CN103484489A - 一种随机突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种pH作用范围拓宽的谷氨酸脱羧酶突变体，其DNA序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4。本发明结合随机突变（易错PCR）技术和DNA定点突变技术，对野生型谷氨酸脱羧酶GadB1编码基因进行分子改造，得到了两种突变酶GadB1^{T17I/D294G/Q346H}和GadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}，相对野生酶其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在偏中性pH条件下仍具有较好的活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH5.5～6.5条件下，仍然具有较高的催化活性，因此解决了谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。

Description

一种随机突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的技术领域。

背景技术

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的编码基因，通过易错PCR、DNA重组等技术来改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的突变酶。近10年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变（site-directed mutagenesis）属于理性设计，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定碱基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。尤其是，在利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后对该位点进行定点突变分析，将有助于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。

谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15）以PLP作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成γ-氨基丁酸（γ-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适pH一般在4～5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了两种谷氨酸脱羧酶突变体，核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。其编码的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性pH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件，氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。其中SEQ ID NO.3所示突变体是在SEQ ID NO.1所述突变体基础上将312位氨基酸由谷氨酸突变为丝氨酸获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。

获得SEQ ID NO.2所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。

获得SEQ ID NO.4所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。

本发明还提供了一种针对上述突变体的指示剂平板筛选方法，具体方法为：将突变库中的转化子转移到筛选板上，30℃培养10h后，挑取在菌落周围变绿色的单菌落。筛选板的配方为：在LB固体培养基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡拉霉素、1/10000甲基红-亚甲基指示剂，待平板凝固后，在每个培养皿上涂布10μL1M IPTG，然后正面放置30min。

上述突变体基因及其所编码氨基酸在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。

本发明还提供了一种生产上述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，是将SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadB1^{T17I/D294G/Q346H}和gadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}的高效表达。

本发明所用的谷氨酸脱羧酶的基因gadB1来自产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2010367，分类学命名短乳杆菌Lb85（Lactobacillus brevis Lb85），gadB1的测序结果在中国专利CN201110020606.8中已经公布，序列见SEQ ID NO.5。

本发明的具体方法如下：第一，以来自L.brevis Lb85的谷氨酸脱羧酶基因gadB1为模板，通过易错PCR获得随机突变文库，采用平板指示剂筛选和粗酶液酶活测定两步筛选法获得需要的突变酶，扩大培养，表达、纯化后得到突变酶GadB1^{T17I/D294G/Q346H}，并测定其最适pH；第二，以第一步筛选得到的突变体基因为模板，进行E312S定点突变，构建突变体，以质粒pET28a或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单菌落进行扩大培养，表达、纯化后得到突变酶GadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}，并测定其最适pH。

本发明中表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。

本发明在gadB1的基础上进行易错PCR随机突变和定点突变，提高了突变酶在pH5.5～6.5条件下的催化能力。通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线模拟突变体酶的三维结构（图5），然后通过分析氢键作用力，发现突变酶中氨基酸替换后，在中性条件下可能会增大活性槽开口的角度，这样会增加酶与底物结合空间，减小它们结合的空间位阻。随着突变酶的有效pH作用范围的扩展，能够更好的运用突变体酶，在pH5.5～6.5的条件下，催化GABA的生物合成。

本发明通过比较野生酶GadB1和突变酶GadB1^{T17I/D294G/Q346H}、GadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}的有效作用pH范围和体外的催化能力，结果发现在pH6.5下，突变体酶GadB1^{T17I/D294G/Q346H}将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的10.6倍；突变体酶GadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.9倍。

附图说明

图1为重组质粒pET28a(+)-gadB1的构建图谱：

图2为定点突变的原理示意图：

图3为平板初筛的颜色变化图：

图4为野生型和突变型酶纯化后的SDS-PAGE图谱：

图5为带有突变位点的谷氨酸脱羧酶的模拟的空间结构：

图6为野生和突变酶的最适pH变化图：

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。材料和试剂：

所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株购于天跟生物公司；引物购于上海捷锐公司；SDS-PAGE试剂盒购于碧云天生物公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。

实施例一： 重组质粒的构建

本发明以PCR方法获取gadB1序列，但不限于PCR方法。

将 L. brevis Lb85（菌株在相关文献中公开，已保存于武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2010367，并在中国专利CN201110020606.8中公开）培养至指数生长中期，取3 mL菌液12000rpm离心1 min弃上清，溶菌酶处理0.5 h，然后按照试剂盒说明提取基因组DNA。

设计如下的引物来用于gadB1的扩增：

gadB1-F：5’-GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC-3’

gadB1-R：5’-CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT-3’

其中上游引物酶切位点为NdeI（gadB1-F中下划线部分），下游引物酶切位点为EcoRI（gadB1-R中下划线部分）。

PCR扩增条件：94℃变性5min，34个循环（95℃30s，55℃30s，72℃90s），最后72℃延伸10min。

扩增产物纯化后，用NdeI和EcoRI对PCR产物和载体pET28a进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4h，化学转化到JM109细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和PCR验证获得重组质粒pET28a-gadB1（图1），然后将重组质粒转到BL21(DE3)细胞，得到BL21(DE3)/pET28a-gadB1工程菌。

实施例二：利用随机突变来构建谷氨酸脱羧酶的突变文库

利用易错PCR技术在体外向谷氨酸脱羧酶基因gadB1引入核苷酸突变。

易错PCR的反应条件和引物：（50 μL体系）

dCTP(10mM)	4μL
		dTTP(10mM)	4μL
dNTP mixture(2.5mM)	4μL
		10×PCR Buffer(containing 3 mM Mn2+,70mM Mg2+)	5μL
pET28a-gadB1(20ng/μL)	1μL
		Primer1(20ng/μL)	1μL
Primer2(20ng/μL)	1μL
		Taq DNA polymerase(5 U/μL)	0.5μL
ddH2O	29.5μL

Primer1：5’-GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC-3’

Primer2：5’-CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT-3’

其中Primer1酶切位点为NdeI（Primer1中下划线部分），Primer2酶切位点为EcoRI（Primer2中下划线部分）。

PCR扩增条件：94℃变性5min，34个循环（95℃30s，55℃30s，72℃90s），最后72℃延伸10min。

易错PCR扩增产物纯化后，用NdeI和EcoRI分别对易错PCR产物和载体pET28a进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4h，化学转化到BL21(DE3)，涂布LB平板，37℃培养15h，构建突变文库。

实施例三：突变体的筛选

平板初筛：用灭菌的白枪头将LB平板上的转化子转移到颜色筛选平板上并做好标记，同时以BL21(DE3)/pET28a、BL21(DE3)/pET28a-gadB1作为对照。30℃培养10h，挑取在菌落周围变绿色在突变库中对应的单菌落（图3）。

粗酶液酶活测定复筛：将平板筛选得到的单菌落进行液体培养，测定粗酶液在pH6.0下的酶活，得到高活性的突变体，进一步扩大培养，表达、纯化，测定纯酶的最适pH。

实施例四：定点突变

定点突变原理：点突变质粒的构建采用DpnⅠ法（图2）。根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以pET-28a-gadB1质粒为模板，以设计的相关的正向引物及其互补引物（反向引物），通过PCR扩增出产物。

正向引物：AGCTACTTGGGTGGTAGTCTACCTACGATGGCC

反向引物：GGCCATCGTAGGTAGACTACCACCCAAGTAGCT

其中下划线部分是突变体基因编码的312位丝氨酸所对应的密码子。

PCR扩增体系为：质粒DNA0.5μL，5×Pimer star Buffer5μL，引物各0.5μL，dNTP2μL，Pimer star0.25μL，ddH₂O补至25μL，PCR扩增条件95℃变性1min，循环18次（95℃40s，50℃15s，68℃6min30s），72℃10min。

PCR产物用DpnⅠ酶在37℃处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过EcoRI单酶切和突变基因PCR扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到待表达的突变株。

实施例五：野生酶和突变酶的表达纯化

表达：BL21(DE3)/pET28a-gadB1、BL21(DE3)/pET28a-gadB1^{T17I/D294G/Q346H}、BL21(DE3)/pET28a-gadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}接种于含有30mg/L卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀至3.0～5.0，将其转接种到含有30mg/L卡拉霉素的装液量为500mL LB液体培养基的2L三角瓶中，控制初始OD₆₀₀为0.02，在37℃、200rpm下培养至OD₆₀₀在0.7～0.9范围内，加入1mM IPTG进行诱导，然后28℃、200rpm诱导表达培养8h。

提取：菌液在4000rpm、4℃的条件下，离心20min，弃上清液；然后加入40mL、pH8.0裂解缓冲液吹打混匀菌体，之后在4000rpm、4℃离心20min，倒掉上清液，重复2次。称量菌体的湿重，加入菌体湿重10倍体积的裂解缓冲液，超声破碎15min，向破碎液中加入1%Triton X-100（把膜上的目的蛋白分离下来）和1mM PMSF（防止目的蛋白分解），在冰上放置1h后，在4℃、12000rpm离心60min，收集上清即为粗酶液，最后用孔径0.22μm水系膜过滤，即得Ni柱上样样品。

纯化：采用Ni-NTA亲和层析柱对上一步所得的样品进行分离纯化。经过上样、漂洗和洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液，SDS-PAGE分析（图4），然后通过透析除去小分子即得到纯酶。测定纯酶的浓度。

所涉及缓冲液配制：

裂解缓冲液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl，1mM PMSF(溶解在无水乙醇中配成200mM的母液在-20℃中保存)，10mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。

漂洗缓冲液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl，1mM PMSF，20mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。

洗脱缓冲液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl，1mM PMSF，250mM咪唑，用NaOH调至pH8.0。

透析缓冲液：0.02M、pH4.6的HAC-NaAC缓冲液。

实施例六：野生酶和突变酶的最适pH测定

将上一步得到的纯酶液稀释至浓度为2.5mg/mL，然后分别进行酶促反应。酶促反应总体积为500μL，取490μL0.2M的不同pH(3.0～7.0)的缓冲液，其中含有0.01mM PLP、100mM L-谷氨酸钠，加入10μL酶液，在反应之前分别把缓冲液和酶液在40℃下预热5min，然后混匀，在40℃下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心，用5%三氯乙酸（TCA）稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。

得到的结果如附图6：相关的突变酶与野生型酶相比，有效pH作用范围拓宽；因此能够更好的运用突变体酶，在pH5.5～6.5的条件下，催化GABA的生物合成。

实施例七：野生酶和突变酶体外的催化能力比较

为了测定突变体酶在偏中性条件下的生物催化能力，将纯化的野生型的酶和突变体酶分别在pH6.5下催化L-谷氨酸钠发生脱羧反应2h，结果发现在pH6.5下，突变酶GadB1T17I/D294G/Q346H将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的10.6倍；突变酶GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.9倍。

Claims (9)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述突变基因编码的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID NO.2。

3.权利要求1所述的突变体，其特征在于其312位氨基酸由谷氨酸突变为丝氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求3所述突变基因编码的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID NO.4。

5.获得权利要求2所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于：在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。

6.获得权利要求5所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于：在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。

7.权利要求2或4所述突变体的指示剂平板筛选方法，其特征是：将突变库中的转化子转移到筛选板上，30℃培养10h后，挑取在菌落周围变绿色的单菌落。筛选板的配方为：在LB固体培养基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡那霉素、1/10000甲基红-亚甲基指示剂，待平板凝固后，在每个培养皿上涂布10μL1M IPTG，然后正面放置30min。

8.权利要求1或3所述突变体基因及其所编码氨基酸在生物合成GABA的应用。

9.一种生产权利要求2或4所述两种谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征是将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadB1^{T17I/D294G/Q346H}和gadB1^{T17I/D294G/E312S/Q346H}的高效表达。

Images