CS227791A3 - Mutant of clostridium histolyticum bacterium, process of its obtaining and its application for the production of collagenase without clostripain - Google Patents

Description

z? H$d ΑΛ3Γ30ťAZ31V . .A Ofcd

Mutant baktérie Clostridium histolyticum,způsob pro jel a. -Λ.- vání a jeho použití pro výrobu kolagenasy bez clostripí.

Oblast techniky mu 16 X '6 0 eg o o Předložený vynález se týká nového mutantu baktérie? fllftqtflifr 0dium histolyticum, způsobu jeho získávání pomocí chemického mu-tagenního činidla a použití tohoto mutantu pro zlepšení! způsO*· ..._ bu výroby kolagenosy bez clostripainu (clos’tridiopeptidasy A).

Dosavadní stav techniky

Je velmi dobře známo, že enzym kolagenasa se používá nejenpro vědecké účely, ale našel také své místo při léčení lidí apři veterinární léčbě, zvláště pokud jde o léčení onemocnění ků-že. Ve spojení s některými nespecifickými proteinasami urychlu-je způsob hojení rány odstraňováním odumřelé tkáně a v důsledkutoho zlepšuje epitelizaci. Kolagenasa se také používá v menšíchoperačních sálech (event. ordinacích) v případech transplantacetkáně a pro dezintegraci tkáně. Při léčení lidí se kolagenasa používá při léčbě spálenin(poleptání) různých stupňů,proleženin, kožních vředů, strupůatd.. Epitelizace a vyléčení kůže pomocí kolagenasy je kromětoho více účinné a rychlé, také zabraňuje tvoření keloidů (z-bytnělých jizev nádorovitého vzhledu) a hypertrofickému (zbyt-nělému) růstu jako výsledek utvoření rozpadlého kolagenu za pů-sobení kolagenasy.

Pro syntetizování kolagenasy jsou známy rozmanité druhymikroorganismů, kultivovaných za definovaných podmínek. Během čištění kolagenasy způsobuje velké těžkosti dopro-vodný enzym clostripain, poněvadž jeho chemické a fyzikálnívlastnosti jsou velmi podobné chemickým a fyzikálním vlastnos-tem kolagenasy. Lékařské přípravky neobsahují clostripain.

Maschman E. 0.: Biochem. Z. 297. 284 (1938) byl první, kdopopsal kolagenasu, získanou kultivací baktérií Clostridum per-fringens. Bylo zjištěno, že mezi všemi organismy, které dokážísyntetizovat kolagenasu, je nejlepším jejím producentem Clos-tridium histolyticum. MacLennan J. D., Mandl I. a Howes E. I.: J. Clin. Inv. 32, 1317 (1953) popsali podmínky pro růst Clos- - 2 - tridium histolyticum. Zkoumali sležení kapalného prostředí, kte- ré sestává hlavně z proteosy-peptonu, anorganických solí a roz- toku vitaminu. Baktérie se kultivuje při teplotě od 37 °C a při hodnotě pH 7,2.

Berman s., Lowenthal J. P., Webster Μ. E., Altieri P. L.a Gochenour R. B.: J. Bact. 82, 582 (1961) rovněž zkoumalipodmínky pro růst ClostridiuB histolyticua s cíleB produkovatkolagenasu<> Měli úspěch při kultivování ClostridiuB histoly-ticum v živnéB prostředí, neobsahující® žádné anorganické so-li, ale pouze proteosu-pepton, enzy»aticky hydrolyžované pro-teiny kaseinu a sóji (sójovou živnou půdu) a roztek vita®inu.Takové složení živného prostředí také podmiňuje další hodnotypodmínek, vyžadované pro uspokojivý růst a biosyntézu kolage-nasy, jako je hodnota pH 8,5 a teplota od 30 *C0

Lettl A.: J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Iumunol. 18,(4)47.(1974) byl úspěšný při substituováni proteosy-peptonu jinýmihydrolyžovaný®i proteiny ve složení živného prostředí, použi-tého pro kultivaci ClostridiuB histolyticum.

Clostridiu® histolyticum je anaerobní baktérie a pro jejíkultivaci v kapalném prostředí musí být zabezpečeny anaerobnípodmínky. Takahashi S., a Seifert S.: J. Appl. Bact. 35, 47 (1972)použili při svých výzkumech redukční činidla thioglykolat sod-ný a bisulfit sodný pro získání anaerobních podmínek, nezbyt-nýchpro bakteriální růst. Optimální výsledky, tj. nejvyšší vý-těžek kolagenasy, byl získán při použití uvedených redukčníchčinidel v poměru 1:1.

Chiulli A. J. a Wegman E, H. (patent U.S. 3,705,083) po-psali produkci kolagenasy kultivací mutantu Clostridium histo-lyticum, který prokazuje zlepšené vlastnosti, vztahující se nanižší toxicitu, kterou lze přirovnat k parenterální (mimostřev-ní - ve smyslu infúzní výživy) toxicitě a možnosti inhibovatrůst jiných baktérií.

Baktérie Clostridium histolyticum se regenerují v prostředíenzymu kolagenasy s větším množstvím jiných aktivních extracelu-lárních (mimobuněčných) proteinas (nespecifických proteinas, al-fa-toxin, doprovázející hnědý pigment), zvláště clostripain(clostridipppptidasa B). Bylo tedy nalezeno, že komerčně dis-ponibilní preparáty obsahují stopy clostripainu (Keil B.: Mol. +Takto je uvedeno v originále; může však jít o aflatoxin.

Cell. Biochea. 23., 87 (1979). K obtížím dochází v průběhu čis-ticích procesů a individuální izolaci z fermentačního prostře-dí, což je nutno přičíst velai podobným chemickým a fyzikální*vlastnostem těchto proteinas.

Baktérie Clostridiua histolyticua , kultivované za znáaýchanaerobních podmínek v prostředí, které obsahuje konvenční zdroje uhlíku, dusíku, ainerálních solí a roztoků vitaainů, při teplotě v rozaezí ®d 32 eC do 37 °C a v rozaezí hodnot pH od 7,2do 8,8, za dobu 10 až 24 hodin, vylučují v tomto prostředí en-zym kolagenasu (clostridiopeptasu A), clostripain (clostridio-peptidasu B) a jiné nespecifické proteinasy. Problémy, kterése projevují při produkci takového enzymu,spočívají v přítom-nosti obou enzymů, kolagenasy a clostripainu, ye filtrátu. Bě-hem separace kolagenasy od clostripainu dochází k velkým ztrá-tám kolagenasy, což má za následek snížení výtěžku enzymu a ná-sledně zvýšení ztrát na jednotku produktu.

Podstata vynálezu Překvapivě bylo nalezeno nyní, že použití nového mutantubaktérie Clostridium histolyticua při výrobě kolagenasy řešívšechny problémy, které zde byly výše uvedeny.

Proto je předmětem předloženého vynálezu nový mutant bak-térie Clostridiua histolyticua, označený jaké Clostridium his-tolyticum K-26 clo 88, který je uložen: i) v Institute of Biochemical Engineering, Laboratory of Micro-biology, Zagreb, Pierottijeva 6, 22. května 1990, pod číslem 4043 ii) podle Budapest Treaty v International Recognition of theDeposit of Microorganisme for the Purposes of Patent Proce-duře, podle Rule 6.1, v National Collection of Agricultural and Industrial Micro-organism, Department of Microbiology and Biotechnology,v University of Horticulture and Food Industry, Somloi ut14-16, H-1118 Budapest, Hungary 4.června 1991, pod číslem NCAIM B (P)001145.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob získává- ní uvedeného mutantu Clostridium histolyticum K-26 clo působe-ním na spory Clostridium histolyticua K-26 (uložených v Insti- - 4 - tute of Biochemical Engineering, Laboratory of Microbiology,Zagreb, Pierottijeva 6, dne 22.5.1990, pod čísle* 4042) muta-genní* činidle* N-*ethyl-Nz-nitro-N-nitroquahidine* po dobu45 a 90 minut při teplotě místnosti, načež se spory oddělí cen-trifugací, suspendují ve fyziologické* roztoku, očkují do pev-ného prostředí (živné půdy) a inkubují (kultivují) při teplotě37 eC po dobu tři dny za aerobních podmínek.

Nový mutant Clostridiu* histolyticu* K-26 clo 88 se podletohoto vynálezu liší od rodičovské linie Clostridiu* histoly-ticu* K-26 ve dvou základních charakteristikách. Jak je patrnéz přiložených obrázků 1 a 2, které byly získány pomocí elektro-nové mikrografie, tento mutant ztrácí pohyblivost systému, kte-rá je základní charakteristikou parenterální linie, klasifiko-vané podle Bergeys Manual of Syste*atic Bacteriology (SneathP. H. A., Mair N. S., Scharpe M. Ě., Holt J. G. (Edits): Wil-liams and Wilking, Baltimore, London, Los Angeles, Sidney, Vol. 2, 1170 (1986)).

Eozdílná je vzhlede* k parenterální linii druhá nová cha-rakteristika tohoto nového mutantu, spočívající v jeho neschop-nosti biosyntézy doprovodného enzymu clostripainu. Tato vlast-nost byla objevena pomocí imunologické precipitační reakce (srá-žecí, vločkovací) séra anticlostripainu a antikolagenasy s kul-tivačními filtráty *utantu i po*ocí analýzy, způsob jejíhožprovedení je popsán v následující* textu.

Každá rostoucí kolonie se testuje na biosyntézu enzy*u ato jak pomocí biochemické analýzy, tak pomocí i*uno-precipitač-ního testu. Zda je clostripain přítomen či nikoliv, se určí pod—,le toho, že se objeví precipitační linie *ezi filtráte* Cloatri-dixT·» histolyticu* K-26 kultury a králičím sérem anticlostripainu.

Další* předmětem předloženého vynálezu je způsob pro výro-bu kolagenasy bez clostripainu, vyznačující se tím, že uvedenýmutant Clostridiu* histolyticu* K-26 clo 88 se kultivuje v živ-né* prostředí, obsahujícím proteosu-pepton, enzymaticky hydro-lyzované proteiny kaseinu a sóji (sójovou živnou půdu), roztokvitaminu, například riboflaviňu, nikotinamidu, pyridoxinu, kyse-liny panthothenové, redukční činidlo, například Na-thioglykolata anorganické soli, pokud se to vyžaduje, například NaHPO^,

MgSO^, FeSO^, po dobu 10 až 24 hodin, při teplotě, pohybujícíse v rozmezí od 28 °C do 37 °C a při hodnotě pH od 7,2 do 8,9, - 5 - za anaerobních submerzních podmínek. Během kultivace se enzymkolagenasa regeneruje v kapalné» prostředí. Produkt neobsahujeclostripain. Po kultivaci následuje čištění a isolace. Výtěžekkolagenasy je vyšší přibližně o 10 % až o 20 % v porovnání sobvyklý»! »etoda»i pro výrobu kolagenasy.

Aktivita získané kolagenasy se určuje aplikací metody pod-le Gass»ana V. a Nordwiga A. (Hoppe-Seylers Z. Phys. Che»., 322,267 (1960)) se syntetickým substrátem.

Aktivita clostripainu se určuje za použití modifikovanémetody, popsané v katalogu firmy Worthington, 1987, p.47.

Metoda pro stanovení nespecifické proteolytické aktivitybyla odvozena od definice jednotky aktivity kaseinu podle ka-talogu firay Sigma, 1990, p. 333. Pro inkubaci a precipitacibyly aplikovány společné podmínky, požadované pro stanoveníproteolytické aktivity. Stanovení uvolněných aminoskupin se pro-vádí podle modifikované kolorimetrické ninhydrinové metody pod-le Rosena H.: Arch. Biochem. Biophys., 67, 10 (1957).

Aby aktivita kolagenasy vydržela během možného zařazovánía lyofilizace, zpracovává se kapalný enzymový preparát přidá-váním sacharidů, jako je sacharosa, maltosa nebo podobné sacha- -3 -2 ridy, v koncentračním rozmezí od 5 x 10 M do 2,5 x 10 M. Prostabilizaci aktivity lyofilizovaného preparátu kolagenasy se při-dávají rozpustné proteiny (enzymaticky hydrolyzovaný kasein (Flur-ka), Pepton 1 v práškové formě (Torlak), kyselý hydrolyzovanýkasein (Serva) atd.) při rozmezí koncentrací od 10 do 50 mg/mlkapalného enzymového preparátu.

Tento vynález ilustrují následující příklady. Příklady provedeni vynálezu Příklad 1

Spory Clostridium histolyticum K-26 se zpracovávají s 3 mg/mlN-methyl-Nz-nitro-N-nitrosoguanidinu (MNNG) rozpuštěnými v 10 mltlumivého roztoku (pufru) Tris po dobu 45 a 90 minut. MutagenníMNNG se odstraňuje centrifugací a dekantací supernatanu. Sporyse suspendují ve fyziologickém roztoku, očkují do prostředí aga-ru v odpovídajícím zředění a inkubují za anaerobních podmínekpři teplotě 37 0C po dobu třech dní. - 6 -

Kolonie, rostoucí v pevném prostředí, se očkují do kapalnéhoživného prostředí a po dvou dnech růstu při teplotě 37 *C sekultura pipetuje do jamky, která má v průměru 8 mm. Do jinésousední jamky stejné velikosti, umístěné ve vzdálenosti 2 cm,se pipetuje králičí anticlostripainové sérum. Gelová difúzecloetripainových protilátek a clostripainu vede k jejich spo-jení (vazbě, řetězení) a k utvoření precipitace genetické li-nie. Tímto způsobem je každý mutant několikrát kontrolovánkromě biochemického stanovení. Jestliže mutanty neprodukujíclostripain, není zjištěna přítomnost precipitace genetickélinie. Získané mutanty se pak lyofilizují a ukládají pro dal-ší použití. Příklad 2

Pro očkování lyofilizovaného parenterálního bakteriální-ho kmene K-26 baktérie Clostridiua histolyticum se použije pre-fermentačníh© živného prostředí, obsahující následující složky: proteosa-pepton 50 g/1 sojová živná půda 15 g/1

Na2HP04 9 g/1 vitaminový roztok:

IvlgS04.7H20 FeSO4.7H2Ovitaminový roztok 0,08 g/10,014 g/15 ml/1 kyselina pantothenová 200 mg/1 nikotinamid 200 mg/1 pyridoxin 200 mg/1 thiamin HC1 200 mg/1 riboflavin 20 mg/1

Použité prostředí má přirozenou hodnotu pH. Sterilizacese provádí při teplotě 120 °θ po dobu 30 minut, zatímco vita-minový roztok se sterilizuje při teplotě 115 po dobu 15 mi-nut. Bezprostředně před očkováním prostředí mikroorganismy sepřidá roztok vitaminů. Mikroorganismy se kultivují po dobu 20hodin při teplotě 37 °C způsobem za ustáleného stavu.

Druhý stupeň kultivace baktérií se provádí ve dvoulitro-vém skleněném bioreaktoru (Multigene, New Brunswick, N.Y.) zanásledujících podmínek: 1500 ml média, tvořícího prostředí, -Ι-ο stejné* složení jako má pre-fermentační živné prostředí, ales přidáním 10 % inokula a s hodnotou pH 7,4 a teplotou 30 *C.Fermentace se provádí po doPu 20 hodin, za podmínek příležitost-ného proPuPlávání dusíkem tak, apy Pyly zachovány podmínky proanaeroPní prostředí a za podmínek mírného mícháni při 50 otáč-kách za minutu. Výtěžek enzymu: kolagenasa 1,32 U/ml clostripain 3,0 U/ml nespecifické proteinasy 820 U/ml Příklad 3 V tomto příkladu se používá pro inokulaci parenterálního

Pakteriálního kmene K-26 Clostridiu* histolyticum pro pre-fer-mentaci živné prostředí (jako je uvedeno v Příkladu 2)o Po dva-ceti hodinách kultivace se použije 10 % tohoto inokula pro ino-kulaci na živné prostředí následujícího složení: proteosa-pepton 50 g/1 sójová živná půda 15 g/1 vitaminový roztok 5 ml/1

Na-thioglykolat 0,57 g/1

Sležení vitaminového roztoku je identické se složením ,kte-ré je popsáno v Příkladu 2 s hodnotou pH 7,4. Prostředí se ste-rilizuje při teplotě 120 °C po doPu 30 minut a kultivace se pro-vádí ve dvoulitrovém skleněném Pioreaktoru (Multigene, New Bruns-wick, N.Y.) s popsaným prostředí* o oPjemu 1500 ml, při teplotě37 po doPu 7 hodin. Výtěžek enzymu: kolagenasa 1,32 U/ml clostripain 2,02 U/ml nespecifické proteinasy 790 U/ml Příklad 4

Tento příklad se týká použití lyofilizovaného mutantu

Clostridium histolyticum K-26 kló/^získaného tak, jak je popsá-no v Příkladu 1, pro inokulaci na pre-fermentační prostředí osložení a podmínkách kultivace takových, jako jsou popsány vPříkladu 2. Deset procent inokula se použije pro inokulaci ka- 8 palného média· Fermentace se provádí po dobu 7 hodin. Výtěžek enzymu: kolagenasa 1,2 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické přeteinasy 630 U/ml Příklad 5

Tento příklad se týká použití lyofilizovaného mutantu Clo-stridium histolyticum K-26 klo 88, získanéhe tak, jak je popsá-no v Příkladu 1, který se inokuluje do živného prostředí o slo-žení takovém, jako je popsán© v Příkladu 3. Kultivace výše uve-děné baktérie se provádí při teplotě 28 WC po dobu 8 až 10 hodin· Výtěžek enzymu: kolagenasa 2,72 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické proteinasy 466 U/ml Příklad 6

Lyofilizovaný mutant Clostridium histolyticum K-26 kle 88,získaný tak, jak je popsáno v Příkladu 1, se použije pro tentopříklad jako inokulum pro pre-fermentační prostředí tak, jakje popsán© v Příkladu 2, Kultivovaný mikroorganismus se použi-je jako inokulum pro druhý stupeň fermentace tak, jak je popsá-no v Příkladu 3· Rozdíl je pouze v hodnotě pH, která je 8,7 av teplotě, která je 30 *Ce Kultivace se přeruší po deseti ho-dinách· Výtěžek enzymu: kolagenasa 4,4 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické proteinasy 376 U/ml Příklad 7

Tento příklad ukazuje metodu pro izolaci enzymu ze steril-ního ultrafiltrátu z fermentačního média mutantu Clostridiumhistolyticum K-26 kló 88, který neprodukuje clostripain. Kon-centrovaný filtrát kultury, získaný tak, jak je popsáno v Pří-kladu 4, 5 a 6, byl zpracován s 0,03K- až 0,05M-CaCl2 a aceto- 9 - ne» na koncentrace 18 % až 33 %. Frakční precipitace (srážení)se dosahuje přidání» síranu a»onného nejprve do nasycení 20 %až 30 % a pak do nasycení 70 % až 80 % a konečně dvoustupňový»zpracování» s gele» fosforečnanu vápenatého, zatí»co zpracová-ní s acetone» bylo vynecháno. Získá se aktivní lyofilizovanýpreparát kolagenasa bez clostripainu s dosažený» využití» na75 % až 85 %. Výtěžek enzy»u: kolagenasa 2,2 U/»g clostripain nespecifické proteinasy 0,0 U/mg45 U/mg Příklad 8

Tento příklad ukazuje metodu pro izolaci kolagenasy zesterilního ultrafiltrátu z fermentačního média mutantu Clost-ridium histolyticu» K-26 kle 88, získaného tak, jak je popsá-no v Příkladech 4,5 a 6 a zpracovaného tak, jak je uvedeno vPříkladu 7, ale neuskuteční se zpracování se sírane» amonný*do nasycení 30 %, Získá se bílý aktivní , lyofilizovaný prepa-rát kolagenasa bez clostripainu, s dosaženým využitím v rozme-zí mezi 75 % a 90 Výtěžek, enzymu: kolagenasa 2,5 U/mg clostripain nespecifické proteinasy

Příklad 9

Tento příklad ukazuje metodu pro izolaci kolagenasy zevzorků, získaných tak, jak je popsáno v Příkladech 4, 5 a 6,a čištěných způsobem, popsaným v Příkladech 7 a 8, ale neusku-teční se zpracování s gelem fosforečnanu vápenatého. Získá sebílý, lyofilizovaný preparát kolagenasa bez clostripainu, s do-saženým využitím v rozmezí mezi 75 % a 90 %, Výtěžek enzymu: kolagenasa clostripain nespecifické proteinasy 2,6 U/mg0,0 U/mg44 U/mg 4 10 - Příklad 10

Tento příklad blíže vysvětluje způsob pr® čištění kapal-ného produktu, získaného kultivací a zpracováním tak, jak jepopsáno v Příkladech 3 a 7» Čisticí postup spočívá v aplikacivzorku na kolenu, obsahující Sephadex G-75. Aplikování na kolo-nu a eluování proteinových frakcí se provádí s tlumicím rozto-kem (pufrem) 0,01M-Tris HC1 při hodnotě pH 7,2 a s přídavkem0,01M octanu vápenatého. Metoda gelové filtrace umožňuje iden-tifikaci tří proteinových frakcí. Analýza potvrzuje aktivitukolagenasy v první frakci, sníženou aktivitu kolagenasy ve dru-hé frakci, zatímco ve třetí frakci byl identifikován hnědý pig- ment, vedle aktivity nespecifických preteinas, jak r íásledují: I frakce kolagenasa 34,2 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické proteinasy 0,0 U/ml II frakce kolagenasa 10,5 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické proteinasy 0,0 U/ml III frakce kolagenasa 0,0 U/ml clostripain 0,0 U/ml nespecifické proteinasy 535 U/ml Příklad 11

Tento příklad popisuje odsolovací způsob pro vzorky čiště-ných frakcí kolagenasy. Kapalné ultrafiltrované frakce čistéhoenzymu, získané tak, jak je popsáno v Příkladu 10 , se odeberoua aplikují na kolenu, obsahující Sephadex G-25. Aplikace vzorkua eluování se provádí za použití destilované vody. Získá se jed-na frakce čistého enzymu, který neobsahuje soli. Aktivita čisté-ho enzymu byla 38,2 U/ml. Příklad 12

Tento příklad se týká zachování aktivity kolagenasy v kapal-ném preparátu během zmrazování a lyofilizace. Postupuje se podlenásledující procedury: ke ka^inému preparátu, získanému tak, jak 11 - ÍíítažilevKAiKt'-*'*-*· 4 4 je popsáno v Příkladech 7 až 11, se přidají sacharidy, jak· jenapříklad sacharosa, Maltosa a podobné, v koncentračním rozmezí•d 5 x 10"3M de 2,5 x 10"2m. Přiklad 13

Tento příklad popisuje způsob, který je vhodný pro stabi-lizaci lyofilizovaného preparátu kolagenasy· Tento způsob spo-čívá v přidání ke kapalnému preparátu kolagenasy, získanémutak, jak je popsáno v Příkladech 7 až 11, různě rozpustných pro-teinů, jako je enzymaticky hydrolyzovaný kasein (Fluka), Pepton1 ve formě prášku (Torlak), kyselý hydrolyzovaný kasein (Serva)a jiné, v koncentračním rozmezí od 10 do 50 mg/ml kapalného pre-parátu enzymu· U takto lyofilizovaného preparátu kolagenasy by-la prokázána nezměněná aktivita,,

Průmyslová využitelnost

Enzym kolagenasa, připravený způsobem podle vynálezu je po-užitelný nejen pro vědecké účely, ale také pro léčení lidí a veveterinární léčbě, zvláště pro léčení kožních onemocnění·

Claims (2)

1. 1. Nový mutant baktérie Clostridium histolyticum, označený ja-ko Clostridium histolyticum K-26 clo, který je uležený: i) v Institute of Biochemical Engineering, Laboratory ofMicrobiology, Zagreb, Pierottijeva 6, dne 22» 5. 1990, pod číslem 4043 ii) a podle Budapest Treaty v International Recognition ofthe Deposit of Microorganisme for the Purposes of PatentProceduře, podle Rule 6.1, v National Collection of Agricultural and IndustrialMicroorganisms, Department ©f Microbiology and Biotech-nology, University of Horticulture and Food Industry, Somloi ut 14-16, H-1118 Budapest, Hungary, dne 4. 6» 1991, pod číslem NCAIM B (P) 001145, tento nový mutant Clostridium histolyticum K-26 clo 88 se lišíod rodičovského bakteriálního kmene Clostridium histolyticumK-26 ve dvou základních charakteristikách: i) nedostatkem pohyblivosti soustavy baktérií, což je zák-ladní charakteristika parenterálního bakteriálního kme-ne , a ii) neschopností biosyntézy doprovázejícího enzymu clostri-painu·
2. 2. Způsob pro získávání nového mutantu Clostridium histályticuaK-26 clo 88, podle bodu 1,vyznačující se tím,že spory Clostridium histolyticum K-26 (uložené v Instituteof Biochemical Engineering, Laboratory of Microbiology, Zag-reb, Pierottijeva 6, dne 22. 5. 1990, pod číslem 4042) sezpracovávají s mutagenním činidlem N-methyl-N -nitro-N-nit-rosoguaňidinem po dobu 45 a 90 minut při přibližně teplotěmístnosti, načež se spory separují centrifugací, suspendujíve fyziologickém roztoku, očkují se do pevného prostředí ainkubují při teplotě 37 °C po dobu třech dnů za aerobníchpodmínek. působ pro výrobu kolagenasy bez clostripainu, v y z” -í -< « < ° “ + í m, že nový mutant Clostridin n a - 13 - tolyticuM K-26 clo 88 podle bodu 1, se kultivuje v kapaln點ivném prostředí, obsahujícím proteosu-pepton, enzymatickyhydrolyzované proteiny kaseinu a sóji (sójovou živnou půdu),vitaminový roztok, například riboflavin, redukční činidle,například Na-thioglykolat, a dusík, po dobu 10 až 24 hodin,při teplotě v rozmezí od 28 °C do 37 °C a hodnotě pH od 7,2do 8,9, za anaerobních submerzních podmínek, s kombinací pre-cipitantů (srážecích činidel), například chloridu vápenatéhohydrátováného, acetonu, síranu amonného a gelu fosforečnanuvápenatého, načež se kapalná fáze, obsahující kolagenasu, Čis-tí a z ní se izoluje kolagenasa, která neobsahuje clostripain.