CN106511448A - 基于r语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺 - Google Patents

基于r语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺 Download PDF

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万海同
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Abstract

本发明公开了一种基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺，选用响应面法中的中心组合设计实验，以甘草中皂苷和黄酮含量作为检测指标，运用R语言环境下的熵权法对上述2指标进行权重赋值，建立BP神经网络和遗传算法数学模型，对提取工艺进行目标寻优，最终得到最佳提取工艺。结果得到最佳提取条件为：氨浓度0.62％，乙醇浓度64％，回流时间1.8h，液固比12∶1。模型综合评价预测值与验证实验的平均综合评价值的相对误差为1.43％，证明神经网络和遗传算法具有较好的预测性。本发明建立的数学模型寻求同时提取甘草皂苷和总黄酮最佳提取条件是科学可行的，为实现中药化学成分乃至药效物质基础多目标寻优提供了新的参考和思路。

Description

基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺
技术领域
本发明涉及一种基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺。
背景技术
甘草很早便运用于传统医学，一般为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根茎，在经过长久的临床实践验证后，确认它能缓解感冒症状、补脾益气、有效止痛、调和各种药效的功能，可用于治疗感冒、脾胃不适、身体虚弱以四肢疼痛等症状，还可以缓解其它药的毒性。起这些药效的主要成分是三萜类和黄酮类化合物，因此这两类物质常常被作为研究的对象。
甘草皂苷是研究最多的甘草活性物质，属三萜类化合物，其中甘草酸是含量最高的皂苷类成分。具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗溃疡、抗变态反应、抗肿瘤及免疫调节等作用。除应用于医药界外，它还被广泛应用于食品添加剂(主要是低热值甜味剂)、烟草、酿造、化妆品等行业，是重要的精细化工产品。甘草总黄酮类化合物主要用于抗癌、抗肿瘤、抗炎症以及抗心律失常等疾病[3]，同时因为它还具有较强的抗氧化、抑制酶的作用，所以，在食品添加剂、化妆品的原料、医药原料行业也都有巨大的市场。
R是一个有着强大统计分析及作图功能的软件系统，其使用的程序语言是S语言中的分支--R语言，具有操作简单、浮点运算功能强大、作图功能强大等特点。然而R语言在中医药方面的应用还鲜有报道。
现有甘草的提取方法提取效率较低，需要对其进行优化研究，而且甘草黄酮和皂苷同时提取的工艺也较少，本发明利用当今热门的R语言技术，结合神经网络和遗传算法，对甘草中的皂苷、总黄酮类化合物的同时提取工艺进行优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺，利用当今热门的R语言技术，结合神经网络和遗传算法，对甘草中的皂苷、总黄酮类化合物的同时提取工艺进行优化，得到最佳的提取工艺。
本发明采用的技术方案是：
一种基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺，所述工艺包括以下步骤：
(1)设计提取条件的因素水平，以甘草提取中的不同控制参数为因子，按照中心组合试验设计条件安排因子组合设计实验，并进行提取，检测其中的皂苷和总黄酮含量；
(2)使用R语言进行熵权法编程，计算权重值，分别得到甘草皂苷和甘草总黄酮的权重系数，然后甘草皂苷和总黄酮的含量各自乘以其权重系数，得到综合评价值；
(3)采用3层结构的BP神经网络进行建模，输入节点数为不同因子；输出节点数为1个，即综合评价值；将中心组合设计实验的数据分别进行全数据交叉验证和留一法交叉验证，进行神经元的训练，对不同隐层神经元的个数进行模型的测试训练，以拟合误差和预测误差作为对隐层神经元选取的依据，选取最优的隐层神经元个数；
(4)采用R语言的实数编码程序，由遗传算法寻优得到最佳的综合评价值及其对应的因子水平；
(5)、根据最优综合评价值对应的控制参数因子水平，在最优化条件下提取甘草中的皂苷和总黄酮，按照步骤(2)的权重系数计算实际综合评价值，与网络预测值相比较，验证模型的可靠性。
进一步，所述步骤(1)中，所述以甘草提取中的不同控制参数为因子，可预先进行单因素实验，筛选多个提取的控制参数后，选取影响最大的几个控制参数为因子。
进一步，所述步骤(1)选取氨醇回流法进行甘草提取，并进行优化。
进一步，所述步骤(1)中，申请人发现提取溶剂氨醇、回流时间、氨醇氨浓度、氨醇氨醇浓度、液固比对甘草皂苷和甘草总黄酮提取影响最大，因此以氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比为四个因子，进行中心组合试验设计。
所述步骤(1)中，甘草提取的工艺为：称取甘草药材，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入氨醇溶液，在80℃下加热回流提取，重复提取3次，放冷至室温，抽滤，即得提取液；氨醇溶液为氨的乙醇溶液，氨醇溶液中的氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比根据因子设计水平确定。
提取液旋转蒸发至近干，用适量的60％乙醇溶解，转入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，用分光光度计分别在252nm和510nm处检测吸光度，与甘草酸标准曲线或芦丁标准曲线比较，分别计算得到甘草皂苷和总黄酮的含量，甘草皂苷的含量＝甘草皂苷的量/甘草生药量，总黄酮的含量＝总黄酮的量/甘草生药量。
进一步，所述步骤(2)中，所述熵权法是将各个待评价单元的信息进行量化与综合后，对熵权值转化为权重值。利用熵权法计算权重值时，采用的数值归一化法是数据离差标准化归一化法。
进一步，所述步骤(3)中，输入节点数为4个，分别为氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比。
进一步，所述步骤(3)中，采用留一法交叉验证进行神经元的训练时，初始随机权(rang)为0.1，参数重量衰变(decay)为5×10-3，最大迭代次数(maxit)为800，其他参数设为默认值。
在采用留一法交叉验证进行神经元的训练时，拟合误差和预测误差的选取标准优选均在5％以下。
所述步骤(3)中，采用全数据交叉验证进行神经元的训练时，优选选取拟合误差最小时的隐层神经元个数。全数据交叉验证是以正交试验的所有数据为样本，对不同个数的隐层神经元(size)进行模型的测试训练。
本发明实验中，综合留一法交叉训练和全数据交叉验证的数据，BP神经网络最优的隐层神经元个数为5。
本发明采用的遗传算法是一种基于自然选择和基因遗传学原理的优化搜索方法。它将“优胜劣汰,适者生存”的生物进化原理引入待优化参数形成的编码串群体中,按照一定的适配值函数及一系列遗传操作对各个个体进行筛选从而使适配值高的个体被保留下来,组成新的群体，新群体中个体适应度不断提高，直到满足一定的极限条件，得到最优解。
本发明采用R version 3.1.1软件、熵权法、神经网络模型代码和遗传算法rgenoud工具包进行BP神经网络的建模和遗传算法的计算。
所述步骤(4)中，遗传算法寻优时，，将中心组合试验的各因子水平和综合评价值输入R语言程序，设定种群大小为800，接近的最大代数为100，最大不可变代数为10，收敛公差为1×10-3，其他参数均设为默认值。本发明实施例中，运用R语言代码进行编程，由遗传算法寻优后得到的结果如下：总共运行了82代，运行时间为28s，运行到第82代时得到网络预测综合评价值为191.65，得到该结果的条件分别为：氨浓度0.62％，乙醇浓度64％，回流时间1.8h，液固比12∶1。
本发明结合神经网络和遗传算法，最终得到甘草中皂苷和总黄酮的最佳提取条件为：氨浓度0.62％，乙醇浓度64％，回流时间1.8h，液固比12∶1，模型综合评价预测值为191.65，而实验所得的平均综合评价值为188.90，相对误差为1.43％，证明神经网络和遗传算法具有较好的预测性。本发明建立的数学模型寻求同时提取甘草皂苷和总黄酮最佳提取条件是科学可行的，为实现中药化学成分乃至药效物质基础多目标寻优提供了新的参考和思路。
具体实施方式
下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
1材料、仪器及软件
甘草酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号：110731-201517，含量98％)；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-201506，含量91.7％)；三氯化铝(上海美兴化工股份有限公司，分析纯，批号：100401)；氢氧化钠(上海国药，分析纯，批号：20150429)；氨水(上海国药，分析纯，批号：20140326)；亚硝酸钠(上海国药，分析纯，批号：20150325)；甘草(宁夏，批号：150701)购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，经浙江中医药大学药学院药剂教研室主任黄绳武教授鉴定为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根，符合《中国药典》2015年版相关规范要求；水为超纯水；乙醇等均为分析纯。
TU-1900型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；018268型电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；AG135型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；FA1004N分析天平(上海精密仪器仪表有限公司)；RE-52AAA型旋转蒸发仪(上海嘉鹏科技有限公司)；R version 3.1.1软件、熵权法、神经网络模型代码和遗传算法rgenoud工具包(新西兰奥克兰大学)。
2方法与结果
2.1甘草皂苷和总黄酮测定准备
2.1.1甘草酸和芦丁标准曲线的制作
甘草酸标准曲线的制作精密称定甘草酸标准品2.0mg，，置10ml容量瓶中，加60％的乙醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.2mg/mL甘草酸标准品溶液。取适量的甘草酸标准品溶液，稀释适当倍数后，进行全波长扫描，得到甘草酸的最大吸收波长在252nm处。用移液枪准确移取0.2mg/mL甘草酸标准品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于5mL容量瓶中，用60％乙醇溶液定容至刻度线，在252nm处测其吸光值。以标准品液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制甘草酸标准品溶液标准曲线，其标准曲线方程为Y＝12.674X+0.0303，r＝0.9995，结果表明甘草酸在质量浓度0.008-0.056mg/mL与吸光度具有良好的线性关系。
芦丁标准曲线的制作精密称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品2.0mg，置于10mL容量瓶中，定容至刻度线，配成浓度为0.2mg/mL芦丁标准品溶液。取适量芦丁标曲溶液置于5mL容量瓶中，先加入5％亚硝酸钠0.15mL，放置6min，再加入10％硝酸铝0.15mL，放置6min，最后加入4％氢氧化钠2.0mL，用60％乙醇定容稀释至刻度，摇匀，静置10-15min，使其充分显色，最后进行全波长扫描，得到芦丁的最大吸收波长在510nm处。用移液枪准确移取0.2mg/mL芦丁标准品标准液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL于5mL容量瓶中，依据上述显色步骤进行实验，以芦丁标准品液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准品溶液吸光度曲线，其标准曲线方程为Y＝9.4643X-0.0356，r＝0.9996，结果表明芦丁在质量浓度0.024-0.08mg/mL与吸光度具有良好的线性关系。
2.1.2甘草溶液的提取与供试品溶液的制备
称取甘草药材5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入醇氨溶液(0.6％氨，60％乙醇)60mL，在80℃下加热回流提取2.5h，放冷至室温，补足减失的质量，摇匀，抽滤，即得提取溶液。提取溶液旋转蒸发至近干，用适量的60％乙醇溶解，转入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
2.1.3精密度实验
取浓度为0.056mg/mL甘草酸标准样品溶液，在252nm条件下重复测定其吸光度5次，吸光度的RSD为0.170％；取浓度为0.08mg/mL芦丁标准样品溶液，显色后在510nm条件下重复测定其吸光度5次，吸光度的RSD为0.162％，表明精密度良好。
2.1.4稳定性测定
按照“2.1.2”项下方法制备的供试品溶液1份，将供试液不避光，在室温下放置0，2，4，6，8h时测定供试品溶液吸光度。在252nm处测定吸光度5次，RSD为0.884％；在510nm处测定吸光度5次，RSD为0.606％，表明供试品溶液稳定性良好。
2.1.5重复性测定
称取甘草药材5g，共5份。按照“2.1.2”项下方法制备的供试品溶液，分别测定其吸光度。在252nm处测定5份供试品溶液，RSD为1.314％；在510nm处测定5份供试品溶液，RSD为0.678％，表明该方法重复性良好。
2.1.6加样回收率测定
取已测定的同一批药材，精密称定甘草药材5g，，共10份，按照“2.1.2”项方法制备提取供试品品溶液，5份分别加入0.2mg/mL甘草酸标准品溶液5mL，其余5份分别加入0.2mg/mL芦丁标准品溶液2mL。甘草皂苷的加样平均回收率为99.80％，RSD为1.20％；总黄酮类化合物的加样平均回收率为99.50％，RSD为2.15％。
2.2试验设计与方法
在相关资料以及前期单因素预试验(因子选择详见后续3.1)的基础上，确定影响甘草中皂苷和总黄酮提取得率的4个因素：氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液料比。以Designexpert 8.0.6软件中Central Composite Design设计原理，因素水平表见表1,中心组合设计实验见表2。
称取甘草药材30份，每份5g，按照中心组合试验设计条件进行提取，重复提取3次，回流提取后放冷，抽滤，滤液置于200mL的量瓶中。密封备用，得30个样品溶液。取样品溶液蒸发至近干，用适量的60％乙醇溶解，转入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，用分光光度计分别在252nm和510nm处检测吸光度，与甘草酸标准曲线或芦丁标准曲线比较，分别计算得到甘草皂苷和总黄酮的含量。甘草皂苷的含量＝甘草皂苷的量/甘草生药量，总黄酮的含量＝总黄酮的量/甘草生药量。测定结果见表2。
表1工艺优化因素水平表
表2中心组合设计及实验结果(n＝3)
2.3综合评价值的计算
使用R语言进行熵权法编程，计算权重值，利用熵权法计算权重值时，采用的数值归一化法是数据离差标准化归一化法。得到甘草皂苷和甘草总黄酮的权重系数分别为0.435和0.565。综合评价值＝甘草皂苷含量×0.435+甘草总黄酮含量×0.565。结果见表2。
2.4R语言模式下的BP神经网络建模
本研究采用3层结构的BP神经网络进行建模，输入节点数为4个(氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比)；输出节点数为1个(综合评价值)。30组中心组合设计实验数据依次采用留一法交叉验证进行神经元的训练，初始随机权(rang)为0.1，参数重量衰变(decay)为5×10-3，最大迭代次数(maxit)为800，其他参数设为默认值，留一法交叉验证后平均拟合误差和平均预测误差训练结果见表4。并且采用全数据交叉验证对BP神经网络进行训练，以30组中心组合设计实验数据为训练样本，对不同隐层神经元(size)的个数进行模型的测试训练，拟合误差结果见表3。同样参数条件下，以拟合误差和预测误差作为对隐层神经元选取的依据，不同神经元的30组实验数据留一法交叉验证后平均拟合误差和平均预测误差训练结果见表4。
表3全数据交叉验证隐层神经元测试训练结果
表4不同神经元的30组实验数据留一法交叉验证后平均拟合误差和平均预测误差训练结果(％)
由表3可知，随着隐层神经元个数的增加，拟合误差先减小后增大再减小，可判别出现了统计学中的拟合过度现象。故初步选取隐层神经元个数为3、5、7。再结合表4留一法交叉验证结果，隐层神经元为3时的平均预测结果劣于5和7，且超过了5％，无显著性意义。然而隐层神经元越多，越会脱离现实实际意义，且隐层神经元5和7平均拟合误差和平均预测误差极为接近，且都小于5％，有显著性意义。故综上所述，最终选取隐层神经元个数为5。
2.5R语言模式下遗传算法进行目标优化
基于R语言模式下遗传算法的基本思想，种群大小为800，接近的最大代数为100，最大不可变代数为10，收敛公差为1×10-3，其他参数均设为默认值。采用R语言的实数编码程序，由遗传算法寻优后得到的结果如下：总共运行了82代，运行时间为28s，运行到第82代时得到网络预测综合评价值为191.65，得到该结果的条件分别为：氨浓度0.62％，乙醇浓度64％，回流时间1.8h，液固比12∶1。
2.6提取工艺验证试验
按上述提取工艺条件，称取5g甘草药材，共3份，进行热回流提取实验，测定甘草中甘草皂苷和甘草总黄酮的含量。结果见表5。由表5可知，其平均综合评价值为188.90，网络预测值为191.65，实验测量值和网络预测值的相对误差为1.43％。优化后提取工艺的测量值结果与预测值吻合度较高，说明模型具有较好的网络预测性。
表5最佳工艺下的验证试验
3分析与讨论
3.1试验因素的选取与确定
据相关文献报道和药材本身特点，提取溶剂、提取温度、回流时间、回流次数、氨醇氨浓度、氨醇中乙醇浓度、液固比等均为影响甘草中甘草皂苷和甘草总黄酮提取的重要影响因素。
故对上述条件因素依次进行单因素实验，分别考察了提取溶剂蒸馏水、稀氨(0.5％)、稀醇(30％)、乙醇(75％)、氨醇(含氨0.5％的30％乙醇)，提取温度55、65、75、85、95℃，回流时间0.5、1、1.5、2、2.5h，回流次数1、2、3、4、5次，氨醇氨浓度0.3、0.4、0.5、0.6、0.7％，氨醇醇浓度30、45、60、75、90％，液固比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1，发现提取溶剂氨醇、回流时间、氨醇氨浓度、氨醇氨醇浓度、液固比对甘草皂苷和甘草总黄酮提取影响最大，依据预实验结果选取氨醇氨浓度0.6％、氨醇氨醇浓度60％、回流时间2h、液固比11∶1为中心组合设计的中心点。且提取温度85℃、回流次数3次两者再往上增加时，提取的效率增幅缓慢，从绿色、经济、环保等角度考虑，将提取温度和回流次数分别确定为80℃和3次。
3.2测定指标的选取与确定
相关文献记载报道，甘草中富含三萜类、黄酮类和多糖等化学成分，具有抗菌与抗病毒活性、抗氧化、保肝等作用，在中医药临床中有着广泛的应用。大量的研究表明，甘草皂苷和黄酮类物质是甘草中最重要的生理活性物质，甘草皂苷具有抗炎、抗变应性炎症等作用，甘草黄酮类物质具有增强记忆力等作用。故以甘草皂苷和甘草黄酮类化合物为典型代表，作为提取测定指标，为甘草中有效部位的质量评价和质量控制提供参考。
3.3模型的选取与确定
响应面试验中，研究者们常采用中心组合设计(CCD)和Box-Benhnken设计(BBD)。然而在相同的因素水平条件下BBD所需的试验次数比CCD少，即CCD比BBD试验能更好的拟合响应曲面，从而能得到较为全面的试验结果，故本研究选择CCD试验模型。
CCD试验后，响应面软件采用多元回归拟合进行数据处理和分析。然而相关文献报道，多元回归拟合精度、效果上劣于神经网络和遗传算法的组合模型。神经网络结合遗传算法模型具有可以进行多个个体同时比较，潜在的并行性，高度准确的预测性，鲁棒性好，能充分逼近复杂的因变量与自变量之间非线性关系等优点。结果显示平均综合评价值为188.90，网络预测值为191.65，实验测量值和网络预测值的相对误差为1.43％。优化后提取工艺的测量值结果与预测值吻合度较高，说明模型具有较好的网络预测性。
本文采用R语言环境下神经网络结合遗传算法对CCD试验结果进行工艺优化和目标寻优，在中药有效物质提取工艺中的运用还鲜有报道。该模型简单易懂、快捷、准确，为甘草乃至中药提取工艺优化提供了新的参考和依据。

Claims (10)

1.一种基于R语言的同时提取甘草中皂苷和总黄酮的优化提取工艺，其特征在于所述工艺包括以下步骤：
(1)设计提取条件的因素水平，以甘草提取中的不同控制参数为因子，按照中心组合试验设计条件安排因子组合设计实验，并进行提取，检测其中的皂苷和总黄酮含量；
(2)使用R语言进行熵权法编程，计算权重值，分别得到甘草皂苷和甘草总黄酮的权重系数，然后甘草皂苷和总黄酮的含量各自乘以其权重系数，得到综合评价值；
(3)采用3层结构的BP神经网络进行建模，输入节点数为不同因子；输出节点数为1个，即综合评价值；将中心组合设计实验的数据分别进行全数据交叉验证和留一法交叉验证，进行神经元的训练，对不同隐层神经元的个数进行模型的测试训练，以拟合误差和预测误差作为对隐层神经元选取的依据，选取最优的隐层神经元个数；
(4)采用R语言的实数编码程序，由遗传算法寻优得到最佳的综合评价值及其对应的因子水平；
(5)根据最优综合评价值对应的控制参数因子水平，在最优化条件下提取甘草中的皂苷和总黄酮，按照步骤(2)的权重系数计算实际综合评价值，与网络预测值相比较，验证模型的可靠性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，采用氨醇溶液回流法进行优化，所述氨醇溶液为氨的乙醇溶液，选取提取溶剂氨醇溶液中的氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比为四个因子，进行中心组合试验设计。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，甘草提取的工艺为：称取甘草药材，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入氨醇溶液，在80℃下加热回流提取，重复提取3次，放冷至室温，抽滤，即得提取液；氨醇溶液中的氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比根据因子设计水平确定。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述提取液旋转蒸发至近干，用适量的60％乙醇溶解，转入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，用分光光度计分别在252nm和510nm处检测吸光度，与甘草酸标准曲线或芦丁标准曲线比较，分别计算得到甘草皂苷和总黄酮的含量，甘草皂苷的含量＝甘草皂苷的量/甘草生药量，总黄酮的含量＝总黄酮的量/甘草生药量。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，输入节点数为4个，分别为氨浓度、乙醇浓度、回流时间、液固比。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，采用留一法交叉验证进行神经元的训练时，初始随机权为0.1，参数重量衰变为5×10-3，最大迭代次数为800，其他参数设为默认值。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，最优的隐层神经元个数为5。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)、(4)中采用R version 3.1.1软件、熵权法、神经网络模型代码和遗传算法rgenoud工具包进行BP神经网络的建模和遗传算法的计算。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，遗传算法寻优时，将中心组合试验的各因子水平和综合评价值输入R语言程序，设定种群大小为800，接近的最大代数为100，最大不可变代数为10，收敛公差为1×10-3，其他参数均设为默认值。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(4)经遗传算法寻优得到的最优工艺为：氨浓度0.62％，乙醇浓度64％，回流时间1.8h，液固比12∶1。
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