CN1340097A

CN1340097A - 从蔗糖酶促产生二果糖二酐iv和相关的酶,以及编码这些酶的基因

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Publication number: CN1340097A
Application number: CN00803749A
Authority: CN
Inventors: 李尚基; 宋基榜; 金哲镐; 俞垠子; 李用福
Original assignee: Real Life Engineering Co; Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Real Life Engineering Co; Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2002-03-13
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: EP1141236A4; AU1419701A; KR20010037651A; US6841368B1; JP2003512045A; KR100380970B1; EP1141236A1; CN1192100C; WO2001029185A1

Abstract

公开了从糖生产二果糖二酐IV。在室温下或低于室温,pH3.0－7.0的酸性缓冲液中,衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶存在下,使糖溶液反应产生左聚糖。通过培养大肠杆菌BL21(DE3)/pEL12(KCTC8661),收集并匀浆细胞,从细胞匀浆中分离左聚蔗糖酶来制备该酶。从反应溶液中纯化得到左聚糖,使其在25－50℃,pH3.0－7.0的酸性缓冲液中,左聚糖果糖转移酶的存在下反应3－10小时,以产生二果糖二酐IV。从大肠杆菌JUD81(KCTC 0877BP)获得左聚糖果糖转移酶。还公开了编码左聚糖果糖转移酶的编码基因和携带该基因的表达载体pUDAF81。

Description

从蔗糖酶促产生二果糖二酐IV和相关的酶，以及编码这些酶的基因

技术领域

本发明涉及从蔗糖酶促生产二果糖二酐IV(下文称作“DFA IV”)。更具体的，本发明涉及参与从糖产生DFA IV的酶及其用途。另外，本发明涉及在DFA IV产生期间中间产物的产生。本发明还涉及编码这些酶的新基因，携带该基因的载体，和用表达载体转化的细胞。

背景技术

Jackson等于1929年，在用硫酸处理菊粉来制备果糖糖浆时，通过分析产生的副产品首先发现了二果糖二酐。二果糖二酐是一种由两个果糖残基组成的环形二糖，其中各残基的还原性末端和相对残基的非还原性羟基连接。迄今为止已发现了5种二果糖二酐，称作DFA I-DFA V。其中，发现DFAII和V只能化学合成而其它可用酶促产生。DFA I和III通过菊粉果糖转移酶的作用从菊粉产生；而DFAIV通过左聚糖果糖转移酶的作用从左聚糖产生。

二果糖二酐是一种非消化性、非发酵性亚糖，它在动物体内不消化。除了可用作低卡路里甜味剂外，该亚糖在抑制蛀牙中和作为双歧杆菌的生产性因子起作用。还有报道二果糖二酐可用作体内的矿物吸收因子(Baik，B.H.，Lee，Y.W.，和Lee，Y.B.；美国专利号5,700,832，英国专利号GB 2 308 547 A，日本专利号8-51370，韩国专利公开出版物号96-13376，Sakurai等，1997)。

果聚糖的代表菊粉和左聚糖都是天然存在的果糖同多糖，用于制备二果糖二酐(Han，1989)。可从它们用化学方法或用酶促方法合成二果糖二酐。然而，从天然果聚糖化学合成二果糖二酐具有明显的缺点。例如，化学合成的反应选择性低，因而随后需要复杂的分离和纯化。更糟的是，它产生环境污染。因此，这些问题影响了化学合成的经济生产价值。相反，在从天然果聚糖合成二果糖二酐时，采用生物催化剂(如微生物和酶)酶促合成现在已被视为经济上非常有利的。

自从Tanaka 1972年在微生物中发现了二果糖二酐III合成酶(菊粉果糖转移酶)以来，已从几种微生物来源分离得到了具有合成二果糖二酐功能的酶。可由这些微生物衍生的酶合成的二果糖二酐包括DFA I、III和IV。从左聚糖通过左聚糖果糖转移酶的催化作用，合成了DFA IV，并发现两种微生物(产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)和噬尼古丁节杆菌GS-9(Arthrobacternicotinovorans))产生DFA IV。

这些细菌仅合成非常少量的左聚糖果糖转移酶，因此就技术和经济方面而言，用这些细菌生产二果糖二酐是非常不理想的。目前为了获得大量感兴趣的基因，通常使用基因重组技术。即首先从微生物来源分离左聚糖果糖转移酶基因并克隆，然后在大肠杆菌中大量表达。在适合发现的产生左聚糖果糖转移酶的菌株中，仅噬尼古丁节杆菌GS-9实现了其左聚糖果糖转移酶基因的克隆。

作为左聚糖果糖转移酶产生DFA IV的底物，通过左聚蔗糖酶的转果糖基作用从蔗糖制备了左聚糖(一种果糖的同多糖)。能催化蔗糖氢化的酶的例子是蔗糖酶(β-D-果糖呋喃糖苷酶，EC 3.2.1.26)、左聚糖酶(β-2，6-D-果聚糖果聚糖水解酶，EC 3.2.1.65)、左聚蔗糖酶(β-2，6-果聚糖：D-葡糖-1-果糖基转移酶，EC2.4.1.10)、麦芽糖酶(α-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC 3.2.1.20)等。利用左聚蔗糖酶的转果糖基活性，可从蔗糖制备左聚糖(Tanaka & Yamamoto，J.Biochem，85，287(1979))。

用左聚蔗糖酶制备左聚糖已有公开的方法。例如，在美国专利号4,879,228和国际专利出版物号WO 86-4091中描述了利用微生物在其代谢中使用蔗糖的发酵过程，制备了左聚糖。然而，这些专利存在许多问题。产生左聚糖需要相当长的一段培养期。另外，由于培养液含有许多产物，需要困难的纯化过程，使得左聚糖的产率下降。当考虑这些问题时，酶反应法比培养法有利，因为左聚蔗糖酶的产物是由从蔗糖产生左聚糖的反应条件决定的，控制反应条件不难获得所需产物。

已报道了发现左聚糖在医学领域中有许多用途，如血清代替品(Dedonder等，Bull.Soc.Chim.Biol.，39，438(1957)；Schecheter等，J.Lab.Clin.Med.，61，962(1963))、胶体稳定剂、免疫制剂、药物增强剂等(Leibovici等，AnticancerRes.，5，553(1985)；Stark等，Br.J.Exp.Path.，67，141(1986))，在食品工业的许多用途，如质量改进剂、稳定剂、健康食品添加剂等(Hatcher等，Bioprocess，Technol.11，1(1989))，在印刷领域和化妆品领域的许多用途(Whiting等，J.Inst.Brew，73，422(1967)；Han，Bioprocess，Technol.12，1(1920))。

发明公开

本发明的一个目的是提供从蔗糖高产量生产左聚糖的酶促方法。

本发明的另一个目的是提供一种衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶基因，它含有一种特殊的工具，使其蛋白质易于纯化。

本发明的另一个目的是提供一种携带衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶基因的重组表达载体，它能在大肠杆菌中表达左聚蔗糖酶。

本发明还有一个目的是提供一种细菌，它被重组表达载体转化，能产生左聚蔗糖酶。

本发明还有一个目的是提供一种利用该转化细菌制备左聚蔗糖酶的方法。

本发明还有一个目的是提供从左聚糖高产量生产DFA IV的酶促方法。

本发明还有一个目的是提供一种新颖的细菌产脲节杆菌K2032，它产生左聚糖果糖转移酶。

本发明还有一个目的是提供一种编码左聚糖果糖转移酶的衍生自产脲节杆菌K2032的新基因。

本发明还有一个目的是提供一种重组果糖转移酶基因，它含有一种特殊的工具，使其蛋白质易于纯化。

本发明还有一个目的是提供一种携带重组基因的重组表达载体，和一种携带该重组表达载体的细菌。

本发明还有一个目的是提供利用该转化的细菌制备左聚糖果糖转移酶的方法。

本发明还有一个目的是提供利用左聚蔗糖酶和左聚糖果糖转移酶从蔗糖高产率生产DFA IV的酶促方法。

根据本发明的第一个实施例，提供了一种从蔗糖产生左聚糖的方法，其中在室温或以下，在pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，在衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶存在下，使糖溶液进行反应。在该实施例的一种形式中，在0-15环境摄氏度(EC)下进行该反应，糖溶液的糖浓度是10-30％(w/v)。

根据本发明的第二个实施例，提供了新的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的左聚蔗糖酶基因，它具有下列碱基序列：1 GCGGTGCACCCCGACTTCCCCTCGACGACCACCGTCCCCCTACCGGCCGACCGCCCGGCCCGACTGCTCCTCAGCCTAGACGGGCCCCTC91 CTCGAGGTCTTCGTCGGGGACGGTGAGGCGACTGCGTCGAACCTGGTCCTCCTGGGGGCCGGCGGTGTGACCGCGAGCCTCGAGACGGCA181 CGGCCAGGAACCGTGCACGTGACCGCGATCGACGTCGAGGCGCCCAGCGATGCTGACGCCCCTGAACCTGCCGCCGTTCTGGGCTGACGA271 GCGCTCCCACCCCGACAGCTCTCCTTCTACCGCTGCCCGAACCAGGGTGGACGCTTCGTCGCGCCCACCCGTCCACGAGAGGAACCAGCA361 ATGACGCCGGCCATCTCACGCCGCGCCGTGCTCCAGGGAGCCGGCGCCGGAGCACTCGCCCTGATCTTCGGCGGTGCTGTGCCGCCTGCA451 GCCCGGGCATCCGCTCCGGGCTCGCTCCGTGCCGTCTACCACATGACGCCCCCCAGCGGCTGGCTCTGCGACCCCCAACGCCCGGTCACC541 ACCCACGGCGCCTACCAGCTGTACTACCTGCACTCCGACCAGAACAACGGCCCCGGCGGCTGGGACCACGCGAGCACGACCGACGGCGTC631 GCCTTCACGCACCACGGCACCGTGATGCCGCTGCGGCCCGACTTCCCCGTGTGGTCCGGGTCGGCGGTCGTCGGCACCGCGAACACGGCA721 GGGTTCGGCGCCGGCGCGGTCGTCGCGCTCGCGACCCAGCCGACCGACGGCGTCCGCAAGTACCAGGAGCAGTACCTCTACTGGTCGACC811 GACGGCGGGTTCACGTTCACCGCCCTGCCCGACCCCGTCATCGTCAACACCGACGGTCGCGCCGCCACCACGCCCGCCGAGATCGAGAAC901 GCCGAGTGGTTCCGCGACCCCAAGATCCACTGGGACACCGCCCGCGGAGAATGGGTCTGCGTCATCGGACGACTGCGGTACGCCGCGTTC991 TACACCTCGCCGAACCTGCGCGACTGGACACTTCGCCGCAACTTCGACTACCCGAACCACGCCCTCGGCGGCATCGAGTGCCCCGACCTG1081 TTCGAGATCACCGCAGACGACGGGACACGCCACTGGGTGCTCGCCGCCAGCATGGACGCCTACGGCATCGGCCTCCCCATGACGTACGCC1171 TACTGGACAGGCACCTGGGACGGCGAGCAGTTCCACGCCGACGACCTCACCCCGCAATGGCTCGACTGGGGCTGGGACTGGTACGCGGCC1261 GTCACCTGGCCATCGATCGACGCGCCCGAGACCAAGCGCCTCGCCATCGCGTGGATGAACAACTGGAAGTACGCCGCACGCGACGTCCCC1351 ACCGACGCATCCGACGGCTACAACGGGCAGAACTCGATCGTCCGCGAGCTGCGGCTCGCCCGACAGCCTGGCGGCTGGTACACCCTCCTG1441 AGCACCCCCGTGGCAGCGCTGACGAACTACGTCACCGCCACCACCACACTCCCCGACCGGACCGTCGACGGCAGCGCCGTCCTGCCATGG1531 AACGGACGCGCATACGAGATCGAGCTCGACATCGCCTGGGACACCGCGACGAACGTCGGCATCTCGGTGGGCCGCTCCCCCGACGGAACC1621 CGGCACACGAACATCGGCAAGTACGGAGCAGACCTGTACGTCGACCGAGGACCCTCCGACCTCGCCGGGTACTCGCTCGCCCCCTACTCG1711 CGAGCCGCCGCCCCCATCGACCCCGGCGCCCGATCCGTGCACCTGCGCATCCTCGTCGACACCCAGAGCGTCGAGGTCTTCGTCAACGCC1801 GGCCACACCGTGCTCTCCCAGCAGGTCCACTTCGCCGAGGGCGACACGGGAATCTCGCTCTACACCGACGGCGGCCCCGCACACTTCACC1891 GGCATCGTCGTCCGCGAGATTGGCCAGGCGATCTAGGCGATGCACACCACACCGCTCACCGAAGCCGCGCCCCGGGAGACGACGGCCGAC1981 AATCGACACGTCCTCGTCGTT

根据本发明的第三个实施例，提供了运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶，它具有下列氨基酸序列： 1 M L N K A G I A E P S L W T R A D A M K V H T D D P T A T M31 P T I D Y D F P V M T D K Y W V W D T W P L R D I N G Q V V61 S F Q G W S V I F A L V A D R T K Y G W H N R N D G A R I G91 Y F Y S R G G S N W I F G G H L L K D G A N P R S W E W S G121 C T I M A P G T A N S V E V F F T S V N D T P S E S V P A Q151 C K G Y I Y A D D K S V W F D G F D K V T D L F Q A D G L Y181 Y A D Y A E N N F W D F R D P H V F I T P K I G K T Y A L F211 E G N V A M E R G T V A V G E E E I G P V P P K T E T P D G241 A R Y C A A A I G I A Q A L N E A R T E W K L L P P L V T A271 F G V N D Q T E R P H V V F Q N G L T Y L F T I S H H S T Y301 A D G L S G P D G V Y G P V S E N G I F G P Y E P L N G S G331 L V L G N P S S Q P Y Q A Y S H Y V M T N G L V T S F I D T361 I P S S D P N V Y R Y G G T L A P T I K L E L V G H R S F V391 T E V K G Y G Y I P P Q I E W L A E D E S S N S A A A L S L421 L N K ·

根据本发明的第四个实施例，提供了一种重组表达载体，携带左聚蔗糖酶基因。

根据本发明的第五个实施例，提供了一种新颖的细菌，大肠杆菌BL21(DE3)/pEL12(KCTC 8661)，该菌中的质粒携带有衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶基因。

根据本发明的第六个实施例，提供了制备左聚蔗糖酶的方法，包括如下步骤：培养锚定有携带左聚蔗糖酶基因的表达质粒的细菌菌种，收集和匀浆细菌细胞，从细胞匀浆中分离得到左聚蔗糖酶。在该实施例的一形式中，左聚蔗糖酶基因在其5’或3’末端有一段碱基序列编码组氨酸残基。在该实施例的另一个形式中，用金属离子亲和层析进行分离步骤，细菌菌种是大肠杆菌BL21(DE3)/pEL12(KCTC8661P)。

根据本发明的第七个实施例，提供了一种新颖微生物产脲节杆菌K2032，它显示从左聚糖选择性产生二果糖二酐IV和降解左聚糖的活性。

根据本发明的第八个实施例，提供了一种新颖左聚糖果糖转移酶，具有下列氨基酸序列1：1 M T P A I S R R A V L Q G A G A G A L A L I F G G A V P P A31 A R A S A P G S L R A V Y H M T P P S G W L C D P Q R P V T61 T H G A Y Q L Y Y L H S D Q N N G P G G W D H A S T T D G V91 A F T H H G T V M P L R P D F P V W S G S A V V G T A N T A121 G F G A G A V V A L A T Q P T D G V R K Y Q E Q Y L Y W S T151 D G G F T F T A L P D P V I V N T D G R A A T T P A E I E N181 A E W F R D P K I H W D T A R G E W V C V I G R L R Y A A F211 Y T S P N L R D W T L R R N F D Y P N H A L G G I E C P D L241 F E I T A D D G T R H W V L A A S M D A Y G I G L P M T Y A271 Y W T G T W D G E Q F H A D D L T P Q W L D W G W D W Y A A301 V T W P S I D A P E T K R L A I A W M N N W K Y A A R D V P331 T D A S D G Y N G Q N S I V R E L R L A R Q P G G W Y T L L361 S T P V A A L T N Y V T A T T T L P D R T V D G S A V L P W391 N G R A Y E I E L D I A W D T A T N V G I S V G R S P D G T421 R H T N I G K Y G A D L Y V D R G P S D L A G Y S L A P Y S451 R A A A P I D P G A R S V H L R I L V D T Q S V E V F V N A481 G H T V L S Q Q V H F A E G D T G I S L Y T D G G P A H F T511 G I V V R E I G Q A I *根据本发明的第九个实施例，提供了序列2的新颖左聚糖果糖转移酶基因：1 GCGGTGCACCCCGACTTCCCCTCGACGACCACCGTCCCCCTACCGGCCGACCGCCCGGCCCGACTGCTCCTCAGCCTAGACGGGCCCCTC91 CTCGAGGTCTTCGTCGGGGACGGTGAGGCGACTGCGTCGAACCTGGTCCTCCTGGGGGCCGGCGGTGTGACCGCGAGCCTCGAGACGGCA181 CGGCCAGGAACCGTGCACGTGACCGCGATCGACGTCGAGGCGCCCAGCGATGCTGACGCCCCTGAACCTGCCGCCGTTCTGGGCTGACGA271 GCGCTCCCACCCCGACAGCTCTCCTTCTACCGCTGCCCGAACCAGGGTGGACGCTTCGTCGCGCCCACCCGTCCACGAGAGGAACCAGCA361 ATGACGCCGGCCATCTCACGCCGCGCCGTGCTCCAGGGAGCCGGCGCCGGAGCACTCGCCCTGATCTTCGGCGGTGCTGTGCCGCCTGCA451 GCCCGGGCATCCGCTCCGGGCTCGCTCCGTGCCGTCTACCACATGACGCCCCCCAGCGGCTGGCTCTGCGACCCCCAACGCCCGGTCACC541 ACCCACGGCGCCTACCAGCTGTACTACCTGCACTCCGACCAGAACAACGGCCCCGGCGGCTGGGACCACGCGAGCACGACCGACGGCGTC631 GCCTTCACGCACCACGGCACCGTGATGCCGCTGCGGCCCGACTTCCCCGTGTGGTCCGGGTCGGCGGTCGTCGGCACCGCGAACACGGCA721 GGGTTCGGCGCCGGCGCGGTCGTCGCGCTCGCGACCCAGCCGACCGACGGCGTCCGCAAGTACCAGGAGCAGTACCTCTACTGGTCGACC811 GACGGCGGGTTCACGTTCACCGCCCTGCCCGACCCCGTCATCGTCAACACCGACGGTCGCGCCGCCACCACGCCCGCCGAGATCGAGAAC901 GCCGAGTGGTTCCGCGACCCCAAGATCCACTGGGACACCGCCCGCGGAGAATGGGTCTGCGTCATCGGACGACTGCGGTACGCCGCGTTC991 TACACCTCGCCGAACCTGCGCGACTGGACACTTCGCCGCAACTTCGACTACCCGAACCACGCCCTCGGCGGCATCGAGTGCCCCGACCTG1081 TTCGAGATCACCGCAGACGACGGGACACGCCACTGGGTGCTCGCCGCCAGCATGGACGCCTACGGCATCGGCCTCCCCATGACGTACGCC1171 TACTGGACAGGCACCTGGGACGGCGAGCAGTTCCACGCCGACGACCTCACCCCGCAATGGCTCGACTGGGGCTGGGACTGGTACGCGGCC1261 GTCACCTGGCCATCGATCGACGCGCCCGAGACCAAGCGCCTCGCCATCGCGTGGATGAACAACTGGAAGTACGCCGCACGCGACGTCCCC1351 ACCGACGCATCCGACGGCTACAACGGGCAGAACTCGATCGTCCGCGAGCTGCGGCTCGCCCGACAGCCTGGCGGCTGGTACACCCTCCTG1441 AGCACCCCCGTGGCAGCGCTGACGAACTACGTCACCGCCACCACCACACTCCCCGACCGGACCGTCGACGGCAGCGCCGTCCTGCCATGG1531 AACGGACGCGCATACGAGATCGAGCTCGACATCGCCTGGGACACCGCGACGAACGTCGGCATCTCGGTGGGCCGCTCCCCCGACGGAACC1621 CGCCACACGAACATCGGCAAGTACGGAGCAGACCTGTACGTCGACCGAGGACCCTCCGACCTCGCCGGGTACTCGCTCGCCCCCTACTCG1711 CGAGCCGCCGCCCCCATCGACCCCGGCGCCCGATCCGTGCACCTGCGCATCCTCGTCGACACCCAGAGCGTCGAGGTCTTCGTCAACGCC1801 GGCCACACCGTGCTCTCCCAGCAGGTCCACTTCGCCGAGGGCGACACGGGAATCTCGCTCTACACCGACGGCGGCCCCGCACACTTCACC1891 GGCATCGTCGTCCGCGAGATTGGCCAGGCGATCTAGGCGATGCACACCACACCG CTCACCGAAG~GCGCCCCGGGAGACGACGGCCGAC1981 AATCGACACGTCCTCGTCGTT根据本发明的第十个实施例，提供了序列3的新颖左聚糖果糖转移酶基因：1 GCGGTGCACCCCGACTTCCCCTCGACGACCACCGTCCCCCTACCGGCCGACCGCCCGGCCCGACTGCTCCTCAGCCTAGACGGGCCCCTC

AvaI AvaI91 CTCGAGGTCTTCGTCGGGGACGGTGAGGCGACTGCGTCGAACCTGGTCCTCCTGGGGGCCGGCGGTGTGACCGCGAGCCTCGAGACGGCA181 CGGCCAGGAACCGTGCACGTGACCGCGATCGACGTCGAGGCGCCCAGCGATGCTGACGCCCCTGAACCTGCCGCCGTTCTGGGCTGACGA271 GCGCTCCCACCCCGACAGCTCTCCTTCTACCGCTGCCCGAACCAGGGTGGACGCTTCGTCGCGCCCACCCGTCCACGAGAGGAACCAGCA

PstI361 ATGACGCCGGCCATCTCACGCCGCGCCGTGCTCCAGGGAGCCGGCGCCGGAGCACTCGCCCTGATCTTCGGCGGTGCTGTGCCGCCTGCA1 M T P A I S R R A V L Q G A G A G A L A L I F G G A V P P A451 GCCCGGGCATCCGCTCCGGGCTCGCTCCGTGCCGTCTACCACATGACGCCCCCCAGCGGCTGGCTCTGCGACCCCCAACGCCCGGTCACC31 A R A S A P G S L R A V Y H M T P P S G W L C D P Q R P V T541 ACCCACGGCGCCTACCAGCTGTACTACCTGCACTCCGACCAGAACAACGGCCCCGGCGGCTGGGACCACGCGAGCACGACCGACGGCGTC61 T H G A Y Q L Y Y L H S D Q N N G P G G W D H A S T T D G V631 GCCTTCACGCACCACGGCACCGTGATGCCGCTGCGGCCCGACTTCCCCGTGTGGTCCGGGTCGGCGGTCGTCGGCACCGCGAACACGGCA91 A F T H H G T V M P L R P D F P V W S G S A V V G T A N T A721 GGGTTCGGCGCCGGCGCGGTCGTCGCGCTCGCGACCCAGCCGACCGACGGCGTCCGCAAGTACCAGGAGCAGTACCTCTACTGGTCGACC121 G F G A G A V V A L A T Q P T D G V R K Y Q E Q Y L Y W S T811 GACGGCGGGTTCACGTTCACCGCCCTGCCCGACCCCGTCATCGTCAACACCGACGGTCGCGCCGCCACCACGCCCGCCGAGATCGAGAAC151 D G G F T F T A L P D P V I V N T D G R A A T T P A E I E N901 GCCGAGTGGTTCCGCGACCCCAAGATCCACTGGGACACCGCCCGCGGAGAATGGGTCTGCGTCATCGGACGACTGCGGTACGCCGCGTTC181 A E W F R D P K I H W D T A R G E W V C V I G R L R Y A A F991 TACACCTCGCCGAACCTGCGCGACTGGACACTTCGCCGCAACTTCGACTACCCGAACCACGCCCTCGGCGGCATCGAGTGCCCCGACCTG211 Y T S P N L R D W T L R R N F D Y P N H A L G G I E C P D L1081 TTCGAGATCACCGCAGACGACGGGACACGCCACTGGGTGCTCGCCGCCAGCATGGACGCCTACGGCATCGGCCTCCCCATGACGTACGCC241 F E I T A D D G T R H W V L A A S M D A Y G I G L P M T Y A1171 TACTGGACAGGCACCTGGGACGGCGAGCAGTTCCACGCCGACGACCTCACCCCGCAATGGCTCGACTGGGGCTGGGACTGGTACGCGGCC271 Y W T G T W D G E Q F H A D D L T P Q W L D W G W D W Y A A

ClaI AvaI1261 GTCACCTGGCCATCGATCGACGCGCCCGAGACCAAGCGCCTCGCCATCGCGTGGATGAACAACTGGAAGTACGCCGCACGCGACGTCCCC301 V T W P S I D A P E T K R L A I A W M N N W K Y A A R D V P1351 ACCGACGCATCCGACGGCTACAACGGGCAGAACTCGATCGTCCGCGAGCTGCGGCTCGCCCGACAGCCTGGCGGCTGGTACACCCTCCTG331 T D A S D G Y N G Q N S I V R E L R L A R Q P G G W Y T L L

NcoI1441 AGCACCCCCGTGGCAGCGCTGACGAACTACGTCACCGCCACCACCACACTCCCCGACCGGACCGTCGACGGCAGCGCCGTCCTGCCATGG361 S T P V A A L T N Y V T A T T T L P D R T V D G S A V L P W1531 AACGGACGCGCATACGAGATCGAGCTCGACATCGCCTGGGACACCGCGACGAACGTCGGCATCTCGGTGGGCCGCTCCCCCGACGGAACC391 N G R A Y E I E L D I A W D T A T N V G I S V G R S P D G T1621 CGGCACACGAACATCGGCAAGTACGGAGCAGACCTGTACGTCGACCGAGGACCCTCCGACCTCGCCGGGTACTCGCTCGCCCCCTACTCG421 R H T N I G K Y G A D L Y V D R G P S D L A G Y S L A P Y S1711 CGAGCCGCCGCCCCCATCGACCCCGGCGCCCGATCCGTGCACCTGCGCATCCTCGTCGACACCCAGAGCGTCGAGGTCTTCGTCAACGCC451 R A A A P I D P G A R S V H L R I L V D T Q S V E V F V N A1801 GGCCACACCGTGCTCTCCCAGCAGGTCCACTTCGCCGAGGGCGACACGGGAATCTCGCTCTACACCGACGGCGGCCCCGCACACTTCACC481 G H T V L S Q Q V H F A E G D T G I S L Y T D G G P A H F T

SmaI1891 GGCATCGTCGTCCGCGAGATTGGCCAGGCGATCTAGGCGATGCACACCACACCGCTCACCGAAGCCGCGCCCCGGGAGACGACGGCCGAC511 G I V V R E I G Q A I *1981 AATCGACACGTCCTCGTCGTT

根据本发明的第十一个实施例，提供了一种重组表达载体，携带左聚糖果糖转移酶基因。

根据本发明的第十二个实施例，提供了从左聚糖产生DFA IV的方法，其中在25-50℃，pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，左聚糖果糖转移酶存在下使左聚糖溶液反应3-10小时。在该实施例的另一种形式中，反应在37℃进行。在该实施例的另一种形式中，酸性缓冲液是pH5.8的磷酸缓冲液，左聚糖溶液的左聚糖浓度是5-15％(w/v)。

根据本发明的第十三个实施例，提供了制备果糖转移酶的一种方法，包括如下步骤：培养锚定有携带左聚糖果糖转移酶基因的表达质粒的细菌菌株，收集并匀浆细菌细胞，从细胞匀浆中分离左聚糖果糖转移酶。在该实施例的一种形式中，左聚糖果糖转移酶在其-N或C-末端具有组氨酸残基，用金属离子亲和层析进行分离步骤。

根据本发明的第十四个实施例，提供了从蔗糖产生二果糖二酐IV的一种方法，包括如下步骤：在室温或以下，pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，在左聚蔗糖酶的存在下使糖溶液反应，来产生左聚糖，从糖反应混合物中部分或完全纯化得到左聚糖，在25-50℃，pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，在左聚糖果糖转移酶存在下，使左聚糖溶液反应3-10小时，产生二果糖二酐IV，并从左聚糖反应混合物中分离得到二果糖二酐IV。

附图简述

本发明的上述和其它目的、特征和其它优点将通过下列详述结合附图将变得更清楚明白。

图1显示了从蔗糖制备二果糖二酐IV过程的各步骤。

图2显示了质粒pZL8的限制性酶切图谱，其中B表示BamHI，H表示HindIII，E表示EcoRV，N表示NcoI，A表示AseI，S表示SphI(B∷Sa)表示BamHI∷Sau3A1。

图3显示了左聚蔗糖酶基因的碱基序列和从其推导的氨基酸序列。

图4显示了纯化的左聚蔗糖酶的SDS-PAGE结果，其中标准蛋白质在M泳道中电泳，大肠杆菌全蛋白在泳道1中，纯化的左聚蔗糖酶在泳道2中。

图5显示了纯化的左聚糖果糖转移酶的SDS-PAGE结果，其中标准蛋白质在泳道1中电泳，纯化的左聚糖果糖转移酶在泳道2中。

图6显示了左聚糖果糖转移酶基因的碱基序列及从其推导的氨基酸序列。

图7显示了携带左聚糖果糖转移酶基因的重组表达载体pUDFA18的结果，其中B表示BamHI，P表示PstI，N表示NcoI，S表示SalI，C表示ClaI，(N/A)表示NcoI/AflIII。

图8显示了大肠杆菌JUD81在SDS-PAGE中的总蛋白质分布模式，其中细菌蛋白质在泳道1中电泳，标准蛋白质在泳道2中。

图9显示了根据反应时间，反应混合物DFA IV和其它糖的量的变化。

图10是纯化的DFA IV的NMR结果。

实施本发明的最佳模式

本发明涉及从蔗糖中用酶生产DFA IV，它是通过实施下列步骤实现的：左聚蔗糖酶加工产生左聚糖过程，左聚糖的纯化和浓缩过程，左聚糖果糖转移酶加工产生DFA IV过程，结晶回收DFA IV的过程。下面将详细给出这些过程的描述(图1)。

1.左聚蔗糖酶产生左聚糖的过程

根据本发明，左聚糖的产生是基于从运动发酵单胞菌分离的左聚蔗糖酶的催化，用蔗糖作为底物。在左聚蔗糖酶存在下，在室温下(优选0-15℃，更优选10℃)，pH3.0-7.0，优选pH5.0的酸性缓冲液中，使蔗糖反应20-80小时，优选20小时。因此，最优选是使蔗糖在10℃下，在pH5.0的乙酸缓冲液中反应20小时。

作为底物，例子包括精制蔗糖和粗制蔗糖，优选精制蔗糖。

糖的优选浓度是总培养物体积的10-30％(w/v)，最优选是20％(w/v)。

不论是天然还是由基因重组产生的，衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶可用于本发明。为了有效催化左聚糖产生，根据反应溶液总体积，该酶的用量为0.42-3.0U/ml，优选2.08U/ml。

通常基因操纵导致蛋白质的大量产生，这非常有利于纯化。因此，本发明的左聚蔗糖酶优选通过遗传重组获得。为此，首先用携带衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶基因的质粒，如从大肠杆菌KCTC 8546P获得的质粒pZL8作为模板，用合适的合成引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增左聚蔗糖酶基因。然后，将扩增的感兴趣基因插入能在合适的宿主中表达的载体中。例如，当用大肠杆菌作为宿主时，将扩增的左聚蔗糖酶基因插入pET3d(Stratagene)中，构建大肠杆菌表达质粒，如pEL11，随后将其转化入宿主中。在合适的条件下培养该转化的细胞并匀浆，然后离心。在上清液中加入硫酸铵，得到粗左聚蔗糖酶。

由于粗酶含有除了左聚蔗糖酶外的各种蛋白质，需要复杂的纯化程序，来获得纯左聚蔗糖酶。为了克服这个问题，提供了一种在-N端或C-端含有组氨酸残基的左聚蔗糖酶，它能根据本发明简单的用金属离子交换柱层析纯化。

组氨酸残基可以如下和左聚蔗糖酶的-N端或C-端结合。首先，用一套合成引物(设计成在其3’或5’-末端具有一组氨酸碱基序列)，同时用携带衍生自运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶基因的质粒，如从大肠杆菌KCTC 8546P获得的质粒pZL8作为模板进行PCR，从而产生大量在其3’或5’-末端还含有编码组氨酸的核苷酸序列的左聚蔗糖酶基因。然后，将扩增的基因插入可在合适宿主中表达的载体。例如，当用大肠杆菌作为宿主时，将扩增的左聚蔗糖酶基因插入pET3d中，构建大肠杆菌表达质粒，如pEL11，然后将其转化入宿主中。在合适条件下培养该转化宿主细胞并匀浆，然后用金属离子交换柱层析纯化，获得纯的左聚蔗糖酶。

实验数据显示，当在20％糖溶液中加入0.5-2U纯化的左聚蔗糖酶时，在10℃，该酶促反应10小时后产生50g/l量的左聚糖。

使用左聚蔗糖酶，可在批量生产和连续生产中，以高纯度(≥98％)和高产率(蔗糖的35-40％)大量产生左聚糖，一种水溶性的同多糖。就批量生产而言，由于葡萄糖(该酶促反应的一种产物)抑制左聚蔗糖酶的活性，必须控制底物浓度。优选是20％底物溶液。就连续生产而言，需要反应器，如膜生物反应器，装备有连续除去产生的葡萄糖的设备。

左聚糖产生后，丢弃用过的酶太浪费。对此，可将酶固定在合适基质上，如羟基磷灰石，铁珠，无孔玻璃，金属丝等上，以重新利用酶。

除了作为产生DFA IV的底物，如前述本发明产生的左聚糖还可用于多种目的，如食品工业和医药材料。

2.左聚糖的纯化和浓缩过程

完成左聚糖的酶促生产反应后，必须除去得到的含左聚糖的溶液中未反应的剩余蔗糖、葡萄糖和寡糖，然后浓缩，优选到10-15％。对此，许多技术是可行的，如溶剂沉淀、超滤、透析、反渗透、层析等。对于小规模如实验室规模，使用乙醇等的有机溶剂方法是合适的。仅在有机溶剂中沉淀2-3次就足以获得纯左聚糖。对于大规模，优选使用膜过滤法，如在各种聚合物生产过程中使用的那样。

当以连续方法生产左聚糖时，使用膜分离技术，如微量过滤(MF)、超滤(UF)或反渗透(RO)，从反应溶液中有效分离得到感兴趣的产物或除去副产品。这些技术的优点是能在低温下进行，还能实现能量产量的简单量度和分离性能。例如，可在超滤(UHF-500-E-90a，500,000分子量截留值，A/G Technology Co.)或MF(CPP-1-k-9A，0.1微米级，A/G Technology Co.)的帮助下从反应混合物中除去葡萄糖。优选是UHF-500-E-90A，它在渗透通量上是卓越的(渗透通量376.47ml.ft²；渗透常数21.16ml/min/ft²/psi；500,000名义分子量截留值)。

为了实现左聚糖的高度纯化，可联合有机溶剂沉淀法使用上述过滤。另外，可用多步进行各种膜分离，实现左聚糖的纯化。

3.左聚糖果糖转移酶产生DFA IV的过程

根据本发明，通过左聚糖果糖转移酶的催化，从部分纯化的或纯左聚糖产生DFA IV。

在左聚糖果糖转移酶的存在下，在25-50℃，优选37℃，pH3.0-7.0，优选pH5.8的缓冲液中使左聚糖反应3-10小时，优选5小时。

用于产生二果糖二酐的是部分或完全纯化的左聚糖，完全纯化的左聚糖更好。

在反应溶液中，优选将左聚糖浓度控制在培养物总体积的5-15％(w/v)，最优选10％(w/v)。

不论是天然的还是从转化微生物如大肠杆菌或酵母菌基因重组产生的，本发明使用的是衍生自产脲节杆菌的左聚糖果糖转移酶。

本发明的左聚糖果糖转移酶优选通过基因重组获得，因为基因操纵导致蛋白质的大量产生，非常有利于纯化。为此，首先将携带衍生自产脲节杆菌的左聚糖果糖转移酶的质粒，如质粒pDA18用作模板，用合适的合成引物进行PCR扩增左聚糖果糖转移酶基因。然后，将扩增的感兴趣基因插入能在合适宿主(如细菌或酵母)中表达的载体中。

根据本发明，将扩增的左聚糖果糖转移酶基因插入pUC18，构建大肠杆菌表达质粒pUDFA18，然后将其转化入大肠杆菌DH5α中。如此获得的新细菌细胞称为大肠杆菌JUD81并于1999年9月1日被保藏在韩国典型培养物保藏中心，韩国生物科学和生物技术研究院，登录号KCTC8961P。原始保藏物根据布达佩斯条约于2000年10月19日转化为登录号KCTC 0877BP的保藏物。在合适的条件下培养该转化的宿主细胞并匀浆，然后离心。在上清液中加入硫酸铵产生粗制左聚糖果糖转移酶。

由于粗酶不仅含有左聚糖果糖转移酶，还含有各种其它蛋白质，粗酶必须经过复杂的纯化过程，来获得纯左聚糖果糖转移酶。为了克服该问题，提供了一种左聚糖果糖转移酶，它还在其-N或C-末端含有组氨酸残基，能根据本发明方法用金属离子交换柱层析简单纯化。

组氨酸残基可以如下和左聚果糖转移酶的-N或C-端结合。首先，用一套合成引物(设计成在其3’或5’-末端具有一组氨酸碱基序列)，同时用携带衍生自产脲节杆菌的左聚果糖转移酶基因的质粒，如从大肠杆菌KCTC 0877BP获得的质粒pUDFA18作为模板进行PCR，从而产生大量的在其3’或5’-末端还含有编码组氨酸的核苷酸序列的左聚果糖转移酶基因。然后，将扩增的基因插入可在合适宿主中表达的载体中。例如，当用大肠杆菌作为宿主时，将扩增的左聚果糖转移酶基因插入pUC18中构建大肠杆菌表达质粒，如pUDFA18，然后将其转化入宿主。在合适条件下培养该转化细胞并匀浆，然后用金属离子交换柱层析纯化，获得纯左聚果糖转移酶。

类似左聚糖，可在批量生产和连续生产中用左聚果糖转移酶大量生产DFAIV。还可将该酶固定于合适的基质，如羟基磷灰石、铁珠、无孔玻璃、金属丝等上，以重新使用酶。

实验数据显示，当运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶催化产生的20克左聚糖与含有25U左聚糖果糖转移酶的匀浆细胞溶液在37℃，1000ml磷酸缓冲液(pH5.8)中反应时，反应20小时后产生了产率为60％的DFA IV。

4.结晶回收DFA IV的过程

从运动发酵单胞菌的左聚蔗糖酶催化产生的左聚糖中，作为左聚糖果糖转移酶的分解活性的结果，获得了一反应溶液，含有DFA IV60％、果糖5％、有限的左聚糖30％和其它糖(主要是寡糖)5％。使该反应溶液经过纯化过程，来分离DFA IV，或浓缩至一定程度，得到具有高含量DFA IV的溶液。如需要，反应溶液本身可用于代替DFA IV。

可通过结晶、溶剂沉淀、透析、超滤、反渗透、蒸发、干燥、层析等，单独或联合，从所得的反应溶液中分离DFA IV。用于本发明的是膜过滤，它常在实践中用于各种聚合物生产过程。

除了对热比蔗糖更稳定外，DFA IV还结晶良好。为了使DFA IV结晶，需要浓缩酶解的左聚糖溶液。就此，可利用上面提到的过滤法或流行的标准糖溶液蒸发法。另外，可将酶解溶液过滤初步浓缩到一定程度，然后加热70-80℃，直到DFAIV达到所需浓度。此时，加热温度超过100EC导致焦糖化。初步过滤的DFA IV滤液可用作左聚糖的稀释溶液。

在小批量如实验室中，优选在DFA IV溶液中加入2体积的有机溶剂，如乙醇，来沉淀寡糖或有限的左聚糖，并用旋转蒸发器浓缩得到的上清液，然后用100％乙醇将浓缩液的乙醇浓度控制在95％，并放置在4℃，引起结晶沉淀。另外，将DFAIV过饱和溶液放置在4℃，以诱导自然结晶的同时，在其中加入DFA IV晶种以迅速形成晶体。然而，这种批量结晶法的缺点在于它很难获得均一的晶体。相反，连续过程在使DFA IV形成均匀大小和形状的晶体中非常有用，而且与批量过程相比，具有成本低廉的优点。

可根据下列实施例获得对本发明更好的理解。列出它们是为了说明，而不是为了限制本发明。

实施例

实验性实施例1

左聚蔗糖酶基因的克隆

按照Raymond和Tate(Raymond和Tate，重组DNA技术，p.162，1983，Addison-Wesley Publ.)的指导，进行了运动发酵单胞菌基因组DNA的分离。用TEN缓冲液(10mM Tris-Cl pH7.6、1mm EDTA、10mM NaCl)洗涤后，将1克在YPS培养液(酵母抽提物0.5％，蛋白胨1％，蔗糖2％)中培养的运动发酵单胞菌ZMl(ATCC10988)的细胞团块悬浮在10mlSET缓冲液(蔗糖20％，50mM Trsi-Cl pH7.6，50mMEDTA)中，用溶菌酶处理(Sigma，5mg/ml PEN缓冲液)。酶处理30分钟后，在混合物中加入10ml TEN缓冲液和1ml 10％十二烷基磺酸钠(SDS)并缓慢搅拌。在裂解的细胞中加入2ml 5M NaCl溶液和20ml TEN缓冲液，并在得到的溶液中加入等体积TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.6，1mM EDTA)配的饱和苯酚溶液，搅拌5分钟，然后10,000rpm离心5分钟。与氯仿/正戊醇(24∶1)充分混合后，再次离心上清液。在得到的上清液中加入2体积冷乙醇沉淀得到DNA。

纯化后，用限制性酶Sau3AI部分切割运动发酵单胞菌DNA，在1％琼脂糖凝胶的帮助下分离出大小在4-10kb范围内的DNA片段。另外，用限制性酶BamHI切割pUC119(Takara，Japan)并去磷酸化。将分离的4-10kbDNA片段与消化的pUC119连接，获得重组质粒。

按照Mandel和Higa(Mandel和Higa，分子生物学杂志，53，159(1970))和Inoue等(Inoue等，基因96，23(1990))的技术进行了转化。首先，18℃，在30mlSOB培养液(胰蛋白胨2％、酵母抽提物0.5％、10mM NaCl、2.5mM CaCl₂、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄)中培养了36小时的大肠杆菌JM109置于冰中10分钟，2500xg离心10分钟，然后将细胞沉淀悬浮在10ml TB溶液(10mM PIPES、55mM MnCl₂、250nM KCl)中。在得到的悬液中加入二甲基亚砜(DMSO)至最终浓度为7％，放置在冰上10分钟，在冷试管中分成400μl等份，并储藏在液氮罐中。为了转化，将冰冻的细胞悬液在室温下融化，并与10μl重组DNA(DNA 1μg)充分混合，将该混合物冷藏30分钟，并在42℃热休克30秒。然后，在转化溶液中加入800μl SOC培养液(胰蛋白胨2％、酵母抽提物0.5％、10mM NaCl、2.5mM CaCl₂、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、10mM葡萄糖)，37℃剧烈振荡1小时，涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂糖平板表面，并在37℃培养16小时。

将形成的菌落转移到补充有蔗糖(20g/l)和氨苄青霉素(50mg/ml)的MG琼脂平板中，并在37℃培养2日。将GOD-PAP喷洒(Beringer Mannheim)在平板上，从而选择到13个周围有红色晕圈的菌落。按Gay等(Gay等，J.Bacteriol153，1432(1983))的指示进行测定，进一步选出可能有蔗糖酶活性和左聚糖形成活性的菌落。从这些大肠杆菌菌落分离出质粒，称为“pZL8”。携带该质粒的大肠杆菌DH5α于1993年12月14日被保藏在韩国典型培养物保藏中心，韩国生物科学和生物技术研究院，保藏号KCTC8546P。

左聚糖形成的基因鉴定

37℃在LBS肉汤(补充了5％蔗糖的LB肉汤)中培养携带pZ18的大肠杆菌3日，检测到和左聚糖相似的聚合物。离心该培养物，在上清液中加入3体积冷乙醇，以沉淀聚合物。将其溶于蒸馏水，并用乙醇沉淀。进行该乙醇沉淀过程两次以上。用薄层层析(TLC)在硅胶上分离如此获得的粗聚合物，用正丁醇/吡啶/水(8/1/1)展开，然后用1％茴香醛-硫酸溶液显色。

由于左聚糖(一种分子量5×10⁷道尔顿的大分子)不能在TLC上移动，根据Tanaka(Tanaka等，J.Biochem.90，521(1981))的说明将其水解。将100μl粗聚合物溶液和50μl 2.5％草酸溶液一起煮沸15分钟，对水解溶液进行TLC。延长酸水解15分钟，仅观察到果糖。用TLC准确分析糖组分有困难，因为葡萄糖的Rf值是0.46，果糖是0.52，而蔗糖是0.4。为了补偿，进行了HPLC分析。

将20μl各水解物样品滤过0.2微米膜，在HPLC装置(如Waters出售的，称为“R401型”的)的帮助下进行HPLC，使水以0.6ml/min的流速通过碳水化合物柱HPX-87C(Bio-Rad)。用RI(炉温85-90℃)进行检测。所有样品显示两个峰：4.19min读到的峰是草酸峰，而另一个9.29min的峰是蔗糖峰。因此，这些数据证明了上面获得的聚合物是由果糖残基构成的。另外，在运动发酵单胞菌中未观察到菊粉(β(2-1)相连的果聚糖)成长性活性。(Toran等，J.Biotechnol.Lett.，7，527(1985))。因此，可肯定在携带质粒pZL8的大肠杆菌中形成的聚合物是左聚糖(β(2-6)连接的果聚糖)(Viikari，L.，CRC Critical Reviews in Biotechnology7，237(1988))，并在质粒pZ18中引入左聚蔗糖酶基因。

基因限制性酶图谱的基因鉴定

用各种限制性酶消化上述获得的重组质粒，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。根据琼脂糖凝胶上的DNA片段数据，绘出了质粒pZL8的限制性酶图，提供的信息表明质粒pZL8中引入的基因组DNA长4.5kb。

为了用作探针，用DNA标记试剂盒(Beringer Mannheim)标记质粒pZL8。另外，用限制性酶EcoRI、EcoRV、HindIII和NcoI切割上述制备的运动发酵单胞菌基因组DNA，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。然后，将琼脂糖凝胶上的基因组DNA片段转移到尼龙膜上，并按照Southern(Southern，J.Mol.Biol.，98，503(1975))的指导与该探针杂交。参照DNA标记试剂盒中的说明书，实现了显色。由于质粒pZL8含有EcoRV、HindIII和NcoI各自的唯一限制性酶位点，引入质粒pZL8中的4.5kbDNA序列必定来自运动发酵单胞菌。

通过碱基测序作基因鉴定

对携带用限制性酶造成的缺失pZL8的突变菌进行了左聚蔗糖酶活性的检测。从检测认识到左聚蔗糖酶基因位于ECoRV和AseI位点之间的1.6kb碱基序列中，如图2所示。

扩增了用外切/绿豆核酸酶缺失试剂盒(Tanaka，Japan)从1.6kb DNA片段构建的缺失质粒。用2N NaOH使2μl从该突变细胞制备的质粒变性，用乙酸铵(pH4.5)中和，用乙醇沉淀，并溶于去离子水中。使用Sequenase试剂盒(USB，U.S.A.)标记了变性的质粒，将4μl反应物煮沸3分钟，在8％聚丙烯酰胺-8M脲凝胶上，1500-1700v电泳3小时。干燥凝胶，-70℃曝光X光片8小时。读取出现在感光X-光胶片上的碱基序列，揭示左聚蔗糖酶包括其终止密码子的总基因长1,981bp：和氨基酸序列对应的结构基因长1269bp。图3显示了左聚蔗糖酶基因的碱基序列和从其推导出的氨基酸序列。

通过氨基酸测序作基因鉴定

在YPS培养液中30℃培养运动发酵单胞菌ZMl 24小时，收集复制的细胞，悬浮在20mM磷酸缓冲液(pH6.8)中，30℃振荡15分钟，按照Yanase(Yanase等，Biosci.Biotech.Biochem.56，1335(1992))的说明离心。用上清液作为粗酶溶液。

在该粗溶液中，将硫酸铵饱和至50％，沉淀蛋白质8,000xg离心20分钟回收。将蛋白团块溶于0.02M磷酸缓冲液(pH6.8)，然后在相同缓冲液中透析。对此，以0.5ml/min的速率通过装填有弱阴离子交换树脂(DEAE-Toyopearl 650M)的柱(2.5×10cm)进行洗脱。在NaCl从0-0.5M的线性浓度梯度中，收集0.3M的洗脱液。浓缩洗脱物，用羟基磷灰石柱层析纯化。浓缩后，用20％饱和硫酸铵沉淀蛋白。最后，将浓缩液加到凝胶过滤柱(Superose 12，Pharmacia)上洗脱含有分子量91000的组分。最终纯化倍数是运动发酵单胞菌粗产物的18.3倍，含有在制备步骤中回收的16.5％的酶(表1)。该溶液用作左聚蔗糖酶溶液。

表2.随着缓冲液的pH，左聚蔗糖酶的减少量(g/l)

表1.从运动发酵单胞菌纯化左聚蔗糖酶步骤小结

步骤	体积(ml)	U总	蛋白质(mg/ml)	比活性(U/mg)	产率(％)	纯化倍数
步骤	体积(ml)	U总	蛋白质(mg/ml)	比活性(U/mg)	产率(％)	纯化倍数	洗涤的细胞	1,300	-a	0.35	-	-	-
第一次(NH₄)₂SO₄	115	-	1.28	-	-	-	洗涤的细胞	1,300	-a	0.35	-	-	-
第一次(NH₄)₂SO₄	115	-	1.28	-	-	-	离子交换	38	4.35	0.57	0.21	100	1.00

羟基磷灰石	20	2.58	0.41	0.31	65	1.52
羟基磷灰石	20	2.58	0.41	0.31	65	1.52	第二次(NH₄)₂SO₄	2	0.96	0.46	1.04	21	5.07
Superose 12	1.5	0.72	0.13	3.75	16.5	18.3	第二次(NH₄)₂SO₄	2	0.96	0.46	1.04	21	5.07

a：未能测定。

在蛋白质-肽测序系统(Applied Biosystems，477A型)的帮助下，以Edman降解法中测定了纯化的左聚蔗糖酶N-末端的氨基酸序列。结果，测定出一段7个氨基酸残基Met-Leu-Asn-Lys-Ala-Gly-Ile的序列，反映了DNA相应的碱基序列。特别是，揭示了levU基因没有与信号肽对应的碱基序列，信号肽通常见于分泌蛋白质中。运动发酵单胞菌左聚蔗糖酶基因的核苷酸和氨基酸序列登录在GenBank，U.S.A.(登录号AF081588)中。

实验性实施例2

左聚蔗糖酶的产生

步骤1表达载体的构建

在LB培养液(酵母抽提物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl 1％)中37℃培养大肠杆菌KCTC-8546P过夜，然后从培养物中按照Maniatis等的方法(Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，U.S.A.)抽提质粒。

使用下列引物1和2，用质粒pZL8作为模板，PCR扩增了长1296bp的左聚蔗糖酶基因：

引物1：5’-CGC CGG ATC CAC ATG TTG AAT AAA GCA GGC-3’

引物2：5’-CGC GGA TCC ACA TGT GCA TAA TCA GAA ACG TC-3’

热处理含有10x Taq聚合酶缓冲液(10μl)，10x dNTP混合物(10μl)(dATP、dCTP、dGTP和dTTP，各2mM)，引物1和2(各1μl(100pM))，质粒pZL8 DNA(5μl(20ng))和去离子水(72μl)的反应混合物与矿物油(100μl)，95℃ 5分钟，使DNA变性。冷却到72℃后，在反应混合物中加入Taq聚合酶(1μl(5U))，然后经过25轮热循环，其中以95EC 1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 3分钟依次进行加热处理。

用限制性酶AflIII消化获得的PCR产物，并引入到质粒pET3d(Stratagene)的NcoI位点中构建大肠杆菌表达质粒pEL11。

步骤2大肠杆菌的转化

分别在30ml SOB培养液(胰蛋白胨2％、酵母抽提物0.5％，NaCl 10mM，氯化钙2.5mM，氯化镁10mM，硫酸镁10mM)中18℃培养大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)，然后离心收集细菌。接着，分别将培养的细菌悬浮在10ml TB缓冲液(Pipes 10mM，氯化锰55mM，氯化钙15mM，氯化钾250mM)中，然后离心收集细胞。将细胞团块重新悬浮在12ml TB缓冲液中，然后加入浓度为7％的DMSO(二甲基亚砜)，将悬液置于冰上，以400μl的等份储藏在液氮罐中。

融化后，在大肠杆菌DH5α中加入10μl步骤1中构建的质粒pEL11，在冰上放置30分钟，然后42℃热休克30秒，以转化。在转化的细胞混合物中加入800μl SOC培养液，37℃剧烈搅拌60分钟，并涂在含有170mg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培育16小时。刮下琼脂培养基上形成的菌落，在含有氨苄青霉素的LB肉汤中培养。从培养细胞抽提质粒，并用限制性酶图谱测试它们是否携带左聚蔗糖酶基因。

将已确定携带左聚蔗糖酶的重组质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，涂在加了氨苄青霉素的LB琼脂板上，37℃培养。

步骤3左聚蔗糖酶的产生和分离

将转化细胞接种在M9-ZB培养液(胰蛋白胨10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 3g，Na₂HPO₄6g，葡萄糖4g，1M MgSO₄ 1ml)并搅动培养。当培养物在600nm处的吸光度达到0.7时，加入浓度为1mM的IPTG(Sigma)，以诱导左聚蔗糖酶的表达。

在培养物离心获得的细胞沉淀中加入体积为培养液1/10的100mM Tris缓冲液(pH7.0)，用超声粉碎机(Branson)超声3次，各30秒匀浆悬浮细胞，然后12000xg离心60分钟。在获得的上清液中加入浓度为20％的硫酸铵，离心，得到94％以上纯的左聚蔗糖酶。如果在加入IPTG4小时后收集，按照实施例2Song等(song和Rhee，Biotechnol.Lett.16，1305(1994))所述进行测量，发现该粗酶具有7.8U/ml的左聚蔗糖酶活性。相当于大肠杆菌产生的总蛋白质量的30％。

比较实施例1

在YPS培养液中(酵母抽提物1％，磷酸钾0.1％，蔗糖20％)30EC培养运动发酵单胞菌ATCC10988 18小时，从培养液中获得左聚蔗糖酶，经测定，具有1.5U/ml的活性。

因此，实验性实施例2中转化细胞产生的左聚蔗糖酶的量是运动发酵单胞菌ATCC 10988产生的左聚蔗糖酶的5.2倍。

实施例1

如实验性实施例2步骤3那样培养大肠杆菌，在规律性时间间隔取出10ml培养液并离心。在细胞沉淀中加入体积为培养液1/10的100mM Tris缓冲液(pH7.0)，用超声粉碎机超声3次匀浆悬浮细胞，每次30秒，然后12000xg离心60分钟。上清液在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG诱导6小时后，左聚蔗糖酶是水溶性的，并在IPTG诱导后8小时开始，逐渐转化成水不溶性的，酶活力也逐渐下降。IPTG诱导后10小时，测定左聚蔗糖酶具有10％的酶活力。

实施例2

用引物1和引物3(5’-CGA CAT GTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GTA AAG ACA GGGCTG-3’)进行PCR，用从大肠杆菌KCTC 8546P分离的质量pZL8作为模板。使用PCR产物，重复实验性实施例2中的相同程序，构建能在大肠杆菌中表达C-末端带有组氨酸残基的左聚蔗糖酶的质粒pEL12，然后将其用于转化大肠杆菌BL12(DE3)。

将转化的大肠杆菌BL12(DE3)/pEL12于1995年4月25日保藏在韩国典型培养物保藏中心，韩国生物科学和生物技术研究院，保藏号为KCTC8861P。

实施例3

将Ni-NTA树脂(Quagen，U.S.A.)填充在1.5×20cm柱中，然后该柱流过50mM磷酸缓冲液(pH8.0)进行金属离子亲和层析柱。

以实施例1步骤3的相同方法培养实施例2的大肠杆菌KCTC 8661P并超声。将细胞匀浆加到柱上，然后用缓冲液(50mM磷酸钠、300mMNaCl、10％甘油，pH6.0)洗涤，然后流过0.3N咪唑溶液(pH7.0)，使酶和树脂分离。图4给出了结果。如图4所示，该酶从大肠杆菌裂解物的总蛋白质(泳道1)纯化到95％以上的均一性(泳道2)。

实施例4

使用实施例3获得的在C-末端携带组氨酸残基的左聚蔗糖酶重复了实施例3-8的实验程序。数据证明，在C-末端结合有组氨酸残基的重组左聚蔗糖酶具有和天然左聚蔗糖酶几乎相同的左聚糖产生活力。

实验性实施例3

左聚糖产生

在5ml pH控制在3-7.5的50mM乙酸缓冲液中，溶解蔗糖至浓度为10％，然后加入0.42U实验性实施例2中获得的粗酶。得到的混合物在10℃反应5小时和48小时，然后测定产生的左聚糖量。

下文表2提供了结果。如数据所显示，当缓冲液pH为5时，产生了最大量的左聚糖。

表2.随缓冲液pH产生的左聚糖量(g/l)时间 pH

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.55 6.6 8.0 9.3 10.0 10.5 9.2 7.0 5.5 4.3 3.048 26.7 30.0 32.9 35.2 35.9 31.1 28.0 27.5 22.1 17.1

实施例5

在10ml 50mM乙酸缓冲液(pH5.0)中溶解蔗糖至浓度为10％，加入实验性实施例2中获得的粗酶1.05U。使得到的混合物在3℃、0℃、5℃和10℃反应达200小时，然后测量根据条件参数产生的左聚糖量。

下文表3显示了结果。如数据所示，反应温度10℃是粗酶的最佳条件，直到反应50小时仍产生左聚糖。

表3.随反应温度产生的左聚糖量(g/l)温度时间期

4 10 27 46 78 167-3℃ 7.3 10.5 20.5 30.0 34.5 30.50℃ 10.1 15.7 29.5 36.5 37.2 32.35℃ 11.3 22.2 33.2 36.4 38.4 33.010℃ 15.2 29.3 34.9 36.7 37.5 29.7

实施例6

在10ml 50mM乙酸缓冲液(pH5.0)中溶解蔗糖至浓度为5-40％，加入实验性实施例2中获得的粗酶2.08U。使得到的混合物在3℃、0℃、5℃和10℃反应达60小时，然后测定根据条件参数产生的左聚糖量。

下文表4显示了结果。如数据所示，蔗糖浓度为30％时产生的左聚糖量比其它蔗糖浓度时的高。

表4.随蔗糖浓度产生的左聚糖量(g/l)蔗糖时间期浓度 2 11 18 25 36 595 12.1 19.0 21.8 21.6 21.4 20.810 14.8 38.2 36.7 39.1 34.2 34.920 14.1 51.4 56.7 52.9 51.4 52.030 14.6 52.4 71.1 66.9 69.8 59.440 11.5 39.1 59.8 58.8 60.0 56.4

实施例7

在5ml 50mM乙酸缓冲液(pH5.0)中溶解蔗糖至浓度为10％，加入实验性实施例2中获得的粗酶0.42U、1.05U和2.08U。使得到的混合物在10℃反应达150小时，然后测定根据条件参数产生的左聚糖量。

下文表5显示了结果。如数据所示，酶活性更高，产生的左聚糖越多。表5.随酶浓度产生的左聚糖量(g/l)

表5.随酶浓度产生的左聚糖量(g/l)酶浓度时间期

4 12 48 96 1440.42U 2.5 4.0 21.7 35.7 39.010.5U 4.9 12.9 34.9 48.5 42.220.8U 24.9 44.9 49.0 49.2 46.2

实施例8

在5ml 50mM乙酸缓冲液(pH5.0)中溶解蔗糖至浓度为20％，加入实验性实施例2中获得的粗酶2.08U。使得到的混合物在10℃反应达36小时，然后测定根据条件参数产生的左聚糖和其它多糖的量。

下文表6显示了结果。如数据所示，酶活性更高，产生的左聚糖量越大。

表6.随反应时间产生的左聚糖量(g/l)糖时间期

0 6 11 18 25 36左聚糖 0 28.3 51.4 56.7 52.9 51.4剩余蔗糖 200 161 125 120 98 10葡萄糖 0 237 36.0 50.4 74.6 104.8果糖 0 2.5 5.8 6.2 6.5 7.2

实施例9

在10ml 50mM乙酸缓冲液(pH5.0)中溶解粗糖至浓度为20％(DaeHan SugarCo.)，加入实验性实施例2中获得的粗酶1.05U。使得到的混合物在10℃反应达91小时，然后测定产生的左聚糖和其它糖的量。反应11小时后产生了12.5g/l左聚糖，25小时后产生了25.0g/l，91小时后产生了45.8g/l。

实验性实施例4

含有能从左聚糖产生DFA IV的左聚糖果糖转移酶的菌株的选择

从韩国土壤中采集的样品中筛选菌株。将0.5克的各土壤样品悬浮于放在9.5ml蒸馏水中，连续将悬液稀释10倍、100倍和1000倍。将各稀释液200微升涂在选择性琼脂平板表面，30℃温箱内培养72小时。选择性琼脂培养基含有0.5％(w/v)左聚糖作为主要碳源，和0.3％NaNO₃、0.05％MgSO₄、0.02％MnCl₂、0.1％K₂HPO₄和1.5琼脂/L。将预定量的左聚糖水溶液通过0.45微米滤膜，将滤液与其它营养物在加到灭菌培养基中之前混合。培养后，初步选出周围有晕圈的菌落作为能分解左聚糖。

在选择性肉汤中接种从最初选择的菌落挑出的菌种，每个肉汤含有左聚糖作为主要碳源，在温箱内30℃培育72小时。对接种的菌株生长和左聚糖代谢产生的代谢物通过薄层层析(TLC)进行了研究。在250个当初选择的菌株中，发现8种微生物产生二果糖二酐。最后，一株可以高酶活力从左聚糖产生二果糖的菌株被选出，称为“K2032”。

菌株K2032的鉴定

通过测试生物化学特性，脂肪酸和醌的组成和含量，并将其与先前积累的数据库比较，鉴定了选出的菌株K2032。许多实验揭示，菌株K2032是革兰氏可变的，能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、木糖、核糖、山梨糖醇、纤维二糖、糖元、蔗糖、乙酸、丙酸和水杨苷，而不能利用鼠李糖、丙二酸、己二酸、N-乙酰谷氨酸和己二酸。对于其胞内脂肪酸组分，该细菌含有比率为51％/14.5％/3.6％的C15反同形/C17反同形，和比率为17.8％/7.1％的C16/C14。作为微生物化学分类的重要成分的醌分析的结果，该细菌含有甲基萘醌MK-9(H₂)。

用这些分析结果将菌株K2032鉴定为产脲节杆菌，称为产脲节杆菌K2032(表7)

表7.菌株K2032的表型和化学分类学特性革兰氏反应可变(早期为+)来自葡萄糖的酸 -硝酸还原 -淀粉水解 -在10％NaCl中的生长 -利用D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、 +D-木糖、D-核糖、D-山梨糖醇、纤维二糖、糖元、蔗糖、乙酸、丙酸、水杨苷利用L-鼠李糖、丙二酸、己二酸、N-乙酰谷氨酸、L-丝氨酸 -细胞脂肪酸C15反同形/C17反同形/C16同形 51％/14.5％/3.6％C16/C14 17.8％/7.1％主要甲基萘醌 MK-9(H2)

实验性实施例3

从节杆菌纯化左聚糖果糖转移酶

在含左聚糖作为主要碳源的选择性肉汤中接种了产脲节杆菌K2032，在温箱内30℃培育72小时。研究该菌生长和左聚糖果糖转移酶活性，了解到培育10小时后，获得最大酶活性。从培育10小时的培养物中纯化该酶(图5)。就此，连续使用丙酮沉淀、离子交换层析(DEAE 650-M和Mono Q)和凝胶过滤层析实现了纯化，产生比活力为2269U/mg蛋白，数量为1.1mg，产率为29.8％的左聚糖果糖转移酶(表8)。

表8从产脲节杆菌K2032纯化左聚糖果糖转移酶的小结

纯化步骤	体积(ml)	总活力(U)	蛋白质(mg)	比活性(Umg^-1蛋白)	纯化倍数	产率(％)
纯化步骤	体积(ml)	总活力(U)	蛋白质(mg)	比活性(Umg^-1蛋白)	纯化倍数	产率(％)	培养上清液	3,800	8,360	182.3	45.9	1.0	100
丙酮沉淀	700	5,670	71.3	79.5	1.7	67.8	培养上清液	3,800	8,360	182.3	45.9	1.0	100
丙酮沉淀	700	5,670	71.3	79.5	1.7	67.8	离子交换吸附	5.5	4,821	5.0	964.2	21.1	57.7
第2次离子交换吸附	3.2	3,416	2.6	1313.8	29.2	40.9	离子交换吸附	5.5	4,821	5.0	964.2	21.1	57.7
第2次离子交换吸附	3.2	3,416	2.6	1313.8	29.2	40.9	凝胶渗透(Superose 12)	1.2	2,496	1.1	2269.0	49.8	29.8

纯化酶的特件

纯化的酶用SDS-PAGE测定，分子量为51,000，而用凝胶过滤层析测定具有96,000的分子量。因此，它被鉴定为在水溶液条件下是二聚体。氨基酸分析显示该酶在C-末端具有一段氨基酸序列SAPGSLRAVYHMTPPSGXLXDOQ，其中X残基未被鉴定。该酶在pH4-105中维持其稳定性，并在pH6.0左右时显示最佳活性。它在55EC时也显示最佳活性。在50℃放置30分钟后，观察到该酶具有90％或更大的残留活性(表9)。该酶活性能被Mn²⁺、Fe²⁺和Hg²⁺所抑制，而被Na⁺和Ca²⁺加强。

表9.添加剂对产脲节杆菌K2032的左聚糖果糖转移酶活性的影响

添加剂	浓度(mM)	相对活性(％)
添加剂	浓度(mM)	相对活性(％)	对照	-	100
NaCl	1,10	125,142	对照	-	100
NaCl	1,10	125,142	NH₄Cl	1	46
MnCl₂	1	9	NH₄Cl	1	46
MnCl₂	1	9	CaCl₂	1,10	156,181
NiCl	1	74	CaCl₂	1,10	156,181
NiCl	1	74	ZnCl₂	1	23
LiCl	1	92	ZnCl₂	1	23
LiCl	1	92	MgCl₂	1	63
FeCl₂	1	4	MgCl₂	1	63
FeCl₂	1	4	HgCl₂	1	0
KCl	1	89	HgCl₂	1	0
KCl	1	89	EDTA	1,10	95,94
SDS	1,10	101,32	EDTA	1,10	95,94

实验性实施例6

节杆菌基因组DNA的分离

用基因组DNA分离试剂盒，如Bio 101出售的，称作“G NOME^TM DNA分离试剂盒”，按照其说明书进行产脲节杆菌编码左聚糖果糖转移酶的基因的分离。首先，将产脲节杆菌K2032接种在50ml选择性肉汤中，培育24小时，然后3,000rpm离心5分钟收集细胞。在细胞沉淀中加入细胞悬液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.1MEDTA(pH8.0))到体积1.85ml。将该细胞悬液与100μl细胞裂解/变性溶液(0.5％SDS)、50μlRNase溶液充分混合，55EC培育15分钟。为了从样品中除去蛋白，加入25μl蛋白酶并在55℃培育1小时。加入500μl盐溶液后，将混合物等分在1.5ml试管中，4℃冷却10分钟。12000rpm离心10分钟后，将上清液转移到15ml试管中，向其中加入2ml TE缓冲液和8ml 100％7醇，来诱导DNA沉淀。12,000rpm离心15分钟收集DNA沉淀，空气干燥，并溶于TE缓冲液中。

左聚糖果糖转移酶编码基因的克隆

用各种限制酶消化从产脲节杆菌制备的基因组DNA，并在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后从琼脂糖凝胶中洗脱出大小范围3-4kb的DNA片段。将部分基因组DNA片段连接在事先用BamHI切割的克隆载体pBluescript KSII⁺中。将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。在转化物中，如下选择携带编码左聚糖果糖转移酶基因的细胞。

首先，用K2032菌株N-末端氨基酸序列的-V-Y-H-M-T-P-，和发现与左聚糖果糖转移酶有同源关系的氨基酸序列(-E-C-P-D-L-F-，p2引物)合成简并引物(p1：5’-GTNTAYCAYATGACNCC和p2：5’-AABAYYTCSGGYCARTC)。使用这些引物，用K2032菌的基因组DNA作为模板，进行标准PCR。从凝胶上洗脱出大小在600-650bp范围内的PCR产物，并引入大肠杆菌的穿梭质粒中。作为限制性酶图谱的结果，鉴定出引入的DNA片段可分为4类，携带这些DNA片段的载体分别被称为pDA17、18和c8。另外，这4种DNA片段的碱基测序分析显示，插入pDA11的DNA片段和噬尼古丁节杆菌的左聚糖果糖转移酶基因具有高度同源(85％)关系。因此，引入pDA18的DNA片段可用作和产脲节杆菌K2032制备的DNA进行Southern杂交的探针，来检测细菌中锚定的左聚糖果糖转移酶基因。在Southern杂交之前，用各种限制性酶消化产脲节杆菌K2032的基因组DNA。Southern杂交的结果，在用ClaI消化后的一5.6kb DNA片段中，用PstI消化后的一8.0kb DNA片段中，用BamIII消化后长于10kb的一DNA片段中检测到信号。因此，用ClaI或PstI切割该基因组DNA，并在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后从琼脂糖凝胶上洗脱得到大小在5-10kb范围内的DNA片段。将部分基因组DNA片段连接入事先已用ClaI或PstI切割的克隆载体pBluescript KSII⁺中。将这些重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中。在这些转化物中，用Southern杂交筛选得到携带编码左聚糖果糖转移酶基因的细胞。最后，当用ClaI切割时，获得携带5.6kbDNA片段的质粒pDCla。另一方面，当用PstI切割时，获得携带8.0kb DNA片段的质粒pDpst。

重组质粒的分离、分析和亚克隆

用常规煮沸法和商品购得的试剂盒进行转化大肠杆菌的DNA制备。为了分析重组质粒，用限制性酶消化并在1％琼脂糖凝胶上电泳。

引入pDcla和pDpst中的DNA片段的限制性酶切基因图谱、基因座的分析和DNA片段的Southern印迹显示，pDcla和pDpst携带有感兴趣基因的N-末端一半和C-末端一半，它们之间有约200bp的重叠段。分别从锚定了这两个基因的细菌中未检测到酶活性。根据碱基测序分析，发现在两个质粒中都存在限制性酶PstI、ApaI和NotI的位点。利用这些共同的限制性酶位点，构建了具有完整开放阅读框(ORF)的质粒pDF8。在质粒pDF8中引入3.5kb长的DNA片段，从锚定该质粒的细菌中检测到酶活力。

克隆的左聚糖果糖转移酶基因的碱基序列及其推测的氨基酸序列

为了分析引入pDF8中的3.5kb DNA的核酸碱基序列，制备了显示规律性距离约300-400bp的DNA梯片段，并进行了测序。结果，确定了3345个碱基的序列，并发现仅具有1个ORF。使用国际互联网上可得的BLAST检索，调查了该ORF的同源性。结果，检测到一个与该ORF高度同源的左聚糖果糖转移酶基因，因此被称作lftA。图6显示了lftA的碱基序列和从其推导的氨基酸序列。

新分离的左聚糖果糖转移酶结构基因含有1566bp，对应于521aa。本发明的基因在其N-末端含有由99个bp(对应于33aa)构成的信号序列，因此推测其完整蛋白的分子量约56kDa。发现其等电点是pH5.15。该左聚糖果糖转移酶基因比噬尼古丁节杆菌GS-9衍生的左聚糖果糖转移酶基因长15个碱基(5个氨基酸)。这两个基因的氨基酸序列同源性是81％(碱基序列同源性76％)。因此，将产脲节杆菌K2032的左聚糖果糖转移酶基因鉴定为新的基因，其碱基序列登录在GenBank，U.S.A.(登录号AF181254)中。

实验性实施例7

携带重组左聚糖果糖转移酶基因的高度可表达的、转化的大肠杆菌的开发

使用限制性酶PstI将lftA基因在其信号肽序列处切断，然后用Klenow处理成平端。用NotI切割分开lftA基因。进一步用SmaI消化Klenow处理的DNA片段，并连接入事先用CIP处理过的pUC118载体中，来构建pUDFA18。将其引入大肠杆菌DH5α中。图7显示了质粒pUDFA18，它通过将lftA基因插入表达载体pUC118中而获得。图8显示了大肠杆菌JUD81在SDS-PAGE中的总蛋白质图谱。大肠杆菌JUD81是用pUDFA18转化的大肠杆菌DH5α。

实验性实施例8

用重组左聚糖果糖转移酶从左聚糖产生DFA IV

在1000ml温水中溶解了20g左聚糖，冷却并用磷酸缓冲液控制在pH6.5。在得到的溶液中加入大肠杆菌JUD81匀浆，并在37℃反应。图9显示了反应混合物中DFA IV和其它糖的量随反应时间的变化。反应40小时后，将反应混合物在热水中放置5分钟，以灭活剩余酶，并加到活性碳柱(直径6.5cm，高20cm)上。用蒸馏水洗涤该柱，直到洗出液中检测不到糖。再次用1000ml 5％乙醇洗涤该柱，然后用1,000ml 25％乙醇洗脱吸附的DFA IV。收集含DFA IV的洗脱液，并用旋转蒸发器浓缩到体积30ml。在该浓缩液中加入100％乙醇，达到最终乙醇浓度为95％或更高，从而使DFA IV沉淀物结晶。用纯乙醇洗涤DFA IV多次并干燥，得到2.5g纯DFA IV。

工业应用性

酸水解后从NMR、HPLC和TLC得到的分析数据证明，获得的DFA IV与标准样品相同。图10是获得的DFA IV的NMR结果。

已用说明性方式描述了本发明，可理解使用的术语是为了描述而不是限制。本发明的许多修改和变化根据上面的讲解是可能的。因此，应理解这些都在权利要求范围内，本发明也可用除了具体描述的以外的方式实施。

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国际格式

原始保藏收据

根据细则7.1条宋基榜儒城区渔隐洞99番地Hanbit APT.110-802韩国大田市305-333

BP/4表(KCCM表17) 单页

Claims

1.一种新颖的微生物产脲节杆菌K2032，其特征在于，该微生物显示了从左聚糖选择性产生二果糖二酐IV的活性和降解左聚糖的活性。

2.一种新颖的左聚糖果糖转移酶，其特征在于，该左聚糖果糖转移酶具有下列氨基酸序列1，衍生自产脲节杆菌K2032，并可水解左聚糖选择性产生二果糖二酐IV：1 M T P A I S R R A V L Q G A G A G A L A L I F G G A V P P A31 A R A S A P G S L R A V Y H M T P P S G W L C D P Q R P V T61 T H G A Y Q L Y Y L H S D Q N N G P G G W D H A S T T D G V91 A F T H H G T V M P L R P D F P V W S G S A V V G T A N T A121 G F G A G A V V A L A T Q P T D G V R K y Q E Q Y L Y W S T151 D G G F T F T A L P D P V I V N T D G R A A T T P A E I E N181 A E W F R D P K I H W D T A R G E W V C V I G R L R Y A A F211 Y T S P N L R D W T L R R N F D Y P N H A L G G I E C P D L241 F E I T A D D G T R H W V L A A S M D A Y G I G L P M T Y A271 Y W T G T W D G E Q F H A D D L T P Q W L D W G W D W Y A A301 V T W P S I D A P E T K R L A I A W M N N W K Y A A R D V P331 T D A S D G Y N G Q N S I V R E L R L A R Q P G G W Y T L L361 S T P V A A L T N Y V T A T T T L P D R T V D G S A V L P W391 N G R A Y E I E L D I A W D T A T N V G I S V G R S P D G T421 R H T N I G K Y G A D L Y V D R G P S D L A G Y S L A P Y S451 R A A A P I D P G A R S V H L R I L V D T Q S V E V F V N A481 G H T V L S Q Q V H F A E G D T G I S L Y T D G G P A H F T511 G I V V R E I G Q A I *

3.一种新颖的左聚糖果糖转移酶基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求2的氨基酸序列的碱基序列。

4.如权利要求3所述的新颖左聚糖果糖转移酶基因，其特征在于，所述碱基序列是下列序列2的碱基序列：1 GCGGTGCACCCCGACTTCCCCTCGACGACCACCGTCCCCCTACCGGCCCACCGCCCGGCCCGACTGCTCCTCAGCCTAGACGGGCCCCTC91 CTCGAGGTCTTCGTCGGGGACGGTGAGGCGACTGCGTCGAACCTGGTCCTCCTGGGGGCCGGCGGTGTGACCGCGAGCCTCGAGACGGCA181 CGGCCAGGAACCGTGCACGTGACCGCGATCGACGTCGAGGCGCCCAGCGATGCTGACGCCCCTGAACCTGCCGCCGTTCTGGGCTGACGA271 GCGCTCCCACCCCGACAGCTCTCCTTCTACCGCTGCCCGAACCAGGGTGGACGCTTCGTCGCGCCCACCCGTCCACGAGAGGAACCAGCA 361 ATGACGCCGGCCATCTCACGCCGCGCCGTGCTCCAGGGAGCCGGCGCCGGAGCACTCGCCCTGATCTTCGGCGGTGCTGTGCCGCCTGCA451 GCCCGGGCATCCGCTCCGGGCTCGCTCCGTGCCGTCTACCACATGACGCCCCCCAGCGGCTGGCTCTGCGACCCCCAACGCCCGGTCACC541 ACCCACGGCGCCTACCAGCTGTACTACCTGCACTCCGACCAGAACAACGGCCCCGGCGGCTGGGACCACGCGAGCACGACCGACGGCGTC631 GCCTTCACGCACCACGGCACCGTGATGCCGCTGCGGCCCGACTTCCCCGTGTGGTCCGGGTCGGCGGTCGTCGGCACCGCGAACACGGCA721 GGGTTCGGCGCCGGCGCGGTCGTCGCGCTCGCGACCCAGCCGACCGACGGCGTCCGCAAGTACCAGGAGCAGTACCTCTACTGGTCGACC811 GACGGCGGGTTCACGTTCACCGCCCTGCCCGACCCCGTCATCGTCAACACCGACGGTCGCGCCGCCACCACGCCCGCCGAGATCGAGAAC901 GCCGAGTGGTTCCGCGACCCCAAGATCCACTGGGACACCGCCCGCGGAGAATGGGTCTGCGTCATCGGACGACTGCGGTACGCCGCGTTC991 TACACCTCGCCGAACCTGCGCGACTGGACACTTCGCCGCAACTTCGACTACCCGAACCACGCCCTCGGCGGCATCGAGTGCCCCGACCTG1081 TTCGAGATCACCGCAGACGACGGGACACGCCACTGGGTGCTCGCCGCCAGCATGGACGCCTACGGCATCGGCCTCCCCATGACGTACGCC1171 TACTGGACAGGCACCTGGGACGGCGAGCAGTTCCACGCCGACGACCTCACCCCGCAATGGCTCGACTGGGGCTGGGACTGGTACGCGGCC1261 GTCACCTGGCCATCGATCGACGCGCCCGAGACCAAGCGCCTCGCCATCGCGTGGATGAACAACTGGAAGTACGCCGCACGCGACGTCCCC1351 ACCGACGCATCCGACGGCTACAACGGGCAGAACTCGATCGTCCGCGAGCTGCGGCTCGCCCGACAGCCTGGCGGCTGGTACACCCTCCTG1441 AGCACCCCCGTGGCAGCGCTGACGAACTACGTCACCGCCACCACCACACTCCCCGACCGGACCGTCGACGGCAGCGCCGTCCTGCCATGG1531 AACGGACGCGCATACGAGATCGAGCTCGACATCGCCTGGGACACCGCGACGAACGTCGGCATCTCGGTGGGCCGCTCCCCCGACGGAACC1621 CGGCACACGAACATCGGCAAGTACGGAGCAGACCTGTACGTCGACCGAGGACCCTCCGACCTCGCCGGGTACTCGCTCGCCCCCTACTCG1711 CGAGCCGCCGCCCCCATCGACCCCGGCGCCCGATCCGTGCACCTGCGCATCCTCGTCGACACCCAGAGCGTCGAGGTCTTCGTCAACGCC1801 GGCCACACCGTGCTCTCCCAGCAGGTCCACTTCGCCGAGGGCGACACGGGAATCTCGCTCTACACCGACGGCGGCCCCGCACACTTCACC1891 GGCATCGTCGTCCGCGAGATTGGCCAGGCGATCTAGGCGATGCACACCACACCGCTCACCGAAGCCGCGCCCCGGGAGACGACGGCCGAC1981 AATCGACACGTCCTCGTCGTT

5.如权利要求3所述的新颖左聚糖果糖转移酶基因，其特征在于，所述碱基序列是下列序列3的碱基序列：1 GCGGTGCACCCCGACTTCCCCTCGACGACCACCGTCCCCCTACCGGCCGACCGCCCGGCCCGACTGCTCCTCAGCCTAGACGGGCCCCTC

6.一种重组表达载体，其特征在于，该载体有携带权利要求3所述的左聚糖果糖转移酶基因。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体是pUDFA81。

8.一种新颖的转化体，其特征在于，该转化体被权利要求6所述的重组表达载体所转化。

9.一种新颖生物大肠杆菌JUD81，保藏号KCTC0877BP，其特征在于，该生物是通过用权利要求7所述的表达载体pUDFA81转化大肠杆菌DH5α制备的。

10.一种从左聚糖产生二果糖二酐IV的方法，其特征在于，在25-50℃，pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，左聚糖果糖转移酶的存在下，使左聚糖溶液反应3-10小时。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，反应在37℃下进行。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，酸性缓冲液是pH5.8的磷酸缓冲液。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，左聚糖溶液的左聚糖浓度是5-15％重量/体积比。

14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，左聚糖果糖转移酶在其C-或N-末端具有组氨酸残基。

15.一种制备左聚糖果糖转移酶的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

培养锚定有携带左聚糖果糖转移酶基因的表达质粒的细菌菌种；

收集并匀浆细菌细胞；和

从细胞匀浆中分离左聚糖果糖转移酶。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，左聚糖果糖转移酶在其C-或N-末端具有组氨酸残基。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，分离步骤用金属离子亲和层析法进行。

18.一种从蔗糖产生二果糖二酐IV的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

在pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，左聚蔗糖酶的存在下使糖溶液在室温或更低温度下反应，产生左聚糖；

从糖反应混合物中部分或完全纯化左聚糖；

在25-50℃，pH3.0-7.0的酸性缓冲液中，左聚糖果糖转移酶的存在下，使左聚糖溶液反应3-10小时；和

从左聚糖反应混合物中分离二果糖二酐IV。

19.如权利要求18的方法，其特征在于，左聚蔗糖酶衍生自运动发酵单胞菌。

20.如权利要求18的方法，其特征在于，糖溶液在0-15℃反应。

21.如权利要求18的方法，其特征在于，糖溶液的糖浓度是10-30％重量/体积比。

22.如权利要求18的方法，其特征在于，左聚糖溶液在37℃反应。

23.如权利要求18的方法，其特征在于，糖溶液的酸性缓冲液是pH5.0的乙酸缓冲液，而左聚糖溶液的酸性缓冲液是pH5.8的磷酸缓冲液。

24.如权利要求18的方法，其特征在于，左聚糖溶液具有5-15％重量/体积比的左聚糖浓度。