CN114134076A - 一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面的应用 - Google Patents

一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵及絮凝技术领域，尤其涉及一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面的应用，该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）MES816，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏日期为2018年5月8日，保藏编号为CGMCC NO.15744。本发明还提供了产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816在污水处理中的应用。本发明的有益效果是：可直接将发酵液用作絮凝剂，不仅简化了工艺降低成本，还减小了二次水体污染的可能性，且发酵液的絮凝效果、稳定性以及耐稀释能力好。

Description

一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面 的应用
技术领域
本发明属于微生物发酵及絮凝技术领域，尤其涉及一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面的应用。
背景技术
水资源，尤其淡水资源，是维持生命活动必不可少的资源、同时也是社会运转、工业生产的不可替代的资源。但地球上淡水资源稀缺，对淡水资源的保护及合理使用就成为不可忽视的事项。我国水资源十分紧张，并且还有分布不均、浪费和污染等问题，其中工业废水对水资源产生了极大污染。对于工业废水的治理成为保护水资源的重点关注方面。
目前我国处理工业废水的方式主要有化学氧化法、萃取法、吸附法、电渗析法和絮凝法。前四种方法受到基建投入大、工艺复杂、能耗较高的各项因素限制，进行大规模推广有一定难度。而絮凝法成本低廉、工艺相对简便的优点使得该法十分常见。
当前絮凝剂主要分为有机合成高分子絮凝剂、无机絮凝剂以及生物絮凝剂三大类。其中生物絮凝剂主要指以细菌真菌等微生物及其代谢产物，通过与污水中的颗粒相互作用产生并达到絮凝效果。与常规絮凝剂相比，生物絮凝剂具有絮凝效率高、无二次污染、产物天然易降解、可持续再生等优点。
微生物絮凝剂大致分为微生物细胞絮凝剂、微生物细胞壁成分絮凝剂、微生物细胞代谢产物絮凝剂和通过基因工程技术获得的絮凝剂四类。微生物代谢产物以荚膜与粘液质为主，其主要成分包括多糖、多肽、蛋白质、脂类以及上述四种物质复合物。以上微生物胞外代谢产物中多糖或者复合物中的多糖组分通常作为絮凝剂的功能组分存在。
通过对微生物进行培养可以得到含有絮凝物质的发酵液，对发酵液进行加工可以得到絮凝剂成品，以多糖为主体的絮凝剂提取工艺较复杂、消耗大量溶剂(乙醇)、提取过程中产生大量废水，不仅导致絮凝剂生产成本较高，还有对水体二次污染的风险。而直接将发酵液用作絮凝剂不仅简化了工艺降低成本，还减小了二次水体污染的可能性。因此发酵液的絮凝效果、稳定性以及耐稀释能力将决定其能否实际应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一株地衣芽孢杆菌胞外多糖的制备方法、絮凝剂及其在污水处理方面的应用，可直接将发酵液用作絮凝剂，不仅简化了工艺降低成本，还减小了二次水体污染的可能性，且发酵液的絮凝效果、稳定性以及耐稀释能力好。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一株产胞外多糖的地衣芽孢杆菌，该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lich eniformis)MES816，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2 018年5月8日，保藏编号为CGMCC NO.15744。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MES816为革兰氏阳性菌，可在厌氧条件下生长。细菌呈直杆状，单个、成对或短链排列。有芽孢，芽孢近椭圆形，中生，芽孢囊不膨大。在营养琼脂培养基上的菌落微黄色，形态不规则，扁平，不透明，在光照下菌落边缘较中央略透明，表面湿润、有光泽，向边缘扩张。
本发明还提供了上述产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816在污水处理中的应用。
优选的，可将上述产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816的发酵液用于污水处理。
优选的，可将上述产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816发酵液中提取的胞外多糖用于污水处理。
使用时，将地衣芽孢杆菌MES816发酵液或从发酵液中提取的胞外多糖稀释后对高岭土悬浊液进行处理。具体为：将微生物发酵液或胞外多糖稀释至多糖含量为0.4g/L，然后取1ml加入到49ml浓度为0.4g/L的高岭土悬浊液中。
优选的，当地衣芽孢杆菌MES816的发酵液所含胞外多糖浓度与从发酵液中提取的胞外多糖浓度相同时，可起到相同的污水处理效果。
本发明还提供了一种污水处理絮凝剂，该絮凝剂由上述产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816发酵而得。
优选的，本发明的所述絮凝剂包含地衣芽孢杆菌MES816的发酵液或从其发酵液中提取的胞外多糖。
优选的，所述絮凝剂的生效pH范围是4-9、适用的环境温度在20-40℃。
优选的，所述地衣芽孢杆菌MES816经一级种子的培养和发酵后，得到发酵液。
进一步优选的，所述地衣芽孢杆菌MES816发酵液制备方法如下：(1)一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES816进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为固体营养琼脂培养基。培养基配方为：蛋白胨8-13g，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂21.0克，超纯水1000 毫升，pH值7.0-7.3。培养条件：温度30℃-35℃，培养24h；(2)发酵:在50L发酵罐中装有20L液体地衣芽孢杆菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取一级种子菌苔后用100mL室温无菌水中混匀，接种在地衣芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02Mpa-0.07Mpa，在35℃培养26h；发酵培养基配方:葡萄糖1％，玉米淀粉2％，酵母浸粉2.5％，氯化钙0.3％(以上百分比均为液料比)，pH值为7.0-7.5；(3)培养35-40h时，结束发酵，放罐。
优选的，所述地衣芽孢杆菌MES816发酵液经离心浓缩、醇沉、离心烘干、除蛋白、透析冻干得到纯化胞外多糖。
进一步优选的，胞外多糖提取方法如下：(1)粗品提取：将所得发酵液4000r/min离心去除菌体，取上清液浓缩后加入3倍体积95％的乙醇放入4℃环境静置过夜，5500r/mi n离心去上清液，收集沉淀。收集好的沉淀置于75℃烘箱中烘干至恒重；(2)除蛋白：将适量多糖粗品溶于100mL蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合剂(体积比为氯仿：正丁醇＝4:1)20mL，震荡20min，6000r/min离心10min收集上层水相，上述步骤重复多次，直至无蛋白层为止；(3)透析冻干：将除蛋白后的多糖溶液装入截留分子量为1×105Da的透析袋中，蒸馏水透析3天，透析后袋中溶液进行冷冻干燥，得到纯化胞外多糖。
本发明的有益效果为：本发明所述的菌株，其分泌的胞外多糖或包含胞外多糖的发酵液可以作为生物絮凝剂使用，并且当地衣芽孢杆菌MES816的发酵液所含胞外多糖浓度与从发酵液中提取的胞外多糖浓度相同时，可起到相同的污水处理效果。直接将发酵液用作絮凝剂时，不仅简化了工艺降低成本，还减小了二次水体污染的可能性。本发明的地衣芽孢杆菌MES816发酵液具有良好的稳定性、絮凝效果良好、耐稀释、用量较少、无毒无害、对施用环境的pH条件要求较缓和，当絮凝体系中多糖含量在7.2mg/L时即可达到95％以上的絮凝率，其大面积推广使用的前景十分广阔。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1地衣芽孢杆菌MES816的分离筛选及微生物特征
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MES816，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2018年5月8日，保藏编号为CGMCC NO.15744。
该株地衣芽孢杆菌MES816是2018年5月我公司研发人员从河北省保定市地区土壤中分离获得。土壤经稀释、划线培养、在28℃培养24小时后，经5次纯化后制成斜面菌种，挑取2支斜面送农村农业部微生物质检机构鉴定，确定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，在4℃和-80℃冰箱保藏。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MES816为革兰氏阳性菌，可在厌氧条件下生长。细菌呈直杆状，单个、成对或短链排列。有芽孢，芽孢近椭圆形，中生，芽孢囊不膨大。在营养琼脂培养基上的菌落微黄色，形态不规则，扁平，不透明，在光照下菌落边缘较中央略透明，表面湿润、有光泽，向边缘扩张。
实施例2地衣芽孢杆菌MES816微生物发酵液的制备
地衣芽孢杆菌MES816微生物发酵液按照以下步骤进行制备：
(1)一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES816进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为营养琼脂培养基。培养基配方为：蛋白胨8-15g，牛肉膏3-6g，氯化钠2-5g，琼脂21g，超纯水1000mL，pH值为7.0-7.5。培养条件：温度25℃-30℃，培养24h。
(2)发酵:在30L发酵罐中装有20L液体地衣芽孢杆菌发酵培养基，120±5℃湿热灭菌 40-45min后冷却到35℃，刮取一级种子菌苔于100mL室温无菌水中，混匀后接种在地衣芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.03Mpa-0.08Mpa，在35℃培养；发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％，玉米淀粉2％，酵母浸粉2.5％，氯化钙0.3％(以上百分比均为液料比)，pH值为7.0-7.5。
(3)放罐：培养直至35-40h时，结束发酵，放罐。
实施例3地衣芽孢杆菌MES816发酵液胞外多糖的提取
将实施例2所得的发酵液进行胞外多糖的提取，提取步骤如下：(1)粗品提取：实施例1得到的发酵液4000r/min离心去除菌体，取上清液浓缩后加入3倍体积95％乙醇放入4℃环境静置过夜，5500r/min离心去上清，收集沉淀。收集好的沉淀置于75℃烘箱中烘干至恒重。
(2)除杂蛋白：将适量多糖粗品溶于100mL蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合剂(体积比为氯仿：正丁醇＝4:1)20mL，震荡20min，6000r/min离心10min收集上层水相，上述步骤重复多次，直至无蛋白层为止。
(3)冷冻干燥：将除蛋白后的多糖溶液装入截留分子量为1×105Da的透析袋中，蒸馏水透析3天，透析后袋中溶液进行冷冻干燥，得到纯化胞外多糖。经计算，得到的胞外多糖产量为18g/L。
实施例4纯化多糖与发酵液絮凝能力的比较
(1)待测试剂准备
微生物发酵液：将实施例2制备的微生物发酵液，使用蒸馏水稀释至溶液中多糖含量为0.4g/L；多糖试剂：使用蒸馏水将实施例3中纯化多糖溶解，并调节多糖浓度至0.4g/L；高岭土悬浊液：取适量高岭土加自来水溶解，调节浓度至4g/L。
(2)试验方法
絮凝体系制备：各取发酵液及多糖溶液1mL，分别加入到49mL高岭土悬浊液中。先350rpm搅拌2min，再100rpm搅拌5min，最后静置7min，使用分光光度计测定550nm的吸光值。以未加絮凝剂的高岭土悬浊液测定550nm吸光值为空白对照。
其中，絮凝率计算公式如下：
Figure BDA0003364975180000051
式中：A0——空白吸光值；
AX——絮凝体系吸光值。
(3)试验结果
测得的不同絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝效果见表1，可以看出，地衣芽孢杆菌MES8 16分泌的胞外多糖具有良好的絮凝功能，其纯品的有效浓度可以低至7.2mg/L，对高岭土悬浊液的絮凝率达到98.32％；将地衣芽孢杆菌MES816发酵液直接用于絮凝时，稀释倍数为2500倍时稀释液中多糖浓度为7.2mg/L，对高岭土悬浊液的絮凝率达到97.91％。表明经稀释的发酵液作为絮凝剂基本可以达到胞外多糖纯品的同样效果，且稀释倍数能达到2500，性价比较高。
表1不同絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝效果
絮凝剂 用量 絮凝率(％)
纯化胞外多糖溶液 7.2mg/L 98.32
发酵液稀释液 1/2500(v/v) 97.91
实施例5地衣芽孢杆菌MES816发酵液作为絮凝剂各项性质的测定
(1)地衣芽孢杆菌MES816发酵液的稳定性
将实施例3中离心得到的地衣芽孢杆菌MES816发酵液进行不同温度(20℃、40℃、60℃、80℃)水浴50min处理。冷却至室温后用蒸馏水稀释至多糖浓度为0.4g/L，按照实施例4的方法进行絮凝率测定，结果见表2。地衣芽孢杆菌MES816发酵液作为絮凝剂具有良好的稳定性，在20-80℃的处理范围内，絮凝率可达到94％以上。
表2不同处理温度对高岭土悬浊液的絮凝效果
处理温度(℃) 絮凝率(％)
20 96.21
40 97.17
60 95.32
80 94.45
(2)地衣芽孢杆菌MES816发酵液的稀释倍数
将实施例3中离心得到的地衣芽孢杆菌MES816发酵液40℃水浴处理50min并冷却至室温。分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍及200倍，对应稀释液中多糖浓度为1.8g/L、0.9g/L、0.36g/L、0.18g/L及0.09g/L。按实施例3方法测定絮凝率，结果见表3。发酵液稀释至10倍到50倍时絮凝率均在95％以上，当稀释倍数达到100倍及以上时絮凝能力略有下降。对成本及效率进行综合考虑，50倍稀释发酵液为最佳，即对于高岭土悬浊液的最适絮凝用量为1/2500(v/v)。
表3不同稀释倍数对高岭土悬浊液的絮凝效果
稀释倍数 絮凝率(％)
10 98.32
20 97.66
50 97.32
100 94.01
200 91.29
(3)地衣芽孢杆菌MES816发酵液的pH适用范围
配制4g/L高岭土悬浊液，并分别调节pH值为4、5、6、7、8、9、10、11。将实施例 2所得地衣芽孢杆菌MES816发酵液稀释50倍，取1mL加入到49mL调节好pH值的高岭土悬浊液中，按照实施例3方法测定絮凝率，结果见表4。地衣芽孢杆菌MES816发酵液稀释液作为絮凝剂的生效pH范围是4-9，当pH值大于10时絮凝能力大幅下降。说明该类絮凝剂的适用pH较宽泛但对较高碱性环境不耐受，适用于偏酸性、中性及偏碱性污水的处理。
表4不同稀释倍数对高岭土悬浊液的絮凝效果
pH值 絮凝率(％)
4 97.32
5 97.01
6 96.55
7 96.63
8 96.59
9 96.33
10 20.15
11 7.31
(4)地衣芽孢杆菌MES816发酵液的适用环境范围
配制4g/L高岭土悬浊液，调节pH值至7，量取49mL悬浊液分别放在20℃、30℃、 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃及90℃水浴中保温模拟环境温度，各取1mL地衣芽孢杆菌 MES816发酵液50倍稀释液加入到保温悬浊液中，按实施例3方法测定絮凝率，结果见表5。地衣芽孢杆菌MES816发酵液稀释液作为絮凝剂使用时，环境温度在20-40℃时絮凝效果较稳定且高于94％；当环境温度高于50℃时絮凝效果大幅减弱，表明地衣芽孢杆菌 MES816发酵液絮凝剂适合在常温下进行污水处理。
表5不同稀释倍数对高岭土悬浊液的絮凝效果
环境温度(℃) 絮凝率(％)
20 95.21
30 95.07
40 94.82
50 73.87
60 52.82
70 30.23
80 3.15
90 2.31
以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌，其特征在于该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）MES816，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏日期为2018年5月8日，保藏编号为CGMCC NO.15744。
2.权利要求1所述的产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816在污水处理中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将所述地衣芽孢杆菌MES816发酵液或从发酵液中提取的胞外多糖用于污水处理。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于使用时，将地衣芽孢杆菌MES816发酵液或从发酵液中提取的胞外多糖稀释后对高岭土悬浊液进行处理。
5.一种污水处理絮凝剂，其特征在于该絮凝剂由权利要求1所述的产胞外多糖地衣芽孢杆菌MES816发酵而得。
6.根据权利要求5所述的絮凝剂，其特征在于所述絮凝剂包含地衣芽孢杆菌MES816的发酵液或从其发酵液中提取的胞外多糖。
7.根据权利要求6所述的絮凝剂，其特征在于所述地衣芽孢杆菌MES816经一级种子的培养和发酵后，得到发酵液。
8.根据权利要求7所述的絮凝剂，其特征在于所述地衣芽孢杆菌MES816发酵液经离心浓缩、醇沉、离心烘干、除蛋白、透析冻干得到纯化胞外多糖。
9.根据权利要求5所述的絮凝剂，其特征在于絮凝剂的生效pH范围是4-9、适用的环境温度在20-40℃。
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