DE1517775B2

DE1517775B2 - Verfahren zur herstellung eines milchkoagulierenden enzyms

Info

Publication number: DE1517775B2
Application number: DE19661517775
Authority: DE
Inventors: Knud Hvidovre Aunstrup (Danemark)
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1965-12-02
Filing date: 1966-11-30
Publication date: 1973-02-08
Also published as: NL6617035A; GB1108287A; CA1137898A; DK110031A; US3988207A; NO120183B; ES333922A1; BR6685010D0; BE690571A; SE347288B; FI42693B; DE1517775A1; NL147782B; SE347288C; CH470477A; AT282511B

Description

3 4

Die Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyms Hefeextrakt 4 g

durch Tauchkultivierung in einem Nährmedium von j/· jjpQ ι „

dem vorerwähnten Mucor Stamm CBS 370.65 wird ^{2 4}

nachfolgend beispielsweise im einzelnen beschrieben: MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g

⁵ Lösliche Stärke 15 g

Agar 20 g

1. Versuch mit Schüttelflaschen Wasser 1000 cm³

Es wurde ein Nährmedium folgender Zusammensetzung angewandt:

Kartoffelstärke 40 g/l

Sojamehl 30 g/l

gemahlene Gerste 100 g/l

CaCO₃ 5 g/l

Sojaöl 0,5 cm³/l

2. Halbindustrieller Versuch

In einem Okulierungstank wurde ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

Kartoffelstärke 2 kg

Sojamehl 1,5 kg

Gerstenmehl 5 kg

bakterielle Amylase

(Novo 5000 SKB) 5 kg

CaCO₃ 500 g

Wasser etwa 40 1

Die Fernbach-Flasche war mit einer lyophilisierten Kultur von Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 okuliert und für die Sporenbildung bei 4O⁰C inkubiert worden.

Nach der Okulierung wurde mit dem Umrühren (240 U/min) und der Belüftung (60 l/min) begonnen. Die Fermentation wurde während 48 Stunden fortgesetzt, bis ein gutes Wachstum im Tank beobachtet wurde.

Der Inhalt des Tanks wurde dann in einen Haupt-Fermentationstank mit einer Füllung folgender Zusammensetzung überführt:

Drei Erlenmeyer Flaschen mit einem Volumen von 500 cm³, die jeweils 100 cm³ des vorerwähnten Mediums enthielten, wurden mit einer Sporensuspension von Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 okuliert und bei 30⁰C während sieben Tagen auf einen Schütteltisch geschüttelt. Das Myzel wurde abfiltriert, und die Enzymaktivität des Filtrates wurde nach der Kunitz-Methode (J. Gen. Physiol. 18, S. 459, 1935) bestimmt.

Flasche I: 15 800 Kunitz-Labeinheiten pro Liter Flasche II: 17 700 Labeinheiten pro Liter

Flasche III: 15 700 Labeinheiten pro Liter

Die Mischung wurde auf etwa 70° C erhitzt und während etwa 30 Minuten auf dieser Temperatur gehalten. Hiernach wurde die Mischung während 90 Minuten bei 12O⁰C unter direkter Einleitung von Dampf gekocht. Nach der Abkühlung betrug das Volumen etwa 50 Liter. Im Anschluß an die Abkühlung auf 34⁰C wurde das Medium mit Sporen aus einer Fernbach-Flasche, die YPPSS-Agar (Thermophilic Fungi Cooney & Emerson, London 1964) folgender Zusammensetzung enthielt, okuliert:

Kartoffelstärke 8 kg

Sojamehl 6 kg

gemahlene Gerste 20 kg

bakterielle Amylase
(Novo 5000 SKB) 25 g

CaCO₃ 2 kg

Das Medium wurde gekocht und sterilisiert in derselben Weise wie das Medium des Okulierungstanks. Das Endvolumen betrug 200 Liter.

Nach der Okulierung wurde mit dem Umrühren (400 U/min) und mit der Belüftung (0,2 m³/min) begonnen. Wenn es erforderlich war, wurde Sojaöl als schaumhemmendes Mittel zugegeben. Während der Fermentation wurde der pH-Wert konstant auf 6,5 gehalten.

Nach 129 Stunden betrug der Gehalt der Kulturflüssrgkeit an milchkoagulierendem Enzym 2580 Kunitz-Lab-Einheiten pro Liter.

3. Zusätzlicher Versuch in der Schüttelflasche

Es wurden Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 cm³ verwendet, die jeweils 100 cm³ eines Mediums (s. die nachfolgende Tabelle) enthielten. Die Kolben wurden bei 3O⁰C auf einem sich drehenden Schütteltisch (240 U/min) während der in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Zeitdauer inkubiert.

Das Okulierungsmaterial bestand aus einer Sporensuspension, die durch Kultivierung von Mucor miehei Cooney und Emerson CBS 370.65 auf YPPSS-Agar bei 40⁰C während 2 bis 3 Tagen und Auswaschen der Sporen mit sterilem Wasser erhalten wurde. Das YPPSS-Agar hatte die oben angegebene Zusammensetzung.

Die Aktivität des milchkoagulierenden Enzyms wurde nach Kunitz bestimmt und in KRE (Kunitz-Rennin-Einheiten) angegeben.

Die Zusammensetzung des Mediums ist in der Tabelle in Gramm pro Liter angegeben. Bei sämtlichen zur Anwendung gelangenden Medien wurde die Stärke vor der Sterilisierung mit bakterieller Amylase abgebaut.

Tabelle

Medium Nr.

95 I 97 I 05 I 25 | 26 | 55 | 62 Zusammensetzung des Mediums in g/l

63

Kartoffelmehl

Sojamehl

gemahlene Gerste

gemahlener Mais

gemahlene Maiskeimlinge ...

gelbes Erbsenmehl

Reismehl

getrocknete lösliche Schlempebestandteile

Na₂SO₄

CaCO₃

KH₂PO₄

40

30

100

40 30

30
100

40

30

100

1
5
3

40 30 50 50

100

40

20

100

10

1 5 3

40

20

100

10

Enzymaktivität KRE/cm³
nach Inkubation

pH nach Inkubation

6 Tage

7 Tage

8 Tage

6 Tage

7 Tage

8 Tage

13,5
15,4
17,2

6,1
6,9
7,0

11,5
11,9
13,8

7,0
6,8
7,5

13,6
19,2
21,2

6,1
6,5
6,9

13,6
17,8
18,2

6,0
6,7
6,8

12,0
13,2
14,6

6,2
6,8
6,9

2,6 13,3 12,9

6,1 6,0 6,7

7,1 14,8 16,7

6,2 6,4 6,2

Es können Ausbeuten an milchkoagulierendem Enzym in derselben Größenordnung wie bei den obigen Versuchen mit Schüttelflaschen erhalten werden, wenn man in einem größeren Maßstab mit (halbindustriellen) Versuchsanlagen arbeitet.

4. Zur weiteren Veranschaulichung sei darauf hingewiesen, daß milchkoagulierendes Enzym, das in einer entsprechenden Weise unter Verwendung von Mucor pusillus (vom Centraalbureau voor Schimmelculturen, Baarn, Holland) hergestellt worden war, in einer Menge von etwa 300 Kunitz-Labeinheiten pro Liter (vgl. Tabelle Medium 95; Schüttelflasche) erhalten wurde, während unter Verwendung von Mucor miehei CBS 370.65 hergestelltes milchkoagulierendes Enzym etwa 10 000 Kunitz-Labeinheiten pro Liter oder noch beträchtlich mehr auswies.

Bei Verwendung eines Mediums aus 10 °/o entrahmter Milch, l°/₀ Glukose, 0,1 % Hefeextrakt und 0,005 M CaCl₂ wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Mucor pusillus:

900 Kunitz-Labeinheiten pro Liter

Mucor miehei CBS 370.65:

5500 Kunitz-Labeinheiten pro Liter

5. Versuch mit einer Oberflächenkultur

In Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 cm³ wurden 25 g einer Mischung von Weizenkleie und Wasser (1:1) sterilisiert. Zu diesem Zwecke wurden die Kolben während 45 Minuten bei 12O⁰C erhitzt. Nach Abkühlen auf 4O⁰C wurden sie mit Sporen des Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 in der oben beschriebenen Weise okuliert. Die Kolben wurden während 3 Tagen bei 40⁰C inkubiert. Die Kleie wurde dann mit 200 cm³ Wasser extrahiert. Die milchkoagulierende Aktivität des Extraktes wurde auf 4500 KRE/1 bestimmt.

Wenngleich die Erfindung vorstehend unter Bezugnähme auf den Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 erläutert wurde, so können für das erfindungsgemäße Verfahren auch andere Stämme dieser Pilzgattung mit gutem Erfolg eingesetzt werden, z. B. die Stämme CBS 182.67, -420.70, -521.70; ATCC 16.457; IMI 89 882, -125 823; NRRL 3169, -A 7772, -13 131, -13 042 und -3420. Beispiele mit diesen Stämmen, die ursprünglich nicht offenbart wurden, hat die ... nachgereicht.

Um die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik zu verdeutlichen, wurden die nachfolgend beschriebenen Vergleichsversuche durchgeführt:

1. Vergleich gegenüber der französischen Patentschrift 1 320 231

Es wurde ein Stamm von Mucor pusillus im Oberflächenkulturverfahren auf einem Substrat aus 10 Tei-. len Weizenkleie und 7 Teilen Wasser gezüchtet. Hiernach wurde bei 30° C während 3 Tage inkubiert.

Die Enzymaktivität wurde mit Hilfe der Soxhlet-Methode in einem wäßrigen Extrakt (1001 Wasser pro 10 Gewichtsteile Kleie) bestimmt. Die Versuchsdurchführung entsprach genau dem Beispiel 1 dieser französischen Patentschrift. Mit dem Mucor pusillus ATCC 16 458 wurden 300 Soxhlet-Einheiten und mit dem Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 wurden 415 Soxhlet-Einheiten erhalten.

Für die Züchtung von Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson CBS 370.65 und Mucor pusillus ATCC 16 458 nach dem Tauchkulturverfahren wurde ein Substrat folgender Zusammensetzung (in g/l) verwendet:

Glucose 100

Sojaschrot 50

CaCO₃ 5

KH₂PO₄ 3

1 OlV VYO

100 ml von diesem Substrat wurden in einem 500 ml Erlenmeyerkolben sterilisiert, mit einer wäßrigen Suspension der Pilzspuren geimpft und während 6 Tage auf einem Schütteltisch mit 220 U/min bei 3O⁰C inkubiert. Die Flüssigkeit wurde filtriert und die Enzymaktivität nach der Soxhlet-Methode bestimmt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse (in Soxhlet-Einheiten) erhalten:

Mucor pusillus ATCC 16 458 175

Mucor miehei

C ο ο η e y und Emerson
CBS 370.65 2280

2. Vergleich gegenüber der französischen
Patentschrift 1 401 474

Mit dem Stamm Endothia parasitica CBS angera II wurde das in der französischen Patentschrift 1401 474 beschriebene Verfahren durchgeführt, wobei allerdings für die Gärung ein 101 Fermentor eingesetzt wurde.

Die Enzymaktivität wurde in der Flüssigkeit nach der Filtration durch die Soxhlet-Methode gemessen. Dabei wurde eine Aktivität von nur etwa 50 Einheiten festgestellt. Diese Ausbeute ist wesentlich schlechter als die mit Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson erhaltene Ausbeute von 2280 Einheiten (vgl. Vergleichsversuch 1).

209586/425

Claims

1 2

bekannten Verfahren größeren Ausbeuten und mit

Patentanspruch: geringerer tertiärproteolytischer Wirkung mit verhält

nismäßig geringen Kosten dadurch herzustellen, daß

Verfahren zur Herstellung von milchkoagulie- man das Enzym durch Züchten eines Stammes von rendem Enzym durch Züchten eines Mucor- 5 Mucor miehei C ο ο η e y und Emerson gewinnt. Stammes in hierfür üblichen Nährmedien und bei Die Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herhierfür üblichen Kulturbedingungen, dadurch stellung von milchkoagulierendem Enzym durch Züchgekennzeichnet, daß man als Mikroorga- ten eines Mucor-Stammes in hierfür üblichen Nährnismus einen Stamm von Mucor miehei Cooney medien "und bei hierfür üblichen Kulturbedingungen, und Emerson einsetzt. io das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro-

■ ■· - - Organismus einen Stamm von Mucor miehei Cooney

und Emerson einsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit einer

Tauchkultur durchgeführt werden, es ist aber auch is durchaus möglich, sich einer Oberflächenkultur zu Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur bedienen.

Herstellung eines milchkoagulierenden Enzyms durch Bei einer vorzugsweisen Ausführungsform der Er-

Züchten eines Mucor-Stammes in hierfür üblichen findüng- wird der Mucor miehei Cooney und Nährmedien und bei hierfür üblichen Kulturbedin- Emerson CBS 370.65 einer Tauchkultur in einem gungen. 20 geeigneten Nährmedium unterworfen.

Bei der Herstellung von Käse ist es erforderlich, die Es liegt aber auch im Rahmen der Erfindung, den

Milch zu koagulieren, um das Kasein von der Molke zuletzt erwähnten Stamm CBS 370.65 vermittels einer abzutrennen. Es ist üblich, hierbei ein Enzym zu ver- Oberflächenkultur in einem geeigneten Nährmedium wenden, das aus Kälbermägen isoliert wurde. Um - zu züchten.

eine zufriedenstellende Käseausbeute zu erzielen und 25 Der vorerwähnte neue Mucor-Stamm wurde aus im Hinblick auf den nachfolgenden Reifeprozeß des einer in Kopenhagen im September 1965 entnommenen Käses ist es sehr wichtig, daß die proteolytische Akti- Probe isoliert und im Centraalbureau voor Schimmelvität des Labenzyms niedrig ist, so daß so wenig culturen, Baarn, Holland, als der Gruppe Mucor Kasein wie möglich während der Herstellung und des miehei Cooney und Emerson zugehörig iden-Reifeprozesses des Käses aufgelöst wird. 30 tifiziert. Der neue Stamm wurde bei dem genannten

Von Kälbermägen gewonnenes Lab reicht für den Institut unter der oben angegebenen CBS Nummer vorerwähnten Zweck aus. Es ist jedoch damit zu hinterlegt.

rechnen, daß in Zukunft der Bedarf an Lab nicht Im folgenden wird eine morphologische Beschrei-

durch Enzyme aus Kälbermägen gedeckt werden kann. bung des obigen neuen Mucor CBS 370.65 gegeben. Deshalb sind schon verschiedene Versuche unter- 35
nommen worden, um andere milchkoagulierende Turf:

Enzyme aufzufinden, die eine niedrige proteolytische kurz, 2 bis 3 mm hoch, zuerst weiß, später

Aktivität besitzen. mausgrau bis dunkelmausgrau;

Eine große Reihe von Microorganismen erzeugen

Proteinasen mit milchkoagulierender Wirkung, von 40 Sporangiophören:

denen die meisten aber ebenso eine beträchtliche pro- 6 bis 10 μ. Durchmesser, Verzweigung gesproßt;

teolytische Wirkung zeigen, so daß die bei der Herstellung von Käse erzielte Ausbeute zu niedrig ist, Sporangien:

wobei noch während des Reifeprozesses des Käses kugelförmig, 25 bis 60 μ Durchmesser, Wan-

bitter schmeckende Zerfallsprodukte des Kaseins 45 düngen mit kurzen Stacheln besetzt;
(Peptide) entstehen. Dies gilt beispielsweise für die
Proteinase von Bacillus subtilis und Aspergillus saitoi. Kolumnen:

Enzyme von Mucor pusillus besitzen zwar ein fast kugelförmig bis oval, 20 bis 40 μ Durch-

günstigeres Verhältnis zwischen milchkoagulierender messer;

und proteolytischer Wirkung; sie besitzen jedoch 5° " ^;'"' :-

immerhin noch eine so starke tertiärproteolytische Sporangiosporen:

Wirkung (v. »Comparative Examinations of Animal farblos, fast kugelförmig bis elliptisch, 3 bis

and Microbial Rennets«, S. 33), daß die bei indu- 5 · 4 bis 6 μ;

strieller Anwendung dieser Enzyme erhaltenen Ergebnisse nicht befriedigen. Ein weiterer mit der Ver- 55 Zygosporen: --■■·· --.
Wendung dieses Stammes verbundener Nachteil ist zahlreich, fast kugelförmig, warzig, gelblich darin zu sehen, daß die bei einem Tauchkulturver- bis rötlich, braun wenn jung, schwärzlich bei fahren erzielten Ausbeuten verhältnismäßig niedrig größerer Reife, 30 bis 45 μ im Durchmesser, auf sind. Bei dem Oberflächenkulturverfahren liegen die einem homothallischen Myzel erzeugt;
Ausbeuten zwar höher, jedoch besitzt ein solches 60
Verfahren wesentliche praktische Nachteile. Es läßt Azygosporen:
sich nur schwer handhaben und ist auch verhältnis- vorhanden;

mäßig arbeitsaufwendig. Ein mit dem Oberflächen- . .

kulturverfahren verbundenes Risiko besteht darin, Knospen:
daß durch Einatmung von Pilzspuren die Gesundheit 65 unbekannt;
der Arbeitspersonen gefährdet wird.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, ein Wachstum:
milchkoagulierendes Enzym in im Vergleich zu den bei 30 bis 55⁰C, sehr schnell bei 40⁰C.