KR20210072059A - 암을 치료하기 위한 항-MerTK 항체 - Google Patents

암을 치료하기 위한 항-MerTK 항체 Download PDF

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주니어 토마스 이. 스피어스
마이클 퀴글리
버지니 라퐁
진저 씨. 레이크스트로
린다 리앙
카렌 에이 아우구스틴-라우흐
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 개시내용은 세포의 표면 상에 발현된 MerTK에 특이적으로 결합하고 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제하는 단리된 항체를 제공한다.　 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 항-MerTK 항체를 단독요법으로서 또는 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

암을 치료하기 위한 항-MerTK 항체
본 출원 전체에 걸쳐, 다양한 간행물들이 괄호 내의 저자 명 및 날짜, 또는 특허 번호 또는 특허 공개 번호로써 인용된다. 이러한 간행물에 대한 전체 인용은 청구범위 바로 앞에 명세서 말미에서 찾을 수 있다. 이들 간행물의 개시내용은 본원에 기재되고 청구된 본 발명의 시점을 기준으로 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 최신 기술을 보다 충분히 설명하기 위해 그의 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 그러나, 이들 개시내용은, 참조로 포함된 정보와 본 출원에서 명시적 개시내용에 의해 제공된 정보 사이에 충돌이 존재하지 않는 정도로만 본 출원에 포함된다. 더욱이, 본원에서 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로서 간주되지 않아야 한다.
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/743,507의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ASCII 카피는 2019년 10월 4일에 생성되었고, 12970WOPCT_Seq_List_ST25.txt로 명명되고, 135,398 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 개시내용은 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (MerTK)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (mAb), 및 대상체에게 항-MerTK 항체 (Ab)를 단독요법으로서 또는 항암제, 예컨대 면역 체크포인트 억제제, 화학요법제 및/또는 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
인간 암은, 면역계에 의해 잠재적으로 인식될 수 있는 신생항원을 생성하는 유전적 및 후성적 변경을 보유한다 (Chakravarthi et al., 2016). T 및 B 림프구로 구성된 적응 면역계는 다양한 종양 항원에 반응하는 광범위한 능력 및 정교한 특이성과 함께, 강력한 항암 잠재력을 갖는다. 추가로, 면역계는 상당한 가소성 및 기억 성분을 나타낸다. 적응 면역계의 이러한 모든 속성들이 성공적으로 이용된다면 면역요법은 모든 암 치료 방식들 중에서 특별한 것이 된다.
지난 10년 동안, 진행성 흑색종을 갖는 환자 치료용의, 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4)에 결합하고 그를 억제하는 Ab인 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®), 및 PD-1 수용체에 특이적으로 결합하고 억제성 PD-1/PD-1 리간드 (PD-L1) 신호전달 경로를 차단하는 Ab 예컨대 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®) 및 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA)®) (Iwai et al., 2017)의 개발을 비롯한, 암 치료를 위한 특이 면역 체크포인트 경로 억제제 개발이 목격되었다 (Chen 및 Mellman, 2013; Lesokhin et al., 2015). 이 경로는 또한 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아테졸리주맙 (테센트릭(TECENTRIQ)®), 두르발루맙 (임핀지(IMFINZI)®), 및 아벨루맙 (발렌시오(BAVENCIO)®)을 포함하는 Ab에 의해 방해될 수 있다.
니볼루맙은 PD-1 리간드인 PD-L1 및 PD-L2와의 상호작용을 선택적으로 방지하여 (미국 특허 번호 8,008,449; Wang et al., 2014), 외래 (종양 포함) 및 자기 항원 둘 다에 대해 지시되는 항원-특이적 T 세포 반응의 하향-조절을 차단하고, 이들 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는, 완전 인간 이뮤노글로불린 (Ig) G4 (S228P) 모노클로날 항체 (mAb)이다. 니볼루맙은 최근 흑색종, 폐암, 신세포 암종, 고전적 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피 암종, MSI-H 또는 dMMR 전이성 결장직장암, 및 간세포성 암종을 비롯한 여러 암에 대해 승인을 받았으며, 현재는 추가 종양 유형에서 단독요법으로서 또는 다른 항암제와 조합하여 임상적으로 평가되고 있는 중이다. 그러나, 단지 작은 백분율의 환자만이, 전형적으로는 대략 25% 미만이 체크포인트 억제제를 사용하는 치료로부터 이익을 얻고 있으며, 현재는 체크포인트 억제제 및 다른 항암제 또는 요법의 조합을 사용하는 면역요법의 효능을 개선시키는 것에 상당한 노력이 집중되고 있다. PD-1/PD-L1 억제제는 매우 다양한 범위의 암을 치료하는 데 있어 매우 성공적인 것으로 입증되었기 때문에, 이들은 면역-종양학에서의 미래의 다양한 약물 조합의 백본이 될 가능성이 있는 것으로 인지되고 있고, 가장 효과적인 조합을 개발하기 위한 경쟁이 계속 진행되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Mahoney et al., 2015; Ott et al., 2017] 참조).
MerTK (c-Mer 티로신 키나제; 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER)는 단백질 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 TAM (Tyro3/Axl/Mer) 패밀리의 구성원이며, 이는 N-말단으로부터 2개의 Ig-유사 C2-유형 도메인, 2개의 피브로넥틴 (Fn) 유형-III 도메인에 이어 소수성 막횡단 도메인 및 세포내 티로신 키나제 도메인을 포함하는 유사한 전체 구조를 나타낸다. 2개의 Ig-유사 도메인은 TAM의 리간드-결합 영역으로서 작용한다.
TAM RTK는 매우 다양한 인간 암, 특히 혈액 및 상피 악성종양에서 이소 발현되거나 과다발현되며, 항종양 면역 반응을 조정하는 데 있어서 TAM 수용체의 역할을 이해하는 데 관심이 증가하고 있다. 종양 미세환경에서, MerTK는 주로 종양-연관 대식세포 상에서 발현되고, 단핵구 및 수지상 세포 (DC) 상에서는 보다 낮게 발현된다. 종양 세포에서의 TAM RTK의 유도는, 종양원성 구동자로서 기능하기보다는 주로 생존, 화학요법저항성 및 운동성을 촉진한다 (Linger et al., 2008; Graham et al., 2014). MerTK 녹다운이 세포 배양물에서 아폽토시스를 약간만 촉진하고 증식을 느리게 하지만, 이러한 효과는 스트레스성 조건 하에 예컨대 혈청 고갈 또는 연질 한천 또는 이종이식편에서의 성장과 조합될 때 더욱 두드러진다 (Lee-Sherick et al., 2013; Linger et al., 2013). 이는 TAM 생존 신호가, 제한된 산소 및 영양소 공급물으로 인해 단백질독성 및 유전자독성 상태가 악화되는 종양 미세환경에서 특히 중요할 수 있음을 시사한다.
성장 정지-특이적 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S1 (PROS1)은 이 수용체 패밀리에 대해 가장 잘 연구된 리간드이고, 그의 N-말단 GLA 도메인을 통해 아폽토시스 세포의 외막 상의 포스파티딜 세린에 결합하고 그의 C-말단 도메인을 통해 MerTK에 직접 결합하는 가교 분자로서 작용한다 (Graham et al., 2014). 이들 리간드는 TAM 수용체에 결합하고 이를 활성화시킨다 (Stitt et al., 1995). 2개의 다른 보고된 리간드인 투비(Tubby) 및 투비-유사 단백질 1 (Tulp1)은 또한 MerTK에 대한 N-말단 MPD (최소 식세포작용 결정기) 도메인 및 아폽토시스 세포와 결속되는 고도로 보존된 C-말단 PPBD (식세포작용 먹이 결합 도메인) 도메인을 통해 가교 리간드로서 유사하게 작용한다 (Caberoy et al., 2010). 또한, 갈렉틴-3 (Gal-3)도 MerTK에 직접 결합할 수 있다는 것이 보고되었지만, 이러한 추정 상호작용은 문헌 [Caberoy et al., 2012]에서 아직 충분히 이해되지 않는다.
일부 혈액암 및 상피암 이외에, MerTK는 종양-연관 대식세포, 관용원성 수지상 세포 및 자연 킬러 (NK) 세포 상에서 우세하게 발현된다 (Graham et al., 2014). 이는 또한 면역계의 전문 식세포 및 정상 상피 세포, 예컨대 적색 속질 대식세포 및 망막 상피인 조직-상주 대식세포 집단 상에서 발현된다. 리간드는 골수 세포, 활성화된 T 세포를 포함한 많은 세포에 의해, 그리고 많은 암 세포/유형에 의해 발현된다 (Graham et al., 2014). 종종 MerTK 또는 다른 TAM 패밀리 수용체를 발현하는 세포는 하나 이상의 리간드를 발현하는 동일한 세포이고, 이는 잠재적인 자가분비-매개 활성화를 일으킨다. TAM 수용체 패밀리에 대한 다양한 리간드의 발현 및 결합은 아폽토시스 세포를 특이적으로 표적화하고 포식하는 과정인 세포 생존, 이동, 분화 및 에페로시토시스(efferocytosis)를 비롯한 수많은 생리학적 과정을 조절한다.
대식세포 상의 MerTK 발현은 건강한 조직 및 손상된 조직 둘 다에서 그의 식세포작용 기능에 중요하다. MerTK는 에페로시토시스의 주요 매개자이고, 종양 미세환경에서 면역억제 및 관용에 기여하는 것으로 생각된다. MerTK의 과다발현은 세포주에 기능 획득 능력을 부여하고 이들이 아폽토시스 세포를 효율적으로 포식할 수 있게 하는 데 충분하고, MerTK 발현을 녹아웃시킴으로써 기능 상실이 달성되는 것으로 밝혀졌다 (Nguyen et al., 2014).
MerTK-/- 마우스를 사용한 공개된 보고서는 면역원성 세팅, 예컨대 PyVMT 유방암 모델에서 면역-매개의 증진된 항종양 활성을 입증하였고, 심지어 치료하기 어려운 세팅, 예컨대 B16F10 흑색종 모델에서 증가된 종양 성장 지연을 입증하였다 (Cook et al., 2013). MerTK 차단과 함께 작동하는 제안된 메카니즘과 일치하게, CD8 Teff 세포 기능이 이들 항종양 이익에 요구되는 것으로 또한 제시되었다 (Cook et al., 2013). 아폽토시스 세포를 섭취하는 대식세포의 중요한 특징은 염증유발 시토카인의 생성을 하향조절하고 면역억제와 연관된 인자를 상향조절하는 그의 후속 성향이다. 다양한 연구들이 아폽토시스 종양 세포의 MerTK-의존성 식세포작용이 대식세포의 종양-촉진 분극을 선호하는 신호전달 캐스케이드를 유도하고, 이들 종양발생-촉진 프로그램이 종양 성장을 돕는 면역억제 시토카인의 생산을 증대시킨다는 아이디어를 뒷받침한다 (문헌 [Akalu et al., 2017] 참조). 또한, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 포스파티딜 세린 차단제 (예를 들어, 아넥신 V)를 사용한 에페로시토시스의 차단은 면역억제 인자 (예를 들어, TGF-β)의 감소, 염증유발 인자 (예를 들어, TNF-α)의 증가 및 대식세포-매개 T 세포 증식의 증진으로 이어지는 것으로 밝혀졌다 (Barker et al. 2002; Bondanza et al., 2004). 이들 데이터는 특히 MerTK에 대해 특이적으로 지시된 길항작용 리간드-차단 Ab를 사용한 에페로시토시스의 차단이 항암 치료제로서 효과적일 수 있다는 가능성을 시사한다. 따라서, 본 연구는 암을 치료하는 데 사용하기 위해 높은 친화도로 MerTK에 결합하고 에페로시토시스를 억제하는 Ab를 확인하기 위해 착수되었다. 이러한 Ab는 T 세포 반응을 재활성화시키는 작용제, 예컨대 체크포인트 억제제, 및/또는 종양 미세환경에서 아폽토시스 반응을 유도하는 치료, 예컨대 특정 화학요법 화합물 및 방사선 요법과 조합하여 특히 효과적일 수 있다 (Jinushi et al., 2013).
최근의 PCT 공개 (WO 2016/106221)는 인간 MerTK (또는 인간 및 마우스 MerTK 둘 다)에 높은 친화도로 특이적으로 결합하고, MerTK에 대한 Gas6 결합을 억제하고, 내피 세포 상에서의 MerTK 신호전달을 효능작용하는 mAb의 단리를 기재하고 있다. WO 2016/106221은 또한 대상체에게 MerTK에 특이적으로 결합하고 내피 세포 상에서의 MerTK 신호전달을 효능작용하는, 즉 내피 세포 상에서의 MerTK 인산화를 활성화시키는 Ab를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 2종의 mAb가 인간 유방암의 마우스 모델에서 종양 진행을 억제하는 것으로 제시되었다. MerTK 효능제의 암을 치료하는 능력은, 내피 세포 상에서의 MerTK의 Gas-6 활성화가 종양 혈관신생, 종양 성장 및 전이를 허용하는 암 세포의 주요 특징인 암 세포에 의한 내피 세포 동원을 억제시킨다는 것에 기초하여 설명되었다. 따라서, 암 세포가 아니라 내피 세포 상에서의 MerTK 신호전달을 활성화시키는 화합물은 종양 혈관신생 및 전이를 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 또 다른 PCT 공개 (WO 2019/005756)는 M6 및 M19의 Ab-약물 접합체의 제조 및 암 치료에서의 그의 용도를 기재한다.
본 개시내용은 항-MerTK Ab의 생산 및 암 치료에서의 그의 효능 및 그에 대한 적합성의 평가에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 체크포인트 차단, 예를 들어, PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 억제와 조합하여 항-MerTK Ab에 의한 암 치료 효능의 평가에 관한 것이다. 항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1의 작용 메카니즘의 조합은 종양 세포 사멸을 증가시키는 특별한 기회를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 세포의 표면 상에 발현된 MerTK에 결합하고, 치료적 Ab에서 바람직한 특성을 비롯한 다양한 기능적 특성을 나타내는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb를 제공한다. 이들 특성은 MerTK에 대한 고친화도 결합, MerTK-발현 세포, 주로 대식세포에 의한 에페로시토시스의 억제, hMerTK에 대한 성장 정지-특이적 단백질 6 (Gas6)의 결합의 억제, MerTK와 Gas6 사이의 상호작용의 방해, MerTK/Gas6 신호전달의 억제, 대상체에게 단독요법으로서 또는 또 다른 항암제와 조합되어 투여되는 경우에 대상체에서의 종양 세포 성장의 억제, 및 암을 앓고 있는 대상체에게 단독요법으로서 또는 또 다른 항암제와 조합되어 투여되는 경우에 상기 대상체의 치료를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항-MerTK mAb는 인간 MerTK (hMerTK), 시노몰구스 원숭이 MerTK (cMerTK), 뮤린 MerTK (mMerTK), 또는 이들 MerTK 표적의 조합인 MerTK에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 1 nM 이하, 바람직하게는 약 0.04 nM 내지 약 0.7 nM의 IC50으로 hMerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 10 nM 이하, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 5 nM의 IC50으로 hMerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 추가의 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 70 nM 이하, 바람직하게는 약 2 nM 내지 약 25 nM의 KD로 hMerTK에 특이적으로 결합한다. 추가의 다른 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 높은 친화도로 hMerTK, cMerTK 및 mMerTK에 특이적으로 결합한다.
본원에 제공된 항-MerTK Ab를 3개의 에피토프 빈(Bin)에 할당하였다. 특정 실시양태에서, Ab는 빈 1에 속한다. 빈 1 Ab는 대략 아미노산 105 내지 165에 걸친 영역 내의 MerTK의 제1 Ig 도메인에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, Ab는 빈 2에 속한다. 빈 2 Ab는 대략 아미노산 195 내지 270에 걸친 영역 내에서 제2 Ig 도메인에 결합한다. 추가의 실시양태에서, Ab는 빈 3에 속한다. 빈 3 Ab는 대략 아미노산 420 내지 490에 걸친 영역 내의 피브로넥틴 (Fn) 도메인에 결합한다.
본 개시내용은 세포의 표면 상에 발현된 hMerTK에 특이적으로 결합하고, 각각의 하기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 쌍 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
(a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
(l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL.
가변 영역의 서열은 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), AbM, 접촉 및 IMGT 정의를 비롯한 다양한 방법에 의해 정의될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 Ab 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 상기 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분의 제조 방법에 사용될 수 있고, 상기 방법은 상기 숙주 세포에서 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 발현시키고 숙주 세포로부터 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 단리하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-MerTK mAb 또는 항원-결합 부분을 투여하여 대상체가 치료되도록 하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-MerTK mAb 또는 항원-결합 부분을 투여하여 대상체에서 종양 세포의 성장이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법의 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb는 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-MerTK mAb는 MerTK의 그의 리간드에의 결합을 억제하고 MerTK/리간드 신호전달을 억제한다.
본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 (a) 본원에 기재된 임의의 항-MerTK mAb 또는 항원-결합 부분, 및 (b) 암을 치료하기 위한 추가의 치료제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 추가의 치료제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 길항작용 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이며, 이들은 제한적 의미로서 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 과학 논문, 진뱅크(GenBank) 등록물, 특허 및 특허 출원을 비롯한, 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
도 1a-1c는 MC38 마우스 결장 선암종 종양 모델에서 Ab로 치료된 10마리의 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, 마우스 항-mPD-1 Ab (4H2) 및 마우스 항-mMerTK Ab의 조합물의 종양 성장에 대한 효과를 항-PD-1 Ab 요법 단독과 비교하여 보여준다: 도 1a, 대조군 마우스 IgG1 Ab; 도 1b, 항-마우스 PD-1 Ab (클론 4H2); 도 1c, 항-PD-1 Ab 및 항-마우스 MerTK (클론 4E9) Ab의 조합물. 10마리 마우스 중 7마리가 조합물 군에서 치유되었고, 즉 종양의 100% 감소를 나타낸 반면, 항-PD-1 Ab 단독으로 치료된 마우스는 전혀 치유되지 않았다.
도 2는 항-PD1과 조합된 항-MerTK로의 처리에 의해 치유된 MC38 마우스의 종양에 의한 리챌린지에 대한 저항성을 보여준다. 모든 7마리의 리챌린지된 마우스는 MC38 종양 성장에 대해 저항성이었다.
도 3a-3h는 MC38 종양 모델에서 Ab로 치료된 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, 항-마우스 PD-1 Ab (4H2) 및 상이한 FcR 이펙터 기능을 갖는 상이한 마우스 항-mMerTK Ab (4E9 및 2D9)의 조합물의 종양 성장에 대한 효과를 항-PD-1 Ab 요법 단독과 비교하여 보여준다: 도 1a, 대조군 마우스 IgG1 Ab; 도 1b, 항-mMerTK Ab (2D9-IgG1); 도 1c, 항-mMerTK Ab (2D9-D265A); 도 1d, 항-mMerTK Ab (4E9-D265A); 도 1e, 항-mPD-1 Ab; 도 1f, 항-mPD-1 Ab 및 항-mMerTK Ab (2D9-IgG1)의 조합물; 도 1g, 항-mPD-1 Ab 및 항-mMerTK Ab (2D9-D265A)의 조합물; 도 1h, 항-mPD-1 Ab 및 항-mMerTK Ab (4E9-D265A)의 조합물. FcR 이펙터 기능이 IgG1인지 또는 IgG1-D265A인지에 상관없이 2종의 상이한 항-MerTK Ab에서 유사한 효능이 관찰되었다.
도 4a-4d는 CT26 마우스 결장 암종 종양 모델에서 단독으로 또는 조합하여 사용된 항-mPD-1 Ab (4H2) 및 항-mMerTK Ab의 종양 성장에 대한 효과를 보여준다: 도 1a, 대조군 마우스 IgG1 Ab; 도 1b, 항-mPD-1 Ab; 도 1c, 항-mMerTK Ab (4E9-IgG1); 도 1d, 항-mPD-1 Ab 및 항-mMerTK Ab (4E9-IgG1)의 조합물. 조합 치료를 받은 마우스에서 10마리 마우스 중 4마리가 치유된 반면, 각각 항-MerTK 단독요법으로 치료된 어느 마우스도 치유되지 않았고, 항-PD-1 Ab 단독요법으로 치료된 1마리 마우스가 치유되었다.
도 5a-5d는 MC38 종양 모델에서 단독으로 또는 조합하여 사용된 항-mPD-1 Ab (4H2) 및 항-mMerTK Ab의 종양 성장에 대한 효과를 보여준다: 도 1a, 대조군 마우스 IgG1 Ab; 도 1b, 항-mPD-1 Ab; 도 1c, 항-mMerTK Ab (16B9-D265A); 도 1d, 항-mPD-1 Ab 및 항-mMerTK Ab (16B9-D265A)의 조합물. 조합 치료를 받은 마우스에서 10마리 마우스 중 7마리가 치유된 반면, 각각 항-MerTK 단독요법으로 치료된 어느 마우스도 치유되지 않았고, 항-PD-1 Ab 단독요법으로 치료된 1마리 마우스가 치유되었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 MerTK에 특이적으로 결합하는 mAb 및 환자에게 항-MerTK Ab를 단독으로 또는 항암제, 예컨대 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
용어
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 본원에서 달리 명확히 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 하기 각각의 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전체에 걸쳐 제시된다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 치료제, 또는 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 치료적 Ab 예컨대 항-PD-1 및 항-MerTK Ab의 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 다른 투여 경로는 근육내, 피하, 복강내, 또는 다른 비경구적 투여 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 의미한다. 또한, 투여는, 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
"항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하고, 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 이뮤노글로불린 (Ig), 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하여야 한다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. IgG Ab의 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. IgG Ab의 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 카바트, 코티아, AbM, 접촉, 및 IMGT 정의를 비롯한 다양한 방법이 Ab 내의 CDR 도메인을 상술하는 데 사용되어 왔다. Ab의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 구성요소 (C1q)를 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에의 Ig의 결합을 매개할 수 있다.
Ig는 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 일반적으로 공지된 이소형으로부터 유래할 수 있다. 또한 IgG 하위부류는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 Ab 부류 또는 하위부류 (예를 들어, IgM, IgG1, 또는 IgG4)를 지칭한다. 용어 "항체"는, 예로서, 자연적으로 발생된 Ab 및 비-자연적으로 발생된 Ab 둘 다, 모노클로날 및 폴리클로날 Ab, 키메라 및 인간화 Ab, 인간 또는 비인간 Ab, 전체 합성 Ab, 및 단일 쇄 Ab를 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해 재조합 방법에 의해서 부분적으로 또는 전체적으로 인간화될 수 있다. 달리 명백하게 언급되지 않는 경우, 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 또한 상기 언급된 Ig 중 임의의 것의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 일부, 및 단일 쇄 Ab를 포함한다.
"단리된" Ab는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 Ab가 실질적으로 없는 Ab를 지칭한다 (예를 들어, MerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab에는 MerTK 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab, 예컨대 Axl 또는 Tyro3에 결합하는 Ab가 실질적으로 없다). 그러나, hMerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab는 다른 항원 예컨대 상이한 종 예컨대 마우스 및 시노몰구스 원숭이로부터의 MerTK 폴리펩티드에 대하여 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 Ab는 또한 실질적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 없도록 정제된 Ab를 의미할 수 있다.
용어 "모노클로날" Ab (mAb)는 단일 분자 조성으로 이루어진 Ab 분자, 즉, 그의 1차 서열이 본질적으로 동일하며, 특정한 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 것인 Ab 분자로 이루어진 비-자연적으로 발생된 제제를 지칭한다. mAb는 단리된 Ab의 예이다. mAb는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술에 의해 생산될 수 있다.
"키메라" Ab는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 것인 Ab, 예컨대 가변 영역은 마우스 Ab로부터 유래되고 불변 영역은 인간 Ab로부터 유래된 것인 Ab를 지칭한다.
"인간" mAb (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 mAb를 지칭한다. 추가로, Ab가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것이다. 본 발명의 인간 Ab는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간" Ab는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 것인 Ab를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간" Ab 및 "완전 인간" Ab는 동의어로 사용된다.
"인간화" mAb는 비-인간 mAb의 CDR 도메인 밖의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 mAb를 지칭한다. 인간화 형태의 Ab에 대한 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터의 아미노산으로 대체된 반면, 1개 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 바뀌지 않는다. 아미노산의 소규모 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 이들이 특정한 항원에 결합하는 Ab의 능력을 없애지 않는 한 허용가능하다. "인간화" Ab는 원래 Ab의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"항-항원" Ab는 항원에 특이적으로 결합하는 Ab를 지칭한다. 예를 들어, 항-PD-1 Ab는 PD-1에 특이적으로 결합하는 Ab인 반면, 항-MerTK Ab는 MerTK에 특이적으로 결합하는 Ab이다. 본원에 사용된 "항-PD-1/항-PD-L1" Ab는 PD-1/PD-L1 신호전달 경로를 방해하는 데 사용되는 Ab이고, 이는 항-PD-1 Ab 또는 항-PD-L1 Ab일 수 있다.
Ab의 "항원-결합 부분" ("항원-결합 단편"으로도 명명됨)은 전체 Ab가 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 Ab의 하나 이상의 단편을 지칭한다.
Ab의 "비닝"은 항원-특이적 Ab의 라이브러리의 에피토프-결합 특징을 결정하는 방법을 지칭한다. 비닝 방법은 통상적으로 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 효소-연결 면역검정 (ELISA) 또는 유동 세포측정법과 같은 기술을 사용하여 Ab의 라이브러리 내의 각각의 Ab의 그의 공통 항원에 대한 경쟁적 결합을 측정하는 것에 기초한다. 각각의 Ab에 대한 경쟁적 차단 프로파일이 라이브러리 내의 다른 것과 비교하여 생성된다. Ab의 빈은 참조 Ab를 사용하여 정의된다. 제2 Ab가 참조 Ab와 동시에 항원에 결합할 수 없는 경우, 제2 Ab가 참조 Ab와 동일한 빈에 속한다고 한다. 반대로, 제2 Ab가 참조 Ab와 동시에 항원에 결합할 수 있는 경우, 제2 Ab는 별개의 빈에 속하는 것으로 언급된다. 동일한 빈에 속하는 Ab는 일반적으로 항원의 동일한 에피토프 영역에 결합하고, 즉, 이들은 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, 동일한 빈 내의 Ab는 별개의 에피토프에 결합하지만, 그의 에피토프에 결합된 하나의 Ab는 다른 Ab가 그의 별개의 에피토프에 결합하는 것을 입체적으로 방해할 수 있다. 상이한 빈에 속하는 Ab는 일반적으로 별개의 에피토프에 결합한다.
"암"은 신체 내 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하는 악성 종양의 형성을 발생시키고, 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다.
"티로신-단백질 키나제 Mer" (MerTK; 예를 들어, 원종양유전자 c-Mer, 수용체 티로신 키나제 MerTK 또는 Mer 막횡단 수용체 티로신 키나제 당형태로서 관련 기술분야에 또한 공지됨)는 Tyro3/Axl/Mer (TAM) 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리의 막횡단 단백질이다. 이는 대식세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포 및 수지상 세포 (DC) 상에서 발현되고, 또한 종종 백혈병, 비소세포 폐암, 교모세포종, 흑색종, 전립선암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌하수체 선종 및 횡문근육종을 포함한 매우 다양한 암에서 과다발현되거나 활성화된다. MerTK는 여러 상이한 리간드, 성장 정지-특이적 6 (Gas6) 단백질, 단백질 S, 투비, 투비-유사 단백질 1 (Tulp1), 및 갈렉틴-3에 결합하며, 이들 모두는 MerTK 자가인산화를 유도한다. 본원에 사용된 용어 "MerTK"는 인간 MerTK (hMerTK), hMerTK의 변이체, 이소형, 종 상동체, 예컨대 시노몰구스 원숭이 MerTK (cMerTK) 및 마우스 MerTK (mMerTK), 및 hMerTK에 대해 적어도 1개의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 hMerTK, cMerTK 및 mMerTK 아미노산 서열을 각각 진뱅크® 수탁 번호 NP_006334.2, XP_005575320.1 및 NP_032613.1 하에 찾을 수 있다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해, 질환을 앓고 있거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환의 재발을 겪는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다. 대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 또는 상태, 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발생, 중증도 또는 재발을 역전, 경감, 호전, 억제, 저속화 또는 예방하기 위한 목적으로 대상체에게 수행되는, 활성제 투여를 비롯한, 임의의 유형의 개입 또는 프로세스를 지칭한다.
"프로그래밍된 사멸-1" (PD-1)은 주로 생체내에서 앞서 활성화된 T 세포 상에서 발현되고, 2개의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합하는, CD28 패밀리에 속하는 면역억제성 수용체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "PD-1"은 인간 PD-1 (hPD-1), hPD-1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 hPD-1 아미노산 서열은 진뱅크® 수탁 번호 U64863 하에 찾을 수 있다.
"프로그램화된 사멸 리간드-1" (PD-L1)은 PD-1에 결합 시 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는, PD-1에 대한 2종의 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나이다 (다른 것은 PD-L2임). 본원에 사용된 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1 (hPD-L1), hPD-L1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 hPD-L1 서열은 진뱅크® 수탁 번호 Q9NZQ7 하에 찾을 수 있다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 사용되었을 때, 대상체를 질환 발병으로부터 보호하거나, 또는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방 또는 감소로 입증되는 질환 퇴행을 촉진시키는 약물 또는 작용제의 임의의 양이다. 추가로, 치료와 관련한 용어 "유효한" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 약물이 환자에서 질환 퇴행, 예를 들어, 암 퇴행을 촉진시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 허용되는 수준의 독성, 또는 약물의 투여로부터 초래되는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서 다른 유해한 생리학적 효과 (부작용)를 지칭한다. 치료제의 효능은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정법에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
종양의 치료에 대한 예로서, 치료 유효량의 항암제는 세포 성장 또는 종양 성장을, 비치료 대상체에 비해 바람직하게는, 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 더 바람직하게는 약 100% 억제한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 30일, 보다 바람직하게는 적어도 약 60일, 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 6개월의 기간 동안 관찰되고, 계속 진행될 수 있다. 이러한 궁극적인 치료 유효성의 측정에도 불구하고, 면역요법 약물의 평가는 "면역-관련" 반응 패턴을 또한 참작하여야 한다.
"면역-관련" 반응 패턴은 암 특이적 면역 반응을 유도함으로써 또는 천연 면역 프로세스를 변형시킴으로써 항종양 효과를 생성하는 면역요법제로 치료받은 암 환자에서 종종 관찰되는 임상 반응 패턴을 지칭한다. 이러한 반응 패턴은 전통적인 화학요법제를 평가하는 데 있어서 질환 진행으로서 분류될 것이고 약물 실패와 동의어가 될 것인, 종양 부담의 초기 증가 또는 새로운 병변의 출현 이후에 오는 유익한 치료 효과를 특징으로 한다. 따라서, 면역요법제의 적절한 평가는 표적 질환에 대한 이들 작용제의 효과의 장기간 모니터링을 요구할 수 있다.
약물의 치료 유효량은, 질환 발생 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 암 발생 위험이 있는, 전암성 상태를 갖는 대상체), 또는 질환 재발을 앓을 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 투여하였을 때, 질환 (예를 들어, 암)의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양인 "예방 유효량"을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 예방 유효량은 질환의 발생 또는 재발을 전적으로 방지한다. 질환의 발생 또는 재발을 "억제하는 것"은 질환의 발생 또는 재발의 가능성을 감소시키거나, 또는 질환의 발생 또는 재발을 전적으로 방지하는 것을 의미한다.
대안적 사용 (예를 들어, "또는")은 대안 중 하나, 둘 다 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 단수 형태는 임의의 언급되거나 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약"은 부분적으로는 수치 값, 조성, 또는 특징이 측정 또는 결정되는 방식, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존하게 되는 상기 값, 조성, 또는 특징이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은, 특정한 값, 조성, 또는 특징에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 지칭한다. 예를 들어, "약"은 플러스 또는 마이너스 20% 범위, 보다 일반적으로는 플러스 또는 마이너스 10% 범위를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에서 특정한 값, 조성, 또는 특징이 제공될 때, 달리 언급되지 않는 한, "약"의 의미는 상기 특정한 값, 조성, 또는 특징에 대해 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 동일한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 측정된 특성과 관련하여 2개 이상의 수치 값, 조성, 또는 특징 사이의 차이는 거의 없거나, 또는 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 없다고 간주할 정도로, 이들 값, 조성, 또는 특징이 충분히 높은 정도로 유사하다는 것을 지칭한다. 측정된 수치 값 사이의 차이는, 예를 들어, 약 50% 미만, 바람직하게는, 약 30% 미만, 보다 바람직하게는, 약 10% 미만일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분율 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
항-MerTK mAb
특정 측면에서, 본 개시내용은 세포의 표면 상에 발현된 MerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 특히 mAb 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. mAb가 결합하는 MerTK는, 서열이 서열식별번호: 259로서 제시되는 hMerTK; 서열이 서열식별번호: 260으로서 제시되는 cMerTK; 및/또는 서열이 서열식별번호: 261로서 제시되는 mMerTK를 포함한다.
항-MerTK mAb에 의한 에페로시토시스의 억제
대식세포에 의한 에페로시토시스는 종양 미세환경에서 면역억제 및 관용에 기여하고 (Nguyen et al., 2014; Akalu et al., 2017), 아폽토시스 세포의 제거에 수반되는 경로의 억제는 항종양발생 반응을 증진시킬 수 있다. 실제로, 에페로시토시스의 차단은 시험관내 및 생체내 둘 다에서의 면역억제 인자의 감소 및 증진된 대식세포-매개 T 세포 증식을 발생시키는 것으로 밝혀졌다 (Barker et al. 2002; Bondanza et al., 2004). 에페로시토시스를 매개하는 데 있어서 MerTK의 중요한 역할을 고려하여, 에페로시토시스를 억제하는 길항작용 리간드-차단 항-MerTK Ab를 상기 Ab가 T 세포 반응을 상향조절하는 작용제, 예컨대 항-PD-1 Ab의 항종양 효능을 증진시킬 수 있는지 평가하기 위한 목적으로 단리하였다 (실시예 2 참조). 에페로시토시스의 억제제는 또한 종양 미세환경에서 아폽토시스 반응을 유도하는 요법, 예컨대 특정 화학요법 화합물 및 방사선 요법과 상승작용할 수 있다 (Jinushi et al., 2013).
개시된 발명의 특정 측면은 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제하는 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 hMerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 약 5 nM 이하; 바람직하게는 약 1 nM 이하; 또는 보다 바람직하게는 약 0.1 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.01 nM 내지 약 1 nM의 IC50으로 에페로시토시스를 억제한다. 특정 다른 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.01 nM 내지 약 0.7 nM의 IC50으로 에페로시토시스를 억제한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.04 nM 내지 약 0.7 nM의 IC50으로 에페로시토시스를 억제한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.04 nM 내지 약 0.1 nM의 IC50으로 에페로시토시스를 억제한다. 이들 IC50 값은 실시예 2에 기재된 검정을 기반으로 한다.
항-MerTK mAb에 의한 MerTK/리간드 신호전달의 억제
특정 실시양태에서, 본 발명의 mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 MerTK, 예를 들어 hMerTK에 대한 Gas6의 결합을 억제하고, MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 약 50 nM 이하; 약 10 nM 이하; 약 5 nM 이하; 바람직하게는 약 1 nM 이하; 보다 바람직하게는 약 0.5 nM 이하; 보다 더 바람직하게는 약 0.1 nM 이하의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.05 nM 내지 약 6 nM의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.08 nM 내지 약 2 nM의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 약 0.2 nM 내지 약 2 nM의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 이들 IC50 값은 실시예 2에 기재된 검정을 기반으로 한다.
MerTK에 높은 친화도로 결합하는 항-MerTK mAb
본 발명의 특정 항-MerTK mAb는 높은 친화도로 MerTK에 결합한다. Ab는 전형적으로 1 μM 내지 10 pM 이하의 해리 상수 (KD)에 의해 반영되는 높은 친화도로 그의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 100 μM 초과의 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 항원에 "특이적으로 결합하는" IgG Ab는 상기 항원 및 실질적으로 동일한 항원에, KD가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 약 10 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 5 nM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 50 nM 내지 0.1 nM 이하임을 의미하는 높은 친화도로 결합하지만, 비관련 항원에는 높은 친화도로 결합하지 않는 Ab를 지칭한다. 항원이 주어진 항원에 대해 고도의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 예를 들어 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 이러한 항원은 주어진 항원과 "실질적으로 동일하다". 예로서, hMerTK에 특이적으로 결합하는 Ab는 또한 특정 영장류 종으로부터의 MerTK 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있지만, 특정 설치류 종으로부터의 MerTK 항원 또는 MerTK 이외의 항원, 예를 들어, Axl 또는 PD-1 항원과는 교차-반응하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "KD"는, k오프 대 k온 (즉, k오프/k온)의 비로부터 수득되고 몰 농도 (예를 들어, nM)로서 표현되는, 특정한 Ab-항원 상호작용에 대한 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "k온"은 Ab 및 그의 항원 상호작용의 회합에 대한 회합 속도 또는 "온 레이트"를 지칭하고, 용어 "k오프"는 Ab-항원 복합체에 대한 해리 속도를 지칭한다. Ab에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 또는 생물층 간섭측정법 (BLI; 포르테바이오(ForteBio), 캘리포니아주 프리몬트)을 사용하여 결정될 수 있다. 단일 Ab에 대해 상이한 방법에 의해 결정된 KD 값은, 예를 들어 1,000배까지 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 상이한 Ab에 대한 KD 값을 비교하는 데 있어서, 이러한 KD 값을 동일한 방법을 사용하여 결정하는 것이 중요하다. 명백하게 언급되지 않는 경우, 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 개시된 Ab 결합에 대한 KD 값은 비아코어(BIACORE)® 바이오센서 시스템 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 일리노이주 시카고)을 사용하여 SPR에 의해 결정하였다.
개시된 발명의 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 MerTK에 약 100 nM 또는 약 50 nM 이하; 바람직하게는 약 10 nM 또는 약 5 nM 이하; 보다 바람직하게는 약 1 nM 또는 약 0.5 nM 이하; 보다 더 바람직하게는 약 0.1 nM 또는 약 0.05 nM 이하의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 약 100 nM 내지 약 0.1 nM의 KD로 인간 MerTK에 결합한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, KD는 약 50 nM 내지 약 0.5 nM이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 약 10 nM 내지 약 1 nM의 KD로 인간 MerTK에 결합한다. 다른 보다 바람직한 실시양태에서, mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 약 6 nM 내지 약 2 nM의 KD로 인간 MerTK에 결합한다.
항-MerTK HuMAb를 선택함에 있어서, hMerTK에 결합된 하이브리도마를 cMerTK에 대한 교차-반응성에 대해 스크리닝하였다. 따라서, 본 개시내용은 cMerTK에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 cMerTK에 약 100 nM 또는 약 50 nM 이하; 바람직하게는 약 10 nM 또는 약 5 nM 이하; 보다 바람직하게는 약 1 nM 또는 약 0.5 nM 이하; 보다 더 바람직하게는 약 0.1 nM 이하의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 cMerTK에 약 100 nM 내지 약 0.1 nM의 KD로 결합한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, KD는 약 50 nM 내지 약 0.5 nM이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 cMerTK에 약 10 nM 내지 약 1 nM의 KD로 결합한다. 다른 보다 바람직한 실시양태에서, mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 cMerTK에 약 5 nM 내지 약 1 nM의 KD로 결합한다.
mMerTK에 특이적으로 결합하는 mAb가 또한 생성되었다. 따라서, 본 개시내용은 mMerTK에 약 100 nM 또는 약 50 nM 이하; 바람직하게는 약 10 nM 또는 약 5 nM 이하; 보다 바람직하게는 약 1 nM 또는 약 0.5 nM 이하; 보다 더 바람직하게는 약 0.1 nM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 mMerTK에 약 100 nM 내지 약 0.1 nM의 KD로 결합한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, mAb는 mMerTK에 약 50 nM 내지 약 0.5 nM의 KD로 결합한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 mMerTK에 약 10 nM 내지 약 1 nM의 KD로 결합한다. 다른 보다 바람직한 실시양태에서, mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 mMerTK에 약 5 nM 내지 약 1 nM의 KD로 결합한다.
본원에 개시된 특정의 항-MerTK mAb, 예를 들어, moMAb 2D9 및 4E9, 및 이들의 인간화 버전, 2L105 및 4M60은 높은 친화도로 m-, h- 및 cMerTK 모두와 교차-반응하고, 즉, 특이적으로 결합한다. 다른 mAb, 예를 들어, HuMAb 1B4, 10K11, 22I16, 25J60, 25J80, 8N42 및 4K10은 h- 및 cMerTK와 교차-반응하지만, mMerTK에는 결합하지 않는다. 추가의 다른 mAb, 예를 들어, moMAb 16B9는 mMerTK에 특이적으로 결합하지만, h- 및 cMerTK에는 결합하지 않는다. 따라서, 본 개시내용은 h- 및 cMerTK 둘 다와 교차-반응하는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분; h- 및 mMerTK 둘 다와 교차-반응하는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분; 및 h-, c- 및 mMerTK 모두와 교차-반응하는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 각각의 h-, c- 및 mMerTK에 약 70 nM 이하; 바람직하게는 약 50 nM 내지 약 1 nM; 보다 바람직하게는 약 25 nM 내지 약 3 nM의 KD로 특이적으로 결합한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분은 적어도 h- 및 cMerTK 둘 다에 약 70 nM 이하; 바람직하게는 약 50 nM 내지 약 1 nM; 보다 바람직하게는 약 25 nM 내지 약 2 nM의 KD로 특이적으로 결합한다.
항-MerTK mAb의 비닝 및 특이적 에피토프에 대한 이들 Ab의 결합
hMerTK를 사용한 비닝 실험으로 항-MerTK Ab가 할당된 3개의 에피토프 빈이 확인되었다. 비닝된 항-MerTK HuMAb 중 대다수인 13종 중 11종이 빈 1에 할당되었다. 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 및/또는 효모 디스플레이에 의한 에피토프 맵핑은 특이적 클론에 따라 대략 아미노산 105 내지 165에 걸친 선형 영역 내의 hMerTK의 제1 Ig 도메인에 빈 1 에피토프를 맵핑하였다. 본 개시내용은 hMerTK 상의 빈 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시양태에서, 빈 1 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 105 내지 165에 걸친 영역 내의 hMerTK의 제1 Ig 도메인에 위치한다. 특정의 다른 실시양태에서, 빈 1 에피토프는 HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 126 내지 155에 걸친 hMerTK의 영역 내에 위치한다. 추가 실시양태에서, 빈 1 에피토프는 HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 126 내지 155 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 20개 또는 모두를 포함한다.
비닝된 항-MerTK HuMAb 중 하나인 25B10을 빈 2에 할당하였다. 서열 문제를 완화시키고, 결합 친화도를 증진시키고, 배선 아미노산으로 복귀시키기 위해 항-hMerTK HuMAb를 최적화한 후 (실시예 2), mAb 25B10으로부터 다수의 mAb를 유도하였고, 이 중 mAb 25J60 및 25J80이 표 1 및 2에 포함된다. MoMAb 2D9 및 4E9, 및 각각 그의 인간화 변이체인 2L105 및 4M60을 또한 빈 2에 할당하였다. HDX-MS 및/또는 효모 디스플레이에 의한 에피토프 맵핑으로, 빈 2 에피토프를 특이적 클론에 따라 대략 아미노산 195 내지 270에 걸친 선형 영역 내의 hMerTK의 제2 Ig 도메인에 맵핑하였다.
개시된 발명은 hMerTK 상의 빈 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 빈 2 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 195 내지 270에 걸친 영역 내의 hMerTK의 제2 Ig 도메인에 위치한다. 특정의 다른 실시양태에서, 빈 2 에피토프는 HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 231 내지 249 (231WVQNSSRVNEQPEKSPSVL249)에 걸친 hMerTK의 영역 내에 위치한다. 추가 실시양태에서, 빈 2 에피토프는 효모 디스플레이 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 빈 2 에피토프는 아미노산 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269를 포함한다. 다른 실시양태에서, 빈 2 에피토프는 HDX-MS 및 효모 디스플레이 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 231 내지 249 및 아미노산 잔기 G269 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10개 또는 모두를 포함한다.
빈 1 및 빈 2 에피토프 영역 둘 다는 Gas6/Axl 결정 구조의 상동성 모델링에 기초한 리간드 차단과 일치한다. 그러나, 빈 1 또는 빈 2 에피토프에 결합하는 대표적인 mAb를 사용한 시노몰구스 원숭이에서의 예비 독성학 연구의 결과는 빈 1 에피토프에 결합하는 2종의 상이한 mAb가 원숭이에서 중증 유해 효과, 구체적으로 말초 신경병증을 유발하는 반면, 빈 2 에피토프에 결합하는 mAb는 내약성이 우수하다는 것을 보여주었다. 따라서, 빈 2 에피토프에 결합하는 항-MerTK mAb는 치료 용도에 바람직한 것으로 보인다. 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK mAb는 빈 2 에피토프에 결합한다.
비닝된 단일 항-MerTK HuMAb를 빈 3에 할당하였다. 본 개시내용은 hMerTK 상의 빈 3 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 특정 실시양태에서, 빈 3 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 420 내지 490에 걸친 영역 내의 hMerTK의 Fn 도메인에 위치한다.
MerTK에의 결합에 대해 참조 Ab와 교차-경쟁하는 항-MerTK mAb
또한, 세포의 표면 상에 발현된 hMerTK에 특이적으로 결합하고, hMerTK에의 결합에 대해 참조 Ab 또는 그의 참조 항원-결합 부분과 교차-경쟁하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분이 개시된 발명의 범주 내에 포괄된다. 항원, 예를 들어 MerTK에의 결합에 대해 "교차-경쟁"하는 한 쌍의 Ab의 능력은 제1 Ab가 제2 Ab와 실질적으로 동일한 항원의 에피토프 영역에 결합하여, 제2 Ab가 상기 특정한 에피토프 영역에 결합하는 것을 입체적으로 방해하고, 반대로, 제2 Ab가 제1 Ab와 실질적으로 동일한 항원의 에피토프 영역에 결합하여, 제1 Ab가 상기 에피토프 영역에 결합하는 것을 입체적으로 방해한다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 mAb 2L105의 hMerTK에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 시험 Ab의 능력은 시험 Ab가 mAb 2L105와 실질적으로 동일한 인간 PD-1의 에피토프 영역에 결합함을 입증한다.
제1 Ab가 항원에 대한 제2 Ab의 결합을 적어도 약 40%만큼 감소시키는 경우에, 제1 Ab는 제2 Ab와 "실질적으로 동일한 에피토프"에 결합하는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 제1 Ab는 항원에 대한 제2 Ab의 결합을 약 50% 초과 (예를 들어, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%)만큼 감소시킨다. 보다 바람직한 실시양태에서, 제1 Ab는 항원에 대한 제2 Ab의 결합을 약 70% 초과 (예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%)만큼 감소시킨다. 제1 및 제2 Ab의 순서는 역전될 수 있고, 즉 "제2" Ab가 먼저 표면에 결합될 수 있고, 그 후에 "제1" Ab가 "제2" Ab의 존재 하에 표면과 접촉된다. Ab가 고정된 항원에 첨가되는 순서와 무관하게 항원에 대한 결합의 경쟁적 감소가 관찰되는 경우에, Ab는 "교차-경쟁"하는 것으로 간주된다.
교차-경쟁 Ab는 그가 MerTK 수용체와 같은 항원의 실질적으로 동일한 에피토프 영역에 결합함에 따라 참조 Ab의 특성과 매우 유사한 기능적 특성을 가질 것으로 예상된다. 교차-경쟁 정도가 더 높을수록, 기능적 특성은 더 유사할 것이다. 예를 들어, 2개의 교차-경쟁 Ab는 그들이 각각 나머지 다른 한 Ab의 에피토프에의 결합을 적어도 약 80%만큼 억제하는 경우에 본질적으로 동일한 기능적 특성을 갖는 것으로 예상된다. 교차-경쟁 Ab가 해리 상수 (KD)에 의해 측정 시 에피토프에의 결합에 대해 유사한 친화도를 나타내는 경우에 이러한 기능 상의 유사성은 훨씬 더 가까울 것으로 예상된다.
교차-경쟁 항-항원 Ab는 재조합 항원 분자 또는 세포-표면 발현된 항원 분자를 사용하여 비아코어® 분석, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법을 포함한 표준 항원 결합 검정에서 검출가능하게 경쟁하는 그의 능력에 기초하여 용이하게 확인될 수 있다. 예로서, 시험 Ab가 인간 MerTK에의 결합에 대해 HuMAb 25J80과 경쟁하는지 여부를 확인하기 위한 단순 경쟁 검정은 (1) 인간 MerTK가 고정되는 비아코어® 칩 (또는 SPR 분석을 위한 다른 적합한 배지)에의 포화 농도로 적용된 25J80의 결합을 측정하는 것, 및 (2) 시험 Ab가 앞서 결합되어 있는 인간 MerTK-코팅된 비아코어® 칩 (또는 다른 적합한 배지)에의 25J80의 결합을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 시험 Ab의 존재 및 부재 하에 MerTK-1-코팅된 표면에 대한 25J80의 결합이 비교된다. 시험 Ab의 존재 하에 25J80의 결합의 유의한 (예를 들어, 약 40% 초과) 감소는 두 Ab 모두가 MerTK 표적에 대한 결합에 대해 그들이 경쟁하도록 실질적으로 동일한 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. 항원에 대한 제1 Ab의 결합이 제2 Ab에 의해 억제되는 백분율은 하기와 같이 계산될 수 있다: [1-(제2 Ab의 존재 하에 제1 Ab의 검출된 결합)/(제2 Ab의 부재 하에 제1 Ab의 검출된 결합)] x 100. Ab가 교차-경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 25J80의 존재 하에 MerTK-코팅된 칩에의 시험 Ab의 결합을 측정하는 것을 제외하고는 경쟁적 결합 검정을 반복한다.
본원에 개시된 임의의 항-MerTK Ab는 교차-경쟁 검정에서 참조 Ab로서 기능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 참조 Ab는 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 255 또는 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH; 및
(b) 서열식별번호: 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 256 또는 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL.
추가 실시양태에서, 참조 Ab 또는 그의 참조 항원-결합 부분은 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
(l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL.
구조적으로 정의된 항-MerTK mAb
본 개시내용은 또한 세포의 표면 상에 발현된 hMerTK에 특이적으로 결합하고, 각각:
(a) 서열식별번호: 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
(l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL
내의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.
Ab 내의 CDR 도메인을 상술하는 상이한 방법이 개발되었다. 널리 사용되는 카바트 정의 이외에도, 카바트 정의의 결점을 해소하고자 하는 코티아, AbNum, AbM, 접촉 및 IMGT 정의를 비롯한 다른 것들이 사용되었다.
카바트 및 동료들의 접근법 (Wu 및 Kabat, 1970; Kabat et al., 1983)은 CDR이 Ab에 대부분의 가변 위치를 포함하고, 따라서 극히 제한된 수의 Ab 서열을 정렬함으로써 확인되고, 이어서 이용가능할 수 있다는 가정에 기초하였다. 이러한 정렬에 기초하여, 카바트 등은 초가변 영역 내의 잔기에 대해 넘버링 스킴을 도입하고, 어느 위치가 각각의 CDR의 처음과 끝을 마킹하는지를 결정하였다 (http://bioinf.org.uk/abs/simkab.html).
코티아 정의는 Ab의 서열과 그의 CDR의 구조적 루프 영역 사이의 관계를 결정하기 위해 소수의 Ab 구조의 분석에 기초한다 (Chothia et al., 1987; 1989; Al-Lazikani et al., 1997; http://bioinf.org.uk/abs/chothia.html). FR과 CDR의 경계를 결정하였고, 후자는 CDR 내의 주요 위치에서의 특정 잔기의 존재 및 플랭킹 FR에 기초하여 제한된 입체형태 세트를 취하는 것으로 제시되었다. 생성된 코티아 넘버링 스킴은 카바트 스킴과 거의 동일하지만, 구조적 고려사항에 기초하여, VL CDR1 및 VH CDR1 내의 상이한 위치에 삽입을 배치한다. 보다 많은 실험 데이터가 이용가능해짐에 따라, CDR의 경계의 재-분석 및 재-정의가 진행 중이었다. 문헌 [Abhinandan 및 Martin (2008)]은 구조의 맥락에서 Ab 서열 정렬을 분석하였고, 수동으로 주석이 달린 카바트 데이터베이스에서의 서열의 대략 10%가 오류 또는 불일치를 함유한다는 것을 발견하였다. 그들은 CDR 및 프레임워크 전반에 걸쳐 구조적으로 정확한 코티아 방식의 교정된 버전을 제안하였으며, 카바트, 코티아 및 변형된-코티아 넘버링을 자동적이고 신뢰할 수 있는 방식으로 적용하는 소프트웨어 도구를 개발하였다 (AbNum; http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/에서 이용가능함). 또 다른 방법인 AbM 정의는 카바트 및 코티아 정의 사이의 절충안을 나타내며, 이는 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)의 AbM Ab 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다 (http://www.bioinf.org.uk/abs; Martin et al., 1989).
접촉 정의는 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank) (http://bioinf.org.uk/abs/; MacCallum et al., 1996)에서 이용가능한 복잡한 결정 구조 내의 Ab와 항원 사이의 접촉 분석에 기초한다.
CDR을 규정하기 위한 보다 최근의 시도는 Ig, T-세포 수용체 (TcR) 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 대한 뉴클레오티드 서열 정보를 선별하는 IMGT 데이터베이스의 시도이다 (Lefranc et al. (2003; http://www.imgt.org). 이는 5000개 초과의 Ig 및 TcR 가변 영역 서열을 정렬시키는 것에 기초하여, Ig 및 TcR 서열에 대한 균일한 넘버링 시스템을 제안한다.
본원에 개시된 항-MerTK mAb에 대한 CDR은 카바트, 코티아 및 IMGT 정의를 사용하여 상술되었다 (표 3-14 참조). 임의의 주어진 mAb에 대해, CDR은 표 3-14에 제시된 바와 같은 카바트, 코티아 및 IMGT 정의 중 임의의 것 및 그의 임의의 조합을 사용하여 확인될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 표 3-14에 제시된 CDR 서열에 상응하는 6개의 CDR 세트를 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb를 제공한다.
예로서, mAb 1B4에 기초하여, 본 개시내용은 카바트, 코티아 및/또는 IMGT 방법에 의해 정의된 바와 같은 하기 CDR 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
(a) 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 4-6 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 7-9 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 10-12 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 13-15 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 16-18 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
본 개시내용은 또한 IMGT 방법에 의해 정의된 바와 같은 하기 CDR 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
(a) 서열식별번호: 3으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 6으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 9로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 12로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 15로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 18로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
또 다른 예로서, mAb 25J80에 기초하여, 본 개시내용은 카바트, 코티아 및/또는 IMGT 방법에 의해 정의된 바와 같은 하기 CDR 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
(a) 서열식별번호: 73-75 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 76-78 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 79-81 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 82-84 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 85-87 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호 88-90 중 어느 하나로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
본 개시내용은 또한 카바트 방법에 의해 정의된 바와 같은 하기 CDR 도메인을 포함하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
(a) 서열식별번호: 73으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 76으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 79로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 82로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 85로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 88로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
Ab에 대한 구조적 정보가 이용가능하지 않을 때 개발되었음에도 불구하고, 카바트 정의가 CDR 도메인을 예측하는 데 가장 통상적으로 사용되는 방법이다. 명백하게 언급되지 않는 경우 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 개시된 CDR은 카바트 정의를 사용하여 확인되었다.
개시된 발명은 또한 세포의 표면 상에 발현된 hMerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 포괄하고, 여기서 단리된 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
(k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
(l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL.
본 발명은 세포의 표면 상에 발현된 hMerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 추가로 포괄하고, 여기서 단리된 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 219로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 220으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(b) 서열식별번호: 223으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 224로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(c) 서열식별번호: 227로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 228로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(d) 서열식별번호: 231로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 232로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(e) 서열식별번호: 235로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 236으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(f) 서열식별번호: 239로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 240으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(g) 서열식별번호: 243으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 244로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
(h) 서열식별번호: 247로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 248로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열식별번호: 251로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 252로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄.
상기 항-MerTK Ab 중 임의의 것의 아미노산 서열과 고도로 유사하거나, 또는 상동성인 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 이들 Ab의 기능적 특성을 유지하는 항-MerTK Ab가 또한 본 방법에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 적합한 Ab는 각각 서열식별번호: 245 및/또는 246에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 각각 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함하는 mAb를 포함한다. 추가 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 245 및/또는 246에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 두 서열 사이의 서열 동일성 정도를 최대화시키기 위해 도입된, 임의의 갭의 수, 및 각 상기 갭의 길이를 고려하여, 비교되는 서열의 길이 대비 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/비교되는 위치의 총 수 x 100)이다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 널리 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4 이소형의 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 이소형의 것이다. 특정 실시양태에서, 단리된 항-MerTK Ab는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 전장 Ab이다. 추가 실시양태에서, 전장 Ab는 IgG1 또는 IgG4 이소형의 것이다.
항-MerTK Ab의 기능적 항원-결합 부분
또한 본 개시내용에 의해 제공된 항-MerTK Ab는 전장 Ab 외에도 항원-결합 단편을 포함한다. Ab의 항원-결합 기능은 전장 Ab의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 충분히 입증되었다. Ab의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) Ab의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 및 (v) Ab의 단일 단량체 가변 도메인으로 이루어진 단일 도메인 Ab (sdAb) 또는 나노바디를 포함한다. 통상의 Ab 이외에도, 낙타과 종 예컨대 낙타, 알파카 및 라마, 및 연골 어류 예컨대 상어 및 가오리는, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 동종이량체로 이루어지고 경쇄가 없는 중쇄 Ab (hcAb)의 서브세트를 함유한다. 제1 sdAb는 원래 낙타과에서 (이들은 VHH 단편으로 명명됨), 또는 연골 어류에서 (VNAR 단편) 발견되는 hcAb로부터 조작되었으나, 통상의 Ab로부터 이량체 가변 도메인을 분리시킴으로써 또한 생성될 수 있다. 중쇄 가변 도메인으로부터 유래된 sdAb 이외에도, 경쇄로부터 유래된 나노바디가 또한 특이적 항원에 선택적으로 결합하는 것으로 제시되었다.
처음에 효소 예컨대 파파인 및 펩신에 의한 단백질분해를 통해 수득된 Ab 단편은 후속적으로 1가 및 다가 항원-결합 단편으로 조작되었다. 예를 들어, Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 상기 도메인이 VL 및 VH 영역이 쌍형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커 펩티드에 의해 연결됨으로써 단일 쇄 가변 단편 (scFv)으로 공지된 1가 분자를 형성할 수 있다. 2가 또는 이가 scFv (디-scFv 또는 비-scFv)는 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 함유하는 탠덤 scFv로 공지된 단일 펩티드 쇄 내에서 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. ScFv 이량체 및 그 초과의 다량체는 또한 두 가변 영역이 함께 폴딩하기에는 너무 짧은 10개 미만의 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드를 사용하여 생성될 수 있으며, 상기와 같이 너무 짧기 때문에 scFv는 이량체화되고, 디아바디를 생성하거나, 또는 다른 다량체를 형성하게 된다. 디아바디는 상응하는 scFv에 대한 KD 값보다 최대 40배 더 낮은 해리 상수를 가지며, 상기 scFv보다 훨씬 더 높은 친화도로 그의 동족 항원에 결합하는 것으로 제시되어 있다. 매우 짧은 링커 (≤3개 아미노산)를 통해, 그의 항원에 대하여 디아바디보다 훨씬 더 높은 친화도를 보이는 3가 트리아바디 또는 4가 테트라아바디가 형성된다. 다른 변이체는 scFv-CH3 이량체인 미니바디, 및 더 큰 scFv-Fc 단편 (scFv-CH2-CH3 이량체)을 포함하고, 심지어 단리된 CDR도 항원-결합 기능을 나타낼 수 있다. 이들 Ab 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 종래의 재조합 기술을 사용하여 조작되고, 단편은 무손상 Ab와 같은 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 상기 단백질분해 및 조작된, Ab의 단편 및 관련 변이체 모두 (추가의 설명을 위해 문헌 [Hollinger 및 Hudson, 2005; Olafsen 및 Wu, 2010] 참조) Ab의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다.
개시된 발명의 특정 측면에서, 단리된 항-MerTK Ab의 항원-결합 부분은 Ab 단편 또는 단일 쇄 Ab이다. 특정 실시양태에서, Ab 단편은 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편, sdAb, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 2가 scFv (디-scFv) 및 이가 scFv (비-scFv), 디아바디, 미니바디, 및 CDR로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, Ab 단편은 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편 및 단일 쇄 가변 단편 (scFv)으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단리된 항-MERTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Ab 또는 그의 단편이다. 다른 실시양태에서, 그것은 인간화 Ab 또는 그의 단편이다. 추가 실시양태에서, 그것은 키메라 Ab 또는 그의 단편이다. 다른 실시양태에서, 단리된 항-MERTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 마우스 Ab 또는 그의 단편이다. 인간 대상체에게의 투여를 위해, Ab는 바람직하게는, 키메라 Ab 또는 보다 바람직하게는, 인간화 또는 인간 Ab이다. 상기 키메라, 인간화, 인간 또는 마우스 mAb는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조 및 단리될 수 있다.
항-MerTK 면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료제, 예컨대 세포독소 또는 방사성 동위원소에 연결된, 본원에 개시된 단리된 항-MerTK Ab, 또는 그의 항원-결합 부분 중 어느 하나에 관한 것이다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 세포독소가 관련 기술분야에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 발명의 Ab에 접합될 수 있다. 방사선면역접합체를 제조하는 방법이 또한 관련 기술분야에 확립되어 있다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분과는 상이한 결합 특이성을 갖는 결합 도메인에 연결된, 본원에 개시된 단리된 항-MerTK Ab 중 어느 하나, 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자에 관한 것이다. 결합 도메인은 생성된 이중특이적 분자가 적어도 2종의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하도록 하는 기능적 분자 (예를 들어, 또 다른 Ab, Ab의 항원-결합 부분, 또는 수용체에 대한 리간드)일 수 있다.
항-MerTK Ab를 코딩하는 핵산 및 Ab를 발현하기 위한 용도
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 발명의 단리된 항-MerTK Ab를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 개시내용은 본원에 기재된 MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분 중 임의의 것을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. "단리된" 핵산은 현저히 상이한, 즉, 자연상에 존재하는 것과 같은 핵산과 구별되는 화학적 정체, 성질 및 유용성을 갖는 핵산 조성물 물질을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 DNA는 천연 DNA와는 달리, 천연 DNA의 독립적 부분이고, 자연계에서 발견되는, 보다 큰 구조적 복합체인 염색체의 내재성 부분이 아니다. 추가로, 천연 DNA와 달리, 단리된 DNA는 특히, 질환을 진단하거나 또는 치료제의 효능을 예측하기 위해 유전자 발현을 측정하고 바이오마커 유전자 또는 돌연변이를 검출하기 위한 PCR 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 단리된 핵산은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질이 실질적으로 없도록 정제될 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 Ig 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 Ab의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 Ab의 경쇄 및 중쇄 또는 가변 영역을 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 기술에 의해 수득될 수 있다. 일단 VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 수득하고 나면, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 이들 DNA 단편을 추가로 조작하여 예를 들여, 가변 영역 DNA를 전장 Ab 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로, 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. Ig 유전자 라이브러리로부터 수득된 Ab의 경우 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용함), Ab를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 핵산은, 예를 들어, RNA 또는 DNA 예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 cDNA이다.
본 개시내용은 또한 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 추가로 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는, 포유동물 숙주 세포가 Ab 발현을 위한 숙주 세포로서 바람직한데, 그 이유는 상기 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다, 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성을 띠는 Ab를 어셈블리하고, 분비할 수 있는 가능성이 더 크기 때문이다. 본 발명의 재조합 Ab를 발현하는 데 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Kaufman 및 Sharp, 1982), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다.
숙주 세포는 항-MerTK mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제조하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 숙주 세포에서 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하고, 숙주 세포로부터 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 단리하는 것을 포함한다. 숙주 세포는 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있다. Ab 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는 둘 다가 동일한 벡터 내로 삽입된다. Ab의 VH 및 VL 세그먼트는 이들 가변 영역을 코딩하는 DNA를 이미 원하는 이소형의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고, Vκ 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 이소형의 전장 Ab를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 트랜스진을 포함하고, 본원에 개시된 항-MerTK HuMAb 중 임의의 것을 발현하는 것인 트랜스제닉 마우스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 마우스로부터 제조된 HuMAb를 생산하는 하이브리도마를 포괄한다.
개시된 치료 방법에 사용하기에 적합한 항-MerTK Ab
개시된 방법에 사용하기에 적합한 항-MerTK Ab는 높은 특이성 및 친화도로 세포의 표면 상에 발현된 MerTK에 특이적으로 결합하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 hMerTK 및 cMerTK 둘 다와 교차-반응하고, 이는 시노몰구스 원숭이에서 Ab의 독성학적 연구를 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 hMerTK, cMerTK 및 mMerTK와 교차-반응한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 MerTK에 대한 Gas6의 결합을 억제하고 MerTK/Gas6 신호전달을 억제한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 대략 아미노산 105 내지 165에 걸친 영역 내에 위치하는 hMerTK의 에피토프, 대략 아미노산 195 내지 270에 걸친 영역 내에 위치하는 에피토프 또는 대략 아미노산 420 내지 490에 걸친 영역 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 대략 아미노산 195 내지 270에 걸친 영역 내에 또는 보다 구체적으로 대략 아미노산 231 내지 249에 걸친 영역 내에 위치하는 hMerTK의 에피토프에 결합한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 모두를 포함하는 hMerTK의 에피토프에 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 생체내에서 암 세포의 성장을 감소시키는 데 있어서 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1/항-PD-L1 Ab와 상승작용적으로 상호작용한다. 본원에서 Ab는 이들 Ab의 조합의 항종양 효능이 각각의 Ab에 의해 개별적으로 나타나는 항종양 효능의 합보다 더 큰 경우에 상승작용적으로 상호작용하는 것으로 간주된다.
항-MerTK Ab 및 체크포인트 억제제를 사용한 조합 요법의 효능이 주로 항-PD-1 Ab를 사용하여 본원에서 입증되었지만, T 세포 반응을 조절하는 여러 다른 공동자극 및 억제 수용체 및 리간드가 확인되었다. 자극 수용체의 예는 유도성 T 세포 공동-자극인자 (ICOS), CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD27, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR) 및 헤르페스바이러스 진입 매개체 (HVEM)를 포함하고, 반면에 PD-1/PD-L1 이외의 억제 수용체의 예는 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4 (CTLA-4), B 및 T 림프구 감쇠자 (BTLA), T 세포 이뮤노글로불린 및 뮤신 도메인-3 (TIM-3), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 아데노신 A2a 수용체 (A2aR), 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG-1), 자연 킬러 세포 수용체 2B4 (CD244), CD160, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체 (TIGIT), 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA)에 대한 수용체를 포함한다 (Mellman et al., 2011; Pardoll, 2012; Baitsch et al., 2012). 이들 수용체 및 그의 리간드는 면역 반응의 억제를 자극하거나 방지하여 종양 세포를 공격하도록 설계된 치료제를 위한 표적을 제공한다 (Weber, 2010; Mellman et al., 2011; Pardoll, 2012). 자극 수용체 또는 수용체 리간드는 효능제 작용제에 의해 표적화되는 반면에, 억제 수용체 또는 수용체 리간드는 차단제에 의해 표적화된다. 많은 면역 체크포인트가 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되기 때문에, 이들은 Ab에 의해 용이하게 차단될 수 있거나 또는 재조합 형태의 리간드 또는 수용체에 의해 조정될 수 있다. PD-1/PD-L1 이외의 T 세포 반응을 조절하는 공동자극 및 억제 수용체 및 리간드 중 1종 이상은 종양 성장을 억제하기 위해 본원에 개시된 항-MerTK Ab와 상승작용하기 위한 표적을 제공할 수 있다. 실제로, 상승작용적 항종양 효능은 면역요법-저항성 마우스 4T1 유방 암종 모델에서 항-MerTK Ab, 4E9 및 CTLA4 차단의 조합을 사용하여, 뿐만 아니라 CT26 및 MC38 마우스 동계 종양 모델에서 항-OX40 및 항-GITR 효능제 Ab를 사용하여 입증되었다 (데이터는 제시되지 않음).
체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1의 항종양 효능을 증진시키는 데 효과적이고 하기 바람직한 특징 중 적어도 1개, 여러 개 또는 모두를 나타내는 특정 항-MerTK-1 mAb가 본 개시내용에 의해 제공된다: (a) SPR (비아코어®) 분석에 의해 결정 시, 약 100 nM 이하의 KD, 바람직하게는 약 50 nM 이하의 KD로 hMerTK 및 cMerTK에 결합함; (b) 인간 Axl 또는 Tyro3에 실질적으로 결합하지 않음; (c) 약 1 nM 이하의 IC50으로 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스를 억제함; (d) MerTK에 대한 Gas6의 결합을 억제하고, 약 10 nM 이하, 바람직하게는 약 1 nM 이하의 IC50으로 hMerTK/Gas6 신호전달을 억제함; (e) 생체내에서 종양 세포 성장을 억제함; 및 (f) 생체내에서 암 세포의 성장을 감소시키는 데 있어서 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1/항-PD-L1 Ab와 상승작용적으로 상호작용함. 본원에 기재된 치료 방법, 조성물 또는 키트에서 사용될 수 있는 특정 항-MerTK Ab는 높은 친화도로 hMerTK에 특이적으로 결합하고 상기 특징 중 적어도 3개, 바람직하게는 모두를 나타내는 mAb를 포함한다.
개시된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 항-PD-1/항-PD-L1 Ab
본원에 개시된 암 치료 방법, 조성물, 또는 키트에서 사용하기에 적합한 항-PD-1 Ab는 높은 특이성 및 친화도로 PD-1에 결합하고, PD-L1 및/또는 PD-L2의 PD-1에의 결합을 차단하고, PD-1 신호전달 경로의 면역억제 효과를 억제하는, 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 포함한다. 유사하게, 이들 방법에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 Ab는 높은 특이성 및 친화도로 PD-L1에 결합하고, PD-L1의 PD-1 및 CD80 (B7-1)에의 결합을 차단하고, PD-1 신호전달 경로의 면역억제 효과를 억제하는, 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분이다. 본원에 개시된 치료 방법 중 임의의 것에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 Ab는 각각 PD-1 수용체 또는 PD-L1 리간드에 결합하고, 수용체-리간드 결합을 억제하고, T 세포 활성의 억제를 역전시켜 면역 반응을 상향조절하는 데 있어 전체 Ab의 것과 유사한 기능적 특성을 보이는 항원-결합 부분 또는 단편을 포함한다.
항-PD-1 Ab
높은 친화도로 PD-1에 특이적으로 결합하는 mAb는 미국 특허 번호 8,008,449에 개시되어 있다. 다른 항-PD-1 mAb는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,488,802, 8,168,757, 8,354,509, 및 9,205,148에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 8,008,449에 개시된 항-PD-1 mAb는 하기 특징 중 여러 개 또는 모두를 나타내는 것으로 입증되었다: (a) SPR (비아코어®) 바이오센서 시스템에 의해 결정 시, 약 50 nM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함; (b) 인간 CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않음; (c) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정법에서 T-세포 증식, 인터페론-γ 생산 및 IL-2 분비를 증가시킴; (d) 인간 PD-1 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합함; (e) PD-L1 및 PD-L2의 PD-1에의 결합을 억제함; (f) CD4+CD25- T 세포의 증식 및 인터페론-γ 생산에 대해 Treg 세포에 의해 부여된 억제를 해제시킴; (g) 항원-특이적 기억 반응을 자극함; (h) Ab 반응을 자극함; 및 (i) 생체내에서 종양 세포 성장을 억제함. 개시된 치료 방법, 조성물 또는 키트에서 사용가능한 항-PD-1 Ab는 높은 친화도로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, 상기 특징 중 적어도 5개, 바람직하게는 모두를 나타내는 mAb를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 항-PD-1 Ab는 (a) SPR (비아코어®)에 의해 결정 시, 약 10 nM 내지 0.1 nM의 KD로 인간 PD-1에 결합하고; (b) MLR 검정법에서 T-세포 증식, 인터페론-γ 생산 및 IL-2 분비를 증가시키고; (c) PD-L1 및 PD-L2의 PD-1에의 결합을 억제하고; (d) CD4+CD25- T 세포의 증식 및 인터페론-γ 생산에 대해 Treg에 의해 부여된 억제를 역전시키고; (e) 항원-특이적 기억 반응을 자극하고; (f) 생체내에서 종양 성장 세포 성장을 억제한다.
다른 항-PD-1 mAb는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,808,710, 7,488,802, 8,168,757 및 8,354,509, 미국 공개 번호 2016/0272708, 및 PCT 공개 번호 WO 2008/156712, WO 2012/145493, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/206107, WO 2015/035606, WO 2015/085847, WO 2015/112800, WO 2015/112900, WO 2016/106159, WO 2016/197367, WO 2017/020291, WO 2017/020858, WO 2017/024465, WO 2017/024515, WO 2017/025016, WO 2017/025051, WO 2017/040790, WO 2017/106061, WO 2017/123557, WO 2017/132827, WO 2017/133540 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 mAb는 니볼루맙 (옵디보®; 이전에 5C4, BMS-936558, MDX-1106, 또는 ONO-4538로 지정됨), 펨브롤리주맙 (키트루다®; 이전에 람브롤리주맙 및 MK-3475로 지정됨; WO 2008/156712A1 참조), PDR001 (WO 2015/112900 참조), MEDI-0680 (이전에 AMP-514로 지정됨; WO 2012/145493 참조), REGN-2810 (WO 2015/112800 참조), JS001 (문헌 [Liu 및 Wu, 2017] 참조), BGB-A317 (WO 2015/035606 및 US 2015/0079109 참조), INCSHR1210 (SHR-1210; WO 2015/085847; 문헌 [Liu 및 Wu, 2017] 참조), TSR-042 (ANB011; WO 2014/179664 참조), GLS-010 (WBP3055; 문헌 [Liu 및 Wu, 2017] 참조), AM-0001 (WO 2017/123557 참조), STI-1110 (WO 2014/194302 참조), AGEN2034 (WO 2017/040790 참조), 및 MGD013 (WO 2017/106061 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항-PD-1 Ab의 투여를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 치료 방법의 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-PD-1 Ab는 니볼루맙 (옵디보®)이며, 이는 다수의 다양한 암 치료용으로서 이미 미국 식품 의약품국 (FDA)의 승인을 받은 것이다. 니볼루맙은 PD-1 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)와의 상호작용을 선택적으로 방지하여 항종양 T-세포 기능의 하향-조절을 차단하는 완전 인간 IgG4 (S228P) PD-1 면역 체크포인트 억제제 Ab이다 (미국 특허 번호 8,008,449에 mAb C5로서 기재됨; 문헌 [Wang et al., 2014]). 다른 바람직한 실시양태에서, 항-PD-1 Ab는 펨브롤리주맙 (키트루다®; PD-1에 대해 지시되는 인간화 모노클로날 IgG4 Ab이며, 미국 특허 번호 8,354,509에 h409A11로 기재됨)이며, 이는 또한 다수의 암 적응증에 대해 승인을 받은 것이다.
개시된 방법에서 사용가능한 항-PD-1 Ab, 조성물 또는 키트는 또한 인간 PD-1 (hPD-1)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 항-PD-1 Ab 중 어느 하나와 인간 PD-1에의 결합에 대해 교차-경쟁하는 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb, 예를 들어, 니볼루맙 (5C4; 예를 들어, 미국 특허 번호 8,008,449; WO 2013/173223 참조) 및 펨브롤리주맙을 포함한다. 항원, 본 경우에서, 인간 PD-1에의 결합에 대해 참조 Ab, 예를 들어, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 교차-경쟁하는 Ab는 표준 PD-1 결합 검정법 예컨대 비아코어® 분석, ELISA 검정법 또는 유동 세포측정법에서 용이하게 확인될 수 있다 (예를 들어, WO 2013/173223 참조). 특정 실시양태에서, 항-PD-1 Ab는 본원에 기재된 항-PD-1 Ab 중 임의의 것, 예를 들어, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 동일한 에피토프에 결합한다.
개시된 발명의 방법에서 사용가능한 항-PD-1 Ab는 또한 Fab, F(ab')2, Fd 또는 Fv 단편, sdAb, scFv, 디-scFv 또는 비-scFv, 디아바디, 미니바디 또는 단리된 CDR을 비롯한 항원-결합 부분을 포함한다 (추가의 상세한 설명을 위해, 문헌 [Hollinger 및 Hudson, 2005; Olafsen 및 Wu, 2010] 참조).
특정 실시양태에서, 단리된 항-PD-1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-PD-1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG4 이소형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 이소형의 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-PD-1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분의 IgG4 중쇄 불변 영역은, 힌지 영역 내의 세린 잔기를 IgG1 이소형 Ab의 상응하는 위치에서 일반적으로 발견되는 프롤린 잔기로 대체하는 S228P 돌연변이 (카바트 시스템을 사용하여 넘버링; 문헌 [Kabat et al., 1983])를 함유한다. 니볼루맙에 존재하는 상기 돌연변이는 야생형 IgG4 Ab와 연관된 Fc 수용체 활성화를 위한 낮은 친화도는 유지하면서, 내인성 IgG4 Ab와의 Fab 아암 교환을 방지한다 (Wang et al., 2014). 또 다른 실시양태에서, Ab는 인간 카파 또는 람다 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 방법의 다른 실시양태에서, 항-PD-1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 mAb 또는 그의 항원-결합 부분이다. 인간 대상체에게의 투여의 경우에, 항-PD-1 Ab는 바람직하게는, 키메라 Ab 또는 보다 바람직하게는, 인간화 또는 인간 Ab이다. 상기 키메라, 인간화 또는 인간 mAb는 관련기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,008,449에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.
항-PD-L1 Ab
항-PD-1 및 항-PD-L1은 동일한 신호전달 경로를 표적화하고, 임상 시험에서 다양한 암에서 유사한 수준의 효능을 나타내는 것으로 제시되어 있으므로 (예를 들어, 문헌 [Brahmer et al., 2012]; WO 2013/173223 참조), 항-PD-L1 Ab는 본원에 개시된 조합 요법 방법에서 항-PD-1 Ab를 대신하여 치환될 수 있다.
개시된 방법, 조성물 또는 키트에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 Ab는 높은 특이성 및 친화도로 PD-L1에 결합하고, PD-L1의 PD-1에의 및 CD80에의 결합을 차단하고, PD-1 신호전달 경로의 면역억제 효과를 억제하는 단리된 Ab이다. 높은 친화도로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 mAb는 미국 특허 번호 7,943,743에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 mAb는 미국 특허 번호 8,217,149, 8,779,108, 9,175,082 및 9,624,298, 및 PCT 공개 번호 WO 2012/145493에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 7,943,743에 개시된 항-PD-1 HuMAb는 하기 특징 중 1개 이상을 나타내는 것으로 입증되었다: (a) SPR (비아코어®)에 의해 결정 시, 약 50 mM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함; (b) MLR 검정법에서 T-세포 증식, 인터페론-γ 생산 및 IL-2 분비를 증가시킴; (c) Ab 반응을 자극함; (d) PD-L1의 PD-1에의 결합을 억제함; 및 (e) T 세포 이펙터 세포 및/또는 수지상 세포에 대한 Treg의 억제 효과를 역전시킴. 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기 위한 항-PD-L1 Ab는 높은 친화도로 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 상기 특징 중 적어도 1개, 일부 실시양태에서, 적어도 3개, 바람직하게는, 모두를 나타내는, 단리된 Ab, 바람직하게는 mAb를 포함한다. 예를 들어, 이들 방법에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 Ab는 (a) 표면 플라즈몬 공명 (비아코어®)에 의해 결정 시, 약 50 mM 내지 0.1 mM의 KD로 인간 PD-1에 결합하고; (b) MLR 검정법에서 T-세포 증식, 인터페론-γ 생산 및 IL-2 분비를 증가시키고; (c) PD-L1의 PD-1에의 및 CD80에의 결합을 억제하고; (d) T 세포 이펙터 세포 및/또는 수지상 세포에 대한 Treg의 억제 효과를 역전시킨다.
본 방법에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 Ab는 BMS-936559 (이전에 MDX-1105; 미국 특허 번호 7,943,743에서 12A4로 지정됨)이다. 다른 적합한 항-PD-L1 Ab는 아테졸리주맙 (테센트릭)®; 이전에 RG7446 및 MPDL3280A로 공지됨; 미국 특허 번호 8,217,149에서 YW243.55S70으로 지정됨; 또한 문헌 [Herbst et al., 2014] 참조), 두르발루맙 (임핀지®; 이전에 MEDI-4736으로 공지됨; 미국 특허 번호 8,779,108에서 2.14H9OPT로 지정됨), 아벨루맙 (바벤시오(BAVENCIO)®; 이전에 MSB-0010718C로 공지됨; 미국 특허 번호 9,624,298에서 A09-246-2로 지정됨), STI-A1014 (미국 특허 번호 9,175,082에서 H6으로 지정됨), CX-072 (WO 2016/149201 참조), KN035 (문헌 [Zhang et al., 2017] 참조), LY3300054 (예를 들어, WO 2017/034916 참조), 및 CK-301 (문헌 [Gorelik et al., 2017] 참조)을 포함한다.
개시된 방법, 조성물, 또는 키트에서 사용하기에 적합한 항-PD-L1 Ab는 또한 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 본원에 개시된 항-PD-L1 Ab 중 어느 하나, 예를 들어, BMS-936559 (12A4; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,943,743; WO 2013/173223 참조), 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙 또는 STI-A1014일 수 있는 참조 Ab와 인간 PD-L1에의 결합에 대해 교차-경쟁하는 단리된 Ab를 포함한다. 인간 PD-L1에의 결합에 대해 참조 Ab와 교차-경쟁할 수 있는 Ab의 능력은 상기 Ab가 참조 Ab와 동일한 PD-L1의 에피토프 영역에 결합한다는 것을 입증하고, 실질적으로 동일한 PD-L1의 에피토프 영역에 그가 결합한다는 점에서 참조 Ab의 특성과 매우 유사한 기능적 특성을 가질 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 Ab는 본원에 기재된 항-PD-L1 Ab 중 임의의 것, 예를 들어, 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙 또는 STI-A1014와 동일한 에피토프에 결합한다. 교차-경쟁 Ab는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 PD-L1 결합 검정법 예컨대 비아코어® 분석, ELISA 검정법 또는 유동 세포측정법에서 참조 Ab 예컨대 아테졸리주맙 또는 아벨루맙과 교차-경쟁할 수 있는 그의 능력에 기초하여 용이하게 확인될 수 있다 (예를 들어, WO 2013/173223 참조).
특정의 바람직한 실시양태에서, 본 방법에서 사용하기 위한 단리된 항-PD-L1 Ab는 mAb이다. 다른 실시양태에서, 특히 인간 대상체에게의 투여의 경우에, 이들 Ab는 바람직하게는, 키메라 Ab, 또는 보다 바람직하게는, 인간화 또는 인간 Ab이다. 키메라, 인간화 및 인간 Ab는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,943,743에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 또는 IgG4 이소형의 것이다. 추가 실시양태에서, 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분의 IgG4 중쇄 불변 영역의 서열은 S228P 돌연변이를 함유한다. 다른 실시양태에서, Ab는 인간 카파 또는 람다 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 항-PD-L1 Ab는 또한 PD-L1에 결합하고, 수용체 결합을 억제하고 면역계를 상향-조절하는 데 있어 전체 Ab의 것과 유사한 기능적 특성을 나타내는, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 및 scFv, 디-scFv 또는 비-scFv, 및 scFv-Fc 단편, 나노바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 단리된 CDR을 비롯한, 상기 Ab의 항원-결합 부분을 포함한다.
치료 방법
단독요법으로서 항-MerTK Ab를 사용한 암 치료
본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나, 또는 상기 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나를 포함하는 제약 조성물을 투여하여, 대상체가 치료되도록 하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나, 또는 상기 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나를 포함하는 제약 조성물을 투여하여, 대상체에서의 종양 세포의 성장이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
실시예 6-8에 기재된 바와 같이, 3종의 상이한 항-MerTK moMAb인 2D9, 4E9 및 16B9는 MC38 및 CT26 결장 선암종 종양 모델에서 종양 성장의 단지 약간의 억제를 나타내었지만, 이들 모델에서 항-PD-1 Ab와 조합될 때 매우 강력한 항종양 활성을 나타내었다 (실시예 4-8 참조). 따라서, 특정의 생리학적 맥락에서, 항-MerTK Ab는 항-MerTK Ab를 사용한 단독요법에 비해 체크포인트 억제제 예컨대 항-PD-1 Ab와 조합될 때 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적인 것으로 나타났다.
또 다른 항암제와 조합된 항-MerTK Ab를 사용한 암의 치료
본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 (a) 본원에 개시된 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나 또는 상기 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나를 포함하는 제약 조성물; 및 (b) 암을 치료하기 위한 추가의 치료제를 투여하여, 대상체가 치료되도록 하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상체에게 치료 유효량의 (a) 본원에 개시된 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나 또는 상기 항-MerTK Ab, 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 어느 하나를 포함하는 제약 조성물; 및 (b) 암을 치료하기 위한 추가의 치료제를 투여하여, 대상체에서 종양 세포의 성장이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
임의의 본 방법의 특정의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 환자이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 MerTK-발현 대식세포에 의한 에페로시토시스를 억제한다. 추가 실시양태에서, MerTK Ab는 hMerTK의 빈 2 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역계의 억제를 감소시키는 화합물이다. 예를 들어, 추가의 치료제는 소분자 화합물, 마크로시클릭 펩티드, 융합 단백질 또는 Ab일 수 있다. 추가 실시양태에서, 추가의 치료제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, BTLA, TIM-3, KIR, KLRG-1, A2aR, TIGIT, VISTA 수용체, CD244 또는 CD160에 특이적으로 결합하는 길항작용 Ab이다. 다른 실시양태에서, 추가의 치료제는 ICOS, CD137, CD134, CD27, GITR 또는 HVEM에 특이적으로 결합하는 효능작용 Ab이다. 실시예 4-8에 제시된 데이터는 MerTK-매개 에페로시토시스의 억제가 종양 미세환경에서 증가된 항원 제시, 공동자극 및 염증유발 시토카인 생산을 유발하고, 그에 의해 T 세포-지정 면역요법에 대해 종양을 감작화시킨다는 가설을 확인시켜 준다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 추가의 치료제는 PD-1에 특이적으로 결합하는 길항작용 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 추가의 치료제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 길항작용 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이다. 추가 실시양태에서, 추가의 치료제는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 길항작용 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이다.
개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 암
암 세포를 공격 및 파괴하는 사실상 면역계의 무한한 유연성을 사용하는 것에 의존하는 면역-종양학은 매우 광범위한 암을 치료하는 데 적용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Yao et al., 2013; Callahan et al., 2016; Pianko et al., 2017; Farkona et al., 2016; Kamta et al., 2017] 참조). 항-PD-1 Ab인 니볼루맙은 다수의 상이한 유형의 암을 치료하는 데 효과적인 것으로 제시되었으며 (예를 들어, 문헌 [Brahmer et al., 2015; Guo et al., 2017; Pianko et al., 2017]; WO 2013/173223 참조), 이는 현재 다수의 고형암 및 혈액암에서 임상 시험 중에 있다. 따라서, MerTK 수용체의 차단 또는 PD-1 및 MerTK 수용체의 이중 차단을 사용하는 개시된 방법은 매우 다양한 고형 및 액상 종양 모두를 치료하는 데 적용가능하다.
치료 가능한 광범위한 스펙트럼의 암
본원에 개시된 암 치료 방법에 사용된 Ab는 암 세포를 직접적으로 표적화하지 않고, 대신에 PD-1 신호전달 경로 및 MerTK-매개 에페로시토시스의 이중 차단에 의해 면역계를 표적화하고 증진시켜, 증진된 면역계가 암 세포를 공격하고 파괴하는 데 있어서 용이하게 하기 때문에, 이들 Ab는 광범위한 암의 치료에 적용가능하다. 다양한 암 치료에서의 니볼루맙의 효능은 이미 진행성 흑색종, 진행성 비소세포 폐암, 전이성 신세포 암종, 전형적 호지킨 림프종, 두경부의 진행성 편평 세포 암종, 전이성 요로상피 암종, MSI-H 또는 dMMR 전이성 결장직장암, 간세포성 암종 및 소세포 폐암 (Drugs.com - Opdivo Approval History: https://www.drugs.com/history/opdivo.html)을 치료하기 위한 상기 약물의 승인에 의해 입증된 것으로 나타났으며, 다수의 다른 암에서의 임상 시험이 진행 중이다. 유사하게, 항-PD-L1 약물, 예컨대 아테졸리주맙 (테센트릭®), 두르발루맙 (임핀지®) 및 아벨루맙 (바벤시오®)은 다양한 적응증에서 승인되었다. 따라서, 매우 다양한 상이한 암이 항-MerTK Ab, 특히 항-MerTK 및 항-PD-1/PD-L1 Ab의 조합을 사용하여 치료가능하다. 이러한 치료제 조합에 대해 입증된 높은 효능으로 많은 미충족 의료 필요에 시달린 암에 집중할 수 있게 되었다.
특정 실시양태에서, 개시된 조합 요법 방법은 고형 종양인 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 조합물은, 즉각적인 종양 탈벌킹이 필요하고, 면역원성 부스팅이 효과적인 것으로 입증될 수 있는, 급속하게 진행되는 질환 또는 체크포인트 억제제 요법에 대한 급속한 진행을 갖는 환자에서 특히 효과적일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 고형 종양은 소세포 폐암 (SCLC), 편평 비소세포 폐암 (NSCLC), 비-편평 NSCLC, 및 삼중 음성 유방암 (TNBC)으로부터 선택된 암이다.
본 발명의 항-MerTK Ab 및 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1/PD-L1 Ab의 조합물은 또한 화학요법 및/또는 방사선이 주요 치료 방식이고 지속적인 항종양 면역을 촉진할 필요가 있는 질환의 초기 단계에서 효과적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 식도암, 위암, 직장암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 및 두경부의 편평 세포 암종 (SCCHN)으로부터 선택된 암이다.
특정의 다른 실시양태에서, 항-MerTK Ab를 포함하는 조합 요법은 종양 면역원성을 증진시키고 염증 반응을 촉진하기 위해 높은 대식세포 함량으로 비-염증발생 종양을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 조합물은 췌장관 선암종 (PDAC), 전이성 거세-저항성 전립선암 (mCRPC) 및 다형성 교모세포종 (GBM)으로부터 선택된 고형 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.
특정의 다른 실시양태에서, 고형 종양은 흑색종, 신암, NSCLC, 결장직장암, 위암, 방광암 및 교모세포종으로부터 선택된다.
특정의 다른 실시양태에서, 고형 종양은 SCLC, NSCLC, 편평 NSCLC, 비-편평 NSCLC, 편평 세포암, 췌장암 (PAC), 췌장관 선암종 (PDAC), 난소암, 자궁경부암, 난관 암종, 자궁 (자궁내막) 암, 자궁내막 암종, 자궁 육종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 요도암, 요관암, 전립선암, 전이성 거세-저항성 전립선암 (mCRPC), 고환암, 음경암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암 (TNBC), 남성 유방암, 배세포 종양, 육종, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 메르켈 세포 암종, 골암, 흑색종, 두경부암, 두경부 (SCCHN)의 편평 세포 암종, 갑상선암, 구강암, 구강암, 타액선암, 인후암, 식도암, 위장암, 위암, 소장암, 담낭 및 담관 암, 결장직장암, 결장 암종, 직장암, 항문암, 간암, 간세포암, 신장암, 신세포 암종, 내분비계암, 흉선 종양, 흉선종, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 중피종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌암, 신경교종, 뇌간 신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종 (GBM), 신경모세포종, 뇌하수체 선종, 표피양암, 소아기 고형 종양, 소아 육종, 횡문근육종, 전이성 암, 원인불명 원발성 기원의 암, 환경-유발 암, 바이러스-관련 암, AIDS-관련 암, 카포시 육종, 바이러스 기원의 암, 진행성, 불응성　및/또는 재발성 고형 종양, 및 상기 고형 종양의 임의의 조합으로부터 선택된 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 진행성, 절제불가능, 전이성, 불응성 암, 및/또는 재발성 암이다.
특정 실시양태에서, 본 조합 요법 방법은 혈액 악성종양인 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 혈액 악성종양은 모든 유형의 백혈병, 림프종, 및 골수종을 비롯한, 2개의 주요 혈액 세포 계통, 즉, (과립구, 적혈구, 혈전구, 대식세포 및 비만 세포를 생산하는) 골수 세포주, 또는 (B, T, NK 및 형질 세포를 생산하는) 림프 세포주로부터 유래된 액상 종양을 포함한다. 본 조합 요법 방법을 사용하여 치료될 수 있는 혈액 악성종양은 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종, 무증상 골수종, 의미불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 진행성, 전이성, 불응성 및/또는 재발성 혈액 악성종양, 및 상기 혈액 악성종양의 임의의 조합으로부터 선택된 암을 포함한다.
다른 실시양태에서, 혈액 악성종양은 급성, 만성, 림프구성 (림프모구성) 및/또는 골수성 백혈병, 예컨대 ALL, AML, CLL 및 CML; 림프종, 예컨대 HL, NHL (이 중 약 85%는 B 세포 림프종임), 예를 들어 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), 외투 세포 림프종, 변연부 B-세포 림프종 (점막-연관 림프성 조직 (MALT) 림프종, 결절성 변연부 B-세포 림프종, 및 비장 변연부 B-세포 림프종), 버킷 림프종, 림프형질세포양 림프종 (LPL; 또한 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM)으로서 공지됨), 모발상 세포 림프종, 및 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, T 세포 림프종인 NHL, 예를 들어 전구체 T-림프모구성 림프종/백혈병, T-림프모구성 림프종/백혈병 (T-Lbly/T-ALL), 말초 T-세포 림프종, 예컨대 피부 T-세포 림프종 (CTLC, 즉 균상 식육종, 세자리 증후군 등), 성인 T-세포 림프종/백혈병, 혈관면역모세포성 T-세포 림프종, 림프절외 자연 킬러/T-세포 림프종 비강형, 장병증-연관 장 T-세포 림프종 (EATL), 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 및 상세불명의 말초 T-세포 림프종, 급성 골수성 림프종, 림프형질세포양 림프종, 단핵구성 B 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장 T-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 이식후 림프증식성 장애, 진성 조직구성 림프종, 원발성 삼출 림프종, 미만성 조직구성 림프종 (DHL), 면역모세포성 대세포 림프종, 및 전구체 B-림프모구성 림프종; 골수종, 예컨대 다발성 골수종, 무증상 골수종 (무통성 골수종이라고도 함), 의미불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 고립 형질세포종, IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비분비성 골수종, 및 아밀로이드증; 및 상기 혈액 악성종양의 임의의 조합으로부터 선택된 암이다. 본 방법은 또한 진행성, 전이성, 불응성 및/또는 재발성 혈액 악성종양의 치료에도 적용가능하다.
항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab의 의학적 용도
본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 단리된 항-MerTK Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 본 개시내용은 에페로시토시스 및 체크포인트 경로, 예를 들어, PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 이중 차단을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 조합하여 사용하기 위한 단리된 항-MerTK Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분 및 체크포인트 억제제 예컨대 단리된 항-PD-1/항-PD-L1 Ab, 바람직하게는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분을 추가로 제공한다. 항-MerTK Ab는 본원에 개시된 전체 범위의 암 치료를 위해 단독요법으로서 또는 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD-1/항-PD-L1 Ab와 조합되어 사용될 수 있다.
개시된 발명의 한 측면은 암을 앓고 있는 대상체 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 단리된 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분의 용도를 포함한다. 항-MerTK Ab는 암 환자 치료용 의약의 제조를 위해 단독으로 또는 체크포인트 억제제 예컨대 단리된 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분과 조합하여 사용될 수 있다. 의약의 제조를 위한 임의의 상기 항-MerTK Ab 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab의 용도는 본원에 개시된 전체 범위의 암에 광범위하게 적용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 상기 치료제 조합을 사용하는 치료 방법의 모든 실시양태에 상응하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한, 체크포인트 억제제 예컨대 단리된 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분과 조합된 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.
제약 조성물 및 투여 요법
본원에 개시된 임의의 치료 방법에 사용된 Ab는 조성물, 예를 들어, Ab 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물로 구성될 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, Ab를 함유하는 조성물을 위한 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해) 정맥내 (IV), 근육내, 피하 (SC), 비경구, 척추 또는 표피 투여하는 데 적합하다.
SC 주사를 위한 옵션은 세포외 매트릭스에 기인하여 피하로 전달될 수 있는 생물제제 및 약물의 부피에 대한 종래 제한을 제거하는, Ab와 재조합 인간 히알루로니다제 효소 (rHuPH20)의 공동-제제화를 수반하는, 할로자임 테라퓨틱스(Halozyme Therapeutics)의 인핸즈(ENHANZE®) 약물 전달 기술에 기초한다 (미국 특허 번호 7,767,429). 조합 요법에서 사용되는 2종의 Ab를 SC 투여를 위한 단일 조성물로 공동-제제화시킬 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염, 항산화제, 수성 및 비-수성 담체, 및/또는 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응, 예를 들어 최대의 치료 반응 및/또는 최소의 유해 효과를 제공하도록 조정된다. 조합 사용하는 경우를 포함하여, 항-MerTK, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분의 투여를 위한 투여량은 대상체의 체중 1 kg당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는, 약 0.1 내지 약 10 mg 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 약 0.1, 0.3, 1, 2, 3, 5 또는 10 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.3, 1, 3, 또는 10 mg/kg 체중일 수 있다. 대안적으로, 체중 기준 용량 대신, 고정 또는 균일 용량, 예를 들어, 약 50-2000 mg의 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이 투여될 수 있다. 투여 스케줄은 전형적으로 Ab의 전형적인 약동학적 특성에 기초하여 수용체 점유율 (RO)을 지속시키는 노출을 달성하도록 설계된다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 3-6개월 또는 그 초과마다 1회 투여하는 것을 수반한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 항-MerTK, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 대상체에게 2주마다 1회 투여된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 3주마다 1회 투여된다. 투여량 및 스케줄링은 치료 과정 동안 바뀔 수 있다.
조합하여 사용될 때, Ab 중 하나 또는 그들 둘 다 치료 투여량 미만의 용량으로, 예를 들어, 항-MerTK, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분이 전형적인 또는 승인된 단독요법 용량보다 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 승인받은 2주마다 3 mg/kg보다 낮은 투여량의 니볼루맙, 예를 들어, 2, 3, 또는 4주마다 1.0 mg/kg 이하가 치료 투여량 미만의 용량인 것으로 간주된다. 니볼루맙으로의 0.3 mg/kg 내지 10 mg/kg을 투여받은 15명의 대상체로부터의 RO 데이터는 PD-1 점유가 상기 용량 범위에서 용량에 비의존하는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 모든 용량에 걸쳐, 평균 점유율은 85% (범위, 70% 내지 97%)였고, 여기서 평균 플래토 점유율은 72% (범위, 59% 내지 81%)였다 (Brahmer et al., 2010). 따라서, 0.3 mg/kg 투여는 충분히 노출시킴으로써 유의한 생물학적 활성을 유도할 수 있다.
마우스 종양 모델에서 관찰된 항-MerTK와 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분 사이의 상승작용적 상호작용을 통해 이들 치료제 중 하나 또는 둘 다를 치료 투여량 미만의 용량으로 암 환자에게 투여하도록 할 수 있다. 개시된 조합 요법 방법의 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 암 환자에게 치료 용량 미만의 용량으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 치료 용량 미만의 용량으로 환자에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 항-PD-1/항-PD-L1 및 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 각각 치료 용량 미만의 용량으로 환자에게 투여된다.
Ab 중 하나 또는 그들 둘 다를 상기와 같이 치료 용량 미만의 용량으로 투여함으로써 단독요법에서 개별 Ab를 더 높은 용량으로 사용할 때와 비교하여 유해 사건을 감소시킬 수 있다. 따라서, 개시된 조합 요법 방법의 성공은 이들 Ab를 사용하는 단독요법 대비 Ab의 조합의 개선된 효능에서뿐만 아니라, 단독요법 용량과 비교하여 조합 시 더 낮은 투여량의 약물 사용으로부터 이루어지는 안전성 증가, 즉, 유해 사건 발생 감소에서도 측정될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 특정 실시양태에서, 항-MerTK, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 Ab는 정맥내 (IV) 투여용으로 또는 피하 (SC) 주사용으로 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 또는 그의 항원-결합 부분 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 항원-결합 부분은 대상체에게 순차적으로 투여된다. "순차적" 투여는 항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 중 하나를 나머지 다른 하나 이전에 투여하는 것을 의미한다. Ab 중 어느 하나를 먼저 투여하고; 즉, 특정 실시양태에서, 항-MerTK Ab 이전에 항-PD-1/항-PD-L1 Ab를 투여하는 반면, 다른 실시양태에서는, 항-MerTK Ab를 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 이전에 투여한다. 특정 실시양태에서, 각 Ab는 IV 주입에 의해, 예를 들어, 약 60분의 기간 동안에 걸쳐 주입에 의해 투여된다. 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 Ab는 SC 주사에 의해 투여된다.
순차적 IV 투여의 특정 실시양태에서, 환자의 편의를 위해, 항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 부분은 서로 30분 이내에 투여된다. 전형적으로, 항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 둘 다가 같은 날에 IV 투여에 의해 전달되는 경우, 각 주입을 위해 별개의 주입 백 및 필터가 사용된다. 제1 Ab의 주입 후, 제2 Ab의 주입 시작 전에 Ab의 라인을 깨끗이하기 위해 염수 플러쉬가 즉시 진행된다. 다른 실시양태에서, 두 Ab는 서로 1, 2, 4, 8, 24 또는 48시간 이내에 투여된다.
SC 투여에 의한 적어도 하나의 Ab 전달은 투여에 필요한 건강 관리 진료의의 시간을 감소시키고, 약물 투여 시간을 단축시킨다. 예를 들어, SC 주사의 사용은 IV 투여에 필요한 시간을 전형적으로 약 30-60분에서 약 5분으로 단축시킬 수 있다. 순차적 SC 투여의 특정 실시양태에서, 항-MerTK 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab 또는 그의 부분은 서로 10분 이내에 투여된다.
체크포인트 억제제 Ab는 부분적으로는 면역계의 기억 구성요소에 기인하여 매우 오래 지속되는 반응을 생성하는 것으로 제시되었므로 (예를 들어, WO 2013/173223; 문헌 [Lipson et al., 2013; Wolchok et al., 2013] 참조), 투여된 항-PD-1/항-PD-L1 Ab의 활성은 수주, 수개월, 또는 심지어는 수년 동안 계속해서 진행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 순차적 투여를 수반하는 본 조합 요법 방법은 앞서 항-PD-1/항-PD-L1 Ab로 치료받은 환자에게 항-MerTK Ab를 투여하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-MerTK Ab는 항-PD-1/항-PD-L1 Ab로 이전에 치료받았고, 계속 진행 중인 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 순차적 투여를 수반하는 본 조합 요법 방법은 앞서 항-MerTK Ab로 치료받은 환자, 임의로 항-MerTK Ab를 사용한 치료 후에도 암이 진행되고 있는 환자에게 항-PD-1/항-PD-L1 Ab를 투여하는 것을 포함한다.
특정의 다른 실시양태에서, 항-PD-1/항-PD-L1 및 항-MerTK Ab는 공동-투여를 위해 제약상 허용되는 제제로 단일 조성물로서 혼합되어 공동으로 투여되거나, 또는 각 Ab가 제약상 허용되는 조성물로 제제화된 별개의 조성물로서 공동으로 투여된다.
키트
또한, 치료 용도를 위한, 항-MerTK Ab 및 항-PD-1/항-PD-L1 Ab를 포함하는 키트가 본 발명의 범주 내에 있다. 키트는 전형적으로, 키트의 내용물의 의도된 사용을 나타내는 라벨 및 사용에 대한 지침서를 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동봉되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 (a) MerTK에 특이적으로 결합하는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 1회 이상의 투여량; 및 (b) 본원에 개시된 임의의 치료 방법에서 mAb 또는 그의 부분을 사용하는 것에 대한 지침서를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 키트를 제공한다.　 본 개시내용은 (a) MerTK에 특이적으로 결합하는 mAb 또는 그의 항원-결합 부분 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 1회 이상의 투여량; (b) 체크포인트 억제제 예컨대 항-PD-1/항-PD-L1 mAb 또는 그의 항원-결합 부분 약 3 mg/kg 체중 또는 200 내지 약 1600 mg의 1회 이상 투여량; 및 (c) 본원에 개시된 임의의 조합 요법 방법에서 항-MerTK mAb 및 체크포인트 억제제, 예를 들어, 항-PD-1/항-PD-L1 mAb를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 키트를 추가로 제공한다.
특정 실시양태에서, Ab는 단위 투여 형태로 공동-패키징될 수 있다. 인간 환자를 치료하기 위한 특정의 바람직한 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 항-인간 PD-1 Ab, 예를 들어, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
MerTK에 대한 MAb의 생성
인간 Ab 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 인간 MerTK (hMerTK) 항원으로 면역화하여 마우스에서 MerTK에 특이적인 인간 Ig의 레퍼토리를 상승시키고, MerTK 녹아웃 마우스를 마우스 MerTK (mMerTK) 항원 또는 mMerTK와 hMerTK 항원의 혼합물로 면역화함으로써 인간 및 마우스 항-MerTK mAb를 생성하였다.
인간 이뮤노글로불린 트랜스제닉 마우스의 면역화
인간 Ig 트랜스제닉 마우스, 계통 Hco42:01 [J/K] (HCo42(289729p)+^;JHD++;JKD++;KCo5(9272)+^;) (Lonberg, 1994; Lonberg et al., 1994)를 C-말단에서 마우스 IgG2a Fc에 연결된 hMerTK의 세포외 부분을 포함하는 재조합 hMerTK-mFc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)로 면역화함으로써 hMerTK에 대한 HuMab를 생성하였다.　 항원을 리비(Ribi) 아주반트와 1:1 혼합하고, 마우스를 1주 간격으로 복강내로 및 피하로 면역화시켰다.　 4회 및 6회 주사 후에 혈청 역가를 모니터링하였다.　 마우스에게 최종 수거 2일 및 3일 전에 정맥내 (IV) 및 복강내 (IP) 주사에 의해 hMerTK-mFc 단백질의 2회의 최종 부스팅을 제공하였다.　 림프절 및 비장 둘 다를 후속 융합을 위해 수거하였다.
MerTK 녹-아웃 마우스의 면역화
hMerTK-hFc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)과 혼합된 재조합 mMerTK-hFc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)로 또는 mMerTK-hFc 단독으로 MerTK 녹아웃 (KO) 마우스를 면역화함으로써 마우스 항-MerTK mAb를 생성하였다.　 항원을 리비 아주반트와 1:1 혼합하고, 발바닥 면역화를 사용하여 1주 간격으로 주사하였다.　 혈청 역가를 4회 주사 후에 모니터링한 다음, 마우스에게 최종 수거 2일 및 3일 전에 2회의 최종 발바닥 부스팅을 제공하였다.　 후속 융합을 위해 림프절을 수거하였다.
MerTK에 대한 MAb를 생산하는 하이브리도마의 생성
마우스 림프구를 상기 기재된 바와 같이 면역화된 마우스로부터 단리하고, 사이토 펄스 하이브리뮨(Cyto Pulse Hybrimmune) 대형 챔버 세포 융합 전기천공기 (BTX/하버드 어패러투스(Harvard Apparatus), 매사추세츠주 홀리스톤)를 사용하여 전기장 기반 전기융합에 의해 마우스 골수종 융합 파트너와의 융합에 의해 하이브리도마를 생성하였다.　 면역화된 마우스로부터의 림프구의 단세포 현탁액을 동일한 수의 P3X63 Ag8.6.53 (ATCC) 비-분비 마우스 골수종 세포에 융합시켰다 (인간 Ig 트랜스제닉 마우스의 경우 융합 번호 5760-5763 및 MerTK KO 마우스의 경우 5712 및 5775).　 생성된 세포를 편평-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 하이브리도마의 선택을 위해 아미노프테린 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)이 보충된 배지 E (스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies), 워싱턴주 시애틀) 중에 플레이팅하였다.
실시예 2
인간 항-인간 MerTK mAb의 스크리닝 및 선택
인간 및 시노몰구스 MerTK에 선택적으로 결합하는 MAb에 대한 스크리닝
hMerTK에 결합하는 HuMAb를 생성하기 위해, 인간 Ig 트랜스제닉 마우스를 실시예 1에 기재된 바와 같이 hMerTK 항원으로 면역화시켰다.
이들 인간 Ig 트랜스제닉 동물로부터 유래된 하이브리도마에 대해, 개별 웰을 10 내지 12일 후에 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 (시스바이오(Cisbio), 매사추세츠주 베드포드)을 사용하여 인간 IgG/인간 카파 경쇄 (hIgG/hκ) Ab의 존재에 대해 스크리닝하였다.　 hIgG/hκ에 대해 양성인 웰로부터의 하이브리도마 상청액을 전장 hMerTK의 키나제-돌연변이체 버전으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에의 결합에 대해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 시험하였다.　 간략하게, hMerTK로 형질감염된 CHO 세포를 차가운 FACS 완충제 (포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 1% 태아 소 혈청 (FBS))로 세척하고, 50 μl 중 ~ 1 x 105개의 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트의 각각의 웰에 분취한 후, 50 μl의 하이브리도마 상청액을 첨가하였다.　 샘플을 얼음 상에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다.　 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하였다.　 1:200 희석률의 PE-접합된 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 Ab (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 샘플당 100 μl로 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다.　 세포를 2회 세척하고, FACS칼리버(FACSCalibur) 세포측정기 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세) 상으로 옮기고 판독하였다.　 인간 MerTK-양성 하이브리도마를 또한 시노몰구스 원숭이 MerTK로 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 시노몰구스 원숭이 MerTK에 대한 교차-반응성에 대해 상기 기재된 염색 프로토콜을 사용하여 FACS에 의해 스크리닝하였다.　 Axl 및/또는 Tyro3 및 비-특이적 단백질, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 대한 결합의 부재에 의해 입증되는 선택성에 대해 FACS에 의해 하이브리도마를 추가로 카운터-스크리닝하였다.　 대략 3,300개의 HuMAb 클론을 스크리닝하였고, 약 300개가 MerTK에 대해 선택적이고 인간 및 시노몰구스 원숭이 MerTK 둘 다에 결합하는 것으로 나타났다.
길항작용 항-MerTK mAb에 대한 기능적 스크리닝
선택된 HuMAb 클론을 세포 기반 검정 (Zizzo et al., 2012)을 사용하여 기능적으로 스크리닝하여 에페로시토시스를 억제하는 Ab를 확인하였다.　 또한, 신호전달 검정을 사용하여 리간드 (Gas6)-유도된 신호전달을 억제하는 데 있어서의 표적 결속 및 효력을 측정하였고 (Tsou et al., 2014), 클론을 효능제 잠재력에 대해 카운터-스크리닝하였다.　 A.　클론을 서브나노몰의 EC50으로 인간 세포 (종양 세포주 및 1차 세포) 상의 MerTK에 결합하는 것; 낮은 nM 내지 서브 nM의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 세포 (형질감염된 세포주 및 1차 세포) 상의 MerTK에 결합하는 것; 서브나노몰의 IC50으로 최대 신호의 80% 초과까지 에페로시토시스를 억제하는 것; 및 서브나노몰의 IC50으로 대조군의 80% 초과만큼 Gas6-매개 신호전달을 억제하고 효능작용 능력을 갖지 않는 것에 기초한 추가의 특징화를 위해 선택하였다.　 이들 Ab 내의 가변 영역 DNA를 차세대 서열분석에 의해 서열분석하고, 약 35종의 HuMAb를 서열 상동성 및 제한된 잠재적 서열 문제, 예를 들어, 아스파라긴 탈아미드화, 메티오닌 산화 및 글리코실화 부위를 기초로 다양성을 위해 선택하였다.　 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 6개의 서열 패밀리가 선택된 HuMAb에서 확인되었다.　 선택된 35종의 HuMAb를 또한 서열에 기초한 그의 면역원성 잠재력에 대해 인 실리코 방법을 사용하여 분석하고, 표준 고함량 방법을 사용하여 수용체 내재화를 유도하는 그의 잠재력에 대해 시험하였다.　 면역원성에 대해 또는 수용체 내재화의 유도에 잠재력을 나타내는 임의의 클론은 우선순위를 낮추었다.
항-hMerTK HuMAb의 결합 친화도 및 결합 동역학의 특징화
선택된 HuMAb의 친화도 및 결합 동역학을 고정된 항-인간 Fc 포획 시약 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 및 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20 및 1 g/l BSA로 구성된 구동 완충제를 갖는 CM4 센서 칩 (지이 헬스케어)을 사용하여 비아코어® 기기 (지이 헬스케어, 일리노이주 시카고)로 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에 의해 특징화하였다.　 MerTK Ab를 칩 상에 포획하였다.　 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 MerTK 폴리펩티드의 세포외 도메인의 재조합 가용성 형태를 각각 다수의 농도로 분석물로서 주입하였다.　 생성된 센서그램을 이중-참조하고, 질량 수송을 갖는 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 피팅하였다.
항-hMerTK HuMAb의 에피토프 비닝
강력한 길항작용 기능적 효과를 나타낸 HuMAb 중에서, 6개의 서열 패밀리를 포함하는 13종의 대표적인 HuMAb를 SPR 결합 경쟁 연구에 적용하여, hMerTK 항원 상의 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 대해 경쟁하고 따라서 동일한 에피토프 빈에 할당될 수 있는 mAb를 확인하였다.　 3개의 에피토프 빈이 확인되었으며, 대부분은 빈 1에 할당되었고: 11종의 mAb는 빈 1에 할당되었고, 하나의 mAb는 빈 2에 할당되었고, 하나의 mAb는 빈 3에 할당되었다.
효모 디스플레이 및 수소 중수소 교환 (HDX)에 의한 에피토프 맵핑
Ab 결합 영역을 추가로 규명하기 위해 효모 디스플레이 및/또는 수소-중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)에 의한 에피토프 맵핑 분석에 대한 에피토프 비닝 데이터에 기초하여 선택 Ab를 선택하였다.　 Fab 단편이 전체 Ab보다 더 깨끗한 결과를 제공하기 때문에 mAb의 Fab 단편을 제조하고 HDX-MS 에피토프 맵핑에 사용하였다.　 빈 1 Ab는 특이적 클론에 따라 대략 아미노산 105 내지 165에 걸친 선형 영역 내의 hMerTK의 제1 Ig 도메인에 결합하는 것으로 나타났다.　 예를 들어, 8N42 Fab 단편에 대한 에피토프를 인간 MerTK (서열식별번호: 259)의 아미노산 126 내지 155 (126TTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTA155)에 걸친 영역에 맵핑하였다.
빈 2 Ab (HuMab 및 moMAb)는 특이적 클론에 따라 대략 아미노산 195 내지 270에 걸친 영역 내의 MerTK의 제2 Ig 도메인에 결합하는 것으로 밝혀졌다.　 예를 들어, HuMAb 25B10의 Fab 단편 (그로부터 mAb 25J60 및 25J80이 유래됨)에 대한 에피토프를 hMerTK (서열식별번호: 259)의 아미노산 231 내지 249 (231WVQNSSRVNEQPEKSPSVL249)에 걸친 선형 영역에 맵핑하였다.　 이들 데이터는 mAb 25B10에 대해 아미노산 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269를 에피토프를 구성하는 것으로서 확인한, 효모 디스플레이에 의해 맵핑된 에피토프와 일치하였다.　 빈 1 및 빈 2 결합 영역 둘 다는 Gas6/Axl 결정 구조의 상동성 모델링에 기초한 리간드 차단과 일치한다.
단일 빈 3 HuMAb는 아미노산 420 내지 490에 걸친 영역 내의 Fn 도메인에 결합한다.
항-hMerTK HuMAb의 최적화
서열 문제를 완화시키고, 결합 친화도를 최적화하고, 배선 아미노산으로 복귀시키기 위한 PROmAb 최적화를 위해 에페로시토시스 억제 효력 및 지속기간, 결합 동역학, 비닝 다양성 및 서열 패밀리 다양성에 기초하여, 특정 mAb를 선택하였다.　 선택 mAb를 또한 다양한 수단 예컨대 분석용 크기 배제 크로마토그래피, 모세관 등전 포커싱, 소수성 평가, 열 안정성 및 응집 잠재력을 통해 그의 생물물리학적 특성에 대해 분석하여, 개발에 적용가능한 클론을 확인하였다.　 서열 패밀리 중 하나의 유일한 선택된 대표물인 mAb가 PROmAb 최적화 동안 상실되었고; 따라서, 최적화 과정으로부터 나타난 13종의 Ab에서 5개의 서열 패밀리 및 3개의 빈이 나타내어진다.
13종의 선택된 HuMAb 중 7종 (HuMAb 1B4, 10K11, 22I16, 25J60, 25J80, 8N42 및 4K10)의 대표적인 샘플에 대한 비닝 데이터 및 에페로시토시스 및 신호전달 검정의 결과가 표 1에 제시된다.　 빈 3에 할당된 하나의 HuMAb 및 빈 2에 할당된 단일 HuMAb로부터 유래된 2종의 밀접하게 관련된 Ab가 표에 포함되고, 나머지 4종의 HuMAb는 빈 1에 할당된다.　 모든 5개의 서열 패밀리가 표 1에 제시된다.
표 1 중 7종의 대표적인 HuMAb에 대해 수득된 결합 동역학 데이터, 즉, 해리 상수 (KD), 결합 반응의 속도 상수 (k온), 해리 반응의 속도 상수 (k오프) 값 및 반감기 (t1/2)가 표 2에 제시된다.
HuMAb 1B4, 10K11, 22I16, 25J60, 25J80, 8N42 및 4K10에 대한 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열이 각각 표 3-9에 제시된다.
HuMAb 1B4, 10K11, 22I16, 25J60, 25J80, 8N42 및 4K10에 대한 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열이 각각 표 15-21에 제시된다.
표 1.　 대표적인 항-MerTK Ab에 대한 비닝 및 기능적 특징화 데이터
Figure pct00001
dnb: hMerTK-발현 세포에 결합하지 않음
nd: 데이터 없음
실시예 3
마우스 항-MerTK mAb의 스크리닝 및 선택
인간 및 시노몰구스 MerTK에 선택적으로 결합하는 MAb에 대한 스크리닝
실시예 1에 기재된 바와 같이, MerTK KO 마우스를 mMerTK 및 hMerTK 항원으로 면역화시켜 mMerTK 및/또는 hMerTK에 결합하는 마우스 Ab를 생성하였다.
이들 MerTK KO 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터의 상청액을 형광측정 마이크로부피 검정 기술 (FMAT)을 사용하여 마우스 및 인간 MerTK CHO 형질감염체에의 결합에 대해 직접 시험하였다.　 2차 시약으로서 알렉사플루오르647(AlexaFluor647)과 접합된 염소 항-마우스 IgG (Fc) (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 FMAT에 의해 하이브리도마를 스크리닝하였다.　 간략하게, hMerTK 또는 mMerTK로 형질감염된 CHO 세포를 세척하고, 2 x 105개 세포/ml의 최종 농도로 FMAT 완충제 중에 재현탁시켰다.　 최종 농도 250 ng/ml로 사용된 1:15-희석된 하이브리도마 상청액 및 염소 항-마우스 IgG FcAb의 혼합물을 세포에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.　 이어서 플레이트를 FMAT 8200 세포 검출 시스템 기기 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티) 상에서 판독하고, 데이터를 팁코 스팟파이어(Tibco Spotfire) 소프트웨어 (캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 분석하였다.　 FMAT에 의해 확인된 양성 클론을 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG Fc 특이적 Ab (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 확인하였다.　 하이브리도마를 FACS에 의해 카운터-스크리닝하여 Axl 및/또는 Tyro3 및 비-특이적 단백질 예컨대 KLH에 결합된 클론을 제외시켰다.　 인간 및/또는 마우스 MerTK에 선택적으로 결합된 약 2,000개의 moMAb 클론을 수득하였다.
표 2. 항-MerTK Ab에 대한 결합 동역학 데이터
Figure pct00002
dnb: mMerTK-발현 세포에 결합하지 않고 시험되지 않음
표 3. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 1B4 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00003
표 4. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 10K11 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00004
표 5. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 22I16 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00005
표 6. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 25J60 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00006
표 7. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 25J80 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00007
표 8. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 8N42 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00008
표 9. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 HuMAb 4K10 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00009
표 10. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 인간화 MAb 2L105 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00010
표 11. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 인간화 MAb 4M60 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00011
표 12. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 MoMAb 2D9 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00012
표 13. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 MoMAb 4E9 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00013
표 14. 카바트, 코티아 및 IMGT 방법을 사용하여 정의된 바와 같은 MoMAb 16B9 중의 6개의 CDR 도메인에 대한 아미노산 서열
Figure pct00014
표 15. HuMAb 1B4 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00015
표 16. HuMAb 10K11 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00016
표 17. HuMAb 22I16 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00017
표 18. HuMAb 25J60 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00018
표 19. HuMAb 25J80 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00019
표 20. HuMAb 8N42 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00020
표 21. HuMAb 4K10 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00021
표 22. 인간화 MAb 2L105 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00022
표 23. 인간화 mAb 4M60 중의 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열
Figure pct00023
표 24. MoMAb 2D9 중의 VH 및 VL 영역에 대한 아미노산 서열
Figure pct00024
표 25. MoMAb 4E9 중의 VH 및 VL 영역에 대한 아미노산 서열
Figure pct00025
표 26. MoMAb 16B9 중의 VH 및 VL 영역에 대한 아미노산 서열
Figure pct00026
표 27. 인간 MerTK 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열
Figure pct00027
완전한 hMerTK, cMerTK 및 mMerTK 아미노산 서열은 각각 진뱅크® 수탁 번호 NP_006334.2, XP_005575320.1 및 NP_032613.1 하에 찾을 수 있다.
표 28. 시노몰구스 원숭이 MerTK 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열
Figure pct00028
표 29. 마우스 MerTK 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열
Figure pct00029
길항작용 항-MerTK moMAb에 대한 기능적 스크리닝
이들 moMAb 클론을 에페로시토시스의 억제 및 Gas6-매개 신호전달의 억제를 측정하기 위한 검정을 사용하여 스크리닝하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 효능제 잠재력에 대해 카운터-스크리닝하였다.　 클론을 서브나노몰의 EC50으로 인간 및/또는 마우스 세포 (종양 세포주 및 1차 세포) 상의 MerTK에 결합하는 것; 및 서브나노몰의 IC50으로 최대 신호의 80% 초과까지 에페로시토시스를 억제하는 것; 및 서브나노몰의 IC50으로 대조군의 80% 초과만큼 Gas6-매개 신호전달을 억제하고 효능작용 능력을 갖지 않는 것에 기초한 추가의 특징화를 위해 클론을 선택하였다.　 이들 클론에서 Ab 가변 영역을 코딩하는 DNA를 차세대 서열분석에 의해 서열분석하고, 약 200개의 클론을 에페로시토시스 및 MerTK-매개 신호전달을 억제하는 효력, 서열 다양성 및 제한된 잠재적 서열 문제에 기초하여 선택하였다.　 3종의 moMAb가 강력한 길항 활성, 즉 신호전달 검정에서 10 nM 미만의 IC50 값을 나타내었고, 추가 분석을 위해 선택되었다.
항-MerTK moMAb의 결합 친화도, 결합 동역학 및 비닝의 특징화
마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이 MerTK에 대한 3종의 선택된 moMAb의 친화도 및 결합 동역학을 SPR 분석에 의해 특징화하였다.　 이들 Ab 중 2종인 2D9 및 4E9는 강력한 길항 활성을 나타내었고, 마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이 MerTK에 높은 친화도로 결합된 반면, 세 번째로 선택된 moMAb인 16B9는 mMerTK에 결합하였지만, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 MerTK에는 결합하지 않았고, 이는 mAb 16B9가 2D9 또는 4E9에 의해 결합된 에피토프와는 상이한 에피토프에 결합하였다는 것을 나타낸다.　 hMerTK 항원 상의 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 대해 경쟁하는 mAb를 확인하기 위한 SPR 결합 경쟁 연구에 의해 2D9 및 4E9 둘 다를 빈 2에 할당하였다.
2D9 및 4E9 둘 다의 인간화 변이체를 생성하였다.　 2D9, 4E9 및 16B9에 대해, 뿐만 아니라 각각 moMAb 2D9 및 4E9로부터 생성된 인간화 Ab 2L105 및 4M60에 대한 비닝 데이터 및 에페로시토시스 및 신호전달 검정의 결과가 표 1에 포함된다.
선택된 moMAb 및 그의 인간화 버전에 대해 얻어진 결합 동역학 데이터가 표 2에 포함된다.
인간화 mAb 2L105 및 4M60에 대한 6개의 CDR에 대한 서열이 각각 표 10 및 11에 제시되고, 한편 moMAb 2D9, 4E9 및 16B9에 대한 6개의 CDR에 대한 서열이 각각 표 12-14에 제시된다.
인간화 mAb 2L107 및 4M60에 대한 VH, VL, 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열이 각각 표 22 및 23에 제시되고, moMAb 2D9, 4E9 및 16B9에 대한 VH 및 VL 영역에 대한 서열이 각각 표 24-26에 제시된다.
인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 MerTK 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 각각 표 27-29에 제시된다.
실시예 4
항-MerTK는 MC38 종양 모델에서 항-PD-1의 항종양 활성을 증진시킨다
MC38 결장 선암종 마우스 종양 모델에서, 마우스 항-MerTK mAb인 4E9 (마우스 IgG1 이소형)의 항종양 활성을 항-마우스 PD-1 Ab인 4H2와 조합하여 평가하였다.　 4H2는 Fc-부분이 마우스 IgG1 이소형으로부터의 Fc-부분으로 대체된, 래트 IgG2a 항-마우스 PD-1 Ab로부터 구축된 키메라 래트-마우스 항-mPD-1 Ab이다 (WO 2006/121168).　 이는 mPD-1에 대한 mPD-L1의 결합 및 mPD-L2의 결합을 차단하고, T 세포 반응을 자극하고, 다양한 마우스 종양 모델에서 항종양 활성을 나타낸다.
C57BL/6 마우스에 각각 106개의 MC38 종양 세포를 SC 주사하였다.　 6일 후에 종양이 대략 100 mm3의 중앙값 크기에 도달하였을 때 마우스를 처리군 (10마리 마우스/군)으로 무작위화하였다. PBS 중에 제제화된 모든 시험 작용제 (단일 Ab 또는 조합물)를 제6일, 제10일 및 제14일에 투여당 200 μg으로 200μl의 부피로 IP 투여하였다.　 종양 부피, 체중 및 임상 관찰을 시험 작용제의 효능 및 내약성을 확립하기 위해 기록하였다.　 종양 캘리퍼 측정치를 하기 식을 사용하여 종양 부피로 전환시켰다: 부피 = 1/2 (길이 x 폭 x 높이).　 종양 성장 및 체중을 이식후 85일까지 모니터링하였다.　 최초 0인 종양 측정치로부터 적어도 45일 동안 무종양 상태로 유지된 마우스는 공식적으로 "치유된" 것으로 간주되었다.
연구시, 마우스에게 멸균 설치류 사료 및 물을 자유롭게 제공하였고, 12시간 명/암 사이클 하에 멸균 필터-탑(filter-top) 케이지에 수용하였다.　 모든 실험은 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
도 1b는 항-PD-1 Ab로의 마우스의 처리가 대조군 마우스 IgG1 mAb (마우스 IgG1 이소형을 갖는 인간 항-디프테리아 독소 (DT) mAb; 간단히 "IgG1"로 지정됨) 대조군으로 처리된 종양의 성장 속도에 비해 종양 성장 속도를 유의하게 감소시켰지만, 제47일까지 어느 마우스에서도 종양을 완전히 수축시키지는 않았음을 보여준다 (도 1a).　 마우스를 항-PD-1 및 항-MerTK 4E9-IgG1 mAb의 조합물로 처리하는 것은 종양 성장 속도를 추가로 현저하게 감소시켰고, 10마리 마우스 중 7마리에서 이식 후 제34일까지 효과적으로 종양이 치유되었다 (도 1c).　 따라서, 항-PD-1 및 항-MerTK의 조합은 MC38 결장 선암종의 성장을 억제하는 데 있어서 강한 상승작용적 효과를 나타낸다.　 Ab의 조합은 조합물의 항종양 효과가 각각의 Ab에 의해 개별적으로 나타난 억제 수준의 합보다 더 큰 경우에 상승작용적인 것으로 간주된다.
실시예 5
항-MerTK 및 항-PD-1의 조합물을 사용한 치료로부터 치유된 마우스는 리챌린지 시 종양 성장에 대해 저항성이다
본 실험에서, 항-PD-1 및 항-MerTK Ab의 조합물 (실시예 4)로의 처리에 의해 MC38 종양이 치유된 7마리의 C57BL/6 마우스를 SC 주사에 의해 106개의 MC38 종양 세포로 리챌린지하였다.　 10마리의 C57BL/6 마우스의 대조군에게 각각 106개의 MC38 종양 세포를 SC 주사하고, 두 마우스 군 모두에서의 종양 성장을 이식후 적어도 23일 동안 모니터링하였다.
대조군의 종양은 급속하게 성장하여, 이식 후 15-23일까지 1,500 mm3의 부피에 도달하였다.　 대조적으로, 모든 7마리의 치유된 마우스는 MC38 종양 성장에 대해 완전히 저항성이었다 (도 2).
실시예 6
상이한 Fc 영역을 포함하는 2종의 상이한 항-MerTK Ab는 유사한 항종양 활성 및 항-PD-1 효능의 유사한 증진을 나타낸다
마우스 항-MerTK Ab인 2D9 및 4E9의 항종양 활성을 MC38 종양 모델에서 단독요법으로서 또는 항-PD-1 Ab인 4H2와 조합하여 평가하였다.　 MerTK Ab의 2종의 이소형, 즉 IgG1 이소형 및 비-FcγR-결합 돌연변이체인 IgG1-D265A 이소형을 사용하였다 (Clynes et al., 2000).　 상기 IgG1-D265A 이소형은 마우스 IgG2a 및 IgG1 이소형과 비교하여 MC38 종양 모델에서 항-CTLA-4 및 항-GITR Ab의 항종양 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 대조적으로 항-PD-1 IgG2a 이소형은 항-IgG1 또는 IgG1-D265A 이소형보다 더 낮은 항종양 활성을 나타낸다 (WO 2014/089113).
C57BL/6 마우스에 각각 106개의 MC38 종양 세포를 SC 주사하고, 앞서 기재된 바와 같이 처리군 (10마리 마우스/군)으로 무작위화하였다 (실시예 4).　 시험 작용제는 도 3에 나타낸 바와 같이 마우스 IgG1 대조군, 항-MerTK mAb 2D9의 IgG1 및 IgG1-D265A 이소형, 항-MerTK mAb 4E9의 IgG1-D265A 이소형, 항-PD-1 mAb 4H2, 및 항-MerTK 및 항-PD-1 Ab의 조합물로 구성되었다.
2D9-IgG1 Ab (도 3b)는 IgG1 대조군 (도 3a)에 비해 종양 성장의 약간의 억제를 이루어냈다.　 2D9-D265A 이소형 (도 3c)은 IgG1 이소형보다 일반적으로 유사하거나 약간 더 높은 수준의 종양 성장 억제를 이루어냈다.　 유사한 수준의 종양 성장 억제가 2D9-D265A 및 4E9-D265A Ab에 의해 유도되었다 (도 3c 및 d).
항-PD-1은 유의한 종양 성장 억제를 일으켰고, 처리된 10마리 마우스 중 2마리에서 완전한 종양 거부가 있었다 (도 3e).
항-PD-1 및 항-MerTK 2D9-IgG1 Ab의 조합물은 9마리의 처리된 마우스 중 5마리에서 완전한 종양 거부와 함께, 훨씬 더 큰 종양 성장 억제를 이루어냈다 (도 3f).　 항-PD-1 및 항-MerTK 2D9-D265A 또는 4E9-D265A Ab의 조합물은 유사한 상승작용적 수준의 종양 성장 억제를 일으켰고, 각각 9마리의 처리된 마우스 중 7마리, 및 10마리의 처리된 마우스 중 5마리에서 완전한 종양 거부를 나타냈다 (도 3g 및 h).　 따라서, 종양 성장-억제 효능의 유사한 상승작용적 수준이 투여된 2종의 상이한 마우스 항-MerTK Ab (4E9 및 2D9)에서 관찰되었고, 유사한 효능이 Fc 수용체 (FcR) 이펙터 기능과 무관하게 (즉 IgG1 이소형과 IgG1-D265A 비교) 관찰되었다.
항-PD-1 단독요법에 비해 MC38 모델에서 종양 성장을 억제하는 데 있어서 항-PD-1 및 항-MerTK Ab의 조합물의 증진된 효능은 다양한 항-MerTK Ab 용량에 걸쳐 재현가능하였다.　 단독요법으로서 투여되는 경우에, 1 mg/kg 체중의 용량의 항-MerTK 4E9는 종양 성장을 억제하는 데 있어서 거의 효과를 나타내지 않았지만, 항-PD-1에 의해 관찰된 종양 성장 억제보다 훨씬 적긴 하지만 1 mg/kg에서 종양 성장의 중간 정도의 억제를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).　 1 또는 3 mg/kg의 항-MerTK 4E9-IgG1과 항-PD-1의 조합물은 둘 다 종양 성장을 대폭 억제하였고, 각각 11마리 마우스 중 7마리 및 11마리 마우스 중 9마리가 완전한 종양 거부를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).　 10 mg/kg의 항-MerTK 4E9-IgG1와 항-PD-1의 조합물은 실제로 모든 마우스에서 종양 성장을 대폭 억제하였지만, 치유율은 변하지 않고 유지되었으며, 11마리 마우스 중 8마리가 완전한 종양 거부를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7
항-MerTK는 CT26 종양 모델에서 항-PD-1의 항종양 활성을 증진시킨다
mAb 4E9의 항종양 활성을 또한 CT26 결장 선암종 마우스 종양 모델에서 단독요법으로서 및 항-PD-1 Ab와 조합하여 평가하였다.
BALB/c 마우스에게 각각 106개의 CT26 종양 세포를 SC 주사하였다.　 6일 후에 종양이 대략 100 mm3의 중앙값 크기에 도달하였을 때 마우스를 10마리 마우스/군의 처리군으로 무작위화하고, Ab (단일 Ab 또는 조합물)를 제6일, 제10일 및 제14일에 투여당 200 μg으로 200μl의 부피로 IP 투여하였다.　 종양 부피를 이식 후 85일까지 매주 2회 측정하여 공식적인 치유를 확립하였다.
도 4b에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 Ab를 사용한 치료는 마우스 IgG1 대조군을 사용하여 치료된 종양의 성장 속도에 비해 대다수의 마우스에서 종양 성장 속도를 감소시키는 데 중간 정도의 효과를 가졌지만 (도 4a), 종양 성장은 1마리의 마우스에서 유의하게 억제되었고, 다른 1마리의 마우스는 완전한 종양 거부를 나타내었다.　 4E9-IgG1 Ab는 IgG1 대조군과 비교하여 종양 성장을 억제하는 데 약간의 활성을 나타낸 반면에 (도 4c), 항-PD-1 및 항-MerTK 4E9-IgG1 Ab의 조합물을 사용한 처리는 종양 성장 속도를 강력하게 감소시켰고, 10마리 마우스 중 4마리에서 이식 후 제38일까지 종양이 치유되었다 (도 4d).　 따라서, 항-PD-1 및 항-MerTK Ab는 또한 상승작용적으로 상호작용하여 CT26 결장 선암종의 성장을 억제한다.　 전체적으로, 항-PD-1, 항-MerTK 또는 Ab 둘 다의 조합물에 의한 치료에 대한 CT26 종양의 반응 패턴 (도 4)은 MC38 종양 모델에서 관찰된 것과 유사하였지만 (도 1 및 3), 성장 억제는 일반적으로 MC38 모델에서 다소 더 현저하였다.
실시예 8
항-MerTK MAb인 16B9는 MC38 종양 모델에서 항-PD-1의 항종양 활성을 증진시킨다
실시예 4 및 6에 제시된 바와 같이, 항-MerTK mAb인 2D9 및 4E9 둘 다는 항-PD-1과 상승작용적으로 조합되어 MC38 결장 선암종의 성장을 강력하게 억제한다.　 실시예 3에 기재된 바와 같이, mAb 2D9 및 4E9는 이들이 둘 다 마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이 MerTK에 높은 친화도로 결합하고, hMerTK 상의 빈 2에 할당될 정도로 유사하다.　 세 번째 항-MerTK moMAb인 16B9는 mMerTK에는 높은 친화도로 결합하지만 인간 또는 시노몰구스 원숭이 MerTK에는 결합하지 않는다는 점에서 2D9 및 4E9와 상이하다.　 hMerTK에 결합하지 않기 때문에, 이는 어느 hMerTK 빈에도 할당될 수 없었지만, 이러한 hMerTK에의 결합 결여는 mAb 16B9가 2D9 또는 4E9에 의해 결합되는 에피토프와는 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
항-MerTK mAb인 16B9-D265A의 항종양 활성을 MC38 종양 모델에서 단독으로 또는 항-PD-1 mAb인 4H2와 조합하여 평가하였다.　 Ab를 실시예 4에 기재된 바와 같이 MC38 종양이 이식된 10마리의 C57BL/6 마우스의 군에 투여하였다.　 앞서 실시예 4 및 6에서 입증된 바와 같이, 항-PD1 처리는 항-DT IgG1 대조군 ("이소형"; 도 5a)과 비교하여 MC38 종양 성장을 유의하게 억제하였으며 (도 5b), 10마리의 항-PD-1-처리된 마우스 중 1마리는 완전한 종양 거부를 나타냈다.　 대조적으로, 종양 성장을 억제하는 데 있어서 단일-작용제 활성은 16B9-D265A 항-MerTK Ab에서 나타나지 않았고, 이는 IgG1 대조군과 대등한 결과를 이루어냈다.　 16B9-D265A에 의한 이러한 종양 성장 억제의 부재에도 불구하고, 상기 Ab 및 항-PD-1의 조합물은 10마리 마우스 중 7마리에서의 완전한 종양 거부를 포함한, 항-PD-1에 의해 관찰된 항종양 활성의 대규모 증진에 의해 입증되는 강한 상승작용적 상호작용을 이루어냈다 (도 5d).
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Ser Lys Pro His Glu Gly Arg 915 920 925 Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala 930 935 940 Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu 945 950 955 960 Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu Pro 965 970 975 Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser 980 985 990 Glu Gly Ser Glu Val Leu Met 995 <210> 260 <211> 1001 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 260 Met Gly Leu Ala Pro Leu Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ala Leu Trp Ser Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys 20 25 30 Pro Tyr Pro Leu Phe Pro Gly Pro Leu Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp 35 40 45 His Thr Ser Leu Leu Ser Leu Pro His Thr Ser Gly Tyr Gln Pro Ala 50 55 60 Leu Met Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro Tyr Thr Gly Asn Val 65 70 75 80 Ala Ile Pro Arg Val Thr Ser Ala Gly Ser Lys Leu Leu Pro Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu Ser Glu His Lys Asp 100 105 110 Val Lys Phe Asn Cys Ser Ile Ser Val Pro Asn Ile Tyr Gln Asp Thr 115 120 125 Thr Ile Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His 130 135 140 Ala Ile Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala 145 150 155 160 Ser Phe Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile 165 170 175 Cys Lys Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr 180 185 190 Ile Glu Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met 195 200 205 Asn Val Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly 210 215 220 Pro Pro Glu Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val 225 230 235 240 Asn Glu Gln Pro Glu Lys Ser Pro Ser Val Leu Thr Val Pro Gly Leu 245 250 255 Thr Glu Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu 260 265 270 Thr Val Ser Lys Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser Pro 275 280 285 Pro Thr Glu Val Ser Ile His Asn Ser Thr Ala His Ser Ile Leu Ile 290 295 300 Ser Trp Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro Phe Arg Asn Cys Ser 305 310 315 320 Val Gln Val Lys Glu Val Asp Pro Leu Ser Asn Gly Ser Val Met Ile 325 330 335 Phe Asn Thr Ser Ala Ser Pro His Met Tyr Gln Ile Lys Gln Leu Gln 340 345 350 Ala Leu Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys Met Asn Glu Ile Gly 355 360 365 Trp Ser Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala 370 375 380 Pro Ser Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Arg 385 390 395 400 Asp Asn Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Leu Thr Lys Arg Gln Ala 405 410 415 Gly Glu Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser His Val Trp Gln Ser Ala Gly 420 425 430 Ile Ser Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Asn Ser Arg Ala 435 440 445 Gln Ile Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala 450 455 460 Ala Val Thr Lys Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile 465 470 475 480 Phe Ile Pro Ala His Gly Trp Val Asp His Ala Pro Ser Ser Thr Pro 485 490 495 Ala Pro Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys 500 505 510 Gly Phe Ile Leu Ile Gly Leu Val Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Val Arg 515 520 525 Lys Arg Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp 530 535 540 Ser Glu Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg 545 550 555 560 Ala Ile Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln 565 570 575 Asn Lys Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu Ile Leu Gly 580 585 590 Lys Ile Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu 595 600 605 Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser Gln Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys 610 615 620 Leu Asp Asn Phe Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala 625 630 635 640 Ala Cys Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly 645 650 655 Val Cys Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile 660 665 670 Leu Pro Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser 675 680 685 Arg Leu Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys 690 695 700 Phe Met Met Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn 705 710 715 720 Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp 725 730 735 Met Thr Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser 740 745 750 Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp 755 760 765 Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp 770 775 780 Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Met 785 790 795 800 Thr Pro Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu 805 810 815 His Gly His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr 820 825 830 Glu Ile Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr 835 840 845 Phe Ser Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro 850 855 860 Asn Val Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Ile Asn Thr Gln Leu Leu 865 870 875 880 Glu Ser Ser Glu Gly Leu Ala Glu Gly Ser Thr Leu Ala Pro Leu Asp 885 890 895 Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Ser Pro His Ala 900 905 910 Ala Ile Ser Val Val Thr Ala Glu Ile His Asp Ser Lys Pro His Glu 915 920 925 Gly Arg Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Val Thr 930 935 940 Ser Ala Ala Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro 945 950 955 960 Gly Glu Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Pro Trp Ser His Ser Ser Thr 965 970 975 Leu Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp 980 985 990 Ser Ser Glu Ser Ser Glu Val Leu Met 995 1000 <210> 261 <211> 994 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 261 Met Val Leu Ala Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ser Gly Gly Thr Ala Glu Lys Trp Glu Glu Thr Glu Leu Asp Gln 20 25 30 Leu Phe Ser Gly Pro Leu Pro Gly Arg Leu Pro Val Asn His Arg Pro 35 40 45 Phe Ser Ala Pro His Ser Ser Arg Asp Gln Leu Pro Pro Pro Gln Thr 50 55 60 Gly Arg Ser His Pro Ala His Thr Ala Ala Pro Gln Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ala Ser Lys Leu Leu Pro Pro Val Ala Phe Asn His Thr Ile Gly His 85 90 95 Ile Val Leu Ser Glu His Lys Asn Val Lys Phe Asn Cys Ser Ile Asn 100 105 110 Ile Pro Asn Thr Tyr Gln Glu Thr Ala Gly Ile Ser Trp Trp Lys Asp 115 120 125 Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His Ser Ile Thr Gln Phe Tyr Pro 130 135 140 Asp Glu Glu Gly Val Ser Ile Ile Ala Leu Phe Ser Ile Ala Ser Val 145 150 155 160 Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Phe Cys Lys Met Lys Val Asn Asn 165 170 175 Arg Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr Val Glu Val Gln Gly Leu Pro 180 185 190 Tyr Phe Ile Lys Gln Pro Glu Ser Val Asn Val Thr Arg Asn Thr Ala 195 200 205 Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Asn Ile 210 215 220 Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu Lys Pro Glu Arg Ser 225 230 235 240 Pro Ser Val Leu Thr Val Pro Gly Leu Thr Glu Thr Ala Val Phe Ser 245 250 255 Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu Thr Val Ser Lys Gly Val His 260 265 270 Ile Asn Ile Lys Val Ile Pro Ser Pro Pro Thr Glu Val His Ile Leu 275 280 285 Asn Ser Thr Ala His Ser Ile Leu Val Ser Trp Val Pro Gly Phe Asp 290 295 300 Gly Tyr Ser Pro Leu Gln Asn Cys Ser Ile Gln Val Lys Glu Ala Asp 305 310 315 320 Arg Leu Ser Asn Gly Ser Val Met Val Phe Asn Thr Ser Ala Ser Pro 325 330 335 His Leu Tyr Glu Ile Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ala Asn Tyr Ser Ile 340 345 350 Ala Val Ser Cys Arg Asn Glu Ile Gly Trp Ser Ala Val Ser Pro Trp 355 360 365 Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser Val Ala Pro Leu Asn 370 375 380 Ile Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Asn Asn Ile Leu Asp Ile Arg Trp 385 390 395 400 Thr Lys Pro Pro Ile Lys Arg Gln Asp Gly Glu Leu Val Gly Tyr Arg 405 410 415 Ile Ser His Val Trp Glu Ser Ala Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Ser Glu 420 425 430 Glu Val Ser Gln Asn Gly Ser Trp Ala Gln Ile Pro Val Gln Ile His 435 440 445 Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Ile Thr Lys Gly Gly Ile 450 455 460 Gly Pro Phe Ser Glu Pro Val Asn Ile Ile Ile Pro Glu His Ser Lys 465 470 475 480 Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro Gly Asn Thr Asp Ser 485 490 495 Met Phe Ile Ile Leu Gly Cys Phe Cys Gly Phe Ile Leu Ile Gly Leu 500 505 510 Ile Leu Cys Ile Ser Leu Ala Leu Arg Arg Arg Val Gln Glu Thr Lys 515 520 525 Phe Gly Gly Ala Phe Ser Glu Glu Asp Ser Gln Leu Val Val Asn Tyr 530 535 540 Arg Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg Ala Ile Glu Leu Thr Leu Gln 545 550 555 560 Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln Asn Lys Leu Glu Asp Val Val 565 570 575 Ile Asp Arg Asn Leu Leu Val Leu Gly Lys Val Leu Gly Glu Gly Glu 580 585 590 Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser 595 600 605 Gln Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Leu Asp Asn Phe Ser Gln Arg 610 615 620 Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Cys Met Lys Asp Phe Asn 625 630 635 640 His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys Ile Glu Leu Ser Ser 645 650 655 Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys Tyr Gly 660 665 670 Asp Leu His Thr Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Asn Thr Gly Pro Lys 675 680 685 Tyr Ile His Leu Gln Thr Leu Leu Lys Phe Met Met Asp Ile Ala Gln 690 695 700 Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn Phe Leu His Arg Asp Leu Ala 705 710 715 720 Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp Met Thr Val Cys Val Ala Asp 725 730 735 Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly 740 745 750 Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala 755 760 765 Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr 770 775 780 Met Trp Glu Ile Thr Thr Arg Gly Met Thr Pro Tyr Pro Gly Val Gln 785 790 795 800 Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu His Gly His Arg Leu Lys Gln 805 810 815 Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr Asp Ile Met Tyr Ser Cys Trp 820 825 830 Ser Ala Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser Val Leu Arg Leu Gln 835 840 845 Leu Glu Lys Leu Ser Glu Ser Leu Pro Asp Ala Gln Asp Lys Glu Ser 850 855 860 Ile Ile Tyr Ile Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser Cys Glu Gly Ile Ala 865 870 875 880 Asn Gly Pro Ser Leu Thr Gly Leu Asp Met Asn Ile Asp Pro Asp Ser 885 890 895 Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ala Ala Val Ser Val Val Thr Ala 900 905 910 Glu Val His Glu Asn Asn Leu Arg Glu Glu Arg Tyr Ile Leu Asn Gly 915 920 925 Gly Asn Glu Glu Trp Glu Asp Val Ser Ser Thr Pro Phe Ala Ala Val 930 935 940 Thr Pro Glu Lys Asp Gly Val Leu Pro Glu Asp Arg Leu Thr Lys Asn 945 950 955 960 Gly Val Ser Trp Ser His His Ser Thr Leu Pro Leu Gly Ser Pro Ser 965 970 975 Pro Asp Glu Leu Leu Phe Val Asp Asp Ser Leu Glu Asp Ser Glu Val 980 985 990 Leu Met

Claims (26)

  1. 세포의 표면 상에 발현된 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (MerTK)에 특이적으로 결합하고 MerTK-발현 세포에 의한 에페로시토시스(efferocytosis)를 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 약 5 nM 이하;
    (b) 약 1 nM 이하;
    (c) 약 0.1 nM 이하
    (d) 약 0.01 nM 내지 약 1 nM;
    (e) 약 0.01 nM 내지 약 0.7 nM;
    (f) 약 0.04 nM 내지 약 0.7 nM; 또는
    (g) 약 0.04 nM 내지 약 0.1 nM
    의 IC50으로 인간 MerTK (hMerTK)-발현 세포의 에페로시토시스를 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, hMerTK에 대한 성장 정지-특이적 단백질 6 (Gas6)의 결합을 억제하고 MerTK/Gas6 신호전달을 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 약 50 nM 이하;
    (b) 약 10 nM 이하;
    (c) 약 5 nM 이하;
    (d) 약 1 nM 이하;
    (e) 약 0.5 nM 이하;
    (f) 약 0.1 nM 이하;
    (g) 약 0.01 nM 내지 약 10 nM;
    (h) 약 0.05 nM 내지 약 6 nM;
    (i) 약 0.08 nM 내지 약 2 nM; 또는
    (j) 약 0.2 nM 내지 약 2 nM
    의 IC50으로 MerTK/Gas6 신호전달을 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 259로서 제시된 인간 MerTK에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 약 100 nM 이하;
    (b) 약 50 nM 이하;
    (c) 약 10 nM 이하;
    (d) 약 5 nM 이하;
    (e) 약 1 nM 이하;
    (f) 약 0.5 nM 이하;
    (g) 약 0.1 nM 이하;
    (h) 약 0.05 nM 이하;
    (i) 약 0.01 nM 이하;
    (j) 약 100 nM 내지 약 0.1 nM;
    (k) 약 50 nM 내지 약 0.5 nM;
    (l) 약 10 nM 내지 약 1 nM; 또는
    (m) 약 6 nM 내지 약 2 nM
    의 KD로 인간 MerTK에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 260으로서 제시된 시노몰구스 원숭이 MerTK에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 약 100 nM 이하;
    (b) 약 50 nM 이하;
    (c) 약 10 nM 이하;
    (d) 약 5 nM 이하;
    (e) 약 1 nM 이하;
    (f) 약 0.5 nM 이하;
    (g) 약 0.1 nM 이하;
    (h) 약 100 nM 내지 약 0.1 nM;
    (i) 약 50 nM 내지 약 0.5 nM;
    (j) 약 10 nM 내지 약 1 nM; 또는
    (k) 약 5 nM 내지 약 1 nM
    의 KD로 시노몰구스 원숭이 MerTK에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 261로서 제시된 뮤린 MerTK에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  10. 제9항에 있어서,
    (a) 약 100 nM 이하;
    (b) 약 50 nM 이하;
    (c) 약 10 nM 이하;
    (d) 약 5 nM 이하;
    (e) 약 1 nM 이하;
    (f) 약 0.5 nM 이하;
    (g) 약 0.1 nM 이하;
    (h) 약 100 nM 내지 약 0.1 nM;
    (i) 약 50 nM 내지 약 0.5 nM;
    (j) 약 10 nM 내지 약 1 nM; 또는
    (k) 약 5 nM 내지 약 1 nM
    의 KD로 마우스 MerTK에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 적어도 인간 및 시노몰구스 원숭이 MerTK 둘 다;
    (b) 적어도 인간 및 뮤린 MerTK 둘 다; 또는
    (c) 인간, 시노몰구스 원숭이 및 뮤린 MerTK
    와 교차-반응하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  12. 서열이 서열식별번호: 259로서 제시된 인간 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (hMerTK) 상의 빈(Bin) 1 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 105 내지 165에 걸친 영역 내의 hMerTK의 제1 Ig 도메인에 위치하는 것인 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  13. 제12항에 있어서, 빈 1 에피토프가
    (a) HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 126 내지 155에 걸친 hMerTK의 영역 내에 위치하거나; 또는
    (b) HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 126 내지 155 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 20개 또는 모두를 포함하는 것인
    모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  14. 서열이 서열식별번호: 259로서 제시된 인간 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (hMerTK) 상의 빈 2 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 195 내지 270에 걸친 영역 내의 hMerTK의 제2 Ig 도메인에 위치하는 것인 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  15. 제14항에 있어서, 빈 2 에피토프가
    (a) HDX-MS 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 231 내지 249에 걸친 hMerTK의 영역 내에 위치하거나;
    (b) 효모 디스플레이 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두를 포함하거나;
    (c) 효모 디스플레이 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 N234, S236, R237, E240, Q241, P242 및 G269를 포함하거나; 또는
    (d) HDX-MS 및 효모 디스플레이 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 아미노산 잔기 231 내지 249 및 아미노산 잔기 G269 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10개 또는 모두를 포함하는 것인
    모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  16. 서열이 서열식별번호: 259로서 제시된 인간 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (hMerTK) 상의 빈 3 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 에피토프는 효모 디스플레이 및/또는 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 에피토프 맵핑에 의해 결정 시 대략 아미노산 잔기 420 내지 490에 걸친 영역 내의 hMerTK의 피브로넥틴 (Fn) 도메인 내에 위치하는 것인 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  17. 세포의 표면 상에 발현된 인간 원종양유전자 티로신-단백질 키나제 MER (hMerTK)에 특이적으로 결합하고, 각각:
    (a) 서열식별번호: 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
    (l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL
    내의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  18. 제17항에 있어서, 카바트 방법에 의해 정의된 바와 같은 하기 CDR 도메인을 포함하는 모노클로날 항체:
    (a) 서열식별번호: 1로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 4로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 7로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 10으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 13으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 16으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    (b) 서열식별번호: 73으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 76으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 79로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 82로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 85로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 88로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
  19. 제17항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 217로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 218로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (b) 서열식별번호: 221로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 222로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (c) 서열식별번호: 225로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 226으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (d) 서열식별번호: 229로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 230으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (e) 서열식별번호: 233으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 234로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (f) 서열식별번호: 237로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 238로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (g) 서열식별번호: 241로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 242로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (h) 서열식별번호: 245로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 246으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (i) 서열식별번호: 249로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 250으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (j) 서열식별번호: 253으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 254로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL;
    (k) 서열식별번호: 255로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 256으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL; 또는
    (l) 서열식별번호: 257로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 258로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 VL
    을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  20. 제17항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 219로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 220으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열식별번호: 223으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 224로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (c) 서열식별번호: 227로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 228로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (d) 서열식별번호: 231로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 232로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (e) 서열식별번호: 235로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 236으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (f) 서열식별번호: 239로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 240으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (g) 서열식별번호: 243으로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 244로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄;
    (h) 서열식별번호: 247로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 248로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄; 또는
    (i) 서열식별번호: 251로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 252로서 제시된 서열을 갖는 연속적으로 연결된 아미노산을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  21. 치료제에 연결된 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하며, 임의로 여기서 치료제는 세포독소 또는 방사성 동위원소인 면역접합체.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분과는 상이한 결합 특이성을 갖는 결합 도메인에 연결된, 상기 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자.
  23. (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분;
    (b) 제21항의 면역접합체; 또는
    (c) 제22항의 이중특이적 분자,
    및 제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 조성물.
  24. 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 제21항의 면역접합체, 제22항의 이중특이적 분자 또는 제23항의 제약 조성물 및 임의로 암을 치료하기 위한 추가의 치료제를 조합하여 투여하여 대상체가 치료되도록 하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 추가의 치료제가
    (a) 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1), 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), B 및 T 림프구 감쇠자 (BTLA), T 세포 이뮤노글로불린 및 뮤신 도메인-3 (TIM-3), 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG-1), 아데노신 A2a 수용체 (A2aR), 자연 킬러 세포 수용체 2B4 (CD244), 또는 CD160에 특이적으로 결합하는 길항작용 항체; 또는
    (b) 유도성 T 세포 공동-자극인자 (ICOS), CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD27, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질(GITR) 및 헤르페스바이러스 진입 매개체 (HVEM)에 특이적으로 결합하는 효능작용 항체
    인 방법.
  26. (a) MerTK에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 1회 이상의 투여량;
    (b) 임의로, PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분 약 200 내지 약 1600 mg 범위의 1회 이상의 투여량; 및
    (b) 제24항 또는 제25항의 방법에서 MerTK에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 부분 및 임의로 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 부분을 사용하는 것에 대한 지침서
    를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 키트.
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