CN102925469A - 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用 - Google Patents

一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102925469A
CN102925469A CN2012103472039A CN201210347203A CN102925469A CN 102925469 A CN102925469 A CN 102925469A CN 2012103472039 A CN2012103472039 A CN 2012103472039A CN 201210347203 A CN201210347203 A CN 201210347203A CN 102925469 A CN102925469 A CN 102925469A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cys
gly
ala
thr
beta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012103472039A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102925469B (zh
Inventor
田云
卢向阳
李亚丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Agricultural University
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN201210347203.9A priority Critical patent/CN102925469B/zh
Publication of CN102925469A publication Critical patent/CN102925469A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102925469B publication Critical patent/CN102925469B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglu135B12，是通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA是克隆载体pUC19部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由3470个碱基组成，包含基因Unglu135B12长2340bp，该基因的GC含量为61.15%。该基因用于生产β-葡萄糖苷酶。本发明亦提供Unglu135B12编码氨基酸序列：1）序列表中序列2的氨基酸序列；2）与序列表中序列2限定的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。该β-葡萄糖苷酶具有很好的稳定性，具有应用降解纤维素工业生产。

Description

一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用
技术领域
本发明涉及从未培养微生物中克隆的酶基因，尤其涉及通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库而筛选得到的酶基因。 
背景技术
纤维素是地球上丰富且可再生的生物聚合物。由于其结构复杂，所以纤维素降解过程依靠复杂的多酶体系即内切纤维素酶、外切纤维素酶与β-葡萄糖苷酶三种酶的协同作用才能完成，其中β-葡萄糖苷酶是此过程的限速酶。 
β-葡萄糖苷酶在自然界的分布较为广泛。目前针对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究文献主要集中在酵母、真菌、细菌中。夏永振应用表面表达技术将来自Trichoderma reesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面进行表达，并研究其酶学性质，实验结果表明酵母表面表达的酶有活性，产酶的最佳诱导时间为24 h，最适温度是70℃。Shipkowski 和Brenchley在Paenibacillus sp. strain C7中发现一种耐低温的β-葡萄糖苷酶，该酶属于糖苷水解酶家族3 (Shipkowski et al., 2005)。Brunner等从致病疫霉Phytophthora infestans中获得的基因bgx1，编码一个具有木糖酶/β-葡萄糖苷酶的双功能酶。 
公开号为CN1778907的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β-葡萄糖苷酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID NO：2；2) 将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。本发明的β-葡萄糖苷酶及其编码基因在纤维素的降解中具有广泛的用途。 
公开号为CN1786171的中国专利介绍了一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶及其编码基因，涉及一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因。该酶具有在高温、碱性条件下保持较高酶活性的特点，其最适反应温度约为70℃，最适反应pH 值约为8.0，该酶能催化水解β-葡萄糖苷键生成葡萄糖，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。 
 公开号为CN101050447的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶基因工程菌——大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.1626，以及该菌种在制备有效霉亚基胺A化合物中的应用。利用该工程菌转化有效霉素A可得到有效霉亚基胺A产物，具有转化效率高、成本较低、反应条件温和、产物纯度高、分离纯化容易、化学污染少等优点。 
公开号为CN102268421A的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用，具体涉及一种能够分解乳糖的在高温和低温条件下都具备很强活性的β-葡萄糖苷酶，并能够高效表达的分泌型β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。本发明公开了一种具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶，并构建出能高效分泌所述β-葡萄糖苷酶的基因工程菌，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.4891。本发明所述方法生产的β-葡萄糖苷酶具有很强的半乳糖苷酶的活性，可应用于乳品工业，同时被发明所述的β-葡萄糖苷酶在较大的pH值范围及温度范围内具有稳定的活性。 
公开号为CN102358898A的中国专利介绍了一种中温β-葡萄糖苷酶BglA1及其基因和应用，涉及一种中温β-葡萄糖苷酶BglA1及其基因和应用。本发明提供了一种新的中温β-葡萄糖苷酶BglA1，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述中温β-葡萄糖苷酶BglA1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的中温β-葡萄糖苷酶BglA1最适pH为6.0，在 pH 5.0～7.0都有较高的酶活性。最适温度为50℃，其耐热特性好，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。 
公开号为CN102399803A的中国专利介绍了一种改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备，改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备，改进的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列bglII如SEQIDNO.1所述。本发明同时提供了以基础盐为培养基的该重组菌表达β-葡萄糖苷酶的方法。通过对基因的人工进化和高密度发酵，改造后的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因bglII在毕氏酵母中的表达量较原始基因bglI提高了36倍。本发明可用于β-葡萄糖苷酶基因的分子改造及其重组毕赤酵母基因工程菌的高密度发酵，能显著提高β-葡萄糖苷酶的表达水平。 
公开号为CN102492710A的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用，涉及β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种表达β-葡萄糖苷酶Cel1b的基因cel1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还提供一种β-葡萄糖苷酶Cel1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中的β-葡萄糖苷酶Cel1b可以用于工业上合成价格昂贵的纤维寡糖，进而应用于研究纤维素酶水解机理、微生物对纤维素的利用过程等。另外这种体外生物法合成的纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂，还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景广阔。 
公开号为 CN1500872的中国专利介绍了一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途，由嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4总DNA获得高温β-葡萄糖苷酶基因(β-glucosidase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达β-葡萄糖苷酶。通过氨基酸序列比较，该酶为一新型β-葡萄糖苷酶。 
公开号为CN101100659的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。该β-葡萄糖苷酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。在以纤维素为原料生产燃料酒精的同步糖化共发酵工艺中的发酵微生物酵母菌最适发酵条件下，该酶具有较高的酶活，可以应用于该工艺中以生产燃料酒精。 
公开号为CN101363026的中国专利介绍了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，提供了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unbgl1B，它通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的β- 葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA是克隆载体 pGEM-3Zf(+)部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的 DNA，该外源DNA片段由838个碱基组成，该基因的GC含量为54.3％。该基因用于生产β-葡萄糖苷酶，以将纤维二糖解离成单个葡萄糖分子。 
公开号为CN101418306的中国专利介绍了一种耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中的应用，涉及一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中作为报告基因的应用，属于植物基因工程领域。本发明公开了该耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物遗传转化中使用方法和效果。耐高温的β-葡萄糖苷酶基因可免除转基因生物体中内源背景的干扰，增加转基因检测的可靠性，使用耐高温β-葡萄糖苷酸酶还将明显提高转基因检测的灵敏度，使时空特异、生物或非生物环境诱导的表达调控研究结果差异更大、数据更准确，并且将大大降低底物的用量，降低检测成本。 
公开号为CN101492661的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备， 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因 (bgl)SEQ ID NO：1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA 全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的bgl/pPIC9K转化P.pastoris KM71 可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精制，达到较好效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。 
公开号为CN101880680A的中国专利介绍了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用，一种编码β-葡萄糖苷酶的基因bgl，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能等同变异体。本发明含涉及该基因或其功能等同变异体编码的β-葡萄糖苷酶(SEQ ID NO：2)及该酶在降解纤维素中的应用。 
公开号为 CN102477417A的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β-葡萄糖苷酶是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白质。实验证明：该重组酶在毕赤酵母中高效分泌表达高达190.2U/mL，该重组酶最适pH和最适温度分别为pH6.0和55℃，具有较宽的底物作用范围和良好的热稳定性，且可水解纤维多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖。该重组酶具有一定的转糖苷能力，利用纤维二糖为底物，可以生成纤维三糖、龙胆二糖等，在食品、饲料、生物化工及医药行业中具有很大的应用潜力。 
公开号为 CN102321647A的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷制备白藜芦醇的应用，所述β-葡萄糖苷酶基因具有与SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列70-100％的同源性，所述β-葡萄糖苷酶基因编码的β-葡萄糖苷酶具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列95％-100％的同源性；本发明β-葡萄糖苷酶能够水解虎杖苷制备白藜芦醇，环境友好，产率高，应用前景广阔。 
公开号为CN101845426A的中国专利介绍了一种黑翅土白蚁β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及应用，提供了一种黑翅土白蚁β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及应用。所述β-葡萄糖苷酶具有与SEQ ID NO：2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁β-葡萄糖苷酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该β-葡萄糖苷酶，用于纤维素的降解，经检测本发明β-葡萄糖苷酶酶活达117U。本发明所提供的β-葡萄糖苷酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。 
而针对纯培养技术未能涉及的另一巨大的微生物资源库——未培养微生物，自从上世纪90年代末就吸引了越来越多研究者的目光。近年来通过宏基因组学技术，以获得目的基因的方法已日趋成熟，在以草食性动物消化道系统未培养微生物为对象的研究中，新的有关纤维素降解功能基因的发现层出不穷。郭宏等构建了水牛瘤胃总微生物的宏基因组文库，筛选得到一个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。马淑华从兔盲肠微生物宏基因组文库中得到一个具有β-葡萄糖苷酶，全长为282 bp的核苷酸序列编码，其GC含量为60.3%，编码93个氨基酸。赵广存通过构建牛瘤胃宏基因组文库，筛选得到10个具有β-葡萄糖苷酶活性以及10个具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性的克隆。 
本发明以芒草驯养牛瘤胃未培养微生物作为研究对象，因芒草茎秆中纤维素和半纤维的含量高达80%，故经芒草驯养的牛瘤胃微生物具有更高的可获得纤维素降解酶的潜力。通过对其瘤胃微生物多样性分析发现，芒草驯养后牛瘤胃细菌中Bacteroidetes的比例从16.33%提高到28.15%，同时，在Firmicutes门，经芒草驯养的牛瘤胃细菌文库的比对信息中出现了Ruminococcus flavefaciens和Butyrivibrio fibrisolvens，这几种细菌均是主要的纤维素降解 菌，它们可以分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶，促进宿主的食物消化和营养能量的吸收。我们进一步通过研究从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库中发现了新的具有β-葡萄糖苷酶活性的基因，这将极大的促进纤维素资源的降解利用，对缓解世界范围内的能源紧张起到巨大的推动作用。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高酶活力的β-葡萄糖苷酶基因 (Unglu135B12)，是通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，以此为β-葡萄糖苷酶的生产提供一条新的途径和方法。 
为解决上述技术问题，本发明提供了一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglu135B12，来源于芒草驯养牛瘤胃未培养微生物，是下列核苷酸序列之一： 
1)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列及其部分序列；  
2)与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。 
序列表中SEQ ID No:1的DNA是克隆载体pUC19部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由3470个碱基组成，重组质粒携带的外源DNA片段中包含完整的新基因Unglu135B12，该基因长2340 bp，GC含量为61.15%。 
序列从序列表中的SEQ ID No:1的DNA从5’端第700位核苷酸开始到3039位核苷酸结束，存在一个完整的开放阅读框 (ORF，Open Reading Frame)。其中，自5’端的第700位至702位核苷酸为Unglu135B12的起始密码子ATG，自5’端的第3037位至3039位核苷酸为Unglu135B12的终止密码子TAG。 
开放阅读框共2340个核苷酸，可编码序列SEQ ID No:2中780个氨基酸组成的蛋白质。 
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，名称为SEQ ID No:2，来源于芒草驯养牛瘤胃未培养微生物，是下列氨基酸序列之一： 
1)与序列表中SEQ ID No:2限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。 
2)与序列表中SEQ ID No:3限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。 
3)与序列表中SEQ ID No:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。 
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆方法，包括以下步骤： 
(1)从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA； 
(2)构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库； 
(3)从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶的克隆； 
(4)β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析。 
步骤(1)包括： 
(1-1) 从芒草驯养牛瘤胃内容物样品中直接抽提宏基因组DNA； 
(1-2) 采取脉冲场电泳和电洗脱法回收纯化粗制宏基因组DNA。 
步骤(2)包括： 
(2-1) 将回收的DNA连接到pcc2FOS vector上，包装，转导至EPI300宿主细胞中，构建成Fosmid文库； 
(2-2) 检测Fosmid文库的覆盖度 
步骤(3)包括： 
(3-1) 获得具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆； 
(3-2) 酶切插入片段，回收1-5 kb长度的DNA片段； 
(3-3) 以pUC19为载体构建亚克隆文库，并用β-葡萄糖苷酶活性检测筛选进行活性克隆的筛选。 
步骤(4)包括： 
(4-1) 获得表达Unglu135B12基因的阳性克隆； 
(4-2) 设计合适特异引物，用PCR的方法扩增Unglu135B12基因； 
(4-3) 用合适的限制性内切酶酶切PCR产物和表达载体pET28a(+)，酶切回收产物连接，得到重组质粒pET135B12。 
基因克隆的步骤还包括：对重组质粒pET135B12表达的β-葡萄糖苷酶基因进行测序和分析，对重组质粒pET135B12进行表达，对β-葡萄糖苷酶基因表达的蛋白质Unglu135B12的氨基酸序列进行分析。并且初步进行了该β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究，包括温度、pH对酶活力的影响。 
在一个具体实施中，重组表达载体所用宿主细胞可以是重组表达载体中的任意一种。 
在一个具体实施中，Unglu135B12基因可应用于纤维素降解生产方面。 
本发明通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法，得到新的β-葡萄糖苷酶基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产β-葡萄糖苷酶，酶学性质研究发现该β-葡萄糖苷酶对pH的适应范围较宽，因此更利于工业生产过程的应用，为推动纤维素资源利用开辟了一条新的途径。 
附图说明
图1为从芒草驯养牛瘤胃内容物样品中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA及电洗脱回收用于Fosmid文库构建的DNA，其中1：电洗脱回收的DNA；2：粗提DNA；M：Lambda Mix Marker 19。 
图2为芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库克隆的限制性内切酶EcoRΙ与Hind Ⅲ酶切分析以判断文库质量，其中  10：λ/Hind III digestive marker；1-9及11-17：文库克隆质粒酶切谱带。 
图3为芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库克隆的筛选； 
图4为亚克隆文库的筛选； 
图5 为Unglu135B12基因DNA序列分析图； 
图6为重组质粒pET135B12经EcoR I、Not I酶切带型，其中M：λ/Hind III digestive marker；1：空载体酶切谱带；2：重组质粒pET135B12酶切谱带。 
图7为验证重组质粒pET135B12携带的Unglu135B12基因转化大肠杆菌E.coli BL21后得到的转化子依然具有β-葡萄糖苷酶活性； 
图8为温度对该β-葡萄糖苷酶活力的影响； 
图9为pH对该β-葡萄糖苷酶活力的影响。 
具体实施方式
本发明提供的一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglu135B12，是下列核苷酸序列之一： 
1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；  
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。 
本发明提供的Unglu135B12基因是通过以下克隆方法的步骤获得的： 
(1) 从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA； 
(2) 构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库； 
(3) 从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶的克隆； 
(4) β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析。 
以下将通过实施例和附图详细解释本发明的技术方案。在本发明实施例中所用到的主要材料包括：限制性内切酶EcoR Ι和Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、pMD-18 T载体、购自大连宝生物公司；Fosmid文库构建试剂盒、高拷贝诱导剂、Fosmid DNA提取试剂盒购自美国Epicentre公司；Lambda Mix Marker 19购自Fermentas公司。 
实施例1、从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取微生物宏基因组DNA。 
1) 从-80℃冰箱取出50g/管样品,室温解冻，放入250 mL三角瓶，并加入50粒直径50 mm的玻璃珠，向三角瓶中倒入已灭菌的磷酸缓冲液100 mL，200 rpm震荡15 min，静置1 min，取悬浮液置于灭菌50 mL离心管中，500 g离心3 min，将上清液转移到另一离心管，再次8000 g离心10 min，收集菌体，用此样品进行总DNA的提取。 
2) 向沉淀的菌体加入6.3 mL提取缓冲液(Sodium Phosphate：100 mmol/L，pH 8.0；Tris-HCl：100 mmol/L， pH 8.0；EDTA：100 mmol/L，pH 8.0；NaCl:：1.5 mol/L；CTAB：2%)，反复吹打充分悬浮菌体，加入2%酸洗PVPP，100 μL溶菌酶(10 mg/mL)，充分涡旋； 
3) 37℃水浴30 min； 
4) 加入蛋白酶K（20mg/mL）50 μL，37℃水浴30 min； 
5) 加入0.7 mL SDS（20%，w/v），65℃水浴90 min，每隔10-15 min颠倒一次； 
6) 8000 g离心15 min，吸出上清液； 
7) 剩余沉淀再次加入2.7 mL提取缓冲液和0.3 mL 20%的SDS，65℃水浴10 min； 
8) 8000 g离心15 min，吸出上清液与5中上清液合并； 
9) 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液，8000g离心15 min，吸出上层水相； 
10) 重复上个步骤； 
11) 向上清液加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置1 h； 
12) 常温下，12000 g离心20 min，收集DNA； 
13) 75%乙醇溶液洗涤2遍，室温晾干，加水溶解。 
实施例2、采用脉冲场电泳和电洗脱法纯化粗提宏基因组DNA 
1) 脉冲场电泳 
① 将DNA样品制成低熔点琼脂糖凝胶的包埋块，4℃放置45 min方可上样； 
② 脉冲场电泳凝胶的配置： 
a．1 g琼脂糖加入100 ml 0.5×TBE，配置1%琼脂糖凝胶； 
b．彻底清洗制胶槽、梳子，吹干； 
c．充分溶解琼脂糖，冷却至50℃左右，灌胶，插好梳子，室温放置至少45 min可使用。 
③ 封胶： 
将①中制备的包埋块放入梳孔中，用少量的液态琼脂糖封口，室温放置5 min左右，即可开始电泳。 
④ 电泳槽和恒温系统的准备： 
a． 向电泳槽中倒入2 L左右的0.5×TBE； 
b． 打开低温循环水浴，设定温度12℃，待电泳槽内缓冲液温度保持在12℃即可开始电泳； 
c． 设定脉冲场电泳条件，时间15 h，脉冲范围1-12 s，电压4.5 V/cm。 
注意观察整个电泳过程温度必须维持在15℃以下。 
2) 电洗脱纯化DNA 
a．取长10-20 cm长的透析袋，在2% NaHCO3，1 mM EDTA （pH 8.0）溶液中煮沸10 min，蒸馏水彻底冲洗；再次于1 mM EDTA溶液煮沸10 min，自然冷却，浸泡于1 mM EDTA溶液，4℃贮存，直至使用。使用前，取出透析袋用蒸馏水反复冲洗其内外壁； 
b．透析袋一端用透析袋夹封口，注满1×TAE，将切下的胶条小心装入上述处理好的透析袋中，挤出大部分缓冲液，但剩余液体要始终包围凝胶块，取另一透析袋夹夹紧，注意不要残留气泡； 
c．透析袋置于电泳槽中，设置电压为4 V/cm，时间3 h，使DNA结合在透析袋内壁；倒转电流电泳1 min，DNA进入袋内缓冲液。打开透析袋一端，吸出袋内所有液体，转移至一无菌离心管中，再次用缓冲液洗透析袋，收集到同一离心管中。 
请参见图1，其中泳道1是电洗脱回收的DNA，2为粗提宏基因组DNA，M为Lambda Mix Marker 19。 
实施例3、芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建 
选用Epicentre公司Fosmid文库构建试剂盒进行宏基因组文库的构建 
1) 宏基因组DNA的准备：用1 mL注射器反复吹吸纯化好的高分子量DNA，将经过注射器打断20次，50次，100次的产物分别在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，与control DNA和Mix Marker进行比较，选取大小最接近40 kb的DNA进行文库的构建。 
2）按照如下体系进行插入DNA的末端修复： 
Figure BDA0000215694781
（所有试剂务必完全溶解混匀，方可使用。） 
末端修复反应在室温下进行45 min，即可终止反应。加入loading buffer，70℃水浴10 min。可放置于-20℃，保存备用。 
3) 末端补平DNA与载体的连接 
连接体系如下： 
Figure BDA0000215694782
室温进行连接反应2 h，置于70℃水浴10 min，灭活Ligase，可放置于-20℃，保存备用，也可继续后续包装反应。 
4) 感受态的制备 
在包装反应的前两天，取出甘油保存的EPI300-T1R菌液，在补充LB培养基上划线，次日挑取单菌落，37℃摇培过夜。包装反应当天取过夜菌，按照10%比例转接，当菌液浓度达到OD600=0.8-1.0时，迅速放冰上，此感受态细胞应在72 h内使用。 
5) 包装 
① 取一管（50 μL）λ包装提取物（MaxPlax Lambda Packaging Extracts），冰上融化，分为两份，各25μL，一份放冰上备用，另一份放回超低温冰箱中，注意不要将MaxPlax Lambda Packaging Extracts暴露于干冰或其他CO2类物质； 
② 将10μL 连接产物与完全融化的λ包装提取物25μL混合； 
③ 移液枪吹打几次，混匀，注意避免气泡产生； 
④ 30℃温育90 min； 
⑤ 再次加入另一份25μL的λ包装提取物，混匀，30℃温育90 min； 
⑥ 加入噬菌体稀释液（phage dilution buffer， PDB），使总体积为1 mL，轻微混匀； 
⑦ 加入25 μL氯仿，轻微混匀，4℃放置备用。 
6) 转导 
取已制备好的EPI300-T1R感受态置冰上，每10 μL连接产物加入100μL感受态中，混匀，37℃温育20 min。将此感染了噬菌体的EPI300-T1R细胞涂布于含有12.5 μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。待菌落长出，挑取CopyControl Fosmid克隆。 
实施例4、芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库覆盖度的检测 
经过瘤胃微生物总DNA的提取、纯化、连接、包装与转化等过程，最终构建的Fosmid文库含有20,160个阳性克隆。随机挑取16个转化子提取质粒，用EcoR Ι、Hind Ⅲ双酶切，发现均含有外源DNA片段，平均长度为30.23 kb。因此，该Fosmid文库的库容量达到609 Mb。 
请参见图2，其中10为λ/Hind III digestive marker，其余泳道为文库克隆质粒酶切谱带。 
同时随机挑取Fosmid文库中的92个克隆子进行单向测序(平均有效读取长度为656 bp)，对随机末端测序结果进行Blast检测，比对结果表明只有3条测序结果具有同源序列(1条序列结果比对上多形拟杆菌，2条测序结果比对上非培养细菌)，占3.26%；另外89条测序结果均未发现同源序列，占96.74%，说明该Fosmid文库覆盖的微生物多样性极其丰富且蕴藏着丰富的新基因资源。 
实施例5、从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库中筛选β-葡萄糖苷酶活性克隆 
将文库中的克隆子逐个挑取，接入含氯霉素(Chloramphenical，Cm) 22.5 μg/mL的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。吸取过夜菌液1 μL转移至含Cm (22.5 μg/mL)的固体β-葡萄糖苷酶筛选培养基上，37℃培养14-16 h，菌斑周围出现黑色变色圈的即初步确定为具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。 
筛选培养基成分为：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%、柠檬酸铁铵0.25%、七叶苷0.1%、琼脂粉1.5-2.0%。 
重复筛选一次后，仍在筛选培养基上产生黑色水解圈的克隆F135B12，提取该克隆的质粒，进行EcoRΙ、Hind Ⅲ双酶切，用于构建亚克隆文库。 
请参见图3，其中出现黑色水解圈的克隆为F135B12。 
实施例6、F135B12外源DNA亚克隆文库的构建及β-葡萄糖苷酶活性克隆筛选 
以克隆载体pUC19为载体，构建F135B12外源DNA亚克隆文库。 
1) 目的片段酶切产物与pUC19载体的连接 
提取筛选得到的β-葡萄糖苷酶活性克隆的Fosmid质粒，根据载体图谱选择EcoRΙ、Hind Ⅲ 进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳后回收1-5 kb范围的片段。同时将pUC19载体进行相同内切酶的双酶切，按如下体系进行连接（总体积：10 μL）： 
Figure BDA0000215694783
连接反应于16℃进行，连接过夜。 
2) 连接产物的转化 
①DH5α化学感受态的制备（CaCl2法） 
a. 制备感受态前两天在固体LB平板上划线培养DH5α，37℃培养14-16 h； 
b. 从平板挑取一个单菌落接入液体LB培养基，37℃振荡培养过夜； 
c. 按照1%-10%的比例转接过夜菌至新鲜液体LB培养基，180 rpm振荡培养2-3 h，待OD600达到0.4-0.6，迅速置冰上，放置30 min； 
d. 4000 rpm离心1 min，收集菌体； 
e. 吸出上清液，加入150 μL预冷的CaCl2溶液，重悬菌体，冰上放置3-5 min； 
f. 4000 rpm离心1 min，吸出上清液，再次加入150 μL预冷的CaCl2溶液，重悬菌体，冰上放置3-5 min； 
g. 4000 rpm离心1 min，吸出上清液，加入50 μL预冷的CaCl2溶液，重悬菌体，此即为感受态细胞。4℃放置不超过72 h使用。 
热击转化 
a. 将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30 min； 
b. 准备42℃水浴，温度稳定后将a中混合液放入，热击60 s，迅速放冰上； 
c. 冰上放置5 min，加入700 μL新鲜LB培养基，37℃恢复培养1 h； 
d. 4000 rpm离心1 min，吸出上清液，留适当体积菌液，涂布于含Amp（100 μg/mL）的固体LB培养基上； 
e. 37℃静置培养。 
3) 亚克隆文库的筛选 
将文库中的克隆子逐个挑取，接入含Amp（100 μg/mL）的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。吸取过夜菌液1 μL转移至含Amp（100 μg/mL）的固体β-葡萄糖苷酶筛选培养基上，37℃培养14-16 h，菌斑周围出现黑色变色圈，确定为具有β-葡萄糖苷酶活性的亚克隆。 
请参见图4，其中出现黑色水解圈的克隆为pUC135B12。 
实施例7、亚克隆pUC135-138上表达β-葡萄糖苷酶的基因测序和开放阅读框的分析 
基因测序由华大基因(武汉)完成。测序结果分析涉及软件：DNAStar、在线工具Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)。 
图5为Unglu135B12基因DNA序列分析。序列表中序列1的DNA由片段由3470个碱基组成，请参见图5，从5’端第700位核苷酸开始到3039位核苷酸结束，存在一个完整的开放阅读框 (ORF，Open Reading Frame)。其中，自5’端的第700位至702位核苷酸为Unglu135B12的起始密码子ATG，自5’端的第3037位至3039位核苷酸为Unglu135B12的终止密码子TAG。经过Blast比对，Unglu135B12预测编码蛋白与来自Parabacteroides distasonis的β-glucosidase （YP_001303775.1）相似性为56%；与来自Bacteroides uniformis的hypothetical protein BACUNI_00919（ZP_02069505.1）相似性为56%。Unglu135B12基因编码的780个氨基酸组成的蛋白质，经简单组件结构研究工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析，结果预测从第71-290个氨基酸是糖基水解酶家族3高度保守结构功能域，从第356-642个氨基酸是糖基水解酶家族3C端高度保守结构功能域。 
实施例8、基因Unglu135B12重组质粒的表达及功能验证 
使用本实验室保存的pET28a表达载体，设计正向扩增引物135B12F:5'-CGGAATTC TCCTTTGTCTACCTTTGTCAG-3',引入EcoR I酶切位点；反向扩增引物 135B12R:5'-ATGCGGCCGCCGAGGTATTTACAAAACACG-3'，引入Not I酶切位点。PCR扩增产物与pET28a载体连接后转化大肠杆菌DH5α，并在含X-gal和IPTG的LB固体平板上筛选正向连接的阳性克隆，重组质粒命名为pET135B12。经酶切验证，转化空载体和重组质粒pET135B12经EcoR I、Not I酶切，证实重组质粒构建成功，且经公司测序，与原基因Unglu135B12序列一致，读码框正确。提取重组质粒pET135B12转化至E.coli BL21，得到菌株BL21/ pET135B12。在含有檬酸铁铵、七叶苷和卡那霉素的LB固体平板上培养菌株BL21/ pET135B12 （37℃）16 h后，发现在克隆周围产生了明显的黑色水解圈，说明pET135B12在大肠杆菌中的表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性，pET135B12的催化功能域具有独立的催化活性。 
请参见图6，提取转化空载体pET28a和转化重组质粒的转化子的质粒，经EcoR I、Not I酶切，证实重组质粒确实插入长度约为2400 bp的外源片段。 
请参见图7，其中空载体pET28a转化得到的转化子(图中CK)不能表达β-葡萄糖苷酶活性，在功能验证平板上无黑色显色圈出现。 
实施例9、Unglu135B12表达β-葡萄糖苷酶酶学性质初步研究 
① β-葡萄糖苷酶最适反应温度的研究：将分离纯化得到的粗酶液与反应底物混合，在不同温度条件下(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)恒温反应10 min，再按1.2.1中方法测定β-葡萄糖苷酶活力，以确定β-葡萄糖苷酶的最适反应温度。如图8所示，该酶的最适温度在35℃-40℃之间，此时酶活力在39.94U-40.98U之间。 
② β-葡萄糖苷酶最适反应pH的研究：将分离纯化得到的粗酶液与反应底物混合，加入不同pH的缓冲液(3.2、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、8.9、10)于最适温度恒温反应10 min，按1.2.1中方法测定β-葡萄糖苷酶活力，以确定酶的最适pH。如图9所示，该酶最适pH为7.0，此时酶活力为43.92U，在pH 4.5-7.5范围，酶活力保持85%以上。 
③ β-葡萄糖苷酶活力的测定：采用pNPG法测定β-葡萄糖苷酶活力。由于β-葡萄糖苷酶可水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)生成对硝基苯酚，产物对硝基苯酚在碱性条件下显黄色，因此可通过测定OD405的数值对对硝基苯酚进行定量，进一步可计算β-葡萄糖苷酶活力。酶活力单位规定为(IU)：每分钟产生1μmol pNP所需要的酶量。 
SEQ ID No:1：DNA序列表为克隆pET135B12所携带外源DNA序列 
gattcttgta tactatctgg tagggaaggg gatacccgta ctcgtgatgg agcccgtcaa        60 
gggcggcgcg ctggccagcg tcagcgacgg cgtcgcgggc gtgatgcgcg agcgccatcc       120 
cgacctgacg cctgcggcga acgccctgac cttcgttggt tcgcttccgg gtgtcatggt       180 
caccttgagc ggcatgtcca acatggagca gctcaaggag aatgtctcgg tgttcaccgg       240 
cttcaagccc ttcgaccaga aggagatgga cttcatgctt acggtggccg acctccacaa       300 
gtccaagggc cagatcccct gcacggcctg caagtactgc atgccctgtc cggcaggcgt       360 
ggacatcccc ggcaatttca agatatacaa cagcgccagc gaagccctca tctcttccga       420 
gaccgacagg aaggatgtcg ttagcaagcg caacgccttc ctcaagctct acaacgagca       480 
ggacaaggcc gttagggcag atgcctgcgt ggcgtgcaac gcctgccttt ccaaatgccc       540 
gcagcacatc agcatccccc agcacatgca gcgcatcaaa gacattgtcg ccagcctgta       600 
gtttgaacat acagtacaca ttttgaactt ccggctcttt ccggaagccc ttcctttgtc       660 
tacctttgtc agacacgaaa ccaaaccaat taccattata tgaaaagaat cttcttgatc       720 
gtcgctgcgg gccttatggc gctttccgcc gccgcccagc cgcagctcac caaagacaac       780 
attgaggaag tcctcaaagc catgaccctt caggagaagg ccacgctcct cgtcggagga       840 
gcccgcgccc agatggtgaa cggcgtcacc tccggtgtcg ccgcccaggt gcccggcgcg       900 
gccggcaaca cccgcccgat cgagcgcctc ggcatccccg gcaccgtcct cgccgacggc       960 
cctgccggtc tccgcatctc tccgacccgt cagggtacga ccgacacttt ctactgcacc      1020 
ggtttcccgg tgggtactct tctcgccagc tcctgggacc ttgacctcgt ccgggcagtt      1080 
accaccgcca tgggccagga ggttcacgag tacggcgtag acgtccttct cgccccgggt      1140 
atgaacatcc accgcaatcc tctatgcggc cgtaacttcg agtatttctc cgaggatcct      1200 
ctcctctccg gaaagatggc cgccgcctat gtcaacggca tccagtccaa caatgtgggc      1260 
gtgtccgtca agcactacgc agtgaacaac caggagacca accgcaacga ggacaacgcc      1320 
cgcgtcagcg agcgcgctct ccgcgagatc taccttagga acttcgagat agccattaag      1380 
gaagccaagc cctggaccgt catgtcctcc tacaaccagc tcaacggcga gtacacccag      1440 
cagaagaagg accttctcac caccatcctt cgcgatgagt ggggctttgg cggcatcgtc      1500 
atgaccgact ggggtaacaa agcgggtaca gtcaagtccg catgggccgg caacgatctc      1560 
atggagcccg gcaaccagaa cgaaatcgac cgcatcgtcg ccggtgtcca ggacggcagc      1620 
ctctccatcg aggatgtcga caggaatgtc cgccacatgc tcgagtacat cgtcaagact      1680 
ccttcgttca acaagtacaa gtattccaac aaacctgacc ttgccggaca cgcccaggtc      1740 
gcccgcaagg ctgccgccga gtccatggtg ctcctccgca acgaggataa cacccttcct      1800 
ctcaagggtg gccagaaggt cgctctctac ggcgtttccg ccatcgactt cgttgccggc      1860 
ggcaccggtt ccggtgacgt taacaaggcc tatgtcgtga atatggtgca gggacttgag      1920 
aatgccggat ttgtcctgga caagggtctg gtggattact acaatgcctt tgccgcttac      1980 
gacaaagcgc agagcgcgct ctccggcggc aacaattcct ggttctcgcg ccgcaagctc      2040 
gccgagatcg ccatccccga ggctgccatc gccaacgagg cgcgcaacaa tgacgttgcc      2100 
gtcatcgtca tcggccgcaa tgccggtgag ggcgccgacc gcaagatgat cgacgacttc      2160 
gacctgacta ccgtcgagcg cgagctgatc cgcgacgtca gccttgcctt ccacggacag      2220 
ggcaagaagg tcgtcgtcgt gctgaacatc ggaggcgtca tcgagaccaa ctcctggaag      2280 
aacagcgtcg acgccatcct ccttccctgg tctcccggcc aggagggcgc caatgccgtc      2340 
gccgacgtgc ttctcggcaa ggtcaatcct tccggcaagc tccctatgac cttcccggtc      2400 
aacttcatgg accacccgtc ctccgccaac ttcccttaca actacaaccg caacgcccag      2460 
cctcagggca tgggtatggg attcggcggc cctcagcagc gtcagctcca gaaggatgtc      2520 
gattatacca actatgagga aggcatctac gtcggctacc gctacttcac cactgccggc      2580 
aaggaagttt cctatccgtt cggctatggc atgagctaca cctccttctc ctacaccaag      2640 
cccgtcgtca aggccgtgtc gggcggcttc gtagccagcg tcaccgtgac caataccggt      2700 
gccgtcgccg gcaaggaagt cgtcgagctc tacgtctccg cccctgccgg cggtctcgag      2760 
aagcctgcgc gcgagcttcg tggttttgcc aagacccgcg agctcaagcc cggcgagagc      2820 
caggtcgtga acatagaggt caccaactac gagatcgctt ccttcaatga agccgcttcc      2880 
gcttgggagg ctccggcagg cgcatacaag atctgcttcg gcgccagcgt cgatgacatc      2940 
cgcgccaccg ccacctatca gctcaagaag gccgccagct ggaagaccaa caagctcttc      3000 
gccctcgacg ccccgctcaa cgagctttcc ctcaagtagg cagcgtgttt tgtaaatacc      3060 
tcgttatgag gtgattaaat aaatgtcccc ctccgttttt ggagggggac gtttgtttat      3120 
gttgttgatt tactgaaagt tacaaaacac ggagtttgta tcgtcctaaa aaaagtttac      3180 
caccaaaggt aagtttttat ggaagctaaa tgctatcggg cgatgcagcg tgcccaagga      3240 
aagatgctgc gtgagtattt ctccggagta ccggtggaga acctgtcaaa gcgatacgga      3300 
tacagtgtcc taaaaataaa gacgcttgca tccgattaca aacaagggaa aattgatatc      3360 
tttgacaatc cgcagaaacg tcggataact atgtcgatta tgacccacca ggaagaagta      3420 
caattactgc aggacaagat caaggcgctg gagaacgcct gaagctggcg                   3470 
SEQ ID No:2：基因Unglu135B12翻译氨基酸序列 
1          MET Lys Arg Ile Phe Leu Ile Val Ala Ala Gly Leu MET Ala Leu Ser Ala Ala Ala Gln  
21         Pro Gln Leu Thr Lys Asp Asn Ile Glu Glu Val Leu Lys Ala MET Thr Leu Gln Glu Lys  
41         Ala Thr Leu Leu Val Gly Gly Ala Arg Ala Gln MET Val Asn Gly Val Thr Ser Gly Val  
61         Ala Ala Gln Val Pro Gly Ala Ala Gly Asn Thr Arg Pro Ile Glu Arg Leu Gly Ile Pro  
81         Gly Thr Val Leu Ala Asp Gly Pro Ala Gly Leu Arg Ile Ser Pro Thr Arg Gln Gly Thr  
101        Thr Asp Thr Phe Tyr Cys Thr Gly Phe Pro Val Gly Thr Leu Leu Ala Ser Ser Trp Asp  
121        Leu Asp Leu Val Arg Ala Val Thr Thr Ala MET Gly Gln Glu Val His Glu Tyr Gly Val  
141        Asp Val Leu Leu Ala Pro Gly MET Asn Ile His Arg Asn Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe  
161        Glu Tyr Phe Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ser Gly Lys MET Ala Ala Ala Tyr Val Asn Gly  
181        Ile Gln Ser Asn Asn Val Gly Val Ser Val Lys His Tyr Ala Val Asn Asn Gln Glu Thr  
201        Asn Arg Asn Glu Asp Asn Ala Arg Val Ser Glu Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Arg  
221        Asn Phe Glu Ile Ala Ile Lys Glu Ala Lys Pro Trp Thr Val MET Ser Ser Tyr Asn Gln  
241        Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Gln Gln Lys Lys Asp Leu Leu Thr Thr Ile Leu Arg Asp Glu  
261        Trp Gly Phe Gly Gly Ile Val MET Thr Asp Trp Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Lys Ser  
281        Ala Trp Ala Gly Asn Asp Leu MET Glu Pro Gly Asn Gln Asn Glu Ile Asp Arg Ile Val  
301        Ala Gly Val Gln Asp Gly Ser Leu Ser Ile Glu Asp Val Asp Arg Asn Val Arg His MET  
321        Leu Glu Tyr Ile Val Lys Thr Pro Ser Phe Asn Lys Tyr Lys Tyr Ser Asn Lys Pro Asp  
341        Leu Ala Gly His Ala Gln Val Ala Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ser MET Val Leu Leu Arg  
361        Asn Glu Asp Asn Thr Leu Pro Leu Lys Gly Gly Gln Lys Val Ala Leu Tyr Gly Val Ser  
381        Ala Ile Asp Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Asp Val Asn Lys Ala Tyr Val Val  
401        Asn MET Val Gln Gly Leu Glu Asn Ala Gly Phe Val Leu Asp Lys Gly Leu Val Asp Tyr  
421        Tyr Asn Ala Phe Ala Ala Tyr Asp Lys Ala Gln Ser Ala Leu Ser Gly Gly Asn Asn Ser  
441        Trp Phe Ser Arg Arg Lys Leu Ala Glu Ile Ala Ile Pro Glu Ala Ala Ile Ala Asn Glu  
461        Ala Arg Asn Asn Asp Val Ala Val Ile Val Ile Gly Arg Asn Ala Gly Glu Gly Ala Asp  
481        Arg Lys MET Ile Asp Asp Phe Asp Leu Thr Thr Val Glu Arg Glu Leu Ile Arg Asp Val  
501        Ser Leu Ala Phe His Gly Gln Gly Lys Lys Val Val Val Val Leu Asn Ile Gly Gly Val  
521        Ile Glu Thr Asn Ser Trp Lys Asn Ser Val Asp Ala Ile Leu Leu Pro Trp Ser Pro Gly  
541        Gln Glu Gly Ala Asn Ala Val Ala Asp Val Leu Leu Gly Lys Val Asn Pro Ser Gly Lys  
561        Leu Pro MET Thr Phe Pro Val Asn Phe MET Asp His Pro Ser Ser Ala Asn Phe Pro Tyr  
581        Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Gln Pro Gln Gly MET Gly MET Gly Phe Gly Gly Pro Gln Gln  
601        Arg Gln Leu Gln Lys Asp Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Glu Glu Gly Ile Tyr Val Gly Tyr  
621        Arg Tyr Phe Thr Thr Ala Gly Lys Glu Val Ser Tyr Pro Phe Gly Tyr Gly MET Ser Tyr  
641        Thr Ser Phe Ser Tyr Thr Lys Pro Val Val Lys Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ala Ser  
661        Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Ala Val Ala Gly Lys Glu Val Val Glu Leu Tyr Val Ser  
681        Ala Pro Ala Gly Gly Leu Glu Lys Pro Ala Arg Glu Leu Arg Gly Phe Ala Lys Thr Arg  
701        Glu Leu Lys Pro Gly Glu Ser Gln Val Val Asn Ile Glu Val Thr Asn Tyr Glu Ile Ala  
721        Ser Phe Asn Glu Ala Ala Ser Ala Trp Glu Ala Pro Ala Gly Ala Tyr Lys Ile Cys Phe  
741        Gly Ala Ser Val Asp Asp Ile Arg Ala Thr Ala Thr Tyr Gln Leu Lys Lys Ala Ala Ser  
761        Trp Lys Thr Asn Lys Leu Phe Ala Leu Asp Ala Pro Leu Asn Glu Leu Ser Leu Lys ***  
SEQ ID No:3：基因Unglu135B12翻译氨基酸序列的部分序列 
1          Thr Arg Pro Ile Glu Arg Leu Gly Ile Pro Gly Thr Val Leu Ala Asp Gly Pro Ala Gly 
21         Leu Arg Ile Ser Pro Thr Arg Gln Gly Thr Thr Asp Thr Phe Tyr Cys Thr Gly Phe Pro 
41         Val Gly Thr Leu Leu Ala Ser Ser Trp Asp Leu Asp Leu Val Arg Ala Val Thr Thr Ala 
61         MET Gly Gln Glu Val His Glu Tyr Gly Val Asp Val Leu Leu Ala Pro Gly MET Asn Ile 
81         His Arg Asn Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ser 
101        Gly Lys MET Ala Ala Ala Tyr Val Asn Gly Ile Gln Ser Asn Asn Val Gly Val Ser Val 
121        Lys His Tyr Ala Val Asn Asn Gln Glu Thr Asn Arg Asn Glu Asp Asn Ala Arg Val Ser 
141        Glu Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ala Ile Lys Glu Ala Lys 
161        Pro Trp Thr Val MET Ser Ser Tyr Asn Gln Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Gln Gln Lys Lys 
181        Asp Leu Leu Thr Thr Ile Leu Arg Asp Glu Trp Gly Phe Gly Gly Ile Val MET Thr Asp 
201        Trp Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Lys Ser Ala Trp Ala Gly Asn Asp Leu MET Glu Pro 
SEQ ID No:4：基因Unglu135B12翻译氨基酸序列的部分序列 
1          MET Val Leu Leu Arg Asn Glu Asp Asn Thr Leu Pro Leu Lys Gly Gly Gln Lys Val Ala 
21         Leu Tyr Gly Val Ser Ala Ile Asp Phe Val Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Asp Val Asn 
41         Lys Ala Tyr Val Val Asn MET Val Gln Gly Leu Glu Asn Ala Gly Phe Val Leu Asp Lys 
61         Gly Leu Val Asp Tyr Tyr Asn Ala Phe Ala Ala Tyr Asp Lys Ala Gln Ser Ala Leu Ser 
81         Gly Gly Asn Asn Ser Trp Phe Ser Arg Arg Lys Leu Ala Glu Ile Ala Ile Pro Glu Ala 
101        Ala Ile Ala Asn Glu Ala Arg Asn Asn Asp Val Ala Val Ile Val Ile Gly Arg Asn Ala 
121        Gly Glu Gly Ala Asp Arg Lys MET Ile Asp Asp Phe Asp Leu Thr Thr Val Glu Arg Glu 
141        Leu Ile Arg Asp Val Ser Leu Ala Phe His Gly Gln Gly Lys Lys Val Val Val Val Leu 
161        Asn Ile Gly Gly Val Ile Glu Thr Asn Ser Trp Lys Asn Ser Val Asp Ala Ile Leu Leu 
181        Pro Trp Ser Pro Gly Gln Glu Gly Ala Asn Ala Val Ala Asp Val Leu Leu Gly Lys Val 
201        Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro MET Thr Phe Pro Val Asn Phe MET Asp His Pro Ser Ser 
221        Ala Asn Phe Pro Tyr Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Gln Pro Gln Gly MET Gly MET Gly Phe 
241        Gly Gly Pro Gln Gln Arg Gln Leu Gln Lys Asp Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Glu Glu Gly 
261        Ile Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Thr Thr Ala Gly Lys Glu Val Ser Tyr Pro Phe Gly 
281        Tyr Gly MET Ser Tyr Thr Ser 
                                SEQUENCE LISTING
 
<110>  湖南农业大学
 <120>  一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用
 <130>  2012
 <160>  6    
 <170>  PatentIn version 3.5
 <210>  1
<211>  3470
<212>  DNA
<213>  牛瘤胃细菌
 <400>  1
gattcttgta tactatctgg tagggaaggg gatacccgta ctcgtgatgg agcccgtcaa       60
 gggcggcgcg ctggccagcg tcagcgacgg cgtcgcgggc gtgatgcgcg agcgccatcc      120
 cgacctgacg cctgcggcga acgccctgac cttcgttggt tcgcttccgg gtgtcatggt      180
 caccttgagc ggcatgtcca acatggagca gctcaaggag aatgtctcgg tgttcaccgg      240
 cttcaagccc ttcgaccaga aggagatgga cttcatgctt acggtggccg acctccacaa      300
 gtccaagggc cagatcccct gcacggcctg caagtactgc atgccctgtc cggcaggcgt      360
 ggacatcccc ggcaatttca agatatacaa cagcgccagc gaagccctca tctcttccga      420
 gaccgacagg aaggatgtcg ttagcaagcg caacgccttc ctcaagctct acaacgagca      480
 ggacaaggcc gttagggcag atgcctgcgt ggcgtgcaac gcctgccttt ccaaatgccc      540
 gcagcacatc agcatccccc agcacatgca gcgcatcaaa gacattgtcg ccagcctgta      600
 gtttgaacat acagtacaca ttttgaactt ccggctcttt ccggaagccc ttcctttgtc      660
 tacctttgtc agacacgaaa ccaaaccaat taccattata tgaaaagaat cttcttgatc      720
 gtcgctgcgg gccttatggc gctttccgcc gccgcccagc cgcagctcac caaagacaac      780
 attgaggaag tcctcaaagc catgaccctt caggagaagg ccacgctcct cgtcggagga      840
 gcccgcgccc agatggtgaa cggcgtcacc tccggtgtcg ccgcccaggt gcccggcgcg      900
 gccggcaaca cccgcccgat cgagcgcctc ggcatccccg gcaccgtcct cgccgacggc      960
 cctgccggtc tccgcatctc tccgacccgt cagggtacga ccgacacttt ctactgcacc     1020
 ggtttcccgg tgggtactct tctcgccagc tcctgggacc ttgacctcgt ccgggcagtt     1080
 accaccgcca tgggccagga ggttcacgag tacggcgtag acgtccttct cgccccgggt     1140
 atgaacatcc accgcaatcc tctatgcggc cgtaacttcg agtatttctc cgaggatcct     1200
 ctcctctccg gaaagatggc cgccgcctat gtcaacggca tccagtccaa caatgtgggc     1260
 gtgtccgtca agcactacgc agtgaacaac caggagacca accgcaacga ggacaacgcc     1320
 cgcgtcagcg agcgcgctct ccgcgagatc taccttagga acttcgagat agccattaag     1380
 gaagccaagc cctggaccgt catgtcctcc tacaaccagc tcaacggcga gtacacccag     1440
 cagaagaagg accttctcac caccatcctt cgcgatgagt ggggctttgg cggcatcgtc     1500
 atgaccgact ggggtaacaa agcgggtaca gtcaagtccg catgggccgg caacgatctc     1560
 atggagcccg gcaaccagaa cgaaatcgac cgcatcgtcg ccggtgtcca ggacggcagc     1620
 ctctccatcg aggatgtcga caggaatgtc cgccacatgc tcgagtacat cgtcaagact     1680
 ccttcgttca acaagtacaa gtattccaac aaacctgacc ttgccggaca cgcccaggtc     1740
 gcccgcaagg ctgccgccga gtccatggtg ctcctccgca acgaggataa cacccttcct     1800
 ctcaagggtg gccagaaggt cgctctctac ggcgtttccg ccatcgactt cgttgccggc     1860
 ggcaccggtt ccggtgacgt taacaaggcc tatgtcgtga atatggtgca gggacttgag     1920
 aatgccggat ttgtcctgga caagggtctg gtggattact acaatgcctt tgccgcttac     1980
 gacaaagcgc agagcgcgct ctccggcggc aacaattcct ggttctcgcg ccgcaagctc     2040
 gccgagatcg ccatccccga ggctgccatc gccaacgagg cgcgcaacaa tgacgttgcc     2100
 gtcatcgtca tcggccgcaa tgccggtgag ggcgccgacc gcaagatgat cgacgacttc     2160
 gacctgacta ccgtcgagcg cgagctgatc cgcgacgtca gccttgcctt ccacggacag     2220
 ggcaagaagg tcgtcgtcgt gctgaacatc ggaggcgtca tcgagaccaa ctcctggaag     2280
 aacagcgtcg acgccatcct ccttccctgg tctcccggcc aggagggcgc caatgccgtc     2340
 gccgacgtgc ttctcggcaa ggtcaatcct tccggcaagc tccctatgac cttcccggtc     2400
 aacttcatgg accacccgtc ctccgccaac ttcccttaca actacaaccg caacgcccag     2460
 cctcagggca tgggtatggg attcggcggc cctcagcagc gtcagctcca gaaggatgtc     2520
 gattatacca actatgagga aggcatctac gtcggctacc gctacttcac cactgccggc     2580
 aaggaagttt cctatccgtt cggctatggc atgagctaca cctccttctc ctacaccaag     2640
 cccgtcgtca aggccgtgtc gggcggcttc gtagccagcg tcaccgtgac caataccggt     2700
 gccgtcgccg gcaaggaagt cgtcgagctc tacgtctccg cccctgccgg cggtctcgag     2760
 aagcctgcgc gcgagcttcg tggttttgcc aagacccgcg agctcaagcc cggcgagagc     2820
 caggtcgtga acatagaggt caccaactac gagatcgctt ccttcaatga agccgcttcc     2880
 gcttgggagg ctccggcagg cgcatacaag atctgcttcg gcgccagcgt cgatgacatc     2940
 cgcgccaccg ccacctatca gctcaagaag gccgccagct ggaagaccaa caagctcttc     3000
 gccctcgacg ccccgctcaa cgagctttcc ctcaagtagg cagcgtgttt tgtaaatacc     3060
 tcgttatgag gtgattaaat aaatgtcccc ctccgttttt ggagggggac gtttgtttat     3120
 gttgttgatt tactgaaagt tacaaaacac ggagtttgta tcgtcctaaa aaaagtttac     3180
 caccaaaggt aagtttttat ggaagctaaa tgctatcggg cgatgcagcg tgcccaagga     3240
 aagatgctgc gtgagtattt ctccggagta ccggtggaga acctgtcaaa gcgatacgga     3300
 tacagtgtcc taaaaataaa gacgcttgca tccgattaca aacaagggaa aattgatatc     3360
 tttgacaatc cgcagaaacg tcggataact atgtcgatta tgacccacca ggaagaagta     3420
 caattactgc aggacaagat caaggcgctg gagaacgcct gaagctggcg                3470
  
<210>  2
<211>  3470
<212>  PRT
<213>  Unglu135B12基因的氨基酸序列
 <400>  2
 Gly Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr
1               5                   10                  15     
 Cys Thr Gly Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala
            20                  25                  30          
 Thr Ala Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr
        35                  40                  45             
 Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys
    50                  55                  60                  
 Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly
65                  70                  75                  80 
 Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys
                85                  90                  95     
 Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Cys Gly Ala Gly
            100                 105                 110        
 Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala
        115                 120                 125            
 Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys
    130                 135                 140                
 Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Thr Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
 Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Ala
                165                 170                 175    
 Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly
            180                 185                 190        
 Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly
        195                 200                 205            
 Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly
    210                 215                 220                
 Thr Cys Thr Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly
225                 230                 235                 240
 Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys
                245                 250                 255    
 Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr
            260                 265                 270        
 Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys
        275                 280                 285            
 Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys
    290                 295                 300                
 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Cys Thr
305                 310                 315                 320
 Gly Cys Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala
                325                 330                 335    
 Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly
            340                 345                 350        
 Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys
        355                 360                 365            
 Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr
    370                 375                 380                
 Ala Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys
385                 390                 395                 400
 Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Thr
                405                 410                 415    
 Cys Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala
            420                 425                 430        
Gly Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala Gly
        435                 440                 445            
 Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala
    450                 455                 460                
 Ala Gly Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala
465                 470                 475                 480
 Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Gly Gly
                485                 490                 495    
 Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly
            500                 505                 510        
 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr
        515                 520                 525            
 Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly
    530                 535                 540                
 Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Cys
545                 550                 555                 560
 Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr
                565                 570                 575    
 Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys
            580                 585                 590        
 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Cys
        595                 600                 605            
 Ala Thr Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr
    610                 615                 620                
 Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr
625                 630                 635                 640
 Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr
                645                 650                 655    
 Thr Gly Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
            660                 665                 670        
 Ala Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala
        675                 680                 685            
 Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala
    690                 695                 700                
 Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr Cys
705                 710                 715                 720
 Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Ala
                725                 730                 735    
 Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys
            740                 745                 750        
 Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys
        755                 760                 765            
 Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly
    770                 775                 780                
 Ala Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys
785                 790                 795                 800
 Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly
                805                 810                 815    
 Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly
            820                 825                 830        
 Thr Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys
        835                 840                 845            
 Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys
    850                 855                 860                
 Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Gly
865                 870                 875                 880
 Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly
                885                 890                 895    
 Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys
            900                 905                 910        
 Cys Gly Cys Cys Cys Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys
        915                 920                 925            
 Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys
    930                 935                 940                
 Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys
945                 950                 955                 960
 Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala
                965                 970                 975    
 Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala
            980                 985                 990        
 Gly Gly Gly Thr Ala Cys Gly Ala  Cys Cys Gly Ala Cys  Ala Cys Thr
        995                 1000                 1005            
 Thr Thr  Cys Thr Ala Cys Thr  Gly Cys Ala Cys Cys  Gly Gly Thr
    1010                 1015                 1020            
 Thr Thr  Cys Cys Cys Gly Gly  Thr Gly Gly Gly Thr  Ala Cys Thr
    1025                 1030                 1035            
 Cys Thr  Thr Cys Thr Cys Gly  Cys Cys Ala Gly Cys  Thr Cys Cys
    1040                 1045                 1050            
 Thr Gly  Gly Gly Ala Cys Cys  Thr Thr Gly Ala Cys  Cys Thr Cys
    1055                 1060                 1065            
 Gly Thr  Cys Cys Gly Gly Gly  Cys Ala Gly Thr Thr  Ala Cys Cys
    1070                 1075                 1080            
 Ala Cys  Cys Gly Cys Cys Ala  Thr Gly Gly Gly Cys  Cys Ala Gly
    1085                 1090                 1095            
 Gly Ala  Gly Gly Thr Thr Cys  Ala Cys Gly Ala Gly  Thr Ala Cys
    1100                 1105                 1110            
 Gly Gly  Cys Gly Thr Ala Gly  Ala Cys Gly Thr Cys  Cys Thr Thr
    1115                 1120                 1125            
 Cys Thr  Cys Gly Cys Cys Cys  Cys Gly Gly Gly Thr  Ala Thr Gly
    1130                 1135                 1140            
 Ala Ala  Cys Ala Thr Cys Cys  Ala Cys Cys Gly Cys  Ala Ala Thr
    1145                 1150                 1155             
 Cys Cys  Thr Cys Thr Ala Thr  Gly Cys Gly Gly Cys  Cys Gly Thr
    1160                 1165                 1170            
 Ala Ala  Cys Thr Thr Cys Gly  Ala Gly Thr Ala Thr  Thr Thr Cys
    1175                 1180                 1185             
 Thr Cys  Cys Gly Ala Gly Gly  Ala Thr Cys Cys Thr  Cys Thr Cys
    1190                 1195                 1200            
 Cys Thr  Cys Thr Cys Cys Gly  Gly Ala Ala Ala Gly  Ala Thr Gly
    1205                 1210                 1215             
 Gly Cys  Cys Gly Cys Cys Gly  Cys Cys Thr Ala Thr  Gly Thr Cys
    1220                 1225                 1230            
 Ala Ala  Cys Gly Gly Cys Ala  Thr Cys Cys Ala Gly  Thr Cys Cys
    1235                 1240                 1245            
 Ala Ala  Cys Ala Ala Thr Gly  Thr Gly Gly Gly Cys  Gly Thr Gly
    1250                 1255                 1260            
 Thr Cys  Cys Gly Thr Cys Ala  Ala Gly Cys Ala Cys  Thr Ala Cys
    1265                 1270                 1275            
 Gly Cys  Ala Gly Thr Gly Ala  Ala Cys Ala Ala Cys  Cys Ala Gly
    1280                 1285                 1290            
 Gly Ala  Gly Ala Cys Cys Ala  Ala Cys Cys Gly Cys  Ala Ala Cys
    1295                 1300                 1305            
 Gly Ala  Gly Gly Ala Cys Ala  Ala Cys Gly Cys Cys  Cys Gly Cys
    1310                 1315                 1320            
 Gly Thr  Cys Ala Gly Cys Gly  Ala Gly Cys Gly Cys  Gly Cys Thr
    1325                 1330                 1335            
Cys Thr  Cys Cys Gly Cys Gly  Ala Gly Ala Thr Cys  Thr Ala Cys
    1340                 1345                 1350            
Cys Thr  Thr Ala Gly Gly Ala  Ala Cys Thr Thr Cys  Gly Ala Gly
    1355                 1360                 1365            
Ala Thr  Ala Gly Cys Cys Ala  Thr Thr Ala Ala Gly  Gly Ala Ala
    1370                 1375                 1380             
 Gly Cys  Cys Ala Ala Gly Cys  Cys Cys Thr Gly Gly  Ala Cys Cys
    1385                 1390                 1395            
 Gly Thr  Cys Ala Thr Gly Thr  Cys Cys Thr Cys Cys  Thr Ala Cys
    1400                 1405                 1410             
 Ala Ala  Cys Cys Ala Gly Cys  Thr Cys Ala Ala Cys  Gly Gly Cys
    1415                 1420                 1425            
 Gly Ala  Gly Thr Ala Cys Ala  Cys Cys Cys Ala Gly  Cys Ala Gly
    1430                 1435                 1440             
 Ala Ala  Gly Ala Ala Gly Gly  Ala Cys Cys Thr Thr  Cys Thr Cys
    1445                 1450                 1455            
 Ala Cys  Cys Ala Cys Cys Ala  Thr Cys Cys Thr Thr  Cys Gly Cys
    1460                 1465                 1470            
 Gly Ala  Thr Gly Ala Gly Thr  Gly Gly Gly Gly Cys  Thr Thr Thr
    1475                 1480                 1485            
 Gly Gly  Cys Gly Gly Cys Ala  Thr Cys Gly Thr Cys  Ala Thr Gly
    1490                 1495                 1500            
 Ala Cys  Cys Gly Ala Cys Thr  Gly Gly Gly Gly Thr  Ala Ala Cys
    1505                 1510                 1515            
 Ala Ala  Ala Gly Cys Gly Gly  Gly Thr Ala Cys Ala  Gly Thr Cys
    1520                 1525                 1530            
 Ala Ala  Gly Thr Cys Cys Gly  Cys Ala Thr Gly Gly  Gly Cys Cys
    1535                 1540                 1545            
Gly Gly  Cys Ala Ala Cys Gly  Ala Thr Cys Thr Cys  Ala Thr Gly
    1550                 1555                 1560            
Gly Ala  Gly Cys Cys Cys Gly  Gly Cys Ala Ala Cys  Cys Ala Gly
    1565                 1570                 1575            
Ala Ala  Cys Gly Ala Ala Ala  Thr Cys Gly Ala Cys  Cys Gly Cys
    1580                 1585                 1590            
Ala Thr  Cys Gly Thr Cys Gly  Cys Cys Gly Gly Thr  Gly Thr Cys
    1595                 1600                 1605             
Cys Ala  Gly Gly Ala Cys Gly  Gly Cys Ala Gly Cys  Cys Thr Cys
    1610                 1615                 1620            
Thr Cys  Cys Ala Thr Cys Gly  Ala Gly Gly Ala Thr  Gly Thr Cys
    1625                 1630                 1635             
Gly Ala  Cys Ala Gly Gly Ala  Ala Thr Gly Thr Cys  Cys Gly Cys
    1640                 1645                 1650            
Cys Ala  Cys Ala Thr Gly Cys  Thr Cys Gly Ala Gly  Thr Ala Cys
    1655                 1660                 1665             
Ala Thr  Cys Gly Thr Cys Ala  Ala Gly Ala Cys Thr  Cys Cys Thr
    1670                 1675                 1680            
Thr Cys  Gly Thr Thr Cys Ala  Ala Cys Ala Ala Gly  Thr Ala Cys
    1685                 1690                 1695            
Ala Ala  Gly Thr Ala Thr Thr  Cys Cys Ala Ala Cys  Ala Ala Ala
    1700                 1705                 1710            
Cys Cys  Thr Gly Ala Cys Cys  Thr Thr Gly Cys Cys  Gly Gly Ala
    1715                 1720                 1725            
Cys Ala  Cys Gly Cys Cys Cys  Ala Gly Gly Thr Cys  Gly Cys Cys
    1730                 1735                 1740            
Cys Gly  Cys Ala Ala Gly Gly  Cys Thr Gly Cys Cys  Gly Cys Cys
    1745                 1750                 1755            
Gly Ala  Gly Thr Cys Cys Ala  Thr Gly Gly Thr Gly  Cys Thr Cys
    1760                 1765                 1770            
Cys Thr  Cys Cys Gly Cys Ala  Ala Cys Gly Ala Gly  Gly Ala Thr
    1775                 1780                 1785            
Ala Ala  Cys Ala Cys Cys Cys  Thr Thr Cys Cys Thr  Cys Thr Cys
    1790                 1795                 1800            
Ala Ala  Gly Gly Gly Thr Gly  Gly Cys Cys Ala Gly  Ala Ala Gly
    1805                 1810                 1815            
Gly Thr  Cys Gly Cys Thr Cys  Thr Cys Thr Ala Cys  Gly Gly Cys
    1820                 1825                 1830             
Gly Thr  Thr Thr Cys Cys Gly  Cys Cys Ala Thr Cys  Gly Ala Cys
    1835                 1840                 1845            
Thr Thr  Cys Gly Thr Thr Gly  Cys Cys Gly Gly Cys  Gly Gly Cys
    1850                 1855                 1860             
Ala Cys  Cys Gly Gly Thr Thr  Cys Cys Gly Gly Thr  Gly Ala Cys
    1865                 1870                 1875            
Gly Thr  Thr Ala Ala Cys Ala  Ala Gly Gly Cys Cys  Thr Ala Thr
    1880                 1885                 1890             
Gly Thr  Cys Gly Thr Gly Ala  Ala Thr Ala Thr Gly  Gly Thr Gly
    1895                 1900                 1905            
Cys Ala  Gly Gly Gly Ala Cys  Thr Thr Gly Ala Gly  Ala Ala Thr
    1910                 1915                 1920            
Gly Cys  Cys Gly Gly Ala Thr  Thr Thr Gly Thr Cys  Cys Thr Gly
    1925                 1930                 1935            
Gly Ala  Cys Ala Ala Gly Gly  Gly Thr Cys Thr Gly  Gly Thr Gly
    1940                 1945                 1950            
Gly Ala  Thr Thr Ala Cys Thr  Ala Cys Ala Ala Thr  Gly Cys Cys
    1955                 1960                 1965            
Thr Thr  Thr Gly Cys Cys Gly  Cys Thr Thr Ala Cys  Gly Ala Cys
    1970                 1975                 1980            
Ala Ala  Ala Gly Cys Gly Cys  Ala Gly Ala Gly Cys  Gly Cys Gly
    1985                 1990                 1995            
Cys Thr  Cys Thr Cys Cys Gly  Gly Cys Gly Gly Cys  Ala Ala Cys
    2000                 2005                 2010            
Ala Ala  Thr Thr Cys Cys Thr  Gly Gly Thr Thr Cys  Thr Cys Gly
    2015                 2020                 2025             
Cys Gly  Cys Cys Gly Cys Ala  Ala Gly Cys Thr Cys  Gly Cys Cys
    2030                 2035                 2040            
Gly Ala  Gly Ala Thr Cys Gly  Cys Cys Ala Thr Cys  Cys Cys Cys
    2045                 2050                 2055             
Gly Ala  Gly Gly Cys Thr Gly  Cys Cys Ala Thr Cys  Gly Cys Cys
    2060                 2065                 2070            
Ala Ala  Cys Gly Ala Gly Gly  Cys Gly Cys Gly Cys  Ala Ala Cys
    2075                 2080                 2085             
Ala Ala  Thr Gly Ala Cys Gly  Thr Thr Gly Cys Cys  Gly Thr Cys
    2090                 2095                 2100            
Ala Thr  Cys Gly Thr Cys Ala  Thr Cys Gly Gly Cys  Cys Gly Cys
    2105                 2110                 2115            
Ala Ala  Thr Gly Cys Cys Gly  Gly Thr Gly Ala Gly  Gly Gly Cys
    2120                 2125                 2130            
Gly Cys  Cys Gly Ala Cys Cys  Gly Cys Ala Ala Gly  Ala Thr Gly
    2135                 2140                 2145            
Ala Thr  Cys Gly Ala Cys Gly  Ala Cys Thr Thr Cys  Gly Ala Cys
    2150                 2155                 2160            
Cys Thr  Gly Ala Cys Thr Ala  Cys Cys Gly Thr Cys  Gly Ala Gly
    2165                 2170                 2175            
Cys Gly  Cys Gly Ala Gly Cys  Thr Gly Ala Thr Cys  Cys Gly Cys
    2180                 2185                 2190            
Gly Ala  Cys Gly Thr Cys Ala  Gly Cys Cys Thr Thr  Gly Cys Cys
    2195                 2200                 2205            
Thr Thr  Cys Cys Ala Cys Gly  Gly Ala Cys Ala Gly  Gly Gly Cys
    2210                 2215                 2220            
Ala Ala  Gly Ala Ala Gly Gly  Thr Cys Gly Thr Cys  Gly Thr Cys
    2225                 2230                 2235            
Gly Thr  Gly Cys Thr Gly Ala  Ala Cys Ala Thr Cys  Gly Gly Ala
    2240                 2245                 2250             
Gly Gly  Cys Gly Thr Cys Ala  Thr Cys Gly Ala Gly  Ala Cys Cys
    2255                 2260                 2265            
Ala Ala  Cys Thr Cys Cys Thr  Gly Gly Ala Ala Gly  Ala Ala Cys
    2270                 2275                 2280             
 Ala Gly  Cys Gly Thr Cys Gly  Ala Cys Gly Cys Cys  Ala Thr Cys
    2285                 2290                 2295            
Cys Thr  Cys Cys Thr Thr Cys  Cys Cys Thr Gly Gly  Thr Cys Thr
    2300                 2305                 2310             
Cys Cys  Cys Gly Gly Cys Cys  Ala Gly Gly Ala Gly  Gly Gly Cys
    2315                 2320                 2325            
Gly Cys  Cys Ala Ala Thr Gly  Cys Cys Gly Thr Cys  Gly Cys Cys
    2330                 2335                 2340            
Gly Ala  Cys Gly Thr Gly Cys  Thr Thr Cys Thr Cys  Gly Gly Cys
    2345                 2350                 2355            
Ala Ala  Gly Gly Thr Cys Ala  Ala Thr Cys Cys Thr  Thr Cys Cys
    2360                 2365                 2370            
Gly Gly  Cys Ala Ala Gly Cys  Thr Cys Cys Cys Thr  Ala Thr Gly
    2375                 2380                 2385            
Ala Cys  Cys Thr Thr Cys Cys  Cys Gly Gly Thr Cys  Ala Ala Cys
    2390                 2395                 2400            
Thr Thr  Cys Ala Thr Gly Gly  Ala Cys Cys Ala Cys  Cys Cys Gly
    2405                 2410                 2415            
Thr Cys  Cys Thr Cys Cys Gly  Cys Cys Ala Ala Cys  Thr Thr Cys
    2420                 2425                 2430            
Cys Cys  Thr Thr Ala Cys Ala  Ala Cys Thr Ala Cys  Ala Ala Cys
    2435                 2440                 2445            
Cys Gly  Cys Ala Ala Cys Gly  Cys Cys Cys Ala Gly  Cys Cys Thr
    2450                 2455                 2460            
Cys Ala  Gly Gly Gly Cys Ala  Thr Gly Gly Gly Thr  Ala Thr Gly
    2465                 2470                 2475             
Gly Gly  Ala Thr Thr Cys Gly  Gly Cys Gly Gly Cys  Cys Cys Thr
    2480                 2485                 2490            
Cys Ala  Gly Cys Ala Gly Cys  Gly Thr Cys Ala Gly  Cys Thr Cys
    2495                 2500                 2505             
Cys Ala  Gly Ala Ala Gly Gly  Ala Thr Gly Thr Cys  Gly Ala Thr
    2510                 2515                 2520            
Thr Ala  Thr Ala Cys Cys Ala  Ala Cys Thr Ala Thr  Gly Ala Gly
    2525                 2530                 2535             
Gly Ala  Ala Gly Gly Cys Ala  Thr Cys Thr Ala Cys  Gly Thr Cys
    2540                 2545                 2550            
Gly Gly  Cys Thr Ala Cys Cys  Gly Cys Thr Ala Cys  Thr Thr Cys
    2555                 2560                 2565            
Ala Cys  Cys Ala Cys Thr Gly  Cys Cys Gly Gly Cys  Ala Ala Gly
    2570                 2575                 2580            
Gly Ala  Ala Gly Thr Thr Thr  Cys Cys Thr Ala Thr  Cys Cys Gly
    2585                 2590                 2595            
Thr Thr  Cys Gly Gly Cys Thr  Ala Thr Gly Gly Cys  Ala Thr Gly
    2600                 2605                 2610            
Ala Gly  Cys Thr Ala Cys Ala  Cys Cys Thr Cys Cys  Thr Thr Cys
    2615                 2620                 2625            
Thr Cys  Cys Thr Ala Cys Ala  Cys Cys Ala Ala Gly  Cys Cys Cys
    2630                 2635                 2640            
Gly Thr  Cys Gly Thr Cys Ala  Ala Gly Gly Cys Cys  Gly Thr Gly
    2645                 2650                 2655            
Thr Cys  Gly Gly Gly Cys Gly  Gly Cys Thr Thr Cys  Gly Thr Ala
    2660                 2665                 2670            
Gly Cys  Cys Ala Gly Cys Gly  Thr Cys Ala Cys Cys  Gly Thr Gly
    2675                 2680                 2685            
Ala Cys  Cys Ala Ala Thr Ala  Cys Cys Gly Gly Thr  Gly Cys Cys
    2690                 2695                 2700             
Gly Thr  Cys Gly Cys Cys Gly  Gly Cys Ala Ala Gly  Gly Ala Ala
    2705                 2710                 2715            
Gly Thr  Cys Gly Thr Cys Gly  Ala Gly Cys Thr Cys  Thr Ala Cys
    2720                 2725                 2730             
Gly Thr  Cys Thr Cys Cys Gly  Cys Cys Cys Cys Thr  Gly Cys Cys
    2735                 2740                 2745            
Gly Gly  Cys Gly Gly Thr Cys  Thr Cys Gly Ala Gly  Ala Ala Gly
    2750                 2755                 2760             
Cys Cys  Thr Gly Cys Gly Cys  Gly Cys Gly Ala Gly  Cys Thr Thr
    2765                 2770                 2775            
Cys Gly  Thr Gly Gly Thr Thr  Thr Thr Gly Cys Cys  Ala Ala Gly
    2780                 2785                 2790            
Ala Cys  Cys Cys Gly Cys Gly  Ala Gly Cys Thr Cys  Ala Ala Gly
    2795                 2800                 2805            
Cys Cys  Cys Gly Gly Cys Gly  Ala Gly Ala Gly Cys  Cys Ala Gly
    2810                 2815                 2820            
Gly Thr  Cys Gly Thr Gly Ala  Ala Cys Ala Thr Ala  Gly Ala Gly
    2825                 2830                 2835            
Gly Thr  Cys Ala Cys Cys Ala  Ala Cys Thr Ala Cys  Gly Ala Gly
    2840                 2845                 2850            
Ala Thr  Cys Gly Cys Thr Thr  Cys Cys Thr Thr Cys  Ala Ala Thr
    2855                 2860                 2865            
Gly Ala  Ala Gly Cys Cys Gly  Cys Thr Thr Cys Cys  Gly Cys Thr
    2870                 2875                 2880            
Thr Gly  Gly Gly Ala Gly Gly  Cys Thr Cys Cys Gly  Gly Cys Ala
    2885                 2890                 2895             
Gly Gly  Cys Gly Cys Ala Thr  Ala Cys Ala Ala Gly  Ala Thr Cys
    2900                 2905                 2910            
Thr Gly  Cys Thr Thr Cys Gly  Gly Cys Gly Cys Cys  Ala Gly Cys
    2915                 2920                 2925             
Gly Thr  Cys Gly Ala Thr Gly  Ala Cys Ala Thr Cys  Cys Gly Cys
    2930                 2935                 2940            
Gly Cys  Cys Ala Cys Cys Gly  Cys Cys Ala Cys Cys  Thr Ala Thr
    2945                 2950                 2955             
Cys Ala  Gly Cys Thr Cys Ala  Ala Gly Ala Ala Gly  Gly Cys Cys
    2960                 2965                 2970            
Gly Cys  Cys Ala Gly Cys Thr  Gly Gly Ala Ala Gly  Ala Cys Cys
    2975                 2980                 2985            
Ala Ala  Cys Ala Ala Gly Cys  Thr Cys Thr Thr Cys  Gly Cys Cys
    2990                 2995                 3000            
Cys Thr  Cys Gly Ala Cys Gly  Cys Cys Cys Cys Gly  Cys Thr Cys
    3005                 3010                 3015            
Ala Ala  Cys Gly Ala Gly Cys  Thr Thr Thr Cys Cys  Cys Thr Cys
    3020                 3025                 3030            
Ala Ala  Gly Thr Ala Gly Gly  Cys Ala Gly Cys Gly  Thr Gly Thr
    3035                 3040                 3045            
Thr Thr  Thr Gly Thr Ala Ala  Ala Thr Ala Cys Cys  Thr Cys Gly
    3050                 3055                 3060            
Thr Thr  Ala Thr Gly Ala Gly  Gly Thr Gly Ala Thr  Thr Ala Ala
    3065                 3070                 3075            
Ala Thr  Ala Ala Ala Thr Gly  Thr Cys Cys Cys Cys  Cys Thr Cys
    3080                 3085                 3090            
Cys Gly  Thr Thr Thr Thr Thr  Gly Gly Ala Gly Gly  Gly Gly Gly
    3095                 3100                 3105            
Ala Cys  Gly Thr Thr Thr Gly  Thr Thr Thr Ala Thr  Gly Thr Thr
    3110                 3115                 3120             
Gly Thr  Thr Gly Ala Thr Thr  Thr Ala Cys Thr Gly  Ala Ala Ala
    3125                 3130                 3135            
Gly Thr  Thr Ala Cys Ala Ala  Ala Ala Cys Ala Cys  Gly Gly Ala
    3140                 3145                 3150             
Gly Thr  Thr Thr Gly Thr Ala  Thr Cys Gly Thr Cys  Cys Thr Ala
    3155                 3160                 3165            
Ala Ala  Ala Ala Ala Ala Gly  Thr Thr Thr Ala Cys  Cys Ala Cys
    3170                 3175                 3180             
Cys Ala  Ala Ala Gly Gly Thr  Ala Ala Gly Thr Thr  Thr Thr Thr
    3185                 3190                 3195            
Ala Thr  Gly Gly Ala Ala Gly  Cys Thr Ala Ala Ala  Thr Gly Cys
    3200                 3205                 3210            
Thr Ala  Thr Cys Gly Gly Gly  Cys Gly Ala Thr Gly  Cys Ala Gly
    3215                 3220                 3225            
Cys Gly  Thr Gly Cys Cys Cys  Ala Ala Gly Gly Ala  Ala Ala Gly
    3230                 3235                 3240            
Ala Thr  Gly Cys Thr Gly Cys  Gly Thr Gly Ala Gly  Thr Ala Thr
    3245                 3250                 3255            
Thr Thr  Cys Thr Cys Cys Gly  Gly Ala Gly Thr Ala  Cys Cys Gly
    3260                 3265                 3270            
Gly Thr  Gly Gly Ala Gly Ala  Ala Cys Cys Thr Gly  Thr Cys Ala
    3275                 3280                 3285            
Ala Ala  Gly Cys Gly Ala Thr  Ala Cys Gly Gly Ala  Thr Ala Cys
    3290                 3295                 3300            
Ala Gly  Thr Gly Thr Cys Cys  Thr Ala Ala Ala Ala  Ala Thr Ala
    3305                 3310                 3315            
Ala Ala  Gly Ala Cys Gly Cys  Thr Thr Gly Cys Ala  Thr Cys Cys
    3320                 3325                 3330            
Gly Ala  Thr Thr Ala Cys Ala  Ala Ala Cys Ala Ala  Gly Gly Gly
    3335                 3340                 3345             
Ala Ala  Ala Ala Thr Thr Gly  Ala Thr Ala Thr Cys  Thr Thr Thr
    3350                 3355                 3360            
Gly Ala  Cys Ala Ala Thr Cys  Cys Gly Cys Ala Gly  Ala Ala Ala
    3365                 3370                 3375             
Cys Gly  Thr Cys Gly Gly Ala  Thr Ala Ala Cys Thr  Ala Thr Gly
    3380                 3385                 3390            
Thr Cys  Gly Ala Thr Thr Ala  Thr Gly Ala Cys Cys  Cys Ala Cys
    3395                 3400                 3405             
Cys Ala  Gly Gly Ala Ala Gly  Ala Ala Gly Thr Ala  Cys Ala Ala
    3410                 3415                 3420            
Thr Thr  Ala Cys Thr Gly Cys  Ala Gly Gly Ala Cys  Ala Ala Gly
    3425                 3430                 3435            
Ala Thr  Cys Ala Ala Gly Gly  Cys Gly Cys Thr Gly  Gly Ala Gly
    3440                 3445                 3450            
Ala Ala  Cys Gly Cys Cys Thr  Gly Ala Ala Gly Cys  Thr Gly Gly
    3455                 3460                 3465            
Cys Gly 
    3470
 
<210>  3
<211>  663
<212>  PRT
<213>  Unglu135B12基因的部分氨基酸序列
 
<400>  3
 
Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys
1               5                   10                  15     
Thr Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr
            20                  25                  30         
Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Cys Ala
        35                  40                  45             
Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys
    50                  55                  60                 
Ala Thr Gly Cys Thr Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly
65                  70                  75                  80 
Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala
                85                  90                  95     
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys
            100                 105                 110        
Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr
        115                 120                 125            
Gly Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys
    130                 135                 140                
Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys
145                 150                 155                 160
Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr
                165                 170                 175    
Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala
            180                 185                 190        
Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys
        195                 200                 205            
Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly
    210                 215                 220                
Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly
225                 230                 235                 240
Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Gly
                245                 250                 255    
Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly
            260                 265                 270        
Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Gly Gly Gly Cys
        275                 280                 285            
Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly
    290                 295                 300                
Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Thr
305                 310                 315                 320
Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Ala
                325                 330                 335    
Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly
            340                 345                 350        
Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala
        355                 360                 365            
Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly
    370                 375                 380                
Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr
385                 390                 395                 400
Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala
                405                 410                 415    
Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys
            420                 425                 430        
Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly
        435                 440                 445            
Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys
    450                 455                 460                
Ala Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr
465                 470                 475                 480
Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala
                485                 490                 495    
Gly Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr
            500                 505                 510        
Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Thr Thr Ala Thr Gly
        515                 520                 525            
Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly
    530                 535                 540                
Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys
545                 550                 555                 560
Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly
                565                 570                 575    
Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala
            580                 585                 590        
Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala
        595                 600                 605            
Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys
    610                 615                 620                
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys Cys
625                 630                 635                 640
Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr
                645                 650                 655    
Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys
            660            
 
<210>  4
<211>  861
<212>  PRT
<213>  Unglu135B12基因的部分氨基酸序列
 
<400>  4
Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala
1               5                   10                  15     
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
            20                  25                  30         
Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys
        35                  40                  45             
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly
    50                  55                  60                 
Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr
65                  70                  75                  80 
Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Ala
                85                  90                  95     
Thr Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly
            100                 105                 110        
Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala
        115                 120                 125            
Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala
    130                 135                 140                
Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr
145                 150                 155                 160
Ala Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala
                165                 170                 175    
Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Cys
            180                 185                 190        
Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr
        195                 200                 205            
Ala Cys Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala
    210                 215                 220                
Gly Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys
225                 230                 235                 240
Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Gly
                245                 250                 255    
Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Cys Thr
            260                 265                 270        
Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Thr
        275                 280                 285            
Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly
    290                 295                 300                
Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala
305                 310                 315                 320
Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Thr Gly
                325                 330                 335    
Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys
            340                 345                 350        
Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys
        355                 360                 365            
Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys
    370                 375                 380                
 Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Cys Gly Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly
                405                 410                 415    
Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr Cys
            420                 425                 430        
Ala Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala
        435                 440                 445            
Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr
    450                 455                 460                
Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Cys
465                 470                 475                 480
Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly
                485                 490                 495    
Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala
            500                 505                 510        
Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys
        515                 520                 525            
Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly
    530                 535                 540                
Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr
545                 550                 555                 560
Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly
                565                 570                 575    
Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys
            580                 585                 590        
Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala
        595                 600                 605            
Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys
    610                 615                 620                 
Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala
625                 630                 635                 640
Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys
                645                 650                 655    
Cys Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys
            660                 665                 670        
Gly Cys Cys Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly
        675                 680                 685            
Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr
    690                 695                 700                
Cys Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr
705                 710                 715                 720
Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Ala
                725                 730                 735    
Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr
            740                 745                 750        
Cys Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Thr
        755                 760                 765            
Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly
    770                 775                 780                
Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly
785                 790                 795                 800
Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Thr Thr Ala Ala Cys
                805                 810                 815    
Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala
            820                 825                 830        
Ala Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala Cys Thr
        835                 840                 845            
Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala
    850                 855                 860    
 
<210>  5
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工合成序列
 
<400>  5
cggaattctc ctttgtctac ctttgtcag                                         29
  
<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工合成序列
 
<400>  6
atgcggccgc cgaggtattt acaaaacacg                                        30

Claims (5)

1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因(Unglu135B12)，其核苷酸序列从序列表中的SEQ ID No:1的5’端第700位核苷酸开始到3039位核苷酸结束；其中，起始密码子ATG为自5’端的第700位至702位核苷酸，终止密码子TAG为自5’端的第3037位至3039位核苷酸；所述基因Unglu135B12的GC含量为61.15%。
2.一种编码β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于为下述核苷酸序列之一的基因：
（1）SEQ ID No:1；
（2）与SEQ ID No:1限定的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列；
（3）在高严谨条件下可与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
（4）在高严谨条件下可与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.一种β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，其特征在于为下述氨基酸序列之一的氨基酸：
（1）SEQ ID No:3或SEQ ID No:4；
（2）与SEQ ID No: 3或SEQ ID No:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的方法，重组表达载体所用宿主细胞可以是重组表达载体中的任意一种。
5.根据权利要求1的方法，Unglu135B12基因可应用于纤维素降解生产方面。
CN201210347203.9A 2012-09-18 2012-09-18 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用 Expired - Fee Related CN102925469B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210347203.9A CN102925469B (zh) 2012-09-18 2012-09-18 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210347203.9A CN102925469B (zh) 2012-09-18 2012-09-18 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102925469A true CN102925469A (zh) 2013-02-13
CN102925469B CN102925469B (zh) 2016-06-15

Family

ID=47640398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210347203.9A Expired - Fee Related CN102925469B (zh) 2012-09-18 2012-09-18 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102925469B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103352031A (zh) * 2013-04-26 2013-10-16 中山大学 一种糖基转移酶基因及应用
CN113667661A (zh) * 2021-07-26 2021-11-19 青岛大学 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备葡萄糖和昆布寡糖中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101100659A (zh) * 2007-07-06 2008-01-09 广西大学 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN102041251A (zh) * 2009-10-26 2011-05-04 复旦大学 葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101100659A (zh) * 2007-07-06 2008-01-09 广西大学 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN102041251A (zh) * 2009-10-26 2011-05-04 复旦大学 葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵光存 等: ""牛瘤胃未培养细菌中一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3A的克隆及鉴定"", 《西南农业学报》, vol. 18, no. 4, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 472 - 477 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103352031A (zh) * 2013-04-26 2013-10-16 中山大学 一种糖基转移酶基因及应用
CN113667661A (zh) * 2021-07-26 2021-11-19 青岛大学 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备葡萄糖和昆布寡糖中的应用
CN113667661B (zh) * 2021-07-26 2023-11-07 青岛大学 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备葡萄糖和昆布寡糖中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102925469B (zh) 2016-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jang et al. Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T3-1
Wang et al. Isolation and characterization of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in different environmental niches
CN100575484C (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN102676480B (zh) 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法
CN101724614A (zh) 一种酸性β-甘露聚糖酶、基因、工程菌及其构建
CN102732494B (zh) β-甘露聚糖酶及其制备方法
CN101463330A (zh) 产纤维素酶的菌剂及其应用
CN111454929B (zh) 一种耐高温木聚糖酶基因及其应用
CN102051369B (zh) 一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法
CN102994425A (zh) 一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法
CN102628056A (zh) 一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用
CN101225376A (zh) 一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用
CN104673713B (zh) 一种嗜碱链霉菌及其产生的中性内切葡聚糖酶和应用
CN100348720C (zh) 一种生产甘露聚糖酶的方法及其专用工程菌
CN102925469A (zh) 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用
CN104877979B (zh) 一种元基因组来源的β‑甘露聚糖酶、其编码基因及其表达
CN102719458B (zh) 一种编码碱性β-葡萄糖苷酶基因及其应用
Górska et al. Degradation and colonization of cellulose by diazotrophic strains of Paenibacillus polymyxa isolated from soil
CN101182527A (zh) 一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用
CN105969783B (zh) 一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3及其应用
CN108103036A (zh) 一种新型漆酶及其基因、工程菌、制备与应用
CN101363026B (zh) 一种编码β-葡萄糖苷酶的基因
CN101225378B (zh) 内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用
CN105368740B (zh) 粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用
CN101225377A (zh) 内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160615

Termination date: 20170918