CN118497253A - 一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法 - Google Patents
一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法。通过采用特定的生物材料构建得到重组巴斯德毕赤酵母，再对重组巴斯德毕赤酵母进行诱导表达，即可有效增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受能力。本发明首次发现将含ymL19基因的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中，得到的重组巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受浓度达到了5 mg/mL，相比巴斯德毕赤酵母GS115（1 mg/mL）有了显著的提升，即对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强，实现了在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升了产品的品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法。
背景技术
对羟基肉桂酸（CAS号501-98-4），因具有优异的抗氧化等活性，被广泛应用于药品、保健品、化妆品或食品等各大领域，如：①在药品领域用于抗血小板活化、免疫抑制甚至是抗肿瘤作用等；②在保健品领域用于抗氧化，保护细胞免受氧化压力的伤害等；③在化妆品领域用于抗氧化、保湿、舒缓、提亮肤色等；④在食品领域用于制备食品添加剂等。
巴斯德毕赤酵母在药品、保健品、化妆品或食品等领域的应用也十分广泛，如：①在药品领域用于生产或表达重组蛋白、疫苗、抗体、抗生素、维生素和氨基酸等；②在保健品领域用于抗氧化，保护细胞免受氧化压力的伤害等；③在化妆品领域用于生产胶原蛋白，发挥抗衰老等作用；④在食品领域用于生产或制作面包、饮料、酱油、酱料、酸奶、酒、酶制剂、饲料和生物肥料等。
然而，当想在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多的对羟基肉桂酸时，会因巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受能力较弱，而出现巴斯德毕赤酵母的正常生长受到明显抑制的问题。因此，亟需寻找一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法，以实现在含巴斯德毕赤酵母的产品中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升产品的品质。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法，通过采用特定的生物材料构建得到重组巴斯德毕赤酵母，再对重组巴斯德毕赤酵母进行诱导表达，使重组巴斯德毕赤酵母相比巴斯德毕赤酵母，对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强，实现在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升产品的品质。
本发明的第一目的是提供一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法。
本发明的第二目的是提供一种构建重组巴斯德毕赤酵母的方法。
本发明的第三目的是提供上述方法构建得到的重组巴斯德毕赤酵母。
本发明的第四目的是提供上述重组巴斯德毕赤酵母在制备含对羟基肉桂酸的产品中的应用。
本发明的第五目的是提供ymL19基因在增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法，即：先构建重组巴斯德毕赤酵母，再对重组巴斯德毕赤酵母进行诱导表达；
其中，采用下述一种或几种生物材料构建重组巴斯德毕赤酵母：
①：ymL19基因；
②：含①的重组表达载体；
③：含①的表达盒；
④：含③的重组表达载体；
其中，所述ymL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明首次发现将含ymL19基因的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中，得到的重组巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受浓度达到了5 mg/mL，相比巴斯德毕赤酵母GS115（1mg/mL）有了显著的提升，即对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强，实现了在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升了产品的品质。
优选地，所述重组表达载体为pPICZa-TEF1-EGFP。
优选地，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
基于此，本发明还提供了一种构建重组巴斯德毕赤酵母的方法，即：构建含ymL19基因的重组质粒，再转入巴斯德毕赤酵母中；其中，所述ymL19基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
优选地，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
本发明首次发现将含ymL19基因的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中，得到的重组巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受浓度达到了5 mg/mL，相比巴斯德毕赤酵母GS115（1mg/mL）有了显著的提升，即对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强。表明ymL19基因在巴斯德毕赤酵母中的过表达能显著增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受能力，实现在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升产品的品质。因此，上述方法构建得到的重组巴斯德毕赤酵母、上述重组巴斯德毕赤酵母在制备含对羟基肉桂酸的产品中的应用，以及ymL19基因（核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示）在增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力中的应用均应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述重组巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
优选地，所述产品为药品、保健品、化妆品或食品中的一种或几种。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现将含ymL19基因的重组质粒转入巴斯德毕赤酵母中，得到的重组巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸的耐受浓度达到了5 mg/mL，相比巴斯德毕赤酵母GS115（1mg/mL）有了显著的提升，即对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强，实现了在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升了产品的品质。
附图说明
图1为琼脂糖电泳图。图中，M为Marker条带，1为PCR扩增产物条带。
图2为荧光显微镜图。
具体实施方式
在本发明中，方法流程中涉及多个步骤的，除非本文有明确的不同说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，其可以以描述以外的其他顺序执行。而且，任一个步骤可以包括多个子步骤或多个阶段，这些子步骤或阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，其执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的一部分轮流或交替或同时地执行。
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以以合适的方式组合于另一实施方式中，以产生新的实施方式。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。除非特别说明，本发明实施例采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明实施例采用的试剂和材料均为市购。
低钠LB琼脂培养基：在水中加入琼脂15 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、酵母抽提物5g，并继续加水至体积为1000 mL，用6 M NaOH溶液调节pH至7.2后，在0.1 MPa、121 ℃下灭菌20 min。
低钠LB液体培养基：在水中加入氯化钠5 g、蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g，并继续加水至体积为1000 mL，用6 M NaOH溶液调节pH至7.2后，在0.1 MPa、121 ℃下灭菌20 min。
YPD平板：在水中加入琼脂15 g、葡萄糖20 g、酵母抽提物10 g、蛋白胨20 g，并继续加水至体积为1000 mL，用6 M NaOH溶液调节pH至7.2后，在0.1 MPa、121 ℃下灭菌20min。
YPD培养基：在水中加入葡萄糖20 g、酵母抽提物10 g、蛋白胨20 g，并继续加水至体积为1000 mL，用6 M NaOH溶液调节pH至7.2后，在0.1 MPa、121 ℃下灭菌20 min。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，购买自北京酷来搏科技有限公司。
大肠杆菌（Escherichia coli）TOP10菌株，购买自生工生物工程（上海）股份有限公司。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），购买自乐斯福公司。
实施例1 构建重组巴斯德毕赤酵母
（1）以酿酒酵母的基因组DNA为模板，用PCR特异引物扩增得到启动子TEF1。
其中，启动子TEF1的PCR特异引物为：
TEF1-F：gtctcggatcggtacctcgagGATCCCCCACACACCATAGCT（SEQ ID NO:1）；
TEF1-R：cccttgctcaccatgcggccgccaACtagtCTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCt（SEQ ID NO:2）。
启动子TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：
gatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaag。
（2）以酿酒酵母的基因组DNA为模板，用PCR特异引物扩增得到ymL19基因。
其中，ymL19基因的PCR特异引物为：
ymL19-F：gcaatctaatctaagactagtATGTCACAGGCAGCAAAAAACG（SEQ ID NO:4）；
ymL19-R：gcccttgctcaccatgcggccAGGTACAACCTTAATACCCACACTTTT（SEQ ID NO:5）。
ymL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示：
ATGTCACAGGCAGCAAAAAACGTGATAGTAAAGCTAATAGTAGGAGCAGGCCAAGCGGCACCATCACCTCCCGTGGGGCCCGCATTGGGCTCCAAGGGTATAAAAGCCATTGACTTTTGTAAGGAATTTAATGCAAGATCAGCAAACTATCAGCCAGGTGTACCGGTTCCAGTATTAATCACAATAAAACCTGATAGAACATTTACGTTTGAAATGAAATCTCCACCAACCGGATATTTGCTGCTAAAAGCTCTTAAAATGGACAAGGGACATGGACAACCGAATGTGGGGACAATGTTAGGCAGTGCACCTGCCAAGGGACCAACCCGTGCTTTAGGAGAGTTATCGCTGAAGCACGTTTACGAAATAGCCAAGATAAAAAAGAGTGATGAAAGGCATAGTTTATTGGAGATGGAAGGTATTGTTAAATCAATAGTTGGCGTTGCAAAAAGTGTGGGTATTAAGGTTGTACCTTGA。
（3）对质粒pPICZa-EGFP进行XhoI和NotI双酶切后，与启动子TEF1、ymL19基因进行重组，经热激转入大肠杆菌TOP10菌株中，再将菌接种于低钠LB液体培养基中，于37 ℃、180rpm/min下振荡培养1 h后，将培养液涂布于低钠LB琼脂培养基（含有25 μg/mL的博来霉素）上，在37 ℃下培养24 h。挑取单菌落（用PCR引物5’AOX-1:gactggttccaattgacaagc（SEQ IDNO:7）；3’AOX-1:gcaaatggcattctgacatcc（SEQ ID NO:8）进行扩增，得到的扩增产物条带为1918 bp），接种于5 mL低钠LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min的摇床中培养24 h，提取质粒pPICZa-TEF1-ymL19-EGFP。
（4）对重组质粒pPICZa-TEF1-ymL19-EGFP进行sacI酶切后，用氯化锂转化法将其转入巴斯德毕赤酵母GS115中，构建得到重组巴斯德毕赤酵母GS115。
实施例2 筛选重组巴斯德毕赤酵母
（1）将实施例1所得重组巴斯德毕赤酵母GS115接种于YPD平板（含100 μg/mL的博来霉素）上，在37 ℃下培养4 d后，挑取单菌落接种于YPD培养基中，再置于30 ℃、180 rpm/min的摇床中培养24 h，得到培养液。
（2）取5 mL（1）所得培养液用以提取该菌的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，用验证引物5’AOX-1:gactggttccaattgacaagc（SEQ ID NO:7）；3’AOX-1:gcaaatggcattctgacatcc（SEQ ID NO:8）进行PCR扩增，再将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，得到的琼脂糖电泳图如图1所示。由图可知，PCR扩增产物的条带在2000 bp附近，且经测序确认其含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，表明重组质粒pPICZa-TEF1-ymL19-EGFP已成功转入到巴斯德毕赤酵母GS115中，即重组巴斯德毕赤酵母GS115构建成功。
（3）用荧光显微镜（用40倍物镜，且发射滤光片的波长为512～558 nm，激发波长为465～495 nm）观察（1）所得培养液，得到的荧光显微镜图如图2所示。由于重组质粒pPICZa-TEF1-ymL19-EGFP中的EGFP与ymL19基因为融合表达，且EGFP为绿色荧光蛋白，故荧光显微镜图中的绿色荧光可证明重组巴斯德毕赤酵母GS115中已成功表达出ymL19基因。
实施例3 测试重组巴斯德毕赤酵母的耐受能力
（1）在乙醇（2 mL）中加入对羟基肉桂酸（0.2 g），得到对羟基肉桂酸乙醇溶液。
（2）分别在培养皿中加入0.1、0.5 mL对羟基肉桂酸乙醇溶液，再加入10 mL融化的YPD平板，并等待其冷却凝固后，得到含1 mg/mL与5 mg/mL对羟基肉桂酸的YPD平板。
（3）将重组巴斯德毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中，在30 ℃、180 rpm/min的摇床中培养24 h后，得到重组巴斯德毕赤酵母GS115菌液。
（4）将巴斯德毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中，在30 ℃、180 rpm/min的摇床中培养24 h后，得到巴斯德毕赤酵母GS115菌液。
（5）分别将重组巴斯德毕赤酵母GS115菌液（5 μL）与巴斯德毕赤酵母GS115菌液（5μL）接种于含1、5 mg/mL对羟基肉桂酸的YPD平板上，在30 ℃下培养24 h。
培养结束后，观察平板上菌落形成情况可以发现，重组巴斯德毕赤酵母GS115在含1 mg/mL与5 mg/mL对羟基肉桂酸的YPD平板上均能正常生长；而巴斯德毕赤酵母GS115只能在含1 mg/mL对羟基肉桂酸的YPD平板上生长，在含5 mg/mL对羟基肉桂酸的YPD平板上则无法生长。可见，重组巴斯德毕赤酵母GS115对对羟基肉桂酸的耐受浓度达到了5 mg/mL，相比巴斯德毕赤酵母GS115有了显著的提升，即对对羟基肉桂酸的耐受能力得到显著增强，实现了在含巴斯德毕赤酵母的产品（如药品、保健品、化妆品或食品等）中添加更多对羟基肉桂酸的目标，进而显著提升了产品的品质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力的方法，其特征在于，先构建重组巴斯德毕赤酵母，再对重组巴斯德毕赤酵母进行诱导表达；
其中，采用下述一种或几种生物材料构建重组巴斯德毕赤酵母：
①：ymL19基因；
②：含①的重组表达载体；
③：含①的表达盒；
④：含③的重组表达载体；
其中，所述ymL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为pPICZa-TEF1-EGFP。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
4. 一种构建重组巴斯德毕赤酵母的方法，其特征在于，构建含ymL19基因的重组质粒，再转入巴斯德毕赤酵母中；其中，所述ymL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
6.权利要求4或5所述的方法构建得到的重组巴斯德毕赤酵母。
7.权利要求6所述的重组巴斯德毕赤酵母在制备含对羟基肉桂酸的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、保健品、化妆品或食品中的一种或几种。
10. ymL19基因在增强巴斯德毕赤酵母对对羟基肉桂酸耐受能力中的应用，其特征在于，所述ymL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
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