CN116555240A - 一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程领域，涉及一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株的构建及应用。本发明获得的蔗糖异构酶突变体相较野生型在热稳定性方面大大提升，因而用于异麦芽酮糖的生产具有明显的优势，具有较大的应用价。

Description

一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株高效生产异麦芽酮糖的重组解脂亚罗酵母菌株的构建及应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
异麦芽酮糖(Isomaltulose)，又称帕拉金糖(Palatinose)，是蔗糖的同分异构体，由葡萄糖与果糖以α-1，6糖苷键结合而成，是一种还原性双糖，具有与蔗糖类似的口感和物理特性，但其甜度是蔗糖的一半。与蔗糖相比，异麦芽酮糖的优势主要体现在以下几个方面：1)异麦芽酮糖不会被唾液、胃酸和胰液消化，在小肠被水解成葡萄糖和果糖吸收，适合糖尿病人食用；2)异麦芽酮糖不能被口腔内的微生物利用，不会形成牙菌斑；3)吸湿性低，稳定性强，货架期长。作为一种具有巨大应用前景的功能性甜味剂，异麦芽酮糖广泛应用于减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等。
目前，异麦芽酮糖的生产方式包括微生物转化法和酶转化法。微生物转化法是将一些可以产生蔗糖异构酶的野生型菌株如沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Psedumonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)等接种至含有蔗糖的培养基中，发酵生产异麦芽酮糖。该方法具有生产菌株遗传背景不清楚，发酵获得的异麦芽酮糖应用于食品中存在安全隐患的缺点；另外，该方法生产异麦芽酮糖需要菌体量巨大、转化率低、后期分离纯化困难，因此难以应用于大规模工业生产。
酶转化法生产异麦芽酮糖可分为两种，一种是通过工程菌株发酵获得蔗糖异构酶，通过游离酶催化蔗糖获得异麦芽酮糖。比如，Park等将Enterobacter sp.FMB-1来源的蔗糖异构酶在Lactococcus.lactis MG1363中表达，最终催化蔗糖到异麦芽酮糖的转化率达到72％(Park等.Microbial production of palatinose through extracellularexpression of a sucrose isomerase from Enterobacter sp.FMB-1in Lactococcuslactis MG1363.Bioresource Technology 101(2010)8828–8833Microbial productionof palatinose through extracellular expression of a sucrose isomerase fromEnterobacter sp.FMB-1in Lactococcus lactis MG1363.Bioresource Technology 101(2010)8828–8833)；Wu等将Erviniarhapontici NX-5来源的蔗糖异构酶基因引入枯草芽孢杆菌WB800中进行胞内表达，在生物反应器内，经过9轮转化，蔗糖的转化率仍能达到90％(Wu等.Green synthesis of isomaltulose from cane molasses by Bacillus subtilisWB800-pHA01-palI in abiologic membrane reactor.Food Chemistry,2017,229.761-768)。酶转化法利用的基因工程菌株多为食品级安全菌株，安全性高，酶表达量高，成为当前研究的热点。解脂亚罗酵母是一种食品级安全菌株，且不能利用蔗糖，在生产异麦芽酮糖中具有天然优势，因此有必要研究开发利用该菌株，将具有较强的应用前景。
发明内容
针对上述需求，本发明目的是筛选得到蔗糖异构酶突变体，由此构建可表达蔗糖异构酶的解脂亚罗酵母重组菌株，并将其应用于生物制备异麦芽酮糖领域。
本发明首先提供一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，尤其是其相应于SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的第118位氨基酸替换为T、N或L，或第150位氨基酸替换为P、L、S或N，或第288位氨基酸替换为D、H或Y，或第301位氨基酸替换为E、S、T或M，或第319位氨基酸替换为Y、N、P、R，或第350位氨基酸替换为L、S、E或N，或第469位氨基酸替换为W、V或L；或第502位氨基酸替换为M或Y，或第573位氨基酸替换为N、D或Y；尤其是其相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第319位氨基酸替换为Y、N、P或R。
本发明也提供进一步的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，其相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第319位氨基酸替换为Y，并且还存在下述之一的突变：第573位突变为N、或第288位突变为D、或第150位突变为P、或第502位突变M和第573位突变为N，或第288位突变D和第573位突变为N，或第150位突变为P和第573位突变为N，或第502位突变M和第573位突变为N，或第150位突变P、第288位突变为D且第573位突变为N。
本发明也提供编码所述的蔗糖异构酶突变体的多核苷酸，优选根据拟表达宿主细胞进行了密码子优化，更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步提供含有所述的多核苷酸的表达载体，优选地其出发载体为含pET21b，优选地的表达载体上含有2个拷贝的所述多核苷酸。
本发明还提供含有所述的多核苷酸或其表达载体的重组宿主细胞。优选地，其出发菌株是解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)，优选地，所述多核苷酸被整合到所述解脂亚罗酵母的染色体上。特别优选地，其保藏编号为CGMCC NO.25627。
本发明进而提供所述的重组宿主细胞在制备蔗糖异构酶中的应用，优选地对所述重组宿主细胞进行固定化得到固定化全细胞；或对制备得到的蔗糖异构酶进行固定化得到固定化酶。
更具体地，将所述重组宿主细胞进行发酵，将细胞浓缩并与海藻酸钠混合，充分搅拌后，加入CaCl2溶液中，制备成球状固定化细胞，优选地将固定化细胞置于CaCl2溶液中，例如在4℃条件下，放置过夜，增强硬度；将所述重组宿主细胞进行发酵，并制备蔗糖异构酶粗酶酶液，再与戊二醛，固定化载体进行混合充分搅拌，收集固定化颗粒得到固定化酶。
进一步本发明提供所述的重组宿主细胞在将蔗糖转化为的异麦芽酮糖中的应用，优选地对所述重组宿主细胞进行固定化得到固定化全细胞用于催化反应；或对制备得到的蔗糖异构酶进行固定化得到固定化酶进行催化反应；更优选地，固定化全细胞或固定化酶可重复循环使用。
本发明获得的蔗糖异构酶突变体相较野生型在热稳定性方面大大提升，因而用于异麦芽酮糖的生产具有明显的优势，有较大的应用价值。
附图说明
图1.重组表达载体pINA1312-PdSI1-PdSI1的构建。
图2.不同拷贝数工程菌株蔗糖异构酶酶活。
图3.全细胞转化过程中HPLC检测蔗糖、异麦芽酮糖。
图4.C-SI4工程菌株异麦芽酮糖产量及转化率。
图5.C-SI4工程菌株固定化应用。
保藏信息说明：
本发明整合有多拷贝蔗糖异构酶基因的重组解脂亚罗酵母菌(C-SI4)已于2022年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的简称为CGMCC，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.25627，分类命名为解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
YPD培养基：蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L。
YPD固体培养基：蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
筛选培养基YNB：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L。
YNB固体培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
下述实施例中涉及的酶活测定方法如下：
蔗糖异构酶酶活的测定方法：取适当粗酶液或纯酶液加入到含有100g/L蔗糖的50mM pH6.0磷酸盐缓冲液，反应体系的总体积为500μL；于30℃反应20min，沸水浴5min终止酶促反应；离心取上清，利用高效液相色谱检测反应液中异麦芽酮糖的含量；高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Hypersil APS-2氨基柱，柱温：40℃，流动相：乙腈：水(75:25，v/v)，流速：1mL/min，上样量为10μL。其中，蔗糖异构酶酶活的定义：在30℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化蔗糖生成1μmol异麦芽酮糖所需的酶量为一个活力单位(U)。
实施例1.蔗糖异构酶突变体库的构建及热稳定性提高突变体的筛选
1、突变体库的构建
委托南京金斯瑞生物技术有限公司合成来源于Pantoea dispersa UQ68J的蔗糖异构酶PdSI(GeneID：AY223549.1)的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，获得含有蔗糖异构酶基因的载体pET21b-PdSI。设计易错PCR所使用的的引物如下：
P1：CGGGATCCATGTCCCCGCTGACCAAACCAAGCACA；
P2：CGGAATTCATTCAGCTTGTAGATGCCAGCCTGC。
以pET21b-PdSI为模板，采用上述引物及随机突变PCR试剂盒进行PCR扩增，对PCR产物进行切胶回收，经限制性内切酶BamHI、EcoRI处理后与同样经过双酶切的pET21b载体进行连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。将获得的转化子，挑取至96孔板中，每个孔中加1mL LB液体培养基，37℃培养6h后，加入终浓度为0.1mM IPTG，并降低温度至16℃诱导过夜。将96孔板离心，弃上清，用50mM PBS(pH＝6)重悬菌体沉淀，并加入溶菌酶，37℃处理1h，反复冻融2次，获得含蔗糖异构酶的大肠杆菌细胞裂解液。取20μL上述大肠杆菌细胞裂解液测定突变体的热稳定性，得到热稳定性提升的突变位点。
2、热稳定性提升位点的定点饱和突变
经筛选发现，118、150、288、301、319、350、469、502、573位点氨基酸突变之后热稳定性的影响较大。突变体118T、150P、288D、301E、319Y、350L、469W、502M、573N在45℃下的半衰期(T1/2)相较野生型提高了2.3、3.7、5、3、8.5、1.5、2.6、3.5、7倍。在此基础上，对上述获得的9个位点进行单点饱和突变，具体操作如下：以重组质粒pET21b-PdSI为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用DpnI酶在37℃条件下消化2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coli BL21，涂布到含有100μg/mL氨苄霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选100个阳性克隆。
分析测定突变体的热稳定性，将热稳定提高的蔗糖异构酶突变体进行测序，分析相应位置氨基酸突变为何种氨基酸。热稳定性提高的突变体的突变位点及在45℃下的相对热稳定性如表1所示，野生型在45℃下的T1/2为1。
表1热稳定性提高的突变体
3、热稳定性提高位点的组合突变
上述结果显示，突变319位氨基酸残基对热稳定性的提高较显著，319Y在45℃下的T1/2最长，相较野生型提高了8.5倍。因此，在突变319Y的基础上进行下一轮的组合突变。
将319Y与其他在单点饱和突变中热稳定性提升的位点进行逐轮组合突变，并测定在45℃下的T1/2，计算相较野生型提升的倍数。表2中列举出热稳定性提高显著的组合突变体的相对热稳定性及突变情况，野生型为1。将热稳定性最优的突变体命名为PdSI1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，对应的质粒为pET21b-PdSI1。
表2热稳定性提高显著的组合突变体
实施例2.重组表达载体pINA1312-PdSI1-PdSI1的构建
1、重组表达载体pINA1312-PrGPD-PdSI1的构建
以实施例2中获得的稳定性最优的突变体质粒pET21b-PdSI1为模板，设计PCR引物，用于扩增PdSI1基因片段：以解脂亚罗酵母polf基因组为模板，设计PCR引物，用于扩增PrGPD启动子片段：以质粒pINA1312为模板，设计PCR引物，用于扩增pINA1312线性化载体：PCR产物中加入DpnI，消化模板，并利用Omega Cycle-Pure Kit对PCR产物进行纯化回收。回收后，采用重组酶进行连接。将所有成分混匀后放置于37℃水浴锅孵育30min，立即放置于冰上冷却2min终止反应，该反应产物直接用于感受态细胞转化。挑取2-3个转化子送至公司测序，验证正确后即获得目标质粒pINA1312-PrGPD-PdSI1。
2、重组表达载体pINA1312-PdSI1-PdSI1(含有两个拷贝的PdSI1)的构建
委托南京金斯瑞生物技术有限公司合成与PdSI1氨基酸序列相同，核苷酸序列同源性为78％的PdSI1-1(SEQ ID NO.4)序列，获得含有蔗糖异构酶基因突变体的载体pET21b-PdSI1-1。以质粒pET21b-PdSI1-1为模板，设计PCR引物，用于扩增PdSI1-1基因片段，以解脂亚罗酵母polf基因组为模板，设计PCR引物，用于扩增PrTEFin启动子片段，以解脂亚罗酵母polf基因组为模板，设计PCR引物，用于扩增Tpex20终止子片段，以pINA1312-PrGPD-PdSI1为模板，设计PCR引物，用于扩增pINA1312-PrGPD-PdSI1线性化载体。PCR产物中加入DpnI，消化模板，并对PCR产物进行纯化回收。回收后，采用重组酶进行重组连接。将所有成分混匀后放置于37℃水浴锅孵育30min，立即放置于冰上冷却2min终止反应，该反应产物直接用于感受态细胞转化。挑取2-3个转化子送至公司测序，验证正确后即获得目标质粒pINA1312-PdSI1-PdSI1(图1)。
实施例3.重组解脂亚罗酵母菌株构建
以实施例2获得的重组质粒为模板，设计PCR引物，用于扩增含有zeta整合位点的蔗糖异构酶基因整合片段PdSI1-PdSI1，PCR产物中加入DpnI，消化模板，并对PCR产物进行纯化回收。回收后，用NanoDrop2000超微量分光光度计对片段进行定量。采用醋酸锂转化法将获得的DNA片段转化至PolfΔsuc感受态细胞中(polfΔsuc菌株为本实验室保存的敲除蔗糖水解酶的菌株)，涂布于SD缺陷型平板中，30℃培养箱培养2-4天，长出单菌落。挑选阳性克隆并进行PCR验证，由于阳性克隆中蔗糖异构酶基因拷贝数存在差异，故筛选多个阳性克隆，获得染色体整合有蔗糖异构酶组合操纵子的解脂亚罗酵母重组菌株C-SIn(整合PdSI1-PdSI1)。
实施例4.工程菌株的培养与蔗糖异构酶酶活测定
将上述整合有蔗糖异构酶PdSI1的解脂亚罗酵母工程菌(C-SIn)接种于YPD培养基中，30℃、200rpm培养24h获得相应种子液。将种子液按照1％的接种量转接至新的YPD培养基中，培养72h。离心收集30mL菌体，用ddH2O重悬细胞洗涤菌体2次后，用30mL PBS缓冲液(pH 6.0)重悬菌体，1800bar高压均质破碎酵母细胞，12000rpm离心15min，取200μL上清用于工程菌株粗酶活测定。
蔗糖异构酶酶活的检测方法：取300μL适当稀释后的粗酶液加入到含有100g/L蔗糖的50mM pH6.0磷酸盐缓冲液，反应体系的总体积为500μL；于30℃反应20min，沸水浴5min终止酶促反应；离心取上清，利用HPLC检测反应液中异麦芽酮糖的含量；其中，蔗糖异构酶酶活的定义：在30℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化蔗糖生成1μmol异麦芽酮糖所需的酶量为一个活力单位(U)。
如图3所示，不同克隆由于整合蔗糖异构酶基因拷贝数不同，酶活不同，其中，C-SI4酶活为12U/mL，为筛选到的酶活最高的菌株。对其进行了保藏，保藏编号为：CGMCCNO.25627。
实施例5.利用工程菌株转化蔗糖生成异麦芽酮糖
将整合蔗糖异构酶基因的解脂亚罗酵母工程菌株C-SI4按照实施例4的方法培养72h后，离心收集菌体，用ddH2O重悬细胞洗涤菌体两次后作为全细胞催化剂。全细胞转化体系如下：用PBS缓冲液(pH 6.0，蔗糖终浓度500g/L)重悬菌体，使得最终菌体OD600为100。将上述反应液放置于200rpm，30℃下持续转化12h，得到高浓度异麦芽酮糖的转化反应液，其中于反应0h、3h、6h、9h、12h取样200μL，12000rpm离心15min，取上清，HPLC检测反应液中蔗糖、异麦芽酮糖、海藻酮糖含量(图3)，并计算异麦芽酮糖转化率及时空产率。其中，异麦芽酮糖转化率的计算公式为：转化率＝(反应后转化液中异麦芽酮糖的浓度/反应前转化液中蔗糖的初始浓度)×100％；异麦芽酮糖时空产率的计算公式为：时空产率＝反应后转化液中异麦芽酮糖的浓度/反应时间。
由图4可知，重组菌株C-SI4全细胞转化蔗糖6h后，即可将反应体系中500g/L的蔗糖转化为425g/L的异麦芽酮糖，蔗糖剩余20g/L，异麦芽酮糖转化率为85％、异麦芽酮糖时空产率达70.8g/L·h。
实施例6.固定化蔗糖异构酶的制备及应用
以重组解脂亚罗酵母C-SI4为出发菌株，采用实施例4所述的方法发酵获得蔗糖异构酶表达菌株，并制备蔗糖异构酶粗酶酶液。配置壳聚糖乙酸溶液，并将大孔树脂置于壳聚糖乙酸溶液中，搅拌；随后加入25％戊二醛，制备固定化载体。进一步在体系中加入25％戊二醛，固定化载体，粗酶酶液，粗酶酶液与固定化载体比例为1:1(g:g),充分搅拌8h，收集固定化颗粒，用于反应。
固定化酶反应体系：蔗糖底物：500g/L，固定化酶：1g/L，缓冲液：PBS(pH 6.0)；反应条件：200rpm，30℃；反应时间：12h。
反应结果：固定化酶转化蔗糖9h后，即可将反应体系中500g/L的蔗糖转化为435g/L的异麦芽酮糖，蔗糖剩余20g/L，异麦芽酮糖转化率为87％、异麦芽酮糖时空产率达48.3g/L·h。
重复固定化酶反应10次，结果显示，固定化细胞转化10次时，转化率依然保持83％以上(图5中A)。
实施例6.固定化细胞的制备及应用
以重组解脂亚罗酵母C-SI4为出发菌株，采用实施例5所述的方法发酵获得表达蔗糖异构酶的菌株，将细胞浓缩至初始菌体浓度OD600为80，并与浓度为3％(w/w)的海藻酸钠混合，充分搅拌后，加入0.6M的CaCl2溶液中，制备成球状固定化细胞，固定化细胞置于0.6M的CaCl2溶液中，在4℃条件下，放置过夜，增强硬度。
建立固定化细胞反应体系：蔗糖底物：500g/L,固定化细胞：2g/L,缓冲液：PBS缓(pH6.0)；反应条件：200rpm，30℃；反应时间：12h。
反应结果：固定化酶转化蔗糖6h后，即可将反应体系中500g/L的蔗糖转化为440g/L的异麦芽酮糖，蔗糖剩余20g/L，异麦芽酮糖转化率为88％、异麦芽酮糖时空产率达73.3g/L·h。
重复固定化细胞反应10次，结果显示，固定化细胞转化10次时，转化率依然保持80％以上(图5中B)。

Claims (10)

1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，尤其是其相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第118位氨基酸替换为T、N或L，或第150位氨基酸替换为P、L、S或N，或第288位氨基酸替换为D、H或Y，或第301位氨基酸替换为E、S、T或M，或第319位氨基酸替换为Y、N、P、R，或第350位氨基酸替换为L、S、E或N，或第469位氨基酸替换为W、V或L；或第502位氨基酸替换为M或Y，或第573位氨基酸替换为N、D或Y；尤其是其相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第319位氨基酸替换为Y、N、P或R。
2.如权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，其相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第319位氨基酸替换为Y，并且还存在下述之一的突变：第573位突变为N、或第288位突变为D、或第150位突变为P、或第502位突变M和第573位突变为N，或第288位突变D和第573位突变为N，或第150位突变为P和第573位突变为N，或第502位突变M和第573位突变为N，或第150位突变P、第288位突变为D且第573位突变为N。
3.编码如权利要求1或2所述的蔗糖异构酶突变体的多核苷酸，优选根据拟表达宿主细胞进行了密码子优化，更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.含有如权利要求3所述的多核苷酸的表达载体，优选地其出发载体为含pET21b，优选地的表达载体上含有2个拷贝的所述多核苷酸。
5.含有如权利要求3所述的多核苷酸或其表达载体的重组宿主细胞。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，其出发菌株是解脂亚罗酵母，优选地，所述多核苷酸被整合到所述解脂亚罗酵母的染色体上。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO. 25627。
8.如权利要求5至7任一项所述的重组宿主细胞在制备蔗糖异构酶中的应用，优选地对所述重组宿主细胞进行固定化得到固定化全细胞；或对制备得到的蔗糖异构酶进行固定化得到固定化酶。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述重组宿主细胞进行发酵，将细胞浓缩并与海藻酸钠混合，充分搅拌后，加入CaCl2溶液中，制备成球状固定化细胞，优选地将固定化细胞置于CaCl2溶液中，放置得到固定化酶；将所述重组宿主细胞进行发酵，并制备蔗糖异构酶粗酶酶液，再与戊二醛，固定化载体进行混合充分搅拌，收集固定化颗粒得到固定化酶。
10.如权利要求5至7任一项所述的重组宿主细胞在将蔗糖转化为的异麦芽酮糖中的应用，优选地对所述重组宿主细胞进行固定化得到固定化全细胞用于催化反应；或对制备得到的蔗糖异构酶进行固定化得到固定化酶进行催化反应；更优选地，固定化全细胞或固定化酶可重复循环使用。
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