CN107854544B - 一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其有包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊20‑60份、黄芩20‑60份、藿香10‑50份、香薷10‑50份、石膏8‑35份、陈皮8‑35份、白术3‑25份、甘草3‑25份。本发明还公开调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法和应用。本发明具有以下优点及有益效果：可通过影响热应激鸡血液生化指标以及调整盲肠肠道菌群，缓解热应激给鸡带来的损伤。

Description

一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物及其制备方法和 应用
【技术领域】
本发明涉及中医兽药领域，特别是一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物及其制备方法。
【背景技术】
热应激是机体面对高温环境时所产生的非特异性的一切生理反应。热应激可以使机体采食量、饮水量减少，生产性能降低，胃肠道持续性缺血，肠道菌群紊乱，消化功能失调等。肠道微生物是动物体最大、最重要的微生态系统，肠道在某些疾病过程中有着至关重要的作用，如肠道是脓毒症多器官功能障碍综合征的启动者。热应激条件下，鸡的机体肠道易发生缺血、缺氧性损害，上皮绒毛顶端脱落形成溃疡，肠道通透性增加等。
【发明内容】
本发明的目的是针对上述现技术存在的不足，提供一种能够清热泻火、解暑化湿、理气健脾，调节热应激鸡血生化和肠道菌群的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物。
本发明的另一目的是提供一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的应用。
为了实现上述目的，本发明是这样实现的：一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊20-60份、黄芩20-60份、藿香10-50份、香薷10-50份、石膏8-35份、陈皮8-35份、白术3-25份、甘草3-25份。
优选的，所述调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊40份、黄芩40份、藿香30份、香薷30份、石膏20份、陈皮20份、白术10份、甘草10份。
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其包括的步骤如下：
(1)取香薷、藿香、陈皮浸泡于水中，提取挥发油；
(2)将步骤(1)得到的药渣加入锅中与紫锥菊、黄芩、石膏、白术、甘草用水煎煮；
(3)将步骤(2)所得的水煎液浓缩至密度为0.5-1.5g/mL；
(4)将步骤(1)所得的挥发油用吐温-80溶解，然后和步骤3)所得的浓缩液混匀，加入总质量0.1-0.5％的山梨酸钾防腐，制得煎液。优选的，所述山梨酸钾的添加量为0.3％。
所述(1)步骤中，浸泡时间为1h，所述挥发油的提取为水蒸气蒸馏法，可以直接加热蒸馏或通入水蒸汽蒸馏。
所述水蒸气蒸馏提取挥发油的蒸馏时间为8h，可以有效的提取药材中的挥发油。
所述(2)步骤中，加水为药材重量的5-12倍，石膏先15-45min，再一起煎煮1-3h，重复煎煮1-5次。优选的，加水为药材重量的8倍，石膏先30min，再一起煎煮2h，重复煎煮3次。
所述(3)步骤中，将步骤2)所得的水煎液使用旋转蒸发仪浓缩。
所述(4)步骤中挥发油与吐温-80的重量比为1:1-3，优选的，挥发油与吐温-80的重量比为1:2。
所述调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的应用，在鸡饮水中添加量为0.1-1％。优选的，在鸡饮水中添加量为0.25％，或者在鸡饮水中添加量为0.5％。
中药理论认为热应激是气分实热证为主，进而发展为营热、血热证。本发明调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物对热应激下鸡肠道菌群的影响进行了试验，试验结果显示，7d(天)时与适温组相比高温组血清ALT、AST、TP、ALB、GLU显著改变(P<0.05)，而中药组与适温组差异不显著(P>0.05)；高温组能显著降低鸡盲肠肠道菌群的丰度和多样性，中药组可以显著增加其丰度和多样性(P<0.05)；鸡盲肠门和纲的丰度比例在热应激条件下与适温组有显著差异(P<0.05)，中药组能改善其变化。结果表明，中药复方煎液可通过影响热应激鸡血液生化指标以及调整盲肠肠道菌群，缓解热应激给鸡带来的损伤。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：可通过影响热应激鸡血液生化指标以及调整盲肠肠道菌群，缓解热应激给鸡带来的损伤。
【附图说明】
图1为observed_species曲线；
图2为Shannon曲线；
图3为chao1曲线；
图4为Rank-abundance曲线；
图5为试验1d加权PCoA分析图；
图6为试验1d不加权PCoA分析图；
图7为试验3d加权PCoA分析图；
图8为试验3d不加权PCoA分析图；
图9为试验7d加权PCoA分析图；
图10试验7d不加权PCoA分析图；
图11试验14d加权PCoA分析图；
图12试验14d不加权PCoA分析图；
图13试验28d加权PCoA分析图；
图14试验28d不加权PCoA分析图。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例对本发明进行详细的描述说明。
实施例1
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊21份、黄芩21份、藿香11份、香薷11份、石膏9份、陈皮9份、白术4份、甘草4份。
实施例2
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊59份、黄芩59份、藿香49份、香薷49份、石膏34份、陈皮34份、白术24份、甘草24份。
实施例3
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊30-50份、黄芩30-50份、藿香20-40份、香薷20-40份、石膏12-20份、陈皮12-20份、白术5-15份、甘草5-15份。
实施例4
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊35份、黄芩45份、藿香28份、香薷30份、石膏15份、陈皮15份、白术6份、甘草10份。
以上配方组成中，所述中药组合物的份数是以中药材生药重量计算，可以以g为单位。
上述调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其包括的步骤如下：
(1)取香薷、藿香、陈皮浸泡于水中1h，直接加热蒸馏或通入水蒸汽蒸馏提取挥发油，蒸馏时间为8h；
(2)将步骤(1)得到的药渣加入锅中与紫锥菊、黄芩、石膏、白术、甘草用水煎煮，加水为药材重量的8倍，石膏先煮30min，再一起煎煮2h，重复煎煮三次。
(3)将步骤(2)所得的水煎液使用旋转蒸发仪浓缩至密度为1g/mL；
(4)将步骤(1)所得的挥发油用吐温-80溶解，然后和步骤3)所得的浓缩液混匀，加入0.3％的山梨酸钾，制得煎液。
实施例5
一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其由包括以下重量份数组分制成的：紫锥菊40份、黄芩40份、藿香30份、香薷30份、石膏20份、陈皮20份、白术10份、甘草10份。
其制备方法如下：香薷、藿香、陈皮浸泡1h，水蒸气蒸馏8h提取挥发油；所得药渣加入紫锥菊、黄芩、石膏、白术、甘草混合煎煮，加药材重量8倍的水，石膏先煮30min，再一起煎煮2h，煎煮三次；所得的水煎液使用旋转蒸发仪浓缩，最后浓缩为g/mL；所得的挥发油用吐温-80以1:2溶解，和浓缩液混匀，加入0.3％的山梨酸钾，制得煎液。
效果验证实验
使用本发明的权利要求5得到中药组合物进行临床试验，试验选取1日龄商品代快大型岭南黄雌性肉鸡，购自广东智威农业科技股份有限公司。
中药紫锥菊、黄芪、藿香、香薷、石膏、陈皮、白术、甘草等所有中药均购自广州市利康堂药店；天根粪便基因组提取试剂盒，批号：DP328-021。
试验选用1日龄商品代快大型岭南黄雌性肉鸡喂养至14日龄，选取180羽体质健康、体重均匀的肉鸡，随机分为4组，每组45羽。分别设为：适温组、中药一组、中药二组、热应激组。肉鸡采用网上平养，人工持续光照制度，鸡舍自然通风，自由采食、饮水。试验期间鸡舍按常规程序进行清洁消毒。试验期为28d(天)，各组饲喂基础日粮相同，饮水处理、分组情况见表1。
表1试验设计与分组
Figure BDA0001234864150000051
分别在试验的第1d、3d、7d、14d、28d，每组随机选取并剖杀6只鸡，取盲肠内容物约5g，置于-20℃冰箱保存，用于提取总DNA，进行16S rDNA测序。用DNA提取试剂盒提取盲肠内容物细菌的DNA，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽取的基因组DNA，全部合格后，用16s rDNAV3～V4区进行扩增，Illumina Miseq测序仪测序，最后进行生物学信息分析。
应用SPSS19.0统计分析软件单因素方差分析各组间的差异显著性，通过Duncan's新复极差检验法进行各组间均数的多重比较，结果用“平均数±标准差”
Figure BDA0001234864150000061
表示，其中样本n＝6。文中柱状图用GraphPad Prism5制作。
如图1-4所示，由observed_species曲线可知当测序深度较小时，OTU数目变化剧烈，OTU数目随着测序深度的增加而大幅增加，当测序深度达到450000reads数时，稀释曲线仍有上升趋势，表明鸡肠道内仍有新的细菌尚未被发现。当测序深度达50000reads时，Shannon曲线已达到饱和状态，说明即使加大测序浓度，也只能是物种丰度增加而多样性不会增加，即当前的测序量足够进行样品微生物多样性分析。图3为基于chao1指标绘制的曲线，用来预测微生物的物种总数，从图中可以看出，样品曲线基本趋于平缓，再次证明样品测序量基本能够反映出样品物种丰度。此外，为了检测样品肠道菌群物种的丰富程度和均匀程度。对每个样品的OTU丰度大小排序，然后对OTU所占相对丰度比例作Rank-abundance曲线图，见图4，图中丰度分布曲线开始波动幅度较大，但在1500丰度值以后处于平缓状态，说明样品中物种分布的整体趋势是均匀的。
如图5和图6所示，试验1d，基于UniFrac的加权及非加权的主坐标分析的第一主成分及第二主成分的贡献率分别为29.13％、21.59％和9.58％、7.91％。从图可以看出，各组样品存在一定交叠现象，说明各组组间个体差异比较大。如图7和图8所示，试验3d，各组PCoA存在交集，但有的组别出现聚类的趋势。在加权与非加权坐标分析中，热应激组组开始聚类；中药二组在加权分析中也开始聚类；适温组组内差距较大。表明环境热应激开始对肠道菌群产生影响。如图9和图10所示，试验7d，各组聚类趋势明显。适温组在加权与非加权坐标分析中已经与其他三组分开，热应激组在不加权中比中药一组和中药二组分散。说明在试验7d，热应激导致肠道菌群与适温组产生差距，且热应激组组内个体差异大于其他三组。表明热应激因素已经主导肠道菌群的差异，其影响大于中药一组与二组的影响。如图11和图12所示，试验14d，在加权情况下，经过中药调节的肠道菌群开始向适温组靠拢，表明中药对肠道菌群起到良好的调节。如果不加权(只考虑物种进化关系)，在第二主成分与第三主成分分别贡献7.87％、6.99％的情况下，则适温组、中药一组和二组均与热应激组完全分开，各组分别聚集在不同区域，各组组内差异变小。如图13和图14所示，试验28d，加权坐标分析中，第一坐标与第三坐标分别贡献9.90％、33.43％，适温组依旧与其他组距离较远，中药组与热应激组分布距离也比较明显，中药二组分布广，与中药一组组和适温组均较接近。在不加权分析中，热应激组与其他三组分散更加明显，中药一组、二组距离较近，均向适温组靠拢。以上表明，随着热应激时间的增加，热应激导致的肠道菌群失常通过主成分分析越来越明显，在热应激开始后第7d，与适温组相比，热应激组肠道微生物菌群出现明显改变，且热应激组组内差异大于其他三组，而中药的添加对热应激菌群的变化有向适温组靠拢的趋势，且在14d、28d效果显著，表明随着热应激的持续用药效果越来越明显。
如下表2-7所示，从整个试验阶段看，随着肉鸡的增长，厚壁菌门丰度均有增加的趋势，且长期慢性热应激能增加厚壁菌门丰度比例。拟杆菌门的丰度比例呈降低趋势，且长期慢性热应激能降低拟杆菌门丰度比例；饮水中添加中药能在一定程度增加拟杆菌门含量，且中药一组优于中药二组组。在试验进行中，变形菌门各组比值波动比较大，在时间上组间表现为先增加后减少的趋势，在7d丰度比例相对较大，整体看中药复方有增加变形菌门的趋势。中药可以有效调节热应激导致的拟杆菌属的减少。热应激使颤螺菌属的丰度比例降低，而中药组有增加的趋势。高温环境中，柔嫩梭菌属减少，而添加中药复方后，柔嫩梭菌属丰度比例增加。
表2中药对热应激下鸡肠道厚壁杆菌门丰度比例(％)的影响
Figure BDA0001234864150000081
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
表3中药对热应激下鸡肠道拟杆菌门丰度比例(％)的影响
Figure BDA0001234864150000082
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
表4中药对热应激下鸡肠道变形菌门丰度比例(％)的影响
Figure BDA0001234864150000083
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
表5中药对热应激下拟杆菌属丰度比例(％)变化
Figure BDA0001234864150000084
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
表6中药对热应激下颤螺菌属丰度比例(％)变化
Figure BDA0001234864150000091
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
表7中药对热应激下柔嫩菌属丰度比例(％)变化
Figure BDA0001234864150000092
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，字母相同或无字母肩标差异不显著(P>0.05)。
围绕本发明的组合物对热应激下鸡肠道菌群的影响进行了临床试验，结果表明，随着肉鸡日龄的增加，其肠道菌群的物种丰富度、物种总数、多样性增加。且长期热应激，肠道菌群的物种丰富度、物种总数以及多样性均有增加的趋势。从PCoA可以看出，随着热应激时间的增加，热应激组肠道内组成与适温组完全分开，添加中药有向适温组靠拢的趋势。长期热应激可以增加厚壁菌门的丰度比例，降低拟杆菌门、变形菌门的丰度比例，而使用中药后可以改变这些变化。热应激导致拟杆菌属、柔嫩梭菌属、颤螺菌属的丰度比例降低，通过本发明中药组合物可以得以缓解。
本发明其他实施例也具类似实验效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其特征在于，由以下重量份数组分制成的：紫锥菊30-50份、黄芩30-50份、藿香20-40份、香薷20-40份、石膏12-20份、陈皮12-20份、白术5-15份、甘草5-15份。
2.根据权利要求1所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物，其特征在于，由以下重量份数组分制成的：紫锥菊40份、黄芩40份、藿香30份、香薷30份、石膏20份、陈皮20份、白术10份、甘草10份。
3.根据权利要求1所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括的步骤如下：
（1）取香薷、藿香、陈皮浸泡于水中，提取挥发油；
（2）将步骤（1）得到的药渣加入锅中与紫锥菊、黄芩、石膏、白术、甘草用水煎煮；
（3）将步骤（2）所得的水煎液浓缩至密度为0.5-1.5 g/mL；
（4）将步骤（1）所得的挥发油用吐温-80溶解，然后和步骤（3)所得的浓缩液混匀。
4.根据权利要求3所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述（1）步骤中，浸泡时间为1h，所述挥发油的提取使用水蒸气蒸馏法。
5.根据权利要求4所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述水蒸气蒸馏提取挥发油的蒸馏时间为8h。
6.根据权利要求3所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述（2）步骤中，加水为药材重量的5-12倍，石膏先煮30min，再一起煎煮1-3h，重复煎煮1-5次。
7.根据权利要求3所述的调节热应激下鸡肠道菌群的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述（3）步骤中，将步骤（2）所得的水煎液使用旋转蒸发仪浓缩。
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