KR101591362B1 - 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 m-5 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주(기탁번호 KCCM11416P), 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 소비자의 다양한 기호에 맞춘 각종 발효식품, 천연조미료 및 건강 기능성 제품의 개발 및 생산에 활용가능한 소재로 제공될 수 있을 것이다.

Description

복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주 및 이의 용도{Saccharomyces cerevisiae M-5 strain producing alcohol and gamma-aminobutyric acid and nonproducing biogenic amine isolated from fermented liquid of raspberry and uses thereof}

본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 M-5 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주(기탁번호 KCCM11416P), 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물에 관한 것이다.

발효는 오래전부터 자연발생적으로 나타난 미생물 작용의 현상으로서, 인류는 미생물의 존재가 밝혀지기 훨씬 이전부터 발효현상을 이용해왔다. 최근, 대부분의 발효는 자연계에서 분리된 미생물 균주들을 배양하여 스타터의 형태로 개발된 미생물을 접종하여 행해지고 있는데, 스타터로 첨가하는 균주에 따라서 발효물의 맛과 향에 중대한 영향을 미치게 된다. 일반적으로 발효에 사용되는 균주로는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 등이 있다.

전통 발효주는 발효 식품의 대표적인 예로, 최근에는 단순 발효과정을 거친 민속주보다 향미와 색상 등의 기호적인 특성과 독특한 기능성을 부여한 발효주가 생산되고 있다. 발효 재료와 발효과정 중에 생산되는 부산물의 효능을 입증하면서 건강 기능성을 강조한 발효주는 주류 시장에서 외국의 술과 견주어 볼만큼 경쟁력을 갖춰나가고 있다.

감마-아미노뷰티르산은 자연계에 분포하는 비단백질성 아미노산의 일종으로 뇌나 척수와 같은 중추신경계의 주된 억제성 신경전달물질(inhibitory neurotransmitter)로 알려져 있다. 뇌의 혈류를 활발하게 하고 뇌에 산소 공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 촉진시키며, 혈액 내의 중성지방을 줄이고 간기능을 개선시키는 등의 여러 약리 활성으로 인해, 뇌동맥 휴유증에 의한 두통, 귀 울림, 의욕저하 등의 치료제에 응용되어 왔다. 또한, 고혈압과 같은 성인병 등의 예방 및 개선에 효과적인 것으로 밝혀져, 기능성 식품소재로서의 관심이 고조되고 있고 최근에는 감마-아미노뷰티르산을 다량 함유하는 음료가 출시되기도 했다.

바이오제닉 아민(biogenic amin, BA)은 발효과정에서 발효 미생물들에 의해 생산되는 것으로서 성장조절 및 염증조절, 신경전달 등의 생리적 기능을 담당하지만, 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품을 통해서 섭취하는 경우에는 인체에 유해한 증상이 나타난다. 따라서 발효에 있어서, 발효과정 동안 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 발효 균주의 선발이 매우 중요하다.

따라서 본 발명을 통해 복분자 발효액으로부터 분리한 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주는 기존의 균주보다 알코올 생성능과 감마-아미노뷰티르산의 생산량이 많고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주로서 전통발효식품, 기능성 식품, 조미료 및 효소제품을 비롯한 산업적 응용이 가능할 것이다.

한국등록특허 제1198746호에는 '천연 GABA를 함유하는 기능성 발효주의 제조방법 및 이에 의해 제조된 기능성 발효주'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1158448호에는 '효모 엑기스를 이용한 고농도의 천연 GABA를 함유하는 기능성 발효소재 및 그의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 M-5 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주를 분리함으로써, 베리류 발효에 적합한 발효 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주(KCCM11416P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주는 알코올 및 감마-아미노뷰티르산의 고생산이 가능하고 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 발효 특성을 가짐으로써 소비자의 다양한 기호에 맞춘 각종 발효식품, 천연조미료 및 건강 기능성 제품의 개발 및 생산에 활용가능한 소재로 제공될 수 있을 것이다.

도 1은 스타터를 배양하여 알코올 발효하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 복분자 발효액으로부터 분리한 M-5 균주의 전세포 반응의 감마-아미노뷰티르산 생산 정도를 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주를 20%과 30%의 글루코스를 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 글루코스 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 4는 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주를 200ppm과 300ppm의 황산을 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 아황산 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 5는 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주를 알코올 농도별로 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 알코올 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 6은 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주의 온도에 따른 생육곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주의 제한효소 CfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ 처리에 의한 패턴을 분석한 것이다. M; 1kb DNA 마커, SC; 사카로마이세스 세레비지애 KACC30008 균주, M-5; 복분자 발효액에서 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주.
도 8은 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주의 분자생물학적 계통분류도이다.
도 9는 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주의 주사전자현미경 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주(KCCM11416P)를 제공한다.

본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주는 유기농 복분자 발효액으로부터 분리된 균주들 중에서 특히 알코올 생산능과 감마-아미노뷰티르산 생산능이 좋고 바이오제닉 아민을 생산하지 않아 발효 균주로서 활성이 가장 좋은 균주를 선발한 것이다.

상기 선발된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주는 가스크로마토그래피/수소염이온화검출(GC/FID) 방법으로 알코올 생산능을 분석한 결과 19.65%의 생산능을 보여 알코올 고생산 균주라 판별하였다.

상기 선발된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주는 전세포 반응 후 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과, 감마-아미노뷰티르산을 67.73±2.11㎎/100㎖ 생산하여 감마-아미노뷰티르산 고생산 균주라 판별하였다.

상기 선발된 M-5 균주의 동정을 위하여 28s rDNA 영역을 증폭하여 염기서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 M-5 균주는 도 8에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주들과 가장 높은 유사도를 나타내었다. 따라서 상기 M-5 균주를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주라 명명하였다.

본 발명의 균주 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주를 한국미생물보존센터에 2013년 5월 2일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11416P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 트립타민(tryptamine), 히세아민(hiseamine), 2-페닐에틸아민(2-phenylethylamine), 티라민(tyramine), 세로토닌(serotonin), L-노르에피네프린(L-norepinephrine) 또는 도파민(dopamine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법에서, 알코올을 생산하기 위해 균주를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 균주 배양시, 글루코스 농도는 10~20%, 바람직하게는 글루코스를 20% 농도로 첨가한 것일 수 있으며, 배양온도는 28~32℃, 바람직하게는 30℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법에서, 감마-아미노뷰티르산을 생산하기 위해 균주를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 균주 배양시, 글루코스 농도는 1~10%, 바람직하게는 글루코스를 5% 농도로 첨가한 것일 수 있고, 모노소듐글루타메이트(monosodium glutamate, MSG) 첨가 농도는 0.2~2%일 수 있으며, 전세포 배양 온도는 29~37℃, 바람직하게는 37℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 방법에 의해서 생산된 감마-아미노뷰티르산은 다양한 식품 조성물로 쓰일 수 있다. 이러한 조성물로 제공되는 식품은 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 감마-아미노뷰티르산의 농도가 낮아 이의 보충을 요하는 사람에게 매우 유용하게 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 생산용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 유기농 복분자 발효액으로부터 효모 분리

국내 무주 유기농 복분자 발효액에서 전통 발효주에 활용 가능한 토종 발효 효모를 분리하기 위하여 효모를 선발하였다. 선발에 사용된 유기농 복분자 착즙액은 약 700ℓ를 18~23℃로 유지되는 발효실에서 자연 발효한 천연 발효액으로 1년 6개월 정도 숙성된 것을 사용하였다. 발효 원액을 멸균증류수에 십진 희석하여 세균의 증식을 억제하기 위한 항생제인 페니실린-스트렙토마이신을 2,500ppm으로 첨가한 YM 배지에 도말하여 30℃에서 24~48시간 배양 후 얻어진 균주 중 단일 콜로니 약 200개를 선택하여 YM 액체배지에 계대 배양한 후 -80℃에 보관하여 연구에 사용하였다.

2. 알코올 함량 가스크로마토그래피( GC ) 분석

분리 효모의 알코올 발효능은 20%의 글루코스를 첨가한 10㎖의 YM 액체배지에 전배양액 1%를 접종하여 30℃에서 48시간 동안 정치시켜 알코올 발효를 수행한 발효액을 이용하였다. 얻어진 배양액에서 균체를 원심분리하고 상등액만을 멸균한 팔콘 튜브에 분리하여 상등액 5㎖에 증류수 2㎖을 혼합하여 증류한 다음, 증류된 액은 알코올 농도를 측정하기 위한 가스크로마토그래피(GC) 분석용 샘플로 사용하였으며, 농도별로 분석한 알코올의 표준곡선과 비교하여 증류액의 알코올함량을 산출하였다(R²=0.999). 가스크로마토그래피 분석 조건은 표 1과 같다.

알코올 함량 분석을 위한 가스크로마토그래피/수소염이온화(GC/FID) 검출 분석 조건

Item	Condition
Instrument	GC (Waters)
Detector	Flame ionization detector (FID)
Column	DB-5
Carrier gas	N2
FID temperatures	250℃
Oven temperature program	70℃ for 3min, 25℃/min to 225℃
Detector temperatures	250℃
Injection volume	1.0㎕

3. 바이오제닉 아민( Biogenic amin , BA ) 분석

11종의 바이오제닉 아민 표준물질인 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 트립타민(tryptamine), 히세아민(hiseamine), 2-페닐에틸아민(2-phenylethylamine), 티라민(tyramine), 세로토닌(serotonin), L-노르에피네프린(L-norepinephrine), 도파민(dopamine)과 유도물질인 단실 클로라이드(dansyl chloride) 및 내부표준물질인 1.7-디아미노헵테인(1.7-diaminoheptane)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서, 프롤린(proline)과 0.1N HCl은 삼천에서, 아세토니트릴(acetonitrile)은 몰린크로트 베이커(Mallinckrodt Baker)에서 구입하였다. 표준용액은 각 표준물질을 0.1N HCl에 녹여 약 1,000 ㎎/ℓ가 되도록 한 것을 십진법으로 희석하여 표준용액으로 하였다. 복분자주 바이오제닉 아민의 검출은 국세청 주류면허지원센터의 주류분석규정에 의한 HPLC 분석법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 복분자주 5㎖를 취하여 0.1N HCl 5㎖를 가한 후 이 용액 1㎖와 혼합표준용액 1㎖를 각각 취하여 내부표준물질(1,7-diaminoheptane, 100 ㎎/ℓ) 0.5㎖와 포화 Na₂CO₃ 0.5㎖, 1% 단실 클로라이트 아세톤 용액 1㎖을 가하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린용액 1㎖을 첨가하여 과량의 유도체화 시약을 제거한 후 에테르 5㎖을 가하여 3분간 진탕하고 상층액을 취하여 질소농축 하였다. 여기에 아세토니트릴 2㎖를 가하여 0.45㎜로 여과하여 자외선/가시광선 검출기(UV/Vis detector)가 부착된 HPLC(Agilent Technologies) 기기와 캡셀팩 C18 컬럼(4.6250㎜, 5㎜, Shiseido Co.)을 사용하였다. HPLC 측정은 이동상의 유속을 1 ㎖/분, 농도구배는 55% 아세토니트릴을 최소 10분간 유지, 15분까지 65%, 20분까지 80%로 하여 5분간 유지, 30분까지 90%로 하여 5분간 유지되도록 프로그램하여 총 40분간 시행하였다. 컬럼 온도는 40℃, UV검출기의 파장은 254㎚에서 시행하였다. 11종의 바이오제닉 아민 표준물질을 이용한 표준곡선을 이용하여 복분자주 시료에서의 바이오제닉 아민을 검출하였다.

4. 분리된 효모 균주 스타터를 이용한 복분자주의 제조

선발된 20종 효모를 YM 액체배지(yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5%, dextrose 10%, pH 6.2±0.2)에 접종하여 25℃ 진탕배양기(VS-8480, Vision Scientific Co., LTD.) 160rpm에서 64시간 배양한 후 복분자 발효액 제조를 위한 스타터를 제조하였다. 복분자 발효액은 순창군 쌍치면 농가에서 재배한 복분자 추출 원액을 12°Brix가 되도록 설탕으로 보당하고 121℃에서 15분간 멸균하여 제조한 복분자 추출액에 각각의 스타터 약 2%를 접종하여 25℃, 160rpm에서 48시간 동안 진탕배양시켜 주모로 사용하였다. 복분자주 제조를 위한 방법으로는 복분자 원액이 24°Brix가 되도록 설탕으로 보당하고 121℃, 15분간 멸균한 후 주모를 각각 2%(v/v) 접종하였으며, 진탕배양기에서 25℃, 160rpm으로 1일 발효시켰고, 4일 동안 25℃ 배양기(VS-1203P3V, Vision Scientific Co., LTD., Korea)에서 정치발효 하였다.

5. 분리된 M-5 균주의 감마- 아미노뷰티르산 (γ- aminobutyric acid , GABA ) 생산량 분석

분리된 효모의 감마-아미노뷰티르산(GABA) 생산량 확인을 위하여 M-5(43B) 균주는 YM 액체배지에서 29℃, 180rpm으로 48시간 동안 배양한 전배양액을 30㎖의 본배양 배지에 2% 접종하여 29℃, 180rpm으로 48시간 동안 배양하여 10,000rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 멸균된 증류수로 2회 세척하여 감마-아미노뷰티르산 합성 활성 스크리닝을 위한 균체로 사용하였다. 1% 모노소듐글루타메이트(MSG)와 5% 글루코스가 함유된 기질 반응액은 0.2㎛의 필터(Minisart RC4, Sartorius stedim)를 이용하여 여과 멸균하였다. 기질 반응액은 균체 중량의 80%(w/v)로 계산하여 균체에 첨가하였다. 균질화된 혼합액은 37℃의 항온수조에서 72시간 동안 전세포 반응을 실시하였고, 80℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.45㎛ 필터(Minisart NY 25, Sartorius stedim)로 여과 후 분석 전까지 -20℃에 보관하였다.

감마-아미노뷰티르산의 정성분석방법을 확립하기 위하여 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)를 이용하여 분석하였다. 표준물질로는 감마-아미노뷰티르산(GABA)와 모노소듐글루타메이트(monosodium glutamate, MSG)를 사용하였으며, 분석에 사용된 전개용매 조성은 N-부탄올:아세트산:물을 5:3:2(v/v)의 비율로 혼합하여 사용하였다. 전개 용매의 경우, 닌히드린(ninhydrin) 0.4%(w/v)를 전개용매에 첨가함으로써 별도의 발색반응 없이 건조만으로 발색을 유도하였다. 사용된 표준물질은 감마-아미노뷰티르산과 모노소듐글루타메이트를 3차 증류수에 녹여 2mM의 농도로 제조하여 사용하였으며, 박층 크로마토그래피 실리카 겔 플레이트(20×20㎝, Merck KGaA, Germany)에 7㎖씩 점적하여 전개하였다. 전개가 완료된 박층 크로마토그래피 플레이트는 핫플레이트 위에서 5~10분간 가열하여 전개용매에 함유된 닌히드린의 아미노산과 결합하여 발생되는 붉은 점을 분석하였다.

감마-아미노뷰티르산의 정량 분석을 위하여 HPLC(515 pump, Waters Co. US)와 ELSD 검출기(ELSD 800, All tech)로 효모가 생산한 감마-아미노뷰티르산의 함량을 분석하였다. 감마-아미노뷰티르산 정량 분석에 사용된 컬럼은 C18 역상컬럼(primesep 100, SIELC)을 사용하였으며 이동상은 10%(v/v)의 아세토니트릴에 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산을 첨가한 등용매를 사용하였으며, 컬럼의 온도는 37℃를 유지하면서 1 ㎖/분의 유속으로 20㎖씩 주입하여 분석하였다. 표준물질인 모노소듐글루타메이트와 감마-아미노뷰티르산의 농도별 표준곡선과 비교하여 반응액의 감마-아미노뷰티르산함량을 산출하였다(R²=0.99).

6. 분리된 M-5 균주의 내당성 조사

스크리닝 결과 선발된 M-5(43B) 균주를 글루코스의 농도가 20%, 30%가 되도록 첨가한 YPD 배지에 각 균주의 전 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v)를 접종한 후, 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양하여 각 균주의 내당성을 조사하였다.

7. 분리된 M-5 균주의 아황산 내성 조사

분리 균주의 메타 아황산 칼슘에 대한 내성을 조사하기 위하여, 산성아황산나트륨(sodium metabisulfite, K2S2O5)의 농도가 200, 500ppm(w/v)이 되도록 각각 첨가하여 만든 YPD 액체배지에 1차 스크리닝에서 선발한 균주의 전 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v)씩 접종하여 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양한 후 600㎚에서 흡광도(UV-VIS spectrophotometer, Beckman coulter)를 측정하여 아황산의 농도에 따른 균주의 생육정도로 아황산 내성을 조사하였다.

8. 분리된 M-5 균주의 알코올 내성 조사

알코올에 대한 내성은 발효 및 양조에 있어서 매우 중요한 특성 중의 하나로 발효 후기로 진행되면서 생산된 알코올의 영향으로 효모의 증식이 억제되거나 효모의 생리화학적 변화로 인하여 자가분해가 발생한다. 당과 알코올이 고농도로 존재할 경우 알코올생산용 효모 균주는 심각한 저해를 받게 되어 발효율이 급감하고 발효시간이 오래 걸릴 수 있기 때문에 발효에 있어 매우 중요한 요소의 하나이다. 따라서 1차 분리 균주의 알코올에 대한 내성을 조사하기 위하여 배양초기 알코올을 0, 5, 10, 15% 함유한 YPD 배지를 이용하여 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v) 접종하고 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양하여 600㎚에서 흡광도(UV-VIS spectrophotometer, Beckman coulter, USA)를 측정하여 균의 생육양상을 분석하였다.

9. 분리된 M-5 균주의 생육곡선

종균배지는 YM broth(BD) 5㎖을 사용하여 29℃, 180rpm으로 24시간 동안 진탕배양 하였으며, 10㎖의 본배양 배지에 종균 배양액을 1.0%로 접종하여 진탕배양기에서 각각 20, 25, 29, 37℃에서 180rpm으로 배양하였다. 본 배양배지를 진탕배양하여 3, 6, 16, 24, 30시간 간격으로 600㎚에서 흡광도를 통한 생육정도를 측정하였다(n=3).

10. 분리된 M-5 균주의 ITS1 , ITS4 영역을 포함한 5.8s rRNA 제한효소 처리에 따른 RFLP 분석

유기농 복분자 발효액에서 분리된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) M-5 균주의 유전자적 구별 방법으로 표준균주와 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 M-5(43B) 균주의 5.8s rRNA 영역의 증폭 및 제한효소 처리 후 패턴분석을 수행하였다. 이스티브-자르조소(Esteve-Zarzoso, 1999)에서 사용한 프라이머 ITS 1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; 서열번호 1)과 프라이머 ITS 4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; 서열번호 2)를 사용하여 95℃에서 15분간 변성 후 얻은 주형 DNA로 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 표 2와 같다. PCR 후 PCR 산물을 정제하여 제한효소 CfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ으로 37℃에서 1시간 반응시킨 후 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 에티디움 브로마이드로 염색 후, 몰레큘라 이미저(Molecular imager, Gel Doc XR+ and ChemiDoc XRS+ Systems, Bio-rad)로 밴드를 확인하였다.

ITS1, ITS4 영역을 포함하는 5.8s rRNA 영역의 증폭을 위한 PCR 조건

PCR condition
Denature	95℃, 5min.
Amplification (35 cycles)	94℃, 1min. (Denature) 55℃, 2min. (Annealing) 72℃, 2min. (Elongation)
Final extension	72℃, 10min.

11. 분리된 M-5 균주의 28s rDNA 동정

현재 가장 광범위하게 자료가 축적된 진균 유전자 서열은 28s rDNA 영역의 D1/D2 영역으로 많은 진균류에 대한 유전정보가 축적되어 있어 효모와 같은 진균류의 동정에 우선적으로 시행할 수 있는 방법으로 알려져 있다. M-5(43B) 균주의 28s rDNA 유전자의 염기서열 분석을 위해 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유니버셜 프라이머인 NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'; 서열번호 3)와 NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'; 서열번호 4) 두 가지의 프라이머가 사용되었으며, PCR은 PCR 사이클 프리머스(MWG-BIOTECH)을 사용하여 수행하였다. 염기서열분석은 ABI PRISM 3730 DNA 아날라이저로 결정하였다.

12. 분리된 M-5 균주의 주사전자현미경 촬영

최종적으로 선발된 효모의 모양, 크기 및 특징을 전자주사현미경(SEM, SN-3000 Hitachi)으로 분석하였다. 시료의 전처리 과정은 배양액을 1,000rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 제거하여 균체를 회수하고 0.9% NaCl로 3회 세척하였다. 1차로 균체를 고정하기 위한 과정으로 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 균체를 현탁하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 0.9% NaCl로 3회 세척하였다. 2차 고정은 1% 오스뮴 테트로독사이드(osmium tetrodoxide)로 실온에서 20분 반응 후 1차 고정과 같은 방법으로 원심분리와 세척과정을 거쳤다. 고정 과정을 마친 균체는 농도별 에탄올(25, 50, 70, 90, 100%)로 각 5분간 탈수하고 100% 에탄올은 2회 반복 처리하였다. 탈수가 끝난 균체는 커버 글라스에 고정 및 건조한 다음 금으로 코팅하여 주사전자현미경 분석을 실시하였다.

실시예 1. 알코올 고생산 효모 분리

복분자 과실 발효액에서 전통발효주에 사용가능한 토종 발효 효모를 분리하였으며, 분리된 약 200균주의 토종 발효 효모에 대한 알코올 생산능을 가스크로마토그래피/수소염이온화검출(GC/FID)로 분석한 결과는 표 3과 같다. 분리된 균주의 알코올 생산량을 분석한 결과, 200개 균주 중 79개 균주에서 15% 이상의 알코올 생산량을 보였으며 31개의 균주는 알코올 발효 후에 20% 이상의 알코올을 생산하는 것으로 분석되었다. 그 중 1A, 11A, 28A, 42B, 109B의 5개 균주는 30% 이상의 높은 알코올 생산량을 보였다. 그 결과 최종적으로 20% 이상의 알코올을 고생산하는 20개의 균주를 선별하여 분석에 사용하였다.

실시예 2. 알코올 고생산 효모의 바이오제닉 아민 생산능

히스타민, 퓨트레신, 카바베린, 페닐에틸아민(phenylethyamine)과 트립타민(tryptamine) 등 주요 바이오제닉 아민은 식중독의 원인이 되며, 히스타민은 특히 알레르기성 과민반응을 일으키는 강력한 혈관확장제로 작용한다. 따라서 약 20% 이상의 고알코올을 생산하는 균주 20종을 사용하여 제조된 복분자 발효액의 바이오제닉 아민의 생산여부를 확인하기 위해, 효모를 접종하지 않은 대조구와 효모를 접종하여 발효시킨 시험구의 바이오제닉 아민 함량을 분석 비교하였다(표 4). 측정 결과, 대조구 및 시험구에서 바이오제닉 아민 11종 중 총 7종의 아민류가 검출되었고, 효모를 접종하지 않은 대조구에서는 카다베린 5.09 ㎎/ℓ, 히스타민 2.72 ㎎/ℓ, 세로토닌 70.25 ㎎/ℓ, 스퍼미딘 1.21 ㎎/ℓ, 도파민 11.43 ㎎/ℓ등 5종의 바이오제닉 아민이 검출되었다. 대조구의 결과를 기준으로 바이오제닉 아민의 생산여부를 확인한 결과 SRCM(A21), M-5(43B), B-8(40B) 및 SRCM(197B), 이 4종의 효모가 바이오제닉 아민을 생산하지 않음을 확인할 수 있었다.

알코올 고생산 효모의 바이오제닉 아민 함량 분석

	바이오제닉 아민(㎎/ℓ)
	카다베린	히스타민	세로토닌	티라민	스퍼미딘	도파민	스퍼민
대조구	5.09	2.72	70.25	-	1.21	11.43	-
SRAM(A21)	-	2.31	64.61	-	-	4.26	-
M-2(37A)	-	4.55	66.90	1.58	1.83	3.87	-
M-3(39A)	-	-	59.52	3.68	1.82	4.32	-
M-4(42B)	-	-	40.96	1.43	1.61	4.03	-
M-5(43B)	-	2.50	44.16	-	1.09	4.49	-
B-6(44B)	-	-	37.99	2.41	2.40	4.14	1.84
B-7(45B)	-	-	41.88	2.22	1.54	3.88	-
B-8(40B)	-	1.93	48.56	-	0.61	3.99	-
B-9(46B)	-	1.22	40.36	1.46	2.11	3.96	-
B-10(47B)	-	-	34.56	2.28	1.59	4.21	-
SRAM(197B)	-	-	66.01	-	-	9.09
SRAM(198B)	0.29	-	73.21	-	5.20	9.65
SRAM(199B)	2.60	5.29	80.98	-	4.77	10.12
SRAM(200B)	1.88	-	66.23	-	4.84	9.53
SRAM(201B)	1.46	0.33	61.78	-	4.06	7.67
SRAM(202B)	0.79	-	57.95	-	4.13	6.84
SRAM(203B)	0.82	-	66.80	-	3.20	-
SRAM(204B)	1.03		60.61	-	3.13	-
SRAM(205B)	0.89	1.02	52.69	-	4.84	-
SRAM(206B)	0.90	0.71	53.83	-	5.98	7.13	1.87

실시예 3. 선별된 알코올 고생산 스타터 균주를 사용한 복분자주 제조 및 알코올 생산량의 변화 양상

도 1은 순창군 쌍치면 농가에서 재배한 복분자를 이용한 복분자 원액의 제조 및 알코올 발효 과정을 제시하였다. 알코올을 고생산하는 분리균주를 스타터로 사용하여 주모 배양한 후 알코올 발효에 적용하였을 때 최종적으로 발효주에 함유된 알코올 함량을 분석한 결과, 206B를 제외한 모든 균주가 9% 이상의 알코올을 생산하였으며 이 결과는 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) KCCM 12224가 발효 후 6%의 알코올을 생산한 결과와 비교했을 때 상대적으로 높은 알코올 발효능을 가진 것으로 확인할 수 있었다(표 5).

유기농 복분자 유래 효모균주를 단일 스타터로 이용하여 제조된 복분자 발효액의 알코올 함유 분석

No.	Strain	Ethanol(%)
1	21A	9.39±1.05
2	B-8	11.66±1.53
3	M-5	11.16±0.87
4	148B	10.05±4.25
5	161B	10.00±1.71
6	164B	10.43±1.11
7	165B	13.23±2.29
8	187B	11.82±0.29
9	190B	11.17±1.78
10	191B	9.84±0.15
11	192B	10.72±0.62
12	195B	10.07±0.93
13	197B	10.09±0.92
14	198B	13.89±2.39
15	199B	11.77±3.89
16	200B	11.11±0.87
17	201B	9.73±1.16
18	202B	9.37±1.53
19	203B	10.03±0.86
20	204B	10.08±0.53
21	205B	15.17±4.32
22	206B	7.18±0.77

실시예 4. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주의 감마- 아미노뷰티르산 생산량 분석

유기농 복분자 발효액으로부터 분리된 M-5 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산능을 확인하기 위하여 전세포 반응을 수행하였다. 전세포 반응 후 감마-아미노뷰티르산의 정성분석을 위한 방법으로 박층 크로마토그래피 분석을 실시한 결과 도 2에서 보이는 것처럼 표준물질인 감마-아미노뷰티르산과 동일한 Rf 값에 해당하는 위치에서 점이 확인되어 M-5 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산 여부를 확인할 수 있었다. K. Masuda 등(2008, Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(12), 3265-3272)은 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산량은 본 연구의 전세포 반응과 동일한 조건인 1% 모노소듐글루타메이트(MSG)와 5% 글루코스를 기질액으로 사용했을 때 2.84~6.6㎎/100㎖의 감마-아미노뷰티르산 생산량을 보인 것에 반해 본 발명에서 분리한 토종 복분자 효모의 경우는 HPLC 분석 결과(표 6), M-5 균주가 67.73±2.11㎎/100㎖의 감마-아미노뷰티르산을 생산하여 해양에서 분리한 감마-아미노뷰티르산 고생산 사카로마이세스 속 균주가 생산하는 것보다 많은 양의 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 것을 알 수 있었다.

No.	Strain	GABA(㎎/100㎖)
1	M-5	67.73±2.11

실시예 5. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주의 내당성 분석

무주 복분자 발효액에서 분리된 고알코올, 바이오제닉 아민 비생산 효모 M-5의 내당성을 비교분석한 실험결과를 도 3에 나타냈다. 12시간까지의 배양 초기에 M-5 균주의 생육 정도는 30%의 글루코스 농도에서 생육의 저해 정도가 다소 큰 것으로 보였지만 24시간 후에는 약 40~50% 감소되어 20%와 30% 조건에서 거의 동일한 수준의 성장을 보였다. 반면에 48시간 이후는 흡광도가 급격하게 증가하는 경향을 보였는데 이는 배지에 함유되어 있던 당이 효모에 의해 소비됨에 따라 균주의 생육 억제 정도가 낮아진 결과로 사료된다. 일반적으로 25~30%의 당농도는 높은 삼투압과 세포 내에 알코올 농도를 증가시켜 효모의 증식에 저해를 일으킴으로 와인양조에는 효모의 생육을 위해 그 이하의 당농도가 요구된다.

실시예 6. 분리된 M-5 균주의 아황산 내성 분석

과실주 발효에 사용되는 아황산은 산화방지와 유해 미생물의 살균을 위하여 사용되는 첨가물로 효모에 의한 알코올 발효에 영향을 미칠 수가 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 선택된 균주의 알코올 발효과정 중에 아황산에 의한 영향을 살펴보고자 YM 배지에 아황산을 농도별로 첨가하여 생육저해도를 분석하였다(도 4). 그 결과 200ppm의 아황산이 함유된 배지에서 M-5 균주는 약 24시간 후에도 생육에 저해를 받지 않았으며 48시간 후에도 꾸준히 생육도가 증가하였다. 이러한 결과는 아황산으로부터 발생되는 H₂SO₃와 SO₂가 주된 작용을 하며, 이들은 포도당과 서서히 결합하여 발효가 진행되면서 알데히드(aldehyde)와 결합하거나 공기 중으로 휘발되어 점차 유리 아황산으로 소실되기 때문에 아황산에 의한 저해가 보이지 않았던 것으로 여겨진다. 일반적으로 와인에 첨가되는 아황산의 첨가량은 약 100ppm 정도로, 200ppm에서 모든 균주가 유사한 양상으로 생육이 진행되는 것으로 보아 아황산에 내성이 높은 것으로 사료된다. 특히 48시간 이후에는 아황산이 휘발되어 소실됨으로써 저해율이 음의 값을 나타내는 것으로 보아 생육이 저해되지 않고 오히려 더 높은 성장을 나타냈다. 500ppm이 함유된 배지조건에서도 생육도는 꾸준히 증가하였으나 200ppm이 함유된 조건보다는 낮은 생육도를 보여 아황산 200ppm에 내성이 높은 것으로 사료된다.

실시예 7. 분리된 M-5 균주의 알코올 내성 분석

알코올에 대한 내성은 발효 및 양조에 있어서 매우 중요한 특성 중의 하나로 효모에 의해 생산된 알코올의 영향으로 발효 후기로 진행되면서 효모의 증식이 억제되거나 자가분해가 발생한다. 고농도의 당과 알코올의 함량에 의해 알코올 생산 스타터 효모 균주는 심각한 저해를 받게 되어 발효율이 급감하고 발효시간이 길어짐에 따라 최종제품의 품질에 영향을 미칠 수 있다. 도 5와 같이 M-5 균주는 12시간 배양 후, 알코올이 첨가되어 있지 않은 배지 조건보다 5% 함유된 배지에서 더 높은 생육도를 보였으며 그 이상의 농도인 10%와 15%에서는 첨가 농도에 비례하여 서서히 생육의 저해가 관찰되었다. 또한, 24시간과 48시간 발효시에는 알코올이 함유되지 않은 배지와 5% 함유된 배지에서 모든 균주가 증식이 가능하였고, 가장 높은 농도의 15%에서는 균주가 거의 생육하지 못함을 알 수 있었다.

실시예 8. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주의 생육곡선

분리균주 M-5을 20, 25, 29, 37℃에서 180rpm으로 진탕배양하며 30시간 동안 시간별로 생육정도를 흡광도로 측정한 결과 25℃에서 대수증식기, 정지기를 거치는 동안 가장 높은 생육도를 보였다. 일반적인 효모의 생육온도가 25~30℃인 특성과 일치하며 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)의 최적 생육온도가 29℃인데 비해 낮은 온도에서 최적 생육조건을 가지는 것으로 나타났다(도 6).

실시예 9. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주의 ITS1 , ITS4 영역을 포함한 5.8s rRNA 제한효소 처리에 따른 RFLP 분석

ITS1, 2영역과 5.8s rRNA 영역은 18s나 25s rRNA 영역보다 이종간의 차이가 더욱 뚜렷하게 나타나기 때문에 가까운 종간의 차이를 식별하는데 유용하게 접근가능한 방법이다. 따라서 본 발명에서는 분리된 균주들을 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) KACC30008과 비교하기 위하여 증폭된 서열을 제한효소 CfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ으로 처리하여 패턴을 분석하였다. 그 결과 도 7과 같이 M-5균주의 패턴이 표준균주와 동일한 것으로 보아 분리된 균주가 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에 속한다는 것을 확인하였다.

실시예 10. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 M-5 균주의 28s rDNA 영역을 이용한 균주의 동정

분리 균주의 동정을 위하여 무주 복분자 발효액에서 분리한 M-5 균주의 28s rDNA 서열로 상동성을 분석한 결과 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)와 99%의 상동성을 보였으며(표 7), 도 8의 계통분류도와 같이 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)를 아웃 그룹으로 지정하였을 때 크게 두 개의 그룹으로 나눠지는데 M-5 균주는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)와 계통분류학적으로 가까운 그룹에 속해있으며 다른 그룹은 비사카로마이세스(non-saccharomyces)의 그룹으로 분리균들과는 계통분류학적으로 상동성이 낮았다. 따라서, 본 발명에서 분리한 균주는 세레비지애(S. cerevisiae)로 나타났다.

무주 복분자 발효액에서 분리한 효모균주 28s rDNA 영역 분석 결과

No.	Strain	Identification	Homology(%)
1	M-5	Saccharomyces cerevisiae strain ATCC MYA-4900	99

실시예 11. 분리된 사카로마이세스 세레비지애 ( S. cerevisiae ) M-5 균주의 주사현미경을 이용한 형태학적 특성 분석

M-5 균주의 형태학적 특성을 주사현미경으로 관찰한 결과, 크기는 평균 2~4㎛의 구형이었으며 표면에 출아 흔적이 관찰되어 전형적인 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균의 형태를 보였으며, 출아법에 의해 생육하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

한국미생물보존센터(국외) KCCM11416P 20130502

<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Saccharomyces cerevisiae M-5 strain producing alcohol and gamma-aminobutyric acid and nonproducing biogenic amine isolated from fermented liquid of raspberry and uses thereof <130> PN14011 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (4)

1. 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonin) 또는 도파민(dopamine)을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) M-5 균주(KCCM11416P).
2. 삭제
3. 제1항의 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하는 방법.
4. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 생산용 조성물.

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