CN104232558A - 基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法 - Google Patents

Abstract

一种基因工程领域的基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物进行PCR扩增得到编码外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得外切葡聚糖酶过表达重组菌株。本发明通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实现了外切葡聚糖酶的胞外过表达。

Description

基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于胞外外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为1730亿t，所含总能量可达2×10¹⁸kJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。 

木质纤维素中的纤维素组分是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，性质稳定；纤维素降解需要纤维素酶的参与，纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统，主要由3类组成：内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶(Endo‐β‐1,4‐glucanase)，又被称为Cen酶；外切葡聚糖酶(Exoglucanses)，又被称为Cex酶；β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase)，又被称为BG酶。目前普遍接受的观点是3种酶协同作用于纤维素的降解过程，即首先由Cen酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将纤维二糖彻底水解为葡萄糖。因此，外切葡聚糖酶(Cex)在纤维素彻底水解过程中起十分关键的作用。 

目前，各种纤维素酶基因均已在细菌中发现并被克隆。与真核生物纤维素酶基因相比，细菌纤维素酶基因具有不含内含子、易克隆、易表达及种类多等优势。其中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。之前，链霉菌研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对不足。 

与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长分化机制，对大分子多糖物质如纤维素有很强的分解利用能力。因此，研究链霉菌对大分子多糖物质的分解利用机制，发现全新的纤维素酶基因序列并对目的基因进行外源表达，对新型纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。 

经过对现有技术的检索发现：中国专利文献号CN101307295公开(公告)日2008.11.19，公开了一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS－CBH3－27。通过RT－PCR及RACE方法从嗜热毛 壳菌获得外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3，然后将得到的外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3表达载体pPIC9K/cbh3导入到毕赤酵母GS115中，从中筛选出了表达外切－β－1，4－葡聚糖酶的酵母工程菌GS－CBH3－27。该工程菌外切－β－1，4－葡聚糖酶表达量高达1.7mg/mL，酶在60℃是稳定的，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为10min，具热稳定性，用于转化植物纤维素的生物降解，具有较高经济价值和社会价值。但该工程菌在碱性条件下的酶学性质难以满足现有工业需要。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的由于外切葡聚糖酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法，通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实现了外切葡聚糖酶的胞外过表达，本发明不仅在高温条件下具有较高的生物学活性，此外在碱性条件下也可以维持稳定的酶学性质。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种外切葡聚糖酶的工程菌，该工程菌为外源表达外切葡聚糖酶的大肠杆菌。 

所述的胞内外切葡聚糖酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1胞外外切葡聚糖酶基因SG‐CX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该外切葡聚糖酶核苷酸序列为1737bp，共编码578个氨基酸，其中信号肽切割位于N端第32个氨基酸与第33个氨基酸之间。 

所述的SEQ ID NO.1克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。 

所述的外切葡聚糖酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。 

本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和谷胱甘肽的引物进行PCR扩增得到编码外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体pET‐41a(+)，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得外切葡聚糖酶过表达重组菌株。 

所述的含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物，即含有Spe I和EcoR I酶切位点引物，具体包括： 

CX‐Spe I‐F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA 

CX‐EcoR I‐R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT 

所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸45s；30个 循环后68℃终延伸3min。 

所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。 

本发明涉及一种外切葡聚糖酶的工程菌的应用，将其用于外切葡聚糖酶的体外高效表达，并用于外切葡聚糖酶的规模化发酵生产。 

技术效果 

与现有技术相比，本发明克服现有技术中的外切葡聚糖酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低，导致应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现其体外的大量表达与合成。此外，本发明通过在重组蛋白N端添加谷胱甘肽标签的方法，在显著提高表达量的同时也方便了蛋白后期的纯化，为外切葡聚糖酶的规模化发酵生产提供一种新的方向。 

附图说明

图1为灰略红链霉菌外切葡聚糖酶信号肽预测图。 

图2为重组木质素过氧化酶(GST·Tag)体外过表达SDS‐PAGE验证图。 

图3为重组木质素过氧化酶(GST·Tag)体外过表达Western Bolt验证图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

本实施例包括以下步骤： 

步骤1)灰略红链霉菌的分离及培养 

灰略红链霉菌分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸秆，保藏编号为CGMCC No.5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32℃培养48h。 

上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH6.8‐7.2。在液体培养基中加入15.0‐20.0g/L琼脂即得LB固体培养基。 

步骤2)灰略红链霉菌基因组DNA提取 

灰略红链霉菌基因组DNA提取 

收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μL EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃处理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。 

步骤3)灰略红链霉菌基因组测序 

确定全基因组鸟枪法(WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq(2×250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建contig及scaffold，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。 

步骤4)蛋白编码基因功能预测 

采用Glimmer 3.0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为110bp，其余参数为Glimmer 3.0的默认设置。 

步骤5)外切葡聚糖酶膜定位预测 

采用SignalP 4.1分别对外切葡聚糖酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测，如图1所示。结果表明外切葡聚糖酶存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞外酶，预测切割位点为N端第32个氨基酸(精氨酸)与第33个氨基酸(精氨酸)之间。 

步骤6)外切葡聚糖酶表达载体构建 

根据外切葡聚糖酶基因序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下： 

CX‐Spe I‐F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA 

CX‐EcoR I‐R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT 

以灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有Spe I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增获得外切葡聚糖酶基因序列，使用DNA A‐Tailing Kit加A后连接到T‐Vector PMDTM 19‐T(TaKaRa)，并将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。Spe I和EcoR I进行双酶切(37℃)，回收外切葡聚糖酶DNA片段CX。用相同内切酶酶切表达载体pET‐41a(+)并回收载体DNA片段。将CX与载体片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接(16℃)，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有目的基因的表达载体的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37℃培养16小时后提取质粒。 

上述PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸45s；30个循环后68℃终延伸3min。 

步骤7)外切葡聚糖酶过表达转基因菌株的构建 

将上述表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌并在含有卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB固体培养基上筛选，获得外切葡聚糖酶过表达菌株。 

上述的Transetta(DE3)具有以下特征：该菌株具有氯霉素(Camr)且含有大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)对应的tRNA，可有效提高外源基因，尤 其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。 

步骤8)重组外切葡聚糖酶体外过表达及纯化 

挑取阳性克隆于含有卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中，在32℃震荡培养，当OD₆₀₀达到0.6‐0.8时，加入IPTG溶液使其在培养液中的浓度达到100μM，28℃继续培养16小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，13000rpm/min离心15min收集上清，上清液即为外切葡聚糖酶的粗酶液。通过0.45μm滤膜过滤掉粗酶液中的杂质，随后通过GST蛋白纯化试剂盒的操作要求完成融合蛋白的纯化。 

重组菌诱导表达外切葡聚糖酶的SDS‐PAGE验证 

制备12％SDS‐PAGE胶，将粗酶液与5×SDS‐PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20μL，在160V电压下电泳60‐70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R‐250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见(如图2)。 

所述的12％SDS‐PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为： 

分离胶：蒸馏水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5M Tris‐HCl(pH 8.8)1.3mL，10％过硫酸铵(APS)0.05mL，10％SDS溶液0.05mL，TEMED 0.002mL； 

浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30％丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris‐HCl(pH 6.8)0.13mL，10％过硫酸铵(APS)0.01mL，10％SDS溶液0.01mL，TEMED 0.001mL； 

所述的5×SDS‐PAGE Loading Buffer组分为：1M Tris‐HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL。小份分装(500μL)后与室温保存，使用前每小份加入β‐巯基乙醇25μL。 

所述的考马斯亮蓝R‐250溶液组分为：考马斯亮蓝R‐2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。 

所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。 

重组菌诱导表达外切葡聚糖酶的Western Blot验证 

Western Blot详细步骤如下： 

按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS‐PAGE胶、三张滤纸、海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜装置放入电转槽，4℃100V转60‐70min。 

所述的SDS‐PAGE胶是指：实施例9中已完成电泳、未染色的胶块；所述电转液的组分 为：甘氨酸2.9g/L，Tris 5.8g/L，SDS 0.37g，甲醇200mL，去离子水800mL，配好之后4℃预冷。 

封闭：将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭1h。 

所述封闭液组分为：5.0g脱脂奶粉溶解于100mL TBST缓冲液；所述的TBST缓冲液组分为：NaCl 8.8g，1M Tris‐HCl(pH 8.0)20mL，吐温‐200.5mL，去离子水980mL。 

一抗杂交：将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。 

所述的一抗溶液组分为：将抗His‐兔多克隆抗体以1：5000溶在封闭液中。 

洗膜：将一抗孵育完的PVDF膜转入TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次10min；之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min。 

所述TBS缓冲液是指不含吐温‐20组分的TBST缓冲液。 

二抗杂交：将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。 

所述的二抗溶液组分为：将羊抗兔IgG‐HRP以1：5000溶在封闭液中。 

洗膜：同前。 

染色：将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置1min。通保鲜膜包好PVDF膜，置于X‐光片盒中，并用透明胶带固定。 

所述的染色液组分是将EasySee Western Blot Kit(TRANSGEN)中500μL溶液A、500μL溶液B与1μL溶液C混合。 

显影：于暗室中压片洗膜显影，结果如图3所示。 

Claims (7)

1.一种外切葡聚糖酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达外切葡聚糖酶的大肠杆菌； 

所述的胞内外切葡聚糖酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1外切葡聚糖酶基因SG‐CX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该外切葡聚糖酶核苷酸序列为1737bp，共编码578个氨基酸，其中信号肽切割位于N端第32个氨基酸与第33个氨基酸之间。 

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日。 

3.一种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物进行PCR扩增得到编码外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列连接到表达载体pET‐41a(+)，再将获得的连接产物转入大肠杆菌表达菌株内，获得外切葡聚糖酶过表达重组菌株。 

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点和谷胱甘肽标签的引物，即含有Spe I和EcoR I酶切位点引物，具体包括： 

CX‐Spe I‐F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA 

CX‐EcoR I‐R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT。 

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸45s；30个循环后68℃终延伸3min。 

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。 

7.一种根据上述任一权利要求所述的外切葡聚糖酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于外切葡聚糖酶的体外高效表达，并用于外切葡聚糖酶的规模化发酵生产。