JPH0429058A - 糖類の分析方法および分析装置 - Google Patents
糖類の分析方法および分析装置Info
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、糖類の分析方法および分析装置に係り、特に
糖類を含有する試料を液体クロマトグラフィーで成分分
離して反応せしめ、反応液を光学的に測定する分析方法
および分析装置に関する。
糖類を含有する試料を液体クロマトグラフィーで成分分
離して反応せしめ、反応液を光学的に測定する分析方法
および分析装置に関する。
液体クロマトグラフィーにより糖類を含む試料を成分分
離して光学的に測定する方法として古くから行われてい
る方法は示差屈折計を用いるものである。他の方法とし
て、″第３３回液体クロマトグラフ研究会講演要旨集、
第１５〜１６頁（平成２年１月）”には、糖類をりん酸
−アニリン法を適用してクロマトグラフィー分析するこ
とが示されている。また、特開昭５７−１１６２５６号
には、モノエタノールアミン又はタウリンを含有するホ
ウ酸水溶液を分離カラムからの溶出液に混合し、加熱反
応を行ったあと吸光度測定して糖類を分析することが示
されている。
離して光学的に測定する方法として古くから行われてい
る方法は示差屈折計を用いるものである。他の方法とし
て、″第３３回液体クロマトグラフ研究会講演要旨集、
第１５〜１６頁（平成２年１月）”には、糖類をりん酸
−アニリン法を適用してクロマトグラフィー分析するこ
とが示されている。また、特開昭５７−１１６２５６号
には、モノエタノールアミン又はタウリンを含有するホ
ウ酸水溶液を分離カラムからの溶出液に混合し、加熱反
応を行ったあと吸光度測定して糖類を分析することが示
されている。
示差屈折法は、ステップワイズ溶離法やグラジェント溶
離法を適用し難く、測定感度が低いため。
離法を適用し難く、測定感度が低いため。
迅速分析の達成および微量成分の検出が難しいという問
題を有する。りん酸−アニリン法は、迅速分析が可能で
あるが、反応性に乏しく、特に蛍光検出感度が低いため
微量の糖類の測定が困難である。特開昭５７−１１６２
５６号に記載された方法は、シュークロースやラフィノ
ースなどの非還元糖を検出するのが困難である。
題を有する。りん酸−アニリン法は、迅速分析が可能で
あるが、反応性に乏しく、特に蛍光検出感度が低いため
微量の糖類の測定が困難である。特開昭５７−１１６２
５６号に記載された方法は、シュークロースやラフィノ
ースなどの非還元糖を検出するのが困難である。
本発明の目的は、微量の糖類を高感度検出することがで
き、且つ非還元糖をも検出することができる糖類の分析
方法および分析装置を提供することにある。
き、且つ非還元糖をも検出することができる糖類の分析
方法および分析装置を提供することにある。
本発明では、分離カラムによって試料中の糖成分を分離
し、分離カラムからの溶出液にフェニルヒドラジンおよ
びりん酸を含む反応試薬液を加える。ラベル化反応時に
は混合液が流通される反応流路部を１３０℃〜１８０’
ｌ：の温度に維持する。
し、分離カラムからの溶出液にフェニルヒドラジンおよ
びりん酸を含む反応試薬液を加える。ラベル化反応時に
は混合液が流通される反応流路部を１３０℃〜１８０’
ｌ：の温度に維持する。
反応流路部の下流に設けた反応液検出器によって反応液
に基づく蛍光又は吸光を測定する。
に基づく蛍光又は吸光を測定する。
分離カラム内には、既知の糖成分分離用充填剤が充填さ
れている。糖類を含有する試料を分離カラムによって成
分分離したあと、糖成分をボストラベル化反応をさせる
。糖成分とフェニルヒドラジンとの反応は、例えば次の
ように示される。
れている。糖類を含有する試料を分離カラムによって成
分分離したあと、糖成分をボストラベル化反応をさせる
。糖成分とフェニルヒドラジンとの反応は、例えば次の
ように示される。
Ｈ−Ｃ−○Ｈ
−Ｃ−ＯＨ
ＨｘＯＨ
Ｈ２ＯＨ
（ａ、糖）
（ｂ、フェニルヒドラゾン）
（ｃ、中間生成物）
（ｄ、オサゾン） （ｅ、
オソン）検出器に導かれる反応液中には、上述した式中
のａ ’＝ ｅの物質が共存していると考えられるが、
これらの内置光発光に寄与するのは、ｂ、ｃ、ｄなどの
物質である。本発明を適用した方法および装置では、分
離カラムから溶出した分離糖成分が溶離液の流れの中で
バンド状に存在するが１分離カラムの下流においてフェ
ニルヒドラジンとの反応をする（ボストラベル化反応）
ため、反応によって複数種の物質が生成されてもそれら
が混在した状態で１つのピークとして検出される。
オソン）検出器に導かれる反応液中には、上述した式中
のａ ’＝ ｅの物質が共存していると考えられるが、
これらの内置光発光に寄与するのは、ｂ、ｃ、ｄなどの
物質である。本発明を適用した方法および装置では、分
離カラムから溶出した分離糖成分が溶離液の流れの中で
バンド状に存在するが１分離カラムの下流においてフェ
ニルヒドラジンとの反応をする（ボストラベル化反応）
ため、反応によって複数種の物質が生成されてもそれら
が混在した状態で１つのピークとして検出される。
このようなボストラベル化反応は、１３０℃以上の温度
において著しく促進される。しかしながら、温度が１８
０℃を越えると気泡が発生しやすくなり測定結果に悪影
響をもたらす。フェニルヒドラジンによる反応を生じせ
しめる際には、りん酸を含む液の使用が好適であり、特
に好ましくはりん酸と酢酸を含有する液が強酸効果をも
たらすので有用である。
において著しく促進される。しかしながら、温度が１８
０℃を越えると気泡が発生しやすくなり測定結果に悪影
響をもたらす。フェニルヒドラジンによる反応を生じせ
しめる際には、りん酸を含む液の使用が好適であり、特
に好ましくはりん酸と酢酸を含有する液が強酸効果をも
たらすので有用である。
フェニルヒドラジンとの反応によって生成された糖成分
由来物質は、蛍光測定できるばかりでなく、吸光測定を
することもできる。またこのような反応は通常の還元糖
ばかりでなく、シュークロースなどの非還元糖に及ぶ。
由来物質は、蛍光測定できるばかりでなく、吸光測定を
することもできる。またこのような反応は通常の還元糖
ばかりでなく、シュークロースなどの非還元糖に及ぶ。
従って、本発明は大部分の糖類の検出に適用できる。
本発明に基づ〈実施例を第１図および第２図を参照して
説明する。
説明する。
第１図において、溶離液槽１内には溶離液Ａが収容され
ており、溶離液槽２内には溶離液Ｂが収容されている。
ており、溶離液槽２内には溶離液Ｂが収容されている。
また、液槽３内にはカラム再生液が収容されている。溶
離液ＡおよびＢの組成を表１に示す。分離カラム７は、
温度が７０℃に維持される恒温槽６内に配置され保温さ
れる。分離カラム７内には、糖類分離用充填剤としてポ
ーラスポリマ形の陰イオン交換樹脂（例えば、日立ゲル
＃３０１３Ｎ）が充填されている。分離カラムを形成す
る円筒は、内径が４ｍで長さが５０ｍ＋＋の大きさのス
テンレス鋼製である。
離液ＡおよびＢの組成を表１に示す。分離カラム７は、
温度が７０℃に維持される恒温槽６内に配置され保温さ
れる。分離カラム７内には、糖類分離用充填剤としてポ
ーラスポリマ形の陰イオン交換樹脂（例えば、日立ゲル
＃３０１３Ｎ）が充填されている。分離カラムを形成す
る円筒は、内径が４ｍで長さが５０ｍ＋＋の大きさのス
テンレス鋼製である。
表１
溶離液組成
溶離液Ａ、Ｂは送液ポンプ４によって試料注入部５を経
て分離カラム７に供給され、さらに混合部を形成する三
方分岐管１０２反応流路１２．冷却部１３．蛍光光度計
からなる検出器１４のフローセル１５を流通して外部に
排出される。反応槽１１は加熱装置を有しており、反応
流路１２を１３０℃〜１８０℃の範囲内の所定温度に維
持する。反応流路は、内径が０．５ｗｍで長さが１０ｍ
の四弗化エチレン製のチューブで形成する。ただし、反
応槽１１内で加熱される反応流路長さは７ｍである。
て分離カラム７に供給され、さらに混合部を形成する三
方分岐管１０２反応流路１２．冷却部１３．蛍光光度計
からなる検出器１４のフローセル１５を流通して外部に
排出される。反応槽１１は加熱装置を有しており、反応
流路１２を１３０℃〜１８０℃の範囲内の所定温度に維
持する。反応流路は、内径が０．５ｗｍで長さが１０ｍ
の四弗化エチレン製のチューブで形成する。ただし、反
応槽１１内で加熱される反応流路長さは７ｍである。
送液ポンプ４は、溶離液を０．４ｍＱ／ｗｉｎの流量で
送液するように流量調整されている。溶離液Ａ、Ｂの送
液プログラムを表２に示す。試料の注入時点を基準時間
として溶離液Ａ、Ｂが表２の順序に従って供給される。
送液するように流量調整されている。溶離液Ａ、Ｂの送
液プログラムを表２に示す。試料の注入時点を基準時間
として溶離液Ａ、Ｂが表２の順序に従って供給される。
反応試薬液槽８に収容されている試薬液は、送液ポンプ
９によって０．５ｍ Ｑ ／ ｗｉｎの流量で送液され
、混合部１０でカラム溶出液と合流される。反応試薬液
槽８内の試薬液は、フェニルヒドラジンを含んでいる。
９によって０．５ｍ Ｑ ／ ｗｉｎの流量で送液され
、混合部１０でカラム溶出液と合流される。反応試薬液
槽８内の試薬液は、フェニルヒドラジンを含んでいる。
この試薬液は、酢酸１８０ｍρとりん酸２２０ｍＡを含
む液にフェニルヒドラジン６ｍＭを混合し合計容量を４
０６ｍΩになるよう調製される。
む液にフェニルヒドラジン６ｍＭを混合し合計容量を４
０６ｍΩになるよう調製される。
表２ 溶離液送液プログラム
第１図の液体クロマトグラフ装置において、反
塔槽１１の温度を１５０℃に保ち、糖類を含有する試料
を試料注入部５から導入する。糖類混合物試料は分離カ
ラム７で成分分離される。分離カラムからの溶出液に混
合部１０において反応試薬液が混合されると、前述した
ようなラベル化反応が開始される。検出器１４によって
検出された蛍光量に対応する信号は、タロマドグラムと
して表示装置に表示されると共に、各ピークの面積値に
基づいて各成分の濃度が演算され表示される。
を試料注入部５から導入する。糖類混合物試料は分離カ
ラム７で成分分離される。分離カラムからの溶出液に混
合部１０において反応試薬液が混合されると、前述した
ようなラベル化反応が開始される。検出器１４によって
検出された蛍光量に対応する信号は、タロマドグラムと
して表示装置に表示されると共に、各ピークの面積値に
基づいて各成分の濃度が演算され表示される。
第２図は、このようにして糖類を含む試料を測定した結
果を表すクロマトグラム例である。この結果を得るため
に、蛍光光度計１４の光源側の励起波長を３３０ｎｍに
設定し、検出側の蛍光波長を４７ Ｏｎ、 ｍに設定し
た。第２図において、（ａ）はシュークロース、セロビ
オース、マルトース。
果を表すクロマトグラム例である。この結果を得るため
に、蛍光光度計１４の光源側の励起波長を３３０ｎｍに
設定し、検出側の蛍光波長を４７ Ｏｎ、 ｍに設定し
た。第２図において、（ａ）はシュークロース、セロビ
オース、マルトース。
ラクトース、ラムノース、リボース、マンノース。
フラクトース、ガラクトース、キシロース、グルコース
の各成分を各々５００ｎｇ含有する試料を導入したとき
のクロマトグラムであり、（ｂ）は（ａ）と同じ成分を
各々Ｌｏｎｇ含有する試料を導入したときのクロマトグ
ラムである。第２図＆；示すように、還元糖ばかりでな
く非還元糖のシ：−クロースも高感度に検出される。
の各成分を各々５００ｎｇ含有する試料を導入したとき
のクロマトグラムであり、（ｂ）は（ａ）と同じ成分を
各々Ｌｏｎｇ含有する試料を導入したときのクロマトグ
ラムである。第２図＆；示すように、還元糖ばかりでな
く非還元糖のシ：−クロースも高感度に検出される。
本発明に基づく分析方法では、反応試薬液がらん酸をベ
ースにした溶液からなるので、特殊なｉ薬品性の送液ポ
ンプを用いる必要がない。また、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン等の二級アミンを有するアミノ糖類は、従来適正な
検出法がなかった（づれども、本発明を適用することに
よって測定が司能となった。
ースにした溶液からなるので、特殊なｉ薬品性の送液ポ
ンプを用いる必要がない。また、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン等の二級アミンを有するアミノ糖類は、従来適正な
検出法がなかった（づれども、本発明を適用することに
よって測定が司能となった。
第１図の実施例では、検出器１４として蛍光波度計を用
いているが、これに代えて吸光光度計各層いることがで
きる。吸光測定波長が３６５ｎｒｒｌの場合、吸光検出
の場合の測定感度は蛍光検出Ｃ場合の約１７３であった
。検出器１４としては偏光光度計と吸光光度計をシリー
ズに配置したものを用いることもできる。
いているが、これに代えて吸光光度計各層いることがで
きる。吸光測定波長が３６５ｎｒｒｌの場合、吸光検出
の場合の測定感度は蛍光検出Ｃ場合の約１７３であった
。検出器１４としては偏光光度計と吸光光度計をシリー
ズに配置したものを用いることもできる。
本発明によれば、還元糖および非還元糖成分を高感度検
出することができる。
出することができる。
第１図は本発明の一実施例の液体クロマトグラフ装置の
流路系統を示す概略図、第２図は第１図の実施例装置に
よる糖含有試料のクロマトグラム例である。
流路系統を示す概略図、第２図は第１図の実施例装置に
よる糖含有試料のクロマトグラム例である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、糖を含む試料を分離カラムに導入し、この分離カラ
ムからの溶出液に反応試薬を加え、反応液の吸光又は蛍
光を測定する糖類の分析方法において、上記反応試薬と
してフェニルヒドラジンおよびりん酸を含む溶液を用い
、溶出された糖成分と上記反応試薬とを１３０℃乃至１
８０℃の温度にて反応させることを特徴とする糖類の分
析方法。 ２、糖成分分離用充填剤が充填された分離カラムと、こ
の分離カラムへ溶離液を供給する装置と、上記分離カラ
ムの下流に設けた１３０℃乃至１８０℃に加熱される反
応流路部と、上記分離カラムと上記反応流路部の間に、
フェニルヒドラジンおよびりん酸を含む反応試薬液を流
入せしめる試薬供給部と、上記反応流路部の下流に設け
た反応液検出器とを備えた糖類の分析装置。 ３、請求項第２項記載の分析装置において、上記反応液
検出器は蛍光光度計であることを特徴とする糖類の分析
装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13382890A JP2846059B2 (ja) | 1990-05-25 | 1990-05-25 | 糖類の分析方法および分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13382890A JP2846059B2 (ja) | 1990-05-25 | 1990-05-25 | 糖類の分析方法および分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0429058A true JPH0429058A (ja) | 1992-01-31 |
| JP2846059B2 JP2846059B2 (ja) | 1999-01-13 |
Family
ID=15113996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13382890A Expired - Lifetime JP2846059B2 (ja) | 1990-05-25 | 1990-05-25 | 糖類の分析方法および分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2846059B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009145169A (ja) * | 2007-12-13 | 2009-07-02 | Japan Health Science Foundation | 糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、該方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法 |
| JP2016080542A (ja) * | 2014-10-17 | 2016-05-16 | 森永乳業株式会社 | 多糖類の測定方法及び測定装置 |
-
1990
- 1990-05-25 JP JP13382890A patent/JP2846059B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009145169A (ja) * | 2007-12-13 | 2009-07-02 | Japan Health Science Foundation | 糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、該方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法 |
| JP2016080542A (ja) * | 2014-10-17 | 2016-05-16 | 森永乳業株式会社 | 多糖類の測定方法及び測定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2846059B2 (ja) | 1999-01-13 |
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