CN110951788B

CN110951788B - 马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用

Info

Publication number: CN110951788B
Application number: CN201911253617.3A
Authority: CN
Inventors: 刘彬; 刘青华; 周志春
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110951788A

Abstract

本发明提供了一种马尾松α‑蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用，涉及植物分子生物技术领域。α‑蒎烯是马尾松在次生代谢水平上的重要防御物质，其合成受α‑蒎烯合成酶调控。本发明发现马尾松α‑蒎烯合成酶还能够催化合成β‑蒎烯、β‑月桂烯和D‑柠檬烯，是一种控制多产物的合成酶，因此本发明提供了马尾松α‑蒎烯合成酶在制备β‑蒎烯、β‑月桂烯和D‑柠檬烯中的至少一种的应用。以马尾松α‑蒎烯合成酶催化底物合成萜烯类化合物的过程接近生物天然合成过程，合成效率高，中间产物和其他非目的产物的杂质含量低，并且避免了传统的化学合成中化学物质的污染。

Description

马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物技术领域，尤其是涉及一种马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)速生、耐干旱瘠薄、适应性强，是我国南方荒山造林的先锋树种，在一些地理条件较差的山地，马尾松甚至是唯一可造林的本土树种。马尾松广泛分布在我国亚热带17个省(区、市)，根据第八次全国森林资源清查结果(2016年)，马尾松林面积约为1001万公顷，而且马尾松年产松脂总量为60-80万吨，约占我国松脂总量的70％。因此，马尾松在我国速生丰产材用和脂用林基地建设中占据极其重要的地位。马尾松松脂成分主要为一些萜类物质，单萜，倍半萜以及二萜等。萜烯类化合物为马尾松主要次生代谢物质，植食性昆虫诱导的植物挥发物的重要成分，是病原入侵后的第一道防线。然而，关于马尾松中萜烯类合成酶的应用鲜有报道，充分利用马尾松中萜烯类合成酶，对合成萜烯类化合物，以及防治植食性昆虫具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种马尾松α-蒎烯合成酶在制备以萜烯类化合物为活性物质的产品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。

优选地，所述萜烯类化合物包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶的底物包括牻牛儿基焦磷酸。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶由原核表达系统表达；

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶由大肠杆菌表达系统；

优选地，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌BL21菌株。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶由pET-28a表达。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了马尾松α-蒎烯合成酶在制备以萜烯类化合物为活性物质的产品中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种；

优选地，所述产品包括防治植食性病虫害的产品。

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

优选地，所述马尾松α-蒎烯合成酶含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

α-蒎烯是马尾松在次生代谢水平上的重要防御物质，在分子水平上α-蒎烯的合成受α-蒎烯合成酶(α-Pi-nene Synthase，apin)调控。本发明发现，马尾松α-蒎烯合成酶除去和α-蒎烯的合成相关，还能够催化合成β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯。基于本发明发现的马尾松α-蒎烯合成酶是一种控制多产物的合成酶，本发明提供了马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。以马尾松α-蒎烯合成酶催化底物合成萜烯类化合物，其合成过程接近生物天然合成过程，合成效率高，中间产物和其他非目的产物的杂质含量低，并且避免了传统的化学合成中化学物质的污染。基于上述发明构思，本发明提供的马尾松α-蒎烯合成酶在制备以萜烯类化合物为活性物质的产品中的应用也具有相同的有益效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中PCR扩增产物；

图2为本发明实施例3中制备得到的蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；

图3为本发明实施例3中制备得到的蛋白的Western Blot鉴定结果；

图4为α-蒎烯GC-MS鉴定结果；

图5为α-蒎烯离子特征峰鉴定结果；

图6为谱库中α-蒎烯离子特征峰比对结果；

图7为β-月桂烯，β-蒎烯GC-MS鉴定结果；

图8为β-蒎烯离子特征峰鉴定结果；

图9为谱库中β-蒎烯离子特征峰比对结果；

图10β-月桂烯离子特征峰鉴定结果；

图11谱库中β-月桂烯离子特征峰比对结果；

图12D-柠檬烯GC-MS鉴定结果；

图13D-柠檬烯离子特征峰鉴定结果；

图14谱库中D-柠檬烯离子特征峰比对结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

α-蒎烯是马尾松在次生代谢水平上的重要防御物质，α-蒎烯属于双环单萜的一种，化学名为2,6,6-三甲基双环[3.1.1]-2-庚烯，在分子水平上α-蒎烯的合成受α-蒎烯合成酶(α-Pi-nene Synthase，apin)调控。本发明发现，马尾松α-蒎烯合成酶除去和α-蒎烯的合成相关，还能够催化合成β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯，是一种控制多产物的合成酶。

β-蒎烯，化学名为6,6-二甲基-2-亚甲基-二环[3.1.1]-庚烷，具有抗真菌的效果，低浓度下能有效抑制病原真菌的孢子萌发和菌丝体生长，也是合成香料的主要原料，例如制备柠檬醛、香茅醇、芳樟醇、紫罗兰酮和薄荷醇等合成香料，还可以用于制备驱避剂、杀菌剂、杀虫剂和农药增效剂等。β-月桂烯，化学名为7-甲基-3-亚甲基-1,6-辛二烯，分子中具有3个不饱和的碳碳双键，易于发生多种化学反应，可以用于制备香料。D-柠檬烯，化学名为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，为柠檬味液体，不溶于水，易与乙醇混合，是多种水果(主要为柑橘类)、蔬菜及香料中存在的天然成分。

基于本发明发现马尾松α-蒎烯合成酶能够催化合成β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯，本发明提供了马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。当将马尾松α-蒎烯合成酶应用于制备β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的其中一种物质时，使用马尾松α-蒎烯合成酶催化底物后，分离出目标物质即可；当使用马尾松α-蒎烯合成酶用于同时制备其中几种物质时，例如制备β-蒎烯和β-月桂烯；制备β-月桂烯和D-柠檬烯；或制备β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯的混合物，使用马尾松α-蒎烯合成酶催化底物后，分离出目标物质，或去除杂质即可。由于马尾松α-蒎烯合成酶是一种控制多产物的合成酶，其可以合成的萜烯类化合物包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯，因此在一些可选的实施方式中，马尾松α-蒎烯合成酶可以用于合成α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯的混合物。

本发明提供的马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，可以用于制备多种萜烯类化合物，包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种；以马尾松α-蒎烯合成酶催化底物合成萜烯类化合物，其合成过程接近生物天然合成过程，合成效率高，中间产物和其他非目的产物的杂质含量低，并且避免了传统的化学合成中化学物质的污染。

在一些可选的实施方式中，所述马尾松α-蒎烯合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。在一些可选的实施方式中，所述马尾松α-蒎烯合成酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。可以理解的是，本发明不限制在制备体外重组马尾松α-蒎烯合成酶时，在编码马尾松α-蒎烯合成酶的氨基酸序列和核苷酸序列上添加标签序列、调控元件或筛选标记等序列。

在一些可选的实施方式中，所述马尾松α-蒎烯合成酶的底物包括牻牛儿基焦磷酸；牻牛儿基焦磷酸(geranylpyrophosphate，GPP)是异戊二烯合成途径中的重要产物，是多种萜类物质的合成前体，马尾松α-蒎烯合成酶能够以牻牛儿基焦磷酸为底物合成萜烯类化合物。

在一些可选的实施方式中，所述在体外催化底物合成所述萜烯类化合物的马尾松α-蒎烯合成酶由原核表达系统表达，优选经由大肠杆菌表达系统表达。经原核表达系统表达的马尾松α-蒎烯合成酶，具有在体外催化底物合成包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯的萜烯类化合物的活性，其中原核表达系统优选使用大肠杆菌表达系统，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，操作简单，培养周期短和抗污染能力强的优点。在一些优选的实施方式中，优选使用生长速度快，并且表达量高的大肠杆菌BL21菌株(E.coli BL21)表达马尾松α-蒎烯合成酶。

在一些优选的实施方式中，所述马尾松α-蒎烯合成酶由含有T7启动子的表达载体pET-28a表达，T7启动子由T7 RNA聚合酶调控，含有以T7作为启动子的表达载体的宿主本身的基因转录竞争不过T7表达系统，因此宿主中的表达载体pET-28a能够利用宿主中的大部分资源用于合成外源蛋白，T7表达系统调控的外源蛋白的表达量可占到宿主细胞总蛋白的50％以上，因此pET-28a能够在宿主中高效表达马尾松α-蒎烯合成酶。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了马尾松α-蒎烯合成酶在制备以萜烯类化合物为活性物质的产品中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。本发明所述的以萜烯类化合物为活性物质的产品，可选的，可以以β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的一种作为活性成分，也可以以β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的几种作为活性成分，例如以β-蒎烯和β-月桂烯作为活性成分；以β-月桂烯和D-柠檬烯作为活性成分；由于马尾松α-蒎烯合成酶是一种控制多产物的合成酶，其可以合成的萜烯类化合物包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯，因此在一些可选的实施方式中，所述产品以α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯的混合物作为活性成分。

需要说明的是，本发明中，当所述产品以β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种，或以α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯的混合物作为活性成分时，α-蒎烯还可以包括α-蒎烯的衍生物，β-蒎烯还可以包括β-蒎烯的衍生物，β-月桂烯还可以包括β-月桂烯的衍生物，D-柠檬烯还可以包括D-柠檬烯的衍生物。其中“衍生物”指的是当以这些衍生物作为产品的活性成分之一时，所述产品在使用时能够为所述产品直接或者间接的提供α-蒎烯活性、β-蒎烯活性、β-月桂烯活性或D-柠檬烯活性的物质。

在一些优选的实施方式中，所述产品包括防治植食性病虫害的产品。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯是植食性昆虫诱导的植物挥发物的重要成分，是病原入侵后的第一道防线，具有防治植食性昆虫的作用。在一些优选的实施方式中，所述用于制备用于防治植食性病虫害的产品的马尾松α-蒎烯合成酶含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述马尾松α-蒎烯合成酶优选含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

提取马尾松茎部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成cDNA。以该cDNA为模板扩增，引物如下：

正向引物为：5’-ACATGGGCAAGAACCCCTAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-TTAAGATGGGCGAAGGCTAA-3’(SEQ ID NO.4)；

利用Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，进行PCR扩增；PCR条件为：95℃，3min；95℃，15sec；56℃，15sec；72℃，2min；35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的M为DNA marker DL2000，泳道1和2为扩增产物，目的基因片段大小约为1890bp，符合预期。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段进TA克隆，连接到pClone007载体上，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，转化条件为：在50μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激45s，迅速冰浴，静置2min，加入500μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，将菌液3000rpm离心1min，弃400μL上清液，悬浮菌液，涂布于含有抗生素(Amp)的固体LB平板，37℃倒置培养12-16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5mL离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取lμL用作模板进行PCR检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。经测序，克隆得到的马尾松α-蒎烯合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1890个碱基，共编码580个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并由此得到将马尾松α-蒎烯合成酶基因插入到pClone007克隆载体的重组质粒成功转化至原核细胞大肠杆菌DH5α的阳性菌。

实施例2

α-蒎烯合成酶基因构建表达载体及转化原核细胞，包括如下步骤：

将克隆好的目的片段通过同源重组的方式转化到pET28a线性化载体上。连接反应条件为：将反应体系混合后置于37℃孵育30min，然后于20℃1h，将5μL反应液加到50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀冰浴静置30min，轻轻取出，42℃，热激60s，立即冰浴2min，加入500μL LB培养基37℃培养1h；取100μL菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，过夜培养。挑取抗生素(Kan)筛选得到的阳性菌落，提取质粒。将原核表达载体转入到大肠杆菌BL21菌株中，37℃，200rpm，待培养至OD600为0.6，向试管培养液中加入终浓度0.lmM的IPTG，之后分别置于15℃和37℃诱导表达，得到大量表达马尾松α-蒎烯合成酶基因菌液。

实施例3

α-蒎烯合成酶的原核表达、蛋白纯化和蛋白质检，包括如下步骤：

挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种；分别挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃震荡培养至OD600约0.6；取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，37℃震荡培养3h；分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL 1×loadingbuffer重悬裂解，SDS-PAGE检测。取保存于-20℃的菌种100μL接种于100mL LB液体培养基(氨苄抗性)中震荡培养过夜；取100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，30℃继续震荡培养3h；8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min；超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、99个循环；16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀至于4℃备用。上清蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤备用；准备Ni-NTA柱；以1mL/min的流速上样上清蛋白溶液；以NTA-0缓冲液(pH8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；分别以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱；对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，对马尾松α-蒎烯合成酶基因进行Western blot检测。SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示，其中泳道M：Marker；泳道2(Pre):诱导前；泳道3(Aft):诱导后；泳道3(Elute):洗脱蛋白。Western blot检测结果如图3所示：其中泳道M为marker，泳道1～4依次为marker，上柱流出液，流出蛋白，洗脱蛋白。

实施例4

马尾松α-蒎烯合成酶的生化功能

以牻牛儿基焦磷酸(GPP)为底物，酶促反应体系为：HEPES，25Mm；KCl，100mM；MgCl₂，10mM；10％(v/v)甘油；DTT，5mM；FPP，30mM；加入30ng纯化后的蛋白置于30℃1h。采用安捷伦气相色谱-质谱联用仪Agilent 6890N-5975B，测挥发性物质是用supelco的50/30umDVB/CAR on PDMS萃取头吸附，40℃吸附45min对催化产物进行检测。称取10.0g磨碎样品于150mL锥形瓶中，在40℃烘箱中平衡5min后，将萃取头插入锥形瓶，于样品上空吸附45min，最后在GC-MS进样口于220℃下解吸5min。

检测方法：GC-MS条件：色谱柱：DB-5MS(60m×0.25mm ID×0.25μm膜厚)。程序升温参数：初始温度50℃，保持2min，以3℃/min升温至80℃保持2min，以5℃/min升温至180℃保持1min，以10℃/min升温至230℃保持5min,最后以20℃/min升温至250℃保持3min。进样口温度：220℃，脉冲不分流，进样1μL，载气为高纯氦气(99.999％)，柱流速：1.5mL/min。色谱-质谱接口温度：250℃。离子源温度：230℃。离子化方式：EI。电子能量：70eV。扫描质量范围50-500m/z。定性与定量：各组分分别用NIST08标准谱库进行检索匹配，碎片比对，并结合相关文献报道、各成分的相对保留时间等进行定性。定量按峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量。实验结果如图4-图14所示：

通过GC-MS检测，结果显示马尾松α-蒎烯合成酶可催化GPP合成α-蒎烯，β-蒎烯，β月桂烯，D-柠檬烯，且，出峰时间以及离子特征峰均可以与NIST08标准谱库检索匹配，因此可对酶催化产物定性；由于酶含量有限，故无法对实验进行定量，只能证明该酶有酶催化活性，且为多产物酶。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的

应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1890

<212> DNA

<213> 马尾松（Pinus massoniana Lamb.）

<400> 1

atgtctcctg tttctgtgat ctcgttgcct tccgacttgt gcctgcccac atcgttcatc 60

gacaggtctg gtcgtgagct taaccctctc catataacaa ttccaaatct cggaatgtgc 120

aggaaaggga aattaatgac acgtgcttcc atgagcatga gcttgacgac ttccgtatct 180

gatgatgctg ttgtaagacg cagaggtgat ttccattcca acctctggga cgatgatttc 240

atacagtccc tttccgcgcc ttatggggaa ccttcttatc gggaacgtgc tgagagactg 300

attggggaag taaagaagct attcaattca atgtcggagg aggatggcga attaatcacc 360

cccctcgatg atctgattca acgcctttgg atggtcgaca gtgttgaacg cttgggaatc 420

gatagacatt tcaaaaatga gataaaatca gcgctcgatc atgtttacag ttattggagc 480

gaaaaaggca ttggatgtgg gagagagagt gttgttactg atctcaactc aactgccttg 540

ggtcttcgaa cccttcgtct gcgcggatac gatgtgtctg cagacgtttt gaatcatttc 600

aaaaatcaaa gtgggcagtt tgcttgcact ctgaatcaga cagaggatca gatcagaact 660

gtacttaatt tatatcgggc ttccctcatt gcctttccag gagagaaagt catggacgag 720

gctgaaactt tctctgccaa atatttgaaa gaagccctgc aaaagattcc agtctcaagt 780

ctttcacgag agatagagga cgtcctcgag tatggttggc acacgtattt gccacgattg 840

gaagcaagga attacatgga cgtcttcgga caggacactg aaaacagcaa gtcatatatg 900

aagaccgaga aacttctaga acttgcaaag ttggagttca acatctttca cgccttacaa 960

aagcgagagt tggaatatct cgtgagatgg tggaaaggct ctggttcgcc tcaaatgacc 1020

ttttgtcgac atcgtcacgt ggaatactac actttggctt cttgcattgc gtttgagcct 1080

caacattctg gattcagact cggctttgcc aaagcctgtc atatcatcac ggttcttgat 1140

gatatgtacg acaccttcgg aacactcgac gagctcgaac tcttcacagc tgcaattaag 1200

agatgggatc catcggcgac agagtgcctt ccagaatata tgaaaggagt ttacatgata 1260

gtttacaaca ctgtaaatga aatgtctcag gaggcagaca aggctcaagg ccgagacacg 1320

ctcaactatt gtcgacaggc ttgggaggaa tatattgatg cgtatatgca agaagcaaag 1380

tggatcgcca gtggtgaggt gccaacattt gaggagtact atgagaacgg gaaagttagc 1440

tctgctcatc gcgtgtcggc attgcaaccc attctgacga ccgacatccc ctttcctgag 1500

cacgtcctca aggaagttga cattccatcg aagctcaatg acttggcatc tgccattctt 1560

cgattacgag gggatacgcg ctgctaccag gcggacaggg cccgtggaga agaagcttcg 1620

tgtatatctt gttatatgaa agacaatcct ggaacaacag aggaagatgc tctcaatcat 1680

atcaacgcca tgatcagaga tgtaattaaa ggattaaatt gggagcttct caaaccaaac 1740

agcagcgttc ccatatctgc caaaaaacat gcttttgaca ttagcagagc tttccattat 1800

ggctacaaat atcgagatgg ctacaccatt gccagcattg aaacaaagag tttggtgaag 1860

agaaccgtca ttgatcctgt cactttataa 1890

<210> 2

<211> 629

<212> PRT

<213> 马尾松（Pinus massoniana Lamb.）

<400> 2

Met Ser Pro Val Ser Val Ile Ser Leu Pro Ser Asp Leu Cys Leu Pro

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ile Asp Arg Ser Gly Arg Glu Leu Asn Pro Leu His Ile

20 25 30

Thr Ile Pro Asn Leu Gly Met Cys Arg Lys Gly Lys Leu Met Thr Arg

35 40 45

Ala Ser Met Ser Met Ser Leu Thr Thr Ser Val Ser Asp Asp Ala Val

50 55 60

Val Arg Arg Arg Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Phe

65 70 75 80

Ile Gln Ser Leu Ser Ala Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Arg Glu Arg

85 90 95

Ala Glu Arg Leu Ile Gly Glu Val Lys Lys Leu Phe Asn Ser Met Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Gly Glu Leu Ile Thr Pro Leu Asp Asp Leu Ile Gln Arg

115 120 125

Leu Trp Met Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly Ile Asp Arg His Phe

130 135 140

Lys Asn Glu Ile Lys Ser Ala Leu Asp His Val Tyr Ser Tyr Trp Ser

145 150 155 160

Glu Lys Gly Ile Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu Asn

165 170 175

Ser Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu Arg Gly Tyr Asp Val

180 185 190

Ser Ala Asp Val Leu Asn His Phe Lys Asn Gln Ser Gly Gln Phe Ala

195 200 205

Cys Thr Leu Asn Gln Thr Glu Asp Gln Ile Arg Thr Val Leu Asn Leu

210 215 220

Tyr Arg Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Asp Glu

225 230 235 240

Ala Glu Thr Phe Ser Ala Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gln Lys Ile

245 250 255

Pro Val Ser Ser Leu Ser Arg Glu Ile Glu Asp Val Leu Glu Tyr Gly

260 265 270

Trp His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr Met Asp Val

275 280 285

Phe Gly Gln Asp Thr Glu Asn Ser Lys Ser Tyr Met Lys Thr Glu Lys

290 295 300

Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Ile Phe His Ala Leu Gln

305 310 315 320

Lys Arg Glu Leu Glu Tyr Leu Val Arg Trp Trp Lys Gly Ser Gly Ser

325 330 335

Pro Gln Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu

340 345 350

Ala Ser Cys Ile Ala Phe Glu Pro Gln His Ser Gly Phe Arg Leu Gly

355 360 365

Phe Ala Lys Ala Cys His Ile Ile Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr Asp

370 375 380

Thr Phe Gly Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ala Ala Ile Lys

385 390 395 400

Arg Trp Asp Pro Ser Ala Thr Glu Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly

405 410 415

Val Tyr Met Ile Val Tyr Asn Thr Val Asn Glu Met Ser Gln Glu Ala

420 425 430

Asp Lys Ala Gln Gly Arg Asp Thr Leu Asn Tyr Cys Arg Gln Ala Trp

435 440 445

Glu Glu Tyr Ile Asp Ala Tyr Met Gln Glu Ala Lys Trp Ile Ala Ser

450 455 460

Gly Glu Val Pro Thr Phe Glu Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val Ser

465 470 475 480

Ser Ala His Arg Val Ser Ala Leu Gln Pro Ile Leu Thr Thr Asp Ile

485 490 495

Pro Phe Pro Glu His Val Leu Lys Glu Val Asp Ile Pro Ser Lys Leu

500 505 510

Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ile Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg Cys

515 520 525

Tyr Gln Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys Ile Ser Cys

530 535 540

Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Thr Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn His

545 550 555 560

Ile Asn Ala Met Ile Arg Asp Val Ile Lys Gly Leu Asn Trp Glu Leu

565 570 575

Leu Lys Pro Asn Ser Ser Val Pro Ile Ser Ala Lys Lys His Ala Phe

580 585 590

Asp Ile Ser Arg Ala Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Tyr

595 600 605

Thr Ile Ala Ser Ile Glu Thr Lys Ser Leu Val Lys Arg Thr Val Ile

610 615 620

Asp Pro Val Thr Leu

625

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acatgggcaa gaacccctat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaagatggg cgaaggctaa 20

Claims

1.氨基酸序列为SEQ ID NO.2的马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萜烯类化合物包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述马尾松α-蒎烯合成酶的底物包括牻牛儿基焦磷酸。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述马尾松α-蒎烯合成酶由原核表达系统表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述马尾松α-蒎烯合成酶由大肠杆菌表达系统。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌BL21菌株。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述马尾松α-蒎烯合成酶由pET-28a表达。

8.氨基酸序列为SEQ ID NO.2的马尾松α-蒎烯合成酶在制备以萜烯类化合物为活性物质的产品中的应用，所述萜烯类化合物包括β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述萜烯类化合物包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和D-柠檬烯。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包括防治植食性病虫害的产品。

11.根据权利要求8-10任一项所述的应用，其特征在于，编码所述马尾松α-蒎烯合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。