CN115372536B - 离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法及应用,根据与菊粉标准品保留因子值对照推断得出黄原胶降解产物中单糖、寡糖和多糖的分布各峰,计算标准品聚合度与保留因子值,并建立关联数学方程;然后计算黄原胶降解产物中未知峰保留因子,并代入上述关联数学方程得出聚合度,从而实现对混合物的定性检测。该方法无需衍生化,即可完成对系列化合物定性,解决了目前必须采用多种检测技术、多种仪器、多种前处理方法才能完成多种组分测定时效率低的技术难题,大幅提高了检测效率,降低了检测成本。可广泛应用于食品安全、生物医药等产业中黄原胶寡糖及多糖产品的聚合度评价,并且参照该法可建立其他成系列化合物的辅助定性方法。
Description
技术领域
本发明涉及离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法及应用,属于糖类化合物检测技术领域。
背景技术
糖类化合物的检测在业内一直是一项具有挑战性的工作,杂多糖的降解产物分析由于其复杂的结构特征使准确分析更具难度。黄原胶是一种由黄单胞杆菌发酵产生的细胞外酸性杂多糖,是由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸按2:2:1组成的多糖类高分子化合物,相对分子质量在100万以上。黄原胶的二级结构是侧链绕主链骨架反向缠绕,通过氢键形成棒状双螺旋结构;黄原胶的降解产物具有良好的生理活性,其产物为聚合度分散、侧链结构多样的单糖、寡糖和多糖混合物;黄原胶寡糖是一种通过降解黄原胶主链产生的新型低聚糖,其具有良好的生理活性,在植物疫苗和生物肥料等领域具有潜在应用价值。由于分离纯化及检测方法的限制,并且无相关的商业化标准品,目前黄原胶降解产物的活性研究均以混合物为研究对象,因此建立有效的黄原胶降解产物检测手段对我国黄原胶寡糖活性研究具有重要意义。
目前测定糖类物质的主要方法有氧化还原滴定法、比色法、气相色谱法、高效液相色谱法、高效离子色谱法,糖类不同检测方法的比较见表1。化学法存在操作繁琐,灵敏度低的缺点,并且只能测定糖的总量而不能分析测定其中各种糖的含量。气相色谱法及气相色谱质谱联用法可测定各种糖的含量,但是因为糖的挥发性低,气化效果不佳,必须对糖进行烷化或者酯化等预处理,故容易改变被测组分的性质。高效液相色谱法一般使用示差折光检测器,存在灵敏度低、基线稳定性受温度影响大,且不适用于梯度洗脱等问题。综上,由于糖类的强极性、无发色基团和荧光基团,在使用常规检测器(如紫外检测器,荧光检测器等)时,需要对糖类进行衍生化,衍生化过程常常伴随操作繁琐、耗时,不可避免地会引入误差。
高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)检测糖是近年来发展起来的新方法,在糖及相关化合物的分析中展现出独特的优势,高效离子色谱法利用中性糖在解离常数pKa为12~14之间的弱酸性,在高pH值的淋洗液中,它能够部分或全部以阴离子形式存在,可以吸附在阴离子交换柱上,并被不同浓度的碱溶液洗脱,配合脉冲安培检测器可实现糖类的梯度洗脱及高灵敏度检测。该方法具有分离能力强,灵敏度高,选择性好等优点,无需衍生就能分析多种糖类物质;操作简便,无需复杂样品前处理,更突出的优势是无需衍生化,而且具有极高的灵敏度,通常可以检测到pmol级的糖类物质。
表1糖类不同检测方法的比较
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷,本发明针对目前糖类化合物的检测存在衍生化操作繁琐,耗时、分离度低、灵敏度低、重现性差,线性范围小等缺点;提供了一种无需衍生反应即可直接检测的方法,更加直接方便,能够使检测结果更准确、灵敏,可实现快速分析和绿色分析。
为实现上述发明目的,本发明提供了离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法,包括如下步骤:
①配制菊粉标准品储备液:将至少两种不同聚合度范围菊粉标准,配制成浓度为2mg/ml菊粉标准品的储备液。
②黄原胶降解产物样品的制备:取5g黄原胶溶于500mL浓度为0.3-0.5mol/L的盐酸溶液中,向上述反应体系中加入2.5g离子液体,充分搅拌使黄原胶溶解,然后加入12.5mL浓度为20-40g/ml的过氧化氢H2O2;将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d后取出;用4M NaOH将溶液的pH调节至中性;而后将上述反应体系放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中,并将透析袋放入纯水中进行透析,透析结束后冻干得到黄原胶降解产物样品。
③配制样品储备液:称取步骤②获得的10mg黄原胶降解产物样品,用超纯水溶解并定容于5ml容量瓶中,配制成浓度为2mg/ml的样品储备液。
④利用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPAEC-PAD)检测步骤①制备的菊粉标准品储备液和步骤③制备的样品储备液,所述检测过程中采用多级梯度洗脱程序进行洗脱;所述多级梯度洗脱程序包括洗脱单糖双糖、洗脱寡糖及多糖、冲洗柱中残留基质、色谱柱平衡四部分。
⑤根据步骤④测得的黄原胶降解产物与菊糖标准品保留时间对照推断得出黄原胶降解产物中单糖、寡糖和多糖的分布各峰,计算菊糖标准品聚合度DP与其保留因子k值,并建立关联数学方程,然后计算黄原胶降解产物混合物中未知峰保留因子,把未知峰的保留因子代入上述关联数学方程计算出黄原胶降解产物中寡糖和多糖未知峰的聚合度,从而实现对所述黄原胶降解产物混合物的定性检测。
步骤①中所述菊粉标准样品的不同聚合度范围为DP2-DP10和DP20-DP50;步骤②中所述离子液体为氯化-1-丁基-3-甲基咪唑;步骤②所述的黄原胶降解产物包括黄原胶寡糖和多糖。步骤④所述的多级梯度洗脱程序具体为:采用超纯水作为流动相A,200mM NaOH溶液作为流动相B,1M NaAc溶液作为流动相C;0-90min期间,B一直保持体积比为50%;0-10min,49%A、1%C洗脱单糖双糖;10-35min,44.5%A、5.5%C洗脱寡糖及多糖;35-60min,22.5%A、27.5%C洗脱寡糖及多糖;60-80min,50%C冲洗柱中残留基质;80.1-90min,49%A、1%C色谱柱平衡。
步骤⑤所述的保留因子k与保留时间之间具有如下关系:k=t'R/t0,t'R=tR-t0;其中tR为组分保留时间,t0为不保留组分的保留时间,t'R为组分在固定相中停留的时间。上式说明一个组分在固定相中停留的时间(t'R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍;k=0时,化合物全部存在于流动相中,在固定相中不保留,t'R=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。通过保留因子的使用,消除了不同仪器间、不同保留时间造成的误差。
步骤⑤所述的关联数学方程为非线性对数方程:y=aln(x)+b,其中a为实数参数,b为常数,x是特定聚合度下菊糖标准品的保留因子值,y是相应聚合度下黄原胶降解产物的保留因子值。
一种所述的方法,应用于食品安全、生物医药产业中黄原胶降解产物中聚合度的评价。
一种所述的方法,当其他系列化合物具有黄原胶寡糖和多糖的检测特性时,适用于所述的其他系列化合物的定性检测。
上述技术方案中,优选的,所述步骤②黄原胶降解产物样品的制备中,盐酸溶液的浓度为0.4mol/L,过氧化氢的浓度为30g/ml。
上述技术方案中,优选的,所述离子色谱定性检测方法适合于黄原胶降解产物中聚合度2-45的糖类化合物。
上述技术方案中,优选的,所述方法应用于黄原胶的化学法、酶法等降解产物中寡糖和多糖的检测。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明采用离子色谱技术,在没有商业化黄原胶寡糖标准品的情况下,通过保留因子的使用,消除了不同仪器间、不同保留时间造成的误差,准确定性具有复杂取代基和侧链结构的复杂黄原胶寡糖混合物,并且有效规避了衍生化过程引入的误差。该方法只需要与菊粉标准品的保留时间对照,即可完成对系列化合物定性,与其他检测方式相比,可以检测黄原胶降解产物中的寡糖以及多糖,聚合度覆盖范围2-45,大大扩大了可检测的糖类化合物种类。其解决了目前采用多种检测技术、多种仪器、多种前处理方法进行多种组分测定时效率低的技术难题,大幅提高了检测效率,降低了检测成本。可广泛应用于食品安全、生物医药等产业中黄原胶寡糖及多糖产品的聚合度评价,并且参照该法可建立其他成系列化合物的辅助定性方法。
附图说明
图1为黄原胶降解产物A与菊糖标准品B的离子色谱对比图;
图2为黄原胶寡糖与菊糖标准品保留因子的关联性拟合结果(y=7.395ln(x)+6.481,R=0.99,其中x是特定聚合度下菊糖标准品的保留因子,y是相应聚合度下黄原胶寡糖的保留因子);
图3为黄原胶寡糖对诱导大豆子叶产生植保素的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不以任何方式限制本发明。仪器选用Thermo fisher公司的ICS-5000+离子色谱仪,柱子选用CarboPac PA100碳水化合物分析柱。黄原胶购于淄博中选生物有限公司;平均聚合度DP10的菊粉标准品为上海源叶生物科技有限公司生产,平均聚合度DP35的菊粉标准品为上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产;其他助剂均为市购。
实施例
①配制菊粉标准品储备液:取两种菊粉标准品,上海源叶生物科技有限公司生产的菊粉标准品(平均聚合度DP10)以及上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产的菊粉标准品(平均聚合度DP35),分别取上述两种菊粉标准品10mg用超纯水溶解并定容于5ml容量瓶中,配制成浓度为2mg/ml菊粉标准品的储备液。
②黄原胶降解产物样品的制备:采用过氧化氢降解方法,将5g黄原胶溶于500mL浓度为0.4mol/L的盐酸溶液中;将2.5g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑加入反应体系中,充分搅拌使黄原胶溶解,最后加入12.5mL浓度为30g/ml的过氧化氢H2O2;将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d,4d过后将反应体系取出;利用4M NaOH将溶液的pH调节至中性。而后将其放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中,并将透析袋放入纯水中进行透析,透析结束后冻干得到黄原胶降解产物样品。
③配制样品储备液:称取步骤②获得的黄原胶降解产物样品10mg,用超纯水溶解并定容于5ml容量瓶中,配制成浓度为2mg/ml的储备液。
④利用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPAEC-PAD)检测步骤①制备的菊粉标准品储备液和步骤③制备的样品储备液,所述检测过程中采用多级梯度洗脱程序进行洗脱;采用超纯水作为流动相A,200mM NaOH溶液作为流动相B,1M NaAc溶液作为流动相C;所述多级梯度洗脱程序具体如表2所示:
表2多级梯度洗脱程序
0-90min期间,B一直保持体积比为50%,Curve*5代表线性。使用以上色谱柱及淋洗液条件,流速为1ml/min,色谱柱及检测池温度为30℃,进样量25uL,ED50A电化学检测器配Au工作电极和Ag-AgCl参比电极,积分脉冲安培检测。
⑤根据步骤④测得的黄原胶降解产物与菊糖标准品保留时间对照推断得出黄原胶降解产物中单糖、寡糖和多糖的分布各峰,计算菊糖标准品聚合度DP与其保留因子k值,并建立关联数学方程,然后计算黄原胶降解产物混合物中未知峰保留因子,把未知峰的保留因子代入上述关联数学方程计算出黄原胶降解产物中寡糖和多糖未知峰的聚合度,从而实现对所述黄原胶降解产物混合物的定性检测。
黄原胶寡糖与菊糖标准品保留时间的具体信息,见表3。
表3黄原胶寡糖与菊糖在离子色谱中的保留时间
根据保留因子k与保留时间之间关系计算保留因子k值:k=t'R/t0,t'R=tR-t0;其中tR为组分保留时间,t0为不保留组分的保留时间,t'R为组分在固定相中停留的时间。
将上述计算得出的保留因子k值以步骤⑤所述的关联数学方程拟合,非线性对数方程:y=aln(x)+b,其中a为实数参数,b为常数,x是特定聚合度下菊糖标准品的保留因子值,y是相应聚合度下黄原胶降解产物的保留因子值。
结果:黄原胶寡糖与菊糖保留因子的关联性拟合结果:y=7.395ln(x)+6.481,R=0.99,其中x是特定聚合度下菊糖的保留因子,y是相应聚合度下黄原胶寡糖的保留因子,见表4。
表4黄原胶寡糖在离子色谱中的保留因子
采用大豆子叶法对黄原胶寡糖抗逆活性进行筛选。通过大豆子叶法测定黄原胶寡糖诱导大豆子叶组织产生植物抗毒素的活性。大豆种子用3%次氯酸钠溶液浸泡10min,再用无菌水冲洗干净。而后将种子放在湿滤纸上再盖上湿纱布。3d后将豆芽播种在光照培养箱中(光照:黑暗=12h:12h)交替培养7d。当长出两片真叶后剪下,用8%次氯酸钠溶液灭菌5min,然后用无菌水冲洗干净。用刀片在子叶外表皮切出1mm厚,6mm长的伤口,切好的子叶放入铺有湿滤纸培养皿中,每皿放10片。含有2mg/mL链霉素的不同浓度(1.0mg/mL,3.0mg/mL,5.0mg/mL,7.0mg/mL,10.0mg/mL)黄原胶寡糖样品溶液10μL加在伤口上。处理后的子叶在25℃黑暗的温箱中培养24h,将皿中的子叶转移到一个盛有10mL水的试管中,充分震荡后测定286nm处测定吸光值。每个样品三个平行。结果显示,经过离子色谱定性分析的聚合度在2-7的黄原胶寡糖浓度为5mg/mL时,诱导产生植保素的效果最好。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言,在不脱离本发明技术方案范围情况下,都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰,均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
①配制菊粉标准品储备液:将至少两种不同聚合度范围的菊粉标准品,配制成浓度为2mg/ml的菊粉标准品储备液;
②黄原胶降解产物样品的制备:将黄原胶溶于0.3-0.5mol/L的盐酸溶液中;向上述反应体系中加入离子液体,搅拌使黄原胶溶解,然后加入20-40g/ml的过氧化氢H2O2;将上述反应体系置于80℃的水浴锅中反应4d后取出;用4MNaOH将溶液的pH调节至中性;而后将上述反应体系放入截留分子量3500Da的多孔透析袋中,并将透析袋放入纯水中进行透析,透析结束后冻干得到黄原胶降解产物样品;
③配制样品储备液:称取步骤②获得的黄原胶降解产物样品,用超纯水配制成浓度为2mg/ml的样品储备液;
④利用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法检测步骤①制备的菊粉标准品储备液和步骤③制备的样品储备液,所述检测过程中采用多级梯度洗脱程序进行洗脱;所述多级梯度洗脱程序包括洗脱单糖双糖、洗脱寡糖及多糖、冲洗柱中残留基质、色谱柱平衡四部分;
所述的多级梯度洗脱程序具体为:采用超纯水作为流动相A,200mMNaOH溶液作为流动相B,1MNaAc溶液作为流动相C;0-90min期间,B一直保持体积比为50%;0-10min,49%A、1%C洗脱单糖双糖;10-35min,44.5%A、5.5%C洗脱寡糖及多糖;35-60min,22.5%A、27.5%C洗脱寡糖及多糖;60-80min,50%C冲洗柱中残留基质;80.1-90min,49%A、1%C色谱柱平衡;
⑤根据步骤④测得的黄原胶降解产物与菊粉标准品保留时间对照推断得出黄原胶降解产物中单糖、寡糖和多糖的分布各峰,计算菊粉标准品及黄原胶降解产物的保留因子k值,并建立关联数学方程,然后通过实验获得的黄原胶降解产物混合物中未知峰的保留因子,把未知峰的保留因子代入上述关联数学方程计算出黄原胶降解产物中寡糖和多糖未知峰的聚合度,从而实现对所述黄原胶降解产物混合物的定性检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤①中所述菊粉标准品的不同聚合度范围为DP2-DP10和DP20-DP50。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤②中所述离子液体为氯化-1-丁基-3-甲基咪唑。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤②所述的黄原胶降解产物包括黄原胶寡糖和多糖。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤⑤所述的保留因子k与保留时间之间有如下关系:k=t'R/t0,t'R=tR-t0;其中tR为组分保留时间,t0为不保留组分的保留时间,t'R为组分在固定相中停留的时间。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤⑤所述的关联数学方程为非线性对数方程:y=aln(x)+b,其中a为实数参数,b为常数,x是特定聚合度下菊糖标准品的保留因子值,y是相应聚合度下黄原胶降解产物的保留因子值。
7.一种如权利要求1所述的离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法,应用于食品安全、生物医药产业中黄原胶降解产物中聚合度的评价。
8.一种如权利要求1所述的离子色谱法定性检测黄原胶降解产物的方法,当其他系列化合物具有黄原胶寡糖和多糖的检测特性时,适用于所述的其他系列化合物的定性检测。
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