ES2564103T3 - Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro humano (sHASEGP) y un agente anticanceroso para uso en el tratamiento de un tumor, en la que; el agente anticanceroso es un anticuerpo o un vector de terapia génica; y el polipéptido hialuronidasa consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone como los aminoácidos 1-448 de la SEC ID Nº: 4, que corresponde a los aminoácidos 36-483 de la SEC ID Nº: 1, en el que: el polipéptido contiene al menos un resto de azúcar que está unido covalentemente a un resto asparragina (N) del polipéptido; y el polipéptido es catalíticamente activo.

Description

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expone en la SEC ID Nº: 6 o una secuencia de nucleótidos que incluye nucleótidos que codifican los aminoácidos 1509 de la SEC ID Nº: 1; un polipéptido que codifica una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta con la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEC ID Nº: 6; un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos que se expone como los aminoácidos 1-509 de la SEC ID Nº: 1; un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 75 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº: 1 o como los aminoácidos 1-448 de la SEC ID Nº: 4.
En particular, se describe el polipéptido sHASEGP con los dominios hialuronidasa que se indican en la SEC ID Nº: 4. El polipéptido es un polipéptido de una o dos cadenas. También se proporcionan porciones más pequeñas del mismo que conservan la actividad hialuronidasa. Los dominios hialuronidasa de las sHASEGP varían en tamaño y constitución, incluyendo inserciones y deleciones en bucles superficiales. Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio catalítico es una porción de una sHASEGP, como se define en este documento, y es homólogo a un dominio de otras secuencias de tipo hialuronidasa, tales como HYAL1, HYAL2, HYAL3, que se han identificado previamente; no se reconoció sin embargo, que una forma de cadena sencilla aislada del dominio hialuronidasa humano pudiera funcionar en ensayos in vitro. Los restos aspartato y glutamato necesarios para la actividad están presentes en motivos conservados.
Como se usa en este documento, un “dominio hialuronidasa neutro de una sHASEGP soluble” se refiere a un dominio beta-1,4-endoglucosaminidasa de una sHASEGP que presenta actividad hialuronidasa a pH neutro, es soluble en condiciones como se describen y comparte homología y características estructurales con los dominios hialuronidasa de la familia de glicosil-hidrolasas pero contiene secuencias adicionales en el extremo carboxi teminal que son necesarias para la actividad a pH neutro. Por tanto, es al menos la porción mínima del dominio que presenta actividad hialuronidasa como se evalúa mediante ensayos in vitro convencionales y permanece soluble. Se contemplan en este documento dichos dominios hialuronidasa y porciones catalíticamente activas de los mismos. También se proporcionan formas truncadas del dominio hialuronidasa que incluyen el fragmento más pequeño del mismo que actúa catalíticamente como una forma de cadena sencilla.
Un dominio hialuronidasa de una sHASEGP, cada vez que se hace referencia al mismo en este documento, incluye al menos una o todas de o cualquier combinación de o una porción catalíticamente activa de: un polipéptido glicoproteico ligado a N que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad reducida, moderada o elevada con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 6; un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N: 1; un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; y/o un dominio hialuronidasa de un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de la sHASEGP.
Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio hialuronidasa es una porción de una sHASEGP, como se define en este documento, y es homólogo a un dominio de otras sHASEGP. Como con la clase más grande de enzimas de la familia de hialuronidasas, los dominios catalíticos de sHASEGP comparten un alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos. Los restos Asp y Glu necesarios para la actividad están presentes en motivos conservados.
Por forma activa se entiende una forma activa in vivo y/o in vitro. Como se describe en este documento, el dominio hialuronidasa existe como una glicoproteína secretada soluble. Se muestra en este documento que, al menos in vitro, las formas de cadena sencilla de las sHASEGP y los dominios catalíticos o porciones enzimáticamente activas de las mismas (típicamente truncamientos C-terminales) presentan actividad hialuronidasa. Por lo tanto, se proporcionan en este documento formas aisladas de los dominios hialuronidasa de sHASEGP y su uso en ensayos de selección de fármacos in vitro para la identificación de agentes que modulen la actividad de las mismas.
Como se usa en este documento, el dominio catalíticamente activo de una sHASEGP se refiere al dominio endoglucosaminidasa activo a pH neutro como se define por la actividad in vitro hacia un sustrato de glicosaminoglicano.
Las sHASEGP de interés incluyen las que son activas frente a sulfatos de condroitina y proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) in vivo e in vitro; y las que son activas frente a hialuronano. Como se usa en este documento, una sHASEGP humana es una codificada por un ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, incluyendo todas las variantes alélicas y variaciones conservativas siempre que no sean variantes que se encuentren en otros mamíferos.
Como se usa en este documento, un ácido nucleico que codifica un dominio hialuronidasa o porción catalítica activa de una “sHASEGP” debe interpretarse que se refiere a un ácido nucleico que codifica sólo el dominio hialuronidasa de cadena sencilla detallado o una porción activa del mismo y no las otras porciones contiguas de la sHASEGP
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como una secuencia continua.
Como se usan en este documento, los términos “enfermedad” o “trastorno” se refieren a una afección patológica en un organismo que es el resultado de, por ejemplo, una infección o defecto genético, y que se caracteriza por síntomas identificables.
Como se usa en este documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ácido nucleico genómico, tal como ADN, que da como resultado más de un tipo de ARNm. Se proporcionan en este documento variantes de corte y empalme de sHASEGP.
Como se usa en este documento, el dominio hialuronidasa de una proteína sHASEGP se refiere al dominio hialuronidasa de una sHASEGP que presenta una actividad endoglucosaminidasa a pH neutro. Por lo tanto, es al menos la porción mínima de la proteína que presenta actividad endoglucosaminidasa como se evalúa por ensayos convencionales in vitro. Los dominios hialuronidasa humanos de la invención incluyen al menos una porción suficiente de secuencias de aminoácidos expuestas en la SEC ID Nº: 4 que presentan actividad endoglucosaminidasa.
También se contemplan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene actividad endoglucosaminidasa en un ensayo hialuronidasa in vitro y que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la longitud completa de un dominio hialuronidasa de un polipéptido sHASEGP, o que hibrida a lo largo de su longitud completa o a lo largo de al menos aproximadamente el 70%, 80% o 90% de la longitud completa con un ácido nucleico que codifica un dominio hialuronidasa, particularmente en condiciones de rigurosidad moderada, generalmente elevada.
Para los dominios hialuronidasa, los restos en la región N-terminal pueden ser críticos aunque no suficientes para su actividad. Se muestra en este documento que el dominio hialuronidasa de la sHASEGP es catalíticamente activo. Por lo tanto, el dominio hialuronidasa requiere generalmente los aminoácidos N-terminales del mismo para su actividad; la porción C-terminal puede estar truncada hasta el último resto cisteína aunque requiere aminoácidos adicionales para ser óptimamente activa. La cantidad que puede eliminarse puede determinarse empíricamente ensayando el polipéptido para determinar su actividad hialuronidasa en un ensayo in vitro que evalúe la escisión catalítica.
Por lo tanto, se contemplan porciones más pequeñas de los dominios hialuronidasa, particularmente los dominios de cadena sencilla de la misma que conservan actividad hialuronidasa. Dichas versiones más pequeñas son generalmente versiones truncadas C-terminales de los dominios hialuronidasa. Los dominios hialuronidasa varían en tamaño y constitución, incluyendo inserciones y deleciones en bucles superficiales. Dichos dominios presentan una estructura conservada, incluyendo al menos una característica estructural, tal como el donador de protones y/o otras características de dominios hialuronidasa de endoglucosaminidasas. Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio hialuronidasa es una porción de cadena sencilla de una sHASEGP, como se define en este documento, pero es homólogo en sus características estructurales y en la retención de una similitud u homología de secuencia con el dominio hialuronidasa de otras secuencias de tipo hialuronidasa. La glicoproteína presenta actividad hialuronidasa como una cadena sencilla.
Como se usa en este documento, por homólogo se entiende una identidad de secuencia de ácido nucleico superior al 25%, tal como del 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Si es necesario, se especificará el porcentaje de homología. Los términos “homología” e “identidad” se usan con frecuencia indistintamente. En general, las secuencias se alinean de modo que se obtenga el mayor orden de coincidencias (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) et al. (1988) Slam J Applied Math 48]: 1073).
Mediante la identidad de secuencia, se determina el número de aminoácidos conservados mediante programas de algoritmos de alineamiento convencionales y se usan con las penalizaciones por huecos por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridarían típicamente a una rigurosidad moderada o a una rigurosidad elevada a todo lo largo de la longitud del ácido nucleico o a lo largo de al menos aproximadamente el 70%, 80% o 90% de la molécula de ácido nucleico de longitud completa de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico que hibrida.
Puede determinarse si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos que tienen una “identidad” de al menos, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa “FASTA”, usando por ejemplo los parámetros por defecto como en
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nucleótidos contiguos, con frecuencia al menos 14 o 16 o 30 nucleótidos contiguos o nucleótidos modificados complementarios a la porción codificante de una molécula de ácido nucleico que codifica un gen de interés, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un dominio hialuronidasa de cadena sencilla de una sHASEGP.
Como se usa en este documento, una matriz se refiere a un grupo de elementos, tales como anticuerpos, que contiene tres o más miembros. Una matriz direccionable es una en la que los miembros de la matriz pueden identificarse, típicamente, por su posición en un soporte en fase sólida. Por lo tanto, en general los miembros de la matriz están inmovilizados en loci identificables separados en la superficie de una fase sólida.
Como se usa en este documento, un anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcialmente o totalmente de forma sintética, que incluye cualquier derivado de la misma que conserve la capacidad de unión específica del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo incluye cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o sustancialmente homólogo a un dominio de unión a inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen miembros de cualquier reivindicación de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
Como se usa en este documento, un fragmento de anticuerpo se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tiene una longitud inferior a la completa, que conserva al menos una porción de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab’, F(AB)2, Fv de cadena sencilla (scFV), FV, diacuerpos dsFV y fragmentos Fd. El fragmento puede incluir múltiples cadenas unidas entre sí, tal como mediante puentes disulfuro. Un fragmento de anticuerpo contiene generalmente al menos aproximadamente 50 aminoácidos y, típicamente, al menos 200 aminoácidos.
Como se usa en este documento, un fragmento de anticuerpo Fv está compuesto por un dominio pesado variable (VH) y un dominio ligero variable unidos por interacciones no covalentes.
Como se usa en este documento, un dsFV se refiere a un Fv con un enlace disulfuro intermolecular generado por ingeniería genética.
Como se usa en este documento, un fragmento F(AB)2 es un fragmento de anticuerpo que es el resultado de la digestión de una inmunoglobulina con pepsina a pH 4,0-4,5; puede expresarse de forma recombinante para producir el fragmento equivalente.
Como se usan en este documento, los fragmentos Fab son fragmentos de anticuerpo que son el resultado de la digestión de una inmunoglobulina con papaína; pueden expresarse de forma recombinante para producir el fragmento equivalente.
Como se usan en este documento, los scFV se refieren a fragmentos de anticuerpo que contienen una cadena ligera variable V y una cadena pesada variable (VH) conectadas covalentemente por un enlazador polipeptídico en cualquier orden. El enlazador es de una longitud tal que los dos dominios variables se enlazan sin una interferencia sustancial. Los enlazadores incluidos son restos (Gly-Ser)n con algunos restos Glu o Lys dispersados por todos los mismos para aumentar la solubilidad.
Como se usan en este documento, los anticuerpos humanizados se refieren a anticuerpos que están modificados para incluir secuencias de aminoácidos humanas de modo que la administración a un ser humano no provoque una respuesta inmune. Se conocen métodos para la preparación de dichos anticuerpos. Por ejemplo, para producir dichos anticuerpos, el hibridoma u otra célula procariota o eucariota tal como una E. coli o una célula CHO, que expresa ese anticuerpo monoclonal se altera mediante técnicas de ADN recombinante para expresar un anticuerpo en el que la composición de aminoácidos de la región no variable esté basada en anticuerpos humanos. Se han diseñado programas informáticos para identificar dichas regiones.
Como se usan en este documento, los diacuerpos son scFV diméricos; los diacuerpos tienen típicamente enlazadores peptídicos más cortos que los scFV y generalmente dimerizan.
Como se usa en este documento, la producción por medios recombinantes mediante el uso de métodos de ADN recombinante se refiere al uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Como se usa en este documento, el término “evaluar” pretende incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una sHASEGP, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual o de otro tipo indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y por supuesto no es necesario que las especies químicas detectadas realmente sean el propio producto de proteolisis, sino que pueden ser por ejemplo un derivado del mismo o alguna sustancia adicional.
Como se usa en este documento, la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o respuestas fisiológicas que son el resultado de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra
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y de la metástasis pueden eliminarse, reducirse o prevenirse mediante el tratamiento. Los ejemplos no limitantes de los sellos característicos incluyen la degradación descontrolada de la membrana basal y de la matriz extracelular proximal, migración, división y organización de las células endoteliales en nuevos capilares funcionales y la persistencia de dichos capilares funcionales.
Como se usan en este documento, las sales farmacéuticamente aceptables, ésteres u otros derivados de los conjugados incluyen cualquier sal, éster o derivado que pueda prepararse fácilmente por los especialistas en esta técnica usando métodos conocidos para dicha derivatización y que producen compuestos que pueden administrarse a animales o seres humanos sin efectos tóxicos sustanciales y que son principios activos farmacéuticos o profármacos.
Como se usa en este documento, un profármaco es un compuesto que, tras la administración in vivo se metaboliza o convierte de otro modo en la forma biológicamente, farmacéuticamente o terapéuticamente activa del compuesto. Para producir un profármaco, el compuesto activo farmacéutico se modifica de modo que el compuesto activo se regenera mediante procesos metabólicos. El profármaco puede estar diseñado para alterar la estabilidad metabólica
o las características de transporte de un fármaco, para enmascarar efectos secundarios o toxicidad, para mejorar el sabor de un fármaco o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. En virtud de los conocimientos de procesos farmacodinámicos y del metabolismo de fármacos in vivo, los especialistas en esta técnica, una vez conocido un compuesto farmacéuticamente activo, pueden diseñar profármacos del compuesto (véase, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nueva York, páginas 388-392).
Como se usa en este documento, un fármaco identificado mediante los métodos de selección proporcionados en este documento se refiere a cualquier compuesto que es un candidato para usar como compuesto terapéutico o candidato para el diseño de un compuesto terapéutico. Dichos compuestos pueden ser moléculas pequeñas, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas antisentido o ARNbc, tal como ARNi, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos recombinantes y otros compuestos de este tipo que pueden servir como candidatos a fármaco o compuestos candidato.
Como se usa en este documento, un peptidomimético es un compuesto que mimetiza la conformación y ciertas características estereoquímicas de la forma biológicamente activa de un péptido particular. En general, los peptidomiméticos están diseñados para mimetizar ciertas propiedades deseables de un compuesto, pero no las propiedades indeseables, tales como flexibilidad, que conducen a una pérdida de una conformación biológicamente activa y rotura de enlaces. Pueden prepararse peptidomiméticos a partir de compuestos biológicamente activos por sustitución de ciertos grupos o enlaces que contribuyen a las propiedades indeseables con bioisoésteres. Los especialistas en la técnica conocen bioisoésteres. Por ejemplo, el bioisoéster de metileno CH2S se ha usado como una sustitución de amida en análogos de enquefalina (véase, por ejemplo, Spatola (1983) págs. 267-357 en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. volumen 7, Marcel Dekker, Nueva York). La morfina, que puede administrarse por vía oral, es un compuesto que es un peptidomimético del péptido endorfina. Para los fines de este documento, los péptidos cíclicos se incluyen entre los peptidomiméticos.
Como se usa en este documento, una región promotora o elemento promotor se refiere a un segmento de ADN o ARN que controla la transcripción del ADN o ARN al que se une operativamente. La región promotora incluye secuencias específicas que son suficientes para el reconocimiento de una ARN polimerasa, su unión y el inicio de la transcripción.
Esta porción de la región promotora se denomina promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan esta actividad de reconocimiento, unión e inicio de la transcripción de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden actuar en cis o pueden ser sensibles a factores que actúan en trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación, pueden ser constitutivos o estar regulados. Los promotores ejemplares contemplados para el uso en procariotas incluyen los promotores de bacteriófagos T7 y T3.
Como se usa en este documento, un receptor se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintético. También puede hacerse referencia a los receptores en la técnica como antiligandos. Como se usan en este documento, los términos receptor y antiligando se usan indistintamente. Pueden usarse receptores en su estado no alterado o como agregados con otras especies. Pueden unirse receptores, covalentemente o no covalentemente, o en contacto físico con, a un miembro de unión, directa o indirectamente a través de una sustancia de unión específica o enlazador. Los ejemplos de receptores incluyen, pero sin limitación: anticuerpos, receptores de membrana celular, receptores de superficie y receptores de internalización, anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos tales como virus, células u otros materiales, fármacos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, péptidos, factores, lectinas, azúcares, polisacáridos, células, membranas celulares y orgánulos.
Los ejemplos de receptores y aplicaciones que usan dichos receptores incluyen, pero sin limitación: a) enzimas: proteínas de transporte específicas o enzimas esenciales para la supervivencia de microorganismos que podrían servir como dianas para selección de antibióticos [ligando]; b) anticuerpos: puede investigarse la identificación de un
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sitio de unión a ligando en una molécula de anticuerpo que se combine con el epítopo de un antígeno de interés; la determinación de una secuencia que mimetice un epítopo antigénico puede conducir al desarrollo de vacunas en las que el inmunógeno se basa en una o más de dichas secuencias o conducir al desarrollo de agentes de diagnóstico relacionados o compuestos útiles en tratamientos terapéuticos tales como enfermedades autoinmunes; c) ácidos nucleicos: identificación de ligandos, tales como proteínas o ARN, sitios de unión; d) polipéptidos catalíticos: polímeros, incluyendo polipéptidos que son capaces de promover una reacción química que implica la conversión de uno o más reactivos con uno o más productos; dichos polipéptidos incluyen generalmente un sitio de unión específico para al menos un reactivo o intermedio de reacción y una funcionalidad activa próxima al sitio de unión, en los que la funcionalidad es capaz de modificar químicamente el reactivo unido (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.215.899); e) receptores de hormonas: la determinación de los ligandos que se unen con alta afinidad a un receptor es útil en el desarrollo de terapias de reemplazo de hormonas, por ejemplo, la identificación de ligandos que se unen a dichos receptores puede conducir al desarrollo de fármacos para controlar la presión sanguínea; y f) receptores de opiato: la determinación de ligandos que se unen a los receptores de opiato en el cerebro es útil en el desarrollo de sustitutos menos adictivos para la morfina y fármacos relacionados.
Como se usa en este documento, una muestra se refiere a cualquier cosa que puede contener un analito para el que se desee un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un fluido biológico o un tejido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, esperma, líquido amniótico o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, habitualmente de una clase particular junto con su sustancia intercelular que forma uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o viral incluyendo tejidos conjuntivo, epitelial, muscular y nervioso. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y células individuales.
Como se usa en este documento: la rigurosidad de hibridación en la determinación del porcentaje de emparejamientos erróneos es de la forma siguiente: 1) alta rigurosidad: SSPE 0,1x, SDS al 0,1%, 65ºC 2) rigurosidad media: SSPE 0,2x, SDS al 0,1% SDS, 50°C 3) rigurosidad baja: SSPE 1,0x, SDS al 0,1 %, 50°C. Los especialistas en esta técnica saben que la etapa de lavado selecciona híbridos estables y también conocen los ingredientes del SSPE (véase, por ejemplo, Sambrook, E, F, Fritsch, T, Maniatis, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3, p. B. 13, véanse también numerosos catálogos que describen soluciones de laboratorio usadas comúnmente). El SSPE es NaCl 0,18 tamponado con fosfato a pH 7,4. Además, los especialistas en la técnica reconocen que la estabilidad de híbridos se determina por la Tm, que está en función de la concentración de ion sodio y la temperatura (Tm = 81,5ºC -16,6 + 0,41 (% G + C) -600/L)), de modo que los únicos parámetros en las condiciones de lavado críticos para la estabilidad del híbrido son la concentración de ion sodio en el SSPE (o SSC) y la temperatura.
Se entiende que pueden conseguirse rigurosidades equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativas. A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que usan condiciones de baja rigurosidad son de la forma siguiente (véase también Shilo y Weinberg, Proc. Natl. Acad Sci USA 78: 6789-6792 (1981)): Filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, SSC 5X, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 500 g/ml. El SSC (10x) es cloruro sódico 1,5 M y citrato de sodio 0,15 M ajustado a un pH de 7.
Las hibridaciones se realizan en la misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, ADN de esperma 100 VG/M, sulfato de dextrano al 10% (p/v) y se usa sonda marcada con 32P de 520 x 106 cpm. Los filtros se incubaron en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 40ºC y después se lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene SSC 2X, Tris-HCI 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y SDS al 0,1%. La solución de lavado se sustituye con solución recién preparada y se incuban 1,5 horas adicionales a 60ºC. Los filtros se transfirieron en seco y se exponen a autorradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer a película. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de baja rigurosidad que pueden usarse, por ejemplo, como se emplean para hibridaciones cruzadas entre especies).
A modo de ejemplo, y no como limitación, los procedimientos que usan condiciones de rigurosidad moderada incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, procedimientos que usan dichas condiciones de rigurosidad moderada de la forma siguiente: Filtros que contienen ADN se tratan previamente durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene SSC 6X, solución de Denhart 5X, SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 g/ml. Las hibridaciones se realizan en la misma solución y se usa sonda marcada con 32P 5-20 X 106. Los filtros se incuban en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55ºC y después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución que contiene SSC 1X y SDS al 0,1%. Los filtros se transfieren en seco y se exponen a autorradiografía. Otras condiciones de rigurosidad moderada que pueden usarse son bien conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X, SDS al 0,1%.
A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que usan condiciones de alta rigurosidad son de la forma siguiente: Se realiza una hibridación previa de filtros que contienen ADN durante de 8 horas a una noche a 65ºC en tampón compuestos por SSC 6X, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%,
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BSA al 0,02% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 500 g/ml. Los filtros hibridan durante 48 horas a 65ºC en mezcla de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 g/ml y sonda marcada con 32P de 5-20 X 106 CPM. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. Esto se sigue de un lavado en SSC 0,1 X a 50ºC durante 45 minutos antes de la autorradiografía. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de alta rigurosidad que pueden usarse.
El término sustancialmente idéntico o sustancialmente homólogo o similar varía con el contexto como entienden los especialistas en la técnica pertinente, y generalmente se refiere a una identidad de al menos el 60% o 70%, preferiblemente se refiere a de al menos el 80%, el 85% o más preferiblemente a de al menos el 90% y más preferiblemente de al menos el 95%.
Como se usa en este documento, sustancialmente idéntico a un producto significa sustancialmente similar de modo que la propiedad de interés permanece suficientemente sin cambios, de modo que el producto sustancialmente idéntico puede usarse en lugar del producto.
Como se usa en este documento, sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para parecer libre de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usadas por los especialistas en la técnica para evaluar dicha pureza, o suficientemente puro de modo que una purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas de la sustancia. Los especialistas en la técnica conocen métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Un compuesto sustancialmente químicamente puro puede ser sin embargo una mezcla de esteroisómeros o isómeros. En tales casos, una purificación adicional puede aumentar la actividad específica del compuesto.
Como se usa en este documento, una célula diana se refiere a una célula que expresa una sHASEGP in vivo.
Como se usa en este documento, una sustancia de ensayo (o compuesto de ensayo) se refiere a un compuesto químicamente definido (por ejemplo, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas/inorgánicas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, lípidos, polisacáridos, sacáridos o híbridos entre estas moléculas tales como glicoproteínas, etc.) o mezclas de compuestos (por ejemplo, una biblioteca de compuestos de ensayo, extractos naturales o sobrenadantes de cultivo, etc.) cuyo efecto sobre una sHASEGP, particularmente una forma de cadena sencilla que incluye el dominio hialuronidasa o una porción suficiente del mismo para la actividad, como se determina por un método in vitro, tal como los ensayos proporcionados en este documento.
Como se usan en este documento, las expresiones agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o quimioterápico se refieren a fármacos convencionales y terapias farmacológicas, incluyendo vacunas, que son conocidos por los especialistas en la técnica. Se conocen bien en la técnica agentes radioterápicos.
Como se usa en este documento, el tratamiento se refiere a cualquier forma en la que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad se mejoren o se alteren beneficiosamente de otro modo.
El tratamiento también incluye cualquier uso farmacéutico de las composiciones de este documento.
Como se usa en este documento, un vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en células para la expresión o replicación del mismo. Los vectores permanecen típicamente episomales, pero pueden diseñarse para lograr la integración de un gen o porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que sean cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y uso de dichos vehículos se conoce bien por los especialistas en la técnica. Un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de lograr la expresión de dichos fragmentos de ADN. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula hospedadora apropiada, dé como resultado la expresión del ADN clonado. Los especialistas en la técnica conocen bien vectores de expresión apropiados e incluyen los que pueden replicarse en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episomales o los que se integran en el genoma de células hospedadoras.
Como se usa en este documento, una secuencia de unión a proteínas se refiere a una proteína o secuencia peptídica que es capaz de la unión específica a otra proteína o secuencias peptídicas, generalmente, a un conjunto de proteínas o secuencias peptídicas o a una proteína o secuencia peptídica particular.
Como se usa en este documento, un marcador epitópico se refiere a una extensión corta de restos aminoacídicos que se corresponde con un epítopo para facilitar el análisis bioquímico e inmunológico posterior de la proteína o péptido marcado con epítopo. El marcaje con epítopo se consigue incluyendo la secuencia del marcador epitópico
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abreviado como Neu5Ac, NeuAc, o NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N-acetilo del NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:21811-21819. También se incluyen ácidos siálicos sustituidos en posición 9 tales como 9-O-C1-C6 acil-Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico véase, por ejemplo, Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N.Y. (1992)). La síntesis y uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialación se describe en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992.
Como se usa en este documento, la PNGasa se refiere a una N-glicosidasa F específica de Péptido de Asparragina, tal como la péptido-N-glicosidasa F de Flavobacterium maningoseptum. Las enzimas PNGasa se caracterizan por su especificidad hacia oligosacáridos ligados a N más que ligados a O. La caracterización de la eficacia de PNGasa puede definirse tanto por electroforesis de SDS PAGE o electroforesis de carbohidratos asistida por fluorescencia.
Como se usa en este documento, una sialación sustancialmente terminada se refiere a oligosacáridos ligados a N que terminan con resto ácido siálico como azúcar terminal. Pueden identificarse ácidos siálicos terminales mediante análisis FACE de carbohidratos liberados después del tratamiento con neuraminidasa.
La vida circulatoria de las glicoproteínas en sangre es altamente dependiente de la composición y estructura de sus grupos carbohidrato ligados a N. Este hecho es de una importancia directa para las glicoproteínas terapéuticas que pretenden administrarse por vía parenteral. En general, la semivida circulatoria máxima de una glicoproteína requiere que sus grupos carbohidrato ligados a N terminen en la secuencia NeuAc-Gal-GlcNAc. Sin el ácido siálico terminal (NeuAc) la glicoproteína se aclara rápidamente de la sangre mediante un mecanismo que implica el reconocimiento de los restos N-acetilgalactosamina (GalNAc) o galactosa (Gal) subyacentes (Goocheeetal. (1991) Biol/Technology 9:1347-1355). Por esta razón, asegurar la presencia de ácido siálico terminal en grupos carbohidrato ligados a N de glicoproteínas terapéuticas es una consideración importante para su desarrollo comercial.
Las glicoproteínas circulantes están expuestas a sialidasas (o neuraminidasa) que pueden eliminar los restos ácido siálico terminales. Típicamente, la eliminación del ácido siálico expone restos galactosa y estos restos se reconocen y se unen por receptores específicos de galactosa en los hepatocitos (revisado en Ashwell y Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51: 531). El hígado también contiene otros receptores específicos de azúcar que median la eliminación de glicoproteínas de la circulación. Las especificidades de dichos receptores también incluyen Nacetilglucosamina, manosa, fucosa y fosfomanosa. Las glicoproteínas eliminadas por los receptores galactosa de los hepatocitos experimentan una degradación sustancial y después entran en la bilis; las glicoproteínas eliminadas por el receptor de manosa de células de Kupffer entran en el sistema reticuloendotelial (revisado en Ashwell y Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51:53).
Como se usa en este documento, la expresión activa a pH Neutro se refiere a una glicoproteína sHASEGP con actividad catalítica hacia un sustrato de glicosaminoglicano in vitro a un pH de entre 5 y 8 en condiciones de sal menores de 150 mM y potencia tamponante menor de 50 mM.
Como se usa en este documento, una solución estabilizada se refiere a una sHASEGP que conserva más del 60% de su actividad inicial después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 30 días.
Como se usa en este documento, a menos que se especifique otra cosa, una unidad se expresa en unidades reductoras de turbidez (TRU). Una TRU se define como la cantidad de actividad hiauloronidasa necesaria para reducir la turbidez de una solución acidificada de ácido hialurónico y es equivalente a las unidades U.S.P./National Formulary (NF XIII) (NFU). El ensayo enzimático de tipo ELISA descrito en este documento puede relacionarse con las unidades TRU, NFU y USP a través de una curva patrón de una muestra de hialuronidasa (por ejemplo, patrón de USP o WHO) estandarizada a través de la U.S.P. Por lo tanto, las actividades enzimáticas determinadas mediante el ensayo enzimático de tipo ELISA son en realidad TRU relativas, puesto que la actividad enzimática no se mide realmente usando el ensayo turbidimétrico (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172: 367).
Como se usa en este documento, la potencia se define por la cantidad de proteína sHASEGP necesaria para degradar un sustrato in vitro basándose en una Unidad Reductora de Turbidez o Unidad Reductora de Turbidez Relativa.
Como se usa en este documento, la actividad específica se refiere a unidades de actividad por mg de proteína. La cantidad de proteína sHASEGP se obtiene por la absorción de una solución de sHASEGP a 280 nm asumiendo un coeficiente de extinción molar de aproximadamente 1,7, en unidades de M-1 cm-1 .
El polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente en biomateriales, en biotecnología y medicina principalmente debido a que el PEG es un polímero biocompatible, no tóxico, no inmunogénico y soluble en agua (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72,1997). En el área de suministro de fármacos, se han usado ampliamente
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Las moléculas poliméricas preferidas son moléculas poliméricas no tóxicas tales como (m)polietilenglicol (mPEG), que requiere además una química relativamente simple para su acoplamiento covalente a grupos de unión en la superficie de la enzima.
Los óxidos de polialquileno (PAO) que se observan generalmente, tales como óxidos de polietileno, tales como PEG y especialmente mPEG son las moléculas poliméricas preferidas ya que estas moléculas poliméricas, en comparación con polisacáridos tales como dextrano, pululano y similares, tienen pocos grupos reactivos capaces de entrecruzarse, no siendo deseable.
B. PERFILES DE EXPRESIÓN TISULAR DE sHASEGP
Aunque anteriormente se pensaba que era específica de testículo, la sHASEGP humana se expresa en múltiples tejidos en seres humanos cuando se usan técnicas más sensibles tales como RT-PCR. El transcrito de sHASEGP se encuentra en médula (cerebro), endotelio microvascular, próstata, mama, retina, melanocitos humanos combinados, corazón fetal y útero gestante. La sHASEGP también se expresa en tumores de células germinales. Generalmente es necesaria la detección basada en RT-PCR de transcritos de sHASEGP para detectar niveles en tejidos distintos de testículo.
C. ENSAYOS PARA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE sHASEGP
ENSAYO DE MICROTITULACIÓN TURBIDOMÉTRICO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD HIALURONIDASA
La actividad hialuronidasa puede detectarse por medio de un ensayo turbidimétrico modificado en solución de suero acidificado. Los reactivos necesarios son los siguientes:
Agua desionizada 2X esterilizada por UV o agua estéril para irrigación
Braun R5000-01
Hylumed Medical -Hialuronato Sódico, HA de Alto Peso Molecular
Genzyme Advanced Biomaterials 4876
Patrón de Referencia de Hialuronidasa
USP 31200
Acetato Potásico, Granular, USP, ACS
JTBaker 2914-01
Ácido Acético, Glacial, 99+ %
Sigma A-6283
Fosfato Sódico Monobásico Monohidrato, USP Granular
Mallinkrodt 7774
Fosfato Sódico Dibásico Anhidro, USP
Mallinkrodt 7771
Cloruro Sódico, Cristales, GR, ACS
EMScience SX0420-5
Hidrolizado Enzimático de Gelatina
Sigma G-0262
Suero de Caballo, rebaño donante, ensayo de cultivo celular, cultivo de hibridoma ensayado, origen de Estados Unidos
Sigma H-1270
Albúmina de Suero Humano al 20 %
Griffols
Ácido Clorhídrico, Reactivo ACS
Sigma H-7020
Cloruro de Calcio, Dihidrato, Granular USP, -FCC
JTBaker 1336-01
Se preparan los siguientes reactivos: Solución de Tampón Acetato-14,0 g de acetato potásico y 25,0 ml de ácido acético glacial en agua para hacer 1000 ml. Solución de Tampón Fosfato-2,5 g de fosfato sódico monobásico, 1,0 g de fosfato sódico dibásico anhidro y 8,2 g de cloruro sódico en agua para hacer 1000 ml. Solución Madre de Diluyente Enzimático-500 ml de Solución de Tampón Fosfato con 500 ml de agua. Solución de Trabajo de Diluyente Enzimático-33 mg de gelatina hidrolizada en 50 ml de solución madre de diluyente enzimático preparada en un intervalo de 2 horas antes del uso. Solución de Tampón de Estabilización de Muestras (Solución "SSB")-125 l de una Solución de Albúmina Sérica Humana al 20% y 50 l de una solución de Cloruro de Calcio 1 M en 50 ml de Solución de Trabajo de Diluyente Enzimático y se mezcla minuciosamente. Solución Madre de Suero-Diluir 1 volumen de Suero de Caballo con 9 volúmenes de Solución de Tampón Acetato. Ajustar con ácido clorhídrico 4 N a un pH de 3,1 y dejar la solución reposar a temperatura ambiente durante de 18 a 24 h. Almacenar la solución a 4ºC y usar en 30 días. Solución de Trabajo de Suero-10 ml de la Solución Madre de Suero en 30 ml de la Solución de Tampón Acetato ajustados a temperatura ambiente. Solución Madre de Ácido Hialurónico-Ácido Hialurónico Sódico
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a una concentración de 5,0 mg/ml en agua. Solución de Trabajo de Ácido Hialurónico-0,75 ml de la Solución Madrede Ácido Hialurónico en 4,25 ml de la Solución de Tampón Fosfato. Solución Madre Convencional-Un recipiente de Hialuronidasa Patrón de Referencia USP a una concentración de 1000 Unidades/ml en agua, dividida en alícuotas en porciones de 50 l y almacenada a -20ºC. Solución de Trabajo Convencional-40 l de Solución Madre
5 Convencional en 960 l de Solución de Trabajo de Diluyente Enzimático fría para obtener una solución que tiene una concentración conocida de 40 Unidades/ml, preparada inmediatamente antes del uso en el ensayo.
Todas las muestras enzimáticas se diluyen en una placa de 96 pocillos de “Baja Unión a Proteína” de acuerdo con las siguientes directrices:
10 a) El intervalo de sensibilidad máxima de este ensayo está entre 10-30 Unidades/ml. Para minimizar el número de veces que debe repetirse un ensayo para obtener resultados que estén dentro del intervalo, se determina primero el número aproximado de unidades totales/ml para la muestra y después se selecciona una dilución (número absoluto) de modo que la concentración final sea de aproximadamente 20 Unidades/ml.
15 b) Los volúmenes de Muestra Mínimos necesarios para realizar un ensayo son los siguientes: Fracciones FPLC = 50 l, Sobrenadantes de Cultivo Tisular = 1 ml, Material Purificado/Concentrado/Etapa Final = 10 l.
c) Para muestras con diluciones seriadas, se realizan diluciones 1:10 en la placa de 96 pocillos de “Baja Unión a 20 Proteínas” por triplicado por pipeteo de 360 l de la solución “SSB” y 40 l de la muestra en cada pocillo.
Para la preparación de Patrón USP se prepara la Curva Patrón de USP en la placa de 96 pocillos de “Baja Unión a Proteína” de la forma siguiente:
Curva Patrón USP
Sol. de Diluente Enzimático Sol. de Trabajo Convencional Conc. Final (en Pocillos: Patrón: (en l):
Unidades/ml):(en l):
A1-A3 St01 0 100 40 B1-B3 St02 20 80 32 C1-C3 St03 40 60 24 D1-D3 St04 60 40 16 E1-E3 St05 80 20 8 F1-F3 St06 90 10 4 G1-G3 St07 100 0 0
25 Para la preparación del control de Ácido Hialurónico en las columnas 1-3, se prepara el Control de H.A. en la placa de 96 pocillos “de Fondo Plano” de la forma siguiente:
Controles de H.A.: Sol. de Trabajo de Ácido Hialurónico Sol. de Trabajo de Diluyente Enzimático Pocillos: Control: (en l):
(en l):
H1-H3 Co01 0 60
30 La Placa de Reacción: se pipetean 30 l por pocillo de Solución de Trabajo de Ácido Hialurónico usando una pipeta de transferencia de 8 canales de 50 l en una placa de microtitulación de 96 pocillos “de Fondo Plano”, dejando vacíos los pocillos H1-H3. Se pipetean 60 l/pocillo de Solución de Trabajo de Diluyente Enzimático en los pocillos H1-H3 de la misma placa como el control de HA.
35 Solución de Trabajo de Suero: se dispensan 40 ml de Solución de Trabajo de Suero en una cubeta de transferencia y próxima al termobloque.
Etapa de precalentamiento: Una vez que se han preparado ambas placas, la placa de 96 pocillos de Baja Unión a Proteína que contiene las muestras diluidas, patrones, controles y la placa de 96 pocillos de fondo plano que 40 contiene la Solución de Trabajo de Ácido Hialurónico se colocan en un termobloque y se deja que se calienten durante 5 min a 37ºC.
La Reacción se inicia mediante la adición de Enzima a Sustrato: 30 l de la placa de enzima en todos los pocillos de la columna nº 1 de la placa de fondo plano de 96 Pocillos (que contiene el sustrato) usando una pipeta de 8 canales 45 de 5-50 l. La mezcla de reacción de Enzima/Sustrato se aspira 5 veces (retirando la solución hacia arriba y hacia abajo con la transferencia durante los primeros 15 segundos para asegurar una mezcla de muestra completa. Después de mezclar la enzima y el sustrato, las puntas se expulsan y se carga un nuevo conjunto de puntas en la pipeta de transferencia para la siguiente columna. Se reinicia un temporizador y a tiempo (t) = 0:30, se repite este proceso para la columna 2. En el siguiente intervalo de 30 segundos (t) = 1:00, se repite este proceso para la
50 columna 3. Este proceso se repite desplazándose de izquierda a derecha a través de la placa, cada 30 segundos hasta que todos los pocillos contengan tanto enzima como sustrato.
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identificadas como cebadores para amplificar por PCR secuencias a partir de una muestra de ácido nucleico (ARN o ADN, generalmente una genoteca de ADNc) a partir de una fuente apropiada (por ejemplo, testículo, próstata, mama).
Puede realizarse una PCR, por ejemplo, mediante el uso de un termociclador Perkin-Elmer Cetus y Taq polimerasa (Gene Amp). El ADN que se amplifica puede incluir ARNm, o ADNc o ADN genómico de cualquier especie eucariota. Se puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes para el uso en las reacciones de PCR.
También es posible variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación usadas en el cebado de las reacciones de PCR para amplificar homólogos de ácido nucleico (por ejemplo, para obtener secuencias de polipéptido sHASEGP de especies distintas de seres humanos o para obtener secuencias humanas con homología con polipéptido sHASEGP), permitiendo mayores o menores grados de similitud de secuencia de nucleótidos entre la secuencia de nucleótidos conocida y el homólogo de ácido nucleico que se está aislando. Para hibridación cruzada entre especies, se usan condiciones de baja rigurosidad a rigurosidad moderada. Para hibridación en la misma especie, se usan condiciones de moderadamente rigurosas a altamente rigurosas. Las condiciones pueden determinarse empíricamente.
Después de la amplificación con éxito del ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia polipeptídica de sHASEGP identificada o de un ácido nucleico que codifica toda o una porción de un homólogo polipeptídico de sHASEGP, ese segmento puede clonarse molecularmente y secuenciarse, y usarse como sonda para aislar un clon de ADNc o genómico completo. Esto a su vez permite la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteico para su análisis funcional. Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos, puede determinarse una fase de lectura abierta que codifica el producto proteico del gen de polipéptido sHASEGP por cualquier método bien conocido en la técnica para determinar fases de lectura abiertas, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente para el análisis de secuencias de nucleótidos. Una vez que se define una fase de lectura abierta, es rutinario determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la fase de lectura abierta. De este modo, pueden identificarse las secuencias de nucleótidos de los genes de polipéptidos sHASEGP completos, así como las secuencias de aminoácidos de proteínas polipeptídicas sHASEGP y análogos.
Cualquier célula eucariota puede servir potencialmente como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen de polipéptido sHASEGP. Los ácidos nucleicos pueden aislarse a partir de vertebrados, mamíferos, seres humanos, porcinos, bovinos, felinos, aves, equinos, caninos, así como fuentes de primates adicionales, insectos, plantas y otros organismos. El ADN puede obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una “genoteca” de ADN), por síntesis química, por clonación de ADNc
o mediante la clonación de ADN genómico o fragmentos del mismo, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D. M. Ed., 1985, DNA Cloning : A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino Unido Vol. 1,11. Los clones derivados de ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrónicas además de las regiones codificantes; los clones derivados de ADNc contendrán solamente secuencias exónicas. Para cualquier fuente, el gen se clona en un vector adecuado para la propagación del mismo.
En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado.
El ADN puede escindirse en sitios específicos usando diversas enzimas de restricción.
Como alternativa, se puede usar ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN o el ADN puede romperse físicamente, por ejemplo, por sonicación. Los fragmentos de ADN lineal pueden separarse después de acuerdo con el tamaño mediante técnicas convencionales, incluyendo pero sin limitación, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.
Una vez que se generan los fragmentos de ADN, la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado puede conseguirse de varias formas.
Por ejemplo, una porción del gen de polipéptido sHASEGP (de cualquier especie) (por ejemplo, un producto de amplificación de PCR obtenido como se ha descrito anteriormente o un oligonucleótido que tiene una secuencia de una porción de la secuencia de nucleótidos conocida) o su ARN específico, o un fragmento del mismo, puede purificarse y marcarse y los fragmentos de ADN generados pueden explorarse mediante hibridación de ácido nucleico con la sonda marcada (Benton y Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein y Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961 (1975)). Los fragmentos de ADN con una homología sustancial con la sonda hibridarán. También es posible identificar el fragmento apropiado mediante digestión o digestiones con enzimas de restricción y la comparación de los tamaños de fragmento con los esperados de acuerdo con un mapa de restricción conocido, si dicho mapa está disponible, o por análisis de secuencia de ADN y comparación con la secuencia de nucleótidos conocida de polipéptido sHASEGP. Puede realizarse una selección adicional en base a las propiedades del gen. Como alternativa, la presencia del gen puede detectarse mediante ensayos basados en las propiedades físicas,
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químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, pueden seleccionarse clones de ADNc o clones de ADN que seleccionen por hibridación el ARNm apropiado que produce una proteína que, por ejemplo, tiene una migración electroforética, un comportamiento de concentración isoeléctrica, mapas de digestión proteolítica, propiedades antigénicas, actividad hialuronidasa similares o idénticas. Si está disponible un anticuerpo antipolipéptido sHASEGP, la proteína puede identificarse por unión de anticuerpo marcado con los clones que sintetizan supuestamente el polipéptido sHASEGP en un procedimiento de tipo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).
Las alternativas para aislar el ADN genómico de polipéptido sHASEGP incluyen, pero sin limitación, sintetizar químicamente la secuencia génica a partir de una secuencia conocida o convertir el ADNc en el ARNm que codifique el polipéptido sHASEGP.
Por ejemplo, el ARN para clonar ADNc del gen de polipéptido sHASEGP puede aislarse de células que expresan la proteína. Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden insertarse después en un vector de clonación apropiado. Pueden usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos tales como derivados de plásmidos pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, por ligación del fragmento de ADN en un vector de clonación que tenga extremos terminales cohesivos complementarios.
Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado por ligación de secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos terminales del ADN; estos enlazadores ligados pueden incluir oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de polipéptido sHASEGP pueden modificarse por formación de colas homopoliméricas.
Las moléculas recombinantes pueden introducirse en células hospedadoras por transformación, transfección, infección, electroporación, precipitación con calcio y otros métodos, de modo que se generen muchas copias de la secuencia génica.
En realizaciones específicas, la transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de polipéptido sHASEGP aislado, ADNc o secuencias de ADN sintetizadas, permite la generación de múltiples copias del gen.
Por lo tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades por cultivo de transformantes, aislamiento de las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperación del gen insertado a partir del ADN recombinante aislado.
E. VECTORES, PLÁSMIDOS Y CÉLULAS QUE CONTIENEN ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UN POLIPÉPTIDO SHASEGP O DOMINIO HIALURONIDASA DEL MISMO Y EXPRESIÓN DE VECTORES DE POLIPÉPTIDOS SHASEGP Y CÉLULAS
Para la expresión recombinante de uno o más de los polipéptidos sHASEGP, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sHASEGP puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transfección y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden suministrarse mediante el promotor nativo para genes de sHASEGP y/o sus regiones flanqueantes.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica las sHASEGP que pueden introducirse en un sistema de expresión capaz de producir una sHASEGP soluble activa a pH neutro.
También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas y los vectores adecuados para el uso en las mismas.
Se proporcionan células eucariotas, incluyendo Células de Ovario de Hámster Chino deficientes en dihidrofolato reductasa (DG44), que contienen los vectores. Las células adecuadas incluyen células de levadura, células fúngicas, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir un polipéptido sHASEGP
o dominio Hialuronidasa del mismo mediante (a) cultivo de las células descritas anteriormente en condiciones por las que el polipéptido sHASEGP codificado o dominio hialuronidasa del polipéptido sHASEGP se expresa por la célula y, después (b) recuperación de la proteína de dominio hialuronidasa expresada. En las realizaciones ejemplificadas, el dominio hialuronidasa se secreta en el medio.
En una realización, se proporcionan vectores que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad Hialuronidasa y contiene toda o una porción de sólo el dominio hialuronidasa, o múltiples copias
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PURIFICACIÓN DE SHASEGP
Pueden cultivarse células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos de sHASEGP en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína purificada a partir del cultivo celular. La proteína producida mediante una célula recombinante se secreta. Como se entenderá por los especialistas en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contienen sHASEGP con secuencias señal que faciliten la secreción directa de sHASEGP a través de una membrana celular procariota o eucariota. Otras construcciones recombinantes pueden unir la sHASEGP a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles (Kroll D J et al (1993) DNA Cell Biol 12: 441-53; consúltese la discusión de vectores a continuación que contienen proteínas de fusión).
La sHASEGP también puede expresarse como proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de proteína. Dichos dominios de facilitación de la purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos de quelación de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle Wash). La inclusión de secuencias enlazadoras escindibles tales como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif.) entre el dominio de purificación y la sHASEGP es útil para facilitar la purificación. Un vector de expresión de este tipo proporciona la expresión de una proteína de fusión que comprende una sHASEGP y contiene un ácido nucleico que codifica 6 restos histidina seguido de tiorredoxina y un sitio de escisión de enteroquinasa. Los restos histidina facilitan la purificación sobre IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath et al (1992) Protein Expression and Purification 3: 263281), mientras que el sitio de escisión enteroquinasa proporciona un medio para purificar la quimiocina a partir de la proteína de fusión.
Además de la producción recombinante, pueden producirse fragmentos de sHASEGP mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida (consúltese Stewart et al (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, W H Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154). La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. Puede conseguirse una síntesis automática, por ejemplo, usando un sintentizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City Calif.) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Diversos fragmentos de sHASEGP pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.
Se generan vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes, o porciones de los mismos de un polipéptido sHASEGP, por ejemplo, subclonando las porciones codificantes en el sitio de restricción de EcoR1 de cada uno de los tres vectores PGEX (vectores de expresión de glutatión S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 7: 31-40 (1988)). Esto permite la expresión de productos en la fase de lectura correcta. Los vectores y sistemas ejemplares para la expresión de los dominios hialuronidasa de los polipéptidos sHASEGP incluyen los vectores de Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, en Invitrogen, San Diego, CA), particularmente los diseñados para la secreción de las proteínas codificadas. La proteína también puede expresarse citoplásmicamente, tal como en los cuerpos de inclusión. Se describe en los ejemplos un vector ejemplar.
Los plásmidos para la transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, la patente de Estados Unidos 4.952.496; disponibles en Novagen, Madison, WI; véase también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema).
Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor lac de T7, el terminador de T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor de lac; pET 12A-C, que contiene el promotor de T7, el terminador de T7 y la señal de secreción OMPT de E. coli; y pET 15B y PET19B (Novagen, Madison, Wi), que contienen una secuencia líder marcada con His para uso en la purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna; la región promotora lac de T7 y el terminador de T7.
Los vectores se introducen en células hospedadoras, tales como células de Pichia y células bacterianas, tales como
E. coli, y las proteínas se expresan en las mismas. Las cepas de Pichia ejemplares incluyen, por ejemplo, GS115. Los hospedadores bacterianos ejemplares contienen copias cromosómicas de ADN que codifica la ARN polimerasa de T7 unida operativamente a un promotor inducible, tal como el promotor LACUV (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 4.952.496). Dichos hospedadores incluyen, pero sin limitación, la cepa de E. coli lisogénica BL21 (DE3).
Los dominios, derivados y análogos de sHASEGP pueden producirse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez que se identifica una célula recombinante que expresa un polipéptido sHASEGP o un dominio, fragmento o derivado del mismo, el producto génico individual puede aislarse y analizarse. Esto se consigue mediante ensayos basados en las propiedades físicas y/o funcionales de la proteína, incluyendo, pero sin limitación, marcaje radioactivo del producto seguido de análisis mediante electroforesis en gel, inmunoensayo, entrecruzamiento con producto marcado con marcador y ensayos de actividad proteolítica.
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182, 1-8). Se pueden resolver ciertos isómeros de oligosacáridos usando HPAEC. Los restos fucosa desplazarán las posiciones de elución antes en el cromatograma de HPAEC, mientras que los restos ácido siálico adicionales aumentarán el tiempo de retención. El tratamiento simultáneo de glicoproteínas cuyas estructuras de oligosacáridos se conocen (por ejemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida -1, ovoalbúmina, ARNasa B, transferrina) puede facilitar la asignación de los picos de oligosacáridos. Los oligosacáridos recogidos pueden caracterizarse por una combinación de análisis de composición y de enlaces por metilación (Waegheet. al; (1983), Carbohydr Res. 123, 281-304), asignándose las configuraciones anoméricas mediante espectroscopía de RMN (Van Halbeek (1993) en Methods Enzymol 230).
Como alternativa, pueden identificarse oligosacáridos mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluorescencia (FACE) Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281.
G. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE RESTOS DE AZÚCARES LIGADOS A N EN sHASEGP
La determinación de si una proteína está de hecho glicosilada es la etapa inicial en el análisis de glicanos de glicoproteínas. La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) se ha convertido en el método de elección como la etapa final antes de la secuenciación de proteínas. Las proteínas glicosiladas migran con frecuencia como bandas difusas mediante SDS-PAGE. Una disminución marcada en el ancho de banda y un cambio en la posición de migración después del tratamiento con péptido-N4-(N-acetil-Dglucosaminil)asparragina amidasa (PNGasa F) se considera diagnóstico de glicosilación ligado a N. Si los otros tipos de glicosilación son predominantes deben usarse otras estrategias. Los métodos de transferencia de lectina proporcionan una estrategia que es independiente de la clase de glicosilación (N frente a O). Las lectinas, proteínas de unión a carbohidratos de diversos tejidos vegetales, tienen tanto una alta afinidad como una estrecha especificidad por un amplio intervalo de epítopos de azúcares definidos que se encuentran en glicanos de glicoproteínas (Cummings, R. D. (1994) Methods in Enzymol. 230, 66-86). Cuando se conjugan con biotina o digoxigenina, pueden identificarse fácilmente sobre transferencias de membrana a través de una reacción colorimétrica que utiliza avidina o anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (Haselbeck, et al. (1993) Methods in Mol. Biol. 141, 161-173), análoga a las reacciones de anticuerpo secundario-fosfatasa alcalina empleadas en transferencias de Western. La exploración con un panel de lectinas con una especificidad bien definida puede proporcionar una información considerable acerca del complemento de carbohidratos de una glicoproteína. De forma importante, la amplificación del desarrollo de color es lo bastante alta para que puedan observarse fácilmente 10-50 ng de una glicoproteína en una transferencia de membrana de un SDS-PAGE. Aunque las lectinas presentan una afinidad muy elevada por sus ligandos afines, algunas ponen de manifiesto una avidez significativa por epítopos estructuralmente relacionados. Por lo tanto, es importante señalar cuidadosamente la posibilidad de reactividad cruzada cuando se selecciona un panel de lectinas y aplicar las que tengan la mayor probabilidad de diferenciar individualmente glicanos ligados a N complejos, híbridos y ricos en manosa de estructuras ligadas a O.
También puede usarse el análisis de monosacáridos para determinar si la sHASEGP está glicosilada y, como en el caso del análisis de lectina, proporciona información adicional sobre características estructurales. El análisis cuantitativo de la composición de monosacáridos i) identifica proteínas glicosiladas, ii) proporciona la proporción molar de azúcares individuales respecto a proteína, iii) sugiere, en algunos casos, la presencia de clases de oligosacáridos, iv) es la primera etapa en el diseño de una estrategia de elucidación estructural y v) proporciona una medida de la consistencia de producción para compuestos terapéuticos de glicoproteína recombinante. En los últimos años se ha usado ampliamente la cromatografía de intercambio aniónico a alto pH con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) para determinar la composición de monosacáridos (Townsend, et al. (1995) en Carbohydrate Analysis: High-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis (Z. E1 Rassi ed.) págs. 181-209). Más recientemente, se han introducido métodos de marcaje basados en fluoróforos y muchos están disponibles en forma de kit. Una ventaja diferente de los métodos fluorescentes es un aumento en la sensibilidad (50 veces). Una desventaja potencial es que diferentes monosacáridos pueden demostrar diferente selectividad por el fluoróforo durante la reacción de acoplamiento, en el hidrolizado o en la mezcla patrón externa. Sin embargo, el aumento en la sensibilidad y la capacidad para identificar qué monosácaridos están presentes a partir de una pequeña porción de la cantidad total de glicoproteína disponible, así como el potencial de una mayor sensibilidad usando fluorescencia inducida por láser hace que esta estrategia sea atractiva.
El análisis de la composición de monosacáridos de pequeñas cantidades de sHASEGP se realiza mejor sobre membranas de PVDF (PSQ) después de electrotransferencia (Weitzhandleret al, (1993) J. Biol. Chem. 268, 51215130) o si se van a analizar alícuotas más pequeñas sobre transferencias puntuales. El PVDF es una matriz ideal para análisis de carbohidratos puesto que ni los mono-ni los oligosacáridos se unen a la membrana, una vez liberados por hidrólisis ácida o enzimática.
El análisis de FACE es un medio eficaz para detectar perfiles de glicosilación de sHASEGP. La generación de perfiles de oligosacáridos ligados a N FACE® (Prozyme) con geles de oligosacáridos al 30% es un mecanismo de este tipo. Los oligosacáridos escindidos a partir de 100 g de glicoproteínas por digestión enzimática con N-Glicanasa (también conocida como PNGasa), marcados usando el fluoróforo ANTS y separados por electroforesis pueden usarse para la detección de perfiles de glicosilación de sHASEGP. Las posiciones relativas de las bandas
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