CN114561386B - 一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用 - Google Patents
一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种具有分子内伴侣特性的序列，由一段信号肽（N）序列及一段UTR序列（I）组成，将其连接到目的蛋白基因序列上游与启动子中间，转化表达后催化底物，可显著提高酶催化效率。该片段在大肠杆菌中，不仅显著提高催化效率，且不区分组成型表达体系及诱导型表达体系，而信号肽区域和此UTR区域单独存在时，均无明显催化效率。本发明为其它蛋白表达及酶催化提供了介导显著提高酶催化效率的基因元件，可应用于大肠体系的酶表达及催化探索。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种具有分子伴侣特性的基因元件及其应用。
背景技术
在实验室和工业生产中，原核系统因高效、简便、廉价的培养条件、清晰的转录和翻译机制被广泛使用于异源蛋白表达，如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis，B.subtilis)。大肠杆菌是原核表达系统常用的异源表达宿主菌株，它具有生长迅速、培养条件简便、能高效整合外源DNA并以非常高的速率表达重组蛋白的显著优势，截止2003年时，在蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中提交三维结构的蛋白质约有80%是利用大肠杆菌表达系统表达。
但大肠杆菌体系也存在难以克服的缺点：目的蛋白通常以包涵体的形式存在，导致产品纯化困难；缺乏将蛋白质释放到胞外培养基中的分泌系统，促进二硫键形成的能力有限，氨基末端蛋氨酸切割效率低，无法赋予翻译后修饰，蛋白质缺乏活性，从而导致蛋白质稳定性降低和免疫原性增加。因此，改善蛋白表达过程中包涵体形成、提高翻译后蛋白催活性具有重要的研究与应用意义。而培养条件优化、分子伴侣共表达、降低诱导培养物的生长温度、培养至早期-对数期时诱导表达、以较低的诱导物浓度诱导培养是获取可溶性蛋白的重要方法。
因此，此段具有分子内伴侣特性的序列，在研究可溶性蛋白获取及介导蛋白正确折叠中具有重要意义。
发明内容
本发明合成了一个具有分子内伴侣特征的基因元件，由一段信号肽和一段5’-UTR组成，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示构成的SEQ ID NO.23，为提高蛋白催化效率提供了一种分子手段。其中，本发明中所述信号肽为NprB信号肽，序列如SEQ ID NO.1所示；所述5’-UTR为一段无义非编码区，基因片段由两部分组成，分别为表达载体pHY-p43中的一段和表达载体pBAD-Myc-HisA中的一段，序列如SEQ ID NO.2所示。其中，在构载体柠檬烯过氧化物酶的表达体系过程中研究不同载体和调控元件串联作用对表达情况的影响时，发现将两段属于不同载体的非编码区（UTR）区与信号肽连接时，能够显著提高酶的催化效率
本发明将组合后的上述基因元件置于启动子与目的蛋白基因序列之间，连接到组成型表达载体及诱导型组成载体上均可介导目的蛋白催化效率的增强。从试验来看，本发明的基因元件不改变基因表达产物（酶或其他蛋白质）的量，但可以显著提高酶的催化产物的量，因此推测该元件有助于酶催化效率的提高，使其正确折叠，并降低包涵体的生成，目前还未对该元件对其他基因的表达进行调控，仅开展了对柠檬烯环过氧化物水解酶的调控，从组成型表达体系来看，当反应进行到36 h时，催化能力依然在提高。
因此，本发明提供一种具有分子内伴侣特性的基因元件，其核苷酸序列如SEQ IDNO：23所示。
本发明进一步提供含有所述基因元件的表达载体。具体地，所述基因元件的上游为启动子、下游为目的蛋白基因。优选地，所述启动子为PlytR、PspoVG、Pveg、pBAD、p43、HpaII、PxylA。最优选地，所述目的蛋白为柠檬烯环氧化物水解酶。
本发明还提供含有所述表达载体的菌株。优选地，其特征在于，所述菌株为原核体系，如大肠杆菌Top10、DH5α、BL21系列。
本发明进一步提供所述的基因元件，或所述表达载体在提高目的蛋白的酶催化效率中的应用。
更具体地，本发明提供了一种重组质粒的构建方法，其特征在于，利用酶切连接，将SEQ ID NO.2序列和LEH连接到pHY-p43上；利用重叠PCR扩增连接SEQ ID NO.1序列及LEH，同源重组将PCR连接好的SEQ ID NO.1及LEH连接到权利要求6所述载体上；利用PCR、单酶切、双酶切及同源重组，将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及LEH序列连接到权利要求6所述载体上。
本文所述“提高蛋白催化效率”是指，该基因元件的存在促进酶催化效率的提高，意味着该基因元件介导了更多目的蛋白正确装配。
附图说明
图1实施例1中的重组质粒p43-I-LEH图谱。
图2实施例1中的重组质粒p43-NI-LEH图谱。
图3实施例1中的重组质粒pHY-N-LEH图谱。
图4本发明基因元件对各个重组体系催化效率的影响对比图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术方案，使用实施例加以举例说明，不旨在对本发明造成任何方式上的限制。
本实验前期没有发现这段组合序列的作用，且5’UTR上又包含BamH I和Nde I的酶切位点，为了用酶切连接直接将信号肽与柠檬烯环氧化物水解酶连到载体上，构建了一批去除了5’UTR的表达载体体系，结果发现对比有5’UTR的表达体系，去除了5’UTR的结果全都出现催化效率低的现象，故考虑那一段5’UTR对催化效率有影响，因此重新以同源重组的形式加上了5’UTR区，且检测证实加上这一段5’UTR的表达体系催化效率明显提高。
实施例1构建去除5’UTR区和含基因元件的模板重组表达质粒
1、获取5’UTR区
以连接到pBAD-Myc-HisA上的目的蛋白LEH序列为模板，利用引物SEQ ID NO.3-4PCR扩增目的蛋白并回收，引物序列见表1。
表1 引物名称序列及编号
| 名称 | 序列（5’-3’） | 编号 |
| P43-F | CGGGATCCCGTTGGGCTAACAGGAGGAATTAC | SEQ ID NO.3 |
| P43-R | CGGAATTCCGCAAGCTGGAGACCGTTTAAACT | SEQ ID NO.4 |
| p43-N-F | AGAGGAATGTACACAGATCTCCCGGGTTGCGCAACTTGACC | SEQ ID NO.5 |
| p43-N-R | ATCCGTCGACCTGCAGATCTCAGCTGAGGCATGTGTTACAAA | SEQ ID NO.6 |
| pHY-N-F | GGTCGACGGATCCCCGGGTTGCGCAACTTGACCAAGA | SEQ ID NO.7 |
| LEH-N-R | TGTTCGATCTTTGATGCCATCAGCTGAGGC ATGTGTTACA | SEQ ID NO.8 |
| N-LEH-F | TGTAA CACATGCCTCAGCTG ATGGCATCAAAGATCGAACA | SEQ ID NO.9 |
| pHY-LEH-R | TTTTTTTATAACAGGAATTC AAGCTGGAGA CCGTTTAAAC TC | SEQ ID NO.10 |
| pHY-LytR-F | TGCCCAAGCTTCTAGAGATCTTTTTTTCACCTCATTATATT | SEQ ID NO.11 |
| pHY-LytR-R | AGTTGCGCAACCGGGGATCCCCTTTGCACCTCGTCTGTTAAA | SEQ ID NO.12 |
| pHY-veg-F | AAGCTTCTAGAGATCTGGAGTTCTGAGAATTGGTATGC | SEQ ID NO.13 |
| pHY-veg-R | AGTTGCGCAACCGGGGATCCTGCATCCACCTCACTACATTTA | SEQ ID NO.14 |
| pHY-spoVG-F | GAAGATCTTC ATTTACCTTA TGCCCGAAAT | SEQ ID NO.15 |
| pHY-SpoVG-R | CGGGATCCCG CACAGTAGTT CACCACCTTT | SEQ ID NO.16 |
| pHY-pBAD-F | AAGCTTCTAGAGATCT AAGAAACCAATTGTCCATATTG | SEQ ID NO.17 |
| pHY-pBAD-R | TTGCGCAACCCGGGGATCC ATGGAGAAACAGTA | SEQ ID NO.18 |
| pMA5-N-F | AGCGATTTACATATGCGGCCGCGTTGCGCAACTTGACCAA | SEQ ID NO.19 |
| pMA5-LEH-R | AGCTCGACTCTAGAGGATCCAAGCTGGAGACCGTTTAAAC | SEQ ID NO.20 |
| pAX01-N-F | GGGGGAAATGGGATCGGTACCTTGCGCAACTTGACCAAGACAT | SEQ ID NO.21 |
| pAX01-LEH-R | AGAGTGCGGCCGCCCAAGCTGGAGACCGTTTAAACTCAATG | SEQ ID NO.22 |
注：下划线处为酶切位点。
扩增反应体系如下，BamH I与EcoRI酶切载体pHY-p43及LEH的PCR回收产物，T4连接两个酶切回收产物，即获取含5’UTR区（SEQ ID NO.2）目的蛋白的重组质粒p43-I-LEH，该重组质粒示意图见图1。
| 2×Rapid Taq Master Mix | 20 μL |
| SEQ ID NO.3 | 1 μL |
| SEQ ID NO.4 | 1 μL |
| LEH | 0.5 μL |
| ddH2O | 17.5 μL |
2、含基因元件的模板重组质粒的构建
以SignalP分析NprB蛋白序列，结合文献报道，确定NprB序列并合成，即SEQ IDNO.1，以合成的NprB序列为模板，利用引物SEQ ID NO.5-6扩增NprB序列并回收，引物序列见表1，扩增反应体系如下：
| 2×Rapid Taq Master Mix | 20 μL |
| SEQ ID NO.5 | 1 μL |
| SEQ ID NO.6 | 1 μL |
| NprB | 1μL |
| ddH2O | 17μL |
Bgl II单酶切重组质粒p43-I-LEH并回收，同源重组连接pCR回收的NprB序列及酶切回收的p43-I-LEH，即获取含此基因元件的重组质粒p43-NI-LEH，该重组质粒示意图见图2。
3、构建去除5’UTR的模板重组质粒
通过引物SEQ ID NO.7-8扩增NprB序列，通过引物SEQ ID NO.9-10扩增LEH序列，然后PCR扩增后的NprB序列和S-LEH序列为模板，利用重叠PCR连接NprB及LEH并回收pcr产物，引物序列见表1，扩增反应体系如下，用Sma I和EcoR I酶切载体pHY-300-PLK并回收，同源重组连接酶切后回收的pHY-300-PLK和重叠PCR回收产物，获得去除5’UTR的模板重组质粒pHY-N-LEH，该重组质粒示意图见图3。
实施例2构建去除5’UTR区和含基因元件的其它重组表达质粒
1、构建其它去除5’UTR的重组质粒
提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，并以此为模板，利用引物SEQ ID NO. 11-16分别扩增启动子PlytR、PspoVG、Pveg并回收，以pBAD-Myc-HisA为模板，利用引物SEQ IDNO. 17-18扩增启动子pBAD并回收，引物序列见表1，扩增反应体系如下，用Bgl II和BamH I酶切重组质粒pHY-N-LEH和PCR扩增回收的PspoVG并回收，同源重组连接酶切后回收的pHY-N-LEH和PCR扩增回收的PlytR、Pveg、pBAD，T4连接酶切后回收的pHY-N-LEH和PspoVG，即获得去除5’UTR的重组质粒pHY-lyt-N-LEH、pHY-spoVG-N-LEH、pHY-veg-N-LEH、pHY-pBAD-N-LEH。
以pHY-N-LEH为模板，利用引物SEQ ID NO.19-22，分别扩增含载体pMA5和pAX01同源臂且去除5’UTR的片段并回收，引物序列见表1，扩增反应体系如下，NdeI和BamHI酶切载体pMA5并回收，BamH I和SacII酶切载体pAX01并回收，同源重组连接酶切后回收的pMA5、pAX01和PCR扩增回收的对应片段，即获得去除5’UTR的重组质粒pMA5-N-LEH和pAX01-N-LEH。
2、构建其它含基因元件重组质粒
以p43-NI-LEH为模板，利用引物SEQ ID NO.7/10扩增连接到pHY体系的基因元件片段并回收，引物序列见表1，扩增反应体系如下，利用引物SEQ ID NO.19-22.，分别扩增含载体pMA5和pAX01同源臂基因元件的片段并回收，引物序列见表1，扩增反应体系如下。用Sma I和EcoR I酶切重组质粒pHY-lyt-N-LEH、pHY-spoVG-N-LEH、pHY-veg-N-LEH、pHY-pBAD-N-LEH以及PCR回收的pHY体系的基因元件，T4连接酶切回收后的pHY-lyt、pHY-spoVG、pHY-veg、pHY-pBAD和相应酶切回收的NI-LEH，即获得pHY-lyt-NI-LEH、pHY-spoVG-NI-LEH、pHY-veg-NI-LEH、pHY-pBAD-NI-LEH。同源重组连接1.4中酶切回收的载体pMA5、pAX01和相应的PCR回收的NI-LEH，即获得pMA5- NI-LEH和pAX01-NI-LEH。
实施例3重组质粒的表达
1、重组质粒的转化、鉴定与保存
将上述构建好的重组质粒转入大肠杆菌体系的感受态细胞如Top10、DH5α和BL21中，涂布含氨苄青霉素抗性的固体平板，挑选单菌落，以相应引物序列进行菌落PCR检测，菌落PCR阳性菌株，送出菌液进行测序验证，同时扩大培养提取质粒进行质粒PCR检验，对测序正确的阳性菌落终浓度25%甘油保存。
2、目的蛋白的表达与收集
将测序正确的重组质粒单菌落扩大培养，以1-5%的接种量接种，含pBAD启动子的菌在对数期加入终浓度0.02%的L-阿拉伯糖，30℃，200rpm培养12 h，含PxylA启动子的菌在对数期加入终浓度0.5%的木糖，37℃，200rpm培养12 h，其它重组质粒均为组成型表达体系，均37℃，200rpm过夜培养12 h。取过夜培养含目的蛋白的菌液1mL，12000 ×g室温离心2min收集沉淀，100 μL细菌裂解液轻柔吸打重悬沉淀，冰上孵育裂解10-15 min，12000 ×g室温离心3-5 min收集上清，即获得可溶性目的蛋白。
3、目的蛋白催化效率的检测
用乙腈配置浓度1 M的底物LE母液10 mL，用50mM磷酸钾缓冲液（pH 6.2）将母液稀释20倍，使底物稀释液的终浓度为50 mM。取4 mL的反应瓶，吸980 μL底物稀释液与20 μL上述3.2中最后获得的可溶性蛋白，30℃孵育90 min，取400 μL反应液与400 μL乙酸乙酯及120 μLNaCl涡旋混合，乙酸乙酯中含1 mM的IS（十六烷）做为内标，8000rpm室温离心2 min，收集上层透明溶液，重复1次上述加乙酸乙酯及NaCl的步骤，取少量MgSO4.去除残余水分，8000rpm室温离心3 min，取150 μL上清进行手性GC-MS， GC进样口温度210°C，90°C保持4min, 10°C /min升至160°C, 20°C /min升至 210°C 并保持5 min。MS溶剂峰延迟4 min，测量峰面积并使用内标峰面积和校准曲线计算浓度，以此对比各个重组质粒体系的催化效率。
结果如图4所示。结果表明LEH在含全片段NI或仅含片段N及仅含片段I的不同表达载体中，催化产物(1S,2S,4R)-(+)-Limonene-1,2-diol的浓度具有明显差异，在LEH蛋白浓度无明显差异的情况下，含NI的体系pHY-lyt-NI-LEH、p43-NI-LEH比仅含片段N的体系pHY-lyt-N-LEH或仅含片段I的体系p43-I-LEH的(1S,2S,4R)-(+)-Limonene-1,2-diol产物浓度高出21.08倍和13.75倍，表明NI片段是一段从功能上类似分子内伴侣，介导LEH的正确折叠并减少包涵体生成来提高可溶性蛋白的表达。
<110>湖南农业大学
<120>一种具有分子内伴侣特性的基因元件及其应用
<160>23
<210> 1
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 1
TTGCGCAACT TGACCAAGAC ATCTCTATTA CTGGCCGGCT TATGCACAGC
GGCCCAAATG GTTTTTGTAA CACATGCCTC AGCTG85
<210>2
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AGATCTGCAG GTCGACGGAT CCCGTTGGGC TAACAGGAGG AATTACAT48
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CGGGATCCCGTTGGGCTAACAGGAGGAATTAC 32
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CGGAATTCCGCAAGCTGGAGACCGTTTAAACT 32
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
AGAGGAATGTACACAGATCTCCCGGGTTGCGCAACTTGACC 41
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ATCCGTCGACCTGCAGATCTCAGCTGAGGCATGTGTTACAAA 42
<210>7
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GGTCGACGGATCCCCGGGTTGCGCAACTTGACCAAGA 37
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TGTTCGATCTTTGATGCCATCAGCTGAGGCATGTGTTACA 40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
TGTAA CACATGCCTCAGCTG ATGGCATCAAAGATCGAACA 40
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
TTTTTTTATAACAGGAATTC AAGCTGGAGA CCGTTTAAACTC 42
<210>11
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
TGCCCAAGCTTCTAGAGATCTTTTTTTCACCTCATTATATT 41
<210> 12
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 12
AGTTGCGCAACCGGGGATCCCCTTTGCACCTCGTCTGTTAAA 42
<210> 13
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 13
AAGCTTCTAGAGATCTGGAGTTCTGAGAATTGGTATGC 38
<210> 14
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 14
AGTTGCGCAACCGGGGATCCTGCATCCACCTCACTACATTTA 42
<210> 15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 15
GAAGATCTTC ATTTACCTTA TGCCCGAAAT 30
<210> 16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 16
CGGGATCCCG CACAGTAGTT CACCACCTTT 30
<210> 17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 17
AAGCTTCTAGAGATCT AAGAAACCAATTGTCCATATTG 38
<210> 18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 18
TTGCGCAACCCGGGGATCC ATGGAGAAACAGTA 33
<210> 19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 19
AGCGATTTACATATGCGGCCGCGTTGCGCAACTTGACCAA 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
AGCTCGACTCTAGAGGATCCAAGCTGGAGACCGTTTAAAC 40
<210>21
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
GGGGGAAATGGGATCGGTACCTTGCGCAACTTGACCAAGACAT 43
<210>22
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
AGAGTGCGGCCGCCCAAGCTGGAGACCGTTTAAACTCAATG 41
<210>23
<211>133
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
TTGCGCAACTTGACCAAGACATCTCTATTACTGGCCGGCTTATGCACAGCGGCCCAAATGGTTTTTGTAACACATGCCTCAGCTGAGATCTGCAGGTCGACGGATCCCGTTGGGCTAACAGGAGGAATTACAT 133
Claims (4)
1.一种具有分子内伴侣特性的基因元件的表达载体，其特征在于，所述基因元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，且所述基因元件的上游为启动子、下游为目的蛋白基因；且所述启动子为PlytR或p43；所述目的蛋白为柠檬烯环氧化物水解酶。
2.含有如权利要求1所述表达载体的重组大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌Top10、DH5α或BL21系列。
4.如权利要求1所述表达载体，或如权利要求2或3所述的重组大肠杆菌在提高目的蛋白的酶催化效率中的应用。
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