CN110106222B

CN110106222B - 一种糖基转移酶在合成甘草酸中的应用

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Publication number: CN110106222B
Application number: CN201811310750.3A
Authority: CN
Inventors: 李春; 赵雨佳; 冯旭东; 朱明�; 刘啸尘; 樊婧婧; 王晨; 周晓宏
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: CN110106222A

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶，可以催化甘草次酸糖基化合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸，属于生物技术领域。该糖基转移酶可用于体外酶法合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸。并且，该糖基转移酶可以用于微生物体内全合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸。

Description

一种糖基转移酶在合成甘草酸中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种糖基转移酶，尤其涉及一种糖基转移酶在转糖基化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸中的应用。

背景技术

单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和甘草酸(GL)是五环三萜类化合物甘草次酸(GA)的糖甙衍生物，糖基转移酶通过在GA的C-3位连接1-2个葡萄糖醛酸分别生成GAMG和GL。作为GA的糖甙衍生物，GAMG和GL也具有镇咳祛痰、消炎抑菌、抗肿瘤及治疗艾滋病等多种药理活性，是一类具有重要药理活性的天然产物；同时，糖侧链的添加提高了GAMG和GL的甜度和极性，其中GAMG的甜度是蔗糖的941倍，作为新型甜味剂用于食品工业，GL的极性是GA的27倍，作为保湿剂用于化妆品行业。综上所述，GAMG和GL具有重要的医药和工业应用价值。因此,获得大量、高纯度的GAMG、GL成为现代工业的研究热点。

甘草又名国老、灵通，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等重要的药用价值；同时，由于甘草是一种根系十分发达的多年生豆科植物，其具有防风固沙，稳定生态，减少土地荒漠化等重要的生态价值。我国甘草主要分布于宁夏、甘肃、青海、内蒙古、新疆和陕西榆林地区，近几年甘草作为药材、食物及化妆品的市场需求量猛增，野生资源的过度采挖导致甘草药材产量和质量急剧下降，同时也加速了我国北方荒漠化的扩展，严重影响了生态环境。

目前获得GAMG和GL的主要方式是从甘草根中提取，以乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂作为萃取液，通过超临界二氧化碳萃取、溶剂萃取和色谱柱分离几种方法的组合从甘草根中分离获得GAMG和GL。然而GAMG和GL在甘草跟中的积累量较少，其中GAMG在甘草根干重中的含量不足1‰，GL在甘草根干重中的含量在2％左右，如果直接从植物中提取存在工艺复杂、能耗高、生产周期较长等问题，且需要消耗大量的甘草资源，严重影响我国北方的生态环境。此外，GAMG和GL由于其分子结构的复杂性使得化学合成也难以实现。

近年来,合成生物学的快速发展为稀有天然产物的制备开辟了一条新的有效途径。例如，Keasling JD课题组以酿酒酵母为底盘宿主，通过在底盘宿主中引入青蒿酸的合成途径并对代谢途径不断优化使青篙酸的产量达到25g/L(Nature,2006,440:940-943；Nature,2013,496:528-532)；Stephanopoulos G课题组利用大肠杆菌为底盘宿主，通过在底盘宿主中引入紫杉二烯的合成途径首次合成了紫杉二烯(Science,2010,330:70-74)，其后又将紫杉二烯的合成途径拆分成两部分，分别构建到大肠杆菌和酿酒酵母中，并通过同培养的方式，实现了紫杉二烯产量的大幅提升，达到33mg/L(Nature Biotechnology,2015,33(4):377-83)。综上所述，以微生物作为底盘宿主，通过在底盘宿主中重建植物次生代谢产物的生物合成途径，用以制备高附加值的植物次生代谢产物具有出良好的应用前景。此外，李春教授课题组在酿酒酵母中构建了GA的生物合成途径，通过代谢调控及发酵过程优化，GA的产量达到1.518mg/L以上(专利申请号201610965315.9)。这为体外酶法合成或微生物体内全合成GAMG、GL奠定了基础。然而与GAMG、GL合成相关的糖基转移酶报道较少，糖基转移酶是生物界广泛存在的多基因家族蛋白，只在少数植物中被克隆，通过酶活性方法进行鉴定的则更少，其中参与三萜皂甙的糖基转移酶仅在拟南芥、蒺藜苜蓿、罗汉果等植物中进行了研究。近期，刘春生课题组鉴定了甘草中催化GA合成GAMG的糖基转移酶基因(NewPhytol,2016,212(1):123-35)。目前仍然没有与GL合成相关的糖基转移酶基因的报道。

通过以GA为底物在体外酶法转化合成或微生物体内全合成的方法，可提高GAMG和GL的产量，然而这两种方法都需要获得可催化GA合成GAMG和GL的糖基转移酶基因，至今仍没有此功能基因的报道。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是开发一种有效的糖基转移酶，用于体外酶法转化及微生物体内全合成法合成GAMG和GL。

为实现上述目的，本发明提供了一种糖基转移酶，并利用该糖基转移酶实现了GAMG和GL的体外酶法和微生物体内全合成。

本发明人借助NCBI、KEGG、BRENDA等数据库资源，基于底物相似性及催化反应类型等原则，筛选了一些可能催化GA的C-3位羟基糖基化反应的糖基转移酶基因。将筛选的基因在酿酒酵母表达系统中进行功能表达，获得重组蛋白的粗酶液。经实验证明，其中来源于人(Homo sapiens)的UGT1A3糖基转移酶可催化GA生成GAMG和GL。

第一方面，本发明提供了一种转糖基合成GAMG和GL的糖基转移酶及其编码的基因，该基因为来源于人Homo sapiens的糖基转移酶基因UGT1A3，将该糖基转移酶命名为UGT1A3蛋白。经密码子优化后所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

第二方面，本发明提供了两种催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸的糖基转移酶及其编码的基因，该基因分别为来源于人Homo sapiens的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Hs)，将该UDP-葡萄糖脱氢酶命名为UGDH(Hs)蛋白，经密码子优化后所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4；来源于大肠杆菌Escherichia coli的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Ec)，将该UDP-葡萄糖脱氢酶命名为UGDH(Ec)蛋白，经密码子优化后所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

第三方面，本发明还提供了包含编码上述糖基转移酶、UDP-葡萄糖脱氢酶的重组载体，以及包含所述重组载体的转化体。

本发明所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如各种质粒，即将糖基转移酶基因、UDP-葡萄糖脱氢酶基因导入能使该糖基转移酶基因、UDP-葡萄糖脱氢酶稳定表达的DNA载体质粒。

而所述的重组载体的转化体，即指重组载体的宿主细胞。例如，本发明实施例1所述的微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的宿主细胞；当然，现有技术常用的宿主细胞的微生物包括革兰氏阳性细菌如枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌如天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolour)，酵母如毕赤酵母(Pichia pastoris)，真菌如黑霉菌(Aspergillus niger)，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。

第四方面，本发明提供了一种使用糖基转移酶转糖基化体外合成GAMG和GL的方法，该方法以GA和糖基供体UDP-葡萄糖醛酸(UDPGA)为原料，在糖基转移酶的催化作用下，GA的C-3位羟基发生糖基化反应，生成GAMG和GL。

第五方面，本发明还提供了一种应用UGT1A3基因和UGDH(Hs)基因；UGT1A3基因和UGDH(Ec)基因在微生物体内合成GAMG和GL的方法。该方法以能够生产GA的工程菌为基础，通过导入糖基转移酶编码基因UGT1A3和UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Hs)；糖基转移酶编码基因UGT1A3基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Ec)基因的表达盒，得到重组菌。发酵培养获得目标产物GAMG和GL。

所述糖基转移酶编码基因UGT1A3，UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶编码基因UGDH(Hs)、UGDH(Ec)的表达盒进一步具体包括启动子P_GAL1、P_GAL10、糖基转移酶编码基因UGT1A3，UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶编码基因UGDH(Hs)、UGDH(Ec)和终止子T_ADH1、T_CYC1。其中启动子P_GAL1核酸序列为SEQ ID NO:7，启动子P_GAL10核酸序列为SEQ ID NO:8，终止子T_ADH1核酸序列为SEQ IDNO:9，终止子T_GAL1核酸序列为SEQ ID NO:10。

所述微生物，例如,本发明实施例2所述的酿酒酵母细胞；当然,现有技术常用微生物生产菌株包括革兰氏阳性细菌如枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolour)，酵母如毕赤酵母(Pichia pastoris)，真菌如黑霉菌(Aspergillus niger)，它们的细胞均是常用的生产菌株。

通过以上技术方案的实现，本发明达到了如下技术效果:

1、利用本发明所述的糖基转移酶在体外酶法合成GAMG和GL。

2、利用本发明所述的糖基转移酶和UDP-葡萄糖脱氢酶成功地实现了在微生物体内全合成GAMG和GL。

3、本发明获得的UGT1A3糖基转移酶可以用于体外酶法转化合成及微生物体内全合成制备GAMG和GL，是区别于现有生产技术的一种新的生产方法，生产过程简单快速且对环境友好，是一种绿色清洁可持续的生产方式。

以下将结合附图对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是UDP-葡萄糖脱氢酶UGDH(Hs)、UGDH(Ec)催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸的反应示意图；

图2是糖基转移酶UGT1A3催化GA生成GAMG和GL的反应示意图；

图3是UGT1A3糖基转移酶体外催化GA转糖基生成GAMG和GL反应的质谱(MS)谱图；

图4是酿酒酵母工程菌株GL01的代谢网络示意图；

图5是酿酒酵母工程菌株GL02的代谢网络示意图；

图6是酿酒酵母工程菌株GL01生产GAMG和GL的质谱(MS)谱图；

图7是酿酒酵母工程菌株GL02生产GAMG和GL的质谱(MS)谱图；

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由苏州鸿讯生物技术有限公司合成制备。

2、实验中所使用的T4DNA连接酶购自New England BIOlabS公司；PrimeSTAR HS高保真聚合酶购自TakaRa公司；限制性内切酶均购自Thermo Fisher公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自天根公司。

3、以下实施例中使用的PCR引物序列：

实施例1催化GA合成GAMG和GL的糖基转移酶的筛选

通过NCBI、KEGG、BRENDA工等数据库资源，基于底物相似性及催化反应类型等原则，筛选了一些可能催化GA糖基化的糖基转移酶基因，分别是来源于人的UGT1A1、UGT1A3以及UGT1A1。这三个基因经密码子优化后交苏州鸿讯生物技术有限公司进行全基因合成，得到质粒pUC57-UGT1A1、pUC57-UGT1A3和pUC57-UGT2A1。

分别以质粒pUC57-UGT1A1、pUC57-UGT1A3和pUC57-UGT2A1为模板，利用引物对UGT1A1-F-BamHI&UGT1A1-R-SalI、UGT1A3-F-BamHI&UGT1A3-R-SalI和UGT2A1-F-BamHI&UGT2A1-R-SalI进行扩增。扩增体系为：PrimerSTAR HS Buffer(2×)12.5μL、dNTP(2.5mM)2μL、质粒模板1μL、引物(5μM)各2μL、PrimerSTAR HS高保真DNA聚合酶0.25μL、补充双蒸水至25μL。扩增条件为98℃预变性5分钟；98℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到5`端带有BamHI同时3`端带有SalI酶切位点的BamHI-UGT1A1-SalI、BamHI-UGT1A3-SalI和BamHI-UGT2A1-SalI片段。

回收得到的DNA片段和质粒pESC-URA利用BamHI和SalI两种限制性内切酶进行酶切反应。酶切反应体系为：限制性内切酶BamHI和SalI各0.25μL、回收产物19.5μL。酶切条件为37℃反应2小时、80℃反应20分钟使酶失活。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到经BamHI和SalI双酶切的DNA片段和酶切后的质粒。

回收得到经双酶切的DNA片段和质粒片段利用T4连接酶进行连接反应。连接反应体系为：T4连接酶0.25μL、回收酶切后的DNA片段7.5μL、回收酶切后的质粒片段2.25μL。连接条件为16℃反应2小时。

将连接产物通过化学法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明在pESC-URA载体上分别插入了正确的目的基因UGT1A1，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:11，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:12；目的基因UGT1A3，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2；目的基因UGT2A1，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:13，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:14。

分别将质粒pESC-URA-UGT1A1、pESC-URA-UGT1A3、pESC-URA-UGT2A1通过醋酸锂法转化到酿酒酵母CEN PK2-1C感受态细胞，涂布于缺少尿苷酸的含有2％葡萄糖的基础培养基SD-URA平板上，培养36小时候筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明酿酒酵母工程菌GT01、GT01、GT03中分别包含质粒pESC-URA-UGT1A1、pESC-URA-UGT1A3、pESC-URA-UGT2A1。

从平板上挑选GT01、GT01、GT03的单菌落，分别接种于含有2％葡萄糖的SD-URA基础培养基，30℃、200rpm、培养至OD₆₀₀达到0.6；6000rpm离心10分钟去除上清、将菌体更换至含有3％半乳糖的SD-URA基础培养基，30℃、200rpm、培养48小时，诱导工程菌表达糖基转移酶蛋白UGT1A1、UGT1A3、UGT2A1。

4℃、6000rpm离心10分钟，去除上清；将菌体重悬于酵母微粒体处理液buffer A，轻轻振摇后，4℃、6000rpm离心10分钟，去除上清；沉淀用2mL酵母微粒体处理液buffer B-I重悬，30℃轻轻振摇1小时，4℃、6000rpm离心10分钟，去除上清；沉淀用2mL酵母微粒体处理液buffer B-II重悬，轻轻振摇后，4℃、6000rpm离心10分钟，去除上清；沉淀用50mL酵母微粒体处理液buffer A重悬，400W超声5分钟，超声液4℃、3000rpm离心10分钟，收集上清；上清液4℃、6000rpm离心10分钟，收集上清；上清液4℃、125000g离心90分钟，沉淀用酵母微粒体悬浮液悬浮，-80℃保存。其中酵母微粒体处理液buffer A的配方为：10mM Tris-HCL、0.65mM Sorbitol、0.1mM DTT、0.1mM EDTA，PH调至7.5；酵母微粒体处理液buffer B-I的配方为：10mM Tris-HCL、2mM Sorbitol、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、10U/mL lyticase，PH调至7.5；酵母微粒体处理液buffer B-II的配方为：10mM Tris-HCL、2mM Sorbitol、0.1mM DTT、0.1mM EDTA，PH调至7.5；酵母微粒体悬浮液配方为：KH₂PO₄ 100mM、K₂HPO₄ 100mM、甘油20％(V/V)、胆酸钠0.5％(V/V)、Tween-20 0.2％(V/V)。

用天根公司的Bradford蛋白质定量试剂盒对得到的酵母微粒体上总蛋白进行定量，分别得到含有糖基转移酶UGT1A1、UGT1A3、UGT2A1的酵母微粒体总蛋白量为0.056mg/L、0.066mg/L、0.047mg/L。

分别用得到的含有糖基转移酶UGT1A1、UGT1A3、UGT2A1的酵母微粒体做体外活性检测。

反应体系为：样品组，2M GA 1μL、5M UDPGA 1μL、5M NADPH 1μL、含有UGT的酵母微粒体蛋白97μL；空白组，2M GA 1μL，5M UDPGA 1μL，5M NADPH 1μL，酵母微粒体重悬液97μL。反应条件为：30℃反应5小时，加900μL甲醇终止反应。样品和空白经LC-MS检测，结果表明糖基转移酶UGT1A3能够使GA转糖基化生成GAMG和GL。

实施例2：构建生产GAMG、GL的工程化酿酒酵母

由于酿酒酵母自身不合成UDP-葡萄糖醛酸，只具有UDP-葡萄糖，为了实现利用酿酒酵母从头合成GAMG和GL，首先要在酿酒酵母中引入UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)，催化酿酒酵母内源的UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸。通过NCBI数据库检索，选择两种催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸的糖基转移酶及其编码的基因，该基因分别为来源于人Homosapiens的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Hs)，将该UDP-葡萄糖脱氢酶命名为UGDH(Hs)蛋白，经密码子优化后所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4；来源于大肠杆菌Escherichia coli的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH(Ec)，将该UDP-葡萄糖脱氢酶命名为UGDH(Ec)蛋白，经密码子优化后所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

其中，人源的UGDH(Hs)经密码子优化后交苏州鸿讯生物技术有限公司进行全基因合成，得到质粒pUC57-UGDH(Hs)。以质粒pUC57-UGDH(Hs)为模板，利用引物对UGDH(Hs)-F-EcoRI&UGDH(Hs)-R-NotI进行扩增。扩增体系为：PrimerSTAR HS Buffer(2×)12.5μL、dNTP(2.5mM)2μL、质粒模板1μL、引物(5μM)各2μL、PrimerSTAR HS高保真DNA聚合酶0.25μL、补充双蒸水至25μL。扩增条件为98℃预变性5分钟；98℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到5`端带有EcoRI同时3`端带有NotI酶切位点的EcoRI-UGDH(Hs)-NotI的片段。

回收得到的DNA片段和质粒pESC-TRP利用EcoRI和NotI两种限制性内切酶进行酶切反应。酶切反应体系为：限制性内切酶EcoRI和NotI各0.25μL、回收产物19.5μL。酶切条件为37℃反应2小时、80℃反应20分钟使酶失活。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到经EcoRI和NotI双酶切的DNA片段和酶切后的质粒。

将连接产物通过化学法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明在pESC-TRP载体上分别插入了正确的目的基因UGDH(Hs)，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:4。

将质粒pESC-TRP-UGDH(Hs)和质粒pESC-URA-UGT1A3通过醋酸锂法转化到能够生产GA的酿酒酵母(公开专利201610965315.9)感受态细胞，涂布于缺少尿苷酸和色氨酸、含有2％葡萄糖的基础培养基SD-URA-TRP平板上，培养36小时候筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明酿酒酵母工程菌GL01中包含质粒pESC-TRP-UGDH(Hs)和pESC-URA-UGT1A3。

从平板上挑选GL01单菌落，接种于含有2％葡萄糖的SD-URA-TRP基础培养基，30℃、200rpm、培养至OD₆₀₀达到0.6；6000rpm离心10分钟去除上清、将菌体更换至含有3％半乳糖的SD-URA-TRP基础培养基，30℃、200rpm、发酵7天，诱导工程菌表达糖基转移酶蛋白UGT1A3和UDP-葡萄糖脱氢酶UGDH(Hs)。发酵产物经乙酸乙酯萃取后，蒸干并用甲醇复溶，经LCMS检测，证明工程菌GL01能够生产GAMG和GL。

此外，大肠杆菌源的UGDH(Ec)是通过从大肠杆菌K-12的基因组中克隆得到。使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌K-12的基因组，利用引物对UGDH(Ec)-F-NotI&UGDH(Ec)-R-ClaI进行扩增。扩增体系为：PrimerSTAR HS Buffer(2×)12.5μL、dNTP(2.5mM)2μL、质粒模板1μL、引物(5μM)各2μL、PrimerSTAR HS高保真DNA聚合酶0.25μL、补充双蒸水至25μL。扩增条件为98℃预变性5分钟；98℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到5`端带有NotI同时3`端带有ClaI酶切位点的NotI-UGDH(Ec)-ClaI的片段。

回收得到的DNA片段和质粒pESC-TRP利用NotI和ClaI两种限制性内切酶进行酶切反应。酶切反应体系为：限制性内切酶NotI和ClaI各0.25μL、回收产物19.5μL。酶切条件为37℃反应2小时、80℃反应20分钟使酶失活。通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到经NotI和ClaI双酶切的DNA片段和酶切后的质粒。

将连接产物通过化学法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明在pESC-TRP载体上分别插入了正确的目的基因UGDH(Ec)，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:5，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:6。

将质粒pESC-TRP-UGDH(Ec)和质粒pESC-URA-UGT1A3通过醋酸锂法转化到能够生产GA的酿酒酵母(公开专利201610965315.9)感受态细胞，涂布于缺少尿苷酸和色氨酸、含有2％葡萄糖的基础培

养基SD-URA-TRP平板上，培养36小时候筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明酿酒酵母工程菌GL02中包含质粒pESC-TRP-UGDH(Ec)和pESC-URA-UGT1A3。

从平板上挑选GL02单菌落，接种于含有2％葡萄糖的SD-URA-TRP基础培养基，30℃、200rpm、培养至OD₆₀₀达到0.6；6000rpm离心10分钟去除上清、将菌体更换至含有3％半乳糖的SD-URA-TRP基础培养基，30℃、200rpm、发酵7天，诱导工程菌表达糖基转移酶蛋白UGT1A3和UDP-葡萄糖脱氢酶UGDH(Ec)。发酵产物经乙酸乙酯萃取后，蒸干并用甲醇复溶，经LCMS检测，证明工程菌GL02能够生产GAMG和GL。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种糖基转移酶在合成甘草酸中的应用

<130> 20170611

<140> 201710824182.8

<141> 2017-09-13

<150> 2017108241828

<151> 2017-09-13

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggctaccg gtttgcaagt tccattgcct tggttggcta ccggcttgtt gttgttgttg 60

tccgttcaac cttgggccga atcaggtaaa gtcttggtgg ttccaatcga cggttctcat 120

tggttgagca tgagggaagt cttgagggaa ttgcacgcta gaggtcacca agcagttgtt 180

ttgaccccag aggtcaacat gcacatcaag gaggagaact tcttcacctt gaccacctac 240

gctatctctt ggacccaaga cgagttcgat agacacgtct tgggtcatac ccagttgtac 300

ttcgagaccg agcacttcct aaagaagttc ttcaggtcca tggccatgtt gaacaacatg 360

tccttggtct accacaggtc ttgcgttgaa ttgttgcaca acgaggcctt gatcaggcat 420

ttgaacgcta cttccttcga cgtcgtcttg acagatccag ttaacctttg cgccgcagtt 480

ttggctaagt acttgtccat cccaaccgtc ttcttcttga ggaacatccc ttgcgacttg 540

gacttcaagg gtactcagtg tccaaaccca tcctcttaca tcccaaggtt gttgaccacc 600

aactccgatc acatgacctt catgcagagg gtgaagaaca tgttgtaccc attggccttg 660

tcctacattt gccacgcttt ttccgctcca tacgcttcct tggcttccga attgttccag 720

agggaagtct ccgtcgttga tatcttgtcc cacgcttccg tttggttgtt cagaggagat 780

ttcgtcatgg actacccaag gccaatcatg ccaaacatgg tcttcatcgg cggcatcaat 840

tgcgctaaca gaaagccatt gtcccaggaa tttgaagcct acatcaacgc ttcaggcgaa 900

cacggtatcg ttgttttctc cttgggttcc atggtctccg aaatcccaga gaagaaggct 960

atggctattg ccgacgcttt gggtaagatc ccacaaacag tcctttggag gtacacaggt 1020

actagaccat ccaacttggc caacaacacc atcctagtca agtggttgcc acagaacgac 1080

ttgttgggtc atcctatgac cagggctttc attactcacg caggttctca cggcgtttac 1140

gaatccattt gcaacggcgt tccaatggtc atgatgccac tattcggcga tcagatggac 1200

aacgccaaga gaatggaaac taaaggcgcc ggcgttactt tgaacgtctt ggagatgacc 1260

tccgaagact tggaaaacgc tttgaaggcc gtcatcaacg acaagtccta caaggagaac 1320

atcatgaggt tgagctcctt gcacaaggac agaccagttg aaccattgga cttggccgtt 1380

ttctgggtgg agttcgtcat gaggcacaag ggtgctccac atttaagacc agcagctcac 1440

gacttgactt ggtatcaata ccactccttg gacgtcatcg gtttcttgtt ggccgttgtt 1500

ttgaccgtcg ccttcatcac cttcaagtgt tgcgcttacg gttacaggaa gtgtttgggt 1560

aagaagggca gggtcaagaa ggctcataag tccaagaccc attaa 1605

<210> 2

<211> 534

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Thr Gly Leu Gln Val Pro Leu Pro Trp Leu Ala Thr Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Ser Val Gln Pro Trp Ala Glu Ser Gly Lys Val Leu

20 25 30

Val Val Pro Ile Asp Gly Ser His Trp Leu Ser Met Arg Glu Val Leu

35 40 45

Arg Glu Leu His Ala Arg Gly His Gln Ala Val Val Leu Thr Pro Glu

50 55 60

Val Asn Met His Ile Lys Glu Glu Asn Phe Phe Thr Leu Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Ile Ser Trp Thr Gln Asp Glu Phe Asp Arg His Val Leu Gly His

85 90 95

Thr Gln Leu Tyr Phe Glu Thr Glu His Phe Leu Lys Lys Phe Phe Arg

100 105 110

Ser Met Ala Met Leu Asn Asn Met Ser Leu Val Tyr His Arg Ser Cys

115 120 125

Val Glu Leu Leu His Asn Glu Ala Leu Ile Arg His Leu Asn Ala Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Val Val Leu Thr Asp Pro Val Asn Leu Cys Ala Ala Val

145 150 155 160

Leu Ala Lys Tyr Leu Ser Ile Pro Thr Val Phe Phe Leu Arg Asn Ile

165 170 175

Pro Cys Asp Leu Asp Phe Lys Gly Thr Gln Cys Pro Asn Pro Ser Ser

180 185 190

Tyr Ile Pro Arg Leu Leu Thr Thr Asn Ser Asp His Met Thr Phe Met

195 200 205

Gln Arg Val Lys Asn Met Leu Tyr Pro Leu Ala Leu Ser Tyr Ile Cys

210 215 220

His Ala Phe Ser Ala Pro Tyr Ala Ser Leu Ala Ser Glu Leu Phe Gln

225 230 235 240

Arg Glu Val Ser Val Val Asp Ile Leu Ser His Ala Ser Val Trp Leu

245 250 255

Phe Arg Gly Asp Phe Val Met Asp Tyr Pro Arg Pro Ile Met Pro Asn

260 265 270

Met Val Phe Ile Gly Gly Ile Asn Cys Ala Asn Arg Lys Pro Leu Ser

275 280 285

Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ile Asn Ala Ser Gly Glu His Gly Ile Val

290 295 300

Val Phe Ser Leu Gly Ser Met Val Ser Glu Ile Pro Glu Lys Lys Ala

305 310 315 320

Met Ala Ile Ala Asp Ala Leu Gly Lys Ile Pro Gln Thr Val Leu Trp

325 330 335

Arg Tyr Thr Gly Thr Arg Pro Ser Asn Leu Ala Asn Asn Thr Ile Leu

340 345 350

Val Lys Trp Leu Pro Gln Asn Asp Leu Leu Gly His Pro Met Thr Arg

355 360 365

Ala Phe Ile Thr His Ala Gly Ser His Gly Val Tyr Glu Ser Ile Cys

370 375 380

Asn Gly Val Pro Met Val Met Met Pro Leu Phe Gly Asp Gln Met Asp

385 390 395 400

Asn Ala Lys Arg Met Glu Thr Lys Gly Ala Gly Val Thr Leu Asn Val

405 410 415

Leu Glu Met Thr Ser Glu Asp Leu Glu Asn Ala Leu Lys Ala Val Ile

420 425 430

Asn Asp Lys Ser Tyr Lys Glu Asn Ile Met Arg Leu Ser Ser Leu His

435 440 445

Lys Asp Arg Pro Val Glu Pro Leu Asp Leu Ala Val Phe Trp Val Glu

450 455 460

Phe Val Met Arg His Lys Gly Ala Pro His Leu Arg Pro Ala Ala His

465 470 475 480

Asp Leu Thr Trp Tyr Gln Tyr His Ser Leu Asp Val Ile Gly Phe Leu

485 490 495

Leu Ala Val Val Leu Thr Val Ala Phe Ile Thr Phe Lys Cys Cys Ala

500 505 510

Tyr Gly Tyr Arg Lys Cys Leu Gly Lys Lys Gly Arg Val Lys Lys Ala

515 520 525

His Lys Ser Lys Thr His

530

<210> 3

<211> 1485

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

atgttcgaga tcaagaagat ttgttgcatt ggagcaggtt acgttggagg tccaacttgt 60

tcagttattg cccatatgtg cccagaaatc agagttaccg ttgttgacgt caacgaatct 120

agaatcaacg cttggaactc tccaactttg ccaatatatg aaccaggctt gaaggaagtt 180

gtcgaatctt gtagaggcaa gaacttgttc ttctccacca acattgacga cgccattaaa 240

gaagccgatt tggttttcat ctccgttaac accccaacta aaacttacgg catgggtaaa 300

ggtagagcag cagacttgaa atacatcgaa gcatgtgcta gaagaatcgt tcaaaactct 360

aacggctaca agatcgttac cgaaaagtct acagttccag ttagagcagc agaatctatc 420

agaagaatct tcgacgctaa caccaaacca aacttgaact tgcaggtctt gtccaatcca 480

gaatttttgg cagaaggtac tgctattaag gacttgaaga acccagacag agtcttgatt 540

ggaggagacg aaactccaga aggtcaaaga gcagttcaag cactttgcgc agtttacgaa 600

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ttggcagcta acgcattttt ggctcaaaga atctcctcca ttaactccat ttccgctttg 720

tgcgaagcta caggagcaga cgttgaagaa gttgctacag ctattggaat ggaccaaaga 780

atcggtaaca agttcttgaa ggcttccgtt ggttttggcg gttcttgttt tcaaaaggac 840

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caacaagtca tcgacatgaa cgactaccaa aggagaagat tcgcttccag aatcattgat 960

tctttgttca acaccgttac cgataagaag atcgccatat tgggtttcgc tttcaagaag 1020

gatacaggcg atactagaga atcttcttcc atctacatct ccaaatactt gatggacgaa 1080

ggcgctcatt tgcatatata tgatccaaag gtcccaagag aacaaatcgt tgttgacttg 1140

tctcatccag gagtttcaga agacgatcaa gtttccagat tggtcaccat ttccaaagat 1200

ccatacgaag catgtgacgg agctcacgca gttgttattt gtaccgagtg ggatatgttc 1260

aaggaattgg actacgagag gattcacaag aagatgttga agccagcctt catttttgac 1320

ggtagaagag tcttggacgg tttacataac gaattgcaga ccatcggttt ccaaatcgaa 1380

actatcggca agaaggtttc ctctaagaga ataccatacg ctccatcagg agaaattcca 1440

aagttcagct tgcaagatcc accaaacaag aagccaaagg tctaa 1485

<210> 4

<211> 494

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Phe Glu Ile Lys Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly

1 5 10 15

Gly Pro Thr Cys Ser Val Ile Ala His Met Cys Pro Glu Ile Arg Val

20 25 30

Thr Val Val Asp Val Asn Glu Ser Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Pro

35 40 45

Thr Leu Pro Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Lys Glu Val Val Glu Ser Cys

50 55 60

Arg Gly Lys Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asn Ile Asp Asp Ala Ile Lys

65 70 75 80

Glu Ala Asp Leu Val Phe Ile Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Tyr

85 90 95

Gly Met Gly Lys Gly Arg Ala Ala Asp Leu Lys Tyr Ile Glu Ala Cys

100 105 110

Ala Arg Arg Ile Val Gln Asn Ser Asn Gly Tyr Lys Ile Val Thr Glu

115 120 125

Lys Ser Thr Val Pro Val Arg Ala Ala Glu Ser Ile Arg Arg Ile Phe

130 135 140

Asp Ala Asn Thr Lys Pro Asn Leu Asn Leu Gln Val Leu Ser Asn Pro

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Glu Phe Leu Ala Glu Gly Thr Ala Ile Lys Asp Leu Lys Asn Pro Asp

165 170 175

Arg Val Leu Ile Gly Gly Asp Glu Thr Pro Glu Gly Gln Arg Ala Val

180 185 190

Gln Ala Leu Cys Ala Val Tyr Glu His Trp Val Pro Arg Glu Lys Ile

195 200 205

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210 215 220

Ala Phe Leu Ala Gln Arg Ile Ser Ser Ile Asn Ser Ile Ser Ala Leu

225 230 235 240

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245 250 255

Met Asp Gln Arg Ile Gly Asn Lys Phe Leu Lys Ala Ser Val Gly Phe

260 265 270

Gly Gly Ser Cys Phe Gln Lys Asp Val Leu Asn Leu Val Tyr Leu Cys

275 280 285

Glu Ala Leu Asn Leu Pro Glu Val Ala Arg Tyr Trp Gln Gln Val Ile

290 295 300

Asp Met Asn Asp Tyr Gln Arg Arg Arg Phe Ala Ser Arg Ile Ile Asp

305 310 315 320

Ser Leu Phe Asn Thr Val Thr Asp Lys Lys Ile Ala Ile Leu Gly Phe

325 330 335

Ala Phe Lys Lys Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Ser Ser Ser Ile Tyr

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355 360 365

Pro Lys Val Pro Arg Glu Gln Ile Val Val Asp Leu Ser His Pro Gly

370 375 380

Val Ser Glu Asp Asp Gln Val Ser Arg Leu Val Thr Ile Ser Lys Asp

385 390 395 400

Pro Tyr Glu Ala Cys Asp Gly Ala His Ala Val Val Ile Cys Thr Glu

405 410 415

Trp Asp Met Phe Lys Glu Leu Asp Tyr Glu Arg Ile His Lys Lys Met

420 425 430

Leu Lys Pro Ala Phe Ile Phe Asp Gly Arg Arg Val Leu Asp Gly Leu

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His Asn Glu Leu Gln Thr Ile Gly Phe Gln Ile Glu Thr Ile Gly Lys

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<210> 5

<211> 1167

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

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tttaatgcca cattagataa aaatgaagcc taccgggatg ctgattatgt catcatcgcc 240

actccaaccg actatgatcc taaaactaat tatttcaata catccagtgt agaatcagta 300

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gaatttctcc gtgagggtaa agccctttac gataatctcc atccttcacg tattgtcatc 480

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caaaatatcc cgatgctgtt taccgactcc actgaagcag aagcgattaa actttttgca 600

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cattacaaca atccgtcgtt tggttatggt ggttattgtc tgccgaaaga taccaagcag 780

ttactggcga actaccagtc tgtgccgaat aacctgatct cggcaattgt cgatgctaac 840

cgcacgcgta aagattttat tgccgatgcc attttgtcac gcaagccgca agtggtgggt 900

atttatcgtc tgattatgaa gagcggttca gataacttcc gtgcgtcttc tattcagggg 960

attatgaaac gtatcaaggc gaaaggtgtt gaagtgatca tctacgagcc agtgatgaaa 1020

gaagactcat tcttcaactc tcgcctggaa cgtgatctcg ccaccttcaa acaacaagcc 1080

gacgtcatta tctctaaccg aatggcagaa gagcttaagg atgtggcaga taaggtatac 1140

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<210> 6

<211> 388

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Lys Ile Thr Ile Ser Gly Thr Gly Tyr Val Gly Leu Ser Asn Gly

1 5 10 15

Leu Leu Ile Ala Gln Asn His Glu Val Val Ala Leu Asp Ile Leu Pro

20 25 30

Ser Arg Val Ala Met Leu Asn Asp Arg Ile Ser Pro Ile Val Asp Lys

35 40 45

Glu Ile Gln Gln Phe Leu Gln Ser Asp Lys Ile His Phe Asn Ala Thr

50 55 60

Leu Asp Lys Asn Glu Ala Tyr Arg Asp Ala Asp Tyr Val Ile Ile Ala

65 70 75 80

Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Pro Lys Thr Asn Tyr Phe Asn Thr Ser Ser

85 90 95

Val Glu Ser Val Ile Lys Asp Val Val Glu Ile Asn Pro Tyr Ala Val

100 105 110

Met Val Ile Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Phe Thr Ala Ala Met His

115 120 125

Lys Lys Tyr Arg Thr Glu Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg

130 135 140

Glu Gly Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu His Pro Ser Arg Ile Val Ile

145 150 155 160

Gly Glu Arg Ser Glu Arg Ala Glu Arg Phe Ala Ala Leu Leu Gln Glu

165 170 175

Gly Ala Ile Lys Gln Asn Ile Pro Met Leu Phe Thr Asp Ser Thr Glu

180 185 190

Ala Glu Ala Ile Lys Leu Phe Ala Asn Thr Tyr Leu Ala Met Arg Val

195 200 205

Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Ser Tyr Ala Glu Ser Leu Gly Leu Asn

210 215 220

Ser Arg Gln Ile Ile Glu Gly Val Cys Leu Asp Pro Arg Ile Gly Asn

225 230 235 240

His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val Pro Asn Asn Leu

260 265 270

Ile Ser Ala Ile Val Asp Ala Asn Arg Thr Arg Lys Asp Phe Ile Ala

275 280 285

Asp Ala Ile Leu Ser Arg Lys Pro Gln Val Val Gly Ile Tyr Arg Leu

290 295 300

Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ala Ser Ser Ile Gln Gly

305 310 315 320

Ile Met Lys Arg Ile Lys Ala Lys Gly Val Glu Val Ile Ile Tyr Glu

325 330 335

Pro Val Met Lys Glu Asp Ser Phe Phe Asn Ser Arg Leu Glu Arg Asp

340 345 350

Leu Ala Thr Phe Lys Gln Gln Ala Asp Val Ile Ile Ser Asn Arg Met

355 360 365

Ala Glu Glu Leu Lys Asp Val Ala Asp Lys Val Tyr Thr Arg Asp Leu

370 375 380

Phe Gly Ser Asp

385

<210> 7

<211> 455

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 7

agtacggatt agaagccgcc gagcgggtga cagccctccg aaggaagact ctcctccgtg 60

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aacctggccc cacaaacctt caaatgaacg aatcaaatta acaaccatag gatgataatg 240

cgattagttt tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc 300

tattaacaga tatataaatg caaaaactgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt 360

ttcggtttgt attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa attgttaata 420

tacctctata ctttaacgtc aaggagaaaa aaccc 455

<210> 8

<211> 212

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 8

tcaatatagc aatgagcagt taagcgtatt actgaaagtt ccaaagagaa ggttttttta 60

ggctaagata atggggctct ttacatttcc acaacatata agtaagatta gatatggata 120

tgtatatgga tatgtatatg gtggtaatgc catgtaatat gattattaaa cttctttgcg 180

tccatccaaa aaaaaagtaa gaatttttga aa 212

<210> 9

<211> 165

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 9

cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat 60

acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt 120

tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat agcatgaggt cgctc 165

<210> 10

<211> 229

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 10

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacg 229

<210> 11

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

atggctgttg agtctcaagg aggtagacca ttggtcttgg gcctattgtt gtgcgtcttg 60

ggtccagttg tttctcacgc aggtaaaatt ttgttgatcc cagtggacgg ttcacattgg 120

ttgagcatgt tgggcgccat acaacagttg cagcagagag gtcacgaaat cgttgtcttg 180

gctccagacg cttctttgta catcagagac ggcgctttct acaccttgaa gacttaccca 240

gtcccattcc aaagagagga cgtgaaggaa tccttcgttt ccttgggtca caacgtcttc 300

gagaacgatt ccttcttgca gagggtcatc aagacctaca agaagatcaa gaaggactcc 360

gctatgttgt tgtccggttg ttcccacttg ttgcacaaca aggagttgat ggccagcttg 420

gccgaatctt ctttcgacgt catgttgacc gacccattct tgccttgttc cccaatcgtt 480

gctcagtact tgtccttgcc aaccgttttc ttcttgcacg ctttgccttg ctccttggaa 540

tttgaagcta cccagtgtcc aaacccattc tcctacgttc caagaccatt gtcctcccat 600

tccgatcata tgaccttctt gcagagggtg aagaacatgt tgatcgcctt ctcccagaac 660

ttcttgtgcg acgtcgttta ctccccatac gctactttgg cctccgaatt tttgcagaga 720

gaggttaccg tccaagactt gttgtcttcc gcttccgttt ggttgttcag atccgacttc 780

gttaaggact acccaaggcc aatcatgcca aacatggtct tcgtcggcgg tatcaattgc 840

ttgcaccaaa acccattgtc ccaggagttc gaagcctaca ttaacgcttc aggcgaacac 900

ggtatcgtcg ttttctcctt gggttccatg gtctccgaaa tcccagaaaa gaaggccatg 960

gctattgcag acgctttggg taagatccca caaaccgtcc tttggagata caccggtact 1020

agaccatcca acttggccaa caacaccatc ctagtcaagt ggttgccaca gaacgacttg 1080

ttgggtcacc ctatgaccag agctttcatc actcacgcag gttctcacgg agtttacgaa 1140

tccatttgca acggcgtccc aatggttatg atgccactat tcggcgacca aatggacaac 1200

gctaagagaa tggaaaccaa aggcgcaggt gttaccttga acgtgttgga gatgacctcc 1260

gaagacttgg aaaacgcttt gaaggccgtc atcaacgaca agtcctacaa ggagaacatc 1320

atgaggttga gctccttgca caaggacaga ccagttgaac cattggactt ggccgtcttt 1380

tgggtggaat ttgttatgag acataagggc gctccacatt tgagaccagc agctcacgat 1440

ttgacttggt atcaatacca ctccttggac gtcatcggtt tcttgttggc cgttgtcttg 1500

accgttgcct tcatcacctt caagtgttgc gcttacggtt acaggaagtg cttgggtaag 1560

aagggtaggg tcaagaaggc tcataagtcc aagactcact aa 1602

<210> 12

<211> 533

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Met Ala Val Glu Ser Gln Gly Gly Arg Pro Leu Val Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Cys Val Leu Gly Pro Val Val Ser His Ala Gly Lys Ile Leu Leu

20 25 30

Ile Pro Val Asp Gly Ser His Trp Leu Ser Met Leu Gly Ala Ile Gln

35 40 45

Gln Leu Gln Gln Arg Gly His Glu Ile Val Val Leu Ala Pro Asp Ala

50 55 60

Ser Leu Tyr Ile Arg Asp Gly Ala Phe Tyr Thr Leu Lys Thr Tyr Pro

65 70 75 80

Val Pro Phe Gln Arg Glu Asp Val Lys Glu Ser Phe Val Ser Leu Gly

85 90 95

His Asn Val Phe Glu Asn Asp Ser Phe Leu Gln Arg Val Ile Lys Thr

100 105 110

Tyr Lys Lys Ile Lys Lys Asp Ser Ala Met Leu Leu Ser Gly Cys Ser

115 120 125

His Leu Leu His Asn Lys Glu Leu Met Ala Ser Leu Ala Glu Ser Ser

130 135 140

Phe Asp Val Met Leu Thr Asp Pro Phe Leu Pro Cys Ser Pro Ile Val

145 150 155 160

Ala Gln Tyr Leu Ser Leu Pro Thr Val Phe Phe Leu His Ala Leu Pro

165 170 175

Cys Ser Leu Glu Phe Glu Ala Thr Gln Cys Pro Asn Pro Phe Ser Tyr

180 185 190

Val Pro Arg Pro Leu Ser Ser His Ser Asp His Met Thr Phe Leu Gln

195 200 205

Arg Val Lys Asn Met Leu Ile Ala Phe Ser Gln Asn Phe Leu Cys Asp

210 215 220

Val Val Tyr Ser Pro Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Glu Phe Leu Gln Arg

225 230 235 240

Glu Val Thr Val Gln Asp Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Trp Leu Phe

245 250 255

Arg Ser Asp Phe Val Lys Asp Tyr Pro Arg Pro Ile Met Pro Asn Met

260 265 270

Val Phe Val Gly Gly Ile Asn Cys Leu His Gln Asn Pro Leu Ser Gln

275 280 285

Glu Phe Glu Ala Tyr Ile Asn Ala Ser Gly Glu His Gly Ile Val Val

290 295 300

Phe Ser Leu Gly Ser Met Val Ser Glu Ile Pro Glu Lys Lys Ala Met

305 310 315 320

Ala Ile Ala Asp Ala Leu Gly Lys Ile Pro Gln Thr Val Leu Trp Arg

325 330 335

Tyr Thr Gly Thr Arg Pro Ser Asn Leu Ala Asn Asn Thr Ile Leu Val

340 345 350

Lys Trp Leu Pro Gln Asn Asp Leu Leu Gly His Pro Met Thr Arg Ala

355 360 365

Phe Ile Thr His Ala Gly Ser His Gly Val Tyr Glu Ser Ile Cys Asn

370 375 380

Gly Val Pro Met Val Met Met Pro Leu Phe Gly Asp Gln Met Asp Asn

385 390 395 400

Ala Lys Arg Met Glu Thr Lys Gly Ala Gly Val Thr Leu Asn Val Leu

405 410 415

Glu Met Thr Ser Glu Asp Leu Glu Asn Ala Leu Lys Ala Val Ile Asn

420 425 430

Asp Lys Ser Tyr Lys Glu Asn Ile Met Arg Leu Ser Ser Leu His Lys

435 440 445

Asp Arg Pro Val Glu Pro Leu Asp Leu Ala Val Phe Trp Val Glu Phe

450 455 460

Val Met Arg His Lys Gly Ala Pro His Leu Arg Pro Ala Ala His Asp

465 470 475 480

Leu Thr Trp Tyr Gln Tyr His Ser Leu Asp Val Ile Gly Phe Leu Leu

485 490 495

Ala Val Val Leu Thr Val Ala Phe Ile Thr Phe Lys Cys Cys Ala Tyr

500 505 510

Gly Tyr Arg Lys Cys Leu Gly Lys Lys Gly Arg Val Lys Lys Ala His

515 520 525

Lys Ser Lys Thr His

530

<210> 13

<211> 1584

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

atgctaaaca acttgttgtt gttctccttg caaatttctt tgattggtac tactttgggc 60

ggtaacgtct tgatttggcc tatggaaggc tcccattggt tgaacgtcaa gatcatcatc 120

gacgagttga tcaagaagga gcacaacgtc accgttttgg ttgcttcagg cgctttgttc 180

atcactccaa cttccaaccc atccttgacc ttcgaaattt ataaggtccc attcggcaag 240

gaaaggatcg aaggcgtcat caaggacttc gtcttgactt ggttggagaa caggccatca 300

ccatccacca tttggaggtt ctaccaggaa atggccaagg tcatcaagga cttccacatg 360

gtttcccagg aaatttgcga cggcgttttg aagaaccagc agttgatggc caagttgaag 420

aagtccaagt tcgaggtctt ggtttccgac ccagtttttc cttgcggaga tatcgttgcc 480

ttgaagttgg gcatcccatt catgtactcc ttgaggttct ccccagcttc taccgttgaa 540

aagcattgcg gtaaggtccc atatccacca tcctacgttc cagcagtttt gtccgagttg 600

accgatcaaa tgtccttcac cgacaggatc aggaacttca tctcctacca cttgcaggac 660

tacatgttcg agaccctttg gaagagttgg gactcctact actccaaggc tttgggtaga 720

ccaaccactc tttgcgaaac catgggtaag gccgagattt ggttgatcag gacctattgg 780

gatttcgagt tcccaaggcc atacttgcca aacttcgagt tcgttggcgg tttgcattgc 840

aagccagcta agccattgcc aaaggagatg gaggagttca tccaaagctc cggtaagaac 900

ggcgttgttg ttttctcctt gggttccatg gtcaagaacc ttaccgagga aaaggccaac 960

ttgatcgctt ccgctttggc tcaaatccca cagaaggtcc tttggaggta caagggcaag 1020

aagccagcta ctttgggtaa caacacccag ctattcgatt ggattccaca gaacgacttg 1080

ttgggtcacc caaagaccaa ggctttcatc actcacggcg gtactaacgg tatctacgaa 1140

gctatttacc acggcgttcc aatggttgga gttccaatgt tcgccgatca accagacaac 1200

attgctcata tgaaggctaa aggcgccgca gttgaggtca acttgaacac catgacctcc 1260

gttgacttgt tgtccgcttt gagaaccgtc atcaacgagc catcctacaa ggagaacgct 1320

atgaggttgt ccagaataca tcacgaccaa ccagttaagc cattggacag agccgtcttt 1380

tggatcgaat ttgttatgag gcacaaaggc gctaagcatt tgagagtcgc agctcacgat 1440

ttgacttggt tccagtacca ctccttggac gtcatcggtt tcttgttggt ttgcgtcacc 1500

accgctatct tcttggtcat ccagtgttgc ttgttcagtt gccagaagtt cggcaagatc 1560

ggcaagaaga agaagaggga gtaa 1584

<210> 14

<211> 527

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Met Leu Asn Asn Leu Leu Leu Phe Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ile Gly

1 5 10 15

Thr Thr Leu Gly Gly Asn Val Leu Ile Trp Pro Met Glu Gly Ser His

20 25 30

Trp Leu Asn Val Lys Ile Ile Ile Asp Glu Leu Ile Lys Lys Glu His

35 40 45

Asn Val Thr Val Leu Val Ala Ser Gly Ala Leu Phe Ile Thr Pro Thr

50 55 60

Ser Asn Pro Ser Leu Thr Phe Glu Ile Tyr Lys Val Pro Phe Gly Lys

65 70 75 80

Glu Arg Ile Glu Gly Val Ile Lys Asp Phe Val Leu Thr Trp Leu Glu

85 90 95

Asn Arg Pro Ser Pro Ser Thr Ile Trp Arg Phe Tyr Gln Glu Met Ala

100 105 110

Lys Val Ile Lys Asp Phe His Met Val Ser Gln Glu Ile Cys Asp Gly

115 120 125

Val Leu Lys Asn Gln Gln Leu Met Ala Lys Leu Lys Lys Ser Lys Phe

130 135 140

Glu Val Leu Val Ser Asp Pro Val Phe Pro Cys Gly Asp Ile Val Ala

145 150 155 160

Leu Lys Leu Gly Ile Pro Phe Met Tyr Ser Leu Arg Phe Ser Pro Ala

165 170 175

Ser Thr Val Glu Lys His Cys Gly Lys Val Pro Tyr Pro Pro Ser Tyr

180 185 190

Val Pro Ala Val Leu Ser Glu Leu Thr Asp Gln Met Ser Phe Thr Asp

195 200 205

Arg Ile Arg Asn Phe Ile Ser Tyr His Leu Gln Asp Tyr Met Phe Glu

210 215 220

Thr Leu Trp Lys Ser Trp Asp Ser Tyr Tyr Ser Lys Ala Leu Gly Arg

225 230 235 240

Pro Thr Thr Leu Cys Glu Thr Met Gly Lys Ala Glu Ile Trp Leu Ile

245 250 255

Arg Thr Tyr Trp Asp Phe Glu Phe Pro Arg Pro Tyr Leu Pro Asn Phe

260 265 270

Glu Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala Lys Pro Leu Pro Lys

275 280 285

Glu Met Glu Glu Phe Ile Gln Ser Ser Gly Lys Asn Gly Val Val Val

290 295 300

Phe Ser Leu Gly Ser Met Val Lys Asn Leu Thr Glu Glu Lys Ala Asn

305 310 315 320

Leu Ile Ala Ser Ala Leu Ala Gln Ile Pro Gln Lys Val Leu Trp Arg

325 330 335

Tyr Lys Gly Lys Lys Pro Ala Thr Leu Gly Asn Asn Thr Gln Leu Phe

340 345 350

Asp Trp Ile Pro Gln Asn Asp Leu Leu Gly His Pro Lys Thr Lys Ala

355 360 365

Phe Ile Thr His Gly Gly Thr Asn Gly Ile Tyr Glu Ala Ile Tyr His

370 375 380

Gly Val Pro Met Val Gly Val Pro Met Phe Ala Asp Gln Pro Asp Asn

385 390 395 400

Ile Ala His Met Lys Ala Lys Gly Ala Ala Val Glu Val Asn Leu Asn

405 410 415

Thr Met Thr Ser Val Asp Leu Leu Ser Ala Leu Arg Thr Val Ile Asn

420 425 430

Glu Pro Ser Tyr Lys Glu Asn Ala Met Arg Leu Ser Arg Ile His His

435 440 445

Asp Gln Pro Val Lys Pro Leu Asp Arg Ala Val Phe Trp Ile Glu Phe

450 455 460

Val Met Arg His Lys Gly Ala Lys His Leu Arg Val Ala Ala His Asp

465 470 475 480

Leu Thr Trp Phe Gln Tyr His Ser Leu Asp Val Ile Gly Phe Leu Leu

485 490 495

Val Cys Val Thr Thr Ala Ile Phe Leu Val Ile Gln Cys Cys Leu Phe

500 505 510

Ser Cys Gln Lys Phe Gly Lys Ile Gly Lys Lys Lys Lys Arg Glu

515 520 525

Claims

1.一种微生物体内全合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid 3-O-mono-β-glucuronide,GAMG)和甘草酸(Glycyrrhizin,GL)的方法，其特征在于，以可生产甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)的工程菌为基础，导入糖基转移酶编码基因UGT1A3和UDP-葡萄糖脱氢酶UGDH的表达盒，得到重组菌，发酵培养获得目标产物GAMG和GL；

所述糖基转移酶是来源于人Homo sapiens的UGT1A3基因编码的糖基转移酶，命名为UGT1A3蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQNO:1，氨基酸序列为SEQNO:2；

所述UDP-葡萄糖脱氢酶为来源于人Homo sapiens的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH或来源于大肠杆菌Escherichia coli的UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH；

所述糖基转移酶编码基因UGT1A3的表达盒具体包括启动子P_GAL1、糖基转移酶编码基因UGT1A3和终止子T_ADH1；

所述UDP-葡萄糖脱氢酶UGDH的表达盒具体包括启动子P_GAL10、UDP-葡萄糖脱氢酶基因UGDH和终止子T_CYC1；

所述工程菌为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。