KR20090122069A - 신규 아스퍼질러스 오리재 균주 및 이를 이용한 야자과종자박의 고상 발효방법 - Google Patents

Abstract

만난아제(mannanase) 생성능 및 야자과 종자박 발효능을 갖는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) MFO1 균주(KCTC 11105BP) 및 이를 이용한 야자과 종자박의 고상 발효방법이 개시된다. 본 발명에 따른 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) MFO1 균주는 사료의 소화 흡수에 도움을 주는 다양한 효소들을 생산하는 효과가 있고, 본 발명에 따른 야자과 종자박의 고상 발효방법으로 생산된 발효 야자과 종자박은 단백질과 같은 영양분뿐만 아니라 동물에 유익한 미생물 및 효소들을 다량으로 함유하고 있어 동물사료 또는 그 첨가제로 유용하다.

야자과 종자박, 가금사료, 만난, 만난아제, 고상발효, 혼합발효

Description

신규 아스퍼질러스 오리재 균주 및 이를 이용한 야자과 종자박의 고상 발효방법 {New Strain of Aspergillus oryzae and Solid Phase Fermentation Process of a Arecaceae Kernel Cake Using the Same}

본 발명은 신규 아스퍼질러스 오리재 균주 및 이를 이용한 야자과 종자박의 고상 발효방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 만난아제(mannanase) 생성능 및 야자과 종자박 발효능을 갖는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주 및 이를 이용한 야자과 종자박의 고상 발효방법에 관한 것이다.

팜(palm) 오일 산업에서는 동물사료로 사용될 수 있는 팜 종자박, 팜오일 슬러지 및 팜 압출 섬유질이 부산물로 생산된다. 상기 부산물 중에서 팜 종자박(palm kernel cake)은 팜 종자유의 채유 후, 잔존하는 분말로서, 동물사료 또는 유기질 비료로 가장 유용하게 사용되고 있다.

팜 종자박은 단백질 및 에너지를 공급하는 중급의 단백질원으로서, 팜 종자박의 단백질 품질은 코프라 박(copra meal)보다는 조금 더 좋고, 땅콩박이나 어밀보다는 더 낮은 것으로 알려져 있다. 또한 팜 종자박은 고함량의 섬유질을 함유하 고 있어, 반추동물의 사료로 적합하다. 따라서, 팜 종자박은 반추동물에 유익한 사료로 각국에서 옥수수 가루나 대두박과 같은 다른 영양분들과 함께 비육우 및 낙농 사료 첨가제로 사용되고 있다.

그러나, 팜 종자박은 만난(mannan)을 주성분으로하는 섬유질로 구성되어 있어서 소화가 어렵고, 대사 에너지가 상대적으로 낮으며, 파쇄과정 중 소화가 어려운 껍질부분이 15-17% 수준으로 포함되므로 닭, 돼지 등의 단위 동물용 사료로는 적합하지 못하다.

팜 종자박의 껍질 함량은 파쇄 후 체를 사용하여 팜 종자박의 껍질을 제거하는 방법을 사용하여 7% 수준으로 감소시킬 수 있다.

팜 종자박에 있는 섬유질은 주로 만난 타입의 헤미셀룰로오스(Daud and Jarvis, Phytochemistry, 31(2): 463-464, 1992)이므로 만난분해효소인 만난아제를 처리할 경우, 가수분해 되어 만노스(mannose)를 비롯하여 단위동물에 의하여 소화흡수 될 수 있는 다양한 소화성 당들이 생성된다(Dusterhoft et al., Bioresource Technology, 44, 39-46, 1993; Daud et al., Proc. of the 19th Malaysian society of animal Production Annual Conference. 8-10 september 1997, Johor Bahru, Johor, Malaysia). 팜 종자박에 자연적으로 존재하거나 팜 종자박의 가수분해시 생성되는 만노스 및 만노올리고당 등의 만노사이드는 가축의 장관 내에 살모넬라의 정착을 억제시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Oyofo et al., Poultry Science, 68:1357, 1989; Allem et al., British Poultry science, 38(5):485, 1997).

코프라 박(copra meal)은 상기의 팜 종자박과 같은 야자과(Arecaceae) 식물인 코코스야자의 배젖(copra)으로부터 오일 채유 후 잔존하는 분말로서, 반추동물용 사료로서 사용하고 있으나, 팜 종자박과 같이 만난을 주성분으로 하는 섬유질로 구성되어 있어 단위동물용 사료로는 적합하지 못하다.

미국특허 US6896918호는 상업적으로 판매되고 있는 베타-만난아제(β-mannanase), 만노시다제(mannosidase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 등의 만난 분해 효소 또는 산 촉매로 만난 및 섬유질 고 함유 박을 분해시켜 생성된 만노스를 포함하는 사료첨가제를 개시하였다. 그러나, 이러한 단일 효소반응 방법만으로는 불용성 분말인 팜 종자박의 효과적인 분해를 기대 할 수 없을 뿐만 아니라, 효소가격, 액상에서의 효소반응 비용과 건조비용 등을 고려할 때 경제적이지 못하다. 또한, 반응기간 중 오염균의 증식의 문제가 있다.

통상적으로 베타-만난아제는 바실러스(Bacillus)과 같은 세균, 아스퍼질러스(Aspergillus)와 같은 곰팡이 및 고등식물에서 분리되고 있다.

일본특허 JP05176767는 클로스트리디움 터티움(Clostridium tertium)과 락토바실러스(Lactobacillus sp.)를 혐기적으로 배양하여 식품용 베타-1,4-만난아제를 생산하는 방법을 개시하였고, 일본특허 JP2001145485는 페니실리리움(Penicillium)과 유페니실리움(Eupenicillium)을 사용하여 커피음료의 침전을 방지하기 위한 만난아제를 개시하였다.

또한, 팜 종자박의 사료가치를 증진시키기 위하여 미생물의 발효를 이용한 연구가 개시되었다. 리아이(Lyayi)와 아데로루(Aderolu)는 팜 종자박을 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)로 14일간 발효시켰을 때 단백질, 수용성 당, 에너지가 증가되고, 섬유소 함량이 감소된다고 보고하였다(Lyayi and Aderolu, African Journal of Biotechnology, 3(3):182, 2004). 그러나, 이는 팜 종자박의 효과적인 가금사료화를 위해 필요한 만난아제, 프로테아제 및 자일란아제 등의 효소 활성에 관한 언급이 없어, 사용하는 미생물이 팜 종자박 발효에 어느 정도 효과적인지 알 수 없고, 발효기간이 너무 긴 문제점 뿐만 아니라 사료용 미생물로서 안전성이 확보되어있지 않은 문제점이 있다.

따라서 당업계에서는 야자과 종자박 발효능이 있는 효과적인 만난아제 생성 미생물의 개발 및 이를 이용하여 발효시킨 야자과 종자박을 함유하는 동물사료의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 만난아제(mannanase) 생성능 및 야자과 종자박 발효능을 갖는 미생물을 분리 동정하고, 이를 이용한 야자과 종자박의 고상 발효방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 신규 아스퍼질러스 오리재 균주가 만난아제 생성능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 만난아제(mannanase) 생성능 및 야자과 종자박 발효능을 갖는 신규 아스퍼질러스 오리재 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 야자과 종자박의 고상발효방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 야자과 종자박의 고상발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박을 함유하는 동물사료 또는 그 첨가제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주로 고상발효된 야자과 종자박으로부터 만난아제(mannanase)를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 만난아제(mannanase) 생성능을 가지는 신규 아스퍼질러스 오리재 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 아스퍼질러스 오리재 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 야자과 종자박의 고상발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박을 함유하는 동물사료 또는 그 첨가제를 제공한다.

본 발명은 또한 만난아제(mannanase) 생성능을 가지는 신규 아스퍼질러스 오리재 균주를 이용하여 발효처리된 야자과 종자박으로부터 만난아제를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 신규 아스퍼질러스 오리재 균주는 사료의 소화 흡수에 도움을 주는 여러가지 효소들을 생산하는 효과가 있고, 특히, 만난아제 활성이 우수하여 팜 종자박과 같은 야자과 종자박류 사료의 소화성을 증진시키는데 효과적이다. 본 발명에 따른 야자과 종자박의 고상 발효방법으로 생산된 발효 야자과 종자박은 소화성이 향상되었을 분 아니라, 단백질과 같은 영양분이 증가되었고, 동물에 유익한 미생물 및 효소들을 다량으로 함유하고 있어 동물사료 또는 그 첨가제로 유용하다.

본 발명의 일 관점에서, 만난아제(mannanase) 생성능을 가지는 신규 아스퍼질러스 오리재 균주에 관한 것이다. 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 아스퍼질러스 오리재 MFO1(기탁번호 KCTC 11105BP)인 것을 특징으로 하고, 분리 및 동정방법은 다음과 같다.

먼저 메주, 청국장, 된장 및 누룩 등에서 채취한 시료를 적절히 희석한 후, 이를 배지에 도말하고, 배양시켜 콜로니를 형성시킨 후, 만난분해에 의해 투명해진 분해환을 형성하는 미생물을 분리하였다. 분리된 만난아제 활성도가 높은 균주는 형태학적 및 ITS-5.8S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 방법을 수행하여 동정하였다.

상기 배지로는 만난이 주성분인 로커스트콩검(logust bean gum)을 탄소 유일 원으로 첨가한 LBG 평판배지, 포테이토 덱스트로즈(potato dextrose) 평판배지, 차페크 독스(Czapek Dox) 평판배지, 트립틱 소이(tryptic soy) 평판배지, 뉴트리언트(Nutrient) 평판배지, 루리아-버타니(Luria-bertani) 평판배지 등을 사용할 수 있다.

상기 분해환을 형성하는 미생물의 만난아제 활성은 로커스트콩검을 기질로 하여 일정한 pH 완충용액에서 효소 반응 시킨 후, 만난분해에 의해 유리된 환원당을 DNS(dinitrosalicylic acid) 시약을 사용하여 발색시키고 그 흡광도를 측정함으로서 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 단백질분해효소, 셀룰로스분해효소, 자일란분해효소, 지방분해효소 및 전분분해효소 생성능을 더욱 갖는 것을 특징으로 한다.

야자과 종자박은 만난을 주성분으로 하는 단단한 구조의 헤미셀룰로오스, 단백질 및 지방 등으로 이루어져 있다. 따라서, 이를 효과적으로 분해하기 위해서는, 만난아제 외에도 전분분해효소(아밀라아제), 단백질분해효소(프로테아제), 지방분해효소(리파아제), 셀룰로오스분해효소(셀룰라아제) 및 자일란분해효소(자일란아제) 등의 효소가 복합적으로 작용해야 한다.

본 발명은 다른 관점에서 만난아제 생산능 및 야자과 종자박의 발효능을 갖는 아스퍼질러스 오리재 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고 상 발효방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 만난아제 생산능 및 야자과 종자박의 발효능을 갖고 있으면, 제한 없이 사용할 수 있으며, 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 야자과 종자박은 팜 종자박(palm kernel cake), 코프라 박(copra meal) 등을 예시할 수 있다.

상기 야자과 종자박의 고상 발효는 25 내지 40℃에서 2일 내지 5일간 통기조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 야자과 종자박의 고상 발효방법은 (a) 야자과 종자박을 70 내지 135℃에서 열처리; (b) 야자과 종자박에 10 내지 200kGy의 방사선 조사; (c) 야자과 종자박을 0.05 내지 0.15%의 유기산으로 처리로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 야자과 종자박을 전처리 하는 것을 특징으로 한다.

상기 열처리는 야자과 종자박에 존재하는 오염균의 생육을 방지하고, 야자과 종자박의 단단한 구조를 이완시켜, 미생물 및 효소의 작용을 더욱 원활하게 하기 위한 것이다. 상기 열처리 온도는 70 내지 135℃에서 증자(steaming), 고압증기멸균(autoclave), 건열 처리(dry heat) 방법으로 수행될 수 있고, 100 내지 121℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 열처리 온도가 70℃ 미만인 경우에는 오염균의 생육방지 및 효소활성 증가 효과가 만족스럽지 않으며, 135℃를 초과할 경우 생산 비용이 증가하는 문제점이 있다. 상기 열처리는 온도에 따라 다르지만, 15분 내지 90분 동안 수행되는 것이 바람직하다.

상기 방사선 조사 또는 유기산 처리는 비열처리 방법으로, 상기 열처리를 대신하여 야자과 종자박에 존재하는 오염균의 생육을 방지하고, 야자과 종자박의 단단한 구조를 이완시켜, 미생물 및 효소의 작용을 더욱 원활하게 하기 위한 것이다.

상기 방사선으로는 코발트-60(Co-60)과 같은 감마선를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 야자과 종자박의 방사선 흡수선량은 10 내지 200kGy인 것이 바람직하다. 상기 방사선 흡수선량이 10kGy 미만인 경우, 오염균의 생육방지 및 효소활성 증가 효과가 만족스럽지 않으며, 200kGy를 초과할 경우 방사선 처리시간이 길어짐에 따라 생산성이 감소하는 문제점이 있다. 여기서, 1 그레이(Gray, Gy)는 1kg의 물질에 대하여 1 주울(joule)의 방사선에너지가 흡수된 것을 의미한다.

또한, 상기 유기산은 초산(acetic acid), 유산(lactic acid), 구연산(citric acid). 프로피온산(propionic acid) 및 이들을 혼합하여 사용할 수 있으며, 초산을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 유기산의 농도는 야자과 종자박 기질 무게의 0.05내지 0.15%(w/w)인 것이 바람직하다. 상기 유기산의 농도가 0.05% 미만인 경우 오염균의 생육방지 및 효소활성 증가 효과가 만족스럽지 않으며, 0.15%를 초과할 경우 본 발명의 아스퍼질러스 오리재 균주의 생육을 방해하는 문제점이 있다.

상기 비열처리 방법은 열처리에 비하여, 발효를 위한 설비가 간단하고, 비용이 적어, 경제적으로 유리한 장점이 있다.

본 발명에 따른 상기 야자과 종자박의 고상 발효방법은 발효 전에 야자과 종자박의 수분 함량을 35~65%(w/w)로 조정하는 것을 특징으로 한다. 상기 야자과 종자박의 수분함량 조정은 만난아제 활성 및 생산 촉진을 위한 것으로서, 분말상의 야자과 종자박에 수분을 첨가함으로써 수분함량을 조정할 수 있다. 상기 야자과 종자박의 수분함량이 35% 미만인 경우 균주의 증식 및 효소생산 감소의 문제가 있고, 65%를 초과할 경우 공기공급 저하 및 오염균 증식 가능성의 문제가 있다.

본 발명에 따른 상기 야자과 종자박의 고상 발효는 유산균을 추가로 첨가하여 발효시킬 수 있다.

상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코쿠스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토코쿠스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스 피칼리스(Streptococcus faecalis), 엔테로코쿠스 페시움(Enterococcus faecium) 등을 예시할 수 있으며, 락토바실러스 속, 특히, 락토바실러스 플랜타룸을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명에서는 여러 가지 유산균주 중에서 팜 종자박에서의 성장 및 오염균의 성장 저해 효과가 가장 우수한 김치로부터 분리한 락토바실러스 플랜타룸 ML2(기탁번호 KCTC 11266BP)을 제공한다. 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 ML2는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2008년 1월 18일 자로 기탁(기탁번호 KCTC 11266BP)되었다.

이와 같이 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주와 유산균을 혼합하여 야자과 종자박을 발효시킬 경우, 유산(lactic acid), 과산화수소, 박테리오신 등의 항균대사물질을 생산하는 유산균은 야자과 종자박에 존재하는 오염균들의 성장을 저해시키므로 야자과 종자박의 열처리 없이도 아스퍼질러스 오리재의 성장속도, 만난아제 생산량, 만난아제 활성 등이 증가되는 장점이 있다. 또한 혼합발효를 수행할 경우, 다양한 종류의 효소 및 대사물질이 생산될 수 있고, 이들 효소 및 대사물질은 야자과 종자박의 발효 및 동물의 소화에 도움을 줄 수 있다. 또한, 유산균은 동물에 있어 유해균억제, 정장작용, 면역활성화작용 등의 효과를 나타내므로 동물의 발육 증진, 질병예방에 도움을 줄 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 야자과 종자박의 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박을 함유하는 동물사료 또는 그 첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박은 통상의 야자과 종자박보다 수용성 단백질, 유리 환원당, 아미노산 함유량이 높고, 섬유질(NDF) 및 헤미셀룰로스의 함유량이 낮은 특징이 있어 소화성 및 영양학적으로 우수하다. 또한 상기 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박은 통상의 야자과 종자박보다 만난아제, 프로테아제, 셀룰라제, 자일란아제, 리파제, 아밀라제 등의 다양한 효소를 함유하고 있어 동물사료 또는 그 첨가제로 사용될 수 있으며, 특히 단위동물용 사료 또는 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

또한 아스퍼질러스 오리재는 동물의 건강에 유익한 작용을 하는 것으로 알려진 프로바이오틱 균주이므로(Lee et al. International Journal of Poultry Science, 5(1): 1-3), 아스퍼질러스 오리재 MFO1(기탁번호 KCTC 11105BP)를 포함하 는 본 발명에 따른 발효 처리된 야자과 종자박을 동물사료 또는 첨가제로 사용할 경우, 더욱 우수한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 야자과 종자박의 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박을 용매로 추출시킨 다음, 상기 추출액을 정제하는 것을 특징으로 하는 만난아제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 만난아제의 제조방법은 상기 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박에 증류수, 완충용액 등의 용매를 가하여 발효된 야자과 종자박을 현탁시킨 후, 침전 및 원심분리로 고형분을 제거하여, 조효소액을 추출시킨 다음, 통상의 효소분리정제과정을 거쳐 만난아제를 정제하는 단계를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 팜 종자박 발효 미생물의 분리 및 동정

가. 팜 종자박 발효 미생물의 1차 분리

만난아제 생성능을 가지는 미생물 균주를 분리하기 위하여, 메주, 청국장, 된장 및 누룩에서 시료를 채취하였다. 채취된 시료를 희석한 후, pH가 각각 4, 5, 6, 7인 LBG 평판배지(ammonium sulfate 0.5g; yeast extract 2g; K₂HPO₄ 2g; MgSO₄·7H₂O 0.2g; FeSO₄·7H₂O 0.01g; CaCl₂·2H₂O 0.05g; 로커스트콩검(locust bean gum) 5g; agar 15g; D.W. 1L)에 도말하고, 30, 35 및 40℃에서 3 내지 7일간 각각 배양하였다. 여기서, LBG 평판배지는 만난을 주성분으로 하는 로커스트콩검이 유일한 탄소원으로 존재한다. 또한, 포테이토 덱스트로즈(potato dextrose) 평판배지, 차페크 독스(Czapek Dox) 평판배지, 트립틱 소이(tryptic soy) 평판배지, 뉴트리언트(Nutrient) 평판배지, 루리아-버타니(Luria-bertani) 평판배지 등을 사용하여 각 시료로부터 곰팡이 균주를 분리하였다. 상기의 배지에서 세균 증식을 억제하여 곰팡이 분리를 용이하게 하기위해 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin)을 각각 0.1mg/L 씩 배지에 첨가하였다. 다음으로, 배지로부터 형성된 콜로니를 분리시킨 후, 이를 포테이토 덱스트로스 배지에서 2회 계대 배양하여 순수분리하였다. 다음으로, 포테이토 덱스트로스 배지에서 5 내지 7일간 배양하여 균주의 포자 현탁액을 얻고 이를 다시 LBG 평판배지에 2㎕씩 접종하여, 30℃ 및 35℃에서 3일 배양한 후, 분해환 크기가 큰 균주를 1차 선발하였다.

분해환의 크기 측정은 하기의 측정법을 병행하였다.

a) 로커스트콩검이 분해되어 투명해진 분해환을 직접 측정하는 방법;

b) 콩고 레드 염색액(0.1% Congo red)으로 배지 표면을 30분간 염색한 후, 배지로 흡수되지 않은 콩코 레드 염색액을 제거하고, 다시 1몰(1M) NaCl 용액을 배지 표면에 도포하고, 15분간 서서히 진탕하였을 때 생성되는 투명환을 측정하는 방 법;

c) 아이오딘(Iodine) 염색액(Iodine 1g, Potassium Iodide 2g, D.W. 300ml)으로 배지를 염색하였을 때 염색되지 않는 투명환을 측정하는 방법.

나. 팜 종자박 발효 미생물의 2차 분리

수분함량 55%로 조정된 팜 종자박을 121℃에서 멸균하였다. 멸균된 팜 종자박 500 g에 1차적으로 선발된 균주의 포자현탁액을 접종하여 초기균수가 팜 종자박 건조무게 1g당 약 5× 10⁵ 수준이 되도록 한 후, 30℃에서 배양하였다. 각 균주의 포자현탁액은 각 균주를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 30℃에서 5 내지 7일간 배양하여 포자를 형성시킨 후 0.1% 트리톤(Triton) X-100 용액으로 포자를 현탁시켜 얻었다. 다음으로 미생물의 생육 및 만난아제 활성도가 우수한 균주로서 곰팡이 MFO1을 2차적으로 선발하였다.

미생물의 만난아제 활성은 로커스트콩검을 기질로 한 효소 반응 후에 유리된 환원당을 정량함으로써 측정하였다. 유리된 환원당의 정량 측정법은 다음과 같다.

멸균 증류수 9ml 및 팜 종자박 발효시료 1g을 3분간 진탕시키고, 12,000rpm에서 15분간 원심분리 한 후, 상등액을 분리하여 효소용액으로 사용하였다. 다음으로 효소 용액 0.5ml, 증류수로 현탁된 0.5%(w/v) 로커스트콩검 용액 1 ml 및 200mM 구연산 나트륨(sodium citrate, pH 5.8) 0.5ml를 혼합하고, 50˚C에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액 1ml 및 3, 5-디니트로살리시릭산(dinitro salicylic acid, DNS) 시약(Miller et al. Analytical Biochemistry, 2:127-132, 1960) 1ml을 첨가하여, 100℃에서 5분간 발색 반응시켰다. 다음으로, 반응물에 증류수 10ml을 첨가한 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 만노스를 표준물질로 사용하였으며, 효소 활성도 1 unit는 상기 조건에서 1분 동안 로커스트콩검으로부터 1λmol의 만노스에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양을 계산한 것이다.

상기의 과정을 통하여 우수균주로 선발된 MFO1 균주의 팜종자박 발효시 최대 만난아제 활성도를 공시균과 비교하여 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 1차 분리된 미생물의 배양 시간에 따른 만난아제 활성도를 도 1에 나타내었다.

균주	만난아제 활성도(unit/g)
MFO1	650
Aspergillus oryzae KCCM 6983	480
A. oryzae NU1	410
A. oryzae NU2	280
A. sp. SS12	178

상기 표 1에서, 효소 활성도 1 unit는 상기조건에서(0.25% 로커스트콩검에 대하여 pH 5.8 및 50˚C 조건) 1분동안 로커스트콩검으로부터 1λmol의 만노스에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양을 의미한다.

다. 팜 종자박 발효 미생물의 동정

높은 만난아제 활성도 및 우수한 팜 종자박 발효능을 갖는 MFO1을 형태학적 및 ITS-5.8S rDNA(5.8S rRNA coding gene) 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 방법으로 동정하였다. ITS-5.8S rDNA 염기서열을 분석하기 위하여, 균주로부터 추출된 DNA를 universal primer인 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(서열번호 1))와 ITS4R(5'-CAGACTTGTACATGGTCCAG-3'(서열번호 2)) primer를 사용하여 PCR 증폭하였다(White et al. In M. A, Innis, D.H. Gelfand. J.J. Sninsky, and T.J. White(ed.) PCR protocols: a guide to the methods and applications academic Press, Inc., New York., 1990; Carbone et al. Mycologia 85: 415-427, 1993). 증폭된 5.8S rDNA 를 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega, USA)으로 정제한 후, ABI PRISM　3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석 하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X program(Thompson et al. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680, 1994)을 이용하여 비교분석하였다.

MFO1 균주의 16S rDNA 염기서열(서열번호 3) 상동성 분석 결과, 분리된 미생물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로 동정되었다. 본 발명에서 분리된 아스퍼질러스 오리재는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2007년 3월 30일자로 기탁(기탁번호: 11105BP)되었다.

[실시예 2] 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 효소 생산 특성

아스퍼질러스 오리재 MFO1의 만난아제(mannanase), 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 섬유질분해효소(cellulase), 지방분해효소(lipase) 생산 특성을 배양온도에 따라 조사하였다.

먼저, 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 30℃에서 5일간 배양하여 포자를 형성시킨 후 0.1% 트리톤 X-100 용액으로 포자를 현탁시켜 포자현탁액을 준비하였다.

다음으로는 아스퍼질러스 오리재 MFO1 포자현탁액 2㎕를 기질로서 로커스트콩검을 0.5% 첨가한 Mandel's 평판배지(ammonium sulfate 1.4g; urea 0.3g; yeast extract 0.25g; proteous peptone 0.75g; KH₂PO₄ 2g; CaCl₂ 0.3g; MgSO₄ 0.3g; FeSO₄· 7H₂O 0.005g; MnSO₄· H₂O 0.0016g; ZnSO₄·7H₂O 0.0014g; CoCl₂ 0.02g, D.W. 1L; pH 5.0)에 접종하였고, 30, 35 및 40℃에서 각각 48시간 배양한 후, 분해환의 크기를 측정하였다. 분해환의 크기는 콩고레드 염색법을 사용하여 측정하였다.

전분분해효소 생산특성은 전분을 1% 첨가한 Mandel's 평판배지를 사용하여 만난분해활성의 경우와 동일하게 조사하였다. 분해환의 크기는 아이오딘(Iodine) 염색액(Iodine 1g, Potassium Iodide 2g, D.W. 300ml)으로 배지를 염색하였을 때 염색되지 않는 투명환을 측정하였다.

단백질분해효소 생산특성은 기질로서 탈지우유분을 1% 첨가한 Mandel's 평판배지(pH 5.0)를 사용하여 만난분해활성의 경우와 동일하게 조사하였다. 분해환의 크기는 탈지우유 단백질이 분해되어 투명해진 투명환을 직접 측정하였다.

지방분해효소 생산특성은 기질로서 트리부티린(tributyrin)을 0.5% 첨가한 Mandel's 평판배지(pH 5.0)를 사용하여 만난분해활성의 경우와 동일하게 조사하였다. 분해환의 크기는 트리부티린이 분해되어 투명해진 투명환을 직접 측정하였다.

섬유소분해효소 생산특성은 기질로서 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose)을 0.5% 첨가한 Mandel's 평판배지(pH 5.0)를 사용하여 만난분해활성의 경우와 동일하게 조사하였다. 분해환의 측정은 콩고 레드 염색액(0.1% Congo red)으로 배지 표면을 30분간 염색한 후, 배지로 흡수되지 않은 콩코 레드 염색액을 제거하고, 다시 1몰(1M) NaCl 용액을 배지 표면에 도포하고, 15분간 서서히 진탕하였을 때 생성되는 투명환을 측정하였다.

자일란분해효소 생산특성은 기질로서 귀리 유래 자일란(oat xylan)을 0.25% 첨가한 Mandel's 평판배지(pH 5.0)를 사용하여 만난분해활성의 경우와 동일하게 조사하였다. 분해환의 크기는 아이오딘(Iodine) 염색액(Iodine 1g, Potassium Iodide 2g, D.W. 300ml)으로 배지를 염색하였을 때 염색되지 않는 투명환을 측정하였다.

각 효소들의 활성을 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

효소활성	분해환 지름(mm)
	30℃	35℃	40℃
만난분해효소	49.5	55.0	55.0
전분분해효소	51.5	58.0	55.5
단백질분해효소	49.0	52.5	40.5
셀룰로스분해효소	41.0	45.5	37.5
자일란분해효소	57.0	62.0	59.0

상기 표 2로부터, 본 발명의 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주는 팜 종자박의 주요 섬유소인 만난의 분해를 위한 만난아제 뿐 아니라 기타의 섬유소 및 단백질을 분해하여 소화에 도움을 줄 수 있는 다양한 효소들을 생산하는 것이 확인되어 팜 종자박 발효에 더욱 유용함을 알 수 있었다.

[실시예 3] 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 팜 종자박 발효조건 측정

가. 팜 종자박 발효에 대한 pH의 영향

수분함량이 55% 되도록 기질인 분말상 팜 종자박(pH 5.2) 500g에 증류수를 첨가하였다. 다음으로 수산화나트륨을 첨가하여 팜 종자박의 pH를 각각 6.0, 6.4 및 6.8로 조정하였다. pH를 조정하지 않은 팜종자박 및 pH가 조정된 각 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 1g당 5× 10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. pH에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 균주량 및 만난아제의 활성을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

pH	MFO1의 균주량 (Log cfu/g)		만난아제 활성 (unit)
	2일	5일	2일	5일
6.8	7.89	9.12	329	640
6.4	7.99	9.27	348	645
6.0	7.94	9.22	350	660
5.2	7.93	9.30	331	650

상기 표 3으로부터, 발효 2일 또는 5일째, 팜종자박 기질의 pH는 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 생육 및 만난아제 활성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주를 사용할 경우, 별도의 pH 조정제를 사용하지 않아도 팜 종자박의 발효가 가능하였다.

나. 팜 종자박 발효에 대한 수분함량의 영향

팜 종자박 발효에 대한 수분함량의 영향을 알아보기 위하여, 팜 종자박의 수분함량을 각각 35, 45, 55 및 65%(w/w)가 되도록 수분을 첨가한 후, 121℃에서 15분동안 고압멸균 시켰다. 다음으로, 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 1g당 5× 10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 수분함량에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 균주량 및 만난아제의 활성을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

수분 함량(%)	MFO1의 균주량(cfu/g)		만난아제 활성 (unit/g)
	2일	5일	2일	5일
35	7.70	8.61	140	230
45	8.15	9.22	217	440
55	8.20	9.28	310	660
65	8.05	9.10	168	650

상기 표 4으로부터, 팜 종자박의 수분함량이 55%일 때, 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 생육 및 만난아제 활성이 가장 높았으며, 수분함량이 낮은 35%에서도 상당량의 만난아제 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1은 통상적인 고상발효 공정의 수분함량 조건보다 높은 경우에도 만난아제 활성을 나타낼 뿐 만 아니라, 낮은 수분함량 조건에서도 만난아제 활성을 나타냄을 알 수 있다.

다. 팜 종자박 발효에 대한 열처리의 영향

팜 종자박 발효에 대한 열처리의 영향을 알아보기 위하여, 팜 종자박(수분함량 55%, pH 5.2)을 열처리하지 않은 경우와 증자(steaming)(100℃, 90분) 또는 고압멸균(autoclave)(121℃, 15분)으로 열처리 한 경우의 발효특성을 조사하였다. 비열처리 된 팜 종자박 및 열처리된 각각의 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 1g당 5× 10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 열처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 균주량 및 만난아제의 생산량을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.

	MFO1의 균주량(cfu/g)		만난아제 활성 (unit)
	2일	5일	2일	5일
비열처리구	7.74	9.20	67	185
열처리구(100도, 90분)	7.81	9.32	295	555
열처리구(121도, 15분)	7.93	9.30	331	650

상기 표 5로부터, 열처리(100℃, 60분 증자 또는 121℃, 15분 고압멸균)를 한 경우는 열처리를 하지 않은 경우보다 만난아제 활성이 높음을 알 수 있었다. 이는 팜 종자박을 열처리 하지 않은 경우, 오염균으로 인하여 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 만난아제 생산 및 활성이 감소되기 때문인 것으로 판단된다.

라. 방사선 조사에 따른 팜 종자박의 조성변화

코발트-60을 이용하여 20, 50, 100, 200kGy의 방사선이 팜 종자박에 흡수되도록 처리하였다. 팜 종자박의 방사선 조사 후 변화를 알아보기 위하여 시료 1g을 증류수 9ml에 현탁하여 5분간 진탕시킨 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리한 상등액에 유리된 환원당과 단백질량을 정량함으로써 측정하였다. 유리된 환원당의 정량방법은 상기의 상등액을 발색반응의 유효범위내로 희석한 액 1ml 및 3, 5-디니트로살리시릭산(dinitro salicylic acid, DNS) 시약 1ml을 첨가하여, 100℃에서 5분간 발색 반응시켰다. 다음으로, 반응물에 증류수 10ml을 첨가한 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 만노스를 표준물질로 사용하였다.

유리된 단백질의 정량은 Lowry-Folin 방법으로 측정하였다. 즉, 상기 방법으로 추출한 시료(상등액) 0.1ml에 2N 수산화나트륨용액 0.1ml과 황산구리용액(CuSO₄ 10g; NaCO₃ 20g; sodium potassium tartrate 10g; distilled water; 1L) 2ml을 가한 후 상온에서 10분동안 방치한 후 여기에 Folin 시약을 가하고 30분 방치한다. 이후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 알부민(bovine serum albumin, BSA)를 표준물질로 사용하였다.

중성세제불용성섬유소(Neutral Detergent Fiber, NDF)는 사료공정서 사료표준분석방법에 기재된 방법에 따라 팜 종자박 시료에 중성세제용액을 가해 끓여 여과한 후 남은 불용성 물질의 무게를 측정하여 계산하였다.

방사선 조사에 따른 팜 종자박의 조성변화를 하기 표 6에 나타내었다.

	팜 종자박의 방사선 흡수량(kGy)
	0	20	50	100	200
환원당(mg/g)	11.50	16.56	17.67	19.33	21.22
수용성 단백질(mg/g)	19.50	25.56	27.67	27.80	29.56
NDF(%, w/w)	71.45	71.00	70.35	68.21	66.81

상기 표 6로부터, 팜 종자박의 방사선 흡수량이 증가함에 따라 환원당 및 수용성 단백질 함량이 증가되고, NDF의 함량이 감소되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 만난을 비롯한 팜 종자박의 섬유소 및 단백질이 방사선 처리에 의해 부분적으로 분해된 것으로 판단된다.

마. 팜 종자박 발효에 대한 방사선의 영향

팜 종자박을 코발트-60을 이용하여 20, 50, 100, 200kGy의 방사선이 흡수되도록 조사하였다. 다음으로, 방사선 처리된 팜 종자박에 증류수를 가하여 수분함량을 55%(w/w)되도록 한 후 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 1g당 5× 10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 방사선 처리 조건에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 균주량 및 만난아제의 생산량을 측정하여 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2는 방사선 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 성장을 나타낸 그래프이다. 도 2로부터, 방사선으로 처리된 팜 종자박의 아스퍼질러스 오리재 MFO1은 고압멸균된 팜 종자박의 아스퍼질러스 오리재 MFO1과 유사한 성장곡선을 나타냄을 알 수 있다.

도 3은 방사선 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 만난아제 활성을 나타낸 그래프이다. 도 3으로부터, 방사선이 처리된 팜 종자박의 아스퍼질러스 오리재 MFO1은 방사선이 처리되지 않거나, 고압멸균된 팜 종자박의 아스퍼질러스 오리재 MFO1보다 만난아제 활성이 우수함을 알 수 있었다. 특히 발효 5일째에 방사선의 흡수량이 20kGy과 50kGy일 때 가장 높은 만난아제 활성을 나타내었다.

바. 팜 종자박 발효에 대한 유기산의 영향

팜 종자박을 수분함량이 55%가 되도록 조정한 후, 초산농도가 0.05%, 0.10%, 0.15% 및 0.20%가 되도록 하였다. 다음으로, 유기산 처리된 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 건조 1g당 5×10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 초산을 농도별로 처리한 팜 종자박의 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 오염 세균의 수를 발효시간에 따라 측정한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

발효시간(일)	아스퍼질러스 오리재 MFO1 수 (log cfu/g)					오염 세균 수 (log cfu/g)
	초산농도(%)					초산농도(%)
	0	0.05	0.10	0.15	0.20	0	0.05	0.10	0.15	0.20
0	5.65	5.64	5.65	5.60	5.53	4.20	3.80	3.30	3.40	3.00
1	6.00	5.95	5.85	5.65	5.50	6.28	5.20	4.20	3.90	3.50
2	7.95	8.14	7.75	7.15	6.05	8.96	7.96	6.80	5.50	4.44
3	8.54	8.60	8.64	8.30	7.74	9.65	8.70	8.52	7.90	7.34
5	9.30	9.30	9.20	9.00	8.80	9.70	9.20	9.00	8.70	8.30

상기 표 7로부터, 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 0.05% 및 0.1% 초산 처리된 팜 종자박에 발효시킨 경우, 초산을 처리하지 않은 경우와 증식에 거의 차이가 없었으며, 0.15% 및 0.2% 초산 처리된 경우는 증식이 약간 저해받는 것으로 나타났다.

오염세균의 경우 초산을 처리하지 않은 경우 빠르게 증식하였고, 반면 초산이 처리된 경우는 오염 세균의 증식 속도가 느려졌고, 특히, 농도 증가에 따라 증식 저해 정도가 컸다. 즉, 초산을 처리하지 않은 경우는 발효 2일째에 1g당 균수가 10⁹ cfu 수준에 도달하였으나, 0.05 및 0.1%의 초산을 처리한 경우는 각각 4일째, 5일째이었고, 0.15 및 0.2%의 초산을 처리한 경우는 5일 이상인 것으로 나타났다.

상기 표 7의 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4는 유기산 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 성장을 나타낸 그래프이고, 도 5는 유기산 처리에 따른 오염 세균의 성장을 나타낸 그래프이다.

또한, 유기산 처리에 따른 만난아제의 활성을 측정한 결과를 하기 표 8 및 도 6에 나타내었다.

초산 농도(%)	만난아제 활성도(unit)
	2일	5일
0	100	245
0.05	209	520
0.10	128	390
0.15	80	310
0.20	5	180

표 8로부터, 발효 2일 째 및 5일째의 만난아제 활성도를 비교한 결과, 초산을 0.05%, 0.10% 및 0.15% 처리한 경우는 초산을 처리를 하지 않은 경우 보다 만난아제 활성이 증가되었음을 알 수 있었다. 특히, 0.05% 초산 처리구가 가장 높은 활성도를 나타냈다. 이는 초산 처리를 통해 오염균의 증식을 감소시킴으로써 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 만난아제 생산을 가능하게 한 것으로 유추된다. 따라서, 팜 종자박을 유기산 처리하여 발효하는 방법은 열처리 없이도 상당량의 만난아제 생산을 가능케 하는 경제적인 팜 종자박의 발효방법으로 활용할 수 있다. 그러나, 초산 0.2% 처리 시에는 오염균 증식 억제에 효과적임에도 불구하고 초산을 처리하지 않은 것보다 만난아제 활성도가 감소되었는데 이는 초산 0.2% 농도 이상에서는 오염균 뿐 아니라 아스퍼질러스 오리재 MFO1도 억제되었기 때문이다.

사. 팜 종자박 발효물의 성분 분석

아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의해 발효된 팜 종자박의 사료 영양학적 가치를 분석하였다. 고압멸균(121℃, 15분)한 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 접종(팜 종자박 1g 당 5× 10⁵ CFU)시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다.

조단백질, 조섬유, 중성세제불용성섬유소(NDF) 및 산성세제불용성 섬유소(ADF)의 분석은 사료공정서 사료표준분석방법에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 즉, 조단백질은 켈달법에 의해 측정하였고, 조섬유는 600℃에서 회화하여 남은 잔여물질의 무게를 측정하였으며, NDF 및 ADF는 각각 중성세제용액 및 산성세제용액을 가해 끓여 여과한 후 남은 불용성 물질의 무게를 측정하여 계산하였다.

발효하지 않은 팜 종자박과 발효된 팜 종자박의 성분을 하기 표 9에 나타내었다.

조성	팜 종자박 (무처리)	발효 팜 종자박
		3일	5일
조단백질(%, w/w)	16.5	20.4	23.8
조섬유(%, w/w)	23.5	14.5	24.7
NDF(%, w/w)	71.7	66.5	72.8
ADF(%, w/w)	43.8	39.7	59.5
헤미셀룰로스(%, w/w)	27.9	26.8	13.3
환원당(mg/g)	11.5	59.1	65.3
수용성 단백질(mg/g)	19.5	58.4	65.2

상기 표 9로부터, 아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의해 발효된 팜 종자박 발효물은 조섬유, NDF, ADF 및 헤미셀룰로스가 감소되었음을 확인 할 수 있었고, 조단백질, 수용성 단백질, 환원당이 증가하였음을 알 수 있었다. 이는 아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의한 팜 종자박의 발효에 의해 팜 종자박의 만난 섬유소의 단단한 구조와 단백질이 분해되어, 이에 따라 환원당 및 수용성 단백질이 증가하며, 균체 증식에 따라 조단백질 함량 증가의 효과가 있어, 팜 종자박의 소화성을 높이고 영양학적 가치를 증진시켰음을 알 수 있다.

또한, 상기의 아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의한 팜 종자박 발효물의 아미노산 함량을 분석하였다.

아미노산 함량 측정은 사료공정서 사료표준분석방법에 기재된 이온교환크로마토그라피법(ninhydrin 법)에 따라 시료를 처리하여 아미노산 자동분석기로 분석하였다.

발효하지 않은 팜 종자박과 발효된 팜 종자박의 아미노산 함량은 하기 표 10에 나타내었다.

아미노산 조성 (g/100g)	팜종자박 (무처리)	발효 팜 종자박
		3일	5일
Aspartic acid	1.37	2.34	2.18
Threonine	0.53	0.92	0.99
Serine	0.76	1.32	1.06
Glutamic acid	3.34	4.70	3.60
Proline	0.60	0.89	0.84
Glycine	0.79	1.24	1.15
Alanine	0.69	1.32	1.10
Valine	0.82	1.56	1.10
Isoleucine	0.54	1.18	0.72
Leucine	1.57	2.19	2.00
Tyrosine	0.43	0.72	0.68
Phenylalnine	0.76	1.03	0.87
Histidine	0.45	0.68	1.53
Lysine	0.33	0.75	0.98
Arginine	1.94	2.63	1.45
Cystein	0.19	0.32	0.38
Methionine	0.25	0.25	0.43
Tryptophan	0.04	0.03	0.06

상기 표 10으로부터, 아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의해 발효된 팜 종자박 발효물은 아미노산 함량이 증가하였음을 알 수 있었다. 이는 아스퍼질러스 오리재 MFO1에 의한 팜 종자박의 발효에 의해 팜 종자박의 구성성분이 전환되면서 아미노산 함량이 높아져 영양학적 가치를 증진시킴을 알 수 있다.

[실시예 4] 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 유산균을 이용한 팜 종자박의 혼합발효

먼저, 아스퍼질러스 오리재 MFO1(균주번호 KCTC 11105BP)를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 30℃온도로 5일간 배양하여 포자를 형성시킨 후, 0.1% 트리톤 X-100 용액으로 포자를 현탁시켜 포자현탁액을 준비하였다. 락토바실러스 플랜타룸 ML2(균주번호 KCTC 11266BP) 균주는 MRS 액체배지에 접종 후, 30℃에서 20시간 배양시켰다. 다음으로 팜 종자박의 수분함량을 55%(w/w)가 되도록 수분을 첨가한 후, 아스퍼질러스 오리재 MFO1(팜 종자박 1g당 5× 10⁵ CFU) 및 락토바실러스 플랜타룸 ML2(팜 종자박 1g당 1× 10⁷ CFU)를 혼합하여 접종시키고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 또한, 대조구로서 비열처리된 팜 종자박 및 고압멸균한 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1을 단독으로 접종시키고, 배양하였다.

도 7은 비열처리 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 단독 배양한 경우와 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 유산균과 혼합발효한 경우의 오염균의 증식을 나타낸 그래프이다. 도 7로부터, 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 락토바실러스 플랜타룸 ML2(KCTC 11266BP)을 비롯한 유산균을 혼합 배양한 경우가 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 단독 배양한 경우보다 오염균의 성장이 크게 감소되었음을 알 수 있었다.

도 8은 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 락토바실러스 플랜타룸 ML2과의 혼합발효에 따른 만난아제 활성도를 나타낸 그래프이다. 도 8로부터, 열처리 하지 않은 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 단독배양하였을 경우에는 고압멸균한 팜종자박에 비하여 만난아제 활성이 낮은 것을 확인할 수 있다. 그러나, 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 락토바실러스 플랜타룸 ML2를 혼합 배양한 경우는 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 단독 배양한 경우보다 만난아제 활성도가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 특히, 고압멸균한 팜 종자박에서 아스퍼질러스 오리재 MFO1 단독 배양시와 유사한 정도의 만난아제 활성을 나타낼 정도로 효과가 우수하였다.

비열처리 팜종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 단독 배양하였을 때 오염균의 성장 가능성이 높아 만난아제 활성을 감소시키는 단점이 있다. 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸과 같은 유산균은 유기산을 비롯하여 각종 항균물질을 생산하는 것이 알려져 있다. 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 ML2은 팜 종자박에서의 성장에 따라 오염균의 성장을 크게 감소시키는 효과가 있다. 상기와 같이 비열처리 팜 종자박에 아스퍼질러스 오리재 MFO1를 배양할때 락토바실러스 플랜타룸 ML2와 같은 유산균을 혼합 배양하는 방법은 고압멸균에 필요한 에너지 및 장치 비용을 절감할 수 있는 효과가 있어 경제적인 방법을 제공한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 성장 및 만난아제 활성을 다른 아스퍼질러스 등의 균주와 비교한 그래프이다.

도 2 및 3은 방사선 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 성장 및 만난아제 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 유기산 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 5는 유기산 처리에 따른 오염 세균의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 6은 유기산 처리에 따른 아스퍼질러스 오리재 MFO1의 만난아제 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 유산균의 혼합발효에 따른 오염균의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 8은 아스퍼질러스 오리재 MFO1 및 락토바실러스 플랜타룸 ML2의 혼합발효에 따른 만난아제 활성도를 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Technology <120> New Strain of Aspergillus oryzae and Solid Phase Fermentation Process Using the Same <130> P07-B30 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4R primer <400> 2 cagacttgta catggtccag 20 <210> 3 <211> 594 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgtag ggttcctagc gagcccaacc 60 tcccacccgt gtttactgta ccttagttgc ttcggcgggc ccgccattca tggccgccgg 120 gggctctcag ccccgggccc gcgcccgccg gagacaccac gaactctgtc tgatctagtg 180 aagtctgagt tgattgtatc gcaatcagtt aaaactttca acaatggatc tcttggttcc 240 ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taactagtgt gaattgcaga attccgtgaa 300 tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga 360 gcgtcattgc tgcccatcaa gcacggcttg tgtgttgggt cgtcgtcccc tctccggggg 420 ggacgggccc caaaggcagc ggcggcaccg cgtccgatcc tcgagcgtat ggggctttgt 480 cacccgctct gtaggcccgg ccggcgcttg ccgaacgcaa atcaatcttt tccaggttga 540 cctcggatca ggtagggata cccgctgaac ttaagcctat ccataagcgg agga 594

Claims (14)

1. 만난아제(mannanase) 생성능을 가지는 신규 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주는 KCTC 11105BP인 것을 특징으로 하는 균주.
3. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주는 단백질분해효소, 셀룰로스분해효소, 자일란분해효소, 지방분해효소 및 전분분해효소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소 생성능을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
4. 만난아제 생산능 및 야자과 종자박의 발효능을 갖는 아스퍼질러스 오리재 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 아스퍼질러스 오리재 MFO1 균주인 것을 특징으로 하는 고상 발효방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 야자과 종자박은 팜 종자박(palm kernel cake) 또는 코프라 박(copra meal)인 것을 특징으로 하는 고상 발효방법.
7. 제4항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 야자과 종자박을 전처리한 다음, 발효시키는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법:

   (a) 야자과 종자박을 70 내지 135℃에서 열처리;

   (b) 야자과 종자박에 10 내지 200kGy의 방사선 조사;

   (c) 야자과 종자박을 0.05 내지 0.15%(w/w)의 유기산으로 처리.
8. 제7항에 있어서, 상기 유기산은 초산(acetic acid), 유산(lactic acid), 구연산(citric acid). 프로피온산(propionic acid) 및 이들을 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
9. 제4항에 있어서, 상기 발효 전에 야자과 종자박의 수분 함량을 35 내지 65%(v/v)로 조정하는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
10. 제4항에 있어서, 유산균을 추가로 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토코쿠스(Lactococcus)속, 스트렙토코커스 피칼리스(Streptococcus feacalis), 엔테로코쿠스 페시움(Enterococcus faecium) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) ML2(KCTC 11266BP)인 것을 특징으로 하는 야자과 종자박의 고상 발효방법.
13. 제4항의 고상 발효방법에 의해 발효 처리된 야자과 종자박을 함유하는 동물 사료 또는 그 첨가제.
14. 제4항의 야자과 종자박의 고상 발효방법으로 발효 처리된 야자과 종자박을 용매로 추출시킨 다음, 상기 추출액을 정제하는 것을 특징으로 하는 만난아제의 제조방법.

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