DE69622924T2

DE69622924T2 - Verbesserte Verfahren zur Herstellung von Nährhydrolysaten

Info

Publication number: DE69622924T2
Application number: DE69622924T
Authority: DE
Inventors: James Mccarthy; Dharam Vir Vadehra
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2016-05-10
Also published as: US5618689A; DE69622924D1; EP0744132A3; CN1140554A; IN183515B; MY113242A; JPH08322471A; EP0744132A2; EP0744132B1; NO962132L; SG80550A1; NZ286636A; BR9602475A; ZA964204B; ATE222065T1; AU5450996A; CA2177294A1; RU2185075C2; MX9601967A; NO962132D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die enzymatische Hydrolyse von Substanzen, insbesonde¬ re von proteinhaltigen Substanzen und darüber hinaus insbesondere von Protein-haltigen Nahrungsmittel-Substanzen.
Das Interesse an der Verwendung von Enzymen, um Substanzen zu hydrolysieren, ist in der Industrie in den vergangenen 25 Jahren erheblich gestiegen, insbesondere in der Nahrungsmittelindustrie, da bei der Säure-Hydrolyse, die lange Zeit angewendet wurde, einige essentielle Aminosäuren vollständig und andere teilweise zersetzt werden. Zudem wurde nun festgestellt, dass während der Protein-Hydrolyse mit Salzsäure Nebenprodukte gebildet werden, einschließlich solche, die als Chlorhydrine bekannt sind, d. h. Chlorpropanol und Diolverbindungen, und Gesundheitsprobleme hervorrufen.
Die enzymatische Hydrolyse von Substanzen funktioniert nach dem Grundsatz der Spaltung von chemischen Bindungen von Substanzen. Allgemein werden Hydrolysat-Zubereitungen, die selbst als genießbares Konsumgut wie für Nahrungsmittelzwecke oder für andere Verwendungen beispielsweise als Geschmacksstoffe oder für die Zubereitung von anderen Produkten eingesetzt werden sollen, oder zum Erhalten einer bestimmten Produktfraktion oder von Fraktionen davon für derartige oder andere Verwendungen eingesetzt werden sollen, beispielsweise gewonnen, indem eine Enzym-Zubereitung mit einer wässrigen Suspension einer Substanz unter Bedingungen vereinigt wird, bei denen die Substanz für die Wirksamkeit des Verfahren zumindest teilweise solubilisiert wird. Die Wahl der Enzym-Zubereitung und anderer Reagenzien basiert auf der zusammengesetzten, chemischen Struktur der Substanz(en), die hydrolysiert werden sol(en), und auf einer gewünschten Hydolysat-Produktspezifikation.
Der Einsatz von sterilen Lactase-Enzym-Zubereitungen in pasteurisierter oder sterilisierter Milch und Milchprodukten, um Lactose aufzuspalten, auf die in Bijl, CA 1 246 476 Bezug genommen wird, ist bekannt, und es wird angenommen, dass sterile Enzymzubereitungen in der Pharmaindustrie verwendet werden. Allgemein im Zusammenhang mit dem Hydrolysieren von Proteinen, insbesondere im Bereich der Industrie zur Zubereitung von genießbaren Nahrungsmittel- und Geschmackstoff-Produkten, wird eine mikrobiologische Kontamination jedoch generell nicht als problematisch angesehen, da die Hydrolyse-Verfahren allgemein bei einer Temperatur im Bereich von 50ºC bis 60ºC, etwa 8 bis 12 Stunden lang durchgeführt werden, so dass der bakterielle Wachstum begrenzt ist, wie in Erikson et al., WO 92/11771 bemerkt ist. Obwohl im Stand der Technik bekannt ist, dass eine enzymatische Hydrolyse von Proteinen bei Temperaturen unter 50ºC durchgeführt werden können, ist jedoch im Allgemeinen sogar in derartigen Fällen eine mikrobiologische Kontamination nicht von. Belang, da die Proteinhydrolysat-Produkte nach Zubereitung auf eine Temperatur und während einer Zeitspanne erhitzt werden, die mindestens ausreicht, um die Enzyme zu deaktivieren, wobei der Einsatz von Temperaturen und Zeitspannen, die eine Pasteurisierung oder Sterilisation des Produktes bewirken, üblich sind.
Andererseits wird jedoch bemerkt, dass die althergebrachte Zubereitung von Sojasoße aus Koji eine mikrobiologische Kontamination mit einer hohen Konzentration an Natriumchlorid umgeht, wobei dies jetzt aus gesundheitlichen Gründen jedoch nicht unbedingt wünschenswert erscheint und darüber hinaus für die Aktivitäten vieler Enzyme nicht förderlich ist.
Andere Mittel, wie in Kemmerer, US 2,180,637, vorgeschlagen und wie von Kikuchi et al., US 3,857,967, angewendet, sind ebenso eingesetzt worden, um das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen sind, die offenbarten Mittel sind für Nahrungsmittel-Anwendungen jedoch unerwünscht.
Verglichen mit bekannten Mikroorganismus-Fermentations- oder Säurehydrolyse-Verfahren, bei denen man die resultierenden Produkte nur begrenzt "maßschneidern" kann, da im Allgemeinen nur das Ausmaß oder der Grad der Hydrolyse leicht gesteuert werden kann, ermöglicht eine enzymatische Hydrolyse hinsichtlich jedes einzelnen, behandelten Substrates theoretisch den Erhalt einer Vielfalt an Produkten, die auf bestimmte Spezifikationen mit größerer Präzision zugeschnitten sind. Selbst für den Fall, dass der Fall auftreten kann, wie im Stand der Technik belegt wird, werden allgemein, insbesondere in Anbetracht einer Kosten-/Nutzen-Analyse, obwohl es auf die eingesetzte Enzymmenge ankommt, die Ausbeuten der erwünschten Produkte, die durch enzymatisches Hydrolysieren von Proteinen erhalten werden, als gering eingestuft, und es ist allgemein die Regel, mehr denn die Ausnahme, dass derartige Verfahren zu beträchtlichen Mengen an Nebenprodukten (eines oder mehrere) führen, für die es relativ wenige Anwendungsmöglichkeiten gibt und die keinen größeren ökonomischen Wert aufweisen.
Ein Faktor, der sich auf die Erträge der erwünschten Produkte (eines oder mehrere) auswirkt, ist, dass Enzymzubereitungen, die für den allgemeinen industriellen Gebrauch hergestellt werden und in Fachkreisen als Enzyme von handelsüblichem Gütegrad bekannt sind, allgemein ein Gemisch oder ein "Cocktail" von einer Vielzahl von Produkten sind, die sich in ihrer Substrat-Affinität und Spezifität, nachstehend "Aktivität", d. h. in der Fähigkeit, eine bestimmte chemische Substratbindungsspaltung unter irgendeinem bestimmten Satz von Reaktionsbedingungen einschließlich pH-Wert und Temperatur zu bewirken, unterscheiden. Obwohl im Allgemeinen die Aktivität eines Enzyms im Zubereitungscocktail überwiegt, und obwohl Situationen bekannt sind, worin zwei erwünschte Aktivitäten der Enzymzubereitung aufeinanderfolgen können wie durch Hilfe einer pH-Wert-Kontrolle, wie in Gianna et al., EP-A-0 320 717, offenbart, können die anderen Enzyme (eines oder mehrere) der Zubereitung, die als "Verunreinigungen" angesehen werden können, Ergebnisse und Wirkungen hervorrufen, die mit den erwünschten Ergebnissen und Wirkungen konkurrieren oder sogar mit diesen nicht übereinstimmen können. Die "Verunreinigungen" können beispielsweise die theoretische Ausbeute, abhängig vom Substrat und/- oder den Hydrolyse-Bedingungen, schmälern, da diese konkurrierende Reaktionen hervorrufen können und/oder das Enzym mit der vorherrschenden Aktivität zerstören können, was zu einer, hinsichtlich theoretischer Überlegungen, in diesem Maße nicht erwarteten Reaktionshemmung führt.
Um die Verfahrenssteuerung und die Endproduktspezifität zu verbessern, wäre der Einsatz von im Wesentlichen reinen Enzymen wünschenswert. Die einhergehenden, erhöhten Enzymzubereitungskosten aufgrund von Reinigungsverfahren weisen im Allgemeinen ein Kosten- /Nutzen-Verhältnis vor, das im Allgemeinen bei einer allgemeinen industriellen Verwendung nicht gerechtfertigt ist, anders als in der Pharmaindustrie oder bei relativ hochwertigen analytischen Vorhaben in kleinem Rahmen oder in der Bio-Technik. Das ist insbesondere im Bereich der Nahrungsmittel-Geschmackstoff-Technik der Fall, insbesondere, wenn die Kosten/Nutzen bei einer Verwendung von gereinigten Enzymen mit denen bei der Durchführung gewöhnlicher Mikroorganismus-Fermentationen oder einer Säure-Hydrolyse verglichen werden.
Um die vorstehend erwähnten Probleme anzugehen, ist es in der industriellen Praxis, insbesondere auf dem technischen Gebiet der genießbaren Stoffe, d. h. Nahrungsmittel, nicht unüblich, größere Mengen an Zubereitungen von handelsüblichem Gütegrad einzusetzen, um die Aktivität des dominierenden Enzymes einer gegebenen Zubereitung zu erweitern, verglichen mit denen, welche theoretisch bei einem gegebenen Satz an Verarbeitungsbedingungen erforderlich wären, und die Reaktion etwa 8 bis etwa 12 Stunden lang durchzuführen. Der Einsatz größerer Mengen an Enzymzubereitung beschleunigt beispielsweise die Reaktionsgeschwindigkeit unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, wobei Schwierigkeiten im Allgemeinen beider Durchführung auf diese Weise nicht aufkommen, wenn Protein-haltige Substanzen im gemäßigten Maße einer Hydrolyse unterworfen werden, um ein Hydrolysat mit einem breiten Peptid-Profil und das Bestandteile mit einem Molakulargewicht von über 10.000 Dalton aufweist, zu erhalten.
Verschiedene Probleme treten jedoch auf, wenn der Erhalt eines Proteinhydolysates, wie eines, das für Nahrungsmittel-Anwendungen geeignet ist, erwünscht wird, das einen hohen Hydrolysegrad aufweist, so dass das Produkt eine bedeutende Menge an freien Aminosäuren und/- oder ein enges Peptid-Größenbereichprofil, beispielsweise ein Molekulargewicht unter etwa 10.000 Dalton und vorzugsweise unter etwa 6.000 Dalton enthält. Wie im Stand der Technik diskutiert wird, sind derartige Produkte bei einer großen Vielfalt an Nahrungsmittel- und die Ernährung betreffenden Anwendungen zweckmäßig, einschließlich für Formulierungen für Kinder, die auf Milchproteine allergisch sind. Die Ausbeuten derartiger Produkte werden jedoch wie bereits angesprochen, außer unter Einsatz von bestimmten Reaktanden-Kombinationen und unter Bedingungen, wie in Jost, US 5,039,532, allgemein für unerwünscht niedrig eingestuft, und im Allgemeinen werden derartige Verfahren aufgrund des Einsatzes der Enzymzubereitung(en) für teuer gehalten. Andererseits kann das eingesetzte Substrat verdünnt sein, um den Enzymverbrauch zu senken, was ebenso die Verfahrenswirtschaftlichkeit auf Grund von Einheit/Volumen-Betrachtungen unattraktiv macht.
Um hochwertige Endverbraucher-Produkte, wie vorangehend beschrieben zu erhalten, kann man bekanntlich zudem enzymatische Verfahren mit Hydolysat-Isolations-Verfahren wie Ultrafiltration kombinieren. Diese Verfahren schließen beispielsweise jene ein, die in Erikson et al., WO 92/11771, und in Nielsen et al., WO 93/24020, offenbart werden, wobei eine Alternative zu separaten Isolationsverfahren in Maubois et al., US 4,427,658, vorgelegt worden ist, worin der Einsatz eines Ultraflltrations-Membran-Reaktors offenbart wird, der in kontinuierlicher Weise zum Recycling und zum weiteren Verarbeiten eines Permeats eingesetzt werden kann. Maubois zeigt jedoch auf, dass das Verhältnis der Enzym-Konzentration zur Protein-Konzentration in der Größenordnung von 8% bis 15% liegen muss.
Folglich ist in der Nahrungsmittelindustrie, insbesondere im Zusammenhang mit dem Hydrolysieren von Proteinen seit langem und immer noch erwünscht, durchwegs enzymatische Hydrolysate mit geringem Molekulargewicht und/oder schmalem Peptid-Profil zu erhalten und das zwiespältige Problem zu lösen, die Ausbeute zu steigern und gleichzeitig die Menge des Enzymgebrauchs zu senken, um Kostenerspamisse und Kosten/Nutzen-Wirtschaftlichkeit zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum enzymatischen Hydrolysieren von Substanzen, die auf enzymatische Hydrolyse ansprechen, insbesondere von Protein-haltigen Substanzen, bereit, das den Einsatz von Enzymzubereitungen bei einer Temperatur ermöglicht, die das Optimieren oder anderweitig das Steuern einer enzymatischen Aktivität ermöglicht, um einen hohen Hydrolysegrad und eine erweiterte Produkt-Profilsteuerung zu bewirken, wobei keine antimikrobiellen Mittel eingesetzt werden. Insbesondere im Fall einer Protein-Hydrolyse, ermöglicht die vorliegende Erfindung bezeichnender Weise nicht nur den Erhalt der vorstehenden Vorteile, sondern ermöglicht zudem den Erhalt von Ausbeuten an enzymatischen Hydrolyse-Produkten mit niedrigem Molekulargewicht, die mindestens mit den Ausbeuten von früheren Verfahren vergleichbar sind, obwohl eine Menge an Enzymzubereitung verwendet wird, die geringer als die bislang im Stand der Technik der enzymatischen Hydrolyseverfahren allgemein Verwendete ist. Die vorliegende Erfindung stellt damit eine Kostenreduzierung verglichen mit enzymatischen Verfahren des Stands der Technik bereit, da die Enzymverwendung einen, wenn nicht den primären Verarbeitungskostenpunkt bei der Anwendung einer enzymatischen Hydrolyse darstellt.
Zusätzlich kann man entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren die Temperaturbedingungen beim Verarbeiten abändern, um eine Aktivität einer Enzymzubereitung zu vergrößern und/oder eine Aktivität von Enzym-"Verunreinigungen" einer Zubereitung zu ändern oder zu vergrößern. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht darüber hinaus die Verwendung von Enzymen zur Herstellung von Hydrolysaten für die Nahrungsmittelverwendung, die vormals allgemein für die industrielle Verwendung aufgrund deren Aktivitäts-Temperaturprofils nicht als günstig eingestuft wurde.
Die vorstehenden Ergebnisse werden durch ein Verfahren erzielt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Substrat, das auf enzymatische Hydrolyse anspricht und keine lebensfähigen mesophilen Mikroorganismen und Sporen enthält, insbesondere ein Protein-haltiges Substrat, in einem sterilen System mit einer sterilen Enzymzubereitung, die zum Hydrolysieren des Substrats, d. h. zur Spaltung des Substrats, geeignet ist, hydrolysiert wird.
Die Hydrolyse kann bei jeder Temperatur einschließlich des mesophilen Bereichs, d. h. bei etwa 20ºC bis etwa 40ºC, und bei Temperaturen unter dem mesophilen Bereich, unter Vorbehalt, dass die Temperatur derart ist, dass die Enzyme (eines oder mehrere) aktiv sind, durchgeführt werden. Um zusätzlichen Nutzen aus der Langzeit-Hydrolyse, die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, zu schlagen, wird die Hydrolyse vorteilshaft bei einer Temperatur unterhalb des mesophilen Bereichs ausgeführt, vorzugsweise im psychophilen Bereich, d. h. bei etwa 0ºC bis etwa 20ºC, und weiter vorteilshaft bei einer Temperatur unter 17ºC. Das Substratmittel sollte jedoch nicht unflüssig bzw. non-fluid, d. h. gefroren, sein, und so kann die Hydrolyse vorteilshaft bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 45ºC durchgeführt werden, obwohl höhere Temperaturen nicht ausgeschlossen sind.
Im Zusammenhang dieser Offenbarung und Ansprüche soll der Begriff "Protein-haltiges Substrat" intakte Proteine bedeuten und beinhalten, d. h. Proteine an sich und Peptide.
Im Zusammenhang dieser Offenbarung und Ansprüche soll der Begriff "Enzym-Zubereitung" mindestens ein Enzym in einer stabilen Form, wie in Form eines dehydratisierten Pulvers oder in einer Lösung oder Suspension in einer Flüssigkeit, im Allgemeinen in einem wässrigen Medium, bedeuten und beinhalten, wobei der Begriff sowohl gereinigte Enzyme als auch Enzyme von handelsüblichen Gütegrad, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhaltet.
Im Zusammenhang dieser Offenbarung und Ansprüche soll eine "sterile" Enzymzubereitung bedeuten und beinhalten, dass die Enzymzubereitung keine lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen davon, d. h. keine Pilze, Hefe und Bakterien enthält, wie sie durch bekannte und übliche Verfahren steriler Filtration erhalten werden kann. Eine sterile Enzymzubereitung wird als eine betrachtet, die keine Mikroorganismen oder Sporen, die eine Membran, d. h. einen Filter mit 0,45 u-Poren, passieren können, enthält.
In Fällen, in denen Mikroorganismen und/oder Sporen in der Enzymzubereitung vorhanden sind, aber nicht lebensfähig sind, soll der Begriff "steril" zudem bedeuten, dass die Zubereitung einem Verfahren unterworfen wurde, das die nachstehend Beschriebenen beinhaltet aber nicht auf diese beschränkt ist, um Mikroorganismen und die damit zusammenhängenden Sporen unfähig zu machen zu leben, sich zu entwickeln, sich zu reproduzieren und/oder sich zu regenerieren, so dass jegliches Mikroorganismus-Wachstum, das sich aus der Zubereitung ergibt und das zu verhindern versucht wird, nicht größer ist, als es im Falle einer steril-gefilterten Zubereitung, wie vorstehend beschrieben, wäre.
Im Zusammenhang dieser Offenbarung und Ansprüche soll ein "sterilisiertes System" eine geeignete Vorrichtung zur Durchführung einer enzymatischen Hydrolyse bedeuten und beinhalten, das nachfolgend beschriebene Geräte und Geräte-Systeme beinhaltet, aber sich nicht auf diese beschränkt, welche mit derartigen Verfahren, wie Hitze, UV oder ionisierender Strahlung oder Bestrahlung und/oder Alkoholwaschung oder anderen ähnlichen, im Stand der Technikbekannten Sterilisierungsverfahren, die für den Erhalt eines aseptischen Vorrichtungszustandes geeignet sind, behandelt wurden. Natürlich sollte der sterile Zustand der Systemelemente bis zu deren erfindungsgemäßen Einsatz für eine Verarbeitung mit Hilfe bekannter und anerkannter aseptischer Praktiken und Verfahren in dem möglichen Ausmaß aufrecht erhalten werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
Obwohl erfindungsgemäß jegliche bekannte enzymatisch hydrolysierbare Substanz behandelt werden kann, werden für die Zubereitung von genießbaren Produkten vorteilshaft Protein-haltige Substanzen behandelt. Wie weiter untenstehend veranschaulicht wird, wird die vorliegende Erfindung besonders vorteilshaft für die Behandlung von pflanzlichen Protein-haltigen Substanzen angewendet und weist eine besondere Anwendbarkeit für die Behandlung von Weizengluten, wobei lebenswichtiges bzw. lebensfähiges Gluten inbegriffen sein soll, und von Sojaprotein und von Getreide-bzw. Maisprotein (Corn protein) und von Peptiden, die daraus hergeleitet werden, auf. In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, ist ein abschließender Hydrolyseschritt oder eine Stufe für die Behandlung derartiger Proteinhaltiger Substanzen üblich, der wie vorstehend dargelegt ausgeführt wird und eine für die Spaltung eines Peptids geeignete, sterile Enzymzubereitung einsetzt, wobei die ausgewählte Enzymzubereitung abhängig von der erwünschten End-Produktspezifikation ist. Um ein Produkt mit einem hohen Gehalt an freien Aminosäuren zu erhalten, kann beispielsweise insbesondere eine Exopeptidase, d. h. eine Aminopeptidase oder eine Carboxypeptidase, eingesetzt werden, und um höhere Ausbeuten an derartigen wie Glutaminsäure oder Glutamyl-Peptiden zu erhalten, wird eine Glutamase eingesetzt.
So werden bevorzugte, erfindungsgemäße Ausführungsformen für das Hydrolysieren von Protein-haltigen Substanzen am vorteilshaftesten in vielen Stufen ausgeführt, wobei die vorstehend beschriebene Erfindung am vorteilshaftesten als abschließende Stufe angewendet wird. Allgemein wird in derartigen Fällen ein Hydrolysat, das durch proteolytisches Hydrolysieren einer Suspension einer Protein-haltigen Substanz erhalten wird, so behandelt, dass mesophile Mikroorganismen und Sporen, die im Hydrolysat enthalten sind, abgetötet werden, wobei allgemein das Abtöten der Mikroorganismen und Sporen wirksam durchgeführt wird, indem das Hydrolysat bei einer Temperatur und für eine Zeit erhitzt wird, die ausreicht, um das Hydrolysat abzuändern, so dass es keine Mikroorganismen und Sporen mehr enthält. Das erhitzte Hydrolysat wird dann derart abgekühlt, dass es seine Sterilität beibehält, und dann wird das abgekühlte Substrat in einem sterilen System mit einer sterilen Enzymzubereitung, wie vorstehend beschrieben, hydrolysiert.
Wie vorstehend gezeigt, werden beim Behandeln von Protein-haltigem Material die erfindungsgemäßen Vorteil bewirkt, indem eine oder mehr enzymatische Hydrolyse-Stufen oder - Schritte ausgeführt werden. Wenn mehrere Stufen ausgeführt werden, können erfindungsgemäß ein oder mehrere Schritte entsprechend dem vorstehend beschriebenen, sterilen Hydrolyse-Verfahren durchgeführt werden. Wie gezeigt, wurde jedoch allgemein gefunden, dass eine Hydrolyse entsprechend des erfindungsgemäßen, sterilen Hydrolyseverfahrens am vorteilshaftesten als abschließender oder letzter Schritt von vielen Hydrolyse-Schritten durchgeführt wird.
Wenn beispielsweise mit intakten Proteinen begonnen wird, wird, damit eine enzymatische Hydrolyse wirksam abläuft, wie es für einen. Fachmann klar ist, die Protein-haltige Substanz vorteilshaft zuerst teilweise in einem wässrigen Mittel solubilisiert, was eine Bildung einer Suspension der Substanz unterstützt. Wie ebenso klar wird, kann eine partielle Solubilisation der Protein-haltigen Substanz abhängig von der Zusammensetzung der Substanz, die das reaktionsfähige Substrat bereitstellt, durch die Auswahl lediglich der pH-Wert-Bedingungen bewirkt werden. Beispielsweise wurde gefunden, dass Getreide und Getreide-Proteine und in ihrer Zusammensetzung ähnliche Substanzen bei einem pH-Wert von etwa 8 bis etwa 9 genügend solubilisieren, um eine Hydrolyse zu erleichtern. Auf der anderen Seite kann eine mindestens partielle Solubilisation mittels eines Proteolyse-Verfahrens bei einem besonderen pH-Wert bewirkt werden, wobei herausgefunden wurde, dass Weizengluten und in ihrer Zusammensetzung ähnliche Substanzen mit einem derartigen Verfahren am besten solubilisieren.
Damit sind erfindungsgemäß Verfahren inbegriffen, worin vor dem sterilen Hydrolyse- Verfahren eine Protein-haltige Substanz mit einer proteolytischen Enzymzubereitung hydrolysiert wird, um ein Substrat zur Behandlung in dem sterilen Verfahren zu erhalten. Weiterhin kann eine Protein-haltige Substanz vor der Durchführung des sterilen Verfahrens mit einer proteolytischen Enzymzubereitung behandelt werden, um Protein der Substanz für den Erhalt eines zumindest teilweise solubilisierten Substrates zu solubilisieren, wobei das solubilisierte Substrat dann mit einer proteolytischen Enzymzubereitung behandelt wird, um das Proteinhaltige Substrat zur Behandlung in dem sterilen Verfahren zu erhalten, wobei diese Behandlungen derartig ausgeführt werden können, dass das Substrat keine lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen mehr enthält, wobei eine derartige Behandlung hier so definiert ist, dass sie eine Hitze- Behandlung einschließt, um derartiges wie weiter nachfolgend erörtert, zu bewirken.
Zusätzlich kann erwünscht werden, dass ein Substrat entsprechend derartiger Verfahren, wie in den vorstehend angesprochenen PCT-Anmeldungen dargestellt oder entsprechend derartiger Verfahren wie in Melachouris et al., EP-A-0 087 247, offenbart, vorbehandelt wird. Wenn die vorliegende Erfindung als eine abschließende Hydrolyse-Stufe eingesetzt wird, wird in jedem Fall das Substrat, d. h. ein Hydrolysat, das derartig hydrolysiert werden soll, derart behandelt, dass mesophile Mikroorganismen und Sporen im Substrat abgetötet werden, wobei das Substrat dann mit einer Enzymzubereitung wie vorstehend beschrieben hydrolysiert wird.
Insbesondere kann festgestellt werden, dass es vorteilhaft ist, das Protein-haltige Substrat vor einer erfindungsgemäßen Hydrolyse und/oder vor und/oder zwischen den Stufen eines mehrstufigen Verfahrens zu erhitzen, um das Protein, das dadurch die Protein/Peptid-Struktur entfaltet und die Substanz für einen enzymatischen Angriff und eine Spaltung anfälliger macht, zu denaturieren. Die pH-Wert-Bedingungen können ebenso zwischen den Stufen verändert werden, um dem Charakter einer verschiedenartigen Enzymzubereitung, die in einer nachfolgenden Stufe eingesetzt wird, und/oder der Beschaffenheit des Substrates gerecht zu werden. Wie es klar ist, wird ein Arbeiten mit Hitze, um das Substrat so zu verändern, dass es keine lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen mehr enthält, entsprechend Verfahren, wie nachfolgend erörtert, ebenso eine Denaturalisation bewirken.
Die Enzymzubereitungen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, können im Wesentlichen steril gemacht werden, indem Mikroorganismen und Sporen von der Zubereitung entfernt werden oder indem die Enzyme Verfahren unterworfen werden, die Mikroorganismen und Sporen abtöten, sich aber nicht auf die Lebensfähigkeit und die Aktivität der Enzymzubereitung auswirken. Ein bevorzugtes Mittel, um sterile Enzyme zu erhalten, ist die sterile Filtration einer Lösung aus den Enzymzubereitungen, wobei zweckmäßige Systeme für eine derartige Durchführung neben im Stand der Technik bekannten Membranfiltern, die UNIFLO Spritzenfilter sind, wie sie von Schleicher und Schuell, Inc., Keene, New Hamphire, USA bezogen werden können. Ebenso zweckmäßig ist ein PROFLUX M12 Tangentialfiltrationssystem, dass von Amicon, Inc., Beverly, Massachusetts, USA bezogen werden kann.
Wie vorstehend gezeigt, wird eine sterile Enzymzubereitung als eine eingestuft, die keine lebensfähigen Mikroorganismen oder Sporen enthält, die nicht durch einen Filter mit 0,45 u Poren durchgehen. Es können jedoch kleinporigere Filter eingesetzt werden, wobei vorzugsweise Mikroorganismen und Sporen, die durch eine Membran, d. h. einen Filter, mit 0,22 u Poren passieren können, sicherheitshalber ausgegrenzt werden können.
Eine sterile Enzymzubereitung kann zudem durch eine Bestrahlung einer Enzymzubereitung, wie mit ionisierender Strahlung wie in der DD 237 078 A3 offenbart, oder durch im Stand der Technik bekannte Aceton- oder Alkohol-Ausfällungsverfahren erhalten werden. Andererseits sollte eine sterile Enzymzubereitung zu Verfügung stehen, wie in Form eines Pulvers, wobei, wenn die Zubereitung wunschgemäß in Wasser verdünnt werden soll, steriles Wasser verwendet werden muss.
Nachdem die sterile Enzymzubereitung erhalten wurde, sollte sie für eine erfindungsgemäße Verwendung in jedem Fall entsprechend guter steriler/aseptischer Praktiken behandelt werden. Bezüglich der Behandlung des Substrates, das erfindungsgemäß hydrolysiert werden soll, so dass es keine lebensfähigen mesophilen Mikroorganismen und Sporen mehr enthält, ist herausgefunden worden, dass, wenn eine mehrstufige Hydrolyse ausgeführt wird, Angaben vorgelegt sein können, ob eine vorangegangene Verarbeitung Sporen zu einem Auswuchsstadium, was vorrangig von den angewandten Temperaturbedingungen abhängt, überführt hat oder nicht. Wenn beispielsweise ein dreistufiges Hydrolyseverfahren angewendet wird, kann man einfach das erste Hydrolysat, d. h. solubilisierte Substrat, auf eine Temperatur und für eine Zeitspanne erhitzen, die lediglich ausreicht, um die lebensfähigen Mikroorganismen abzutöten, d. h. nur die Mikroorganismen zu töten. Obwohl einige Sporen abgetötet worden sein können, werden die restlichen Sporen in diesem Fall zu einem sogenannten Auswuchsstadium überführt. Es werden dann Bedingungen für eine Zeitspanne bei einer Temperatur beibehalten, die günstig sind, damit sich die Sporen regenerieren und sich zu lebensfähigen Mikroorganismen umwandeln und wachsen, d. h. in einer Größenordnung bis zu etwa 2 Stunden oder so, wobei das Substrat dann auf eine ausreichende Temperatur und über eine ausreichende Dauer hinweg erhitzt wird, um die Mikroorganismen abzutöten, dabei befreit dieses mehrstufige Verfahren das Substrat wirksam von lebenden Mikroorganismen und Sporen.
Von einem praktischen Standpunkt aus darf sich das Auswuchsstadium im Zusammenhang eines dreistufigen Hydrolyse-Verfahrens im zweiten Hydrolyse-Schritts fortsetzen, wobei nach diesem Hydrolyseschritt das Hydrolysat erhitzt wird, um die Mikroorganismen abzutöten, wodurch die erforderliche Eigenschaft für das Substrat bereitgestellt wird, um mit dem Verfahren, das eine sterile Enzymzubereitung einsetzt, fortzufahren. In so einem Verfahren kann man daher allgemein eine Temperatur und eine Zeitspanne, die für das Deaktivieren der Enzyme (eines oder mehrerer) ausreicht und/oder eine Temperatur, die für gewöhnliche Pasteurisierungs-Verfahren angewendet wird, einsetzen. Damit können Temperaturen im Bereich von allgemein mindestens etwa 80ºC eingesetzt werden. Sicherheitshalber wird jedoch allgemein eine Temperatur in der Größenordnung von mindestens etwa 90ºC für eine Zeit, die für das Abtöten von Mikroorganismen ausreicht, d. h. von etwa 5 Minuten bis etwa 30 Minuten, eingesetzt, wobei vorzugsweise am vorteilshaftesten Temperaturen im Bereich von etwa 90ºC bis etwa 110ºC eingesetzt werden
Ein Erhitzen für die Deaktivierung/Pasteurisierung kann schubweise, vorzugsweise unter Rühren oder mit anderer Bewegung, unter Anwendung von Dampfinjektion oder mit einem umhüllten Behälter oder einem geeigneten platten-artigen Wärme-Austauscher mit oder ohne Dampfinjektion oder kontinuierlich in einem Rohr, das vorzugsweise Dampfinjektion und statische Mischelemente einsetzt, ausgeführt werden.
Für den Erhalt eines Substrates, das keine lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen enthält, kann auf der anderen Seite das Substrat, beispielsweise ein Hydrolysat, in einer Suspension schubweise oder kontinuierlich mit Dampf bei Temperaturen von mindestens etwa 121ºC und einem Druck von 15 psi (d. h. über etwa 1 bar) mindestens etwa 15 Minuten lang und gemäß im Stand der Technik anerkannter Hoch- oder Ultrahhoch-Temperatur/Kurzzeit-Sterilisations-Verfahren erhitzt werden. Dieses Verfahren muss ausgeführt werden, wenn das Substrat, das erfindungsgemäß behandelt werden soll, keinen Bedingungen unterworfen wurde, die zu einem Auswuchsstadium, wie vorstehend erörtert, überführen. Die Sterilisation kann mit vorstehend erwähnten Mitteln in Verbindung mit dem Deaktivierungs/Pasteurisierungs-Verfahren ausgeführt werden, wird jedoch allgemein am vorteilhaftesten kontinuierlich, mit Dampf in einer Röhre, die statische Mischelemente enthält, ausgeführt.
Proteinhaltige Substanzen, die erfindungsgemäß zweckmäßig behandelt werden sollen, enthalten eine genießbare Proteinsubstanz, insbesondere Nahrungsmittel-anerkannte Substanzen. Zusätzlich zu den besonderen, vorstehend bemerkten Substanzen beinhalten derartige Proteinhaltige Substanzen Fleisch (einschließlich tierisches, Geflügel- und Fisch-Fleisch) und Knochen, Collagen, Eiweiß- (bzw. Albumin) und Eigelb-Proteine und andere Phospho-Proteine und Protein-enthaltende Extrakte daraus, und beinhalten Derivate von tierischen Proteinprodukten, wie Gelatine. Diese Substanzen beinhalten zudem Milchsubstanzen, einschließlich aber nicht beschränkend auf Molkeproteine und Casein, und beinhalten andere, vorstehend nicht erwähnte, Protein-enthaltende pflanzliche Substanzen, wie Protein-enthaltende Ölfrucht-Samen zusätzlich Sojabohnen, einschließlich entfettete Sojabohnen, und Reisprotein und Quinoa. Die Proteinhaltigen Substanzen können zudem Protein-beladene Substanzen und Extrakte, die aus Mikroorganismen einschließlich Zellen von Hefe und dergleichen erhalten werden, enthalten.
Die eingesetzte Enzymzubereitung ist von ihrer Zusammensetzung und Aktivität(en) abhängig und wird mit Blick auf die gewünschte Endprodukt-Spezifikation gewählt. Die Enzyme der Zubereitungen können natürlich, d. h. aus in der Natur vorkommenden Mikroorganismen isoliert sein oder aus genetisch modifizierten Mikroorganismen ("GMO"), d. h. Genprodukten, die geklont und/oder über-exprimiert wurden, sein, oder können Enzyme, die mittels Mutagenese erzeugt wurden, sein. Enzyme, die chemisch modifiziert wurden, wie durch Immobilisation oder Insolubisation einschließlich ein Überziehen auf Kügelchen oder biologische Proteine oder mit derartigem wie PEG oder Pektin, können ebenso eingesetzt werden.
Obwohl Enzyme von handelsüblichen Gütegrad am kostenwirksamsten eingesetzt werden, kann insbesondere in Fällen, bei denen ein Höchstgrad an Steuerung des Spezifikationsprofils des Endprodukts angestrebt wird, ein Enzym mit höchster Reinheit eingesetzt werden, wobei gereinigte und andere bislang nicht als kostenwirksam eingestufte Enzyme Kosten-Nutzen-wirksame Anwendungen finden können, da verglichen mit den Mengen, die gewöhnlich für das Erreichen eines ähnlichen Ergebnisses eingesetzt werden, beispielsweise einem ähnlichen Hydrolysegrad und ähnlicher Produktausbeuten, geringere Mengen an Enzym in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können.
Insbesondere im Fall von Enzymen mit handelsüblichen Gütegrad kann eine Auswahl auf einer Sicht auf die Aktivitäten von "Verunreinigungen" basieren, d. h. von anderen Enzymen, als das spezifische Enzym, das eine dominierende Aktivität aufweist, die wie vorstehend bemerkt in einer Enzymzubereitung enthalten sind.
Diesbezüglich kann, wie vorstehend gezeigt, festgestellt werden, dass Temperaturbedingungen abgeändert werden können, um die gewünschte dominierende Enzym- Aktivität der Zubereitung zu vergrößern und/oder die Aktivität von derartigen "Verunreinigungen" zu ändern oder vergrößern, was bisher im Stand der Technik noch nicht wissentlich vorgeschlagen wurde. Darüber hinaus können Enzyme, die im psychophilen Temperaturbereich aktiv sind, ebenso besondere Anwendbarkeit finden, insbesondere wenn unter vorstehend bemerkten, bevorzugten, erfindungsgemäßen Temperaturbedingungen gearbeitet wird.
Im Fall der Behandlung von Proteinen kann jede proteolytische Enzymzubereitung eingesetzt werden, wobei auf Webb, Enzyme Nomenclature, NC-IUBMB, Academic Press, Inc., 1992, Bezug genommen wird, worin eine Zusammenstellung von Enzymen sowie deren Verwendungen und Substratspaltung-Kennzeichen bereitgestellt werden. Jede sauer-, neutral- oder alkalisch-aktive Protease kann gewählt werden, abhängig von der Eigenschaft des Substrats und den gewünschten Verarbeitungsbedingungen.
Allgemein können beispielsweise proteolytische Enzyme aus tierischen und pflanzlichen Quellen und insbesondere aus mikrobiellen Quellen wie aus Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sogae, Bacillus subtilis, Mucor sp. oder Rhizopus oryzae erhalten werden. Derartige Enzyme umfassen Enzyme wie beispielsweise in den vorstehend angegebenen Schriften und in der US 3,914,346 offenbart, wobei die Offenbarungen hiervon unter Bezugnahme eingegliedert werden. Obwohl allgemein im industriellen Zusammenhang für die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten als teuer eingestuft wird, können Trypsin und Chymotrypsin jedoch ebenso zweckmäßig verwendet werden, wobei Pankreatin, das sowohl lipolytische als auch proteolyitsche Aktivität bereitstellt, in bestimmten Fällen zweckmäßig eingesetzt werden kann.
Aus Kostengründen kann jedoch insbesondere bei der Verarbeitung unter sauren Bedingungen eine saure Protease (acid protease), wie sie von Quest International aus Sarasota, Florida, USA, bezogen werden kann und die als Biocon saure Protease oder als saure Protease L-Zubereitungen bekannt ist, zweckmäßig eingesetzt werden. Beim Verarbeiten unter neutralen Bedingungen kann eine neutrale Protease wie Protease 2A, wie sie von Amano International Enzyme Co., Inc. aus Troy, Virginia, USA, bezogen werden kann, zweckmäßig eingesetzt werden, und beim Verarbeiten unter alkalischen Bedingungen kann eine Alkalase 2.4L-Zubereitung, wie sie von Novo Nordisk A/S aus Bagsvaerd, Dänemark, bezogen werden kann, zweckmäßig eingesetzt werden.
Für den Erhalt von Produkten mit hohen Gehalten an freien Aminosäuren kann jede der verschiedenartigen Exopeptidase-Zubereitungen eingesetzt werden. Aminopeptidase-Enzyme wie in der US 3,914,436 offenbart, deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme eingegliedert wird, können zweckmäßig eingesetzt werden, obwohl eine Auswahl aus allen in der Enzym Nomenclature aufgelisteten, abhängig von den erwünschten Ergebnissen, gemacht werden kann.
Eine besonders zweckmäßige Aminopeptidase-Enzymzubereitung beinhaltet eine Peptidase A Amano-Zubereitung, die bei Amano erhältlich ist und die, wie bemerkt werden soll, ebenso eine Endopeptidase-Aktivität aufweist. Corolase-Enzymzubereitungen, die von Rohm Tech, Inc. aus Malden MA, USA, geliefert werden, und die eine Exo- oder Endopeptidase-Aktivität aufweisen können, werden zweckmäßig eingesetzt, wobei festgestellt wird, dass Corolase PP Carboxypeptidase-B-Aktivität aufweist. Ebenso zweckmäßig werden Flavourzyme- Enzymzubereitungen von Novo eingesetzt, die Carboxypeptidase-Aktivität enthalten können. Es kann ebenso gefunden werden, dass Promod-Peptidase-Enzyme, erhältlich bei Biocatalysts Ltd, aus Pontypield, Wales, UK, zweckmäßig für das Hydrolysieren von Sojaprotein eingesetzt werden.
Klar ist ebenfalls, dass Carboxypeptidasezubereitungen, die in Enzyme Nomenclature aufgelistet sind, eingesetzt werden können.
Für den Erhalt von Produkten mit hohen Anteilen an Glutaminsäure und/oder Glutamyl-Peptiden, kann das "PGase"-Enzym, das in dem Kikuchi '967 Patent, vorstehend angemerkt, offenbart wurde, verwendet werden, und abermals können derartige Enzyme wie in der Enzyme Nomenclature aufgelistet, verwendet werden.
Obwohl sich die Lehrmeinungen des Stand der Technik auf Aktivitäts-Einheit-Gehalte von Enzymen und Enzymzubereitungen, d. h. auf Einheitenlg wie beispielsweise Anson Einheiten/- Hersteller-Einheiten, für die allgemein eine Kreuzkorrelation ohne eine Durchführung von Tests schwierig ist, konzentrieren, ist derartiges keine kritische oder besonders bedeutende Variable, im Zusammenhang mit der Durchführung des erfindungsgemäßen Konzepts. Natürlich sollte man dennoch die Angaben eines Herstellers zu Aktivität, Verwendungskonzentration und Spezifikationen berücksichtigen.
Zusätzlich wurde festgestellt, dass ein Arbeiten entsprechend erfindungsgemäßer Verfahren die Gesamtmenge an Enzym verringert, die für das Erreichen eines gleichwertigen und im Allgemeinen höheren Hydrolysegrades als einem, der beim Arbeiten entsprechend früherer Verfahren zu erwarten war, eingesetzt wird. Beispielsweise können eingesetzte Enzymmengen allgemein in der Größenordnung von bis zu 50% geringer als allgemein von Enzymlieferanten empfohlen und/oder allgemein in einer besonderen Anwendung eingesetzt wird, sein. Wie ebenso nachstehend in einem Beispiel veranschaulicht wird, können erwünschte Ergebnisse und höhere Ausbeuten durch Einsatz von Enzymmengen in der Größenordnung von 1 Gew.-% oder weniger, bezogen auf das Trockengewicht des Substrats, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Hydrolyseverfahren können schubweise, wie seit langen im Stand der Technik üblich, oder mittels derartiger Verfahren wie im vorstehend angegebenen Jöst Patent dargelegt, durchgeführt werden. Ein kontinuierlicher Ultrafiltrationmembran-Reaktor kann ebenso eingesetzt werden, wobei Zirkulationsrohr-Reaktoren zweckmäßig eingesetzt werden können einschließlich derartiger wie in Oosterhuis et al., US 5,073,496, offenbart. Kontinuierliches Arbeiten auf eine Weise wie in Baensch et al., EP-A-0 566 877, offenbart, ist möglich. Ortsfeste Enzymreaktoren (fixed enzymreactors) können ebenso in Betracht gezogen werden. In dieser Hinsicht ist es klar, dass sich abweichende Ausstattungs- und Verarbeitungskonfigurationen im Allgemeinen auf derartiges wie Reaktionskinetik und Reaktionsinhibitionsgrenzen auswirken werden, aufgrund von derartigem wie über die Zeit, aufgrund von Unterschieden in der Arbeitsweise, abweichenden Verhältnissen zwischen Reaktanden und einem Reaktionsprodukt.
Wie aus den Offenbarungen von Jost überdies klar wird, kann insbesondere die Hydrolyse von Milchproteinen, und insbesondere von Molkeproteinen, in mindestens zwei Stufen mit Hitze-Denaturierungsschritten und Enzymen wie Trypsin, Chymotrypsin und Pancreatin und einer Alkalase-Zubereitung durchgeführt werden. Um die Endprodukt-Spezifikation zu erreichen, wird die End-Hydrolysestufe erfindungsgemäß jedoch in einem sterilen System mit einem sterilen Enzym und einem Hydrolysat, das keine lebensfähigen mesophilen Mikroorganismen und Sporen enthält, ausgeführt.
Beim Ausführen eines vielstufigen Verfahrens können die zum Bewirken einer Solubilisation und/oder Proteolyse eingesetzten Verarbeitungsbedingungen, vor der Durchührung des erfindungsgemäßen, enzymatischen Verfahrens irgendeine von verschiedenen Bedingungen einschließen, die ausreichen, um Solubilisation und/oder Hydrolyse-Reaktionsgeschwindigkeit und Produktausbeute wie im Stand der Technik bekannt zu optimieren. Im Allgemeinen überschreiten jedoch die Verarbeitungs-Temperaturbedingungen für Proteolyse-Verfahren, die vor der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, wunschgemäß den mesophilen Bereich, was das Herbeiführen des Auswuchs von Sporen unterstützt, wobei derartige Temperaturen, wie im Stand der Technik üblich, 50ºC vorzugsweise überschreiten, um das Mikroorganismus-Wachstum zu hemmen.
Wie vorstehend gezeigt, wird das erfindungsgemäße Verfahren vorteilshaft bei einer Temperatur unter dem mesophilen Bereich und vorzugsweise unter etwa 17ºC ausgeführt, was weiterhin eine mögliche Kontamination durch unerwünschte Mikroorganismen senkt. Obwohl derartige Temperaturen unterhalb optimaler Bereiche von vielen Enzymen liegen können und folglich die Reaktionsgeschwindigkeiten verlangsamen, kann die Reaktion während längerer Zeitspannen, die in einer Größenordnung von Tagen eher als von Stunden liegen, durchgeführt werden und kann über einen Zeitpunkt hinaus, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit zurückzugehen beginnt, ausgeführt werden. Wie vorstehend gezeigt, werden vorteilshaft Enzymmengen in der Größenordnung von 1 Gew.-% oder weniger, bezogen auf das Substratgewicht, eingesetzt.
Beim Durchführen der erfindungsgemäßen Hydrolyse für die erwünschte Zeitspanne, unter der Annahme, dass kein Membranreaktor verwendet wird, kann das gesamte Hydrolysat, d. h. der Überstand und die Feststoffe des hydrolysierten Substrates (auf die Feststoffe wird hierin als das "pelletisierte Substrat" Bezug genommen), auf eine Temperatur und für eine Zeitspanne erhitzt werden, die mindestens für eine Inaktivierung der Enzyme (eines oder mehrerer) ausreicht, oder auf eine Temperatur und für eine Zeitspanne, die für den Erhalt eines pasteurisierten oder sterilen /aseptischen Produkts ausreicht. Im letzteren Fall könnte das Produkt, falls erwünscht, aseptisch verpackt werden. Andererseits kann der Überstand von dem pelletisierten Substrat getrennt werden, was unter Einsatz eines Membranreaktors in kontinuierlicher Weise der Fall sein kann, und so behandelt werden. Allgemein kann ein Trennen des Überstands von dem pelletisierten Substrat durch Filtrieren bewirkt werden, vorzugsweise jedoch durch Zentrifugieren, was allgemein größere Ausbeuten an Überstand liefert, oder durch eine Kombination von Filtrieren und Zentrifugieren.
Alternativ dazu kann der enzym-deaktivierte Überstand und das pelletisierte Substrat zusammen, oder der Überstand getrennt von dem pelletisierten Substrat, wie vorliegend verwendet werden, oder der Überstand kann konzentriert werden mit derartigem wie Vakuumverdampfung, und/oder kann mittels verschiedener, im Stand der Technik bekannter Trocknungsverfahren, einschließlich insbesondere Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung getrocknet werden. Weiter alternativ dazu kann ein Überstand einer Ultrafiltrations- oder einer anderen trennenden/fraktionierenden Technik unterworfen werden, um Produktfraktionen zu erhalten.
Produktausbeuten können zudem weiterhin erhöht werden, indem das pelletisierte Substrat, von dem der Überstand getrennt wurde, mit der gleichen Enzymzubereitung oder mit einer unterschiedlichen Enzymbereitung behandelt wird. Diesbezüglich wurde festgestellt, dass das pelletisierte Substrat nicht unbedeutende Hydrolysatprodukt-Mengen, sogar nach Zentrifugieren und dergleichen, zurückbehält. Dieses Produkt kann vom pelletisierten Substrat wie durch Pressen oder anderweitig durch Extrahieren des Selbigen entfernt werden. Es wurde zudem festgestellt, dass dieses Hydrolysat Eigenschaften und eine Zusammensetzung unterschiedlich zu dem zuvor entfernten Überstand, aufweist. Das zurückbleibende pelletisierte Substrat kann zudem weiterhin hydrolysiert werden.
Darüber hinaus soll bemerkt werden, dass erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt werden können, indem Enzyme sequentiell in einem oder mehreren Schritten zu verschiedenen Zeitpunkten, zugesetzt werden, was ein weiteres "Produkt-Maßschneidern" und/oder eine Ausbeutenerhöhung ermöglicht. Beispielsweise können ein Enzym oder Enzyme eingesetzt werden, um ein Produkt mit überwiegend Di-, Tri- und/oder Poly-Peptiden über eine bestimmte Zeitspanne hinweg zu erhalten, wobei dann eine Enzymzubereitung mitbestimmter Aktivität für die Spaltung der Peptide zugesetzt werden kann, wodurch das Reaktionsgleichgewicht, um zugleich die Produktion von Di-, Tri- und/oder Poly-Peptidprodukten zu vergrößern, verschoben wird. Veranschaulichend wird zuerst eine Enzymzubereitung für den Erhalt von Glutamin eingesetzt, und dann wird, während die Reaktion andauert, eine für die Spaltung des Glutamins geeignete Enzymzubereitung zum Erhalten von Glutaminsäure zugeführt. Auf ähnliche Art und Weise kann x-Prolyl Dipeptidase (pro-x) und x-Pro Dipeptidasen zweckmäßig eingesetzt werden, um so Prolin zu erhalten.
Pronase, extrazelluläre Proteine, die von Streptomyces griseus ausgesondert werden, können ebenso erfindungsgemäß, besonders zweckmäßig für den Erhalt von hohen freien Aminosäure- Gehalten, eingesetzt werden, und können allein oder in Verbindung oder in Aneinanderfolge mit anderen Enzymen eingesetzt werden kann. Mikrobielle Collagenase, Clostridio-Peptidase A, wird ebenso als zweckmäßig befunden, allein oder zusammen mit anderen Enzymzubereitungen, die für das Hydrolysieren von Collagen geeignet sind.
Wie vorstehend gezeigt, wird die vorliegende Erfindung besonders zweckmäßig für das Hydrolysieren von Weizengluten, Sojaprotein und Getreideprotein in einem mehrstufigen Verfahren unter Einsatz einer Exopeptidase, insbesondere einer Aminopeptidase, eingesetzt, wobei in einer Endstufe entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens das Erreichen eines hohen Hydrolysegrades ermöglicht wird. Es wurde herausgefunden, dass insbesondere bei bestimmten, weiter nachstehend beschriebenen Ausführungsformen eine Ausbeute von freien Aminosäuren und Peptiden mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 2.000 Dalton (d. h. eine Kettenlänge von bis zu 20 Aminosäuren) in dem Hydrolyse-Überstand und in dem pelletisierten Substrat in der Größenordnung von mindestens etwa 65% und allgemein von etwa 65% bis mindestens etwa 80% enthalten ist. Freie Aminosäure-Mengen können in dem Überstand in einer Größenordnung von etwa 40% bis etwa 60% gefunden werden.
In der folgenden Erläuterung soll eine Bezugnahme auf alkalische Bedingungen ein Medium mit einem pH-Wert von etwa 7,5 und darüber und im besonderen, mit einen pH-Wert von etwa 8 bis 12 und mehr besonders von etwa 8,5 bis 11 bedeuten und beinhalten. Neutrale Bedingungen sollen ein Medium mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 bedeuten und beinhalten, und saure Bedingungen sollen ein Medium mit einem pH-Wert von weniger als etwa 6,5 und im besonderen von etwa 2 bis etwa 6,5 und mehr insbesondere von etwa 3 bis 4 bedeuten und beinhalten.
Um die vorstehend bemerkten Ergebnisse einfach mit der erfindungsgemäßen Praktik zu erreichen, wird im Fall eines Getreideproteinsubstrats, Getreideprotein mindestens teilweise unter alkalischen Bedingungen derart solubilisiert, dass es in einem für einen Angriff von proteolytischen Enzymen geeignetem Zustand vorliegt. Ein erster Hydrolyseschritt, dem ein Hitze-Denaturierungsschritt vorausgeht, wird unter alkalischen Bedingungen mit einer Protease, die bei alkalischen Bedingungen aktiv ist, durchgeführt. Zweckmäßig wird eine Alkalase 2.4L-Enzymzubereitung eingesetzt, wobei die Reaktion für eine derartige Zeitspanne durchgeführt wird, dass die Reaktion eine Neigung aufweist, gehemmt zu werden, d. h. bis zu einem Punkt eines Reaktionsgeschwindigkeitabfalls, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen.
Nach dem ersten Hydrolyseschritt wird das proteolysierte Getreidesubstrat bei einer ausreichenden Temperatur und für eine ausreichende Dauer erhitzt, um mesophile Mikroorganismen und Sporen abzutöten. Da die Verarbeitung von Getreideprotein auf diese Weise erwünschte Ergebnisse in einem nur zwei-stufigen Hydrolyseverfahren liefert, sollte das Erhitzen so ausgeführt werden, dass das Substrat auf einer Temperatur von mindestens etwa 121ºC mindestens etwa 15 Minuten lang unter einem Druck von mindestens etwa 15 psi (etwa 1 bar) gehalten wird. Das erhitzte Hydrolysat wird darin gekühlt und mit einer sterilen Enzymzubereitung in einem sterilen System erfindungsgemäß, wie vorstehend beschrieben, für die Hydrolyse von Peptiden behandelt, dabei bevorzugt mit einer Exopeptidase und bevorzugt für eine Zeitspanne, die vorzugsweise mindestens soweit reicht, bis die Hydrolysegeschwindigkeit zu sinken beginnt. Zweckmäßig wird eine Peptidase A Amano-Zubereitung eingesetzt.
Im Fall von Weizenprotein, insbesondere von Gluten, wird ein drei-stufiges Hydrolyse-Verfahren durchgeführt. Das Protein wird in ein saures Medium, d. h. in angesäuertes Wasser, eingebracht, wobei es dann erst mit einer sauren Protease behandelt wird, um das intakte Protein mindestens teilweise zu solubilisieren und die Hydrolyse einzuleiten, wobei diese Reaktion ausgeführt werden kann, bis die Reaktionsgeschwindigkeit zu fallen beginnt, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen. Zweckmäßig wird eine Biocon saure Protease-Zubereitung eingesetzt. Das Reaktionsmedium wird neutralisiert und erhitzt, um die Enzymzubereitung zu deaktivieren und mesophile Mirkoorganismen derart abzutöten, wie durch Erhitzen bei etwa 100ºC bis 110ºC für mindestens etwa 5 Minuten, jedoch allgemein bevorzugt für mindestens etwa 10 Minuten.
Nach dem Abkühlen wird das Substrat mit einer neutralen Protease behandelt, um Peptide und intaktes Protein für den Erhalt eines zweiten Hydrolysats zu hydrolysieren, wobei diese Reaktion ebenfalls ausgeführt werden kann, bis die Reaktionsgeschwindigkeit zu fallen beginnt, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen. Zweckmäßig wird eine Protease 2A-Zubereitung eingesetzt. Diese zweite Hydrolyse wird ebenso betrieben, um ein Sporen-Auswuchsstadium zu bewirken, wobei dabei das Substratmedium nur mit Hitze behandelt werden muss, um die Enzymzubereitung zu deaktivieren und mesophile Mikroorganismen auf eine derartige Weise, wie vorstehend bemerkt, abzutöten. Der Einsatz eines Sterilisationsverfahrens soll jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Nach dem Abkühlen wird das zweite Hydrolysat mit einer sterilen Enzymzubereitung in einem sterilen System erfindungsgemäß, wie vorstehend beschrieben, für die Hydrolyse von Peptiden behandelt, vorzugsweise mit einer Exopeptidase und vorzugsweise für eine Dauer, die vorzugsweise mindestens soweit reicht, bis eine Hydrolysegeschwindigkeit zu sinken beginnt, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen. Zweckmäßig wird ebenfalls eine Peptidase A Amano-Zubereitung eingesetzt.
Im Fall von Sojaprotein wird ebenso ein drei-stufiges Hydrolyseverfahren eingesetzt. Das Protein wird in Wasser unter alkalischen Bedingungen suspendiert und in einem alkalischen Medium mit einer alkalischen Protease, die weiterhin das Protein solubilisiert und eine Hydrolyse bewirkt, behandelt, wobei diese Reaktion ausgeführt werden kann, bis die Reaktionsgeschwindigkeit zu fallen beginnt, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen. Zweckmäßig wird eine Alkalase 2.4L-Zubereitung eingesetzt, wobei es für zweckmäßig befunden werden kann, den pH-Wert vor dem Abschluss der ersten Hydrolyse-Stufe auf einen neutralen Bereich zu senken, obwohl dies nicht für notwendig erachtet werden sollte.
Wenn das erste Soja-Hydrolysat-Reaktionsmedium nicht bereits neutralisiert wurde, kann es neutralisiert und dann erhitzt werden, um die Enzymzubereitung zu deaktivieren und mesophile Mikroorganismen abzutöten wie durch Erhitzen bei etwa 100ºC bis 110ºC, mindestens etwa 5 Minuten lang, vorzugsweise jedoch allgemein mindestens etwa 10 Minuten lang.
Nach dem Abkühlen wird das erste Hydrolysat unter neutralen Bedingungen mit einer neutralen Protease behandelt, um Peptide und intakte Proteine zu hydrolysieren, wobei diese Reaktion ebenso ausgeführt werden kann, bis die Reaktionsgeschwindigkeit zu sinken beginnt, obwohl längere Zeitspannen nicht ausgeschlossen werden sollen. Zweckmäßig wird abermals eine Protease 2A-Zubereitung eingesetzt. Diese zweite Hydrolyse wird ebenso betrieben, um ein Sporenauswuchsstadium zu bewirken, wobei folglich das Substratmittel lediglich mit Hitze behandelt werden muss, um die Enzymzubereitung zu deaktivieren und mesophile Mikroorganismen auf derartige Weise, wie vorstehend bemerkt, abzutöten. Der Einsatz eines Sterilisationsverfahrens soll jedoch ebenfalls nicht ausgeschlossen werden.
Nach dem Abkühlen wird das zweite Hydrolysat mit einer sterilen Enzymzubereitung in einem sterilen System erfindungsgemäß, wie vorstehend beschrieben, zum Hydrolysieren von Peptiden behandelt, bevorzugt mit einer Exopeptidase und vorzugsweise für eine Zeitspanne, die vorzugsweise mindestens soweit reicht, bis eine Hydrolysegeschwindigkeit zu sinken beginnt. Ebenfalls wird zweckmäßig eine Peptidase A Amano-Zubereitung eingesetzt.
Wie aus dem Vorstehendem klar, kann jedes bekannte Hydrolysat-Produkt mittels dem erfindungsgemäßen Vorgehen hergestellt werden, wobei derartige auf viele bekannte Weisen verwendet werden können. Folglich beinhalten derartige Produkte und Verwendungen Nahrungsmittelprodukte und Verwendungen einschließlich hypoallergene Produkte wie Kindernahrungsmittel, oder Produkte, die speziell auf eine bestimmte Anwendung zugeschnitten sind, einschließlich der Behandlung von Menschen mit Bedarf an einer oder mehreren freien Aminosäuren, oder kleinen Peptiden, d. h. 2-5 Aminosäuren, oder zum weiteren Verarbeiten für die Zubereitung weiterer Produkte. Insbesondere können Hydrolysate mit hohen Gehalten an freien Aminosäuren und/oder Fraktionen davon zweckmäßig als Geschmackstoffe an sich oder als Vorläufer für andere Produkte einschließlich insbesondere als Vorläufer für die Geschmackstoff- Herstellung mittels einer derartigen wie einer Maillard-Reaktion oder anderen Reaktionen zur Geschmackstoff-Herstellung, eingesetzt werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden für die weitere Veranschaulichung der Erfindung dargelegt. Prozentangaben werden, außer anderweitig angezeigt, als Gewichts- oder Volumen/Volumenprozent angegeben.

Testverfahren

Gesamt-Aminosäuren in einem Produkt werden bestimmt, indem ein gefrier-getrocknetes Produkt mit Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wird, gefolgt von HPLC-Verfahren. Es wird eine Probe mit 6 M HCR in eine Pierce Hydrolyseröhre eingefüllt und gemischt. Um das unter Vakuum Setzen der Probe zu erleichtern, wird die in der Röhre enthaltene Probe eingefroren und Vakuum wird angelegt, um ein Vakuum in der Röhre zu bewirken, und die Röhren werden verschlossen. Die Probe unter Vakuum wird dann bei etwa 110ºC etwa 24 Stunden lang erhitzt, um die Hydrolyse zu bewirken. Nach dem Abkühlen wird das erhaltene Hydrolysat Vakuumgetrocknet, und die getrocknete Probe wird in einem Pickering-Verdünnungspuffer 2,2 suspendiert. Die Pickering-Puffer-Probe wird mikro-zentrifugiert, wobei der Überstand durch eine 30 000 MW bzw. MG Trenn-Membran ultrafiltriert wird. Ein Aliquot wird auf eine Pickering-Aminosäure-Analysensäule geladen, die mit einem Varian 5500 HPLC System betrieben wird. Die Aminosäuren werden mit einem pH-Gradienten eluiert und nach einer Nach-Säulenreaktion mit Ninhydrin, die in einer Pickering-Vorrichtung ausgeführt wird, nachgewiesen.
Die Menge an freien Aminosäuren in einem Produkt wird nachgewiesen, indem eine Probe in einem Pickering-Verdünnungspuffer 2,2 suspendiert und dann zentrifugiert, filtriert und analysiert wird, wie vorstehend.
Zellzählungen werden ausgeführt, indem 10-fache, aufeinanderfolgende Verdünnungen einer Probe in einem wässrigen, sterilen Aufbereitungsverdünnungsmittel, das 8,5 g NaCl und 1 g Pepton pro 1 enthält, vorgenommen werden. 0,1 ml Aliquot der Verdünnungsmittelproben werden auf Difco Plattenzählungs-Agar-Platten (PCA, plate countagar) aufgezogen. Die Platten werden bei 37ºC etwa 2 Tage lang inkubiert, und die Kolonien werden gezählt.

Beispiel 1

Etwa 2 l einer mit entionisiertem Wasser zubereiteten 0,19%-igen Orthophosphorsäurelösung werden in einem Kolben auf etwa 75ºC erhitzt. 200 g Weizengluten wird zu der Säurelösung zugesetzt, und das Gemisch wird mit einer hohen Geschwindigkeit in einem Waring Mischgerät gemischt, um das Gluten in Suspension zu bringen. Vor dem Ende des Mischens wird 0,5 g saure Protease (BIOCON 200.000 BU/g) zu der angesäuerten Suspension zugesetzt, um die Zubereitung im Substrat in einer Menge von etwa 0,25%, bezogen auf das Gluten-Substrat, zu erhalten. Es wurde gefunden, dass die Suspension einen pH-Wert von etwa 3,5 aufweist. Das angesäuerte Gluten/Enzym-Gemisch wird in einen Kolben gegeben, der bedeckt ist, und wird in einen Schüttelinkubator eingesetzt. Der Kolben und die Inhalte werden ausreichend geschüttelt, um das Gluten/Enzym-Gemisch suspendiert zu halten, und werden bei etwa 60ºC etwa 16 Stunden lang erhitzt, wobei diese Inkubation betrieben wird, um die intakten Proteine teilWeise zu solubilisieren und eine Hydrolyse-Reaktion einzuleiten sowie ein Reaktion-Mischsubstrat (Hydrolysat I) zu liefern. Nach Inkubation wird eine Probe aus dem Hydrolysat I für eine Zellzählung genommen, die nachweist, dass die Zahl der Mikroorganismus-Zellen unter 300 CFU/ml liegt.
2,5 M NaOH werden zugesetzt und mit dem Hydrolysat I-Substrat in einer Menge, die ausreicht, den pH-Wert des Gemischs auf einen pH-Wert von etwa 6,2 anzuheben, gemischt. Der Kolben wird bedeckt und in einen Autoklaven gestellt und bei etwa 104ºC etwa 5 Minuten lang erhitzt, was das Deaktivieren der Enzymzubereitung, das Abtöten der mesophilen Mikroorganismen, und dadurch ebenso ein Denaturieren der Peptide, betätigt. Der Kolben und das erhitze Hydrolysat I werden auf etwa 50ºC abgekühlt.
Ein g der Protease 2A-Zubereitung (> 20.000 Amano Einheiten/g) wird zu dem gekühlten Hydrolysat I zugegeben, um eine Zubereitung in einer Menge von etwa 0,5%, bezogen auf das anfangs eingesetzte Gluten, zu liefern. Der Kolben wird bedeckt und in einen Schüttelinkubator eingesetzt, und die Hydrolysat I/Enzymsuspension wird auf eine Temperatur von etwa 50ºC etwa 7 Stunden lang erhitzt unter ausreichendem Schütteln, um das Gemisch in Suspension zu halten und ein zweites Hydrolysatprodukt (Hydrolysat II) zu liefern, wobei dieses ebenso zu einem Sporenauswuchs-Stadium, das Mikroorganismen ergibt, führt. Es wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen, die nachweist, dass die Zellenanzahl weniger als 2 · 10³ CFU/ml beträgt.
Der Kolben, der das Hydrolysat II enthält, wird bedeckt und in einen Autoklaven gegeben und bei etwa 104ºC etwa 10 Minuten lang erhitzt, was das Deaktivieren der Protease, wiederum das Denaturieren von Peptiden (und irgendwelchen verbleibenden, intakten Proteinen) und das Abtöten von mesophilen Mikroorganismen betätigt. Der bedeckte Kolben und das erhitzte Hydrolysat II werden dann auf Raumtemperatur (~22,5ºC) gekühlt.
2 g PEPTaASE A AMANO-Zubereitung (> 100.000 Aminopeptidase Amano Einheiten/g) werden in 15 ml sterilem Wasser, das in einem sterilen Becher enthalten ist, suspendiert. Die Suspension wird durch ein 0,45 u-Membran-Filter in gekühltes Hydrolysat II aseptisch filtriert, um eine Enzymzubereitungskonzentration von etwa 1%, bezogen auf das anfangs eingesetzte Gluten, zu liefern, wobei der Kolben bedeckt wird.
Das Aminopeptidase/Hydrolysat II-Reaktionsgemisch wird in dem bedeckten Kolben auf eine Temperatur von etwa 14ºC gekühlt, und um ein weiteres Hydrolysat-Produkt (Hydrolysat III) zu erhalten, wird das Gemisch bei etwa 14ºC etwa 7 Tage lang, in denen der Kolben mindestens täglich für das Suspendieren abgetrennter Feststoffe geschüttelt wird, aufbewahrt. Es wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen, die nachweist, dass die Zellenanzahl 0 CFU/ml beträgt, d. h. es liegt kein feststellbares Mikroorganismus-Wachstum vor. Das Hydrolysat III wird dann bei etwa 104ºC etwa 5 Minuten lang für das Deaktivieren des Enzyms erhitzt.
Das Hydrolysat III wird bei etwa 5.000 Upm etwa 5 Minuten lang zentrifugiert, wodurch ein Überstand und ein pelletisiertes Substrat geliefert wird. Der Überstand wird gefrier-getrocknet, wobei 122 g gefrier-getrocknetes Material erhalten wird.
Es werden Proben aus dem gefrier-getrockneten Material entnommen. Eine Aminosäure- Analyse weist nach, dass das Material etwa 64,3% Gesamt-Aminosäuren enthält und dass etwa 39,8% der Gesamt-Aminosäuren freie Aminosäuren sind.

Vergleichsbeispiel A

2 l einer 0,425%-igen Orthophosphorsäurelösung werden wie im Beispiel I erhitzt, wobei 200 g Weizengluten zugesetzt werden und mit der Lösung, ebenso wie in Beispiel I gemischt werden. 4 g saure Protease (BIOCON 200.000 BU/g) werden zu der angesäuerten Gluten-Suspension wie in Beispiel I zugesetzt, um die Zubereitung in einer Menge von etwa 2%, bezogen auf das Gluten-Substrat, bereitzustellen. Das angesäuerte Gluten/Enzym-Gemisch wird geschüttelt und wie in Beispiel I inkubatiert, mit der Ausnahme, dass es bei etwa 65ºC und lediglich etwa 5,5 Stunden lang erhitzt wird. Am Ende dieses Verfahrens, das ein Reaktions- Mischsubstrat (Hydrolysat IA) liefert, wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen, die nachweist, dass die Zellenanzahl weniger als 300 CFU/ml beträgt.
Der pH-Wert des Hydrolysats IA wird mit 2,5 M NaOH auf etwa 6,3 gebracht, und das Hydrolysat IA wird dann in einem Autoklav wie in Beispiel 1 etwa 5 Minuten lang erhitzt und dann auf etwa 45ºC abgekühlt.
4 g PEPTaASE A AMANO-Zubereitung (> 100.000 Amano Einheiten/g) werden zum abgekühlten Hydrolysat IA zugesetzt, wodurch die Enzymzubereitung in einer Konzentration von etwa 2%, bezogen auf das anfangs eingesetzte Gluten, geliefert wird. Das Aminopeptidase- /Hydrolysat IA-Reaktionsgemisch wird bei etwa 45ºC etwa 6 Stunden lang inkubiert, um ein weiteres Hydrolysat-Produkt (Hydrolysat IIA) zu erhalten. Es wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen, die nachweist, dass die Zellenanzahl etwa 7.500 CFU/ml beträgt, was nachweist, dass Mikroorganismen wachsen und was hinsichtlich der Reaktionszeit nachweisen kann, dass sich Mikroorganismen jede Stunde annähernd verdoppeln.
Das Hydrolysat IIA wird zentrifugiert und der Überstand wie in Beispiel I gefrier-getrocknet. Eine Aminosäure-Bestimmung weist nach, dass das gefrier-getrocknete Material etwa 68,1% Gesamtaminosäuren enthält, wobei etwa 26,6% der Gesamt-Aminosäuren freie Aminosäuren sind.

Vergleichsbeispiel B

Es wird entsprechend der Verfahren von Vergleichsbeispiel A ein Versuch ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die Mengen der eingesetzten Enzymzubereitung für jede Protease- und Aminopeptidase-Hydrolyse-Reaktion 1% betragen, mit der Ausnahme, dass die saure Proteolyse etwa 14 Stunden lang ausgeführt wird, mit der Ausnahme, dass das erste Hydrolysat-Produkt in 10 Minuten erhitzt wird, sowie mit der Ausnahme, dass die Aminopeptidase-Hydrolyse bei einem pH-Wert von 7,3 etwa 5 ¹/&sub2; Stunden lang bei 45ºC, gefolgt von 1 Stunde bei 60ºC, ausgeführt wird.
Das gefriergetrocknete Material enthält etwa 62,7% Gesamt-Aminosäuren, wobei etwa 24,2% der Gesamt-Aminosäuren freie Aminosäuren sind. Die Zellzählung nach der Säure- Proteolyse beträgt weniger als 10 CFU/ml, wobei die Zellmenge nach der Aminopeptidase- Hydrolyse weniger als 15 CFU/ml beträgt.

Beispiel II

200 g Getreideprotein werden zu etwa 21 entionisiertem Wasser, das in einem Kolben enthalten ist und eine Temperatur von etwa 75ºC aufweist, zugegeben. Für das schrittweise Anpassen des pH-Werts des Gemischs auf etwa 8,5 werden 2,5 M NaOH zum Wasser und Getreideprotein in Teilmengen über eine Zeit hinweg unter Schütteln des Kolbens und des Inhalts mit einem Incubatorschüttler, um die Zutaten zu mischen und das Protein zu suspendieren, zugesetzt. Während des Mischens geht das Protein teilweise in Lösung, wobei vor dem Ende des Mischens 3 ml Alkalase 2,4L-Zubereitung hinzugegeben wird und mit der Getreideprotein-Substrat-Suspension gemischt wird, um die Zubereitung mit einer Konzentration von etwa 1,5%, bezogen auf das Getreideprotein, bereitzustellen.
Um ein erstes Hydrolysat-Produkt (Hydrolysat I) zu erhalten, wird der Kolben bedeckt und die Substrat/Enzym-Suspension etwa 7 Stunden lang ausreichend geschüttelt, um das Getreide- Protein/Enzym-Gemisch suspendiert zu halten, während es bei etwa 55ºC erhitzt wird. 2,5 M NaOH werden während der ersten 6 Stunden gelegentlich zugesetzt, um den pH-Wert bei etwa 8 zu halten, wobei der pH-Wert während der 7. Stunde langsam abfallen darf. Es wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen, die nachweist, dass die Anzahl der Mikroorganismus-Zellen weniger als 1.000 CFU/ml beträgt.
Der bedeckte Kolben und das Hydrolysat I werden in einem Autoklav bei etwa 121ºC unter einem Druck von etwa 15 psi etwa 15 Minuten lang erhitzt, wobei sie dann wieder auf Zimmertemperatur (~22,5ºC) abkühlen dürfen.
2 g der PEPTIDASE A AMANO-Zubereitung (> 100.000 Aminopeptidase Amano Einheiten/g) werden in 15 ml Wasser suspendiert und durch einen 0,45 u-Membranfilter in das abgekühlte Hydrolysat I aseptisch filtriert, um eine Konzentration der Enzym-Zubereitung von etwa 1%, bezogen auf das anfangs eingesetzte Getreideprotein, zu erhalten, und der Kolben wird bedeckt.
Um ein zweites Hydrolysat-Produkt (Hydrolysat II) zu erhalten, wird das Aminopeptidase/- Hydrolysat I-Reaktionsgemisch auf etwa 14ºC abgekühlt und auf dieser Temperatur etwa 6 ¹/&sub2; Tage unter Schütteln wie in Beispiel I gelagert. Dann werden Proben für die Zellzählung entnommen, die 0 CFU/ml nachweisen.
Das Hydrolysat II wird bei 5.000 Upm etwa 5 Minuten lang zentrifugiert, um einen Überstand und ein pelletisiertes Substrat zu erhalten. Der Überstand wird gefrier-getrocknet, wobei 161 g Produkt erhalten wird.
Das gefrier-getrocknete Material enthält etwa 43,9% Gesamt-Aminosäuren, wobei etwa 48% der Gesamt-Aminosäuren freie Aminosäuren sind.

Beispiel III

Versuche werden entsprechend der Verfahren von Beispiel I durchgeführt, unterscheiden sich jedoch, wie in der nachfolgenden Tabelle angezeigt, in den Inkubations-Temperaturen des Hydrolysats II mit Aminopeptidase. Es werden, wie ebenso in der Tabelle angezeigt, zu verschiedenen Zeitpunkten Proben für die Bestimmung des freien Aminosäure-Gehalts des Überstands als Prozentsatz der Gesamt-Aminosäuren entnommen, wobei die Striche besagen, dass Proben nicht analysiert wurden.

Beispiel IV

200 g Sojabohnen-Mehl wird zu 2000 ml Wasser in einen Kolben zugesetzt und auf einem Platten-Schüttler (platform shaker) bei einer Temperatur von etwa 60ºC etwa 30 Minuten lang zum Suspendieren des Mehls gerührt bzw. geschüttelt. 2,5 M NaOH werden der Suspension in einer ausreichenden Menge zum Anpassen deren pH-Werts auf etwa 8 zugegeben. 3,5 ml Alkalase 2,4L-Zubereitung werden zu der pH-angepassten Suspension zugesetzt und bei 60ºC etwa 8 Stunden lang für den Erhalt eines ersten Hydrolysats (Hydrolysat I) erhitzt.
Phosphorsäure wird dem Hydrolysat I in einer ausreichenden Menge für das Anpassen dessen pH-Wertes auf etwa 6,5 zugesetzt, wobei dieses ph-angepasste Hydrolysat I dann in einem Autoklav bei einer Temperatur von etwa 104ºC etwa 5 Minuten lang erhitzt, und dann abgekühlt wird.
Ein g der PROTEASE 2A-Zubereitung (> 20.000 Amano Einheitenlg; 0,5% Enzyme) werden dem abgekühlten Hydrolysat I zugegeben und in einer Schüttelinkubation bei 50ºC etwa 5 Stunden lang für den Erhalt eines zweiten Hydrolysat-Produkts (Hydrolysat II) inkubiert. Das Hydrolysat II wird dann in einem Autoklav bei 121ºC 15 Minuten lang bei einem Druck von etwa 15 psi erhitzt und dann abgekühlt.
2 g PEPTIDASE A AMANO-Zubereitung (> 100.000 Amano Einheiten/g) werden wie in den vorstehenden Beispielen sterilisiert, wobei die sterile Enzymzubereitung zum abgekühlten Hydrolysat II zugegeben wird, was eine Konzentration der Zubereitung von etwa 1%, bezogen auf das anfangs eingesetzte Sojamehl, liefert. Die Temperatur des Hydrolysats II und der Zubereitung werden auf etwa 16ºC gesenkt und mit einem Inkubations-Schüttler etwa 4 Tage lang für den Erhalt eines weiteren Hydrolysat-Produkts (Hydrolysat III) inkubiert.
Das Hydrolysat III wird dann für die Deaktivierung der Enzymzubereitung erhitzt, abgekühlt und wie in den vorstehenden Beispielen zentrifugiert. Der Überstand wird gefrier-getrocknet, wobei etwa 83 g des gefrier-getrockneten Materials erhalten werden, das etwa 45% freie Aminosäuren als Prozentsatz der Gesamt-Aminosäuren enthält.
Wie es sich aus dem Vorhergehendem herausstellt, können verschiedene Abänderungen bei der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, ohne vom Schutzumfang und Wesen der Offenbarung abzuweichen, wobei die Erfindung in Abwesenheit und/oder im Ausschluss von Verfahrensschritten und/oder von Handhabungen, Bedingungen, Substanzen und/oder behandelten Zutaten und/oder hierin nicht ausdrücklich offenbarten Beschränkungen ausgeführt und/oder angemessen praktiziert werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Erhalt eines Nahrungsmittel-Hydrolysats, welches umfasst, Hydrolysieren eines proteinhaltigen Substrats, das keine lebensfähigen mesophilen Mikroorganismen und Sporen enthält, in einem sterilen System mit einer sterilen Enzym-Zubereitung, die für das Hydrolysieren des Substrats geeignet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat bei einer Temperatur von etwa 0º bis · etwa 45ºC hydrolysiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 20ºC hydrolysiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat bei einer Temperatur von etwa 20º bis etwa 40ºC hydrolysiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat Peptide und die Enzym-Zubereitung eine Exopeptidase-Zubereitung enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, welches weiter umfasst, Hydrolysisieren einer proteinhaltigen Substanz mit einer proteolytischen Enzym-Zubereitung, um das Substrat zu erhalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die proteinhaltige Substanz intakte Protein aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem vor dem Schritt des Hydrolysierens des Substrats, das Substrat auf eine Temperatur und für eine Zeitspanne erhitzt wird, die ausreichend ist, um die mesophilen Mikroorganismen und Sporen abzutöten, um ein Substrat zu erhalten, das keine lebensfähigen mesophilen Mikroorganismen und Sporen enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 8, bei dem die proteinhaltige Substanz Getreide ist und das Getreide unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert wird, um das Substrat zu erhalten.

10. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter umfasst, Umsetzen einer proteinhaltigen Substanz mit einer proteolytischen Enzym-Zubereitung, um das Protein der Substanz zu solubilisieren, um ein zumindest teilweise solubilisiertes Substrat zu erhalten, und Behandeln des solubilisierten Substrats mit einer Enzym-Zubereitung, um das proteinhaltige Substrat zu erhalten, so dass das Substrat frei von lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Behandlungsschritte umfassen, Erhitzen des solubilisierten Substrats für eine Zeitspanne, um die mesophilen Mikroorganismen abzutöten, und Erhitzen des proteinhaltigen Substrats, um die mesophilen Mikroorganismen abzutöten, um ein Substrat zu erhalten, das keine lebensfähigen Mikroorganismen und Sporen enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die proteinhaltige Substanz Weizengluten enthält und bei dem das Weizengluten in einem sauren Medium mit einer sauren Protease umgesetzt wird, um das solubilisierte Substrat zu erhalten, und bei dem das solubilisierte Substrat neutralisiert und mit einer neutralen Protease behandelt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die proteinhaltige Substanz Sojaprotein enthält, und bei dem das Sojaprotein in einem alkalischen Medium mit einer alkalischen Protease umgesetzt wird, um das solubilisierte Substrat zu erhalten, und bei dem das solubilisierte Substrat neutralisiert und mit einer neutralen Protease umgesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat mit zwei Enzym-Zubereitungen hydrolysiert wird, umfassend eine Pronase-Zubereitung (extrazelluläre Proteine, die von Streptomyces griseus sezerniert werden) und eine Exopeptidase-Zubereitung.

15. Verfahren nach Anspruch 5. bei dem die proteinhaltige Substanz mit einer Pronase- Zubereitung (extrazelluläre Proteine, die von Streptomyces griseus sezerniert werden) hydrolysiert wird.