精密量取蒸馏水20mL，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液200μL置10mL离心管中，分别加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡咯啉酮甲醇溶液240μL、0.3mol/L氢氧化钠溶液200μL，充分摇匀，70℃水浴反应60min，冷却至室温，加0.3mol/L盐酸溶液200μL，加入1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，弃去有机相，重复4次，8000r/min离心10min，收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

4.根据权利要求2所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，枸杞药材HPLC指纹图谱建立中色谱条件为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脱梯度0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B；进样量10μL，体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长250nm。

5.根据权利要求1所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究：枸杞的抗疲劳试验研究对BUN、LDH、LA及肝糖原的影响，枸杞的免疫提高试验研究对细胞因子及脏器比、迟发型变态反应、血清溶血素的影响。

6.根据权利要求1所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，枸杞指纹图谱与药效指标谱效关系的建立：采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把枸杞各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作为比较数列，选择药效指标为参考数列，记为Y(k),k＝1,2,3,...,m，选择特征峰的峰面积为比较数列，记为Xi(k)，i＝1,2,3,...,n；

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

PLSR分析枸杞抗疲劳及免疫提高的谱效关系：

以枸杞的指纹图谱中各共有峰的峰面积为X，以枸杞的抗疲劳总药效及免疫提高总药效相加成综合药效为Y，采用软件SIMCA 14.1进行偏最小二乘回归法谱效相关性分析；计算出各X对应Y的回归系数，其中回归系数代表各X对Y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

PLSR回归方程的建立：

Y＝61.5423-0.0045X₁+0.0819X₂+0.0205X₃+0.0116X₄+0.0813X₅+0.0812X₆+0.0701X₇+0.0213X₈+0.0052X₉-0.1030X₁₀-0.1148X₁₁-0.0197X₁₂+0.0154X₁₃-0.0380X₁₄+0.0505X ₁₅+-0.0318X₁₆+0.0535X₁₇-0.0842X₁₈-0.0104X₁₉-0.0852X₂₀-0.0476X₂₁。

7.根据权利要求1所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：结合枸杞抗疲劳总药效及免疫提高总药效的灰色关联度分析及偏最小二乘法分析结果，选择灰色关联度分析结果中关联度大于0.7，且偏最小二乘法分析结果中对综合药效呈正相关的指纹峰为特征峰，然后通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定枸杞质量评价方法。

8.根据权利要求1所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.05-0.15％甲酸水(A)-乙腈(B)，其中乙腈(B)占比为5％-95％，进样量5-15μL，体积流量0.5-1.5mL/min；柱温28-32℃；检测波长250nm，采用高效液相色谱仪检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于74-76％。

9.根据权利要求8所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质量：枸杞的质量评价方法为：采用ZORBAX SB-Aq色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱0～130min，5％～30％B；130～140min，30％～95％B；140min～150min，95％～5％B，进样量10μL，体积流量1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm，采用高效液相色谱仪检测枸杞衍生化的水提液，其特征峰占比色谱峰2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于75％。

10.根据权利要求9所述的基于谱效关系的枸杞质量检测方法，其特征在于：所述特征峰是以D-葡萄糖醛酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、3、4、5、6、7、8、9、13、15、17号特征峰的相对保留时间分别为0.114、0.123、0.179、0.21、0.222、0.241、0.275、0.549、0.869、0.965、1。

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