JPH03143394A - 広域ｐＨ作用を有する新規なロイシンアミノペプチダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　産業上の利用分野 カツオやマグロ等の缶詰製造時に副生する煮汁は日本に
おいて年間ＩＯ万トンも産生され大部分が未利用のまま
である。本煮汁は良質な蛋白質を含んでいるため各種プ
ロテアーゼで処理された後、濃縮され一部は魚肉エキス
に加工されている。

この魚肉エキスは調味料の素材や微生物の培地成分及び
肥料などにも利用されている。しかし、この魚肉エキス
の有効利用の一環として、例えば調味料へ加工する場合
は旨味性が弱い、魚臭が強いなどの問題があり、魚肉エ
キスとして十分価値のある利用がなされていないのが現
状である。

本発明は、これら魚類蛋白質を処理するのに通した新規
な広域ｐ）１作用を有するロイシンアミノペプチダーゼ
に関するものである。

（２）従来の技術 アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　
　ｏｒ■肚〉やアスペルギルス・ソニー（Ａ、　　５ｏ
ｊａｅ）といった麹菌起源のロイシンアミノペプチダー
ゼは食品として添加　あるいは加工する場合、安全性が
高いことからｅｎｄｏ−ブロティナーゼとともに調味食
品をはじめとして広く食品加工用酵素として利用されて
いる。特にロイシンアごノペブチダーゼは、旨味性の改
善に重要な役割を果たすものと考えられている。

（３）発明が解決しようとする問題点 麹菌起源で性質が明らかにされている公知のロイシンア
ミノペプチダーゼは、アスペルギルス・ソニー起源では
１種類〔ワイ・オザヮ等；アグリカルチエラル　アンド
　バイオロジカル　ケミストリー、主７．１２８５−１
２９３　（１９７３）　）あり、アスペルギルス・オリ
ゼー起源では５種類ＣＬＡＩ）　ｒ　二ティ・ナカダイ
等；アグリカルチュラル　アンドバイオロジカル　ケミ
ストリー、　　３７．７５７−７６５（１９７３）。Ｌ
ＡＰＩ［：テイ・ナヵダイ等：アグリヵルチュラル　ア
ンド　バイオロジカル　ケミストリ　−、　　　３７．
　　７６７−７７４．　　　（１９７３）　　。　ＬＡ
Ｐ　　ＩＩＩ　　：テイ・ナカダイ等：アグリ力ルチュ
ラルアンドバイオロジカル　ケミストリー、３７，７７
５−７８２　（１９７３）。ＬＡＰＩＶ：ティ・ナカダ
イ等；アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　
ケミストリー、１土、　　１６５７−１６６６　（１９
７７）。ＡＯＰ＝長谷川喜香用；日本農芸化学会誌、５
８．４８３−４８５　　（１９８４）　）ある。

公知のアスペルギルス属のロイシンアごノベブチダーゼ
の基質特異性を調べると、アスペルギルス・ソニー起源
のアミノペプチダーゼは、分子量が２２０，０００であ
り、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対する活性を１００％と
したとき、Ｌｅｕ−Ｇｌｙに対して９％の活性しか示さ
ない。一方、アスペルギルス・オリゼー起源では、ＬＡ
Ｐ　　Ｉは分子量が２６．５００であり、Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕに対する分解活性は低く、主にＬｅｕＧｌｙ
−ＧｕｙやＬｅｕ−Ｇｌｙに対して高い分解活性を有す
る。ＬＡＰ　ｎは分子量が６１，０００であり、ＧＩｕ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕをｐｉｆ４〜７の範囲で分解する活性
を有し、硫酸鋼で完全に失活され、活性至適温度が５０
℃である。

ＬＡＰ　１１１ｒは分子量が５６，０００であり、Ｇｌ
ｕ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをｐＨ３，５〜７の範囲で分解する
活性を有し、硫酸銅で完全に失活され、活性至適温度が
５０℃である。

ＬＡＰ　ＩＶは分子量が１３０，０００であり、Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対する活性を１００％としたとき、
Ｌｅｕ−Ｇｌｙに対して７．６％の活性しか示さない。

ＡＯＰは［、ｅｕＧｌｙ−Ｇｌｙに対する活性を１００
％としたとき、Ｌｅｕ−Ｇｌｙに対して０．３％の活性
しか示さない。以上の基質特異性からしｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ　ＸＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ及びＬｅｕ−Ｇｌｙ
等のペプチドに対して高い分解活性を示し、しかも広い
ｐＨ域で活性を維持できるロイシンアミノペプチダーゼ
が食品工学で切望されてきた。

（４）問題点を解決するための手段 上述した現況に鑑み、種々のペプチドに対して広いｐＨ
領域で高い分解活性を示すロイシンアミノペプチダーゼ
を提供すべく鋭意検討を重ねた結果、アスペルギルス属
に属する菌株を培養した麹中に、広いｐＨ領域で強いペ
プチド分解活性を有する新規なロイシンアミノペプチダ
ーゼが得られることを発見し、本発明を完成した。

即ち、本発明は下記の理化学的性質を有する広域ｐｌＩ
に作用する新規なロイシンアミノペプチダーゼである。

記 ■　作用：ペプチド鎖のＮｚ端から順次アミノ酸を１個
ずつ加水分解する作用をもった…虹ペプチダーゼである
。

■　基質特異性、至ｉ！￥ｉｐＨ及び安定ｐＨ範囲：Ｌ
−ロイシル−グリシル−グリシン（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ）及びＨ−グルクミル−チロシル−グルタミン酸−
〇Ｈ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　）に対するＫｍ値（碇
カニリス定数）は３７°ｃ、、　ｐＨ８，０（アドキン
ス−パンチン緩衝液）に於いて前者が４４ｍＭ、後者が
３０ｍ　Ｍで、ｐＨ１１，５（炭酸ナトリウム−水酸化
ナトリウム水溶液）に於いては前者が４．８ｍＭで後者
は１．６ｍＭである。また、基質しｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ及びＧｌｕ−ＴｙｒＧｌｕについての至適ｐ）Ｉは前
者が９．０で後者は６．０である。なお、安定ｐＨ範囲
は共に２．８〜１０．１である。

■　作用ｐＨの範囲二基質分解について、至適、Ｈでの
酵素活性を１００％としたとき、約８０％以上の相対活
性を示すｐＩＩ域は、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対して
６．０〜１１．０であり、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕに対
して４．６〜７．２である。

■　至適作用温度及び安定温度範囲；　ＬｅｕＧｌｙ−
Ｇｌｙに対してｐＩ（８，０で６０℃が活性至適温度で
、３７°Ｃにおける活性に対して約３．５倍の活性増加
が見られる。安定温度範囲はｐＨ８，０で６０℃以下で
ある。

■　失活、阻害条件：エチレンジアミン四酢酸塩により
ｐｌ（５以下で失活される。１ｍＭ硫酸銅（ｐＨ８，０
）により、活性の３０％が阻害される。

■　分子量：　５７，０００〜５８，０００　（ゲル濾
過法：セファデックスＧ２００使用） 以下、本発明の広域に作用するロイシンアミノペプチダ
ーゼ（以下、ｒＬＡＰ　ＷＪと略す）理化学的性質につ
いて詳細に説明する。

（作用） ＬＡＰ　Ｗはペプチド鎖のＮ、を端から順次アミノ酸を
１個ずつ加水分解して遊離する作用を有したｅｘｏ−ペ
プチダーゼである。

（基質特異性） 第１表に示す各基質１０ｍＭを３０ｍｔｌ（Ｌ−ロイシ
ル−ｐ−ジエチルアミノアニリド分解力〉／ｎＩｌのＬ
ＡＰ活性量で、８０ｍＭアドキンス−パンチン緩衝液（
ｐＨ８，０）において、３７℃、６０分間反応させ、こ
れに冷水を添加して反応を停止させた。反応液中に遊離
したアミノ酸をニンヒドリン法〔ニス・タカハシ：ジャ
ーナル　オブ　バイオケミストリー、８３．　５７−６
０　（１９７８）　）で定量した。

なお、ＬＡＰ活性は国際単位ｍｕ／ｍｆｆで表わしてお
り、Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエチルアごノアニリドを基質
にしてＬＡＰ　Ｃ−Ｔｅ５ｔＷａｋｏキツト　（和光純
薬工業製）を用いて測定した。

相対活性（％）は、１．ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを基質と
して酵素反応させて得られたアミノ酸の量を１００％と
し、他のペプチドを基質とした場合に得られたアミノ酸
の量との比較値（％）で示した。

第 表 ＬＡＰ　Ｗは、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ１．ｙに対するＫｍ
値が３７℃、ｐＨ８゜０　（アドキンス−パンチン緩衝
液）において４４ｍＭ及びｐＨ１１，５（炭酸ナトリウ
ム−水酸化ナトリウム水溶液）において４．８ｍＭであ
り、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕに対するｌ＜ｍ値が３７°
ｃ、ｐＨ８，０において３０ｍＭ及びｐＨ１１，５にお
いて１．６ｍＭである。

（至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲） ＬＡＰ　Ｗの活性至適ｐＨは第１図に示す如（，１，ｅ
ｕＧｕｙ−Ｇｌｙを基質にした場合（・−・）ｐＨ９．
０であり、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを基質にした場合（
ムーム）　ｐＨ０ ６．０である。なお、３０ｍＭ　Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙあるいは５　ｍＭ　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを基質と
しく　〉内に示したＬＡＰ活性量、ｍ［Ｉ／’＋ｎｊ’
でそれぞれのｐｌ（において３７℃、３０分間反応させ
、冷水を反応液中に加えて反応停止させた後遊離アミノ
酸の量をニンヒドリン法で測定した。ｐＨ４〜５は酢酸
緩衝液、ｐ＋＋６〜７はリン酸緩衝液、ｐＨ８〜１０は
アドキンス−パンチン緩衝液、ｐＨ１１は炭酸ナトリウ
ム−水酸化ナトリウム水溶液を用いたものである。

ＬＡＰ　Ｗの安定ｐｉ範囲は、２８６ｍＵ／　ｍ６のＬ
ＡＰＷを含有した２５ｍＭの各ｐｌ（の緩衝液を３７　
”ｃで２時間放置した後、２００ｍＭｔ□リスー塩酸緩
衝液でｐＨ８．０に調整し、直ちに残存する酵素活性を
０、５ｍＭ　Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　（・−・）また
ば０．５ｍＭＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　　（ムーム）を
用いて調べた。第２図に示す如く、いずれの基質に対し
ても安定ｐ＋＋範囲は２．８〜１０．１である。なお第
２図中、ｐＨ２〜３は酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ３，５〜６．０は酢酸緩衝液、ｐＨ７，０〜９．０は
トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，８以上は炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウ１ ム緩衝液を用いた。

（作用ｐ１１の範囲） 第１図に示す如＜　、ＬＡＰ　Ｗの各基質分解に対する
至適ｐ＋＋における酵素活性を１００％としたとき、約
８０％以上の相対活性を示すｐＨ域は、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙに対してｐＨ６，０〜１１．０であり、Ｇｌｕ
−ＴｙｒＧｌｕに対してｐＨ４，６〜７．２である。

（作用温度の範囲〉 第３図に示す如＜、ｐＨ８，０において、Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙｃｒｙに対して６０″Ｃが活性至適温度であり、３７
°Ｃにおける活性に対して約３．５倍の活性増加がみら
れる（各温度で２分間ブレインキュベーションし、１０
分間酵素反応を行った） （温度による失活条件） 第４図に示す如＜、ｐｕｓ。０においてＬｅｕ−Ｇｌｙ
ＧＩｙの分解活性は６０℃を越えると漸次失われてゆく
ことを示している。

（阻害条件〉 エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）によるＬＡＰＷ
活性の阻害はｐＨに依存しており、ｐＨ５以下で失２ 活される。即ち、２２２ｍＵ／　ｍｆｆのＬＡＰ　Ｗ、
５５ｍＭの各ｐｏの緩衝液及び各ｐ）Ｉに調整した２２
ｍＭＥＤＴＡを含む溶液を３７℃で２時間インキュベー
ションした後、０．４ｍＭ　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを
加え３７°Ｃで３０分間酵素反応させた。冷水を２０倍
量加えて反応を停止した後、遊離したアミノ酸の量をニ
ンヒドリン法で測定した。ｐＨ３，５〜６．０は酢酸緩
衝液、ｐＨ７，０〜９．０はトリス−塩酸緩衝液、ｐｌ
（１０１０以上は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム
緩衝液を用いた。結果を第４図に示す。

第５図において・−・はＬＡＰ　ＷがＥＤＴＡ未処理の
もの、○−・−○はＥＤＴＡ処理のものである。ｐＨ５
，０でＥＤＴＡ未処理のときの遊離アミノ酸量を１００
％とし、各ｐＨにおける相対活性値％で表わした。

ＬＡＰ　Ｗは、３０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）において１ｍＭ硫酸銅と共に３７°Ｃで２０分間イ
ンキュベーションすることにより、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ＩＶの分解活性が３０％阻害される。

（分子量） ＬＡＰ　Ｗの分子量は、セファデックスＧ　２００　（
ス３ −バーファイン、直径１．５　ｃｍ　ｘ長さ９８ｃｍ）
カラムを用い、０．１Ｍ食塩を含有する０、１Ｍ酢酸緩
衝液中で測定したく流速：　１．４１　ｍ７！／ｈｒ、
分画容量０．５８ｍｊ？、４℃）　、　ＬＡＰ　Ｗの分
子量は５７．０００〜５８，０００である。なお、分子
量標準蛋白質は、ベーリンガー・マンハイム社製のウサ
ギ筋肉のアルドラーゼ（分子ｉｔ　：　１６０，０００
　）　、牛血清アルブミン（６７，０００）、卵アルブ
ミン（４５，０００）、キモトリプシノーゲンＡ　（２
５，０００＞及びチトクロームＣ（１２，０００）を用
いた。

（力価の測定法） ＬＡＰ活性の力価は、ロイシンアミノペプチダーゼ測定
用ＬＡＰ　Ｃ−Ｔｅｓｔ　（Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエチ
ルアミノアニリド基質法、和光純薬工業株式会社製）を
用いて測定した。酵素の単位は、Ｌ−口イシル−β−ナ
フチルア５ドを基質として用い、酵素液０．０２　ｍＩ
ｌが３７°Ｃで２時間基質に作用してβ−ナフチルアミ
ン１７１２μｇを遊離させるとき（Ｇ−Ｒ単位とし、こ
のＧ−Ｒ単位を４．１２４倍した国際単位（ｍｕ／ｍｊ
りで表わした。

４ （精製方法） ＬＡＰ　Ｗは後述する精製方法にまり単離することがで
きる。

以上のとおり、ＬＡＰ　Ｗはその酵素学的、物理化学的
な諸性質は公知のロイシンアミノペプチダーゼの何れと
も異なっており、特に広いｐＨ域において各種のペプチ
ドに高い分解力を有するため、食品工業上有利な酵素で
ある。

次に本発明に係わるＬＡＰＷの製造法についてその一例
を説明する。

本発明において使用される微生物は、ＬＡＰ　Ｗ産生能
を有する菌株であれば何れを用いてもよく、例えばアス
ペルギルス属に属する菌株を用いるのが有利で、その具
体例としてはアスペルギルス・ソニー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ　　５ｏｊａｅ　）　Ｓ−２９７株が挙げられ
る。アスペルギルス・ソニーＳ−２９７株は工業技術院
微生物工業技術研究所に徽工研菌寄第９０７３号として
寄託されており、菌学的性質が特開昭６３−１４８９８
５号に詳述されている。

次に、ＬＡＰ　Ｗ産生能を有するアスペルギルス・５ ソニーＳ−２９７株を培養し、培養物よりＬＡＰ　Ｗを
製造する方法を述べる。

まず、培養法としては液体培養でもよいが、−船釣には
好気的固体培養の方が好ましい。通常、Ｓ−２９７株は
小麦皺等の固体培地に接種し、４０〜５５時間好気的に
培養するとプロテアーゼを培地（麹）中へ分泌する。培
養後、麹を水に懸濁することにより、プロテアーゼは容
易に水層中に移行し、不溶物を遠心分離操作や濾過等の
適当な手段で除去し、ＬＡＰ　Ｗを含む粗酵素液を得る
ことができる。得られた粗酵素液よりＬＡＰ　Ｗを採取
する手段としては、透析、イオン交換樹脂に吸着し溶出
させる方法及びゲル濾過等が挙げられ、ＬＡＰ　Ｗを単
離することができる。

以下、実施例により本発明の実施態様を詳細に説明する
。

〔実施例〕

皺４゜８ｋｇＸＫＨｚＰＯ４３２０ｇ、　Ｌ−グルタミ
ン酸ナトリウム１６０ｇ及び水８１からなる固体培地を
１２１℃、１気圧下２０分間滅菌した後、アＧ スペルギルス・ソニーＳ−２９７株の分生子を接種し、
３０℃で２日間通気培養し、Ｄ　６．９　ｋｇを得た。

この麹を水６０Ｉ！中に懸濁させ充分に撹拌した後、遠
心分離（９０００ｒｐｍ）　シて上滑液５５１を得た。

次いで、この液をホローファイバーシステム（小松用化
工機ＷＪ）において分離膜ＰＭ　１０００を通過させた
後、分離膜ＰＭ　５で濃縮した。得られた濃縮液は４１
で、２８０　ｎｍでの吸光度が２６であった。この液に
安定化剤として４２０ｇのデキストリン（日本資糧工業
社製　ＮＳ０１３１Ｂ）を加えた後、凍結乾燥を行い、
４２２ｇの粗酵素粉末（以後サカナーゼと呼ぶ）を得た
。

サカナーゼはＬＡＰ　Ｗを含む総ロイシンアごノベブチ
ダーゼ力価が６．６　ｕｎｉｔｓ／ｇであった。

以下の操作は４℃で行った。サカナーゼの一部（１００
ｇ）　　に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，１）を１．
ＯＮ加えて溶解させ、不溶物を遠心分離（９０００ｒｐ
ｍ、１時間〉して除去し、得られた上澄液に４０％飽和
になるよう硫安を加え一夜放置した。生じた沈澱物を遠
心分離（９０００ｒｐｍ、　１時間）７ により除いた後、上澄液（１，１ｆｆ）に８０％飽和に
なるように硫安を加え、２時間放置した。生じた沈澱物
を再び遠心分離（１７０００ｒｐｍ、　３０分間）して
回収し、２ｍＭ酢酸カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，８）　　１０　ｍ６を加えて溶解し、同じ
緩衝液（２１，液を２回交換）を用いて一夜透析した。

透析して得た酵素液は、２ｍＭ酢酸カルシウムを含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，８）であらがじめ平衡化し
たアンバーライトＣ’Ｇ−５０（米国ローム・アンド・
ハース社製イオン交換樹脂〉のカラム（直径６ｃｍ×高
さ６８ｃｍ）に通塔してＬＡＰ　Ｗを吸着させ、その洗
浄液は２８０ｎｍにおける吸光度が０になるまで上記の
緩衝液でカラムを洗浄した後、０．５Ｍ酢酸ナトリウム
水溶液で？容出した。

活性画分はｐＨ６，５に調整した後、冷アセトンを終濃
度７０％になるまで添加し、生した沈澱を９０００ｒｐ
Ｉ１１．３０分間の遠心分離で回収した。得られた酵素
を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ域７．０）　　２５　ｍ
ＩＶで？客筋し、同じ緩衝液（１ｅ、液を２回交換）を
８ 用いて一夜透析した。

透析して得た酵素液（２５，５ｍ１２）は、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）であらかじめ平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製イオン交換樹脂）のカラム（直径４
　ｃｍ　Ｘ高さ２８ｃｍ）に通塔して、ＬＡＰＷを吸着
させた。樹脂に吸着しない酵素として、アルカリ性プロ
ティナーゼ（ＭＰと略す）画分を回収した後、カラムを
充分に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した
。その後、吸着したＬＡＰＷは、同じＭｉ或の緩衝液５
００ｎｌｘ２に含有させた０〜０．５　Ｍ塩化ナトリウ
ムの直８ｇ濃度匂配法で溶出させた。流速は０．６４　
ｍ　ｌ　／ｍｉｎ　、−画分量は１０．４ｍｊ２とした
。本クロマトグラフィーでのしＡＰＷの溶出パターン（
斜線で表示）を第６図に示す。図からｓｅｍｉ−Ａ　！
ｌ　Ｐ　、中性プロティナーゼ■（ＮＰ　Ｉ）　、ＬＡ
Ｐ　　Ｉ”およびＬＡＰ　Ｗが主要活性ピークを構成し
ている。なお、公知のアスペルギルス・オリゼー起源の
ＬＡＰ　　Ｉはアンバーライ）ＣＧ５０樹脂クロマトグ
ラフイーの非吸着画分に回９ 収される性質があり、一方当該操作ではアンバーライ１
−ＣＧ−５０樹脂に吸着した画分から回収される性質を
もったＬＡＰ　ｒ類似酵素であるため、区別する意味で
＊印を冠した。ＬＡＰＷの活性画分はｐＨ６，５に調製
した後、１％マンニトールを加え、次いで、冷アセトン
を終濃度７０％になるまで添加し、生じた沈澱を９００
Ｏｒｐｍ、３０分間の遠心分離で回収した。酵素は少量
の１．５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶解した後
、同じ緩衝液（ｉｆｆ、液を２回交換）を用いて一夜透
析した。

透析して得た酵素液（１２，６ｍｊりは、１５０ｍＭ　
　＃酸緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−１００（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製ゲル濾過担体
）のカラム（直径２ｃｍ×高さ１２７ｃｍ）を用い、流
速１９．６ｍｌ！、／ｈで一画分２．３３ｍｊ２ずつを
集めゲル濾過した。活性画分は、１０％グリセロールを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した後
、透析チューブに入った酵素液をポリエチレングリコー
ル２０００で濃縮し、８０”Ｃで保存した。こうして得
られた酵素溶液０ （５，２ｍＡ）をＬＡＰ　Ｗの標品とした。

上述の実施例の各精製工程で得たＬＡＩ’　Ｗの液量、
総蛋白質、総括性、比活性及び回収率を比較すれば、第
２表に示す通りである。

２ 〔発明の効果〕 本発明に係るＬ７１Ｐ　Ｗは、広いｐＨ域において高い
ペプチド分解活性が維持できるため、食品加工にＬＡＰ
　Ｗを含むプロテアーゼ（例えば前述のザカナーゼ）を
利用すれば、プロテアーゼによる食品加工用原料処理時
にｐＦＩをあらかじめ酵素の活性至適ｐＨに調整しなく
ても、高いペプチド分解を行わせることを期待できる。

従って、本発明は食品製造上極めて有意義である。

本発明のＬＡＰ　Ｗの作用効果を説明するため、以下に
試験例を示す。

試験例１ 実施例で分画した個々のｅｎｄｏ−プロテア−ゼとＬＡ
Ｐを組合せた総括検量を均一にし、それらのＭＬ威を色
々とかえた再構成系で魚蛋白質を分解させたところ、本
発明のＬＡＰ　Ｗの含有割合が高い再構成系は魚蛋白分
解度が高かった。次に試験方法を説明する。

（試験方法） カルチベーター３５０　（カツオとマグロ缶詰製３ Ｂ　（Ｈ’形）カラムに通液し、その中に含まれている
遊離のアミノ酸を吸着除去し、吸光度２６０ｎｍ／吸光
度２８０ｎｍ比が１．５以下の画分を集め、ｐＨ６，１
に調整し凍結乾燥を行い基質として用いる魚蛋白質をｉ
ｉｌ製した。

第３表に示したＡＬＰ　、　ＮＰＩ　、ＬＡＰ　　Ｉ、
　ＬＡＰ　　Ｔ”およびＬＡＰ　Ｗからなる酵素系でミ
カエリスのベロナール緩衝液（ｐ）１６゜ｌ）に溶解し
た３、６％の魚蛋白質を、５０℃で３時間加水分解反応
を行い、生成したα−アミノ基の量をＴＮＢＳ法〔奥山
興生、笠井久隆著；蛋白質・核酸・酵素、土８，１１５
３１１５９　（１９７３）　）　４こ従って測定し、魚
蛋白質分解率を次式から算出した。

魚蛋白質分解率 ４ なお、Ａｎ’、ＮＰ＋の活性は、ミルクカゼインを基質
とし、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で
酵素反応を３０℃、１０分間行なう。

アンソン−萩原改変法〔ティ・ナカダイ等；アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケごストリー、　
　３７．２６８５−２６９４　（１９７３）　）で求め
た。実験に供した各プロテアーゼの由来と比活性は以下
の表の通りである。

５ 第 表 試験例２ 本発明のＬＡＰＷを含むサカナーゼ（実施例参照）と糸
状菌起源の市販プロテアーゼによる単位ＬＡＰ活性当り
の魚ペプチドおよびＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ分解度６ プロテアーゼはｐＨ１０では弱い分解力であり、更にＰ
Ｉ＋１１．５では微弱な活性しか示さなかった。次に試
験方法を説明する。

（試験方法） 基質として用いた魚ペプチドは、２５ｍＭアドキンス−
パンチン緩衝液（ｐｔｌ　８．０　）に溶解した５％（
’／ｖ）魚蛋白質（試験例１で調製したもの）をサカナ
ーゼから単離した２５００　ｕｎｉｔｓ／　ｍｅのＡＬ
Ｐで３７℃、３０分間分解したのち、１００℃で３分間
処理して調製した。

供試酵素 供試酵素のＬＡＰ活性を１００ｍＬＩ／　ｍＩｌになる
ように加え、０．９１％魚ペプチドあるいは３０ｍＭＬ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを基質として、ｐＨ１０とｐＨ１
１，５の７ １００ｍＭアドキンス−パンチン緩衝液中で３７°Ｃ１
３０分間酵素反応させた。反応液に冷水を加えて反応停
止した後、ＭＦ＋ｉｌしたアミノ酸の量をニンヒドリン
法で測定した。試験例の結果を第４表に示した。

第４表

【図面の簡単な説明】

第１図はＬＡＰ　Ｗの１、ｅｕ−Ｇａｙ−Ｇａｙおよび
Ｇｌｕ−ＴｙｒＧｌｕに対する至適ｐＨを示す図であり
、第２図はＬＡＰ　Ｗの安定ｐ）Ｉ範囲を示す図であり
、第３図はＬＡＰ　Ｗの活性至適温度を示す図であり、
第４図はＬＡＰ　ＷＯ熱安定性を示す図であり、第５図
はＥＤＴＡによるＬＡＰ　Ｗ活性阻害のｐＨ依存性を示
す図であり、８ 第６図はサカナーゼのアンバーライトＣＧ−５０樹脂吸
着画分のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０クロマトグ
ラフィーを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の理化学的性質を有する広域ｐＨに作用する新規な
   ロイシンアミノペプチダーゼ。 記 （１）作用 ペプチド鎖のＮ末端から順次アミノ酸を１個ずつ加水分
   解。 （２）基質特異性 ▲数式、化学式、表等があります▼（表） ＊３７℃、ｐＨ８．０（アトキンス−パンチン緩衝液）
   ｐＨ１１．５（炭酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水溶
   液） （３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 ▲数式、化学式、表等があります▼（表） （４）作用ｐＨの範囲 基質分解について、至適ｐＨでの酵素活性を１００％と
   したとき、約８０％以上の相対活性を示すｐＨ域は、Ｌ
   ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対して６．０〜１１．０、Ｇｌ
   ｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕに対して４．６〜７．２。 （５）活性至適温度 Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対してｐＨ８．０で６０℃。 （６）安定温度範囲 Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対してｐＨ８．０で６０℃以
   下。 （７）失活、阻害 エチレンジアミン四酢酸塩によりｐＨ５以下で失活、１
   ｍＭ硫酸銅（ｐＨ８．０）で活性が３０％阻害。 （８）分子量 ５７，０００〜５８，０００。