CN112326828A - 一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,包括以下步骤:(1)杜仲多糖的提取;(2)显色反应;(3)多糖样品酶解;(4)杜仲多糖含量测定;(5)杜仲多糖样品衍生化;(6)测定色谱图并对比。本发明通过对杜仲多糖产品进行酶解处理,通过指纹图谱比对,单糖组成分析等对杜仲多糖产品进行评价,以确定一种快速、准确的杜仲多糖类产品质量鉴定方法。
Description
技术领域
本发明属于质量鉴定技术领域,尤其涉及一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法。
背景技术
天然植物提取物有着自己独特的结构和生物活性,被广泛应用于食品、保健品、化妆品以及饲料等行业当中。杜仲多糖作为杜仲提取物中的一种主要活性物质,拥有增强机体免疫活力,提高抗氧化能力,促进糖脂代谢等生理作用,具有良好的市场前景。但是市售产品真假难辨,非法添加和假冒伪劣等现象层出不穷,市售多糖类产品良莠不齐,一些商家在多糖类产品中添加廉价的没有功能性的糖类物质以降低成本,以次充好,这不仅损害了消费者的权益,而且阻碍了植物提取物产业的健康发展。
糊精拥有耐热、耐酸、耐压、耐冷冻、低褐变以及耐储存等性质。这些性质使得糊精作为佐剂辅料加入到植物多糖类产品中不会改变产品的品质。而且还可以解决植物多糖类产品在生产的过程中,因为含糖量较高导致的粘度大、干粉软化点低、热熔型黏壁等问题。但是,一些不法商贩却利用糊精的这些性质以及用途,在植物多糖类产品中没有限制的添加,外加行业标准不完善以及传统检测方法的局限性,导致植物多糖类产品的有效含量得不到保障,使得其实际使用效果不尽人意,严重损害了消费者的权益。
因此,简单有效的质量鉴定方法对保证杜仲多糖类产品发展有着不可或缺的作用。
发明内容
本发明的目的在于:针对上述现有技术中存在的行业标准不完善以及传统检测方法的局限性,提供一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法。
本发明采用的技术方案如下:
一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,包括以下步骤:
(1)标准品溶液及多糖样品溶液制备
取D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-GalUA、D-GlcUA、L-Fuc 10种单糖标品各10mg,用纯净水定容至10mL,得1mg/mL标准品溶液。各取等体积的10种单糖标准溶液即得单糖混合标准品溶液;向杜仲多糖中加三氟乙酸,氮气封口后于110℃水解5h,旋干水解后的溶液,再利用甲醇洗涤后旋干,继续重复3次除去残留的三氟乙酸,最后加水得到多糖样品水解溶液;
(2)显色反应
向杜仲多糖溶液中滴入I-KI溶液,观察颜色变化;
(3)多糖样品酶解
向待测品中加入糖化酶,酶与底物质量比为1:4-6,调节pH为5.0,置于60℃水浴酶解50-80min,再加热至沸,冷却,加入无水乙醇,4℃静置10-15h,离心,弃上清液,沉淀洗涤
(4)多糖含量测定
对酶解后的多糖样品进行水解,采用分光光度计在490nm波长分别测定待测品和葡萄糖标准溶液的的吸光度,建立标准曲线,得到多糖含量;
(5)杜仲多糖样品衍生化
另取酶解后的多糖样品水解溶液中加入三氟乙酸,氮气封口后100-120℃水解4-6h,旋干,洗涤,再旋干,重复3次,加水得到水解液;向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液,在60-80℃水浴反应80-120min,冷却后加入HCl溶液,再加入氯仿萃取,取上层液,重复3次,离心,收集上清,过滤,得待测品;
(6)测定色谱图并对比分析
采用HPLC法测定色谱图,并与杜仲多糖指纹图谱对照图谱为参照图谱进行对比,并对单糖组成进行分析。
进一步地,多糖含量测定采用如下方法:采用分光光度计在490nm波长分别测定待测品和葡萄糖标准溶液的的吸光度,建立标准曲线,得到粗多糖含量;向待测品中加入糖化酶,酶与底物质量比为1:4-6,调节pH为5.0,置于50-70℃水浴酶解50-80min,再加热至沸,冷却,采用DNS法,向待测品和葡萄糖标准溶液中分别加入DNS试剂,沸水浴加热灭酶;冷却后在520nm波长分别测试习惯度,建立标准曲线,得到游离还原糖含量;粗多糖含量与游离还原糖含量之差为多糖含量。
进一步地,(3)中糖化酶与底物的质量比为1:5。
进一步地,(3)中于60℃水浴酶解60min。
进一步地,(6)中色谱条件为色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18,柱温:35℃;检测波长:250nm;流速:1mL/min,进样体积:10μL,流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸缓冲盐溶液。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
糊精是淀粉水解产生的中间产物,常被用在一些植物多糖产品中充当佐剂辅料。由于糊精也是一种多糖,最后的水解产物是葡萄糖,所以常用的多糖类定量测定方法无法排除其影响。苯酚硫酸法和DNS法只能测定粗多糖和游离还原糖的含量,结合I-KI显色试验,可以初步判断产品中是否添加淀粉糊精类物质,但不能评价是合理添加还是非法添加,也不能对植物多糖产品进行定性分析,存在以低成本植物多糖代替高成本植物多糖的的可能。HPLC法可以对所有单糖进行测定,并通过指纹图谱比对以及单糖组成分析可以有效地对杜仲多糖进行定性以及定量测定。通过糖化酶去除杜仲多糖中糊精的验证试验结果以及酶解前后杜仲多糖产品的HPLC色谱图和单糖组成分析。证明糖化酶可以在不影响植物多糖的情况下分解糊精,从而达到纯化植物多糖类产品中糊精的目的。本发明提供了一种杜仲多糖产品的质量鉴定的新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例杜仲多糖类产品色谱图;
图2为对比例杜仲多糖类产品色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此,以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本发明较佳的实施例提供一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,具体步骤如下:
(1)标准品溶液制备
取D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-GalUA、D-GlcUA、L-Fuc 10种单糖标品各10mg,用纯净水定容至10mL,得1mg/mL标准品溶液。各取等体积的10种单糖标准溶液即得单糖混合标准品溶液。
(2)显色反应
取10mg杜仲多糖产品,用蒸馏水定容至10mL,得1mg/mL的样品溶液。取2mL样品溶液于10mL试管中,另取一只试管加入2mL蒸馏水作空白对照,各加入1滴I-KI溶液,观察样品颜色变化。
(3)多糖样品酶解
向5mL待测品中加入糖化酶,酶与底物质量比为1:5,调节pH为5.0,置于60℃水浴酶解60min,再加热至沸灭酶,冷却,加入无水乙醇,4℃静置12h,4000r/min离心5min,弃上清液,沉淀用80%乙醇溶液洗涤3次。
(4)多糖含量测定
对酶解后样品进行水解定容至24mL,采用分光光度计在490nm波长分别测定待测品和葡萄糖标准溶液的的吸光度,建立标准曲线,得到多糖含量。
(5)样品衍生化
取多糖样品的水解液或单糖标准溶液200μL,置于7mL离心管中,加入200μL NaOH溶液(0.3mol/L)、200μL PMP甲醇溶液(0.5mol/L),充分摇匀,在70℃水浴条件下反应100min后冷却至室温,再加入200μL HCl溶液(0.3mol/L),混匀后加1mL氯仿用于萃取过量的PMP,弃掉下层液体,此操作重复3次,离心10min(转速8000r/min)后收集上清液,最后用0.45μm滤膜过滤,待测。
(6)测定色谱图并对比分析
采用HPLC法测定色谱图,色谱条件为色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm~4.6mm,5μm),柱温:35℃;检测波长:250nm;流速:1mL/min,进样体积:10μL,流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH=7.8),并与杜仲多糖指纹图谱对照图谱为参照图谱进行对比,并对单糖组成进行分析。
对比例
对比例提供一种杜仲多糖质量鉴定方法,具体步骤如下:
(1)标准品溶液制备
取D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-GalUA、D-GlcUA、L-Fuc 10种单糖标品各10mg,用纯净水定容至10mL,得1mg/mL标准品溶液。各取等体积的10种单糖标准溶液即得单糖混合标准品溶液。
(2)多糖水解
称取多糖样品固体10.0mg于离心管中,加2mol/L的三氟乙酸2mL,氮气封口后于110℃水解5h,旋干水解后的溶液,再利用甲醇洗涤后旋干,继续重复3次除去残留的三氟乙酸,最后加入10.0mL蒸馏水得到1.0mg/mL的样品水解溶液。
(3)显色反应
取10mg杜仲多糖产品,用蒸馏水定容至10mL,得1mg/mL的样品溶液。取2mL样品溶液于10mL试管中,另取一只试管加入2mL蒸馏水作空白对照,各加入1滴I-KI溶液,观察样品颜色变化。
(4)样品衍生化
取多糖样品的水解液或单糖标准溶液200μL,置于7mL离心管中,加入200μL NaOH溶液(0.3mol/L)、200μL PMP甲醇溶液(0.5mol/L),充分摇匀,在70℃水浴条件下反应100min后冷却至室温,再加入200μL HCl溶液(0.3mol/L),混匀后加1mL氯仿用于萃取过量的PMP,弃掉下层液体,此操作重复3次,离心10min(转速8000r/min)后收集上清液,最后用0.45μm滤膜过滤,待测。
(4)测定色谱图并对比分析
采用HPLC法测定色谱图,色谱条件为色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm~4.6mm,5μm),柱温:35℃;检测波长:250nm;流速:1mL/min,进样体积:10μL,流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH=7.8),并与杜仲多糖指纹图谱对照图谱为参照图谱进行对比,并对单糖组成进行分析。
实验例1
分别按照常规方法和本发明实施例方法分别对添加0%、20%、40%、60%糊精的杜仲多糖产品中的多糖含量进行测定。结果如下表1,说明本发明方法用于排除糊精的影响是有效的。
表1杜仲多糖含量(%)
实验例2
分别采用实施例方法对10批杜仲多糖类产品(Y1-10)进行显色反应检测,结果如下表2:
表2显色反应结果
“-”为不变色;“+”为红色。
由上表可知,10份杜仲多糖类产品中,Y1、Y3、Y8三个样品与碘不变色,疑似添加了以葡萄糖为主体的其他多糖或无色糊精。Y2、Y4、Y5、Y6、Y7、Y9、Y10七个样品遇碘呈红色,疑似添加了红色糊精。
实验例3
分别采用实施例方法和对比例方法对上述10批杜仲多糖产品进行检测,结果如图1和图2所示。对比例显示,10批杜仲多糖类产品的色谱图中的葡萄糖所对应的色谱峰远远高于其他单糖的色谱峰。10批杜仲多糖类产品中都添加了大量糊精或葡萄糖等。而通过实施例的方法,各样品中葡萄糖对应的色谱峰峰高和峰面积相对降低,其他各峰相对增加,因而有效排除了杜仲多糖产品中额外添加的糊精的影响。
酶解后杜仲多糖类产品的各单糖百分含量和摩尔比如下表3-4所示:
表3酶解后杜仲多糖类产品的单糖百分含量(%)
表4酶解后杜仲多糖类产品的单糖摩尔比
经糖化酶酶解后,葡萄糖的含量明显降低,最高的为80.98%(除Y8),最低的为7.34%。可能因为葡萄糖醛酸、木糖含量较少(占杜仲多糖的2%以下),所以十份样品皆未检测到。有9批产品中的出现了核糖,其原因可能是其产品中还添加了其他物质,在处理过程中释放出了核糖。Y1、Y3、Y6、Y9四个样品含有半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖的阿拉伯糖四种杜仲多糖中的主要单糖,且与葡萄糖的摩尔比分别在对照杜仲多糖的0.4-1.90、0.6-0.1.38、0.55-1.5倍之间,属于含有杜仲多糖的产品。这四个样品的指纹图谱与对照图谱相比,相似度在所有产品中最高。指纹图谱比对和化学计量学结果类似。其他样品中的四种主要单糖的摩尔比与杜仲多糖中的相差较大。Y2、Y7号样品中甘露糖的百分含量达到了68%以上,说明这两个样品添加了以甘露糖为主体的其他多糖。Y4、Y5、Y10样品中的葡萄糖含量达到了70%以上,说明这三个样品中添加了以葡萄糖为主体的其他多糖,Y8样品经酶解后只含有葡萄糖,说明这个样品中可能存在其他由葡萄糖组成的大分子多糖,如纤维素等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)标准品溶液及多糖样品溶液制备
取D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-GalUA、D-GlcUA、L-Fuc 10种单糖标品,用纯净水定容,得1mg/mL标准品溶液;各取等体积的10种单糖标准溶液即得单糖混合标准品溶液;向杜仲多糖中加三氟乙酸,氮气封口后于110℃水解5h,旋干水解后的溶液,再利用甲醇洗涤后旋干,继续重复3次除去残留的三氟乙酸,最后加水得到多糖样品水解溶液;
(2)显色反应
向杜仲多糖水解溶液中滴入I-KI溶液,观察颜色变化;
(3)多糖样品酶解
向待测品中加入糖化酶,酶与底物质量比为1:4-6,调节pH为5.0,置于50-70℃水浴酶解50-80min,再加热至沸,冷却,加入无水乙醇,4℃静置10-15h,离心,弃上清液,沉淀洗涤;
(4)多糖含量测定
对酶解后的多糖样品进行水解,采用分光光度计在490nm波长分别测定待测品和葡萄糖标准溶液的的吸光度,建立标准曲线,得到多糖含量;
(5)杜仲多糖样品衍生化
另取酶解后的多糖样品水解溶液中加入三氟乙酸,氮气封口后100-120℃水解4-6h,旋干,洗涤,再旋干,重复3次,加水得到水解液;向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液,在60-80℃水浴反应80-120min,冷却后加入HCl溶液,再加入氯仿萃取,取上层液,重复3次,离心,收集上清,过滤,得待测品;
(6)测定色谱图并对比分析
采用HPLC法测定色谱图,并与杜仲多糖指纹图谱对照图谱为参照图谱进行对比,并对单糖组成进行分析。
2.根据权利要求1所述的消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,其特征在于,所述(3)中糖化酶与底物的质量比为1:5。
3.根据权利要求1所述的消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,其特征在于,所述(3)中于60℃水浴酶解60min。
4.根据权利要求1所述的消除糊精干扰的杜仲多糖质量鉴定方法,其特征在于,所述(6)中色谱条件为色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18,柱温:35℃;检测波长:250nm;流速:1mL/min,进样体积:10μL,流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸缓冲盐溶液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210205 |