CN106801063A - 一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法、工程大肠杆菌及应用 - Google Patents
一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法、工程大肠杆菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法、工程大肠杆菌及应用，步骤为1）以质粒PACYCDuet‑1为出发质粒，将丙酰辅酶A转移酶PCT基因和PHA合成酶基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21；2）通过PCR的方法对合成乳酸酯的乳酸脱氢酶LDH基因引入突变位点；以质粒pTrcHis2B为出发质粒，将遗传修饰后的LDH基因引入质粒并转导到大肠杆菌BL21中，得到pTrcHis2B‑LDH；3）以质粒pTrcHis2B‑LDH为出发质粒，通过同源重组的方法将突变后的sulA基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21中，通过过表达突变后的sulA基因，抑制细胞分裂，增大细胞内体积，得到工程大肠杆菌。
Description
技术领域
本发明属于工程菌改造技术领域以及利用工程菌合成聚乳酸的技术领域，具体涉及一种利用细胞修饰后形态改变的工程大肠杆菌的构建方法、工程大肠杆菌及应用。
背景技术
聚乳酸(polylactic acid)是乳酸分子脱水缩合的产物。相比传统的石油基热塑材料，聚乳酸制品具有可降解性，生物相容性，低毒性等突出的优点；相比其他的生物可降解聚合物，聚乳酸熔点高，结晶度大，热稳定性好，有良好的抗溶剂性，能用多种方式进行加工。因此，聚乳酸广泛应用于医药材料、食品工程、纺织工业等领域。
作为可以代替石油基热塑材料的可再生材料，聚乳酸具备越来越重要的商业价值。目前成熟的聚乳酸工业制备均采用发酵-化学聚合二步法：先通过微生物以可再生生物质为原料发酵和分离乳酸，然后通过化学方法将乳酸聚合为均聚物或共聚物。其流程为含淀粉生物质→糖化→乳酸发酵→乳酸单体的分离提纯→化学聚合。乳酸单体的制备方法有发酵法、化学合成以及酶化法，其中发酵法因其工艺简单，原料充足，食用安全而成为比较成熟的乳酸生产方法在世界范围内广泛采用。聚乳酸通常由经典的丙交酯开环聚合工艺制得，该工艺已经成熟的应用于工业化生产(Vink et al.,2004 MacromolecularBioscience,4:551-564)。丙交酯开环聚合工艺虽然易于控制，但是也存在着很多缺陷：丙交酯的提纯需要多次重结晶、流程长溶剂消耗多，最终产品的收率较低以及污染环境等。为了克服上述缺点，研究人员开发出很多替代的聚乳酸化学聚合方法，包括直接熔融缩聚法和不需要溶剂的固相缩聚法(Moon et al,2001 High Performance Polymers,13(2):S189-S196；Maharana et al.,2009 Progress in Polymer Science,34:99-124)，但这些方法多需要特殊的催化剂和极端的工艺条件，提高了生产成本并限制了它们的进一步应用。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，繁殖周期短，最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。对于它的培养和代谢可以很好地人为控制，因此常用作发酵菌。
大肠杆菌的这些生理特点说明它在生物发酵领域有较强的应用前景，已有研究通过对大肠杆菌的遗传修饰来发酵生产聚羟基脂肪酸酯，如将大肠杆菌XL1-Blue经过遗传修饰【敲除原有的乙酸激酶(ackA)基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和乙醇脱氢酶(adhE)基因，用trc启动子取代D-乳酸脱氢酶(ldhA)基因的启动子acs】能够以葡萄糖为唯一碳源，合成的聚乳酸可达细胞干重的11％(Jung YK et al.,2009 BiotechnologyBioengineering,105:161-170)。将大肠杆菌XL1-Blue经过遗传修饰【敲除原有的延胡索酸还原酶(frdB)基因，引入外源的丙酰辅酶A转移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因】能够以葡萄糖和木糖为碳源合成高浓度的目标产物聚乳酸聚羟乙酸共聚物(PLGA)，发酵产量可达细胞干重的40％(Choi SY et al.,2016 Nature Biotechnology,34(4):435-442)。因此，目前对于提高发酵生产聚乳酸产量的方法都是在对工程菌的代谢途径及关键酶的改造方面，并没有涉及对细胞形态的改造。
发明内容
本发明涉及一种利用形态改变的工程菌合成聚乳酸的方法，在所述遗传修饰的工程大肠杆菌中通过过表达抑制细胞分裂的基因使细胞内体积变大，从而增加聚乳酸的产量。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法，步骤为
1)以质粒PACYCDuet-1为出发质粒，将用于合成聚乳酸的外源性丙酰辅酶A转移酶PCT基因和PHA合成酶基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21；
2)通过PCR的方法对合成乳酸酯的乳酸脱氢酶LDH基因引入突变位点，提高酶的活性；以质粒pTrcHis2B为出发质粒，将遗传修饰后的LDH基因引入质粒并转导到大肠杆菌BL21中，得到pTrcHis2B-LDH，使其表达的乳酸酯高于未遗传修饰的对照宿主菌；
3)对SOS细胞分裂抑制sulA基因进行突变，以质粒pTrcHis2B-LDH为出发质粒，通过同源重组的方法将突变后的sulA基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21中，通过过表达突变后的sulA基因，抑制细胞分裂，增大细胞内体积，得到工程大肠杆菌。由于微生物包涵体的积累总是受到微生物细胞大小的限制，本发明所述的工程大肠杆菌经过遗传修饰抑制细胞分裂FtsZ环的装配，改变细胞形态，使棒状大肠杆菌变成纤维状，增大了细胞体积，因此增加了细胞包涵体的产量。
进一步，步骤1)中对转移酶PCT基因进行优化，得到PCTcp，序列为SEQ ID NO:1。
进一步，步骤1)中对PHA合成酶基因进行优化，得到PHApse，序列为SEQ ID NO:2。
进一步，步骤2)遗传修饰后的LDH基因的序列为SEQ ID NO:3。
进一步，步骤3)突变后的sulA基因的序列为SEQ ID NO:4。
本发明还保护经上述构建方法得到的工程大肠杆菌。
本发明的工程大肠杆菌应用于合成乳酸、聚乳酸或3羟基丙酸共聚物；具体是以葡萄糖为底物合成聚乳酸，转化时温度为35-37℃，是在温和的条件下进行。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明构建了遗传修饰的大肠杆菌，使之适用于将葡萄糖底物发酵转化为聚乳酸，并增加了聚乳酸的产量。采用的技术手段是，在工程大肠杆菌中过表达乳酸脱氢酶(LDH)基因，大大增加了乳酸酯的形成。同时引入外源性丙酰辅酶A转移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因，丙酰辅酶A转移酶基因能显著增加聚乳酸前体乳酰辅酶A的产量，PHA合成酶基因能促进乳酰辅酶A的聚合。然后通过过表达sulA基因进行遗传修饰，抑制细胞分裂，使得大肠杆菌细胞形态由棒状变成纤维状，增大了细胞内体积，使得聚乳酸的产量高于现有的传统棒状大肠杆菌的发酵产量。同时，相互缠绕的纤维状细胞比单一的棒状细胞重，更容易从发酵液中沉淀出来，降低下游分离成本，使整体的生产成本得到降低，经济性得到提高。
附图说明
图1.实施例3中核磁共振氢谱图；
图2.实施例3中核磁共振碳谱图；
图3.实施例3中红外谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
步骤1)含外源性丙酰辅酶A转移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因的表达载体的构建。
根据已公布的丙酸杆菌(Clostridum propionicum)丙酰辅酶A转移酶(PCT)基因(Choi SY et al.,2016 Nature Biotechnology,34(4):435-442)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MBEL 6-19的PHA合成酶基因(Yang TH et al.,2011 Appl MicrobiolBiotechnol,90:603-614)的全长序列信息，对两个序列进行优化使之适用于在大肠杆菌中进行表达，优化后得到PCTcp(序列为SEQ ID NO:1)和PHApse(序列为SEQ ID NO:2)。
根据PHApse进行化学合成，合成时分别在序列的两端加上NdeI和XhoI酶切位点的序列。分别用NdeI和XhoI酶切通用表达质粒PACYCDuet-1和合成的线性DNA片段并连接为新表达载体PACYC-PHApse。根据PCTcp进行化学合成，并用同源重组的方法无缝克隆到表达质粒PACYC-PHApse中，构建表达载体PACYC-PHApse-PCTcp。
步骤2)乳酸脱氢酶(LDH)基因和SOS细胞分裂抑制(sulA)基因的过表达。
设计引物(见表1)从大肠杆菌BL21(DE3)中克隆出乳酸脱氢酶(LDH)基因和SOS细胞分裂抑制(sulA)基因。分别在基因的上游和下游设计15bp的同源臂，用同源重组的方法克隆到通用表达质粒pTrcHis2B中构建表达载体pTrcHis2B-LDH-sulA。其中LDH优化基因的序列为SEQ ID NO:3。
本实施例还对sulA基因的几个位点进行了突变，具体是L23E,I80E,F106A,C69G,A360G,T495C，突变后的sulA基因的序列为SEQ ID NO:4，使其更适应大肠杆菌，能在大肠杆菌中稳定表达，而且有利于增加底物特异性，提高表达量，加强对FtsZ环的抑制作用，使细胞增大，增加聚乳酸产量。
表1 扩增目的基因的引物序列
步骤3)工程大肠杆菌的构建。
将表达载体PACYC-PHApse-PCTcp和pTrcHis2B-LDH-sulA通过传统的热激转化法转入大肠杆菌BL21中，构建生产聚乳酸的工程大肠杆菌。
实施例2
利用实施例1中构建的工程大肠杆菌以葡萄糖为碳源发酵生产聚乳酸。使用该菌株发酵生产聚乳酸的条件为：在1L发酵体系中(上海百仑，1L生物反应器)使用400mL装液量，接种量5％，发酵温度37℃，pH值控制在6.95，培养基组分见表2，初始葡萄糖添加量为20g/L，搅拌速度为300至600rap/min，溶氧控制在体积浓度为10％-30％，发酵72h后，离心培养液收集菌体。菌体沉淀用乙醇洗一次，蒸馏水洗两次，然后再烘干。烘干后的菌体用索氏提取法提取聚乳酸。
表2 实验用培养基组成
以不同遗传修饰的工程大肠杆菌(见表3)发酵聚乳酸的产量见表4。产物用核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和红外分析，1H NMR和13C NMR分别在500MHz和125MHz由Bruker AM-500MHz光谱仪检测，条件及结果见图1-3。
表3 外源基因的遗传修饰
| 外源基因 | 氨基酸取代 |
| PCTcp | V193A |
| PHApse | E130D,S325T,S477G,Q481K |
表4 不同遗传修饰下的聚乳酸产量
从以上结果可以看出，丙酰辅酶A转移酶和PHA合成酶存在的情况下可以合成可提取量的聚乳酸。仅过表达乳酸脱氢酶基因没有聚合物产生，而与丙酰辅酶A转移酶和PHA合成酶共同存在的情况下聚乳酸产量大大增加，说明前体乳酸酯的量是决定聚乳酸产量的关键因素之一。过表达sulA基因后，聚乳酸产量明显增加，说明所构建的纤维状大肠杆菌增大了细胞内空间，从而能增加聚乳酸的产量。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法、工程大肠杆菌及应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1572
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGCGCAAAGTGCCGATTATTACCGCGGATGAAGCGGCGAAACTGATTAAAGATGGCGAT 60
ACCGTGACCACCTCAGGCTTTGTGGGCAATGCGATTCCGGAAGCGCTGGATCGCGCGGTG 120
GAAAAACGCTTTCTGGAAACCGGCGAACCGAAAAATATTACCTATGTTTATTGTGGTAGC 180
CAGGGTAATCGTGATGGTCGTGGTGCAGAACATTTTGCCCATGAAGGTCTGCTGAAACGT 240
TATATTGCCGGTCATTGGGCCACCGTTCCGGCCCTGGGTAAAATGGCAATGGAAAATAAA 300
ATGGAAGCATATAATGTTAGCCAGGGTGCACTGTGTCATCTGTTTCGTGATATTGCAAGC 360
CATAAACCGGGTGTTTTTACCAAAGTTGGTATTGGTACCTTTATTGATCCGCGTAATGGT 420
GGCGGCAAAGTGAATGATATTACCAAAGAAGATATTGTGGAACTGGTGGAAATTAAAGGT 480
CAGGAATATCTGTTTTATCCGGCCTTTCCGATTCATGTGGCGCTGATTCGCGGCACCTAT 540
GCGGATGAATCAGGCAATATTACCTTTGAAAAAGAAGCCGCCCCGCTGGAAGGTACCAGT 600
GTTTGTCAGGCTGTGAAAAATTCTGGCGGCATTGTGGTGGTTCAGGTTGAACGTGTTGTT 660
AAAGCAGGTACCCTGGATCCGCGCCATGTGAAAGTGCCGGGCATTTATGTGGATTATGTG 720
GTGGTGGCTGATCCGGAAGATCATCAGCAGTCACTGGATTGCGAATATGATCCGGCGCTG 780
AGCGGTGAACATCGTCGTCCGGAAGTTGTTGGTGAACCGCTGCCGCTGAGTGCCAAAAAA 840
GTGATTGGCCGCCGCGGCGCGATTGAACTGGAAAAAGATGTGGCGGTGAATCTGGGCGTG 900
GGCGCCCCGGAATATGTTGCCTCAGTGGCGGATGAAGAAGGCATTGTTGATTTTATGACC 960
CTGACCGCTGAATCTGGCGCTATTGGTGGTGTTCCGGCAGGCGGCGTGCGCTTTGGCGCC 1020
AGTTATAATGCCGATGCCCTGATTGATCAGGGTTATCAGTTTGATTATTATGATGGTGGT 1080
GGTCTGGATCTGTGTTATCTGGGCCTGGCTGAATGCGATGAAAAAGGCAATATTAATGTG 1140
TCACGCTTTGGCCCGCGTATTGCCGGTTGCGGCGGCTTTATTAATATTACCCAGAATACC 1200
CCGAAAGTGTTTTTTTGCGGCACCTTTACCGCTGGCGGCCTGAAAGTGAAAATTGAAGAT 1260
GGTAAAGTTATTATTGTGCAGGAAGGTAAACAGAAAAAATTTCTGAAAGCGGTGGAACAG 1320
ATTACCTTTAATGGCGATGTGGCCCTGGCCAATAAACAGCAGGTGACCTATATTACCGAA 1380
CGTTGCGTGTTTCTGCTGAAAGAAGATGGTCTGCATCTGTCAGAAATTGCCCCGGGCATT 1440
GATCTGCAGACCCAGATTCTGGATGTTATGGATTTTGCTCCGATTATTGATCGCGATGCG 1500
AATGGCCAGATTAAACTGATGGATGCAGCACTGTTTGCAGAAGGTCTGATGGGCCTGAAA 1560
GAAATGAAATCA 1572
<210> 2
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGTCAAATAAAAGCAATGATGAACTGAAATATCAGGCGTCAGAAAATACCCTGGGCCTG 60
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CAGGCGATTAAACAGCCGGTGCATTCAGTGAAACATGTGGCGCATTTTGGCCTGGAACTG 180
AAAAATGTGCTGCTGGGCAAATCAGGCCTGCAGCCGACCTCAGATGATCGCCGCTTTGCG 240
GATCCGGCGTGGTCACAGAATCCGCTGTATAAACGCTATCTGCAGACCTATCTGGCGTGG 300
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CATCTGGCTAAAGATCTGGTGCATAATGGCGGTATGCCGAGCCAGGTTAATATGGGTGCA 540
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GTGCCGCCGCAGATTAATAAATTTTATGTGTTTGATCTGTCACCGGATAAAAGCCTGGCT 720
CGCTTTTGCCTGCGCAATAATGTGCAGACCTTTATTGTGTCTTGGCGCAATCCGACCAAA 780
GAACAGCGTGAATGGGGTCTGAGCACCTATATTGAAGCACTGAAAGAAGCCGTGGATGTG 840
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ACCCTGCTGGTGACCGTTCTGGATACCACCCTGGATAGCGATGTTGCACTGTTTGTTAAT 1020
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<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> DNA
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<400> 4
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GCGCGTGTGAGCACCGAAAACACCACCGCGGGCCTGATTAGCGAAGTGGTTTACCGTGAG 120
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AGCGGTCTGCCGCTGACCAAAGTTATGCAGATCAGCCAACTGAGCCCGTGCCACACCGTG 300
GAGAGCATGGTTCGTGCGCTGCGTACCGGTAACTACAGCGTGGTTATTGGCTGGCTGGCG 360
GACGATCTGACCGAGGAAGAGCACGCGGAACTGGTGGATGCGGCGAACGAGGGTAACGCG 420
ATGGGCTTTATCATGCGTCCGGTTAGCGCGAGCAGCCACGCGACCCGTCAGCTGAGCGGT 480
CTGAAAATTCACAGCAACCTGTATCACTAA
510
Claims (8)
1.一种形态改变的工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤为
1）以质粒PACYCDuet-1为出发质粒，将用于合成聚乳酸的外源性丙酰辅酶A转移酶PCT基因和PHA合成酶基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21；
2）通过PCR的方法对合成乳酸酯的乳酸脱氢酶LDH基因引入突变位点，提高酶的活性；以质粒pTrcHis2B为出发质粒，将遗传修饰后的LDH基因引入质粒并转导到大肠杆菌BL21中，得到pTrcHis2B-LDH；
3）对SOS细胞分裂抑制sulA基因进行突变，以质粒pTrcHis2B-LDH为出发质粒，通过同源重组的方法将突变后的sulA基因引入质粒并导入大肠杆菌BL21中，通过过表达突变后的sulA基因，抑制细胞分裂，增大细胞内体积，得到工程大肠杆菌。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中对转移酶PCT基因进行优化，得到PCTcp，序列为SEQ ID NO:1。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中对PHA合成酶基因进行优化，得到PHApse，序列为SEQ ID NO:2。
4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2）遗传修饰后的LDH基因的序列为SEQ ID NO:3。
5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3）突变后的sulA基因的序列为SEQ ID NO:4。
6.根据权利要求1-5任一项构建方法得到的工程大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的工程大肠杆菌应用于合成乳酸、聚乳酸或3羟基丙酸共聚物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，工程大肠杆菌以葡萄糖为底物合成聚乳酸。
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