JP2016080542A - 多糖類の測定方法及び測定装置 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
しかしながら、これらの方法では、多糖類と発色試薬との反応により生じる反応物質の色調・蛍光性と同様の色調・蛍光性を有する多糖類以外の物質(夾雑物)を含む試料に対しては、正確な定量が行えないという問題点があった。
更に、SECを用いた後、示差屈折率検出器や、蒸発型光散乱検出器により検出する方法も報告されている(特許文献2、非特許文献3)。その他にも、SECを用いた後、比色定量する方法も報告されている(特許文献3)。
しかしながら、これらの方法では、非選択的な検出法により検出を行っているため、複雑なマトリックス中の多糖類を測定する際に、夾雑物の影響を受け易い。したがって、前処理や塩析操作などにより、事前に試料中の妨害成分を除去する必要があり、測定操作が非常に煩雑であるという問題点があった。
しかしながら、これらの方法では、多糖類を構成する糖を測定対象物とするため、元々の多糖類自体の平均分子量を測定することができないという問題点があった。
しかしながら、この方法では、グルコース、ガラクトース等の低分子の糖を定量することはできても、分子量が大きい糖に対しては十分な感度を得ることができず、正確な測定が行えないという問題点があった。また、多糖類の分子量の違いにより反応性が異なるという問題点もあった。
前記多糖類誘導体と、ポストラベル化試薬と、を反応させて前記多糖類誘導体を蛍光物質とするラベル化工程と、
前記蛍光物質を検出する検出工程と、
が少なくとも行われることにより、前記多糖類の平均分子量が測定される、多糖類の測定方法を提供する。
本技術に係る多糖類の測定方法においては、更に多糖類の含有量が測定されることを態様としている。
また、前記ラベル化工程における設定温度は特に限定されないが、150℃以上で行われることを態様としている。
更に、前記誘導体化工程と前記ラベル化工程とは、同時に行われることを態様としている。
加えて、前記測定は、高速液体クロマトグラフ法により行われることを態様としている。
本技術に係る多糖類の測定方法において、測定対象物である多糖類は特に限定されないが、高分子多糖類を測定対象物とすることができる。
また、前記高分子多糖類も特に限定されないが、ヒアルロン酸を測定対象物とすることもできる。
前記多糖類中のヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化することが可能な酸化剤を収容する酸化剤収容部と、ポストラベル化試薬を収容するポストラベル化試薬収容部と、を一つの収容部として備える反応試薬供給装置と、
蛍光物質を検出するための蛍光検出器と、
前記分離カラムと前記反応試薬供給装置とを連結する連結部と、前記蛍光検出器と、の間に備えられ、加熱反応を行うための加熱反応管と、
前記蛍光検出器の下流に、排圧を付与するための排圧調整器と、
が備えられた多糖類の測定装置を提供する。
本技術に係る多糖類の測定方法は、誘導体化工程と、ラベル化工程と、検出工程と、が少なくとも行われることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定方法を用いることにより、簡便かつ高感度で多糖類を測定することができる。また、定量性・再現性に優れた測定結果を得ることができ、更には使用者の利便性も向上する。以下、各工程について、詳細に説明する。
本技術において、誘導体化工程とは、多糖類と、前記多糖類中のヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化することが可能な酸化剤と、を反応させて前記多糖類を多糖類誘導体とする工程である。
また、本技術において、「低分子多糖類」とは、約1万未満の平均分子量を有する多糖類をいう。低分子多糖類としては、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、スタキオースなどが知られている。
従来技術では、前述の通り、高分子多糖類に対しては十分な感度を得ることができなかった。しかしながら、生体試料、医薬品、食品、化粧品などに含まれている高分子多糖類を正確に定量する技術は以前から需要が多いことが知られており、本技術は、簡便かつ高感度で高分子多糖類を定量できるため、非常に有用である。
また、使用者の利便性及び反応性の観点から、ホウ酸緩衝液に溶解して用いることが好ましい。
本技術において、ラベル化工程とは、多糖類誘導体と、ポストラベル化試薬と、を反応させて前記多糖類誘導体を蛍光物質とする工程である。
感度が低い等の理由により測定対象物がそのまま分析できない場合、感度を上げるために測定対象物を誘導化する方法がある。測定対象物を誘導化する方法には、プレラベル法とポストラベル法があり、本技術に用いられるポストラベル法は、試料を分離した後に誘導化する方法である。
また、使用者の利便性及び反応性の観点から、緩衝液に溶解して用いることが好ましい。
また、使用者の利便性及び反応性の観点から、当該溶液は、ホウ酸緩衝液に溶解して用いることが好ましい。
更に、酸化剤として過ヨウ素酸、ポストラベル試薬としてグアニジン/ホウ酸を選択した場合、これらの溶液中の濃度も特に限定されないが、多糖類との反応効率を考慮して、過ヨウ素酸の濃度を0.05〜50mM、グアニジンの濃度を0.5〜500mM、ホウ酸の濃度を1〜500mMとすることが好ましく、過ヨウ素酸の濃度を0.1〜5mM、グアニジンの濃度を1〜150mM、ホウ酸の濃度を10〜300mMとすることがより好ましい。
本技術において、検出工程とは、蛍光物質を検出する工程である。
従来技術では、前述の通り、元々の多糖類自体の平均分子量を正確に測定できなかった。しかしながら、本技術によれば、多糖類自体の元々の平均分子量を、高感度で測定することができる。
なお、クロマトグラムから多糖類の平均分子量を測定する方法の詳細については、後述する実施例にて説明する。
なお、多糖類の平均分子量に基づき、含有量を測定する方法の詳細についても、後述する実施例にて説明する。
高速液体クロマトグラフ法とは、物質が固定相(分離カラム)とこれに接して流れる移動相(液体)との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なることを利用して分離する分析手法である。多糖類の測定を高速液体クロマトグラフ法により行うことで、高い分離及び感度を得ることができ、測定精度が向上する。また、ルーチン分析にも向いており、使用者の利便性や、測定時のコストダウンにも貢献できる。
図1は、本技術に係る多糖類の測定装置の一例を示す模式図である。
本技術に係る多糖類の測定装置は、分離カラム1、反応試薬供給装置2、蛍光検出器3、加熱反応管4及び排圧調整器5を備えることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置を用いることにより、簡便かつ高感度で多糖類を測定することができる。また、多糖類と反応する反応試薬の連続的な供給に好適である。
以下、各部位について、詳細に説明する。
分離カラム1は、試料中の多糖類と前記多糖類以外の物質とを分離するための部位であり、その下流に後述する反応試薬供給装置2が連結されていることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置が分離カラム1を備えることにより、試料中の多糖類と前記多糖類以外の物質とをより正確に分離することができ、これに伴い測定精度も向上する。
反応試薬供給装置2は、反応試薬を供給するための部位であり、酸化剤収容部21と、ポストラベル化試薬収容部22と、を一つの収容部として備えることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置が反応試薬供給装置2を備えることにより、多糖類と反応する反応試薬の連続的な供給を行うことができ、使用者の利便性が向上する。
蛍光検出器3は、蛍光物質を検出するための部位であり、後述する加熱反応管4の下流に備えられていることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置が蛍光検出器3を備えることにより、蛍光物質の検出までを連続的に行うことができ、使用者の利便性が向上する。
加熱反応管4は、加熱反応を行うための部位であり、前述した分離カラム1及び反応試薬供給装置2の連結部と、蛍光検出器3と、の間に備えられていることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置が加熱反応管4を備えることにより、加熱反応を行うことができるため、多糖類と反応試薬との反応効率が向上し、これに伴い測定精度も向上する。
排圧調整器5は、排圧を付与するための部位であり、前述した蛍光検出器3の下流に備えられていることを特徴とする。本技術に係る多糖類の測定装置が排圧調整器5を備えることにより、泡の発生を抑制することができ、測定精度が向上する。より具体的には、加熱反応管4において試料溶液が高温に加熱されることで泡が発生し、この泡が蛍光検出器3での蛍光物質の検出を妨害するため、排圧調整器5により排圧を付与することでこの泡を除去し、蛍光物質の検出を高感度で行うことが可能となる。
本技術に係る多糖類の測定装置は、必要に応じて、移動相供給装置6を備えることもできる。移動相供給装置6は、移動相を供給するための部位であり、移動相収容部61と、移動相供給装置用送液ポンプ62と、を備えている。本技術に係る多糖類の測定装置が移動相供給装置6を備えることにより、移動相の連続的な供給を行うことができ、使用者の利便性が向上する。
本技術に係る多糖類の測定装置は、必要に応じて、試料注入装置7を備えることもできる。試料注入装置7は、多糖類を含む試料を注入するための部位であり、前述した移動相供給装置6の下流に備えられている。本技術に係る多糖類の測定装置が試料注入装置7を備えることにより、正確な量の試料を注入することができ、測定精度が向上する。
本技術に係る多糖類の測定装置は、必要に応じて、冷却管8を備えることもできる。冷却管8は、蛍光物質を冷却するための部位であり、前述した加熱反応管4の下流に備えられている。本技術に係る多糖類の測定装置が冷却管8を備えることにより、蛍光物質が高温となり、検出に適合しない場合などにおいて、低温にて蛍光物質を検出することを可能とする。したがって、自然に、或いは他の方法により、検出の適温範囲内の一定温度に冷却可能な場合には、冷却管8を備える必要はない。
本技術に係る多糖類の測定装置は、必要に応じて、データ処理装置9を備えることもできる。データ処理装置9は、前述した蛍光検出器3から得られるデータ(クロマトグラム)を処理するための部位であり、蛍光検出器3に接続されている。本技術に係る多糖類の測定装置がデータ処理装置9を備えることにより、検量線を予め作成しておき、ピーク面積から多糖類を精度良く定量できる。また、ノイズのピークの高さの平均値:Nを求め、シグナルとして検出される試料中の測定対象物のピークの高さの値:Sより、感度の指標となるS/N比を求めることもできる。なお、得られたクロマトグラム中のピークの同定は、市販されている標準物質のピークの保持時間と比較することにより行うことができる。
試験例1では、本技術に係る多糖類の測定方法を用いて、検量線を作成した。
多糖類(ヒアルロン酸)の標準品(中原社製)を、精製水(ミリポア社製)を使用して希釈し、100ppm(100ng/μl)の水溶液を調製し、これを試料溶液として用いた。
前記試料溶液の注入容積を、0.5〜100μlの範囲で変更して注入し、後述する試験例3に示す測定方法及び測定装置を用いて、ヒアルロン酸量:0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、5μg及び10μgにおけるピーク面積を測定した。
得られた試験結果を図2に示す。図2に示す検量線において、縦軸はピーク面積、横軸はヒアルロン酸量を示す。
ヒアルロン酸量が0.05〜10μgの範囲で、良好な直線性(相関係数:γ=0.999)を有する、下記式(1)で表される検量線が得られることが判明した。なお、下記式(1)において、Xはヒアルロン酸量、Yはピーク面積を示し、A及びBは定数である。
試験例2では、本技術に係る多糖類の測定方法において、誘導体化工程及びラベル化工程を同時に行った場合の設定温度について、検討を行った。
データ処理装置(島津製作所製:Class LC−10)を使用して、ノイズのピークの高さの平均値:Nを求め、シグナルとして検出される試料溶液中に一定量:15ngのヒアルロン酸を含有するピークの高さの値:Sを求めた。これら2つの値から、S/N比を算出し、これを感度の指標とした。
なお、本技術に係る多糖類の測定方法において、多糖類としてヒアルロン酸を選択した場合の検出限界は15ngであることが予め判明しているため、前記一定量として検出限界の値を用いた。
多糖類(ヒアルロン酸)の標準品(中原社製)を、精製水(ミリポア社製)を使用して溶解し、500ppmの水溶液を調製し、これを試料溶液として用いた。
前記試料溶液を20μl(ヒアルロン酸量として10μg)注入し、後述する試験例3に示す測定方法及び測定装置を用いて、設定温度の範囲を100℃〜180℃とした場合の感度の指標(S/N比)を算出した。
なお、前述の通り、設定温度の上限は反応を阻害することがない限り特に限定されないが、測定装置に使用した素材の特性を鑑みて、試験例2においては上限を180℃に設定した。
得られた試験結果を図3に示す。図3に示すグラフにおいて、縦軸はS/N比を示し、横軸は設定温度を示す。
感度の指標となるS/N比が、設定温度を100℃とした場合と比較して、150℃以上の温度で2倍以上となった。したがって、高感度かつ高精度で多糖類を測定するためには、設定温度を少なくとも150℃以上とすることが好ましいことが判明した。また、図3に示すグラフからも明らかなように、設定温度を160℃以上、170℃以上とする毎に、感度が高くなることも判明した。
試験例3では、本技術に係る多糖類の測定方法及び測定装置を用いて、試料中の多糖類を測定した。
試験例3においては、図1に示す多糖類の測定装置を用いた。
当該測定装置の詳細について、以下に記載する。
・分離カラム:分離カラム用恒温槽(島津製作所製)に収容され、TSKgelG5000 PWXL、TSKgelG6000 PWXL及びPLRP−S1000Åの3本を連結したもの
・反応試薬供給装置:酸化剤及びポストラベル化試薬の収容部(遮光ガラス瓶、岩城硝子社製)及び反応試薬供給装置用送液ポンプ(定量ポンプ、島津製作所社製:LC−10AD)から構成
・蛍光検出器:分光蛍光検出器、島津製作所製
・加熱反応管:加熱反応管用恒温槽(ドライ反応槽、島村計器製作所製:DB−5)に収容されたピークチューブ、GLサイエンス社製:内径0.5mm×長さ10m
・排圧調整器:UPCHURCH SCIENTIFIC社製
・移動相供給装置:移動相収容部(遮光ガラス瓶、岩城硝子社製)及び移動相供給装置用送液ポンプ(定量ポンプ、島津製作所製:LC−10AD)から構成
・試料注入装置:島津製作所製
・冷却管:テフロンチューブ、GLサイエンス社製:内径0.5mm×長さ2m
・データ処理装置:島津製作所製:Class LC−10
食品用ヒアルロン酸(中原社製)を試料とし、カラム内温度を40℃に設定した分離カラムに、前記試料10μlを試料注入装置により注入した。
これに対して、塩化ナトリウム及びアセトニトリル(国産化学社製)で調製した水溶液からなる移動相を、移動相供給装置により0.8ml/分の流速で連続的に供給し、ヒアルロン酸を溶出させ、分離した。
得られた試験結果(クロマトグラム)を、図4に示す。図4に示すグラフにおいて、縦軸は蛍光検出器の出力、横軸は保持時間を示す。
ここで、図5に示すグラフは、試験例3に示す測定方法及び測定装置を用い、標準物質(R&D社製、分子量:154万、21.5万、2.9万及び0.75万)を測定して予め作成した、ピークの保持時間と分子量との関係を示すグラフである。図5に示すグラフにおいて、縦軸は分子量の対数、横軸は保持時間を示す。
11:分離カラム用恒温槽
2:反応試薬供給装置
21:酸化剤収容部
22:ポストラベル化試薬収容部
23:反応試薬供給装置用送液ポンプ
3:蛍光検出器
4:加熱反応管
41:加熱反応管用恒温槽
5:排圧調整器
6:移動相供給装置
61:移動相収容部
62:移動相供給装置用送液ポンプ
7:試料注入装置
8:冷却管
9:データ処理装置
Claims (8)
- 多糖類と、前記多糖類中のヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化することが可能な酸化剤と、を反応させて前記多糖類を多糖類誘導体とする誘導体化工程と、
前記多糖類誘導体と、ポストラベル化試薬と、を反応させて前記多糖類誘導体を蛍光物質とするラベル化工程と、
前記蛍光物質を検出する検出工程と、
が少なくとも行われることにより、前記多糖類の平均分子量が測定される、多糖類の測定方法。 - 更に前記多糖類の含有量が測定される、請求項1に記載の多糖類の測定方法。
- 前記ラベル化工程は、150℃以上で行われる、請求項1又は2に記載の多糖類の測定方法。
- 前記誘導体化工程と前記ラベル化工程とは同時に行われる、請求項1から3のいずれか一項に記載の多糖類の測定方法。
- 前記測定は、高速液体クロマトグラフ法により行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の多糖類の測定方法。
- 前記多糖類は、高分子多糖類である、請求項1から5のいずれか一項に記載の多糖類の測定方法。
- 前記高分子多糖類は、ヒアルロン酸である、請求項6に記載の多糖類の測定方法。
- 試料中の多糖類と、前記多糖類以外の物質と、を分離するための分離カラムと、
前記多糖類中のヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化することが可能な酸化剤を収容する酸化剤収容部と、ポストラベル化試薬を収容するポストラベル化試薬収容部と、を一つの収容部として備える反応試薬供給装置と、
蛍光物質を検出するための蛍光検出器と、
前記分離カラムと前記反応試薬供給装置とを連結する連結部と、前記蛍光検出器と、の間に備えられ、加熱反応を行うための加熱反応管と、
前記蛍光検出器の下流に、排圧を付与するための排圧調整器と、
が備えられた多糖類の測定装置。
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