JPH0795951B2 - 広域ｐＨ作用を有する新規なロイシンアミノペプチダーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （１） 産業上の利用分野 カツオやマグロ等の缶詰製造時に副生する煮汁は日本に
おいて年間10万トンも産生され大部分が未利用のままで
ある。本煮汁は良質な蛋白質を含んでいるため各種プロ
テアーゼで処理された後、濃縮され一部は魚肉エキスに
加工されている。この魚肉エキスは調味料の素材や微生
物の培地成分及び肥料などにも利用されている。しか
し、この魚肉エキスの有効利用の一環として、例えば調
味料へ加工する場合は旨味性が弱い、魚臭が強いなどの
問題があり、魚肉エキスとして十分価値のある利用がな
されていないのが現状である。

本発明は、これら魚類蛋白質を処理するのに適した新規
な広域pH作用する有するロイシンアミノペプチダーゼに
関するものである。

（２） 従来の技術 アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus or yzae）や
アスペルギルス・ソエー（A.sojae）といった麹菌起源
のロイシンアミノペプチダーゼは食品として添加あるい
は加工する場合、安全性が高いことからendo−プロティ
ナーゼとともに調味食品をはじめとして広く食品加工用
酵素として利用されている。特にロイシンアミノペプチ
ダーゼは、旨味性の改善に重要な役割を果たすものと考
えられている。

（３） 発明が解決しようとする問題点 麹菌起源で性質が明らかにされている公知のロイシンア
ミノペプチダーゼは、アスペルギルス・ソエー起源では
１種類（ワイ・オザワ等；アグリカルチュラル アンド
バイオロジカル ケミストリー，37,1285−1293（197
3）〕あり、アスペルギルス・オリゼー起源では５種類
〔LAP I:ティ・カナダイ等；アグリカルチュラル アン
ド バイオロジカル ケミストリー，37,757−765（197
3）。LAP II:ティ・ナカダイ等；アグリカルチュラル
アンド バイオロジカル ケミストリー，37,767−774
（1973）。LAP III:ティ・ナカダイ等；アグリカルチュ
ラルアンド バイオロジカル ケミストリー，37,75−7
82（1973）。LAP IV:ティ・ナカダイ等；アグリカルチ
ュラル アンド バイオロジカル ケミストリー，41,1
657−1666（1977）。AOP:長谷川喜斐等；日本農芸化学
会誌、58,483−485（1984）〕ある。

公知のアスペルギルス属のロイシンアミノペプチダーゼ
の基質特異性を調べると、アスペルギルス・ソエー起源
のアミノペプチダーゼは、分子量が220,000であり、Leu
−Gly−Glyに対する活性を100％としたとき、Leu−Gly
に対して９％の活性しか示さない。一方、アスペルギル
ス・オリゼー起源では、LAP Iは分子量が26,500であ
り、Glu−Tyr−Gluに対する分解活性は低く、主にLeu−
Gly−GlyやLeu−Glyに対して高い分解活性を有する。LA
P IIは分子量が61,000であり、Glu−Tyr−GluをpH4〜７
の範囲で分解する活性を有し、硫酸銅で完全に失活さ
れ、活性至適温度が50℃である。LAP IIIは分子量が56,
000であり、Glu−Tyr−GluをpH3.5〜７の範囲で分解す
る活性を有し、硫酸銅で完全に失活され、活性至適温度
が50℃である。LAP IVは分子量が130,000であり、Leu−
Gly−Glyに対する活性を100％としたとき、Leu−Glyに
対して7.6％の活性しか示さない。AOPはLeu−Gly−Gly
に対する活性を100％としたとき、Leu−Glyに対して0.3
％の活性しか示さない。以上の基質特異性からLeu−Gly
−Gly、Glu−Tyr−Glu及びLeu−Gly等のペプチドに対し
て高い分解活性を示し、しかも広いpH域で活性を維持で
きるロイシンアミノペプチダーゼが食品工学で切望され
てきた。

（４） 問題点を解決するための手段 上述した現況に鑑み、種種のペプチドに対して広いpH領
域で高い分解活性を示すロイシンアミノペプチダーゼを
提供すべく鋭意検討を重ねた結果、アスペルギルス属に
属する菌株を培養した麹中に、広いpH領域で強いペプチ
ド分解活性を有する新規なロイシンアミノペプチダーゼ
が得られることを発見し、本発明を完成した。

即ち、本発明は下記の理化学適性質を有する広域pHに作
用する新規なロイシンアミノペプチダーゼである。

記 作用：ペプチド鎖のＮ末端から順次アミノ酸を１個
ずつ加水分解する作用をもったexo−ペプチダーゼであ
る。

基質特異性、至適pH及び安定pH範囲:L−ロイシル−
グリシル−グリシン（Leu−Gly−Gly）及びＨ−グルタ
ミル−チロシル−グルタミン酸−OH（Glu−Tyr−Glu）
に対するKm値（ミカエリス定数）は37℃、pH8.0（アト
キンス−パンチン緩衝液）に於いて前者が44mM、後者が
30mMで、pH11.5（炭酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水
溶液）に於いては前者が4.8mMで後者は1.6mMである。ま
た、基質Leu−Gly−Gly及びGlu−Tyr−Gluについての至
適pHは前者が9.0で後者は6.0である。なお、安定pH範囲
は共に2.8〜10.1である。

作用pHの範囲：基質分解について、至適pHでの酵素
活性を100％としたとき、約80％以上の相対活性を示すp
H域は、Leu−Gly−Glyに対して6.0〜11.0であり、Glu−
Tyr−Gluに対して4.6〜7.2である。

至適作用温度及び安定温度範囲;Leu−Gly−Glyに対
してpH8.0で60℃が活性至適温度で、37℃における活性
に対して約3.5倍の活性増加が見られる。安定温度範囲
はpH8.0で60℃以下である。

失活、阻害条件：エチレンジアミン四酢酸塩により
pH5以下で失活される。1mM硫酸銅（pH8.0）により、活
性の30％が阻害される。

分子量:57,000〜58,000（ゲル過法：セファデック
スG200使用） 以下、本発明の広域に作用するロイシンアミノペプチダ
ーゼ（以下、「LAP Ｗ」と略す）理化学的性質につい
て詳細に説明する。

（作用） LAP Ｗはペプチド類のＮ末端から順軸アミノ酸を１個
ずつ加水分解して遊離する作用を有したexo−ペプチダ
ーゼである。

（基質特異性） 第１表に示す各基質10mMを30mU（Ｌ−ロイシル−ｐ−ジ
エチルアミノアニリド分解力）/mlのLAP活性量で、80mM
Fアトキンス−パンチン緩衝液（pH8.0）において、37
℃、60分間反応させ、これに冷水を添加して反応を停止
させた。反応液中に遊離したアミノ酸をニンヒドリン法
〔エス・タカハシ；ジャーナル オブ バイオケミスト
リー、83,57−60（1978）〕で定量した。

なお、LAP活性は国際単位mU/mlで表わしており、Ｌ−ロ
イシル−ｐ−ジエチルアミノアニリドを基質にしてLAP
Ｃ−Test Wakoキット（和光純薬工業製）を用いて測
定した。

相対活性（％）は、Leu−Gly−Glyを基質として酸素反
応させて得られたアミノ酸の量を100％とし、他のペプ
チドを基質とした場合に得られたアミノ酸の量との比較
値（％）で示した。

LAP Ｗは、Leu−Gly−Glyに対するKm値が37℃、pH8.0
（アトキンス−パンチン緩衝液）において44mM及びpH1
1.5（炭酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水溶液）にお
いて4.8mMであり、Glu−Tyr−Gluに対するKm値が37℃、
pH8.0において30mM及びPH11.5において1.6mMである。

（至適pH及び安定pH範囲） LAP Ｗの活性至適pHは第１図に示す如く、Leu−Gly−G
lyを基質にした場合（●−●）pH9.0であり、Glu−Tyr
−Gluを基質にした場合（▲−▲）pH6.0である。なお、
30mM Leu−Gly−Glyあるいは5mM Glu−Tyr−Gluを基質
とし（ ）内に示したLAP活性量、mU/mlでそれぞれのpH
において37℃、30分間反応させ、冷水を反応液中に加え
て反応停止させた後遊離アミノ酸の量をニンヒドリン法
で測定した。pH4〜５は酢酸緩衝液、pH6〜７はリン酸緩
衝液、pH8〜10はアトキンス−パンチン緩衝液、pH11は
炭酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水溶液を用いたもの
である。

LAP Ｗの安定pH範囲は、286mU/mlのLAP Ｗを含有した
25mMの各pHの緩衝液を37℃で２時間放置した後、200mM
トリス−塩酸緩衝液でpH8.0に調整し、直ちに残存する
酵素活性を0.5mM Leu−Gly−Gly（●−●）または0.5mM
Glu−Tyr−Glu（▲−▲）を用いて調べた。第２図に示
す如く、いずの基質に対しても安定PH範囲は2.8〜10.1
である。なお第２図中、pH2〜３は酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液、pH3.5〜6.0は酢酸緩衝液、pH7.0〜9.0はトリ
ス−塩酸緩衝液、pH9.8以上は炭酸ナトリウム−炭酸水
素ナトリウム緩衝液を用いた。

（作用pHの範囲） 第１図に示す如く、LAP Ｗの各基質分解に対する至適p
Hにおける酵素活性を100％としたとき、約80％以上の相
対活性を示すpH域は、Leu−Gly−Glyに対してpH6.0〜1
1.0であり、Glu−Tyr−Gluに対してpH4.6〜7.2である。

（作用温度の範囲） 第３図に示す如く、pH8.0において、Leu−Gly−Glyに対
して60℃が活性至適温度であり、37℃における活性に対
して約3.5倍の活性増加がみられる（各温度で２分間プ
レインキュベーションし、10分間酵素反応を行った） （温度による失活条件） 第４図に示す如く、pH8.0においてLeu−Gly−Glyの分解
活性は60℃を越えると漸次失われてゆくことを示してい
る。

（阻害条件） エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）によるLAP Ｗ活性
の阻害はpHに依存しており、pH5以下で失活される。即
ち、222mU/mlのLAP Ｗ、55mMの各pHの緩衝液及び各pH
に調整した22mM EDTAを含む溶液を37℃で２時間インキ
ュベーションした後、0.4mM Glu−Tyr−Gluを加え37℃
で30分間酵素反応させた。冷水を20倍量加えて反応を停
止した後、遊離したアミノ酸の量をニンヒドリン法で測
定した。pH3.5〜6.0は酸酢緩衝液、pH7.0〜9.0はトリス
−塩酸緩衝液、pH10.0以上は炭酸ナトリウム−炭酸水素
ナトリウム緩衝液を用いた。結果を第４図に示す。

第５図において●−●はLAP ＷがEDTA未処理のもの、
○…○はEDTA処理のものである。pH5.0でEDTA未処理の
ときの遊離アミノ酸量を100％とし、各pHにおける相対
活性値％で表わした。

LAP Ｗは、30mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）において
1mM硫酸銅と共に37℃で20分間インキュベーションする
ことにより、Leu−Gly−Glyの分解活性が30％阻害され
る。

（分子量） LAP Ｗの分子量は、セファデックスG200（スーパーフ
ァイン、直径1.5cm×長さ98cm）カラムを用い、0.1M食
塩を含有する0.1M酢酸緩衝液中で測定した（流速:1.41m
l/hr,分画容量0.58ml、４℃）。LAP Ｗの分子量は57,0
00〜58,000である。なお、分子量標準蛋白質は、ベーリ
ンガー・マンハイム社製のウサギ筋肉のアルドラーゼ
（分子量:160,000）、牛血清アルブミン（67,000）、卵
アルブミン（45,000）、キモトリプシノーゲンＡ（25,0
00）及びチトクロームＣ（12,000）を用いた。

（力価の測定法） LAP活性の力価は、ロイシンアミノペプチダーゼ測定用L
AP Ｃ−Test（Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド基質法、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定し
た。酵素の単位は、Ｌ−ロイシル−β−ナフチルアミド
を基質として用い、酵素液0.02mlが37℃で２時間基質に
作用してβ−ナフチルアミン1/12μｇを遊離させるとき
（Ｇ−Ｒ単位とし、このＧ−Ｒ単位を4.124倍した国際
単位（mU/ml）で表わした。

（精製方法） LAP Ｗは後述する精製方法により単離することができ
る。

以上のとおり、LAP Ｗはその酵素学的、物理化学的な
諸性質は公知のロイシンアミノペプチダーゼの何れとも
異なっており、特に広いpH域において各種のペプチドに
高い分解力を有するため、食品工業上有利な酵素であ
る。

次に本発明に係わるLAP Ｗの製造法についてその一例
を説明する。

本発明において使用される微生物は、LAP Ｗ産性能を
有する菌株であれば何れを用いてもよく、例えばアスペ
ルギルス属に属する菌株を用いるのが有利で、その具体
例としてはアスペルギルス・ソエー（Aspergillus soja
e）Ｓ−297株が挙げられる。アスペルギルス・ソエーＳ
−297株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第9073号として寄託されており、菌学的性質が特開昭
63−148985号に詳述されている。

次に、LAP Ｗ産生能を有するアスペルギルス・ソエー
Ｓ−297株を培養し、培養物よりLAP Ｗを製造する方法
を述べる。

まず、培養法としては液体培養でもよいが、一般的には
好気的固体培養の方が好ましい。通常、Ｓ−297株は小
麦▲麸▼等の固体培地に接種し、40〜55時間好気的に培
養するとプロテアーゼを培地（麹）中へ分泌する。培養
後、麹を水に懸濁することにより、プロテアーゼは容易
に水層中に移行し、不溶物を遠心分離操作や過等の適
当な手段で除去し、LAP Ｗを含む粗酵素液を得ること
ができる。得られた粗酵素液よりLAP Ｗを採取する手
段としては、透析、イオン交換樹脂に吸着し溶出させる
方法及びゲル過等が挙げられ、LAP Ｗを単離するこ
とができる。

以下、実施例により本発明の実施態様を詳細に説明す
る。

〔実施例〕

▲麸▼4.8kg、KH₂PO₄ 320g、Ｌ−グルタミン酸ナトリウ
ム160g及び水８からなる固体培地を121℃、１気圧下2
0分間滅菌した後、アスペルギルス・ソエーＳ−297株の
分生子を接種し、30℃で２日間通気培養し、麹6.9kgを
得た。この麹を水60中に懸濁させ充分に攪拌した後、
遠心分離（9000rpm）して上清液55を得た。次いで、
この液をホローファイバーシステム（小松川化工機製）
において分離膜PM1000を通過させた後、分離膜PM5で濃
縮した。得られた濃縮液は４で、280nmでの吸光度が2
6であった。この液に安定化剤として420gのデキストリ
ン（日本資糧工業社製 NSD 1318）を加えた後、凍結乾
燥を行い、422gの粗酵素粉末（以後サカナーゼと呼ぶ）
を得た。

サカナーゼはLAP Ｗを含む総ロイシンアミノペプチダ
ーゼ力価が6.6units/gであった。

以下の操作は４℃で行った。サカナーゼの一部（100g）
に50mMリン酸緩衝液（pH6.1）を1.0加えて溶解させ、
不溶物を遠心分離（9000rpm,1時間）して除去し、得ら
れた上澄液に40％飽和になるよう硫安を加え一夜放置し
た。生じた沈澱物を遠心分離（9000rpm,1時間）により
除いた後、上澄液（1.1）に80％飽和になるように硫
安を加え、２時間放置した。生じた沈澱物を再び遠心分
離（17000rpm,30分間）して回収し、2mM酢酸カルシウム
を含む50mM酢酸緩衝液（pH4.8）10mlを加えて溶解し、
同じ緩衝液（２，液を２回交換）を用いて一夜透析し
た。

透析して得た酵素液は、2mM酢酸カルシウムを含む50mM
酢酸緩衝液（pH4.8）であらかじめ平衡化したアンバー
ライトCG−50（米国ローム・アンド・ハース社製イオン
交換樹脂）のカラム（直径6cm×高さ68cm）に通塔してL
AP Ｗを吸着させ、その洗浄液は280nmにおける吸光度
が０になるまで上記の緩衝液でカラムを洗浄した後、0.
5M酢酸ナトリウム水溶液で溶出した。活性画分はpH6.5
に調整した後、冷アセトンを終濃度70％になるまで添加
し、生じた沈澱を9000rpm、30分間の遠心分離で回収し
た。得られた酵素を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）25mlで
溶解し、同じ緩衝液（１、液を２回交換）を用いて一
夜透析した。

透析して得た酵素液（25.5ml）は、10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）であらかじめ平衡化したDEAE−セファデック
スＡ−50（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製イ
オン交換樹脂）のカラム（直径4cm×高さ28cm）に通塔
して、LAP Ｗを吸着させた。樹脂に吸着しない酵素と
して、アルカリ性プロティナーゼ（AlPと略す）画分を
回収した後、カラムを充分に10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で洗浄した。その後、吸着したLAP Ｗは、同じ組成
の緩衝液500ml×２に含有させた０〜0.5M塩化ナトリウ
ムの直線濃度勾配法で溶出させた。流速は0.64ml/min、
一画分量は10.4mlとした。本クロマトグラフィーでのLA
P Ｗの溶出パターン（斜線で表示）を第６図に示す。
図からsemi−AlP、中性プロティナーゼＩ（NPI）、LAP
I^＊およびLAP Ｗが主要活性ピークを構成している。な
お、公知のアスペルギルス・オリゼー起源のLAP Iはア
ンバーライトCG−50樹脂クロマトグラフィーの非吸着画
分に回収される性質があり、一方当該操作ではアンバー
ライトCG−50樹脂に吸着した画分から回収される性質を
もったLAP I類似酵素であるため、区別する意味で＊印
を冠した。LAP Ｗの活性画分はpH6.5に調製した後、１
％マンニトールを加え、次いで、冷アセトンを終濃度70
％になるまで添加し、生じた沈澱を9000rpm、30分間の
遠心分離で回収した。酵素は小量の150mM酢酸緩衝液（p
H6.5）で溶解した後、同じ緩衝液（１、液を２回交
換）を用いて一夜透析した。

透析して得た酵素液（12.6ml）は、150mM酢酸緩衝液で
平衡化したセファデックスＧ−100（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ社製ゲル過担体）のカラム（直径
2cm×高さ127cm）を用い、流速19.6ml/hで一画分2.33ml
ずつを集めゲル過した。活性画分は、10％グリセロー
ルを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で透析した後、透
析チューブに入った酵素液をポリエチレングリコール20
00で濃縮し、−80℃で保存した。こうして得られた酵素
溶液（5.2ml）をLAP Ｗの標品とした。

上述の実施例の各精製工程で得たLAP Ｗの液量、総蛋
白質、総活性、比活性及び回収率を比較すれば、第２表
に示す通りである。

〔発明の効果〕 本発明に係るLAP Ｗは、広いpH域において高いペプチ
ド分解活性が維持できるため、食品加工にLAP Ｗを含
むプロテアーゼ（例えば前述のサカナーゼ）を利用すれ
ば、プロテアーゼによる食品加工用原料処理時にpHをあ
らかじめ酵素の活性至適pHに調整しなくても、高いペプ
チド分解を行わせることを期待できる。従って、本発明
は食品製造上極めて有意義である。

本発明のLAP Ｗの作用効果を説明するため、以下に試
験例を示す。

試験例１ 実施例で分画した個々のendo−プロティナーゼとLAPを
組合せた総活性量を均一にし、それらの組成を色々とか
えた再構成系で魚蛋白質を分解させたところ、本発明の
LAP Ｗの含有割合が高い再構成系は魚蛋白質分解度が
高かった。次に試験方法を説明する。

（試験方法） カルチベーター350（カツオとマグロ缶詰製造時に副生
する煮汁エキスの商品名、焼津水産化学工業製）を水で
５倍希釈した液をアンバーライト1R 120B（H⁺形）カラ
ムに通液し、その中に含まれている遊離のアミノ酸を吸
着除去し、吸光度260nm/吸光度280nm比が1.5以下の画分
を集め、pH6.1に調整し凍結乾燥を行い基質として用い
る魚蛋白質を調製した。

第３表に示したAlP、NP I、LAP I、LAP I^＊およびLAP
Ｗからなる酵素系でミカエリスのベロナール緩衝液（pH
6.1）に溶解した3.6％の魚蛋白質を、50℃で３時間加水
分解反応を行い、生成したα−アミノ基の量をTNBS法
〔奥山典生、笠井久隆著；蛋白質・核酸・酵素，18，−
1153−1159（1973）〕に従って測定し、魚蛋白質分解率
を次式から算出した。

（但し、式中〔 〕は〔 〕内の物質のα−アミノ基の
分解値を示す。） なお、AlP、NP Iの活性は、ミルクカゼインを基質と
し、50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）中で酵素反応を3
0℃、10分間行なう。

アンソン−萩原改変法〔ティ・ナカダイ等；アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー，3
7,2685−2694（1973）〕で求めた。実験に供した各プロ
テアーゼの由来と比活性は以下の表の通りである。

試験例１の結果を第３表に示す。

試験例２ 本発明のLAP Ｗを含むサカナーゼ（実施例参照）と糸
状菌起源の市販プロテアーゼによる単位LAP活性当りの
魚ペプチドおよびLeu−Gly−Gly分解度を、PH10とpH11.
5において比較した。サカナーゼは魚ペプチドおよびLeu
−Gly−Gly両者に対してpH10とpH11.5において高い分解
力を示したが、市販プロテアーゼはpH10では弱い分解力
であり、更にpH11.5では微弱な活性しか示さなかった。
次に試験方法を説明する。

（試験方法） 基質として用いた魚ペプチドは、25mMアトキンス−パン
チン緩衝液（pH8.0）に溶解した５％（w/v）魚蛋白質
（試験例１で調製したもの）をサカナーゼから単離した
2500units/mlのAlPで37℃、30分間分解したのち、100℃
で３分間処理して調製した。

供試酵素のLAP活性を100mU/mlになるように加え、0.91
％魚ペプチドあるいは30mM Leu−Gly−Glyを基質とし
て、pH10とpH11.5の100mMアトキンス−パンチン緩衝液
中で37℃、30分間酵素反応させた。反応液に冷水を加え
て反応停止した後、遊離したアミノ酸の量をニンヒドリ
ン法で測定した。試験例の結果を第４表に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はLAP ＷのLeu−Gly−GlyおよびGlu−Tyr−Glu
に対する至適pHを示す図であり、第２図はLAP Ｗの安
定pH範囲を示す図であり、第３図はLAP Wの活性至適温
度を示す図であり、第４図はLAP Ｗの熱安定性を示す
図であり、第５図はEDTAによるLAP Ｗ活性阻害のpH依
存性を示す図であり、第６図はサカナーゼのアンバーラ
イトCG−50樹脂吸着画分のDEAE−セファデックスＡ−50
クロマトグラフィーを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有する広域pHに作用
   する新規なロイシンアミノペプチダーゼ。 記 （１） 作 用 ペプチド鎖のＮ末端から順次アミノ酸を１個ずつ加水分
   解。 （２） 基質特異性 （３） 至適pHおよび安定pH範囲 （４） 作用pHの範囲 基質分解について、至適pHでの酵素活性を100％とした
   とき、約80％以上の相対活性を示すpH域は、Leu−Gly−
   Glyに対して6.0〜11.0、Glu−Tyr−Gluに対して4.6〜7.
   2。 （５） 活性至適温度 Leu−Gly−Glyに対してpH8.0で60℃。 （６） 安定温度範囲 Leu−Gly−Glyに対してpH8.0で60℃以下。 （７） 失活、阻害 エチレンジアミン四酢酸塩によりpH5以下で失活、1mM硫
   酸銅（pH8.0）で活性が30％阻害。 （８） 分子量 57,000〜58,000。