Verfahren zur Verminderung eines Mitomycin-Abbaues in einer Gesamtfermentationsbrühe Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung eines Mitomycin-Abbaues in einer Gesamtfermentationsbrühe. Die Verbesserung be steht darin, dass bei der Arbeitsweise nach dem neuen Verfahren erhöhte Ausbeuten an den Antibio tika erhalten werden.
Mitomycine sind bekannte antibiotische Substan zen, deren physikalische, chemische und biologische Eigenschaften sowie deren Herstellung und verschie dene Anwendungszwecke wohlbekannt und in der Literatur beschrieben sind. Sie enthalten einen Chi- nonring, der unterschiedlich substituiert sein kann, wobei die verschiedenen Substitutionsprodukte als Mitomycin A, B, C. . . bezeichnet werden.
Zum Bei spiel trägt das Mitomycin A am Chinonring eine Methoxygruppe, das Mitomycin C einen Aminorest. Das erfindungsgemässe Konservierungsverfahren ist nicht beschränkt auf einzelne dieser Stoffe, sondern wirkt allgemein.
Technisch wird Mitomycin hergestellt durch Kul tivieren eines Mitomycin produzierenden Organis mus z. B. Streptomyces caespitosus in einem geeig neten Medium während einer Zeitdauer, die norma lerweise zwischen einigen bis mehreren Tagen be trägt.
Üblicherweise werden hierbei nach Vollendung der Fermentation die festen Anteile von der über stehenden Flüssigkeit abgetrennt, welch letztere im wesentlichen alle antibiotisch aktiven Substanzen ent hält. Die Zeit, welche für die Abtrennung durch Zentrifugieren, Filtrieren oder andere Mittel not wendig ist, kann von einigen Minuten bis zu einigen Stunden betragen. Sie hängt ab von einer Anzahl von Faktoren, z. B. vom Zeitbetrag, der für die eigentliche physikalische Trennung erforderlich ist, wie auch von der Zeit, die für das Gebrauchs fertigmachen der Trenneinrichtung benötigt wird.
Ein schwerwiegendes Problem resultierte bisher aus der Tatsache, dass die Gesamt-Fermenta- tionsbrühe des Mitomycins in ihrer Aktivität wäh rend der Zeit zwischen der Vollendung der Fermenta tion und der Entfernung des Myceliums (feste An teile) rasch abnimmt. Es wurde z. B. beobachtet, dass praktisch die gesamte Mitomycin-Aktivität einer Fer- mentationsbrühe im Lauf von 6 Stunden bei Zimmer temperatur und im Verlauf von 24 Stunden bei 10 C verlorengeht.
Anderseits erwies sich, dass die ge klärte überstehende Flüssigkeit, wie sie durch Zen trifugieren derselben Fermentationsbrühe erhalten werden kann, unter denselben Bedingungen keinen Verlust an Aktivität erleidet.
Es wurde entdeckt, dass das Mycelium, welches beim Züchten des Mitomycin produzierenden Orga nismus im Verlauf der Fermentation entsteht, eine Substanz enthält, welche das Mitomycin inaktiviert oder zerstört. Diese Substanz, welche bisher nicht isoliert oder charakterisiert werden konnte, wurde Mitase genannt. Dieser Ausdruck wird in der folgen den Beschreibung und den Ansprüchen durchwegs verwendet werden mit Bezug auf das Antibiotikum zerstörende Agens.
Da es aus den oben erwähnten Gründen nicht möglich ist, das Mycelium von der überstehenden Flüssigkeit unmittelbar nach Schluss der Fermentation abzutrennen, setzt sich die vorliegende Erfindung zum Ziel, eine Methode zur Inhibierung des ab bauenden Effekts der Mitase zu finden.
Dies wurde dadurch erreicht, dass man der Gesamt-Fermenta- tionsbrühe bei der Vollendung der Fermentation ei nen Mitase-Inhibitor in solcher Menge zusetzt, dass der Abbau des Mitomycins durch Mitase mindestens teilweise unterbunden wird. Es hat sich gezeigt, dass der abbauende Effekt vermindert oder gänzlich un terbunden werden kann durch Zugabe von Inhibito- ren, wie Chloroform, Merkurichlorid,
Toluol und Alkalialkyl-sulfaten. Zweckmässigerweise wird diese Zugabe am Ende der Fermentation gemacht, d. h. kurz bevor oder beim Aufhören der Belüftung der Fermentationsbrühe. Die genannten Substanzen ha ben sich experimentell als wirksame Mitase-Inhibito- ren erwiesen, wie dies untenstehend beschrieben wer den soll. Es können aber auch andere wirksame Mitase-Inhibitoren in ähnlicher experimenteller Weise identifiziert werden.
Von den erwähnten beschriebenen Mitase-Inhibi- toren ist die Anwendung von Natrium- oder Kalium alkylsulfat, oder Mischungen dieser Salze, bei wel chen die Alkylgruppe 8 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist, vorzuziehen. Ein besonders wirksamer In- hibitor dieser Gruppe von Verbindungen ist das Natrium-laurylsulfat.
Vorzugsweise wird der Mitase-Inhibitor in einer Menge von 0,1 bis 0,5 % des Gewichts der Gesamt- Fermentationsbrühe zur Anwendung gebracht. Grö ssere Mengen als 0,5 % erweisen sich als nur wenig oder gar nicht stärker wirksam als die geringeren Anteile. Die Wirksamkeit des Mitase-Inhibitors kann durch Abkühlen der Fermentationsbrühe unmittelbar nach Beendigung des Fermentationsschrittes sowie durch Einstellen der Brühe auf ihren endgültigen pH-Wert verstärkt werden.
Die im folgenden beschriebenen Experimente zei gen den Abbau des Mitomycins in unbehandelter Ge samt - Fermentationsbrühe. Vergleichsweise enthält die folgende Tabelle Daten über die geklärte über stehende Lösung, welche beweisen, dass der ab bauende Effekt vom Mycelium oder von den festen Anteilen der Gesamt-Fermentationsbrühe ausgeht.
EMI0002.0039
Probe <SEP> Behandlung <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> 0 <SEP> Stunden <SEP> 24 <SEP> Stunden
<tb> I <SEP> Gesamt <SEP> Fermentationsbrühe, <SEP> zentrifugiert <SEP> zur <SEP> Testzeit <SEP> 17,6 <SEP> 11,5
<tb> 1I <SEP> überstehendes <SEP> und <SEP> festes <SEP> Mitomycin <SEP> 37,8 <SEP> 52,2
<tb> III <SEP> Suspendierte <SEP> und <SEP> gewaschene <SEP> Mycelia <SEP> plus <SEP> festes <SEP> Mitomycin <SEP> 24,3 <SEP> 0,0
<tb> IV <SEP> Gesamt-Fermentationsbrühe, <SEP> zentrifugiert <SEP> zur <SEP> Testzeit <SEP> 22,6 <SEP> 12,6
<tb> V <SEP> überstehendes <SEP> plus <SEP> festes <SEP> Mitomycin <SEP> 28,8 <SEP> <B>15,3</B>
<tb> VI <SEP> Suspendierte <SEP> gewaschene <SEP> Mycelia <SEP> plus <SEP> festes <SEP> Mitomycin <SEP> 28,8 <SEP> 15,
3 Die Probe I war eine Gesamt-Fermentations- brühe, welche am siebenten Tag der Fermentation gewonnen wurde. Probe II war ein Anteil dieser selben Brühe, welche zentrifugiert worden war, um die klare überstehende Lösung abzutrennen, zu wel cher ein geringer Anteil festen Mitomycins zugefügt worden war. Probe HI wurde aus einem Teil dieser Brühe hergestellt, welcher zentrifugiert worden war, um die festen Anteile abzutrennen (das Mycelium wurde mit wässriger Salzlösung gewaschen).
Diese festen Anteile wurden hierauf in einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung von pH 7 suspendiert und ein geringer Anteil festen Mitomycins zugegeben. Die Proben IV, V und VI wurden in derselben Weise wie die Proben I, 1I und III hergestellt, mit Aus nahme, dass eine andere Fermentationsbrühe verwen det wurde, welche am achten Tag der Fermentation gewonnen worden war.
Ein weiterer Versuch wurde angestellt mit dem Zweck zu zeigen, dass die Substanz, welche das Mi- tomycin inaktiviert, im Mycelium oder in den festen Anteilen enthalten ist. Diese Versuche erweisen fer ner, dass die Substanz selbst durch Kochen zerstört wird.
EMI0002.0060
Verweildauer <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> im <SEP> Wasserbad <SEP> von <SEP> 37 <SEP> C <SEP> Suspension <SEP> Suspension
<tb> Stunden <SEP> von <SEP> gekochtem <SEP> Mycelium <SEP> von <SEP> ungekochtem <SEP> Mycelium
<tb> mit <SEP> Mitomycin <SEP> mit <SEP> Mitomycin
<tb> 0,0 <SEP> 4,95 <SEP> 5,4
<tb> 0,25 <SEP> 5,7 <SEP> 3,7
<tb> 0,50 <SEP> 5,1 <SEP> 1,2
<tb> 1,0 <SEP> 5,4 <SEP> 0,5
<tb> 2,0 <SEP> 6,0 <SEP> 0
<tb> 3,0 <SEP> 6,6 <SEP> 0
<tb> 4,0 <SEP> 4,65 <SEP> 0
<tb> 5,0 <SEP> 4,95 <SEP> 0 Die Tabelle zeigt, dass Mitomycin nach einer Stunde bei 37 C vollständig inaktiviert wird.
Wäh rend die vorher beschriebenen Versuche dartun, dass Mitomycin nicht immer vollständig inaktiviert wird, im Verlaufe einer 24stündigen Periode bei Zimmer temperatur.
In den ganzen vorliegenden Beschreibung wird die Aktivität der Mitomycin enthaltenden Brühen gemessen in Mikrogramm Mitomycin pro ml Brühe und bestimmt vermittels des Diffusions-Platten-Te- stes, wobei Klebsiena pneumoniae als Testorganismus verwendet wird.
<I>Beispiel 1</I> Es wurden verschiedene Proben von Mitomycin enthaltenden Gesamtbrühen hergestellt. Die Probe I, welche die volle Aktivität der Brühe enthält, wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung sofort auf ihre Mitomycin-Aktivität getestet, wodurch der Aus gangswert der Aktivität der Brühe bestimmt werden konnte. Die Restaktivität der Brühe nach Zerstörung eines Teils des Mitomycins durch die Mitase des My- celiums wurde hierauf in der Probe 1I der Gesamt brühe bestimmt.
Diese Probe wurde eine Stunde lang auf 37 C erwärmt, hierauf zentrifugiert und die über stehende Lösung getestet. Die Wirkung von Merkuri chlorid, auf Mitase wurde durch Zugabe von 0,025 Gew. % Merkurichlorid, bezogen auf das Gewicht der Gesamtbrühe der Probe III ermittelt. Nach Zugabe des Reagenz wurde die Probe eine Stunde lang auf 37 C erhitzt, hierauf mit Butanol extrahiert,
um die Mitomycinaktivität auszuziehen. Der Extrakt wurde hierauf vom organischen Lösungsmittel abgetrennt, mit Wasser wieder aufgenommen und getestet.
Es erwies sich dabei, dass der Abbaueffekt der Mitase auf das Mitomycin durch das Merkurichlorid inhi- biert worden war und dass die volle Mitomycinakti- vität der Brühe erhalten geblieben war,
trotz des ge- linden Erwärmens derselben in Gegenwart des My- celiums. Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle I enthalten.
EMI0003.0055
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Probe <SEP> Behandlung <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> I <SEP> Gesamtbrühe <SEP> ohne <SEP> Mycelia, <SEP> unmittelbar <SEP> getestet <SEP> 35,0
<tb> 1I <SEP> Gesamtbrühe <SEP> erwärmt <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> während <SEP> einer <SEP> Stunde, <SEP> hierauf <SEP> getestet <SEP> 1,5
<tb> <B>in</B> <SEP> Gesamtbrühe <SEP> plus <SEP> 0,025 <SEP> GewA <SEP> HgC12 <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> erwärmt, <SEP> 35,
0
<tb> hierauf <SEP> Mitomycin <SEP> extrahiert <SEP> und <SEP> getestet Beispiel <I>2</I> Die Wirkung von verschiedenen Mitase-Inhibito- ren wurde in einer Versuchsreihe untersucht. Hierzu dienten verschiedene identische Proben von Mitomy- cin enthaltender Gesamtbrühe. Bei der ersten Probe wurden die festen Anteile abgetrennt und die über stehende Lösung unmittelbar getestet.
Bei der näch sten Probe (Probe V) wurde die Restaktivität der Brühe nach Zerstörung eines Teils des Mitomycins durch die Mitase getestet, nachdem die Gesamtbrühe eine Stunde lang auf 37 C erwärmt, hierauf zentri fugiert und die überstehende Lösung abgetrennt wor den war. Die verbleibenden Proben wurden in genau derselben Weise wie Probe V behandelt, mit der Ausnahme, dass ihnen verschiedene Inhibitoren vor dem Erwärmen zugefügt worden waren, wie sie in der Tabelle Il untenstehend angegeben sind. Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 1I zusammen gestellt.
EMI0003.0069
<I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb> Probe <SEP> Behandlung <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> IV <SEP> Gesamtbrühe <SEP> ohne <SEP> Mycelia, <SEP> unmittelbar <SEP> getestet <SEP> 35,0
<tb> V <SEP> Gesamtbrühe <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> eine <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> erwärmt, <SEP> hierauf <SEP> getestet <SEP> 2,8
<tb> VI <SEP> Gesamtbrühe <SEP> plus <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> Phenol, <SEP> eine <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> 12,5
<tb> erwärmt, <SEP> hierauf <SEP> getestet
<tb> VII <SEP> Gesamtbrühe <SEP> plus <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Toluol, <SEP> eine <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> erwärmt, <SEP> 35,0
<tb> hierauf <SEP> getestet
<tb> VIII <SEP> Gesamtbrühe <SEP> plus <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Toluol, <SEP> eine <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> auf <SEP> 37 <SEP> C <SEP> erwärmt,
<SEP> 27,0
<tb> hierauf <SEP> getestet <I>Beispiel 3</I> Die Wirkung verschiedener Mengen von Natrium- laurylsulfat als Mitase-Inhibitor in Gesamt-Fermen- tationsbrühen wurde demonstriert durch Testen der Aktivität von verschiedenen Proben von Mitomycin enthaltenden Brühen, die in der folgenden Weise her- gestellt worden waren: Proben IX und X waren Portionen der Gesamtbrühe, welche zum Zeitpunkt ihrer Reife genommen worden waren.
Probe XI war eine Gesamtbrühe identisch mit der Probe X, jedoch 0,1 Gew.% des Brühengewichtes an Natrium-lauryl- Sulfat enthaltend. Die Proben XII und XIII enthielten <B>0,01</B> und 0,001 % Natrium-laurylsulfat mit Bezug auf das Gewicht der Gesamtbrühe, waren jedoch im übrigen identisch mit der Probe X. Die Proben X bis XIII wurden eine Stunde lang bei 37 C in kubiert.
Alle Proben wurden hierauf einem Differen- tial-Test unterworfen, wobei Klebsiella pneumoniae und Bacillus subtilis als Testorganismen verwendet wurden, und bei dem die Gehalte an Mitomycin A und Mitomycin C bestimmt wurden. Die Testergeb nisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
EMI0004.0014
<I>Tabelle <SEP> 111</I>
<tb> Probe <SEP> Beschreibung <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> Mitomycin <SEP> A <SEP> Mitomycin <SEP> B <SEP> A <SEP> -F- <SEP> C
<tb> IX <SEP> Gesamtbrühe <SEP> ohne <SEP> Mycelia, <SEP> abgekühlt <SEP> bevor <SEP> 5 <SEP> 39 <SEP> 44
<tb> getestet <SEP> wurde
<tb> X <SEP> Gesamtbrühe <SEP> als <SEP> Vergleich <SEP> 0,8 <SEP> 5,7 <SEP> 6,5
<tb> XI <SEP> Gesamtbrühe <SEP> mit <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> Natrium-laurylsulfat <SEP> 3 <SEP> 41 <SEP> 44
<tb> XII <SEP> Gesamtbrühe <SEP> mit <SEP> 0,01 <SEP> % <SEP> Natrium-laurylsulfat <SEP> 4 <SEP> 11 <SEP> 15
<tb> XIII <SEP> Gesamtbrühe <SEP> mit <SEP> 0,001 <SEP> % <SEP> Natrium-laurylsulfat <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass,
obschon mit geringeren Konzentrationen an Inhibitor sich noch eine gewisse Stabilisierung erreichen lässt, es wünsch bar ist, ungefähr 0,1 % Natrium-laurylsulfat zuzu setzen, um den Hauptanteil der Aktivität der Fer- mentationsbrühe aufrechtzuerhalten.