CN101173223A - 一种作为微生物发酵剂的菌株,包含该菌株的复合发酵剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物和食品加工技术领域，具体涉及一种作为微生物发酵剂的菌株，包含该菌株和植物乳杆菌的复合发酵剂及其应用。本发明的特征在于，分离、筛选得到一株适合米发糕发酵用的酵母菌－卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M207150。利用该卡斯特酒香酵母ZSM－001菌株和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS1.510制备成一种微生物复合发酵剂。该微生物复合发酵剂可应用于大米发酵制品，其中的应用包括在米发糕制品中的应用。该微生物复合发酵剂具有良好的发酵性能，产品具有典型的酸甜香味，且复合发酵剂易于工业化生产。

Description

一种作为微生物发酵剂的菌株，包含该菌株的复合发酵剂及应用

技术领域

本发明属于食品发酵和食品加工技术领域，具体涉及一种作为微生物发酵剂的菌株的筛 选，包含该菌株的复合发酵剂（菌剂）及其在米发糕制品中的应用。

背景技术

大米发酵食品是我国的传统食品，但目前大多手工方法和传统发酵方法生产。研究大米 发酵食品的发酵剂对于传统发酵食品的工业化生产具有重要意义。

米发糕的生产中起主要作用的微生物是酵母菌和乳酸菌，传统的生产均为自然发酵或接 入老浆进行人工发酵，由于发酵的过程微生物菌系复杂，且在发酵的过程中微生物的活性和 比例容易发生变化，容易受杂菌污染，导致米发糕生产的周期拉长，而且产品的质量也不稳 定。

微生物发酵剂是用于生产发酵制品的特定微生物培养物，微生物发酵剂在发酵制品生产 中的应用，改变了传统的发酵制品生产的模式，开发发酵制品的专用微生物发酵剂是解决传 统发酵食品的工业化生产的重要方法。直接使用微生物发酵剂具有如下优点：发酵活力强， 发酵时间短；可以保持微生物菌种的活性、比例；可有效地防止杂菌的污染（李元莉等，功 能性乳酸菌在食品发酵工业中的应用，中国乳品工业，2006， 1: 35-37);可以节省原材料， 降低成本，避免发酵失败；还可以保证发酵产品质量的稳定（贺稚非等，泡菜活'叶直投式乳 酸菌发酵剂的研究，食品科学，2006, 8: 191-197);微生物发酵剂接种量小，可以精确控制 发酵工程（杜磊等，乳酸菌浓缩发酵剂的研究意义，河南畜牧兽医，2007， 2: 13)等等。

多菌种发酵是微生物发酵领域中通用技术问题。文献报道了利用乳酸菌和酵母菌可以很

好的混合发酵（赵玉红等，乳酸菌和酵母菌共生发酵生产面包的研究，食品工业科技，2003

(3): 61-62;廖永红等，酵母和乳酸菌发酵生产白啤酒的研究，食品与发酵工业，2000 (3):

48-52;江洁等，乳酸菌和酵母菌共生发酵茶饮料的研制，食品科学，2001， 1: 44-46)，多 菌种混合发酵可以弥补单菌种发酵的单调性（何余堂等，混合发酵法生产花粉面包的工艺优 化，食品科技，2006(9): 57-59;候先志等，复合菌发酵剂的研制，内蒙古农牧学院学报， 1999 (3): 1-5),使产品风味物质更加丰富，质暈更好，还可增加产品的多样性，扩大市场 消费。 一般认为，乳酸菌对产品的储存稳定性起决定作用；而酵母菌对产品的形态，色泽，

风味起决定作用，因此制作混合发酵剂具有良好的效果。

在工业生产上，微生物发酵剂的应用己逐渐成为热门，对各种发酵剂的研究也相继增多。 伊.还是主要集中在酸奶，肉类和发酵香肠的研究领域，对于在大米类发酵食品中的应用才刚 刚起步，目前还没有适用于米发糕发酵专用微牛物发酵剂的菌株及其多菌株发酵在大米制品 上应用的报道。

发明内容本发明的第一个目的是从米浆的发酵液中分离出发酵性能良好的纯种菌株作为微生物发 酵剂应用的菌株；本发明的第二个目的是制备作为大米制品特别是米发糕发酵用的包含本发 明的酵母菌的和筛选的植物乳杆菌的复合发酵剂（菌剂）；本发明的第三个目的是含有本发明 制备的微生物菌株的复合发酵剂（菌剂）在大米制品特别是在米发糕生产中的应用，以达到 米发糕生产简便、高效、稳定生产的目的。

本发明通过下列技术方案实现：

一种筛选得到的适用于大米制品，特别是米发糕发酵的卡斯特酒香酵母菌 (5re"朋o町ces c""erw7) ZSM-001,于2007年9月25日保藏在中国典型培养物保藏中 心（CCTCC),其保藏号为CCTCC NO: M207150。

一种包含保藏号为CCTCC NO: M207150的卡斯特酒香酵母菌^re"a/?側/ces ciASterw7 j ZSM-001和植物乳杆菌Oa"o/?ac/A?"s p7a"te/Y//^ AS1. 510 (该植物乳杆菌购自中国科学 院微生物研究所）的复合发酵剂（菌剂）。

一种微生物复合发酵剂（菌剂）的制备方法，所述的微生物复合发酵剂（菌剂）的菌株 来自于申请人自行分离鉴定的卡斯特酒香酵母ZSM-001 (保藏号为CCTCCN0: M207150)和商 购的植物乳杆菌AS1. 510制备成的微生物复合发酵剂（菌剂），申请人利用上述菌剂可以制备 成液态复合发酵剂（菌剂）和固态复合发酵剂（菌剂），它们具有下列特征；

1) 液态复合发酵剂中卡斯特酒香酵母（5re"ay?o/^ees ci/Werw7) ZSM-001与植物乳 杆菌aa"oZ^c/〃〃s A/a/7Z^7^y») AS1. 510的活菌数均达到10Bcfu/mL以上；

2) 固态发酵剂的含水量为20%以下，卡斯特酒香酵母ZSM-001与植物乳杆菌、AS1.510 的活菌数均达到107cfu/g以上；

卡斯特酒香酵母菌ZSM-001菌株的分离、筛选和鉴定：

如附图1所示，本发明的卡斯特酒香酵母菌菌株ZSM-001的分离、筛选和鉴定如无特别 说明均参照周德庆主编，《微生物学实验手册》，上海科学技术出版社，1986年；胡瑞卿译， 《酵母菌的特征与鉴定手册》，青岛海洋大学出版社，1991年；白毓谦等编著，《微生物实 验技术》，山东大学出版社，1987年，和魏景超著，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版 社，1979年版介绍的方法。本发明的菌株卡斯特酒香酵母菌ZSM-001是本申请人从传统的 米发糕原料-米浆发酵液中分离得到40个候选菌，经分离、纯化，并通过酵母膏葡萄糖蛋 白胨（YPD)液体培养基（10g酵母膏，20g葡萄糖，10g蛋白胨，补充蒸馏水至1000mL， 灭菌前调pH至6. 0左右）发酵杜氏小管产气试验（毛志群等，高产酒精酵母的筛选及鉴定， 食品与发酵工业，2003 (3): 50-53)得到酵母菌的预选株，然后通过生长曲线法（王俊沪 等，优良香梨酒酵母的选育，酿酒，2003 (6): 26-29)筛选出产气和产酒精能力最强的菌 株，申请人将其编号为ZSM-001。经鉴定该菌株为卡斯特酒香酵母（5re"a"o/^ces

卡斯特酒香酵母菌菌株ZSM-001菌株的保藏按上述《微生物学实验技术手册》操作。

卡斯特酒香酵母菌ZSM-001菌株的菌学特征：—

卡斯特酒香酵母菌ZSM-001菌株细胞卵圆形，芽殖，无假菌丝，无子囊孢子。在豆芽汁 葡萄糖琼脂平板上形成的菌落乳白色、边缘整齐、表面隆起、有光泽。发酵葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、松三糖和纤维二糖，不发酵乳糖、蜜二糖、棉子糖、淀粉和菊 糖；碳源同化蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、甘油和D—甘露糖，不同化D—核糖、D— 木糖、纤维二糖、乳糖、菊糖、淀粉、柠檬酸和D—山梨醇；氮源同化硫酸铵，硝酸钾；不 产生类淀粉物质。

卡斯特酒香酵母菌菌株ZSM-001在分类学上属于卡斯特酒香酵母（5re"a/70/^ces c""ers/i义该菌株2007年9月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO. M207150'。

与现有传统米发糕生产所用的老浆（含天然发酵激生物相比，本发明具有以下优点：

1、 该菌株可以作为优质专用发酵剂：本发明作为高活菌数的菌种培养物接入到米发酵制

品（例如米发糕）中，可使米发糕中起主要发酵作用的微生物成为优势菌种，实现强化发酵， 发酵时间短，发酵特性好，产品质量稳定，

2、 本发明的发酵剂使用方便：本发明的发酵剂可直接添加到米浆中，不需添力:;其他添加

剂，使用方便，使用剂量小。

3、 本发明的复合发酵剂实现了混合菌种（卡斯特酒香酵母和植物乳杆菌）的复合发酵，

酵母菌发酵使米发糕成品具有良好的形态，蓬松的口感，而植物乳杆菌代谢产生的乳酸还使 成品具有酸甜的滋味，并且乳酸也具有防腐作用，有利于产品的保鲜。

实施例l:菌株的分离、筛选与鉴定

1、 分离培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基制备

按重量计称取去皮的新鲜土豆200g，切片，加水1000mL，煮沸30min,过滤后加入葡萄 糖20g,琼脂粉7.5g，煮沸后补足水分至1000mL，调pH至6.0-6.5,常规方法（121。C，灭 菌30分钟）灭菌。

2、 分离方法（稀释平板法） 2. 1样品稀释液的制备：

用lml无菌吸管吸取富集培养液lml，放入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀即成10—'

附图说明

图1 图2 图3 图4

是本发明的菌种分离、筛选以及鉴定的技术流程图。 是本发明的液态复合发酵剂（菌剂）的技术流程图。 是本发明的固态复合发酵剂（菌剂）的技术流程图。

是利用本发明发酵剂（菌剂）生产米发糕应用的工艺路线。

具体实施方式

稀释液；再用lml无菌吸管吸取1(T稀释液lml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次， 让菌液混匀，即成10—2稀释液；再换一支无菌吸管吸取I(T稀释液lml放入装有9ml无菌水 的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10—3稀释液；以次类推，每次更换吸管，连续稀释 至10—5、 IO"6、 10—7稀释度。 2.2平板接种培养：

采用混平板法；用无菌吸管吸取lml菌液加入灭菌的培养皿中，倒入冷却至50'C左右的 土豆葡萄糖琼脂培养基（即上述的土豆葡萄糖琼脂培养基)，混合均匀，凝固后将平板倒置保 温培养2-3天。

2.3、 挑菌纯化：

从培养过的平板中选取分离较好的酵母菌菌落转接斜面。酵母菌落一般都有湿润，较光 滑，有一定的透明度，容易挑起等特点。酵母菌菌落的颜色比较单调，多数都呈乳白色，一 般还会散发出一股悦人的酒香味。

2.4、 菌株筛选： 2. 4. 1初筛

杜氏小管法：将2.3步骤制备的菌种接入放有杜氏小管的土豆葡萄糖液体培养基（同上 述的分离培养基，不含琼脂）的试管中，于3(TC培养箱中培养,定时观察小管的产气情况，筛 选出产气量最快最多的候选菌株8株。 ?. 4. 2复筛

牛长曲线法：将2. 4. 1步骤制备的菌种接入土豆葡萄糖液体培养基（同上述分离培养基， 不含琼脂），3(TC培养，定时取样，测定C02及酒精含量，筛选出产C02及酒精能力最强的酵 母菌菌株，申请人将其命名为ZSM-001。

2.5、 酵母菌的鉴定：

结合菌株的形态学特征、培养特征和生理生化特征，参考周德庆主编，《微生物学实验手 册》，上海科学技术出版社，1986年；胡瑞卿译，《酵母菌的特征与鉴定手册》，青岛海洋大学 出版社，1991年；白毓谦等编著，《微生物实验技术》，山东大学出版社，1987年和魏景超著， 《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，1979年争文献，将酵母菌鉴定到种。确定本发明的 菌株ZSM-OOl为卡斯特酒香酵母（5re"a/7o/?/yces cw"erw7)。

本发明的卡斯特酒香酵母菌株ZSM-001的保藏培养基为酵母膏葡萄糖蛋白胨（YPD)琼脂 培养基，配方如下：10g酵母膏，20g葡萄糖，10g蛋白胨，13g琼脂粉，补充蒸馏水至1000mL， 灭菌前调pH至6.0左右，按照上述所述的常规方法灭菌。

实施例2液体复合发酵剂（菌剂）的制备

1、试验材料：卡斯特酒香酵母ZSM-001，从米发糕的原料-米浆发酵液中分离筛选得到；植 物乳杆菌AS1.510，购自中国科学院微生物研究所；早籼米为市售产品。 2、液体复合发酵剂的制作

1)斜面试管菌种的培养：将保藏号为CCTCC NO: M207150的卡斯特酒香酵母菌ZSM-001 和商购的植物乳杆菌AS1. 510分别接种于酵母葡萄糖蛋白胨土豆琼脂培养基上（胡瑞卿译， 酵母菌的特征与鉴定手册，青岛海洋大学出版社，1991年。该培养基在灭菌前调pH至6.0 左右）和MRS培养基（凌代文主编，乳酸细菌分类鉴定及实验方法，中国轻工业出版社，该 培养基灭菌前调pH至6. 2-6. 4)斜面固体上，在30'C条件下培养2-3d,使其活化即成为斜 面菌种；

2)三角瓶扩大培养：将上述步骤l)的保藏号为CCTCC NO: M207150的卡斯特酒香酵母 菌ZSM-001试管菌种接种于按前述常规方法灭菌的酵母菌的三角瓶增菌液体培养基上（由于 培养基成分不一，具体请参见Jl- J2所述），在30'C条件下培养24h,其菌体活菌数达到 107cfu/mL，得到卡斯特酒香酵母菌ZSM-001的菌悬液，备用；将步骤l)的植物乳杆菌AS1. 510 试管菌种接入乳酸菌的三角瓶增菌液体培养基（由于培养基成分不一，具体请参见R1-R5所 述）中，在3(TC条件下培养24h，其菌体活菌数达到10scfu/mL,得到植物乳杆菌AS1. 510的 菌悬液，备用。

申请人比较了几种酵母菌和乳酸菌增菌培养基，以便从中筛选最佳发酵培养基组合，本 发明设计了下列几个配方的培养基：

编号Jl:酵母粉7 g/L,蛋白胨3 g/L，蔗糖5 g/L,补充水分至1L，灭菌前调pH至 6.0左右。

编号J2: 1L蒸馏水中加入200g去皮的新鲜土豆，沸水煮30min，纱布过滤，补水至1L， 即得到20%土豆汁，加蔗糖2 0g/L，调pH至6.0-6.5。 乳酸菌增菌培养基：

编号R1:脱脂乳100g/L，蔗糖60g/L，乳酸钙O. 15g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH 至6. 0-6. 5。

编号R2:脱脂乳100g/L,蔗糖16g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉7 g/L，乳酸钙0. 15 g/L, 补充水分至1L，灭菌前调pH至6.0-6.5。

编号R3:乳糖10 g/L,酵母粉3.5 g/L，蛋启胨10 g/L，乳酸钙0. 15 g/L，补充水分 至1L，灭菌前调pH至6.0-6. 5。

编号R4:麦芽浸粉IO g/L，蛋白胨3 g/L，乳糖5 g/L，乳酸钙O. 15 g/L，补充水分至 1L，灭菌前调pH至6. 0-6. 5。

编号R5:蔗糖20 g/L，蛋白胨5.8 g/L，乳酸钙0. 15 g/L，补充水分至1L，灭菌前调 pH至6. 0-6. 5。 3)复合菌悬液的混合

将本发明的卡斯特酒香酵母菌ZSM-001和植物乳杆菌AS1. 510的菌悬液分别以9:I，8:2，5:5, 1:9, 0.5:9(体积:体积）的比例混合，得到的菌体混合液，即为本发明所述的液体复合 发酵剂（菌剂）产品。

4)将步骤3)得到的菌体混合液于4'C冰箱保存，备用。 3、液态复合发酵剂（菌剂）在米发糕的制作中的应用

1) 原料米：称取原料大米lKg,清洗。

2) 浸泡:加水2000mL，于30'C浸泡21h。

3) 米浆的制备：用自来水清洗数遍后加1200mL水磨浆。

4) 接种：加入400mL液体复合发酵剂，混匀。

5) 发酵：将接种后的米浆放入恒温（30。C)培养箱发酵3h。

6) 调味：加入200g蔗糖调味，混匀。

7) 蒸煮：将步骤6)的米浆放入蒸锅中，上蒸汽后蒸15min取出，即为本发明所述的米发 糕成品。

表1显示了不同的增菌培养基的液态复合发酵剂制作的米发糕的感官品质。

表1不同的增菌培养基的液态复合发酵剂对发糕的感官 品质的影响（综合评价满分为10分） 培养基编 形态 色泽 香气 口感 滋味 综合评分

号及组合

R1+ Jl 8.4 8.2 8.4 8.3 8.6 8.8

R2+ Jl 8.0 8.2 8. 1 8.0 8. 1 8.0

R3+ Jl 8.0 8.2 8. 1 8.4 8.3 8.3

R4+ Jl 8.0 8.0 8.2 8.2 8.3 8.4

R5+ Jl 7.3 8.1 7.7 7.8 8. 1 8. 1

R1+ J2 8.2 7,7 7.6 7.5 8. 1 7.8

R2+ J2 7.5 8.4 8.5 8.0 8. 3 8.4

R3+ J2 7.2 7.8 8.0 6.9 7.2 7.6

R4+ J2 8.2 8.5 8.2 8.4 8.4 8.8

R5+ J2 7.6 7.9 8.4 7.4 7.6 8.0

由表1可知，编号R1+ Jl与R4+ J2组合培养基的液态复合发酵剂制作的米发糕感官得 分最高。

表2是选择R4+ J2为卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳杆菌AS1. 510的增菌培养基，以 本发明的卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳杆菌AS1. 510的菌悬液以不同体积比例的液态复 合发酵剂制作的米发糕的感官品质评价结果。 '

表2菌种复配发酵的发糕感官评定结果 (综合评价满分为10分） 试验处理 形态 色泽 香气 口感 滋味 综合评分

R:J(V:V)=9:1 5.8 6. 3 6. 5 6.4 6. 5 6.6

R:J(V:V)=8:2 7. 3 7. 1 7. 3 7. 3 7. 1 7. 7

R:J(V:V)=5:5 8.4 8. 3 8.7 8. 3 8.5 8.6

R:J(V:V)=1:9 9. 1 9.0 8.8 8.8 8.9 9.0

R:J(V:V):O. 5:9 8.7 8.8 8.7 8.9 8.8 8.8

由表2可知，当卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳杆菌ASl. 510的菌悬液体积之比为1:

9时发酵后的米发糕感官得分最高。

实施例3固态复合发酵剂（菌剂）的制备

1、 试验材料

试验菌株为卡斯特酒香酵母菌ZSM-001和植物乳杆菌AS1. 510,早籼米为市售产品（同 实施例2)。

2、 固态复合发酵剂的制作

1) 斜面试管菌种的培养：将保藏号为CCTCC NO: M207150.的卡斯特酒香酵母菌ZSM-001 和商购的植物乳杆菌AS1. 510分别接种于按前述常规方法灭菌的酵母葡萄糖蛋白胨土豆琼脂 培养基（胡瑞卿译，酵母菌的特征与鉴定手册，青岛海洋大学出版社，1991年，该培养基灭 菌前调pH6.0左右）和MRS培养基（凌代文主编，乳酸细菌分类鉴定及实验方法，中国轻工 业出版社，该培养基灭菌前调PH6.2-6.4)斜面固体上，在30'C条件下培养2-3d，使其活化 即为试管斜面菌种：

2) 三角瓶扩大培养：将步骤l)的卡斯特酒香酵母ZSM-001的试管菌种接种于按前述常 规方法灭菌的土豆汁（1L蒸馏水中加入200g去皮的新鲜土豆，沸水煮30min，纱布过滤，补 水至1L)， 2%蔗糖的三角瓶液体培养基上，灭菌前调pH至6. 0-6. 5)培养基上，于30'C条 件下培养24h，其菌体活菌数达到107cfu/mL,得到卡斯特酒香酵母JM-21的三角瓶菌种；将 步骤1)的植物乳杆菌AS1.510试管菌种接入含有脱脂奶粉100 g/L,蔗糖60 g/L，乳酸钙 0.15g/L，补充水分至1L，灭菌前调培养基的pH至6.0-6.5)煮沸灭菌的三角瓶液体培养 基中，在30。C条件下培养24h,其菌体活菌数达到108cfu/mL，得到植物乳杆菌AS1. 510的三 角瓶菌种：

3) 菌液混合：将步骤2)的卡斯特酒香酵母ZSM-001与植物乳杆菌AS1.510的菌悬液以 9: 1 (体积：体积）的比例混合，加入10%的脱脂奶粉，10%的蔗糖，混合均匀，得到菌种 的混合液（混合菌液）；

4) 干燥：将步骤3)的混合菌液于-18'C预冻4h，然后于-60'C冷冻干燥24h，使其含水 量为20%以下，即得到固态复合发酵剂（菌剂）。

3、 固态复合发酵剂的应用

按实施例2中米发糕的制作方法制作米发糕，本i施例，比较了固态复合发酵剂在不同 添加量，发酵时间及发酵温度下对米发糕发酵后的感官品质评价见表3所示。

表3 本发明的固态复合发酵剂对发酵后米发糕的感官品质的评价（综合评价满分为10分）

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8 2.1 35 1.0 5.9 6.0 7.5 6.1 6.8 8.8 9__^_^_7.0 7.0 7.7 6.6 7.0_9.0

由表3可知，不同组合条件下制作的米发糕感官品质存在较大差异，实验表明，添加2.1 %的固态复合发酵剂，于38C下发酵1. 5h制作的米发糕感官得分最高。

实施例4液态复合发酵剂与传统老浆发酵的比较

1、 试验材料

液态复合发酵剂按实施例2的方法制作(卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳杆菌AS1. 510 的菌悬液体积之比为l: 9),老浆为市场上销售的米,糕的通用原料，早籼米为市售产品（同 实施例2)。

2、 液态复合发酵剂与传统老面发酵制作的米发糕的比较

按实施例2中米发糕的制作方法制作米发糕，液态复合发酵剂与老浆的添加量相同。 表4本发明的液态复合发酵剂与传统老浆制作的米发糕的感官品质评价（综合评价满分为10分）

实验编号 添加物 形态 色泽 香气 滋味 口感 综合评分

1 液态发酵剂 7.2 7. 1 8.0 7.0 7.3 8.8

2 传统老浆 6.3 7.0 6.0 6.0 5.2 6.6

由表4可知，与传统生产米发糕所用的老浆相比，本发明的复合发酵剂（菌剂）在试验 条件范围内具有较强的发酵作用，而且米发糕成品的感官品质有较大的提高，质量完全可以 人工控制，容易实现标准化生产。

Claims (5)

1、一种作为微生物发酵剂的菌株，其特征在于，该菌株为卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M207150。

2、 包含权利要求1所述的菌株和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) AS1.510的微生 物复合发酵剂。

3、 权利要求l所述的菌株作为微生物发酵剂的应用。

4、 权利要求2所述的微生物复合发酵剂在大米发酵制品中的应用。

5、 权利要求2所述的微生物复合发酵剂在米发糕制品中的应用。