CN113621637A - 一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。本发明助溶表达质粒的构建方法，包括如下步骤：(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。将本发明的pGroE质粒与dnmS和/或dnmQ基因编码的糖基化转移酶共表达，较pGro7质粒能显著提高其可溶性，该助溶表达质粒的开发，为解决基因表达时的包涵体问题提供了良好的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。
背景技术
DNA重组技术使得体外表达目的蛋白成为可能。大肠杆菌以其易于遗传操作、繁殖速度快、表达重组蛋白产量高、培养成本低等特点，优于其他蛋白质异源表达宿主，成为分子生物学研究的有力工具。然而，大肠杆菌无法实现蛋白质转录后的修饰，胞质内还原性环境不利于二硫键的形成和稳定，造成部分重组蛋白无法正确折叠，进而，容易形成无生物活性不可溶的包涵体。
解决包涵体问题的方法有降低表达温度，更换弱启动子或RBS序列，采用分子伴侣协助表达以及提高二硫键折叠效率。现有技术的这些方法在提高外源蛋白表达方面仍然有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效提高外源蛋白表达量的大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种大肠杆菌助溶表达质粒的构建方法，包括如下步骤：
(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；
(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。
作为优选，伴侣基因groEL1的序列如SEQ ID NO.1所示；
伴侣基因groES1的序列如SEQ ID NO.2所示；
伴侣基因groEL2的序列如SEQ ID NO.3所示。
作为优选，扩增时的反应体系为：链霉菌DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×PhantaMax MasterMix 25μL，ddH2O 22μL；
扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃～60℃30s，72℃2min～3min，共35个循环；72℃，10min。
作为优选，扩增伴侣基因groEL1的引物如SEQ ID NO.4～5所示；
扩增伴侣基因groES1的引物如SEQ ID NO.6～7所示；
扩增伴侣基因groEL2的引物如SEQ ID NO.8～9所示。
作为优选，克隆时的反应体系为：删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro71μL，伴侣基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH2O 1μL；
克隆时的反应条件为：48～52℃反应4～6min。
本发明还提供了所述的方法制备得到的助溶表达质粒pGroE。
本发明还提供了所述的质粒pGroE在促进糖基转移酶可溶表达中的应用。
作为优选，pGroE在促进糖基转移酶可溶表达时的诱导剂为：质量浓度为0.4～0.6g/ml的L-阿拉伯糖和/或摩尔浓度为0.05～0.15M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
作为优选，糖基转移酶由dnmS和/或dnmQ基因编码。
dnmS基因的序列如SEQ ID NO.10所示；
dnmQ基因的序列如SEQ ID NO.11所示。
作为优选，pGroE在促进dnmS和/或dnmQ基因编码的糖基转移酶可溶表达的方法为：pGroE与表达dnmS和/或dnmQ基因的质粒载体共表达；
表达dnmS基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmS、pET28a-dnmS、pET30a-dnmS或pET32a-dnmS；
表达dnmQ基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmQ、pET28a-dnmQ、pET30a-dnmQ或pET32a-dnmQ。
本发明提供了一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用，按照本发明的方法构建得到的质粒具有如下优点：
(1)本发明的表达质粒是对商业化的大肠杆菌质粒pGro7进行的改造，其不仅具有商业化分子伴侣的特性，还具有良好的助溶效果；
(2)采用链霉菌来源的重组蛋白替换商业化大肠杆菌质粒pGro7中具有助溶功效的groES和groEL，得到的新的质粒可实现目的蛋白更高效可溶表达。
附图说明
图1为质粒pGroE的构建过程。
图2为重组菌落中groEL1、groES1和groEL2的表达情况(其中M为DNAMarker；1为groEL1基因；2为groES1基因；3为groEL2基因)。
图3为不同质粒对dnmS的可溶表达情况(其中M为蛋白质标记物M221-01；1-3为BL21(DE3)/pET32a对dnmS的可溶表达情况；4-5为BL21(DE3)/pGro7/pET32a对dnmS的可溶表达情况；7-9为BL21(DE3)/pGroE/pET32a对dnmS的可溶表达情况)。
图4为不同质粒对dnmQ的可溶表达情况(其中M为蛋白质标记物M221-01；1-3为BL21(DE3)/pET32a对dnmQ的可溶表达情况；4-5为BL21(DE3)/pGro7/pET32a对dnmQ的可溶表达情况；7-9为BL21(DE3)/pGroE/pET32a对dnmQ的可溶表达情况)。
具体实施方式
在本发明中大肠杆菌质粒载体pGro7的整体序列为NCBI中记载的登录号为NC_002695的序列。
在本发明中链霉菌为天蓝色链霉菌，天蓝色链霉菌的DNA序列为NCBI中记载的登录号为ASM20383v1的序列。
在本发明中克隆采用Vazyme公司ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit快速克隆试剂盒进行。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例和对比例中所述的TB培养基中包含如下浓度的组分：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4ml/L。
本发明实施例1～2中构建质粒pGroE的过程如图1所示。
实施例1
以天蓝色链霉菌DNA为模板，扩增groEL1、groES1和groEL2伴侣基因。扩增的反应体系为：模板DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×Phanta Max MasterMix 25μL，ddH2O 22μL。扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃2min，共35个循环；72℃10min。扩增groEL1基因的上游引物如SEQ ID NO.4所示；扩增groEL1基因的下游引物如SEQ ID NO.5所示。扩增groES1基因的上游引物如SEQ ID NO.6所示；扩增groES1基因的下游引物如SEQ IDNO.7所示。扩增groEL2基因的上游引物如SEQ ID NO.8所示；扩增groEL2基因的下游引物如SEQ ID NO.9所示。
PCR扩增反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳。结果，pGro7在3500bp有一特异性条带；groEL1在1600bp有一特异性条带；groES1在300bp有一特异性条带；groEL2在1600bp有一特异性条带。
采用thermo scientific公司GeneJET PCR Purification Kit柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收PCR产物。
将纯化回收的groEL1、groES1和groEL2 PCR产物采用Vazyme公司ClonExpressUltra One Step Cloning Kit快速克隆试剂盒，定向克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7的相应位点上，得到助溶表达质粒pGro7-groEL1-groES1-groEL2，即pGroE。克隆时的反应体系为：删除groEL和groES基因片段的pGro71μL，伴侣基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH2O 1μL；反应条件为：52℃反应4min。
将pGroE化学转化到DH5α中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到重组产物pGroE/DH5α。将pGroE/DH5α三区划线，37℃，恒温培养箱培养12h，得到重组菌落。提取重组菌落DNA，PCR验证重组菌落中groEL1、groES1和groEL2的表达情况。1％琼脂糖电泳结果如图2所示。PCR反应体系为：上下游引物各0.3μL，2×Taq Plus MasterMix 10μL，ddH2O 9.4μL。上下游引物为扩增groEL1、groES1和groEL2时对应的引物。
采用GenStar公司StarPrep Plasmid Miniprep Kit质粒小提试剂盒提取pGroE/DH5α中的质粒pGroE，将此化学转化至BL21(DE3)中，得到pGroE/BL21(DE3)感受态细胞。
将pET32a-dnmS质粒载体化学转化至pGroE/BL21(DE3)感受态细胞中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pGroE/pET32a-dnmS。按体积比为1:50将BL21(DE3)/pGroE/pET32a稀释接种于TB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.7后，加入摩尔浓度为0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和质量浓度为0.5g/ml的L-阿拉伯糖，25℃诱导表达8h，得到表达菌体。表达菌体经超声破碎细胞，12000rpm离心30min收集破胞液上清，得到表达产物。表达产物经SDS-PAGE检测糖基转移酶DnmS的可溶性表达情况。结果如图3所示。
实施例2
将pET28a-dnmQ质粒载体化学转化至实施例1制备得到的pGroE/BL21(DE3)感受态细胞中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pGroE/pET28a-dnmQ。按体积比为1:50将BL21(DE3)/pGroE/pET28a-dnmQ稀释接种于TB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.7后，加入摩尔浓度为0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和质量浓度为0.5g/ml的L-阿拉伯糖，37℃诱导表达4h，收集表达菌体。表达菌体经超声破碎细胞，12000rpm离心30min收集破胞液上清，得到表达产物。表达产物经SDS-PAGE检测糖基转移酶dnmQ的可溶性表达情况。结果如图4所示。
对比例1-1
将pET32a-dnmS质粒载体化学转化至BL21(DE3)中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pET32a-dnmS。将BL21(DE3)/pET32a-dnmS按实施例1的条件收集表达菌体后，检测BL21(DE3)感受态细胞对dnmS的可溶表达情况。结果如图3所示。
对比例1-2
将pET32a-dnmS质粒载体化学转化至pGro7/BL21(DE3)中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pGro7/pET32a-dnmS。将BL21(DE3)/pGro7/pET32a-dnmS按实施例1的条件收集表达菌体后，检测pGro7质粒对dnmS的可溶表达情况。结果如图3所示。
对比例2-1
将pET28a-dnmQ质粒载体化学转化至BL21(DE3)中，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pET32a-dnmS。将BL21(DE3)/pET32a-dnmS按实施例2的条件收集表达菌体后，检测BL21(DE3)感受态细胞对dnmQ的可溶表达情况。结果如图4所示。
对比例2-2
将pET28a-dnmQ质粒载体化学转化至pGro7/BL21(DE3)，37℃，恒温培养箱培养12h，得到BL21(DE3)/pGro7/pET32a-dnmQ。将BL21(DE3)/pGro7/pET32a-dnmQ按实施例2的条件收集表达菌体后，检测pGro7质粒对dnmQ的可溶表达情况。结果如图4所示。
图3～4显示，改造得到的pGroE质粒较pGro7质粒更能有效的提高dnmS基因和/或dnmQ基因编码的糖基转移酶的可溶表达，更能有效的减少包涵体的形成。
由以上实施例可知，本发明提供了一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用，按照本发明的方法构建得到的质粒具有如下优点：
(1)本发明的表达质粒是对商业化的大肠杆菌质粒pGro7进行的改造，其不仅具有商业化分子伴侣的特性，还具有良好的助溶效果；
(2)采用链霉菌来源的重组蛋白替换商业化大肠杆菌质粒pGro7中具有助溶功效的groES和groEL，得到的新的质粒可实现目的蛋白更高效可溶表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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gtcgaggacc cgtacgagaa cctcggcgcc cagctggtga aggaggtggc gaccaagacc 240
aacgacatcg cgggtgacgg caccaccacc gccaccgtgc tcgcccaggc gctcgtgcgc 300
gagggcctga agaacgtcgc cgccggtgcc tccccggcgc tgctgaagaa gggcatcgac 360
gcggccgtcg ccgccgtgtc ggaagacctt ctcgccaccg cccgcccgat cgacgagaag 420
tccgacatcg ccgccgtggc cgcgctgtcc gcccaggacc agcaggtcgg cgagctgatc 480
gccgaagcga tggacaaggt cggcaaggac ggtgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc 540
ttcggtctgg agctggactt caccgagggc atggccttcg acaagggcta cctgtcgccg 600
tacttcgtga cggaccagga gcgcatggag gccgtcctcg acgacccgta catcctgatc 660
aaccagggca agatctcctc catcgcggac ctgctgccgc tgctggagaa ggtcatccag 720
gccaacgcct ccaagccgct gctgatcatc gccgaggacc tggagggcga ggcgctctcc 780
accctcgtcg tcaacaagat ccgcggcacc ttcaacgcgg tggccgtcaa ggcccccggc 840
ttcggcgacc gccgcaaggc gatgctgcag gacatggccg tcctcaccgg cgccacggtc 900
atctccgagg aggtcggcct caagctcgac caggtcggcc tcgaggtgct cggcaccgcc 960
cgccgcatca ccgtcaccaa ggacgacacc acgatcgtcg acggtgccgg caagcgcgac 1020
gaggtccagg gccgcatcgc ccagatcaag gccgagatcg agaacacgga ctccgactgg 1080
gaccgcgaga agctccagga gcgcctcgcg aagctggccg gcggcgtgtg cgtgatcaag 1140
gtcggcgccg ccaccgaggt ggagctgaag gagcgcaagc accgtctgga ggacgccatc 1200
tccgcgaccc gcgccgcggt cgaggagggc atcgtctccg gtggtggctc cgcgctggtc 1260
cacgccgtca aggtgctcga gggcaacctc ggcaagaccg gcgacgaggc caccggtgtc 1320
gcggtcgtcc gccgcgccgc ggtcgagccg ctgcgctgga tcgccgagaa cgccggcctg 1380
gagggttacg tcatcacctc caaggtcgcc gacctcgaca agggccaggg cttcaacgcc 1440
gccaccggcg agtacggcga cctggtcaag gccggcgtca tcgacccggt gaaggtcacc 1500
cgctccgccc tggagaacgc cgcctccatc gcctccctcc tgctgacgac cgagaccctg 1560
gtcgtcgaga agaaggaaga ggaagagccg gccgccggtg gccacagcca cggccactcc 1620
cactga 1626
<210> 2
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgacgacca ccagctccaa ggttgccatc aagccgctcg aggaccgcat cgtggtccag 60
ccgctcgacg ccgagcagac cacggcttcg ggcctggtca ttccggacac ggccaaggag 120
aagccccagg agggcgtcgt cctggccgtc ggcccgggcc gcttcgagga cggcaaccgc 180
cttccgctcg acgtcagcgt cggcgacgtc gtgctctaca gcaagtacgg cggcaccgag 240
gtgaagtaca acggcgagga gtacctcgtc ctctcggccc gcgacgtgct cgcgatcgtc 300
gagaagtag 309
<210> 3
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccaaga tcatcgcgtt cgacgaggag gcgcggcgcg gcctcgagcg cggcatgaac 60
cagctcgcgg acgccgtcaa ggtgacgctc ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctcgag 120
aagaagtggg gcgcccccac gatcaccaac gatggtgtct ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctcgaggacc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aggaagtcgc caagaagacg 240
gacgacgtcg ccggtgacgg tacgaccacc gcgaccgttc tcgcccaggc cctggtcaag 300
gaaggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgatgg ccctgaagcg cggtatcgag 360
aaggccgtcg aggccgtctc cgccgccctg ctcgagcagg ccaaggacgt cgagaccaag 420
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ttcggtctgg agctggagct caccgagggt atgcgcttcg acaagggcta catctcggcg 600
tacttcgcca ccgacatgga gcgtatggag gcgtcgctcg acgacccgta catcctgatc 660
gccaactcca agatcggcaa cgtcaaggac ctgctgccgc tcctggagaa ggtcatgcag 720
tcgggcaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggccct gtcgaccctg 780
gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tccgtcgccg tcaaggctcc gggcttcggc 840
gaccgccgca aggccatgct cggcgacatc gccatcctca cgggcggcga ggtcatctcc 900
gaggaggtcg gcctcaagct cgagaacgcc acgctggacc tgctgggcag cgcgcgcaag 960
gtcgtcatca ccaaggacga gaccacgatc gtggacggcg ccggttcggc cgaccaggtt 1020
cagggccgcg tcaaccagat ccgcgccgag atcgagaaca gcgactcgga ctacgaccgc 1080
gagaagctcc aggagcgcct ggcgaagctg gccggcggcg tggccgtcat caaggccggt 1140
gccgccaccg aggtcgagct caaggagcgc aagcaccgca tcgaggacgc cgttcgcaat 1200
gcgaaggcgg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtggtg gcgtggccct gctccaggcc 1260
tcccaggtct tcgagaagct ggagctgacg ggtgacgagg cgaccggcgc caacgccgtg 1320
aagctcgccc tggaggcccc gctgaagcag atcgccgtca acggcggtct cgagggcggc 1380
gtcgtcgtgg agaaggtccg caacctgacc gtcggccacg gcctgaacgc cgccaccggt 1440
gagtacgtcg acatgatcgc cgaaggcatc atcgacccgg cgaaggtgac ccgctctgcc 1500
ctgcagaacg ccgcctccat cgccgcgctg ttcctcacca ccgaggccgt catcgccgac 1560
aagcccgaga aggccgctcc ggcgggcgcc ccgggcggca tgccgggtgg tgacatggac 1620
ttctga 1626
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctcaaagg agagttatca ctctagaaat aattttgttt aactttaaga agg 53
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttctagagtc agtgggagtg gccgtg 26
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactcccact gactctagaa ataattttgt ttaactttaa gaagg 45
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctagagcta cttctcgacg atcgcgag 28
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtcgagaag tagctctaga aataattttg tttaacttta agaagg 46
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctgcgagg tgcagggcaa tcagaagtcc atgtcaccac cc 42
<210> 10
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaggtgc tcgtgacggc gttcgccatg gacgcgcact tcaatggtgt ggtgccgctc 60
gcctgggcgc tgcgggcggc cgggcacgac gtccgggtgg cgagccagcc cgctctcacc 120
gacagcatca cccgcgctgg actcacggcc gtaccggtgg gtacggacca ccaggtgcag 180
gcggcgatgg gggccatggc gcccggcgtg ttcgcgctgc acctgaaccc ggactacctg 240
gagaaccggc cggagctgct cgacctggag ttcctcgaag cgtccacgtc catgctgacg 300
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gcctggtggc gtcccgacct ggtcgtctgg gagcccttca ctttcggcgg cgcggtggcg 420
gcccaggtga ccggcgcggc gcaggcccgc ctgctgtggg gcccggacct cttcctgcgg 480
gtgcacgacc ggttccagca ggtgctgcac gaggtgccgg ccgagcgccg ggacgacgcc 540
ctggaggagt ggctgacgtg gacgctggag cggcacggtg cggccttcgg gcccgaggtg 600
atcagcggcc actggacgat cgaccagatg ccgccgagcg tgcggttcgc cacggcccgc 660
ccgacggtgc cgatgcggtt cgtcccgtac aacgggccgg tcccggcggt ggtgccgccg 720
tggctgcggg cggatccggg gcgcccgagg gtcctgctca cccaaggcat cacggagcgc 780
tcgacgggct tcaccgggct gccccgggcc ggtgagctgc tggcctcgat cgcggagctg 840
gacgccgagg tggtcgccac ggtcaaggcc gaggagcgcg agggcctgcc gcctctgccc 900
gggaacgtgc gggtggtgga cagcctgtcc ctgcacgtcg tcctgccgag ctgcgcggcc 960
gtcgtgcacc acggcggcgc cggcacctgg gcgacggcgg cgctgcacgg ggtgcctcag 1020
cttgccctcg cctggcagtg ggacgacgtc ttccgggccg ggcagctgga gaagctgggc 1080
gcggggatct tcctcccgcc gcacggcgag ggcgcctcgg ccggccgggt cagggacagg 1140
ctggctcagg tactggccga gccgtccttc cggcagggcg cggcgcggat ccgcgcggag 1200
atgctgcgga ccccggcacc cggtgcggtg gtgccgacgc tggaacagct gacggcccgg 1260
caccgtgctc cggccgggca gggcgtccgg cactag 1296
<210> 11
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcccacac ccacgtccgc gccgccggcc gccccgaccg acagcgagct ggggcgccat 60
ctgctgaccg tgcgcggctt ccacttcgtc ttcggcgcgc tgggcgaccc ctatgcccgg 120
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ctggacgatc cgctgctggg tccccggcac cccgcctcag agggcccgca ggagcacgtt 300
ctcgagaacg tctgggagac ctggcggacc tgtcacgtca ctccgctcgg cgaggacctg 360
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gatcccgggg acaccgtcac ggccgcagtg ctgagcacgg tggtcggagc cgagacagcg 840
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ctgcgggccg atcccggcag ggcggcggac gcggtcgagg agaccctgcg ctgggcgccg 960
cctgtgacgc tgcgcagcct gatcacccag ggagaggttc agatcggtgg cgagacgctg 1020
gaggcggacc agcacgtggt ggtgctggtc gacgccgccc agcgggaccc ggcgctgtac 1080
gaggacccgg accgattccg tctcgaccgc ccccgtagcc ccggtttcac gcacatggcc 1140
ctggcgggcc gggaccatct ggggctggtc gccccgctcg tccgcgtgca gtgcaccgcc 1200
gtcctgcggg cgcttgccga acggctgccc gggctgcggg ccgagggcga gccgctgcgg 1260
cgcgggcgct cccctgtggt ccgcgccccg ctctcgctgc ggctggccca gaagtga 1317
Claims (10)
1.一种大肠杆菌助溶表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；
(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，伴侣基因groEL1的序列如SEQ ID NO.1所示；
伴侣基因groES1的序列如SEQ ID NO.2所示；
伴侣基因groEL2的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增时的反应体系为：链霉菌DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 22μL；
扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃～60℃30s，72℃2min～3min，共35个循环；72℃，10min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增伴侣基因groEL1的引物如SEQ IDNO.4～5所示；
扩增伴侣基因groES1的引物如SEQ ID NO.6～7所示；
扩增伴侣基因groEL2的引物如SEQ ID NO.8～9所示。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，克隆时的反应体系为：删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro71μL，伴侣基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH2O 1μL；
克隆时的反应条件为：48～52℃反应4～6min。
6.权利要求1～5任意一项所述的方法制备得到的助溶表达质粒pGroE。
7.权利要求6所述的质粒pGroE在促进糖基转移酶可溶表达中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，pGroE在促进糖基转移酶可溶表达时的诱导剂为：质量浓度为0.4～0.6g/ml的L-阿拉伯糖和/或摩尔浓度为0.05～0.15M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，糖基转移酶由dnmS和/或dnmQ基因编码；
dnmS基因的序列如SEQ ID NO.10所示；
dnmQ基因的序列如SEQ ID NO.11所示。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，pGroE在促进dnmS和/或dnmQ基因编码的糖基转移酶可溶表达的方法为：pGroE与表达dnmS和/或dnmQ基因的质粒载体共表达；
表达dnmS基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmS、pET28a-dnmS、pET30a-dnmS或pET32a-dnmS；
表达dnmQ基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmQ、pET28a-dnmQ、pET30a-dnmQ或pET32a-dnmQ。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
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ID=78385918
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| CN109554382A (zh) * | 2018-04-12 | 2019-04-02 | 安徽师范大学 | 一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用 |
| CN111887246A (zh) * | 2019-05-06 | 2020-11-06 | 成都特普生物科技股份有限公司 | 一种激活微生物菌剂的分子伴侣 |
-
2021
- 2021-08-16 CN CN202110938727.4A patent/CN113621637A/zh active Pending
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