EA009383B1 - РАСТВОРИМЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ГИАЛУРОНИДАЗЫ (sHASEGP), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ - Google Patents

РАСТВОРИМЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ГИАЛУРОНИДАЗЫ (sHASEGP), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ Download PDF

Info

Publication number
EA009383B1
EA009383B1 EA200501384A EA200501384A EA009383B1 EA 009383 B1 EA009383 B1 EA 009383B1 EA 200501384 A EA200501384 A EA 200501384A EA 200501384 A EA200501384 A EA 200501384A EA 009383 B1 EA009383 B1 EA 009383B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
glycoprotein
sequence
pharmaceutical composition
cell
Prior art date
Application number
EA200501384A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501384A1 (ru
Inventor
Луис Х. Букбиндер
Анирбан Кунду
Грегори И. Фрост
Original Assignee
Хэлозим, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32962713&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA009383(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Хэлозим, Инк. filed Critical Хэлозим, Инк.
Publication of EA200501384A1 publication Critical patent/EA200501384A1/ru
Publication of EA009383B1 publication Critical patent/EA009383B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/04—Amoebicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Изобретение относится к открытию новых активных в нейтральных условиях растворимых гиалуронидазных гликопротеинов (sHASEGP), способам их получения и их применению для облегчения введения других молекул или для снятия связанных с гликозаминогликанами патологий. Описаны минимальные активные полипептидные домены растворимого, активного в нейтральных условиях sHASEGP, включающие связанные с аспарагином сахарные части молекулы, необходимые для функционирования активного в нейтральных условиях гиалуронидазного домена. Включены аминоконцевые лидерные пептиды, усиливающие секрецию sHASEGP. Изобретение далее вводит сиалированные и ПЭГилированные формы рекомбинантного sHASEGP с целью повысить стабильность и улучшить фармакокинетику в сыворотке по сравнению с природными ферментами, производимыми на скотобойнях. Далее описаны подходящие наборы, содержащие, по существу, очищенный рекомбинантный гликопротеин sHASEGP, полученный из эукариотических клеток, производящих надлежащее гликозилирование, необходимое для его оптимальной активности.

Description

Ссылки на родственные заявки
Заявка на данное изобретение относит приоритет под номером 35 И8С §119(е) к заявке с регистрационным номером 60/452360, поданной 5 марта 2003 г., которая включена в настоящую работу ссылкой во всей её полноте.
Область техники
Настоящее изобретение в основном относится к активным в нейтральных условиях растворимым гликопротеинам гиалуронидазы (пеи1га1-асйуе. ко1иЬ1е йуа1итошбаке д1усорто!етк, кНА8ЕОР), их частям, в особенности к гиалуронидазным доменам. Более конкретно, изобретение относится к химическим модификациям, фармацевтическим композициям, экспрессирующим плазмидам, способам производства и терапевтическим способам, использующим гиалуронидазные гликопротеины и их домены, и к кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты для терапевтической модификации гликозаминогликанов в лечении заболевания и для применения в целях усиления у животного диффузии других введённых инъекцией молекул, имеющих диаметр менее 200 нм.
Предшествующий уровень техники
Гликозаминогликаны (ГАГ) - это сложные линейные полисахариды внеклеточного матрикса (ВКМ), характеризующиеся повторяющимися дисахаридными структурами, состоящими из Ν-замещённого гексозамина и уроновой кислоты [гиалуронана (ГУ), хондроитин-сульфата (ХС), хондроитина (X), дерматан-сульфата (ДС), гепаран-сульфата (ГС), гепарина (Г)] или галактозы [кератансульфата (КС)]. За исключением ГУ все оказываются ковалентно связанными с сердцевинными (капсидными) белками. ГАГ со своими сердцевинными белками в соответствии с их структурой относят к протеогликанам (ПГ).
Гиалуронан (ГУ) обнаруживается у млекопитающих преимущественно в соединительных тканях, коже, хрящах и синовиальной жидкости. Гиалуронан является также основной составляющей стекловидного тела глаза. В соединительной ткани связанная с гиалуронаном гидратная вода создаёт просветы между тканями, образуя окружение, способствующее перемещению и пролиферации клеток. Гиалуронан играет ключевую роль в биологических процессах, связанных с подвижностью клеток, включая быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, залечивание ран, ангиогенез и онкогенез (развитие опухолей) (Тоо1е //«Се11 Вю1. Ех!гасе11. Ма!йх». Под ред. Нау. Р1епит Ргекк, №\ν Уогк, 1991, р. 1384-1386; Вейтаиб е! а1. //1п!. I. Сапсег. 1992, ν. 52, р. 1-6; Кпибкоп е! а1. //ΡΑ8ΕΒ I. 1993, ν. 7, р. 1233-1241). Кроме того, уровень гиалуронана коррелирует с агрессивностью раковых опухолей (Охе11о е! а1. //Сапсег Век. 1960, ν. 20, р. 600-604; ТакеисЫ е! а1. //Сапсег Век. 1976, ν. 36, р. 21332139; К1та!а е! а1. //Сапсег Век. 1983, ν. 43, р. 1347-1354).
ГУ обнаружен во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в мягких соединительных тканях. ГУ выполняет различные физиологические функции, такие, как связанные с гомеостазом воды и белков плазмы (Ьаигеп! Т.С. е! а1. //ΡΑ8ΕΒ 1. 1992, ν. 6, р. 2397-2404). Продукция ГУ повышается в пролиферирующих клетках и может играть роль в митозе. Он участвует также в подвижности клеток и клеточной миграции. По-видимому, ГУ играет важную роль в регуляции, развитии и дифференцировке клеток (Ьаигеп! е! а1., см. выше).
ГУ использовался в клинической медицине. Была доказана полезность его тканезащитных и реологических свойств в офтальмологической хирургии для защиты эндотелия роговицы в ходе операций катаракты. Сывороточный ГУ является диагностическим показателем при заболеваниях печени и различных воспалительных болезненных состояниях, таких как ревматоидный артрит. Интерстициальный отёк, вызванный накоплением ГУ, может приводить к дисфункции различных органов (Ьаигеп! е! а1., см. выше).
Взаимодействия гиалуронана с белком вовлечены также в формирование структуры внеклеточного матрикса или «базового вещества» (дтоипб киЬк!апсе).
Гиалуронидазы представляют собой группу активных в нейтральных или кислотных условиях ферментов, которые обнаруживаются во всем животном царстве. Гиалуронидазы различаются по субстратной специфичности и механизму действия.
Существуют три основных класса гиалуронидаз:
1. Гиалуронидазы млекопитающих (КФ 3.2.1.35), которые представляют собой эндо-бета-Νацетилгексозаминидазы с тетрасахаридами и гексасахаридами в качестве конечных продуктов. Они имеют как гидролитическую, так и трансгликозидазную активности и могут расщеплять гиалуронан и хондроитинсульфаты (С8), особенно С4-8 и С6-8.
2. Бактериальные гиалуронидазы (КФ 4.2.99.1), которые расщепляют гиалуронан и, до различной степени, С8 и дерматан-сульфат (Ό8). Они представляют собой эндо-бета-№ацетилгексозаминидазы, которые осуществляют реакцию бета-отщепления, где конечными продуктами являются в основном дисахариды.
3. Гиалуронидазы (КФ 3.2.1.36) из пиявок, других паразитов и ракообразных, которые являются эндо-бета-глюкуронидазами и дают в качестве конечных продуктов тетрасахариды и гексасахариды путём гидролиза бета 1-3 связи.
Гиалуронидазы млекопитающих могут быть далее подразделены на две группы: ферменты, активные в нейтральных условиях и активные в кислотных условиях. В геноме человека имеется шесть генов,
- 1 009383 подобных генам гиалуронидазы: НУЛЫ, НУАБ2, НУЛЬЗ, НУАБ4, НУЛБР1 и РН20/8РАМ1.
НУАБР1 - это псевдоген, а у продукта НУЛЬЗ не было обнаружено никакой ферментативной активности в отношении любых известных субстратов.
Продукт НУАБ4 представляет собой хондроитиназу и не обладает активностью в отношении гиалуронана.
Продукт НУАЫ - это прототип фермента, активного в кислотных условиях, а продукт РН20 прототип фермента, активного в нейтральных условиях.
Активные в кислотных условиях гиалуронидазы, такие как НУАЬ1 и НУАЬ2. утрачивают каталитическую активность при нейтральном рН. Например, НУАЫ не обладает каталитической активностью ίη νίίτο при рН выше 4,5 (РтоЧ с1 а1. //Апа1. Вюсйешкйу. 1997). НУАБ2 представляет собой фермент, активный в кислотных условиях, с очень низкой специфической активностью ίη νίίτο.
Гиалуронидазоподобные ферменты можно также разделить на те, которые закреплены в плазматической мембране с помощью гликозилфосфатидил-инозитольного (СР1) якоря, такие как НУАЬ2 и РН20 человека (ΌαηίΙΓονίίοΗ-Μία^φονα еί а1. //Ргос. Ναίΐ. Асаб. 8с1. И8А. 2003, ν. 100, № 8, р. 4580-4585; Рйе1рз еί а1. //8с1епсе. 1988), и такие, которые растворены, как НУАЬ1 человека (Γτοδί еί а1. //Вюсйеш. Вюрйуз. Вез. Сοттиη. 1997, ν. 236, № 1, р. 10-15). Однако от вида к виду наблюдаются вариации: например, РН20 крупного рогатого скота очень слабо прикреплена к плазматической мембране и не зацеплена чувствительным к фосфолипазе якорем (Ьа1апсейе еί а1. //Βίο1. Вергоб. 2001, ν. 65, № 2, р. 628-636). Эта уникальная особенность бычьей гиалуронидазы позволила использовать растворимый фермент гиалуронидазу из бычьих семенников в виде экстракта для клинического применения (^убазе®, Нуа1азе®). Другие виды РН20 являются заякоренными в липиде ферментами, которые не могут быть растворены без применения детергентов или липаз. Например, РН20 человека заякорен в плазматической мембране через ОРГ Попытки создать конструкции ДНК для РН20 человека, не внедряющие липидный якорь в полипептид, приводили к получению либо каталитически неактивного, либо нерастворимого фермента (Аттшд еί а1. //Еиг. ί. Вюсйет. 1997, ν. 247, № 3, р. 810-814). Существующая в природе гиалуронидаза из спермы макак обнаружена и в растворимой, и в связанной с мембраной формах. В то время как связанная с мембраной форма с молекулярной массой 64 кДа обладает ферментативной активностью при рН 7,0, форма 54 кДа активна только при рН 4,0 (Сйегг еί а1. //Эеу. Βίο1. 1996, ν. 175, № 1, р. 142-153). Таким образом, растворимые формы РН20 часто теряют ферментативную активность при нейтральных условиях.
Хондроитиназы - это ферменты, имеющиеся во всём животном мире. Эти ферменты расщепляют гликозаминогликаны по механизму эндогликозидазной реакции. Конкретные примеры известных хондроитиназ включают в себя хондроитиназу АВС (получаемую из Рго1еиз уиЦапз: заявка на японский патент, регистрационный номер 6-153947, Уатада1а Т., 8<ιίίο Н., НаЬисЫ О., 8ι.ιζι.ιΒί 8. //I. Βίο1. Сйет. 1968, ν. 243, р. 1523; 8ι.ιζι.ιΒί 8., 8а1Ю Н., Уатада1а Т., Ашю К., 8егю Ν., Ка^а1 Υ., ГигийазЫ Т. //I. Βίο1. Сйет. 1968, ν. 243, р. 1543);
хондроитиназу АС (получаемую из Г1аνοЬасίе^^ит йерагйшт: Υатадаίа Т., 8ηίίο Н., НаЬисЫ О., 8иζιιΓί 8. //I. Вю1. Сйет. 1968, ν. 243, р. 1523);
хондроитиназу АС11 (получаемую из АййгоЬаЛег аигезсепз: Нуата К. апб Окаба 8. //ί. Βίο1. СЬет. 1975, ν. 250. р. 1824; Н1уата К. апб Окаба 8. //I. ΒίοΟκιη. (Тοкуο). 1976, ν. 80, р. 1201);
гиалуронидазу АС111 (получаемую из Г1аνοЬасίе^^ит зр. Нр102: Μίλτιζοπο Н., К1кисй1 Н., Υοзй^ба К., Μοπίολνη К., ^киуази К. //8е1кадаки. 1989, ν. 61, р. 1023);
хондроитиназу В (получаемую из Г1аνοЬасίе^^ит йерагйшт: Мюйе1аса Υ.Μ. апб Э|е1псй С.Р. //ΒίοΟκιη. Β^οрйуз. Вез. ^тщию 1974, ν. 56, р. 973; М1сйе1асс1 Υ.Μ. апб Э|е1псй С.Р. //ΒίοΟκιη. I. 1975, ν. 151, р. 121; Маеуата К., Тараба А., иегю А., Υοзй^ба К. //8е1кадаки. 1985, ν. 57, р. 1189);
хондроитиназу С (получаемую из ΕΕινο^κ^πιιιη зр. Нр102: Μ^уаζοηο Н., К1кисй1 Н., Υοзй^ба К., ΜοΓίΚηνη К., ΤοΙιπ^ιι К. //8е1кадаки. 1989, ν. 61, р. 1023) и подобные им.
Гликопротеины состоят из полипептидной цепи, ковалентно связанной с одним или более углеводными фрагментами. Имеются две обширные категории гликопротеинов, которые содержат углеводы, сшитые с белковой составной частью либо Ν-гликозидной связью, либо О-гликозидной связью. Ν- и О-связанные гликаны присоединены к полипептидам через соответственно аспарагин-Ы-ацетил-Эглюкозамин и серин(треонин)-М-ацетил-О-галактозамин. Комплекс Ν-связанных олигосахаридов не содержит концевых маннозных остатков. Они содержат только концевые остатки Ν-ацетилглюкозамина, галактозы и/или сиаловой кислоты. Гибридные олигосахариды содержат концевые маннозные остатки, а также концевые остатки Ν-ацетилглюкозамина, галактозы и/или сиаловой кислоты.
Что касается гликопротеинов с Ν-связью, олигосахаридный предшественник присоединяется к аминогруппе аспарагина в ходе пептидного синтеза в эндоплазматической сети (эндоплазматическом ретикулуме). Затем олигосахаридный фрагмент последовательно обрабатывается серией специфических ферментов, которые удаляют и добавляют фрагменты молекулы сахара. Процессинг происходит в эндоплазматическом ретикулуме и продолжается при прохождении сквозь цис-, промежуточный и трансаппарат Гольджи.
- 2 009383
Сущность изобретения
В настоящей работе предусматриваются представители семейства растворимых гиалуронидазных гликопротеинов, активных в нейтральных условиях, в частности растворимых гиалуронидазных гликопротеинов РН-20 человека (называемых здесь также &ΗΑ8ΕΟΡ). Предусмотренный в настоящей работе 8ΗΆ8ΕΟΡ является представителем семейства δΗΆδΕΟΡ, обозначаемым как δΗΆδΕΟΡ. Предусматривается также растворимый гиалуронидазный домен и его применение.
Изобретение основывается на открытии того, что высокий уровень продукции активной в нейтральных условиях растворимой гиалуронидазы может быть получен в экспрессирующей системе млекопитающих путём введения нуклеиновых кислот, лишённых узкой области, кодирующей в кДНК РН20 человека аминокислоты карбоксильного конца. Предусматриваются также дополнительные модификации δΗΆδΕΟΡ для повышения секреции с использованием ненативных лидерных пептидов. Далее предусматриваются также способы модификации δΗΆδΕΟΡ для продления его времени полужизни путём маскировки белка полиэтиленгликолем и посттрансляционных модификаций в направлении нативного гликозилирования. Ранее производившиеся попытки получить секретируемый активный в нейтральных условиях &ΗΑ8ΕΟΡ человека оказались безуспешными. Был сделан вывод, что усечения полипептида человеческого &ΗΑ8ΕΟΡ приводят к утрате и ферментативной активности в нейтральных условиях и способности клеток секретировать рекомбинантный белок в экспрессирующих системах млекопитающих (Лгштд с1 а1. //Ειπ. 1. Вюсйеш. 1997, ν. 247, № 3, р. 810-814). Крайне необходимым является создание активного в нейтральных условиях секретируемого &ΗΑ8ΕΟΡ для коммерческого производства и для терапевтического применения в качестве гиалуронидазы. Эти проблемы преодолеваются раскрываемым здесь изобретением.
Далее настоящим изобретением предусмотрен каталитически активный гликопротеин &ΗΑ8ΕΟΡ человека, причём &ΗΑ8ΕΟΡ содержит по меньшей мере один Ν-связанный сахарный фрагмент. Приведённые в настоящей работе исследования показывают, что для каталитической активности РН20 человека требуется наличие Ν-связанных гликанов, тогда как гиалуронидазы крупного рогатого скота и пчелиного яда остаются активными и без таких Ν-связанных гликанов. Гиалуронидазный домен человека, лишённый Ν-связанных фрагментов, каталитически неактивен. Поэтому классическая технология рекомбинантной ДНК не позволяет получить продукцию каталитически активного человеческого &ΗΑ8ΕΟΡ в отличие от &ΗΑ8ΕΟΡ пчелиного яда, который можно продуцировать в Е. со11.
Изобретение включает способы и клетки для получения гликопротеинового полипептида &ΗΑ8ΕΟΡ с Ν-связью путём использования клеток, способных вводить указанные Ν-связанные фрагменты, или путём введения указанных Ν-связанных фрагментов в полипептид &ΗΑ8ΕΟΡ. Далее раскрываются способы идентификации надлежащим образом гликозилированных &ΗΑ8ΕΟΡ.
Предусматриваются также каталитически активные сверхсиалированные гликопротеины &ΗΑ8ΕΟΡ. Сверхсиалированные &ΗΑ8ΕΟΡ имеют более длительные времена полужизни в сыворотке в сравнении с природными &ΗΑ8ΕΟΡ из семенников быка и барана и поэтому они предпочтительны и для повышения ферментативной стабильности и для применения в качестве внутривенно вводимых лекарств. Изобретение предусматривает способы получения сверхсиалированных &ΗΑ8ΕΟΡ, композиции и применение.
Предусматриваются также белки, кодируемые полученными сплайсингом вариантами последовательностей для &ΗΑ8ΕΟΡ, дефицитными по природному якорю ΟΡΕ
Далее предусматриваются композиции &ΗΆ8ΕΟΡ, содержащие растворимый гликопротеин &ΗΆ8ΕΟΡ с ионом металла, причём ион металла представляет собой ион кальция, магния или натрия. Оптимум активности &ΗΆ8ΕΟΡ достигается в присутствии указанных металлов. Предусматриваются также композиции, состоящие из &ΗΆ8ΕΟΡ в присутствии указанных ионов металлов.
Предусматриваются модификации &ΗΆ8ΕΟΡ для дополнительного продления полужизни. Предусматриваются химические модификации &ΗΆ8ΕΟΡ полимерами, такими как полиэтиленгликоль и декстран. Такие модификации защищают (экранируют) &ΗΆ8ΕΟΡ от выведения через циркуляцию в кровотоке и от иммунной системы, а также от чувствительных к гликосиалированию рецепторов для маннозы и асиалогликопротеинов. Далее предусматриваются способы присоединения к специфическим функциональным группам, таким как сайты гликозилирования, положительно заряженные аминогруппы и цистеины.
В настоящей работе также предусматриваются способы анализа для идентификации эффекторов, таких как вещества, в том числе малые молекулы, и условий, таких как рН, температура и ионная сила, которые модулируют активацию, экспрессию или активность &ΗΆ8ΕΟΡ. В приводимых для примера анализах оценивается влияние испытуемых соединений на способность гиалуронидазного домена &ΗΆ8ΕΟΡ расщеплять известный субстрат, как правило, гликозаминогликан или протеогликан. Агенты, обычно соединения, в особенности малые молекулы, которые модулируют активность гиалуронидазного домена, являются соединениями-кандидатами для модулирования активности &ΗΑ8ΕΟΡ. Гиалуронидазные домены могут быть также применены для получения специфичных к гиалуронидазе антител, функция которых заключается в нарушении активности. Предусматриваемые здесь гиалуронидазные домены включают (но не ограничиваются ими) Ν-концевой гликозилгидролазный домен с усечёнными С-концевыми частями его, проявляющий каталитическую активность ίη νίίτο.
- 3 009383
Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки и гиалуронидазные домены, молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют растворимый гиалуронидазный домен или его каталитически активные части, а также те молекулы, которые кодируют кНАБЕСР полной длины. Нуклеиновая кислота, кодирующая гиалуронидазный домен, и нуклеотидная кислота противоположного направления представлены далее последовательностью БЕС ΙΌ N0: 6; а гиалуронидазный домен кНАБЕСР представлен далее последовательностью БЕС ΙΌ N0: 1 (аминокислоты 35-464). Белковая последовательность аминокислот и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты для кНАБЕСР полной длины представлены далее как последовательности БЕС ΙΌ N0: 1 и БЕС ΙΌ N0: 6.
Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются с такой кодирующей кНАБЕСР нуклеиновой кислотой по всей их полной длине или вдоль по меньшей мере 70, 80 или 90% от их полной длины, и кодирующие гиалуронидазный домен или его часть. Гибридизация обычно проводится при условиях, по меньшей мере, низкой, как правило, по меньшей мере, умеренной, и часто высокой степени строгости.
Изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК, включающий геномную ДНК или кДНК, или представляет собой РНК, или может включать другие компоненты, такие как пептидонуклеиновую кислоту или другие нуклеотидные аналоги. Изолированная нуклеиновая кислота может включать дополнительные компоненты, такие как гетерологичные или нативные промоторы, и иные последовательности, регулирующие транскрипцию или трансляцию. Эти гены могут быть присоединены к другим генам, таким как репортерные гены или другие индикаторные гены или гены, кодирующие индикаторы.
Предусматривается также изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность таких молекул, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, кодирующей кНАБЕСР или его часть.
Предусматриваются также фрагменты изолированной молекулы нуклеиновой кислоты или олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в качестве зондов или праймеров и которые содержат по меньшей мере примерно 10, 14, 16 нуклеотидов, обычно количество нуклеотидов менее 1000, или же менее 100, или равно 100, эти фрагменты представлены далее последовательностью БЕС ΙΌ N0: 6 (или комплементарной ей последовательностью); или эти фрагменты содержат по меньшей мере 30 нуклеотидов (или комплементарную им последовательность), или они содержат олигонуклеотиды, которые гибридизируются по всей своей полной длине (или по меньшей мере на 70, 80 или 90% своей полной длины) с любыми из таких фрагментов или олигонуклеотидов. Длина фрагментов зависит от цели, для которой они используются и/или от сложности представляющего интерес генома. Как правило, зонды и праймеры содержат менее чем примерно 50, 150 или 500 нуклеотидов.
Предусматриваются также плазмиды, содержащие любую из указанных молекул нуклеиновой кислоты. Предусматриваются также клетки, содержащие плазмиды. Такие клетки включают (но не ограничиваются ими) бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки грибов, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных.
Предусматриваются также системы млекопитающих с усиленной экспрессией, использующие сигнальные лидерные последовательности, способные эффективно секретировать кНАБЕСР. Пример аминокислотной последовательности такого лидерного пептида с эффективной секрецией и слитого белка с кНАБЕСР представлен в последовательностях БЕС ΙΌ N0: 43 и БЕС ΙΌ N0: 46.
Предусматривается также способ продукции кНАБЕСР путём выращивания описанных выше клеток в условиях, когда кНАБЕСР экспрессируется клетками, и выделения экспрессированного полипептида или гликопротеина кНАБЕСР. Предусматриваются также способы выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей другие кНАБЕСР.
Предусматриваются также клетки, как правило клетки эукариот, такие, как клетки млекопитающих и дрожжевые клетки, в которых полипептид кНАБЕСР экспрессируется на поверхности клеток. Такие клетки используют в тестах по скринингу лекарств для идентификации соединений, модулирующих активность полипептида кНАБЕСР. В этих тестах, в том числе тестах на связывание ίη νίίτο и тестах на основе транскрипции, в которых происходит прямое или косвенное влияние на передачу сигнала, как, например, через активацию факторов стимуляции роста, оценивается действие кНАБЕСР.
Предусматриваются также пептиды, кодируемые такими молекулами нуклеиновой кислоты. Среди этих пептидов - гиалуронидазный домен кНАБЕСР или полипептид с такими аминокислотными заменами, когда специфичность и/или гиалуронидазная активность существенно не изменяются. В частности, предусматривается существенно очищенный гликопротеин кНАБЕСР млекопитающего, который включает секретируемый гиалуронидазный домен, каталитически активный в нейтральных условиях.
Изобретение включает также каталитический гиалуронидазный домен и может дополнительно включать другие домены. кНАБЕСР может образовывать гомодимеры и может также образовывать гетеродимеры с некоторыми другими белками, такими, как связанные с мембранами белки. Предусматривается также, по существу, очищенный гликопротеин, включающий последовательность аминокислот, имеющую степень идентичности с кНАБЕСР по меньшей мере 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, где процент идентичности определяется с помощью стандартных
- 4 009383 алгоритмов и отбрасывания пробелов, максимизирующего процент идентичности.
Здесь рассматриваются полученные сплайсингом варианты кНА8ЕОР, в особенности те, которые содержат каталитически активный гиалуронидазный домен.
В других формах осуществления настоящего изобретения предусматриваются, по существу, очищенные полипептиды, которые включают гиалуронидазный домен полипептида кНАЗЕСР или его каталитически активную часть, но не включают полную аминокислотную последовательность, представленную далее как последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1. Среди них полипептиды, включающие последовательность аминокислот, имеющие степень идентичности с последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 8Е0 ΙΌ N0: 3, по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95 или 100%.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается нуклеиновая кислота, которая кодирует эукариотический гиалуронидазный гликопротеин, обозначенный кНАЗЕСР. В частности, нуклеиновая кислота включает последовательность нуклеотидов, указанную далее в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 6, особенно указанную далее как нуклеотиды 106-1446 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 6, или же её часть, кодирующую каталитически активный полипептид.
Предусматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются при условиях, по меньшей мере, низкой степени строгости, обычно при условиях умеренной степени строгости и более типично при условиях высокой степени строгости, с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 6 или её вырожденными производными.
В одном из осуществлений настоящего изобретения изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную далее в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 6 (или её вырожденные производные) при условиях высокой степени строгости. &НЛ8ЕСР полной длины указан далее в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 и кодируется последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 6 или её вырожденными производными.
Предусматриваются также мутеины (мутантные белковые формы) гиалуронидазного домена кНА8Е0Р, в частности такие мутеины, в которых остаток Сук в гиалуронидазном домене, являющийся свободным (т.е. не образующий дисульфидных связей ни с каким из других остатков Сук в гиалуронидазном домене), замещён другой аминокислотой, как правило (хотя и не обязательно), такая аминокислотная замена является консервативной заменой или такой заменой, которая не нарушает активность, и мутеины, в которых удалён (или удалены) специфический сайт (или сайты) гликозилирования.
В настоящей работе предусматриваются полипептиды кНЛЗЕСР. в том числе (но не ограничиваясь ими) полученные сплайсингом его варианты, и нуклеиновые кислоты, кодирующие кНЛ8ЕСР, и их домены, производные и аналоги. Предусматриваются также одноцепочечные секретируемые гиалуронидазные гликопротеины, имеющие №конец, функционально эквивалентный тем, которые создаются активацией сигнальной пептидазы с образованием кНЛЗЕСР. Существуют семь сайтов потенциально возможного ^связанного гликозилирования в положениях N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 кНЛ8ЕСР, как для примера приведено в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1. Между цистеиновыми остатками Сук С60-С351 и остатками Сук С224-С238 образуются дисульфидные связи, формируя сердцевину гиалуронидазного домена кНЛЗЕСР. Однако для каталитической активности фермента в нейтральных условиях необходимы дополнительные цистеины в карбоксильном конце, так что кНЛЗЕСР с аминокислотами от № 36 до Сук464 в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 представляет собой минимальный активный гиалуронидазный домен кНЛЗЕСР человека. Таким образом, сайт ^связанного гликозилирования N490 не нужен для полноценной активности кНЛЗЕСР.
Гликозилирование кНЛЗЕСР с ^связью играет решающую роль для их каталитической активности и стабильности. В то время как изменение типа гликана, модифицирующего гликопротеин, может очень сильно влиять на антигенность, структурное сворачивание, растворимость и стабильность белка, существует мнение, что для оптимальной ферментативной активности большинства ферментов гликозилирование не требуется. Таким образом, кНЛЗЕСР являются в этом смысле уникальными, так как удаление ^связанного гликозилирования может приводить к почти полной инактивации гиалуронидазной активности. Присутствие ^связанных гликанов является решающим для создания активного кНЛЗЕСР. Сюда включены системы экспрессии белка, пригодные для введения в кНЛЗЕСР важных ^связанных гликозилирующих остатков. Дополнительно включено введение дегликозилированного полипептида кНЛЗЕСР в присутствии экстрактов, способных присоединять ^связанные гликаны. В одном из аспектов изобретения описывается также комплексное гликозилирование, завершающееся сиалированием, но рассматриваются и другие случаи, когда гликозилирование завершается свободными остатками маннозы. Предпочтительно в концевых остатках ^связанного гликозилирования на кНЛЗЕСР находятся остатки сиаловой кислоты.
^связанные олигосахариды распадаются на несколько главных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфированные), которые все имеют сердцевины (Μаη)3,-С1сNАс-С^сNАс-. присоединённые через атом амидного азота в остатках Акп, находящихся в пределах последовательностей -Аки-Хаа-Тйг/8ег-(где Хаа - это не Рго). Гликозилирование в сайте -Акп-Хаа-Сук- было описано для коагуляционного белка С. Часто сайты с ^связью косвенно различимы по появлению «пустого» цикла при секвенировании. Позитивная идентификация может быть осуществлена после высвобождения олигоса
- 5 009383 харида ферментом РЫСазой (пептид-Ы-гликозидазой) Р, которая превращает гликозилированный Аки в Акр. После удаления РСЫазы Р Ν-связанные олигосахариды могут быть очищены с помощью хроматографии на биогеле Р-6, а олигосахаридный пул подвергается препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (Ыдй рН аиюи схсйапдс сйгота1одгарйу, НРАЕС) (То\\'пкспб с! а1. //Апа1. Βίοс11ст. 1989, ν. 182, р. 1-8). С помощью НРАЕС можно разделить некоторые изомеры олигосахаридов. На хроматограммах НРАЕС остатки фукозы смещаются к более раннему элюированию, тогда как остатки дополнительной сиаловой кислоты выходят при большем времени элюирования. Путём сопутствующей обработки гликопротеинов с известной олигосахаридной структурой (например, фетуин крупного рогатого скота, кислый гликопротеин α-1, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) можно улучшить идентификацию олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды можно охарактеризовать, сочетая анализы состава и метилирующих связей (^асдйс с! а1. //СагЬойубг. Век. 1983, ν. 123, р.281-304), различая аномерные конфигурации с помощью спектроскопии ЯМР (Уап На1Ьсск //МсОюбк Епхуто1. 1993, ν. 230).
Предусматриваются также композиции, содержащие кНАБЕСР. Композиции, содержащие кНАБЕСР могут быть составлены в лиофилизованной форме или как стабилизированные растворы. Для оптимальной активности при нейтральных рН полезны композиции, содержащие ионы специфических металлов, таких как кальций, магний или натрий. Кроме композиций в виде стабилизированных растворов, в настоящей работе рассматриваются также композиции с медленным высвобождением, пригодные для пролонгированного выделения гликозаминогликанов. В настоящей работе предусматриваются также наборы для введения малых объёмов кНАБЕСР при процедурах внутриглазной хирургии и других процедур с введением малых объёмов. Наборы представляют собой предварительно наполненные шприцы с кНАБЕСР. Предусматриваются также композиции со сбалансированным солевым составом для применения сх νίνο в процедурах технологии искусственного оплодотворения.
Предусматриваются также способы применения кНАБЕСР для удаления гликозаминогликанов. кНАБЕСР открывает каналы в интерстициальном пространстве путём разрушения гликозаминогликанов, что даёт возможность диффундировать молекулам, имеющим размер менее 500 нм. Эти каналы продолжают существовать в течение 24-48 ч, в зависимости от дозы и типа композиции. Такие каналы могут быть использованы для усиления диффузии добавленных извне молекул, таких как жидкости, небольшие молекулы, белки, нуклеиновые кислоты, векторы для генотерапии и другие молекулы размером менее 500 нм.
кНАБЕСР может быть также применён для удаления избытка гликозаминогликанов, таких как возникающие после повторной ишемической перфузии, воспаления, артериосклероза, водянки, рака, травмы спинного мозга и других форм рубцевания. В некоторых случаях кНАБЕСР может вводиться системно путём внутривенного вливания. Это может быть полезно тогда, когда местное введение невозможно как в случае сердца или мозга, или в случае рассеянной неоплазии, когда заболевание охватывает всё тело. Сверхсиалированные кНАБЕСР предпочтительны для увеличения времени полужизни в сыворотке и улучшения распространения в организме по сравнению с природными гиалуронидазными ферментами, лишёнными концевых сиаловых кислот.
В некоторых случаях, таких как повреждение спинного мозга, глаукома и косметические процедуры, предпочтительно длительное введение.
При других симптомах предпочтительна однократная доза с кратким действием. Кратковременное удаление гликозаминогликанов можно применять для усиления доставки растворов и лекарств в интерстицальные промежутки. Это может быть полезно для диффузии анестетиков и для введения терапевтических жидкостей, молекул и белков. Подкожное и внутримышечное введение молекул в присутствии кНАБЕСР также быстрее способствует их системному распределению. Такие способы чрезвычайно полезны, когда внутривенное введение невозможно или когда необходима более быстрая системная доставка молекул. Для доставки других больших молекул, таких как фактор VIII, которые при подкожном введении имеют низкую биологическую доступность, можно осуществлять инъекцию вместе с кНАБЕСР, чтобы повысить их доступность.
Предусматриваются также способы применения кНАБЕСР для ферментативного удаления скопившегося матрикса («кумулюс матрикс»), окружившего овоциты. Удаление скопившегося матрикса с помощью очищенного кНАБЕСР, не содержащего токсических примесей, характерных для полученных из экстрактов гиалуронидаз, обеспечивает более мягкую процедуру получения овоцитов с повышенной выживаемостью. Кроме того, производство кНАБЕСР может осуществляться без использования экстрактов из организма крупного рогатого скота или других организмов, которые содержат вирусы и другие патогены, такие как агенты передаваемых губкообразных энцефалопатии.
Для малых пространств также могут быть применены инъекции малых объёмов кНАБЕСР, предназначенные для внутриглазного применения. кНАБЕСР могут быть инъецированы в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, вводимых в ходе хирургических операций. Внутриглазные инъекции кНАБЕСР можно также применять для снижения внутриглазного давления при глаукоме, для растворения в стекловидном теле агрегатов (или «скитальцев», «Доа1сгк»), для очистки стекловидного тела от кровоподтёков, для лечения (рассасывания) пятен на роговице, для помощи при отслойке сетчатки в случаях диабетической ретинопатии и для смешивания с другими ферментами с це- 6 009383 лью корректировки формы роговицы для улучшения её облегания корректирующими линзами. Следует учитывать, что в некоторых случаях может быть желательно применение кНАЗЕСР длительного действия, такого как модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ), «ПЭГилированного» кНАЗЕСР.
Можно предвидеть также совместные композиции кНАЗЕСР с другими веществами для пригодных к инъекции доз, предназначенных для введения малого объёма или для быстрого подкожного введения. Для примера в композиции Ер1реп® могут быть объединены инсулин и другие жидкости. Способы данного изобретения включают введение полипептида кНАЗЕСР или фармацевтических композиций, содержащих кНАЗЕСР, до, одновременно или после введения других терапевтических молекул. Можно ввести кНАЗЕСР в месте, отличном от места введения терапевтической молекулы, или же кНАЗЕСР может быть введён в том же самом месте, что и терапевтическая молекула.
Итак, в настоящей работе предусматривается семейство секретируемых эукариотами активных в нейтральных условиях гиалуронидазных гликопротеинов, обозначенных кНАЗЕСР, и их функциональных доменов, особенно их гиалуронидазных (или каталитических) доменов, мутеинов и других их производных и аналогов. Предусматриваются здесь также нуклеиновые кислоты, кодирующие кНАЗЕСР. Дополнительно предусматриваются композиции и способы терапевтического применения указанных кНАЗЕСР для лечения заболеваний и для использования в качестве ферментов, модифицирующих ткани.
Краткое описание графических материалов
На чертеже фигуры представлена карта вектора ΗΖ24 для кНАЗЕСР.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
А. Определения
Если не определено иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как обычно понимается специалистами в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и печатные публикации, последовательности банка данных СепЬапк, вебсайты и другие опубликованные материалы, на которые производятся ссылки на протяжении всего этого описания, если это не определено иным образом, включены в настоящую работу ссылкой во всей их полноте. В том случае, когда для используемых здесь терминов существует несколько определений, предпочтение отдаётся определениям, приводимым в этом разделе.
Если сделана ссылка на ЦКЕ или иной подобный идентификатор или адрес, понятно, что такие идентификаторы могут меняться и что конкретная информация в Интернете может появляться и исчезать, однако поиском в Интернете может быть найдена эквивалентная информация. Ссылка на это свидетельствует о доступности и открытом распространении такой информации.
Сокращения для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, как они использованы в настоящей работе, находятся, если не указано иное, в согласии с их общепринятым использованием, легко поддающимися расшифровке сокращениями или рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре ШРАС-ШВ (см. ВюсЬет. 1972, ν. 11, р. 942-944).
Термин «гиалуронидаза эукариот», как он использован в настоящей работе, относится к семейству разнообразных гликозаминогликан-эндоглюкозаминидаз, причём остаток глутамата в гиалуронидазе гидролизует бета-1,4 связи в гиалуронане и хондроитин-сульфатах по кислотно-щелочному механизму катализа.
Особый интерес представляют кНАЗЕСР, происходящие из млекопитающих, включая человека. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, одиночные аминокислотные замены в существенно неважных частях полипептида не влияют заметным образом на биологическую активность (см., например, \Уа1коп е1 а1. //«Мо1еси1аг Вю1оду о£ 111е Сепе». 4-е изд. Тйе Вещатш/Ситттдк РиЬ. Со. 1987, р. 224).
Термин «заякоренный в мембране НАЗЕСР», как он использован в настоящей работе, относится к семейству заякоренных в мембране гиалуронидаз, имеющих общие структурные особенности, как описано в настоящей работе.
Термин «растворимая гиалуронидаза», как он использован в настоящей работе, относится к полипептиду, для которого характерна растворимость при физиологических условиях. Растворимый НАЗЕСР можно отличить, например, по его переходу в водную фазу раствора тритона Х-114, нагретого до 37°С (ВогФег е1 а1. //1.Вю1.Сйет. 1981, ν. 256, № 4, р. 1604-1607). С другой стороны, заякоренный в липиде НАЗЕСР будет переходить в богатую детергентом фазу, но будет переходить в обеднённую детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой С.
Таким образом, ссылка, например, на «кНАЗЕСР» охватывает все гликопротеины, кодируемые семейством генов кНАЗЕСР, включая (но не ограничиваясь ими) кНАЗЕСР человека, кНАЗЕСР мыши, или эквивалентную молекулу, полученную из любого другого источника, или молекулу, приготовленную синтетически, или молекулу, обладающую такой же активностью. Последовательности кодирующих молекул нуклеиновой кислоты и кодируемые аминокислотные последовательности приводимых для примера кНАЗЕСР и/или их доменов, приведены далее, например, в последовательности ЗЕО Ш N0: 4. Этот термин охватывает также кНАЗЕСР с аминокислотными заменами, которые не меняют существенно активность каждого представителя, и охватывают также их варианты, полученные сплайсингом. Подходя
- 7 009383 щие замещения, включающие, но не обязательно, консервативные замещения аминокислот, известны специалистам в данной области и могут быть сделаны без утраты биологической активности, такой как каталитическая активность, получаемой молекулы.
Термин «κΗΑδΕΟΡ», как он использован в настоящей работе, при всякой ссылке на него, включает по меньшей мере один или все, или любую комбинацию из следующих:
полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, приведённую далее как последовательность 8ΕΟ ΙΌ N0: 6, или последовательностью нуклеотидов, включающей нуклеотиды, которые кодируют аминокислоты 1-509 в последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 1;
полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, которая гибридизируется при условиях низкой, умеренной или высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведённой далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 6;
полипептид, который включает последовательность аминокислот, приведённую далее как аминокислоты 1-509 в последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 1;
полипептид, который включает последовательность аминокислот, имеющую степень идентичности по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с последовательностью аминокислот, приведённой далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 1 или как аминокислоты 1-448 в последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 4.
В частности, предусматривается полипептид κΗΑδΕΟΡ с гиалуронидазными доменами, как указано в последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 4. Полипептид представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный полипептид. Предусматриваются также его меньшие части, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Гиалуронидазные домены из κΗΑδΕΟΡ различаются по размеру и составу, в том числе имеют вставки и делеции в поверхностных петлях. Таким образом, для указанных здесь целей каталитический домен представляет собой часть κΗΑδΕΟΡ, как определено в настоящей работе, и гомологичен домену других гиалуронидазоподобных последовательностей, таких как ΗΥΑΕ1, ΗΥΑΕ2, ΗΥΑΕ3, которые были идентифицированы ранее. Ранее, однако, не было отмечено, что изолированная одноцепочечная форма гиалуронидазного домена человека может функционировать в испытаниях ίη νίΐτο. В консервативных лейтмотивах присутствуют остатки аспартата и глутамата, необходимые для активности.
Термин «нейтральный гиалуронидазный домен растворимого κΗΑδΕΟΡ» относится к бета-1,4-эндоглюкозаминидазному домену κΗΑδΕΟΡ, который проявляет гиалуронидазную активность при нейтральном рН, растворим при описанных условиях и имеет одинаковые гомологию и структурные особенности с доменами гиалуронидазного семейства гликозил-гидролаз, но содержит дополнительные последовательности в карбоксильном конце, необходимые для активности в нейтральных условиях. Следовательно, он представляет собой по меньшей мере минимальную часть домена, которая проявляет гиалуронидазную активность при испытаниях стандартными методами анализа ίη νίΐτο, и остаётся растворимым. В настоящей работе рассматриваются такие гиалуронидазные домены и их каталитически активные части. Предусматриваются также усечённые формы гиалуронидазного домена, включающие его наименьший фрагмент, действующий каталитически в виде одноцепочечной формы.
Гиалуронидазный домен κΗΑδΕΟΡ во всех случаях, когда на него сделана ссылка, включает по меньшей мере один, или все, или любую комбинацию, или каталитически активную часть из следующего:
гликопротеиновый полипептид с ^связью, который включает последовательность аминокислот, приведённую далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 1;
полипептид, кодируемый последовательностью нуклеотидов, которая гибридизируется при условиях низкой, умеренной или высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведённой далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 6;
полипептид, который включает последовательность аминокислот, приведённую далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 1;
полипептид, который включает последовательность аминокислот, имеющую степень идентичности по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с последовательностью аминокислот, приведённой далее как последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 1; и/или гиалуронидазный домен полипептида, кодируемого полученным сплайсингом вариантом κΗΑδΕΟΡ.
Таким образом, для указанных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен представляет собой часть κΗΑδΕΟΡ, как он определён в настоящей работе, и гомологичен домену других κΗΑδΕΟΡ. Так же, как и для более обширного класса ферментов гиалуронидазного семейства, каталитические домены κΗΑδΕΟΡ имеют высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей. В консервативных лейтмотивах присутствуют остатки Акр и С1и. необходимые для активности.
Под активной формой подразумевается форма, активная ίη νίνο и/или ίη νίΐτο. Как описано в настоящей работе, гиалуронидазный домен может также существовать как растворимый секретируемый гликопротеин. В настоящей работе показано, что, по меньшей мере, ίη νίΐτο одноцепочечные формы κΗΑδΕΟΡ и его каталитические домены или ферментативно активные части (как правило, С-концевые усечения) обладают гиалуронидазной активностью. Поэтому в настоящей работе предлагаются изолированные формы гиалуронидазных доменов κΗΑδΕΟΡ и способы их применения в анализах на скрининг
- 8 009383 лекарств ίη νίΐτο для идентификации агентов, модулирующих их активность.
Термин «каталитически активный домен кНАЗЕСР», как он использован в настоящей работе, относится к активному в нейтральных условиях эндоглюкозаминидазному домену, как это определено по активности ίη νίΐτο ηο отношению к гликозаминогликановому субстрату.
Представляющие интерес кНАЗЕСР включают такие кНАЗЕСР, которые активны по отношению к хондроитин-сульфатам и хондроитин-сульфат-протеогликанам (СЗРСк) ίη νΐνο и ίη νίΐτο; и такие, которые активны по отношению к гиалуронану. Термин «кНАЗЕСР человека» представляет собой кНАЗЕСР, кодируемый нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, присутствующей в геноме человека, включая все аллельные варианты и консервативные вариации, если только они не являются вариантами, обнаруживаемыми у других млекопитающих.
Термин «нуклеиновая кислота, кодирующая гиалуронидазный домен или каталитически активную часть кНАЗЕСР», как он использован в настоящей работе, следует понимать как относящийся к нуклеиновой кислоте, кодирующей лишь перечисленные одноцепочечный гиалуронидазный домен или его активную часть, но не другие смежные части кНАЗЕСР как непрерывную последовательность.
Термины «заболевание» или «расстройство», как они использованы в настоящей работе, относятся к патологическому состоянию организма, являющемуся результатом, например, инфекции или генетического дефекта, и характеризуемому годными для идентификации симптомами.
Термин «сплайсинговый вариант» или «полученный сплайсингом вариант», как он использован в настоящей работе, относится к варианту, полученному характерной обработкой (процессингом) исходного транскрипта геномной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, приводящей к получению более чем одного типа мРНК. В настоящей работе предусматриваются сплайсинговые варианты кНАЗЕСР.
Термин «гиалуронидазный домен белка кНАЗЕСР», как он использован в настоящей работе, относится к гиалуронидазному домену кНАЗЕСР, обладающему эндоглюкозаминидазной активностью в нейтральных условиях. Следовательно, он представляет собой, по меньшей мере, минимальную часть белка, которая проявляет эндоглюкозаминидазную активность при испытаниях стандартными способами анализа ίη νίΐτο. Приводимые для примера гиалуронидазные домены человека включают для проявления эндоглюкозпаминидазной активности, по меньшей мере, достаточную часть последовательностей аминокислот, приведённых далее как последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 4.
Рассматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, имеющийт эндоглюкозаминидазную активность при анализе активности гиалуронидазы ίη νίΐτο и степень идентичности последовательности по меньшей мере 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с гиалуронидазным доменом полной длины полипептида кНАЗЕСР, или которые гибридизируются по всей своей длине или по меньшей мере 70, 80 или 90% от полной длины с нуклеиновыми кислотами, кодирующими гиалуронидазный домен, в особенности при условиях умеренной, обычно высокой, степени строгости.
Для гиалуронидазных доменов остатки в Ν-концевой части могут быть крайне важными, но недостаточными для активности. В настоящей работе показано, что гиалуронидазный домен кНАЗЕСР каталитически активен. Следовательно, для активности гиалуронидазного домена нужны, как правило, его Νконцевые аминокислоты; С-концевая часть может быть усечена вплоть до последнего остатка цистеина, но домену для оптимальной активности нужны дополнительные аминокислоты. Количество аминокислот, которые могут быть удалены, можно определить эмпирически тестированием гиалуронидазной активности полипептида анализом ίη νίΐτο, который определяет степень каталитического расщепления.
Поэтому рассматриваются меньшие части гиалуронидазных доменов, в частности их одноцепочечные домены, сохраняющие гиалуронидазную активность. Такие уменьшенные версии представляют собой, как правило, усечённые на С-конце версии гиалуронидазных доменов. Гиалуронидазные домены различаются по размеру и составу, в том числе имеют вставки и делеции в поверхностных петлях. Такие домены проявляют консервативные особенности структуры, включая по меньшей мере одну структурную особенность, такую как донор протона, и/или другие особенности гиалуронидазных доменов эндоглюкозаминидаз. Так, для обозначенных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен представляет собой одноцепочечную часть кНАЗЕСР, как он определён в настоящей работе, но он гомологичен по своим структурным особенностям и по сохраняющимся последовательностям, определяющим подобие или гомологию гиалуронидазного домена, другим гиалуронидазо-подобным последовательностям. Гликопротеин проявляет гиалуронидазную активность как одиночная цепь.
Под гомологией, как этот термин используется в настоящей работе, подразумевается степень идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты большая, чем 25%, такая как 25, 40, 60, 70, 80, 90, или 95%. При необходимости процент гомологии может быть точно установлен. Термины «гомология» и «идентичность» часто используются как взаимозаменяемые. Как правило, последовательности выравнивают таким образом, что получается перекрывание наибольшего порядка (см., например: Сοтρиΐаΐ^οηа1 ΜοΙοοιιΕίΓ ВюМду. Под ред. Ьекк А.М. Охкгб ишуегкйу Ргекк, №\ν ΥογΡ 1988; Βίο^ιηριιΙίηβ: ΙηΓοπηηΙ1С8 алб Сесюще Ргокс1к. Под ред. 8тйй ЭЛУ. Асабет1с Ргекк, №\ν ΥοΛ, 1993; СотрШег Аш-букк οί 8есщенсе Оа1а, Рай 1. Под ред. СпГГш А.М. аиб СпГПп Н.С. Нитаоа Ргекк, №\ν 1егкеу, 1994; Зециенсе ΑηαΚκίκ ίη ΜοΕαιΕπ Вюкду. Под ред. νοη Нещ)е С. Асабетк Ргекк, 1987; Зесщеисе Аш-букк Рптег.
- 9 009383
Под ред. СпЬккоу М. апб Эсусгсих 1. М. ЗЮскЮп Ргезз, №\ν Уогк, 1991; СагШо е! а1. //81ат 1. Аррйеб МаШ. 1988, ν. 48, р. 1073).
При установлении идентичности последовательностей определяют число сохраняющихся (консервативных) аминокислот с помощью стандартных программ с алгоритмами выравнивания, которые используются с устанавливаемыми каждым поставщиком программ вычетами несовпадающих пробелов. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот гибридизируются, как правило, при условиях умеренной или высокой степени строгости по всей длине нуклеиновой кислоты или по длине, составляющей по меньшей мере примерно 70, 80 или 90% от полной длины представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Рассматриваются также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизирующейся молекуле нуклеиновой кислоты.
Можно определить, имеют ли две молекулы нуклеиновой кислоты нуклеотидные последовательности, которые «идентичны» по меньшей мере, например, на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99% с помощью известных компьютерных алгоритмов, таких как программа РА8ТА, использующая, например, параметры вычетов, как предложено Реагзоп е! а1. //Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 1988, ν. 85, р. 2444. Другие программы включают пакет программ ССС (Эеуегеих 1. е! а1. //Ыис1е1с Ас1бз Везеагсй. 1984, ν. 12, р. 387), ВЬА8ТР, ВЬА8ТЫ, РА8ТА (АйсЬи1 8.Р. //1. Мо1ес. Бю1. 1990, ν. 215, р. 403; Сшбе !о Ниде СотрШегз. Под ред. МагИп 1. В18Йор. Асабетю Ргезз, 8ап П1едо, 1994; и СагШо е! а1. //81ат 1. Аррйеб МаШ. 1988, ν. 48, р. 1073). Например, для определения идентичности можно использовать функцию ВЬА8Т банка данных от №1юпа1 Сеп1ег Гог Бю1ес11по1оду ШГогшабоп. Другие коммерчески поставляемые или открытые программы включают программу ΟΝΛ8ΤΛΡ МЕСАЫСЫ РВОСВАМ (Маб18ои, XVI) и программу Сар группы иптуегзйу оГ νίβ^^ω Сепебсз СотрШег Сгоир (υνΌ) (Маб18оп, VI). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновой кислоты можно определить, например, с помощью компьютерной программы САР (см., например, №еб1етап е! а1. //1. Мо1. Вю1. 1970, ν. 48, р. 443; ссылка в обзоре 8тй11 апб Vа!е^таи //Абу. Арр1. МаШ. 1981, ν. 2, р. 482). Вкратце, программа САР определяет степень подобия как число расположенных последовательно символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), являющихся одинаковыми, делённое на общее число символов в более короткой из двух последовательностей.
Параметры вычета для программы САР могут включать:
1) однокомпонентную (одномерную) матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и нормированную матрицу сравнения по СпЬ^кох е! а1. //№с1. Аабз. Вее. 1986, ν. 14, р. 6745, описанную в Абаз оГ Рго!еш 8ес.|иепсе апб 8!гис!иге. Под ред. 8с11\\'аг1х апб ОауйоГГ. №!юпа1 Вютебюа1 Везеагсй Роипбабоп, 1979, р. 353-358;
2) вычет 3,0 для каждого пробела и дополнительный вычет 0,10 для каждого символа в каждом пробеле;
3) отсутствие вычетов для концевых пробелов.
Следовательно, термин «идентичность», как он использован в настоящей работе, представляет сравнение между испытуемым и референсным полипептидами или полинуклеотидами.
Термин «не менее чем на 90% идентичен с», как он использован в настоящей работе, относится к проценту идентичности от 90 до 99,99% по отношению к референсным полипептидам. Идентичность на уровне 90% или более указывает на тот факт, предполагая для примера, что сравниваются испытуемый и референсный полипептиды длиной 100 аминокислот; при этом не более 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в испытуемом полипептиде отличаются от аминокислот в референсном полипептиде. Подобные же сравнения могут быть произведены между испытуемым и референсным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены точечными мутациями, случайным образом распределёнными по всей длине аминокислотной последовательности, или же они могут быть расположены блоками различной длины в одной или нескольких позициях, составляя максимально допустимую разницу в аминокислотах 10/100 (идентичность приблизительно 90%). Различия определены как замещения или делеции в последовательности нуклеиновой кислоты или в последовательности аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше, чем приблизительно 85-90% результат не должен зависеть от программы и установки параметров пробелов; такие высокие уровни идентичности могут быть легко обнаружены, часто без обращения к компьютерным программам.
Термин «праймер», как он использован в настоящей работе, относится к олигонуклеотиду, содержащему два или более дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида, обычно более трёх, которые могут инициировать синтез продукта удлинения праймера. Экспериментальные условия, благоприятные для синтеза, включают наличие нуклеозид-трифосфатов и агента для полимеризации и удлинения, такого как ДНК-полимераза, а также подходящие буфер, температуру и рН.
Упоминаемые в настоящей работе животные включают любых животных, таких как (но не ограничиваясь ими) козы, коровы, олени, овцы, грызуны, свиньи и люди. Животные, не являющиеся людьми (иои-йитаη аштак) не включают человека как рассматриваемое животное. Предусматриваемые в настоящей работе зНА8ЕСР происходят из любого источника: животного, растительного, прокариотического и грибкового. Большинство зНА8ЕСР происходят из животных, включая млекопитающих.
- 10 009383
Термин «генетическая терапия (генная терапия)», как он использован в настоящей работе, включает перенос гетерологичной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в определённые клетки, клетки-мишени из млекопитающего, особенно человека, имеющего расстройство или болезненное состояние, для которого подбирается такая терапия. Нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, вводят в выбранные клеткимишени таким способом, что гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, экспрессируется и в результате этого продуцируется кодируемый ею терапевтический продукт.
В качестве альтернативы гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может некоторым способом опосредовать экспрессию ДНК, кодирующей терапевтический продукт, или она может кодировать продукт, такой как пептид или РНК, который некоторым способом опосредует, прямо или косвенно, экспрессию терапевтического продукта. Генетическая терапия может быть также использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена, которая заменяет дефектный ген или дополняет продукт гена, продуцируемый животным или клеткой, в который она вводится. Вводимая нуклеиновая кислота может кодировать терапевтический продукт, такой как фактор роста или его ингибитор либо фактор некроза опухолей или его ингибитор, такой как его рецептор, который в норме не продуцируется в животном-хозяине или который не продуцируется в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически необходимое время. Гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, кодирующая терапевтический продукт, может быть модифицирована перед введением в клетки поражённого хозяина, чтобы усилить или иным образом изменить продукт или его экспрессию. Генетическая терапия может также включать доставку ингибитора или репрессора или иного модулятора экспрессии гена.
Термин «гетерологичная нуклеиновая кислота», как он использован в настоящей работе, обозначает нуклеиновую кислоту, которая кодирует РНК и белки, которые не продуцируются в нормальных условиях ίη νίνο клеткой, или которая опосредует или кодирует медиаторы, изменяющие экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, путём воздействия на транскрипцию, трансляцию или другие подвергающиеся регуляции биохимические процессы. Гетерологичной нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, может считаться также чужеродная нуклеиновая кислота, такая как ДНК. Любая нуклеиновая кислота, такая как ДНК, которую специалист в данной области может признавать или рассматривать как гетерологичную или чужеродную для клетки, в которой осуществляется экспрессия, входит здесь в понятие «гетерологичная нуклеиновая кислота»; гетерологичная нуклеиновая кислота включает добавляемую извне нуклеиновую кислоту, которая экспрессируется также и эндогенно. Примеры гетерологичной нуклеиновой кислоты включают (но не ограничиваются ими) нуклеиновую кислоту, которая кодирует прослеживаемые маркерные белки, такие как белок, привносящий лекарственную устойчивость, нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтически эффективные вещества, такие как противораковые агенты, ферменты и гормоны, и нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, которая кодирует другие типы белков, такие как антитела. Антитела, кодируемые гетерологичной нуклеиновой кислотой, могут секретироваться или экспрессироваться на поверхности клетки, в которую была введена гетерологичная нуклеиновая кислота.
Гетерологичная нуклеиновая кислота, как правило, не является эндогенной для клетки, в которую она вводится, но получена из другой клетки или приготовлена синтетически.
Как правило, хотя и не обязательно, такая нуклеиновая кислота кодирует РНК и белки, которые в нормальных условиях не продуцируются клеткой, в которой она экспрессируется.
Термин «терапевтически эффективный продукт», как он использован в настоящей работе, обозначает продукт, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой, как правило, ДНК, которая, будучи введена в хозяина, экспрессирует продукт, ослабляющий или сводящий на нет симптомы, проявления наследственного или приобретённого заболевания или излечивающий заболевание.
Используемое в настоящей работе утверждение, что гликопротеин состоит, по существу, из гиалуронидазного домена, означает, что единственная часть &НА8ЕСР полипептида представляет собой гиалуронидазный домен или его каталитически активную часть. Полипептид может по желанию включать, и, как правило, включает дополнительные, не входящие в &НА8ЕСР, последовательности аминокислот.
Термин «домен», как он использован в настоящей работе, относится к части молекулы, например, гликопротеина или кодирующей нуклеиновой кислоты, которая структурно и/или функционально отличается от других частей молекулы.
Термин «гиалуронидаза», как он использован в настоящей работе, относится к ферменту, катализирующему гидролиз гликозаминогликанов.
Для ясности ссылка на гиалуронидазу относится ко всем формам и конкретные формы будут специально обозначаться. Для изложенных в настоящей работе задач гиалуронидазный домен включает связанные с мембраной и растворимые формы белка кНАБЕСР.
Упоминаемые в настоящей работе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, включая пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть однонитевыми или двунитевыми. Когда упоминаются зонды или праймеры, по усмотрению несущие распознаваемую метку, такую как флуоресцентная или радиоактивная метка, рассматриваются однонитевые молекулы. Такие молекулы обычно имеют такую длину, что их мишень статистически уникальна или существует в малом числе копий (обычно менее 5, как правило, менее 3) для зондирования или амплификации опреде
- 11 009383 лённых последовательностей в библиотеке генов. Как правило, зонд или праймер содержат по меньшей мере 14, 16 или 30 смежных элементов последовательности, комплементарной или идентичной последовательности в рассматриваемом гене. Зонды и праймеры могут быть длиной 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов.
Термин «нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент или часть &ΗΆ8Ε6Ρ», как он использован в настоящей работе, относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей только упоминаемый фрагмент или упоминаемую часть 5ΗΆ8Ε6Ρ, но не другие части 5ΗΆ8Ε6Ρ.
Термин «функциональное (орегайуе) присоединение» гетерологичной нуклеиновой кислоты к регуляторным и эффекторным нуклеотидным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, сайты остановки транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности, относится к взаимоотношениям между такой нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, и такими последовательностями нуклеотидов. Например, функциональное присоединение гетерологичной ДНК к промотору относится к физической взаимосвязи между ДНК и промотором, в результате чего с промотора инициируется транскрипция такой ДНК РНК-полимеразой, которая специфически распознаёт, связывается и транскрибирует ДНК в рамке считывания. Поэтому выражения «функционально присоединённая» или «функционально ассоциированная» относится к функциональным взаимоотношениям нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы, энхансеры, сайты остановки транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности. Например, функциональное присоединение ДНК к промотору относится к физической и функциональной взаимосвязи между ДНК и промотором, в результате чего транскрипция такой ДНК инициируется с промотора РНК-полимеразой, которая специфически распознаёт, связывается и транскрибирует ДНК. Для того чтобы оптимизировать экспрессию и/или транскрипцию ίη νίίτο, может оказаться необходимым удалить, добавить или изменить 5'-нетранслируемые области (5' ИТВ) в клонах, чтобы удалить избыточные, потенциально неподходящие альтернативные кодоны инициации трансляции (т.е. стартовые кодоны) или иные последовательности, которые могут мешать экспрессии или снижать её на уровне либо транскрипции, либо трансляции. В качестве альтернативы непосредственно в 5'-положении относительно стартового кодона можно ввести консенсусные сайты связывания с рибосомой (см., например, Кохак //1. ΒίοΙ. Сйет. 1991, ν. 266, р. 19867-19870), которые могут усилить экспрессию. Желательность (или необходимость) такой модификации может быть установлена опытным путём.
Упоминаемая в настоящей работе последовательность, комплементарная по меньшей мере части РНК, с упоминанием антисмысловых олигонуклеотидов, означает последовательность, чья комплементарность достаточна, чтобы быть способной гибридизироваться с РНК, в основном при условиях умеренной или высокой степени строгости, образуя стабильный дуплекс; в случае двунитевых антисмысловых нуклеиновых кислот &ΗΆ8ΕΟΡ можно поэтому тестировать одну нить дуплекса РНК (или двунитевой РНК, άδΚ,ΝΛ). или же можно анализировать образование триплекса. Способность гибридизироваться зависит от степени комплементарности и длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем длиннее гибридизирующаяся нуклеиновая кислота, тем больше она может содержать нарушений комплементарного спаривания оснований (Ьаке 1Ш5та1с11е5) с кодируемой РНК δΗΆδΕΟΡ, но всё ещё может образовывать стабильный дуплекс (или, как в ряде случаев, триплекс). Специалист в данной области может установить допустимую степень неспаренности оснований с помощью стандартных процедур определения точки плавления гибридного комплекса.
Для обозначенных в настоящей работе задач в любом из &ΗΆ8ΕΟΡ и их гиалуронидазных доменов могут быть сделаны аминокислотные замены, при условии, что получаемый в итоге белок проявляет гиалуронидазную активность. Рассматриваемые аминокислотные замещения включают консервативные замещения, такие как представленные далее в табл. 1, которые не нарушают протеолитическую активность. Как описывается в настоящей работе, рассматриваются также замещения, которые изменяют свойства белков, такие как удаление сайтов расщепления и других подобных сайтов. Такие замещения, как правило, не являются консервативными, но они могут быть легко произведены специалистами в данной области.
Специалистам в данной области подходящие консервативные замещения аминокислот хорошо известны и могут быть произведены, как правило, без изменения у получаемой молекулы биологической активности, например ферментативной активности. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, одиночные аминокислотные замещения в несущественных участках полипептида, по существу, не меняют биологическую активность (см., например: \Уа150п е1 а1. Мо1еси1аг Βίοίοβν о£ 1йе Сепе, 4-е изд. Тйе Веп)ат1п/Ситттд8 БиЬ. Со., 1987, р. 224). В пределы этого определения включён также каталитически активный фрагмент &ΗΑ§ΕСΡ, в особенности одноцепочечная гиалуронидазная часть. Консервативные аминокислотные замещения выполнены, например, в соответствии с замещениями, представленными далее в табл. 1.
- 12 009383
Таблица 1 Исходный аминокислотный остаток - консервативное замещение
А1а (А) 61у; Зег, АЬи Агд (К) 1_уе, Огп Азп (Ν) ΟΙη; Ηίδ Суз (С) Зег С1п (О) Азп С1и (Е)
Азр 61у (6) А1а; Рго Ηίδ (Н) Азп; ΘΙη Не (I) Ьеи; Уа1; Ме!; Ы1е; Ича Ьеи (Ь); Уа1; Ме!; ЬИе;
Иуа Ьуз (К) Агд; ΘΙη; С1и Ме! (М) Ьеи; Туг; Не; ΝΙβ \/а1 Огп Ьуз; Агд РЬе (Р) Ме!; Ьеи;
Туг Зег (3) ТЬг ТЬг (Т) Зег Тгр (νν) Туг Туг (Υ) Тгр; РЬе Уа1 (V) Не; Ьеи; Ме(; ΝΙβ; Νν3.
Допустимы также другие замещения, которые могут быть определены эмпирически или установлены по соответствию с известными консервативными замещениями.
Использованная в настоящей работе аббревиатура АЬи обозначает 2-аминомасляную кислоту (2-атшоЬи!уг1с асИ); Огп - это орнитин. Указанные в настоящей работе аминокислоты, которые появляются в различных приводимых аминокислотных последовательностях, идентифицированы в соответствии с их хорошо известными трёхбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды, появляющиеся в различных фрагментах ДНК, даны в стандартных однобуквенных обозначениях, постоянно используемых в данной области.
Приводимые в настоящей работе зонды или праймеры, основанные на раскрываемых в настоящей работе нуклеотидных последовательностях, содержат последовательности по меньшей мере из 10, 14, обычно по меньшей мере из 16 соприкасающихся нуклеотидов последовательности 8ЕО Ш N0: 6, а зонды - по меньшей мере из 30, 50 или 100 соприкасающихся нуклеотидов последовательности 8ЕО Ш N0: 6. Длина зонда или праймера, обеспечивающая уникальную гибридизацию, является функцией сложности представляющего интерес генома.
Упоминаемое в настоящей работе ослабление симптомов конкретного расстройства введением конкретной фармацевтической композиции относится к любому уменьшению: постоянному или временному, длящемуся или преходящему, которое может быть приписано введению или связано с введением композиции.
Термин «антисмысловые полинуклеотиды», как он использован в настоящей работе, относится к синтетическим последовательностям нуклеотидных гетероциклических оснований, комплементарным мРНК или смысловой нити двунитевой ДНК. Смесь смысловых и антисмысловых полинуклеотидов при подходящих условиях приводит к связыванию двух молекул, или гибридизации. Если эти полинуклеотиды связываются (гибридизируются) с мРНК, происходит ингибирование синтеза белка (трансляции). Если эти полинуклеотиды связываются с двунитевой ДНК, происходит ингибирование синтеза РНК (транскрипции).
Получаемое в результате ингибирование трансляции и/или транскрипции ведёт к ингибированию синтеза белка, кодируемого смысловой нитью. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты обычно содержит достаточное число нуклеотидов, чтобы специфически связаться с целевой нуклеиновой кислотой; обычно это по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, часто по меньшей мере 14 или 16, или 30 смежных нуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, комплементарных кодирующей части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует целевой ген, например нуклеиновой кислоты, которая кодирует одноцепочечный гиалуронидазный домен &НА8ЕОР.
Термин «сетка, матрица (аггау)», как он использован в настоящей работе, относится к набору элементов, таких как антитела, содержащему три или более элемента. Матица с адресованием - это такая матрица, в которой элементы могут быть идентифицированы, обычно по положению на твердофазной подложке. Поэтому элементы матрицы, как правило, иммобилизованы на дискретных доступных для идентификации участках на поверхности твёрдой фазы.
Термин «антитело», как он использован в настоящей работе, относится к иммуноглобулину, либо природному, либо полученному частично или полностью синтетическим путём, включая любое его производное, которое сохраняет специфическую способность антитела к связыванию. Поэтому антитело включает любой белок, имеющий домен связывания, гомологичный или существенно гомологичный домену связывания иммуноглобулина. Антитела включают представителей любых иммуноглобулиновых семейств, в том числе 1дС. 1дМ, 1дА, 1дИ и 1дЕ.
Термин «фрагмент антитела», как он использован в настоящей работе, относится к любому производному антитела, которое меньше его полной длины, сохраняющему по меньшей мере часть специфической способности к связыванию антитела полной длины. Примеры фрагментов антитела включают (но не ограничиваются ими) фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2, одноцепочечный Ενκ (ксЕУ), Εν, двойное антитело (ФаЬобу) άκΕν и фрагменты Εά. Фрагмент может включать несколько цепей, соединённых вместе, например, дисульфидными мостиками. Фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере около 50 аминокислот и обычно по меньшей мере 200 аминокислот.
Упоминаемый в настоящей работе фрагмент антитела Εν состоит из одного варьируемого тяжёлого домена (УН) и одного варьируемого лёгкого домена, соединённых нековалентными взаимодействиями.
Упоминаемый в настоящей работе ά&Εν относится к Εν со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью.
- 13 009383
Упоминаемый в настоящей работе фрагмент Е(аЬ)2 - это фрагмент антитела, полученный в результате расщепления иммуноглобулина пепсином при рН 4,0-4,5; он может быть экспрессирован с помощью генно-инженерных способов, чтобы получить эквивалентный фрагмент.
Упоминаемые в настоящей работе фрагменты ЕаЬ - это фрагменты антитела, получаемые путём расщепления иммуноглобулина папаином; они могут быть экспрессированы с помощью генноинженерных способов, чтобы получить эквивалентный фрагмент.
Используемое в настоящей работе обозначение 5сРу относится к фрагментам антитела, содержащим варьируемую лёгкую цепь V и варьируемую тяжёлую цепь (УН), ковалентно соединённые полипептидным мостиком в любой последовательности. Мостик имеет такую длину, чтобы два варьируемых домена были соединены, не мешая друг другу. Мостики включают последовательности η остатков (С1у-8ет) с некоторым количеством распределённых среди них остатков С1и или Ьук для повышения растворимости.
Термин «очеловеченные антитела» («йиташхеб апйЬоФек»), как он использован в настоящей работе, относится к антителам, которые модифицированы включением свойственных человеку последовательностей аминокислот, так что их введение человеку не провоцирует иммунного ответа. Способы приготовления таких антител известны. Например, чтобы получить такие антитела, гибридому или другую прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетку Е. со11 или СНО, которая экспрессирует моноклональные антитела, изменяют с помощью техники рекомбинантной ДНК таким образом, чтобы она экспрессировала антитела, в которых аминокислотный состав неварьируемой части основан на составе антител человека. Для идентификации таких участков были разработаны компьютерные программы.
Упоминаемые в настоящей работе двойные антитела (ЛаЬоЛек) - это димерные §сЕу; двойные антитела обычно имеют более короткие пептидные мостики, чем 5сЕу. и они, как правило, димеризуются.
Термин «продукция рекомбинантным способом», как он использован в настоящей работе, значит «с помощью методов рекомбинантной ДНК», что означает применение хорошо известных методов молекулярной биологии для экспрессирования белков, кодируемых клонированной ДНК.
Подразумевается, что термин «определение» (аккекДпд) включает качественное и количественное определение в смысле получения абсолютной величины для активности &НЛ8ЕСР или его домена, присутствующего в образце, а также получения показателя, соотношения, процентной доли, визуальной или другой величины, указывающей на уровень активности. Определение может быть прямым или косвенным, и реально обнаруживаемое химическое вещество, конечно, не должно быть обязательно самим продуктом протеолиза, но может быть, например, его производным или некоторым дальнейшим веществом.
Термин «биологическая активность» как он использован в настоящей работе, относится к активностям соединения ίη νίνο или к физиологическим проявлениям, являющимся следствием введения ίη νίνο соединения, композиции или иной смеси. Таким образом, биологическая активность касается терапевтических воздействий и фармацевтической активности таких соединений, композиций и смесей. Виды биологической активности могут быть наблюдаемы в системах ίη νίΐτο, разработанных для тестирования или использования таких видов активности. Так, для очерченных в настоящей работе задач биологической активностью люциферазы является её оксигеназная активность, вследствие которой при окислении субстрата испускается свет.
Термин «функциональная активность», как он используется в настоящей работе, относится к полипептиду или его части, которые проявляют одну или более активностей, присущих белку полной длины.
Типы функциональной активности включают (но не ограничиваются ими) биологическую активность, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связываться с антиполипептидным антителом или конкурировать с полипептидом за связывание с антиполипептидным антителом), иммуногенность, способность образовывать мультимеры, способность специфически связываться с рецептором или лигандом для полипептида.
Термин «конъюгат», как он использован в настоящей работе, относится к предусматриваемым в настоящей работе соединениям, которые включают один или более из &НЛ8ЕСР, включая &НЛ8ЕСР, в частности и его одноцепочечные гиалуронидазные домены, и один или более из нацеливающих агентов. Эти конъюгаты включают конъюгаты, продуцируемые рекомбинантными способами в виде слитых белков, получаемые химическими способами, такими как химическое сшивание путём, например, сшивания с сульфгидрильными группами, и получаемые любым другим способом, причём по меньшей мере один 5НЛ8ЕСР или его домен соединён, непосредственно или через мостик(и), с нацеливающим агентом.
Термин «нацеливающий агент (ΐ3Γ§οΐΐη§ адеШ)». как он использован в настоящей работе, представляет собой любой фрагмент, такой как белок или его эффективная часть, который обеспечивает специфическое связывание конъюгата с рецептором клеточной поверхности, который может интернализовать (переносить в клетку) конъюгат или его &НЛ8ЕСР-часть. Нацеливающий агент может быть также таким агентом, который содействует или усиливает, например, аффинное выделение или очистку конъюгата, прикрепление конъюгата к поверхности или обнаружение конъюгата или комплексов, содержащих конъюгат.
- 14 009383
Упоминаемый в настоящей работе термин «конъюгат с антителом» относится к конъюгату, в котором нацеливающим агентом является антитело.
Термины «производное» или «аналог» молекулы, как они используются в настоящей работе, относятся к полученной из молекулы её части или к модифицированной версии молекулы.
Термин «эффективное количество соединения» для лечения конкретного заболевания, как он использован в настоящей работе, - это количество, достаточное, чтобы ослабить или некоторым образом уменьшить симптомы, связанные с заболеванием. Такое количество может быть введено в виде разовой дозы или может вводиться курсом, в зависимости от того, в каком случае оно эффективно. Это количество может излечивать заболевание, но обычно оно вводится, чтобы ослабить симптомы заболевания. Для достижения необходимой степени ослабления симптомов может потребоваться повторное введение.
Термин «эквивалентный», как он использован в настоящей работе, если он относится к двум последовательностям нуклеиновых кислот, означает, что рассматриваемые последовательности кодируют одну и ту же последовательность аминокислот или эквивалентные белки. Если понятие «эквивалентный» используется в отношении двух белков или пептидов, это означает, что два белка или пептида имеют, по существу, одну и ту же аминокислотную последовательность только с такими аминокислотными замещениями (такими, но не ограничиваясь ими, как консервативные замещения, такие как приведённые выше в табл. 1), которые не меняют существенно активность или функцию белка или пептида. Если «эквивалентный» относится к свойству, это свойство не обязательно должно присутствовать в той же самой степени (например, два пептида могут проявлять разные скорости в одном и том же типе ферментативной активности), но активности обычно, по существу, одни и те же. «Комплементарный», если это относится к двум нуклеотидным последовательностям, означает, что две последовательности нуклеотидов способны гибридизироваться, обычно с содержанием нарушений спаривания между противолежащими нуклеотидами менее 25, 15, 5 или 0%. При необходимости процент комплементарности может быть точно определён. Обычно две молекулы выбирают таким образом, что они будут гибридизироваться в условиях высокой степени строгости.
Упоминаемый в настоящей работе агент, модулирующий активность белка или экспрессию гена или нуклеиновой кислоты, либо снижает, либо повышает, либо иным образом изменяет активность белка или же некоторым образом регулирует её с повышением или с понижением, или иным образом изменяет экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке.
Термин «ингибитор активности &НА8ЕОР», как он использован в настоящей работе, охватывает любое вещество, которое прекращает или снижает продукцию, посттрансляционную модификацию (модификации), созревание или мембранную локализацию &НЛ8ЕОР, или любое вещество, мешающее его протеолитической эффективности или снижающее его протеолитическую эффективность, в частности, его одноцепочечной формы в анализах на скрининг ίη νίίτο.
Термин «способ лечения или предотвращения опухолевого заболевания», как он использован в настоящей работе, означает, что любой из симптомов, таких как опухоль, её метастазы, васкуляризация опухолей или другие параметры, которыми характеризуется заболевание, уменьшаются, снижаются, предотвращаются, переводятся в состояние ремиссии или поддерживаются в состоянии ремиссии. Он также означает, что признаки опухолевого заболевания и метастазирования могут быть удалены, уменьшены или предотвращены лечением. Неограничивающие примеры признаков включают неконтролируемое разрушение базальной мембраны и проксимального внеклеточного матрикса, миграцию, деление и организацию клеток эндотелия в новые функционирующие капилляры и устойчивость таких функционирующих капилляров.
Термин «фармацевтически приемлемые соли, эфиры или иные производные конъюгатов», как он использован в настоящей работе, включает любые соли, эфиры или производные, которые могут быть легко приготовлены специалистами в данной области с использованием известных способов для такой обработки и получением в итоге соединений, которые могут быть введены животным или людям без существенных токсических воздействий и которые являются фармацевтически активными или представляют собой предшественники лекарств.
Термин «пролекарство» («предшественник лекарства», ргойгид), как он использован в настоящей работе, - это соединение, которое при введении ίη νίνο подвергается метаболизму или иным образом превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически активную форму соединения. Для того чтобы получить пролекарство, фармацевтически активное соединение модифицируют таким образом, что активный компонент регенерируется в ходе метаболических процессов. Пролекарство может быть предназначено для изменения метаболической стабильности или транспортных характеристик лекарства, чтобы препятствовать побочным эффектам или токсичности, чтобы улучшить вкус лекарства или изменить другие характеристики или свойства лекарства. На основании знания фармакодинамических процессов и метаболизма лекарства ίη νίνο, специалисты в данной области могут (если известно фармацевтически активное соединение) сконструировать предшественники этого соединения (см., например: Νοβπιάν //Мейюша1 СйетМгу. А Вюсйетюа1 Арргоасй. ОхГогй Ипщегайу Ргс55. Νον Уогк, 1985, р. 388-392).
- 15 009383
Термин «лекарство, идентифицированное предусматриваемыми в настоящей работе способами скрининга», как он использован в настоящей работе, относится к любому соединению, которое является кандидатом для применения в качестве терапевтического или преимущественного соединения (1еаб сотроипб) для создания терапевтического соединения. Такими веществами могут быть небольшие молекулы, в том числе небольшие органические молекулы, пептиды, пептидоимитаторы, антисмысловые молекулы или двунитевые РНК (άδΚ,ΝΛ). такие как Κ,ΝΛί. антитела, фрагменты антител, рекомбинантные антитела и другие соединения, которые могут быть кандидатами в лекарства или преимущественными соединениями.
Термин «пептидоимитатор», как он использован в настоящей работе, обозначает соединение, которое имитирует конформацию и определённые стереохимические особенности биологически активной формы конкретного пептида. Как правило, пептидоимитаторы конструируют, чтобы имитировать определённые желательные свойства соединения, но не повторять нежелательные свойства, такие как гибкость, которая приводит к утрате биологически активной конформации и разрыву связей. Пептидоимитаторы могут быть приготовлены из биологически активных соединений путём замещения биоизостерами определённых групп или связей, которые дают вклад в нежелательные свойства. Биоизостеры (т.е. вещества, имеющие подобную пространственную, стерическую конфигурацию) известны специалистам в данной области. Например, метиленовый биоизостер СН28 был использован как амидный заместитель в аналогах энкефалина (см., например, 8раЮ1а //СБетЕРу апб ВюсБетШгу о£ Атто Аабк, РерБбек, апб РгоЮтк. Под ред. ^е181ет, ν. 7. Магсе1 Эеккег, №\ν Уогк, 1983). Морфин, который можно вводить перорально, является пептидоимитатором пептида эндорфина. Для определённых в настоящей работе задач среди пептидоимитаторов включены циклические пептиды.
Термины «промоторная область» или «промоторный элемент», как они использованы в настоящей работе, относятся к сегменту ДНК или РНК, контролирующему транскрипцию ДНК или РНК, к которым он функционально присоединён. Промоторная область включает специфические последовательности, достаточные для распознавания РНК-полимеразой, её связывания и инициации транскрипции.
Эта часть промоторной области называется промотором. Кроме того, промоторная область включает последовательности, модулирующие эту активность РНК-полимеразы в распознавании, связывании и инициации транскрипции. Эти последовательности могут быть действующими в цис-положении или могут участвовать в действии трансфункционирующих факторов. Промоторы, в зависимости от природы регуляции, могут быть конститутивными или регулируемыми. Рассматриваемые для примера промоторы для использования в прокариотах включают промоторы бактериофагов Т7 и Т3.
Термин «рецептор», как он использован в настоящей работе, относится к молекуле, которая имеет сродство (аффинность) к данному лиганду. Рецепторы могут быть существующими в природе или синтетическими молекулами. В данной области рецепторы могут быть также названы антилигандами. Термины «рецептор» и «антилиганд», как они использованы в настоящей работе, являются взаимозаменяемыми. Рецепторы могут использоваться в их неизменённом состоянии или как агрегаты с другими видами. Рецепторы могут быть прикреплены, ковалентно или нековалентно, к связывающему участнику или могут находиться с ним в физическом контакте; это может осуществляться прямо или косвенно - через посредство специфического связывающего вещества или мостика («линкера»). Примеры рецепторов включают (но не ограничиваются ими): антитела, рецепторы клеточной мембраны (рецепторы поверхности и интернализующие рецепторы), моноклональные антитела и антисыворотки, реагирующие со специфическими антигенными детерминантами, такими как находящиеся на вирусах, клетках или других материалах), лекарства, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, факторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и органеллы.
Примеры рецепторов и применений с использованием таких рецепторов включают (но не ограничиваются ими:
a) ферменты: специфические транспортные белки или ферменты, необходимые для выживания микроорганизмов, которые могут служить мишенями для отбора антибиотиков (лигандов);
b) антитела: может быть исследована идентификация лиганд-связывающего сайта на молекуле антитела, которая соединяется с эпитопом представляющего интерес антигена; определение последовательности, имитирующей антигенный эпитоп может привести к разработке вакцин, иммуноген которой основывается на одной или более из таких последовательностей; или привести к разработке связанных с этим диагностических агентов или соединений, полезных в терапевтическом воздействии на такие заболевания, как аутоиммунные заболевания;
c) нуклеиновые кислоты: идентификация сайтов связывания лиганда, такого как белок или РНК;
б) каталитические полипептиды: полимеры, в том числе полипептиды, которые способны запускать химическую реакцию, включая конверсию одного или более реагентов в один или более продуктов; такие полипептиды, как правило, включают сайт связывания, специфичный для по меньшей мере одного реагента или промежуточного соединения в реакции, и функционально активный участок, следующий непосредственно за сайтом связывания, в которых функционально активный участок способен химически модифицировать связанный реагент (см., например, патент США № 5215899);
- 16 009383
е) рецепторы гормонов: определение лигандов, связывающихся с высокой степенью сродства с рецептором полезно для разработки терапии с замещением гормонов; например, идентификация лигандов, связывающихся с такими рецепторами, может приводить к разработке лекарств для контроля кровяного давления;
ί) рецепторы наркотиков (опиатные рецепторы): установление лигандов, связывающихся с рецепторами наркотиков в мозгу, полезно для разработки заместителей морфина и других родственных лекарств, дающих меньшее привыкание.
Термин «образец», как он использован в настоящей работе, относится ко всему, что содержит подлежащий анализу объект, для которого необходим анализ. Образцом может быть биологический образец, такой как биологическая жидкость или биологическая ткань. Примеры биологических жидкостей включают мочу, кровь, плазму, сыворотку, слюну, семенную жидкость, испражнения, мокроту, спинномозговую жидкость, слёзы, слизь, сперму, околоплодные воды или подобные им. Биологическими тканями являются агрегаты клеток, обычно определённого типа, вместе с их внеклеточным веществом, которые формируют один из структурных материалов структуры человека, животного, растения, бактерии, грибка или вируса, включая соединительные, эпителиальные, мышечные и нервные ткани. Примеры биологических тканей включают также органы, опухоли, лимфатические узлы, артерии и индивидуальные клетки.
Термин «строгость условий гибридизации» при определении процентного содержания неспаренностей оснований, как он использован в настоящей работе, состоит в следующем:
1) Высокая степень строгости: 0,1хББРЕ (ББРЕ - 0,18 М №1С1 в фосфатном буфере, рН 7,4), 0,1% БОБ (додецилсульфат натрия), 65°С.
2) Средняя степень строгости: 0,2хББРЕ, 0,1% БОБ, 50°С.
3) Низкая степень строгости: 1,0хББРЕ, 0,1% БОБ, 50°С.
Специалистам в данной области известно, что этап промывки отбирает стабильные гибриды, и известны также ингредиенты ББРЕ (см., например, БатЬгоок, Егйкск Е.Е., ΜαηίαΙίδ Т.В. «Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаФгу Мапиа1». Со1й Бргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, 1989, ν. 3, р. В.13; см. также многочисленные каталоги, описывающие обычно используемые лабораторные растворы).
Далее, специалистам в данной области понятно, что стабильность гибридов определяется температурой плавления (Тт), которая является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Тт=81,5°С-16,6+0,41(% С+С)-600/Ь), так что единственными параметрами в условиях промывки, важными для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в ББРЕ (или ББС) и температура. ББС - «йапйагй ка1те-сйга1е кокШоп»: 0,15 М №С1+0,015 М №-цитрат. рН 7.
Понятно, что эквивалентные степени строгости могут быть получены при использовании альтернативных буферов, солей и температуры. Только с целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия низкой степени строгости (см. также БЫ1о апй ХУетЬегд //Ргос. №И. Асай. Бс1. ИБА. 1981, ν. 78, р. 6789-6792): содержащие ДНК фильтры предварительно обрабатывают в течение 6 ч при 40°С раствором, содержащим 35% формамид, 5хББС, 50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА (этилендиамин-тетраацетат), 0,1% ПВП (поливинилпирролидон), 0,1% фиколл, 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 500 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося. 10хББС представляет собой раствор 1,5 М хлорида натрия и 0,15 М цитрата натрия, рН которого доведён до 7.
Гибридизацию проводят в таком же растворе со следующей модификацией: 0,02% ПВП, 0,02% фиколл, 0,2% БСА, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 10% (масса к объёму) декстран-сульфат и (5-20)х106 имп./мин меченого 32Р-зонда. Фильтры инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 ч при 40°С и затем промывают в течение 1,5 ч при 55°С раствором, содержащим 2хББС, 25 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% БОБ. Промывной раствор заменяют свежим раствором и инкубируют в течение ещё 1,5 ч при 60°С. Фильтры просушивают фильтровальной бумагой и экспонируют с плёнкой для авторадиографии. При необходимости фильтры промывают третий раз при 65-68°С и повторно экспонируют с плёнкой. Другие условия для низкой степени строгости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (например, это условия, которые используют при межвидовой гибридизации ДНК).
С целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия умеренной (средней) степени строгости. Содержащие ДНК фильтры предварительно выдерживают в течение 6 ч при 55°С в растворе, содержащем 6хББС, 5храствор Денхардта, 0,5% БОБ и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизацию проводят в том же растворе, добавляя (5-20)х106 имп./мин меченого 32Р-зонда. Фильтры инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 ч при 55°С и затем промывают дважды в течение 30 мин при 60°С в растворе, содержащем 1хББС и 0,1% БОБ. Фильтры просушивают фильтровальной бумагой и экспонируют с плёнкой для авторадиографии. Другие условия умеренной степени строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области. Промывание фильтров может производиться при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2хББС и 0,1% БОБ.
- 17 009383
С целью примера, но не ограничения, могут быть приведены следующие процедуры, использующие условия высокой степени строгости. Предгибридизацию содержащих ДНК фильтров проводят в течение 8 ч в течение ночи (до следующего дня) при 65°С в буфере, состоящем из 6х88С, 50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02% фиколла, 0,02% бСа и 500 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося. Фильтры подвергают гибридизации в течение 48 ч при 65°С в предгибридизационной смеси, содержащей 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося и (5-20)х106 имп./мин меченого 32Р-зонда. Промывку фильтров проводят при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2х88С, 0,01% ПВП, 0,01% фиколл и 0,01% БСА. После этого проводится промывка в 0,1х88С при 50°С в течение 45 мин с последующей авторадиографией. Другие условия высокой степени строгости, которые можно использовать, хорошо известны в данной области.
Термины «по существу, идентичный» или «по существу, гомологичный» или подобные им, как понятно специалистам в данной области, варьируют в зависимости от контекста и обозначают, как правило, по меньшей мере 60 или 70%, предпочтительно по меньшей мере 80 или 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность.
Термин «по существу, идентичный продукту» означает «по существу, подобный» в том смысле, что представляющее интерес свойство в основном не изменено, вследствие чего, по существу, идентичный продукт может быть использован вместо основного продукта.
Термин «по существу, чистый», как он использован в настоящей работе, означает - настолько гомогенный, чтобы быть свободным от легко обнаруживаемых примесей, определяемых стандартными способами анализа, такими как тонкослойная хроматография (ТСХ), электрофорез в геле и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которые применяются специалистами в данной области для оценки такой чистоты, или настолько существенно чистый, что дальнейшая очистка не меняет заметным образом физических и химических свойств вещества, таких как ферментативная и биологическая активности. Методы очистки соединений с целью получения, по существу, химически чистых соединений известны специалистам в данной области. По существу, химически чистое соединение может быть, однако, смесью стереоизомеров или изомеров. В таких случаях дополнительная очистка может повысить специфическую активность соединения.
Термин «клетка-мишень», как он использован в настоящей работе, относится к клетке, которая экспрессирует кНА8Е6Р ΐπ νί\Ό.
Термин «испытуемое вещество» (или «испытуемое соединение»), как он использован в настоящей работе, относится к химически определённому соединению (например, к органическим молекулам, неорганическим молекулам, органическим/неорганическим молекулам, белкам, пептидам, нуклеиновым кислотам, олигонуклеотидам, липидам, полисахаридам, сахаридам или гибридам этих молекул, таким как гликопротеины и т.д.) или к смесям соединений (к примеру, библиотекам испытуемых соединений, природным экстрактам или культуральным жидкостям и т.д.), чьё действие на кНА8ЕСР, в частности на одноцепочечную форму, содержащую гиалуронидазный домен или достаточную для активности его часть, определяют т νίΙΐΌ таким способом, как предлагаемые в настоящей работе способы анализа.
Такие термины, как «терапевтический агент», «лечебная схема», «радиопротектор» или «хемотерапевтическое средство», как они использованы в настоящей работе, означают традиционные лекарства и способы лекарственного лечения, в том числе вакцины, которые известны специалистам в данной области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в данной области.
Термин «лечение», как он использован в настоящей работе, означает любой образ действий, при котором симптомы болезненного состояния, расстройства или заболевания ослабляются или иным образом благоприятно изменяются.
Лечение также охватывает любое фармацевтическое применение предлагаемых в настоящей работе композиций.
Термин «вектор» (или «плазмида»), как он использован в настоящей работе, относится к дискретным элементам, которые используются для введения в клетки гетерологичной нуклеиновой кислоты для неё экспрессии или репликации. Векторы, как правило, остаются эписомными, но они могут быть сконструированы так, чтобы достигалась интеграция гена или его части в хромосому генома. Рассматриваются также векторы, являющиеся искусственными хромосомами, такими, как дрожжевые искусственные хромосомы (УАС) и искусственные хромосомы млекопитающих (МАС). Селекция и использование таких переносчиков хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессирующий вектор включает векторы, способные экспрессировать ДНК, которая функционально соединена с регуляторными последовательностями, такими, как промоторные области, которые способны осуществлять экспрессию таких фрагментов ДНК. Таким образом, экспрессирующий вектор относится к конструкции с рекомбинантной ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или иной вектор, который при введении в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают такие векторы, которые способны реплицироваться в эукариотических клетках и/или в прокариотических клетках, и такие, которые остаются эписомными, или такие, которые интегрируются в геном клетки-хозяина.
- 18 009383
Термин «белковая последовательность связывания», как он использован в настоящей работе, относится к последовательности белка или пептида, которая способна специфически связываться с последовательностью другого белка или пептида вообще, с набором последовательностей белков или пептидов или же с конкретной последовательностью белка или пептида.
Термин «эпитопная метка» («ерйоре 1ад»), как он использован в настоящей работе, относится к короткой протяжённости аминокислотных остатков, соответствующих эпитопу, предназначенных для облегчения последующего биохимического и иммунологического анализа помеченного в эпитопе белка или пептида. Введение метки в эпитоп достигается путём вставки последовательности для эпитопной метки в кодирующую белок последовательность в соответствующем экспрессирующем векторе. Белки с метками в эпитопе можно подвергнуть аффинной очистке, используя высоко специфичные антитела, нацеленные на метки.
Термин «последовательность связывания с металлом», как он использован в настоящей работе, относится к последовательности белка или пептида, способной специфически связываться вообще с ионами металлов, с набором ионов металлов или с конкретным ионом металла.
Термин «комбинация», как он использован в настоящей работе, относится к любой ассоциации между двумя или более партнёрами.
Термин «композиция», как он использован в настоящей работе, относится к любой смеси. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста - водная или неводная или их любая комбинация.
Термин «жидкость», как он использован в настоящей работе, относится к любой композиции, которая способна течь. Поэтому жидкости охватывают такие композиции, которые находятся в форме полутвёрдых веществ, паст, растворов, водных смесей, гелей, лосьонов, кремов и других подобных композиций.
Термин «клеточный экстракт», как он использован в настоящей работе, относится к препарату или фракции, которые получены из лизированных или разрушенных клеток.
Если говорится, что «средство» (или «агент»), как этот термин используется в настоящей работе, выбрано случайным образом, это означает, что средство выбрано случайным образом без учета специфических последовательностей, участвующих в ассоциации белка самого по себе или с ассоциированными с ним субстратами, связывающимися партнёрами, и т.д. Примером случайным образом выбранных средств является использование химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки, или ростовой среды организма, или среды, отвечающей внешним условиям.
Если говорится, что средство выбрано или сконструировано рационально, это означает, что средство выбрано на неслучайной основе, которая принимает во внимание связь между последовательностью адресующего сайта и/или его конформацией и действием средства. Как описано в примерах, существуют предполагаемые сайты связывания для гиалуронидазного и (каталитического) сайтов в гликопротеине, имеющем последовательность ЗЕО Ш N0: 1 или последовательность ЗЕО Ш N0: 4. Средства могут быть рационально выбраны или рационально сконструированы путём использования пептидных последовательностей, которые образуют эти сайты. Например, рационально выбранным пептидным средством может быть пептид, чья аминокислотная последовательность идентична сайтам или доменам связывания АТР или кальмодулина.
Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, вне зависимости от того, является ли сахарид на редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с принятой номенклатурой, олигосахариды изображены в настоящей работе с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные в настоящей работе олигосахариды описаны с названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Са1), за которым следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), связь в кольце, положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в связи, и затем название или аббревиатура редуцирующего сахарида (например, С1сNАс). Связь между двумя сахарами может быть обозначена, например, как 2, 3, 2^.3 или (2, 3). Каждый сахарид является пиранозой.
Термин «Ν-связанный сахарный фрагмент», как он использован в настоящей работе, относится к олигосахариду, присоединённому к кНАЗЕСР посредством амидного азота в остатках Акп. Ν-связанные олигосахариды подразделяются на несколько главных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфированные), все они имеют сердцевины (Мап)3-С1сХЛс-СЕсХАс-. присоединённые через атом амидного азота в остатках Акп, находящихся в пределах последовательностей -Акп-Хаа-ТЬг/Зег- (где Хаа - это не Рго). Часто сайты с Ν-связью косвенно различимы по появлению «пустого» цикла при секвенировании. Позитивная идентификация может быть осуществлена после высвобождения олигосахарида ферментом РNСазой Б, которая превращает гликозилированный Акп в Акр. После удаления РСNазы Б Ν-связанные олигосахариды могут быть очищены с помощью хроматографии на биогеле Р-6, а олигосахаридный пул подвергается препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (1ндЬ рН апюп ехсЬапде сЬгота1одгарЬу, НРАЕС) (То\гпкепй е1 а1. //Апа1. ВюсЬет. 1989, ν. 182, р. 1-8). С помощью НРАЕС можно разделить некоторые изомеры олигосахаридов. На хроматограммах НРАЕС остатки фукозы смещаются к более раннему элюированию, тогда как остатки дополнительной сиаловой кислоты выходят при большем времени элюирования. Путём сопутствующей обработки гликопротеинов с известной олигосахаридной структурой (например, фетуин крупного рогатого ско
- 19 009383 та, кислый гликопротеин α-1, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) можно улучшить идентификацию олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды можно охарактеризовать сочетанием анализов состава и метилирующих связей (ХУаедйе еΐ а1. //СагЬойубг. Кек. 1983, ν. 123, р.281-304), различая аномерные конфигурации с помощью спектроскопии ЯМР (Vаη На1Ьеек //Ме1йобк Еηζутο1. 1993, ν. 230).
В качестве альтернативы можно идентифицировать олигосахариды с помощью соединённого с флуоресценцией электрофореза углеводов (Г1иогексепсе аккМеб сагйойубгаЮ е1ес1горйогек1к. РАСЕ) (см. Са'11е\\'аег1 еΐ а1. //61усоЬю1оду. 2001, ν. 11, р. 275-281).
Термин «сиаловая кислота», как он использован в настоящей работе, относится к любому представителю семейства 9-углеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее часто встречающимся представителем семейства сиаловых кислот является Ν-ацетилнейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5дидезокси-О-глицеро-О-галактононулопираноз-1-ная кислота (обозначение часто сокращается как №и5Ас, №иАс или ΝΑΝΑ). Вторым представителем семейства является Ν-гликолилнейраминовая кислота (№и5Сс или №иСс), в которой Ν-ацетильная группа в №иАс гидроксилирована. Третьим представителем семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-дезоксинонулосоновая кислота (ΚΌΝ) (№1бапо е1 а1. //1. Бю1. СБет. 1986, ν. 261, р. 11550-11557; Капатоп е1 а1. //1. Бю1. СБет. 1990, ν. 265, р. 2181121819). Сюда входят также 9-замещённые сиаловые кислоты, такие как подобные соединению 9-О-С.киЬ.1-С.киЬ.6 асу1-Ыеи5Ас-9-О-лактил-Ыеи5Ас или 9-О-ацетил-Ыеи5Ас, 9-дезокси-9-фтор-Ыеи5Ас и 9-азидо-9-дезокси-Ыеи5Ас. Для обзора семейства сиаловых кислот см., например, Уагк1 //С1усоЬ1о1оду. 1992, ν. 2, р. 25-40; 81а1ю Ас1бк: СйеиикЦу. Ме1аЬойкт апб Рппс11оп. Под ред. К. 8сйаиег. 8ргтдегУег1ад, Ν. Υ., 1992. Синтез и применение соединений с сиаловыми кислотами в процедуре сиалирования раскрыты в международной публикации \УО 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г.
Использованное в настоящей работе обозначение «РХСаза» (РNСаке) относится к специфичной к аспарагиновому пептиду Ν-гликозидазе Р, такой как пептид-Ы-гликозидаза Р из Р1ауоЬас1епит татпдокерЦпп. Для ферментов РNСаз характерна специфичность к Ν-связанным, но не к О-связанным олигосахаридам. Охарактеризовать эффективность РХСазы можно с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8 или с помощью электрофореза углеводов в соединении с флуоресценцией.
Упоминаемое в настоящей работе в основном оконечное сиалирование относится к Ν-связанным олигосахаридам, оканчивающимся остатком сиаловой кислоты в качестве оконечного сахара. Оконечные сиаловые кислоты могут быть идентифицированы с помощью анализа методом РАСЕ углеводов, высвобождаемых после обработки нейраминидазой.
Время жизни гликопротеинов при циркуляции в крови в высокой степени зависит от состава и структуры присоединённых Ν-связью углеводных групп. Этот факт имеет непосредственное значение для терапевтических гликопротеинов, предназначенных для парентерального введения. Как правило, для максимального времени полужизни в циркуляции гликопротеина необходимо, чтобы его Ν-связанные углеводные группы оканчивались последовательностью NеиΑс-Са1-С1сNΑс. Без оконечной сиаловой кислоты (№иАс) гликопротеин быстро выводится из кровотока с помощью механизма, включающего распознавание прилегающих остатков Ν-ацетилгалактозамина (СаШАс) или галактозы (Са1) (Соосйее еΐ а1. //Вю1/Тесйпо1оду. 1991, ν. 9, р. 1347-1355). По этой причине для коммерческого производства терапевтических гликопротеинов важным обстоятельством является наличие в их Ν-связанных углеводных группах оконечной сиаловой кислоты.
Циркулирующие гликопротеины подвергаются действию сиалидазы (сиалидаз) (или нейраминидазы), которые могут отщеплять концевые остатки сиаловой кислоты. Как правило, удаление сиаловой кислоты открывает галактозные остатки, которые распознаются и связываются галактозоспецифичными рецепторами гепатоцитов (обзор см. в Акй\\'е11 апб НагГогб //Апп. Кем Вюсйет. 1982, ν. 51, р. 531). Печень содержит также другие сахароспецифичные рецепторы, которые являются посредниками в выведении гликопротеинов из циркуляции. Эти рецепторы специфичны также к Ν-ацетилглюкозамину, маннозе, фукозе и фосфоманнозе. Удаляемые с помощью галактозных рецепторов гликопротеины претерпевают существенное расщепление и затем поступают в жёлчь; выводимые с помощью маннозных рецепторов клеток Купфера гликопротеины поступают в ретикулоэндотелиальную систему (обзор см. в Акй\уе11 апб НагГогб //Апп. Кеу. Вюсйет. 1982, ν. 51, р. 531).
Термин «активный в нейтральных условиях» (или «нейтрально активный»), как он использован в настоящей работе, относится к гликопротеину &НА8ЕСР с каталитической активностью по отношению к гликозаминогликановому субстрату ίη νίΐΐΌ при рН в интервале от 5 до 8 при концентрации соли менее чем 150 мМ и буферной силе менее чем 50 мМ.
Термин «стабилизированный раствор», как он использован в настоящей работе, относится к &НА8ЕСР, который сохраняет более 60% своей исходной активности после хранения при комнатной температуре в течение 30 дней.
Термин «единица», как он использован в настоящей работе, если не определён иначе, представляет собой единицу снижения мутности ПигЫбйу гебисшд пай. ТКИ). Одна ТКИ определяется как такая величина гиалуронидазной активности, которая необходима для снижения мутности подкисленного раствора гиалуроновой кислоты и эквивалентна единице ΝΡυ Фармакологического справочника фармакопеи США (и8Р/№1йопа1 Рогти1агу (ΝΡ XIII)). Приведенный в настоящей работе иммуноферментный анализ
- 20 009383 типа твердофазного иммуноферментного анализа ΕΠδΑ может быть соотнесён с единицами ТКИ, ΝΕυ или единицей Национальной фармакопеи США (υδΡ) с помощью стандартной кривой для образца гиалуронидазы (например, стандарт Фармакопеи США или Всемирной организации здравоохранения, ВОЗ), стандартизованного по правилам Фармакопеи США. Следовательно, ферментативные активности, определённые иммуноферментным анализом типа ΕΠδΑ, выражаются на самом деле в относительных единицах ТКи, поскольку в турбидиметрическом анализе ферментативная активность в действительности не измеряется (ЭогГшап е! а1. //1. Вю1. Сйет. 1948, ν. 172, р. 367).
«Эффективность» (ро!епсу), как она указывается в настоящей работе, определяется количеством белка &ΗΑ8ΕСΡ, необходимого для расщепления субстрата ίη νίίΐΌ с использованием единицы снижения мутности или относительной единицы снижения мутности.
Термин «удельная активность» (кресШс ас!туйу), как он использован в настоящей работе, относится к единицам активности на 1 мг белка. Количество белка 5НА8ГСГ определяют по поглощению раствора 5НА8ГСГ при 280 нм, принимая коэффициент молярной экстинкции равным приблизительно 1,7 М-1-см-1.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) и ранее широко использовался в биоматериалах, биотехнологии и медицине, прежде всего, потому что это - биологически совместимый, нетоксичный, неиммуногенный и водорастворимый полимер (2йао апб Натлк //АС8 8утрояит 8епе5. 1997, ν. 680, р. 458-472). В области доставки лекарств производные ПЭГ широко используются в ковалентном присоединении к белкам (например, «ПЭГилирование») для снижения их иммуногенности, протеолиза и выведения через почки и для повышения растворимости (2а11р§ку //Α6ν. Эгид. Эе1. Кет. 1995, ν. 16, р. 157-182). Подобным же образом присоединяли ПЭГ к низкомолекулярным, относительно гидрофобным лекарствам для повышения их растворимости, снижения токсичности и изменения биологического распределения. Как правило, ПЭГилированные лекарства вводят инъекцией в виде растворов.
Тесно связанным применением является синтез сшитых разлагаемых сеток или композиций с ПЭГ для применения в доставке лекарств, поскольку многое из таких же химических подходов, применённых в конструировании разлагаемых, растворимых носителей лекарств, может быть использовано в создании разлагаемых гелей (8а\\йпеу е! а1. //Масгото1еси1е§. 1993, ν. 26, р. 581-587). Известно также, что межмолекулярные комплексы можно получать смешиванием растворов двух комплементарных полимеров. Такие комплексы обычно стабилизированы электростатическими взаимодействиями (полианионполикатион), и/или образованием водородных связей (поликислота-полиоснование) между участвующими полимерами, и/или гидрофобными взаимодействиями между полимерами в водном окружении (Кгирегк е! а1. /Жиг. Ρο1ут. Г 1996, ν. 32, р. 785-790). Например, смешивание растворов полиакриловой кислоты (ПАК) и полиэтиленоксида (ПЭО) при подходящих условиях приводит к образованию комплексов, в основном путём формирования водородных связей. Диссоциацию этих комплексов при физиологических условиях использовали для доставки свободных лекарств (например, не ПЭГилированных). Кроме того, комплексы комплементарных полимеров получали из гомополимеров и сополимеров.
В одном из аспектов полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 3 до приблизительно 50 кДа, предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 30 кДа. Ковалентное связывание ПЭГ с лекарством (известное как «ПЭГилирование») может быть достигнуто с помощью известных методов химического синтеза. Например, в одном из аспектов настоящего изобретения ПЭГилирование белка может быть произведено путём реакции ПЭГ, активированного ΝΗ8, с белком при подходящих условиях реакции.
Хотя для ПЭГилирования было описано много реакций, наиболее широко применимые из них являются прямыми, используют мягкие реакционные условия, и не требуют экстенсивной последующей обработки для удаления токсичных катализаторов или побочных продуктов. Например, монометоксиПЭГ (мПЭГ) имеет только один реакционно-способный концевой гидроксил, и поэтому его применение частично ограничивает гетерогенность получаемых в смеси продуктов ПЭГ-белок. Обычно для достижения эффективного ПЭГилирования белка необходима активация гидроксильной группы на конце полимера, противоположном концевой метоксигруппе. Это требуется для того, чтобы сделать модифицированный ПЭГ более восприимчивым для нуклеофильной атаки. Атакующим нуклеофилом обычно является эпсилон-аминогруппа лизильного остатка, но при благоприятных локальных условиях и другие амины (например, Ν-концевой альфа-амин или амины в кольце гистидина) могут давать реакцию. В белках, содержащих одиночный лизин или цистеин, возможно более направленное прикрепление. На остаток цистеина может быть нацелен ПЭГ-малеимид для тиол-специфичной модификации. В качестве альтернативы ПЭГ-гидразид может реагировать с окисленным периодатом &ΗΑ8ΕСΡ и затем быть восстановленным в присутствии NаСNΒΗз. Более специфично, ПЭГилированные сахара СМБ (цитидинмонофосфата, суйбте топорйо§рйа!е) могут реагировать с 5НА8ГСГ в присутствии соответствующих гликозилтрансфераз. Одной из техник является техника «ПЭГилирования», в которой к целевому полипептиду присоединено несколько полимерных молекул. При использовании такой техники у иммунной системы возникают трудности в распознавании ответственных за образование антител эпитопов на поверхности полипептида, что ослабляет иммунную реакцию. Для полипептидов, вводимых непосредственно в циркуляторную систему тела человека с целью получения конкретного физиологического эффекта (т.е. для
- 21 009383 фармацевтических препаратов), типичным потенциальным иммунным ответом является появление 1дС и/или 1дМ, тогда как при ингаляции полипептидов в дыхательную систему (например, полипептиды в промышленных загрязнениях) потенциальным ответом может быть появление 1дЕ (т.е. аллергическая реакция). Одна из теорий, объясняющих сниженный иммунный ответ, состоит в том, что полимерная молекула (полимерные молекулы) экранирует (экранируют) эпитоп(ы) на поверхности полипептида, ответственные за иммунную реакцию, приводящую к образованию антител. Другая теория (или по меньшей мере один из факторов) состоит в том, что чем больше конъюгат, тем большее снижение иммунного ответа получается в итоге.
Полимерными молекулами, присоединёнными к полипептиду, могут быть любые пригодные полимерные молекулы с молекулярной массой, определённой в соответствии с настоящим изобретением, в том числе природные и синтетические гомополимеры, такие как полиолы (например, поли-ОН), полиамины (например, поли-ИН2) и поликарбоновые кислоты (например, поли-СООН), а также гетерополимеры, т.е. полимеры, содержащие одну или более из других связывающихся групп (например, гидроксильную группу и аминогруппы).
Примеры подходящих полимерных молекул включают полимерные молекулы, выбранные из группы, содержащей полиалкиленоксиды (ПАО), такие как полиалкиленгликоли (ПАГ), в том числе полиэтиленгликоли (ПЭГ), метоксиполиэтиленгликоли (мПЭГ) и полипропиленгликоли, ПЭГ-глицидиловые эфиры (Ерох-ПЭГ), ПЭГ-оксикарбонилимидазол (СП1-ПЭГ), разветвлённые полиэтиленгликоли (ПЭГ§), поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, поли-О,Ь-аминокислоты, сополимер полиэтилена с ангидридом малеиновой кислоты, сополимер полистирола с ангидридом малеиновой кислоты, декстраны, в том числе карбоксиметилдекстраны, гепарин, гомологичный альбумин, целлюлозы, в том числе метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиэтилцеллюлозу и гидроксипропилцеллюлозу, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмалы и гидроксипропилкрахмалы, гликоген, агарозы и их производные, камедь гуара, пуллулан, инулин, ксантановую камедь, каррагинан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты и биополимеры.
Предпочтительными полимерными молекулами являются нетоксичные полимерные молекулы, такие как метоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), для которого, кроме того, нужны относительно простые химические подходы, чтобы осуществить его ковалентное связывание с реакционными группами на поверхности фермента.
Предпочтительными полимерными молекулами являются обычно рассматриваемые полиалкиленоксиды (ПАО), такие как полиэтиленоксиды (такие как ПЭГ и, в особенности, мПЭГ), поскольку эти полимерные молекулы, в сравнении с полисахаридами, такими как декстран, пулуллан и подобные им, имеют небольшое количество реакционноспособных групп, способных обеспечить сшивание.
В. Профили экспрессии 5НА8ЕСР в тканях
Хотя первоначально полагали, что 5НА8ЕСР человека специфически находится в яичках, применение более чувствительного анализа методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) позволило установить, что он экспрессируется во многих тканях человека. Транскрипция &НА8ЕСР обнаружена в продолговатом мозгу (головной мозг), эндотелии микрокапилляров, простате, молочной железе, сетчатке глаза, скоплениях меланоцитов человека, сердце плода и беременной матке. &НА8ЕСР экспрессируется также в опухолях половых клеток. Для определения уровней транскрипции 5НА8ЕСР в других, кроме яичек, тканях обычно требуется применение ОТ-ПЦР.
С. Анализ ферментативной активности &НА8ЕСР
Определение гиалуронидазной активности на основе турбидиметрического микротитрования.
Гиалуронидазную активность можно обнаружить в подкисленном растворе сыворотки с помощью модифицированного турбидиметрического метода анализа. Для этого необходимы следующие реагенты (табл. 2).
- 22 009383
Таблица 2
Стерилизованная УФ 2-кратно деионизованная вода или стерильная вода для промывания Вгаип К5000-01
Ну1ите<1 МесНса! - гиалуронат натрия, высокомолекулярный ГУ Сепгуте Αάνβποβά В|ота(епа15 4876
Гиалуроназа - референсный стандарт изр 31200
Ацетат калия гранулированный, ΙΙ3Ρ, АСЗ ЭТВакег 2914-01
Уксусная кислота ледяная, 99+% 8|дта А-6283
Фосфат натрия однозамещённый, моногидрат, гранулированный, ЦЗР МаШпкгосЦ 7774
Фосфат натрия двузамещённый, безводный, иЗР МаЖпкгосК 7771
Хлорид натрия, кристаллы, СК, АСЗ ЕМЗаепсе 3X0420-5
Желатина ферментативный гидролизат 3|дта С-0262
Сыворотка лошади, Оопог Негф проверенная в культуре клеток, проверенная в культуре гибридом, полученная из США Згдта Н-1270
Сывороточный альбумин человека 20% СпЯо1з
Соляная кислота, реагент АСЗ 31дта Н-7020
Хлорид кальция, дигидрат, гранулированный, изр, -РСС ЗТВакег 1336-01
Готовят следующие реагенты.
Раствор ацетатного буфера: 14,0 г ацетата калия, 25,0 мл ледяной уксусной кислоты, вода до 1000 мл.
Раствор фосфатного буфера: 2,5 г фосфата натрия двузамещённого (одноосновного), 1,0 г безводного фосфата натрия однозамещённого (двухосновного), 8,2 г хлорида натрия, вода до 1000 мл.
Базовый раствор для разбавления фермента: 500 мл раствора фосфатного буфера и 500 мл воды.
Рабочий раствор для разбавления фермента: 33 мг гидролизованного желатина растворяют в 50 мл базового раствора для разбавления фермента - готовят не более чем за 2 ч до использования.
Буферный раствор для стабилизации образцов («раствор 88В»): 125 мкл 20% раствора человеческого сывороточного альбумина и 50 мкл 1 М раствора хлорида кальция в 50 мл рабочего раствора для разбавления фермента, тщательно перемешать.
Базовый раствор сыворотки: разбавить 1 объём лошадиной сыворотки 9 объёмами раствора ацетатного буфера. Довести рН до 3,1 добавлением 4 Н соляной кислоты и оставить раствор стоять при комнатной температуре в течение 18-24 ч. Хранить раствор при 4°С, использовать в течение 30 дней.
Рабочий раствор сыворотки: 10 мл базового раствора сыворотки в 30 мл раствора ацетатного буфера, довести температуру до комнатной.
Базовый раствор гиалуроновой кислоты: растворить натриевую соль гиалуроновой кислоты в воде до концентрации 5,0 мг/мл.
Рабочий раствор гиалуроновой кислоты: 0,75 мл базового раствора гиалуроновой кислоты в 4,25 мл раствора фосфатного буфера.
Стандартный базовый раствор: одну упаковку референсного стандартного препарата гиалуронидазы И8Р растворить в воде до концентрации 1000 ед./мл, разделить на аликвоты по 50 мкл, хранить при 20°С.
Стандартный рабочий раствор: 40 мкл стандартного базового раствора в 960 мкл холодного рабочего раствора для разбавления фермента, чтобы получить раствор с известной концентрацией 40 ед./мл, готовить непосредственно перед использованием в анализе.
Все образцы фермента разбавляют в планшетах на 96 ячеек «для низкого связывания белка» («Боте Рго!еш Βίηάί移), согласно следующим предписаниям:
a) Область максимальной чувствительности данного анализа располагается между 10 и 30 ед./мл. Для того чтобы минимизировать число определений, следует повторить анализ, чтобы получить результаты, попадающие в этот интервал. Для этого в образце определяют приблизительное полное число ед./мл, а затем выбирают разбавление (полное число разведений), так что конечная концентрация составит около 20 ед./мл.
b) Минимальные объёмы проб, необходимые для проведения анализа, следующие:
фракции ЕРЬС - 50 мкл, надосадочные жидкости из культур ткани - 1 мл, очищенный/концентрированный конечный материал - 10 мкл.
c) Для проб с последовательными разведениями делают разведения 1:10 с 3-кратным повтором в планшетах на 96 ячеек «для низкого связывания белка», внося пипеткой в каждую ячейку 360 мкл «раствора 88В» и 40 мкл пробы.
- 23 009383
Для приготовления стандарта И8Р получают стандартную кривую И8Р в планшетах на 96 ячеек «для низкого связывания белка», как указано ниже (табл. 3).
Таблица 3
Стандартная кривая иЗР
Ячейки Стандарт Раствор для разбавления фермента (мкл) Стандартный рабочий раствор (мкл) Конечная концентрация (ед./мл)
А1-АЗ 8101 0 100 40
В1-ВЗ 8102 20 80 32
С1-СЗ 8103 40 60 24
Ο1-ϋ3 8104 60 40 16
Е1-ЕЗ 8105 80 20 8
Р1-РЗ 8106 90 10 4
61-63 8107 100 0 0
Для получения контроля гиалуроновой кислоты в колонках 1-3 готовят его в планшетах на 96 ячеек с плоским дном следующим образом (табл. 4).
Таблица 4
Контроль гиалуроновой кислоты
Ячейки Контроль Рабочий раствор гиалуроновой кислоты (мкл) Рабочий раствор для разбавления фермента (мкл)
Н1-НЗ Со01 0 60
Реакционный планшет: Рабочий раствор гиалуроновой кислоты (30 мкл на ячейку) пипетируют в микротитровальный планшет на 96 ячеек с плоским дном, используя 8-канальный дозатор на 50 мкл. Ячейки Н1-Н3 оставляют пустыми. В эти ячейки Н1-Н3 того же планшета пипетируют рабочий раствор для разбавления фермента (60 мкл на ячейку) (контроль гиалуроновой кислоты).
Рабочий раствор сыворотки: 40 мкл рабочего раствора сыворотки помещают в ячейку для переноса и затем переносят в нагревательный блок.
Стадия предварительного прогрева: Как только приготовлены оба планшета - планшет на 96 ячеек «для низкого связывания белка», содержащий разбавленные пробы, стандарты и контроли, и планшет на 96 ячеек с плоским дном, содержащий рабочий раствор гиалуроновой кислоты, их помещают в нагревательный блок и прогревают в течение 5 мин при 37°С.
Реакцию инициируют добавлением фермента к субстрату: добавляют по 30 мкл из ферментного планшета во все ячейки в колонке 1 в планшете на 96 ячеек с плоским дном (содержащем субстрат) с помощью 8-канальной пипетки на 5-50 мкл. Фермент-субстратную реакционную смесь всасывают пипеткой 5 раз (прогоняя раствор пипеткой вверх и вниз в течение первых 15 с для обеспечения полного перемешивания проб. После перемешивания фермента и субстрата наконечники пипетки выбрасывают и на дозатор для переноса помещают новый набор наконечников для следующей колонки. Отсчёт времени включают заново и в момент времени 1=30 с этот процесс повторяют для колонки 2. После следующего 30-секундного интервала, 1=1 мин, этот процесс повторяют для колонки 3. Процесс повторяют каждые 30 с, перемещаясь по планшету слева направо, пока все ячейки не будут содержать и фермент, и субстрат.
Остановка реакции: Когда отсчёт времени достигает 1=6 мин, в каждую ячейку пипетируют 240 мкл рабочего раствора сыворотки с помощью 8-канальной пипетки для переноса на 50-300 мкл. Раствор вносят из резервуара для реагентов объёмом 50 мл в ячейки колонки 1-го планшета на 96 ячеек с плоским дном. Смесь отсасывают 3 раза (прогоняя раствор пипеткой для переноса вверх и вниз) в течение первых 10 с для обеспечения полного перемешивания. Этот процесс повторяют каждые 30 с, перемещаясь от колонки 1 до колонки 12. После завершения процедуры для последней колонки (колонка 12) реакционный планшет удаляют из нагревательного блока и помещают планшет на регистрационный столик в аппарат для автоматического просмотра планшетов при 640 нм. По ячейкам для стандартной кривой получается линейная калибровка, которая позволяет экстраполировать испытуемые пробы.
Альтернативные методы анализа для гиапуронидазы.
Микротитровальный анализ биотинилированного гиалуронана.
Свободные карбоксильные группы на остатках глюкуроновой кислоты гиалуронана биотинилируют в одностадийной реакции, используя биотин-гидразид (Р1егсе), сульфо-№Н8 (Р1егсе) и 1-этилдиметиламинопропилкарбодиимид (81дта). Этот субстрат - биотинилированный гиалуронан (ГУ) ковалентно связывают во второй реакции в ячейках микротитровального планшета на 96 ячеек. После завершения ферментативной реакции остаточный субстрат определяют с помощью авидинпероксидазной реакции, которую можно регистрировать в стандартном устройстве для считывания планшетов ЕЫ8А. Поскольку субстрат ковалентно связан с микротитровальным планшетом, отсутству
- 24 009383 ют такие артефакты, как рН-зависимое замещение биотинилированного субстрата. Чувствительность реакции позволяет быстро измерять гиалуронидазную активность в пробах из культивируемых клеток и биологических образцов с разбросом между параллельными анализами менее 10%.
Удельную активность гиалуронидазы выражают в единицах снижения мутности (ТКИ). Одна единица ТКИ определяется как такая величина гиалуронидазной активности, которая необходима для снижения мутности подкисленного раствора гиалуроновой кислоты и эквивалентна единице №ϋ Фармакологического справочника фармакопеи США (υ8Ρ/№ιΙίοηα1 ΕοπηιιΕιίΎ (ЛГ ΧΙΙΙ)). Проведенный в настоящей работе иммуноферментный анализ типа твердофазного иммуноферментного анализа ΕΕΙ8Α может быть соотнесён с единицами ТКИ, ХЕи или единицей Национальной фармакопеи США с помощью стандартной кривой для образца гиалуронидазы (например, стандарт Фармакопеи США или Всемирной организации здравоохранения), стандартизованного по правилам Фармакопеи США. Следовательно, ферментативные активности, определённые иммуноферментным анализом типа ΕΜδΑ, выражаются на самом деле в относительных ТКИ, поскольку в турбидиметрическом анализе ферментативная активность в действительности не измеряется (ΌοιΤιικιη с1 а1. //1. ΒίοΙ. СЬет. 1948, ν. 172, р. 367).
Многие методы анализа гиалуронидазы были основаны на измерении появления новых редуцирующих N-ацетиламиногрупп (ΒοηικΓ алб С’аЩеу //С1т. СЫт. Ас1а. 1966, ν. 13, р. 746-752) либо утраты вязкости (Эе 8а1едш еΐ а1. //АгсЬ. ВюсНет. ВюрНук. 1967, ν. 121, р. 548-554) или мутности (ΌοιΤιικιη ;·ιηά 0й //1. Βίο1. СЬет. 1948, ν. 172, р. 367). С очищенными субстратами все эти методы пригодны для определений в присутствии или в отсутствие эндоглюкозамидазной активности.
По существу, очищенные субстраты гликозаминогликана могут быть также использованы в анализе по сдвигу подвижности в геле. Гликозаминогликаны смешивают с рекомбинантным κΗΑδΕΟΡ для определения эндоглюкозидазной активности, которая приводит к сдвигу подвижности субстрата в геле. Хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепаран-сульфат можно получить от фирмы §1дта СйетюаЕ Гиалуронан пупочного жгутика человека можно получить от ШХ Каждый тестовый субстрат разбавляют до концентрации 0,1 мг/мл в буфере с рН в интервале 3,5-7,5. Пробы объёмом 10 мкл очищенного κΗΑδΕΟΡ или культуральной среды от продуцирующих κΗΑδΕΟΡ клеток смешивают с 90 мкл тестового субстрата в необходимом буфере и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. После инкубации пробы нейтрализуют буфером для образцов (трис-ЭДТА, рН 8,0, содержащий бромфенол синий и глицерин), после чего проводят электрофорез. Гликозаминогликаны детектируют, окрашивая гели в точение ночи 0,5% альцианом голубым в 3% уксусной кислоте с последующей отмывкой краски 7% уксусной кислотой. Расщепление определяют путём сравнения подвижности субстрата в присутствии и в отсутствие фермента.
Гиалуронидазную активность можно также определять зимографией гелей с субстратом (6иелΐелΙιοικγ еΐ а1. //Ма1пх. 1992, р.388-396). В этом методе анализа образец наносят на полиакриламидный гель с δΌδ, содержащий гиалуроновую кислоту, и белки в образце разделяют электрофорезом. Затем гель инкубируют в буфере для анализа фермента и после этого окрашивают для определения распределения гиалуроновой кислоты в геле. Гиалуронидазная активность визуализируется как неокрашенная зона в геле с субстратом.
Ό. Идентификация и выделение генов для полипептида &ΗΑ8Ε6Ρ
Ген полипептида &ΗΑ8Ε6Ρ и/или его доменов может быть получен методами, хорошо известными в области выделения ДНК. Может быть применён любой метод, известный специалистам в области идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих требуемые гены. Для получения клона комплементарной ДНК (кДНК) или геномной ДНК полной длины, кодирующей полипептид κΗΑδΕΟΡ, можно использовать любой метод, существующий в данной области. Например, можно использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для размножения (амплификации) последовательности, которая может быть экспрессирована в нормальных тканях (например, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид κΗΑ8Ε6Ρ (последовательности № 1 и 2) из библиотеки геномной ДНК или кДНК). Олигонуклеотидные праймеры, гибридизирующиеся с последовательностями на 3'-и 5'-концах идентифицированных последовательностей, могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации с помощью ПЦР последовательностей из образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК, обычно библиотеки кДНК) из соответствующего источника (например, яичек, простаты, молочной железы).
ПЦР можно проводить, например, с использованием термоциклера СеШк фирмы Ρе^к^η-Ε1те^ и полимеразы Тад (Сене Αтр). Подлежащая амплификации ДНК может включать мРНК, или кДНК, или геномную ДНК из любого вида эукариот. Для использования в реакциях ПЦР можно выбрать для синтеза несколько различных вырожденных праймеров.
Возможно также варьирование степени строгости условий для гибридизации, используемых при затравке (прайминге) реакций ПЦР с целью амплифицировать гомологи нуклеиновой кислоты (например, чтобы получить последовательности для полипептидов κΗΑδΕΟΡ из видов, отличающихся от человека, или чтобы получить последовательности человека с гомологией по отношению к последовательностям для полипептида &ΗΑ8Ε6Ρ), обеспечивая большую или меньшую степень подобия последовательностей нуклеиновой кислоты между известной нуклеотидной последовательностью и подлежащим выделению гомологом нуклеиновой кислоты. Для межвидовой гибридизации используют для смягчения степени стро
- 25 009383 гости низкую степень строгости. Для гибридизации в пределах одного вида используют условия умеренной степени строгости или высокой степени строгости. Условия могут быть определены опытным путём.
После успешной амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующую последовательность для всего идентифицированного полипептида κΗΑδΕΟΡ или его части, или же нуклеиновой кислоты, кодирующей весь полипептидный гомолог κΗΑδΕΟΡ или его часть, этот сегмент нуклеиновой кислоты может быть подвергнут молекулярному клонированию, секвенирован и использован в качестве зонда для выделения полной кДНК или полного геномного клона. Это, в свою очередь, позволяет определить полную нуклеотидную последовательность гена, провести анализ его экспрессии и получить его белковый продукт для функционального анализа. Когда нуклеотидная последовательность определена, открытая рамка считывания, кодирующая белковый продукт гена полипептида κΗΑδΕΟΡ, может быть определена любым методом, хорошо известным в данной области для определения открытых рамок считывания, например с помощью общедоступных компьютерных программ анализа нуклеотидных последовательностей. Как только открытая рамка считывания установлена, нетрудно определить аминокислотную последовательность белка, кодируемого открытой рамкой считывания. Таким путём можно идентифицировать нуклеотидную последовательность полных генов полипептида κΗΑδΕΟΡ, так же как и аминокислотную последовательность белков полипептида κΗΑδΕΟΡ и его аналогов.
Любая эукариотическая клетка в принципе может служить источником нуклеиновой кислоты для молекулярного клонирования гена полипептида κΗΑδΕΟΡ. Нуклеиновые кислоты можно выделить из клеток позвоночных, млекопитающих, людей, свиней, кошачьих, птиц, лошадей, собак, а также из других видов приматов, насекомых, растений и иных организмов. ДНК может быть получена стандартными методами, известными в данной области, из клонированной ДНК (например из ДНК-«библиотеки»), химическим синтезом, клонированием кДНК или клонированием геномной ДНК или её фрагментов, полученных и очищенных из требуемых клеток (см., например, 8атЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1ошпд, Α ЬаЬога1огу Мапиа1, 2-е изд. Сок 8ргтд ИагЬог ЬаЬогаФгу Ριόκκ, Сок 8ргтд ИагЬог, №\ν Уогк, 1989; ΌΝΑ С1ошпд: Α Ρ^асΐ^са1 ЛрргоасЕ. Под ред. С1отег Ό.Μ. МКЬ Ριόκκ, Ь1б. ОхГогб, иК, 1985, ν. 1, р. 11). Полученные из геномной ДНК клоны могут содержать, кроме кодирующих участков, регуляторные и интронные участки ДНК, полученные из кДНК клоны будут содержать только экзонные последовательности. При любом источнике, ген клонируют в подходящий вектор для его воспроизводства.
При молекулярном клонировании гена из геномной ДНК получаются фрагменты ДНК, некоторые из которых кодируют требуемый ген.
ДНК может быть расщеплена в специфических местах с помощью различных ферментов рестрикции.
В качестве альтернативы для фрагментирования ДНК можно использовать ДНКазу в присутствии ионов марганца или же ДНК можно фрагментировать механически, например, с помощью ультразвука. Затем линейные фрагменты ДНК можно разделить по размерам с помощью стандартных методов, включающих (но не ограниченных ими) электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле и колоночную хроматографию.
Когда фрагменты ДНК получены, можно осуществить различными способами идентификацию фрагмента, содержащего требуемый ген.
Например, часть гена полипептида κΗΑδΕΟΡ (любого вида), например, полученная как продукт амплификации в ПЦР в соответствии с описанным выше, или олигонуклеотид, имеющий известную нуклеотидную последовательность или её часть, или его специфическая РНК, или её фрагмент могут быть очищены и помечены, и созданные фрагменты ДНК могут быть подвергнуты скринингу путём гибридизации нуклеиновой кислоты с меченым зондом (Веп1оп апб Ωηνίκ //8аепсе. 1977, ν. 196, р. 180; 6гипк1ет апб Ыодпекк. /^гос. №И. Αсаб. 8сг υδΑ. 1975, ν. 72, р. 3961). Фрагменты ДНК, имеющие существенную гомологию с зондом, будут с ним гибридизироваться. Можно также идентифицировать подходящий фрагмент с помощью расщепления ферментом (ферментами) рестрикции и сопоставления размеров полученных фрагментов с размерами, ожидаемыми на основании известной карты рестрикции (если она имеется), или с помощью анализа последовательности ДНК и её сопоставления с известной нуклеотидной последовательностью для полипептида κΗΑδΕΟΡ. Дальнейшую селекцию можно осуществить на основании свойств гена. В качестве альтернативы наличие гена может быть установлено анализом физических, химических или иммунологических свойств его экспрессированного продукта. Например, могут быть отобраны клоны кДНК или клоны ДНК, селективно гибридизирующиеся с подходящей мРНК, которые продуцируют белок, имеющий, например, похожие или идентичные электрофоретическую подвижность, поведение при изоэлектрическом фокусировании, карты протеолитического расщепления, антигенные свойства, гиалуронидазную активность. Если имеются антитела к полипептиду κΗΑδΕΟΡ, белок можно идентифицировать по связыванию меченых антител с клонами, предположительно синтезирующими полипептид κΗΑδΕΟΡ, с помощью метода типа твердофазного иммуноферментного анализа ΕΟδΑ (епхуте-Нпкеб 1ттипокогЬеп1, аккау).
Альтернативные подходы в выделении геномной ДНК для полипептида κΗΑδΕΟΡ включают (но не ограничиваются ими) химический синтез последовательности гена по известной последовательности или получение по мРНК кодирующей полипептид κΗΑδΕΟΡ кДНК.
- 26 009383
Например, РНК для клонирования кДНК гена полипептида кНАБЕСР можно выделить из клеток, экспрессирующих белок. Затем идентифицированные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в подходящий клонирующий вектор. Можно использовать большое число систем векторхозяин, известных в данной области. Возможные векторы включают (но не ограничиваются ими) плазмиды или модифицированные вирусы, однако векторная система должна быть совместима с использованной клеткой-хозяином. Такие векторы включают (но не ограничиваются ими) бактериофаги, такие как производные бактериофага X, или плазмиды, такие как плазмидные производные рВВ322 или рИС вектора В1исксг1р1 (81га1адспс, Ьа 1о11а, СА). Вставка в клонирующий вектор может быть, например, осуществлена вшиванием (лигированием) фрагмента ДНК в клонирующий вектор, имеющий комплементарные липкие концы.
Если комплементарные сайты рестрикции, необходимые для вставки фрагмента ДНК, отсутствуют в клонирующем векторе, концы молекул ДНК можно ферментативно модифицировать. В качестве альтернативы любой необходимый сайт можно создать пришивкой нуклеотидных последовательностей (линкеров, мостиков) на концы ДНК; эти пришитые линкеры могут включать специфические синтезированные химически олигонуклеотиды, кодирующие узнаваемые последовательности для рестрикционных эндонуклеаз. В альтернативном способе расщеплённый вектор и ген полипептида кНАБЕСР можно модифицировать пришивкой гомополимеров на их концах.
Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки-хозяева путём трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации, осаждения кальцием или иными способами, так что создаётся большое число копий последовательности гена.
В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения трансформация клеток-хозяев рекомбинантными молекулами ДНК, включающими изолированный ген полипептида кНАБЕСР, кДНК или синтезированную последовательность ДНК, обеспечивает создание многих копий гена.
Таким образом, ген может быть получен в больших количествах путём выращивания трансформантов, выделения из трансформантов рекомбинантных молекул ДНК и, при необходимости, возвращения вставленного гена из изолированной рекомбинантной ДНК.
Е. Векторы, плазмиды и клетки, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид кНАБЕСР или его гиалуронидазный домен, и экспрессирующие полипептиды кНАБЕСР векторы и клетки
Для рекомбинантной экспрессии одного или более полипептидов кНАБЕСР нуклеиновая кислота, содержащая всю или часть нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид кНАБЕСР, может быть вставлена в подходящий экспрессирующий вектор, т. е. в вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной последовательности, кодирующей белок. Необходимые транскрипционный и трансляционный сигналы могут быть также предоставлены нативным промотором для генов кНАБЕСР и/или их фланкирующими участками.
Предусматриваются также векторы, содержащие кодирующую кНАБЕСР нуклеиновую кислоту, которая может быть введена в экспрессирующую систему, способную продуцировать растворимый кНА8Е6Р, активный в нейтральных условиях.
Предусматриваются также клетки, содержащие векторы. Клетки включают эукариотические и прокариотческие клетки, а векторы включают такие векторы, которые пригодны для использования в них.
Предусматриваются эукариотические клетки, в том числе дефицитные по дигидрофолат-редуктазе клетки яичников китайского хомячка (Ό644), содержащие векторы. Подходящие клетки включают клетки дрожжей, клетки грибков, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных. Клетки используются для продукции полипептида кНАБЕСР или его гиалуронидазного домена путём (а) выращивания описанных выше клеток в условиях, при которых клетка экспрессирует кодируемый полипептид кНА8ЕСР или гиалуронидазный домен полипептида &НА8Е6Р, и затем (Ь) выделения экспрессированного белка гиалуронидазного домена. В приводимых для примера вариантах осуществления настоящего изобретения гиалуронидазный домен секретируются в культуральную среду.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматриваются векторы, которые включают последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, который имеет гиалуронидазную активность и содержит весь белок кНАБЕСР или часть только гиалуронидазного домена, или множество его копий. Предусматриваются также векторы, содержащие последовательность нуклеотидов, которая кодирует гиалуронидазный домен и дополнительные части белка кНАБЕСР, вплоть до белка кНАБЕСР полной длины и включая его, а также его множественные копии. Векторы могут быть выбраны для экспрессии белка кНАБЕСР или его гиалуронидазного домена в клетке или такой экспрессии, что белок кНАБЕСР экспрессируется как секретируемый белок. В качестве альтернативы векторы могут включать сигналы, необходимые для секреции кодируемых белков. Когда экспрессируется гиалуронидазный домен, нуклеиновая кислота присоединена к нуклеиновой кислоте, кодирующей сигнал секреции, такой как кодирующая сигнальный фактор спаривания у 8ассйаготусск ссгсуЫас или её части, или нативную сигнальную последовательность.
- 27 009383
Для того чтобы произвести растворимый кНА8ЕСР, активный в нейтральных условиях, необходимы клетки, способные осуществлять гликозилирование с Ν-связью. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки яичников млекопитающего - китайского хомячка, дефицитные по дигидрофолат-редуктазе (такие, как клетки ЭС44), подвергают электропорации с плазмидой, содержащей сильный промотор млекопитающих (такой как промотор цитомегаловируса, СМУ), кодирующую кНА8ЕСР нуклеиновую кислоту, за которой следуют внутренний сайт входа в рибосому, ген дигидрофолат-редуктазы мыши и последовательность полиаденилирования 8У40, как показано в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 51. Затем эти клетки культивируют в химически точно охарактеризованной среде в отсутствие гипоксантина и тимидина с повышающимися концентрациями метотрексата, после чего проводят амплификацию гена.
Для экспрессии кодирующей белок последовательности могут быть использованы различные системы хозяин-вектор. Эти системы включают (но не ограничиваются ими) клеточные системы млекопитающих, заражённые вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом и т. д.); клеточные системы насекомых, заражённые вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие, как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы; или бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК Необходимые для экспрессии элементы векторов варьируют по их силе и специфичности. В зависимости от использованной системы хозяин-вектор может быть использован любой из большого числа подходящих элементов транскрипции и трансляции. Следует отметить, что бактериальная экспрессия ДНК кНА8ЕСР сама по себе не приводит к получению каталитически активного кНА8ЕСР, для этого необходимо соединение с подходящей системой гликозилирования, тогда кНА8ЕСР может быть гликозилирован искусственно.
Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих химерный ген, в который входят подходящие сигналы контроля транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности, могут быть использованы любые известные специалистам в данной области методы вставления фрагментов ДНК в вектор. Эти методы могут включать технику получения рекомбинантной ДНК и синтеза ίη νίΐΓο и получения рекомбинантов ίη νΐνο (генетическая рекомбинация). Экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид кНА8ЕСР или его домены, производные, фрагменты или гомологи, можно регулировать второй последовательностью нуклеиновой кислоты, так что её гены или их фрагменты экспрессируются в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой (молекулами) ДНК. Например, экспрессию белков можно контролировать любым известным в данной области промотором/энхансером. В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения промотор не является нативным по отношению к генам для полипептида кНА8ЕСР. Промоторы, которые могут быть использованы, включают (но не ограничиваются ими) ранний промотор СУ40 (Βепο^κΐ алб Οΐιηιηόοη //№11иге. 1981, ν. 290, р. 304-310), содержащийся в 3'концевом длинном повторе вируса саркомы Роуза (Υататοΐο еΐ а1. //Се11. 1980, ν. 22, р. 787-797), промотор тимидин-киназы вируса герпеса (Уадие!· еΐ а1. //Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А. 1981, ν. 78, р. 1441-1445), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Вгшйег еΐ а1. //№Щ.1ге. 1982, ν. 296, р. 39-42);
промоторы прокариотических экспрессирующих векторов, такие как промотор гена β-лактамазы (УШа-КатагоЕГ еΐ а1. //Ргос. №И. Асаб. 8с1. изА. 1978, ν. 75, р. 3727-3731); или промотор ТАС (^еЬοе^ еΐ а1. //Ргос. №И. Асаб. 8сЕ и8А. 1983, ν. 80, р. 21-25); (см. также икеГи1 Ргсйеюк Ггот ВесοтЬталΐ Вас1епа //8с1еЩ1Лс Атенсам. 1980, ν. 242, р. 79-94);
растительные экспрессирующие векторы, содержащие промотор опалин-синтетазы (Неггега- Ек1ге11а еΐ а1. //№11иге. 1984, ν. 303, р. 209-213) или промотор 358 РНК вируса цветной капусты (Сагбег еΐ а1. //№.1с1е1с Ас1бк Век. 1981, ν. 9, р. 2871), и промотор фотосинтетического фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы (Неггега-Ек1ге11а еΐ а1. //№11иге. 1984, ν. 310, р. 115-120);
промоторные элементы из дрожжей и других грибов, такие как промотор Са14, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицерин-киназы, промотор щелочной фосфатазы, и следующие области контроля транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы в трансгенных животных:
контрольную область гена эластазы Ι, активную в гроздевидных клетках поджелудочной железы (8\νίΠ еΐ а1. //Се11. 1984, ν. 38, р. 639-646; ΟιηίΙζ еΐ а1. //С.о1б 8ргтд Нат^г 8утр. ОнаШ. Βίο1. 1986, ν. 50, р. 399- 409; Μас^οпа1б //НераЮкду. 1987, ν. 7, р. 425-515);
контрольную область гена инсулина, активную в бета-клетках поджелудочной железы (НашНи-т еΐ а1. //№11иге. 1985, ν. 315, р. 115-122), контрольную область гена иммуноглобулина, активную в лимфоидных клетках Сгоккс11еб1 еΐ а1. //Се11. 1984, ν. 38, р. 647-658; Абатк еΐ а1. //№Щ.1ге. 1985, ν. 318, р. 533-538; А1ехаг1бег еΐ а1. //Μο1. Се11 Βίο1. 1987, ν. 7, р. 1436-1444), контрольную область вируса опухоли молочной железы мыши, активную в клетках яичников, молочной железы, лимфоида и сосков (Ьебег еΐ а1. //Се11.
1986, ν. 45, р. 485-495), контрольную область гена альбумина, активную в печени (Ршскей еΐ а1. //Сспск аиб Эеуе1. 1987, ν. 1, р. 268-276), контрольную область гена альфа-фетопротеина, активную в печени (Кгит1аиГ еΐ а1. //Μο1. Се11. Βίο1. 1985, ν. 5, р. 1639-1648; Наттег еΐ а1. //8с1спсс. 1987, ν. 235, р. 53-58), контрольную область гена альфа-1 антитрипсина, активную в печени (Ке1кеу еΐ а1. //Сспск аиб Эеуе1.
1987, ν. 1, р. 161-171), контрольную область гена бета-глобина, активную в миелоидных клетках
- 28 009383 (Модгат е! а1. //№11иге. 1985, ν. 315, р. 338-340; КоШак е! а1. //Се11. 1986, ν. 46, р. 89-94), контрольную область гена основного белка миелина, активную в олигодендроцитных клетках мозга (ИеабБеаб е! а1. //Се11. 1987, ν. 48, р. 703-712), контрольную область гена лёгкой цепи 2 миозина, активную в скелетных мышцах (8ап1 //№11иге. 1985, ν. 314, р. 283-286), и контрольную область гена высвобождающего гонадотропин гормона, активного в дельта-клетках гипоталамуса (Макоп е! а1. //8с1епсе. 1986, ν. 234, р. 13721378).
В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения использован вектор, который содержит промотор, функционально присоединённый к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептид кНА8ЕСР или его домен, фрагмент, производное или гомолог, одно или более мест начала репликации и, по усмотрению, один или более из селектирующих маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику).
Для эффективной трансляции последовательности кНАБЕСР также могут быть нужны специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают инициирующий кодон АТС и прилегающие к нему последовательности. В тех случаях, когда в подходящий экспрессирующий вектор вставлены последовательность кНА8ЕСР, её инициирующий кодон и восходящие последовательности, может не быть необходимости в дополнительных сигналах контроля трансляции. Однако в тех случаях, когда вставлена только кодирующая последовательность или её часть, должны быть добавлены экзогенные (внешние) сигналы контроля транскрипции, в том числе инициирующий кодон АТС. Кроме того, инициирующий кодон должен быть в правильной рамке считывания, чтобы обеспечить транскрипцию всей вставки. Экзогенные элементы регуляции транскрипции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение - они могут быть и природными, и синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить введением энхансеров, подходящих для используемой клеточной системы (8с11агГ Ό. е! а1. //Яеки1!к РгоЬ1. Се11 ΌίίίεΓ. 1994, ν. 20, р. 125-162; Вй!пег е! а1. //Ме!Бобк ш Епхуто1. 1987, ν. 153, р. 516-544).
Кроме того, в выборе штамма клеток-хозяев могут учитываться его способность модулировать экспрессию вставленных последовательностей или осуществлять процессинг (модификацию) экспрессированного белка нужным образом. Такие модификации полипептида включают (но не ограничиваются ими) ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Посттрансляционная модификация, в которой преобразуется «предварительная» форма белка, может также быть важна для правильной вставки, сворачивания и/или функционирования. Различные линии клеток-хозяев, такие как СНО (ЭС44, ΌΧΒ11, СНО-К1), НеЬа, МОСК, 293, ^138 и др., имеют специфические клеточные структуры и характерные для них механизмы для таких посттрансляционных процессов и могут выбираться таким образом, чтобы обеспечить правильные модификацию и процессинг внедрённых чужеродных белков.
Для длительной продукции с высоким выходом рекомбинантных белков предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют кНА8ЕСР, можно трансформировать экспрессирующими векторами, содержащими вирусные области начала репликации или экзогенные элементы регуляции экспрессии и пригодный для селекции маркерный ген. После введения вектора клеткам можно дать расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед переносом их в селективные среды. Задача пригодного к селекции маркера состоит в том, чтобы придать клеткам устойчивость в селектирующих условиях, и его присутствие позволяет вырастить и отобрать клетки, которые успешно экспрессируют внедрённые последовательности. Пролиферацию устойчивых агрегатов стабильно трансформированных клеток можно получить с помощью техники культур ткани, подходящей для данного типа клеток.
Для выделения линий трансформированных клеток пригодно любое число систем селекции. Они включают (но не ограничиваются ими) гены тимидин-киназы вируса простого герпеса (\№1д1ег М. е! а1. //Се11. 1977, ν. 11, р. 223-232) и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Ьо^у I. е! а1. //Се11. 1980, ν. 22, р. 817823), которые могут быть использованы соответственно в клетках ТК или АРИТ. Как основу для селекции можно также использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам. Например, ЭНЕИ привносит устойчивость к метотрексату (^1д1ег М. е! а1. //Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А. 1980, ν. 77, р. 3567-3570); пр! придаёт устойчивость к аминогиликозидам неомицину и С-418 (Со1Ьеге-Сагарт Р. е! а1. //1. Мо1. Вю1. 1981, ν. 150, р. 1-14), а а1к или ра! обеспечивают устойчивость соответственно к хлорсульфурону и фосфинотрицин-ацетилтрансферазе (Мшту, см. выше). Были описаны и другие пригодные для селекции гены, например !грВ, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или ЫкЭ, который даёт возможность клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина (Найтап 8. Апб МиШдап И.С. //Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 1988, ν. 85, р. 8047-8051). В последнее время, благодаря использованию видимых маркеров, приобрели популярность такие маркерные системы, как антоцианины, бета-глюкуронидаза и её субстрат СИ8 и люцифераза и её субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также и для количественной оценки уровня преходящей или стабильной экспрессии белка, присущей конкретной векторной системе (ЯЬобек С.А. е! а1. //Ме!Бобк Мо1. Вю1. 1995, ν. 55, р. 121-131).
- 29 009383
Идентификация трансформантов, содержащих полинуклеотидную последовательность.
Хотя присутствие/отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что представляющий интерес ген также присутствует, наличие и экспрессию активного гена зНА8ЕСР необходимо подтверждать. Например, если последовательность зНА8ЕСР вставлена внутри последовательности маркерного гена, содержащие последовательность зНА8ЕСР рекомбинантные клетки могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В качестве альтернативы маркерный ген может быть помещён в стыке с последовательностью зНА8ЕСР под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно указывает на полноценную экспрессию тандема с последовательностью зНА8ЕСР. Свидетельство о наличии должным образом гликозилированного активного в нейтральных условиях зНА8ЕСР может быть получено на основании измерений ферментативной активности зНА8ЕСР в культуральной среде при подходящих условиях.
Очистка зНА8ЕСР.
Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью для зНА8ЕСР, можно культивировать в условиях, необходимых для экспрессии и выделения кодированного белка из клеточной культуры. Продуцируемый рекомбинантной клеткой белок предпочтительно секретируется, но он может и оставаться внутри клеток, в зависимости от нуклеотидной последовательности и/или использованного вектора. Специалистам в данной области понятно, что содержащие последовательность для ЗНА8ЕСР экспрессирующие векторы могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые способствуют прямой секреции зНА8ЕСР через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. В других рекомбинантных конструкциях последовательность для зНА8ЕСР может быть присоединена к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчит очистку растворимых белков (Кго11 Ό.Ε е! а1. //^NА Се11 Вю1. 1993, ν. 12, р. 441-453; см. дискуссию по векторам шГга, содержащим последовательности для слитых белков).
ЗНА8ЕСР может быть также экспрессирован как рекомбинантный белок с одним или более добавочными полипептидными доменами, добавленными для облегчения очистки белка. Такие облегчающие очистку домены включают (но не ограничиваются ими) хелатирующие металл пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые позволяют вести очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые позволяют вести очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе РЬАС8 с удлинением и аффинной очисткой (1ттипех Согр., 8еа111е. νηδίι.). Вставка последовательностей для расщепляемого линкера, такого, как фактор ХА или энтерокиназа (Iиν^!^одеи, 8ап О1едо, СайГ.) между последовательностями для обеспечивающего очистку домена и зНА8ЕСР, полезна для облегчения очистки. Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию содержащего зНА8ЕСР слитого белка и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 остатков гистидина, за которыми следуют последовательности для тиоредоксинового и энтерокиназного сайтов расщепления. Остатки гистидина обеспечивают очистку на 1М1АС (иптоЫНхеб те!а1 юн аГГйШу сйгота!одгарйу, аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла, описанная Рога!й е! а1. //Рго!ет Ехргеззюп апб РипПсайоп. 1992, ν. 3, р. 263-281), тогда как энтерокиназный сайт расщепления представляет способ очистки хемокина из слитого белка.
Кроме продукции на основе рекомбинантной техники, фрагменты зНА8ЕСР можно получать прямым пептидным синтезом с помощью твердофазного метода (см. 81е\\'аг1 е! а1. //8ойб-Рйазе Рерйбе 8уп!йез15. №.Н. Ргеетап Со. 8ап Ргапазсо, 1969; МетГ1е1б 1. //1. Ат. Сйет. 8ос. 1963, ν. 85. р. 2149-2154). Синтез белка т νίΙΐΌ может быть осуществлён как вручную, так и в автоматическом режиме. Автоматизированный синтез может быть осуществлён, например, в пептидном синтезаторе Аррйеб Вю5уз!ет5 431А (Регкт Е1тег, Роз!ег Сйу, СайГ.) в соответствии с инструкциями производителя. Различные фрагменты зНА8ЕСР можно синтезировать химически по отдельности и затем объединить с помощью химических методов, получая молекулу полной длины.
Экспрессирующие векторы, содержащие кодирующие последовательности или их части для полипептида ЗНА8ЕСР, получают, например, субклонированием кодирующих частей в сайт расщепления рестриктазой ЕсоВ1 каждого из трёх векторов РСЕХ (экспрессирующие векторы для глутатион 8-трансферазы (8тйй апб ^ойи5ои //Сепе. 1988, ν. 7, р. 31-40)). Это позволяет экспрессировать продукты в правильной рамке считывания. Приводимые для примера векторы и системы для экспрессии гиалуронидазных доменов полипептидов зНА8ЕСР включают хорошо известные векторы РюЫа (их можно приобрести, например, в ^Игодещ 8ап П1едо, СА), в особенности те, которые сконструированы для секреции кодируемых белков. Белок может быть также экспрессирован в цитоплазме, например в тельцах включения. Один приводимый для примера вектор описан в примерах.
Плазмиды для трансформации клеток Е. сой включают, например, экспрессирующие векторы рЕТ (см. патент США № 4952496), поставляемые фирмой Nоνадеи, Мабкоп, VI (см. также описание этой системы в литературе, опубликованной Nоνадеи).
Такие плазмиды включают рЕТ 11а, содержащую промотор Т7-1ас, терминатор Т7, индуцибельный оператор 1ас Е. сой и ген 1ас-репрессора; рЕТ 12А-С, содержащую промотор Т7, терминатор Т7 и сигнал секреции ОМВТ Е. сой; и рЕТ 15В и рЕТ 19В (Nоνадеи, Мабкоп, VI), содержащие лидерную последовательность Н15-Тад для использования при очистке на колонке Н15 и тромбиновый сайт расщепления, ко
- 30 009383 торый обеспечивает расщепление после очистки на колонке, промотор Т7-1ас и терминатор Т7.
Векторы вводят в клетки-хозяева, такие как клетки Р1сЫа, и бактериальные клетки, такие как Е. со11, и в них экспрессируются белки. Приводимые для примера штаммы клеток Р1сЫа включают, например, С8115. Приводимые для примера бактериальные клетки-хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей РНК-полимеразу Т7, функционально присоединённые к индуцибельному промотору, такому как промотор БасИУ (см. патент США № 4952496). Такие хозяева включают (но этим не ограничиваются) лизогенный штамм Е. со11 ВЬ21 (ΌΕ3).
Домены, производные и аналоги кНА8БСР могут быть произведены различными методами, известными в данной области. Например, как только идентифицирована рекомбинантная клетка, экспрессирующая полипептид кНА8БСР или его домен, фрагмент или производное, продукт индивидуального гена может быть выделен и проанализирован. Это достигается методами анализа, основанными на физических и/или функциональных свойствах белка, включая (но не ограничиваясь ими) введение в продукт радиоактивной метки с последующим анализом с помощью электрофореза в геле, иммунологический анализ, сшивку меченого продукта с маркером и анализ протеолитической активности.
Полипептиды кНА8БСР могут быть выделены (либо из природных источников, либо из рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих комплексы белков) и проанализированы стандартными методами, известными в данной области, включая (но не ограничиваясь ими) колоночную хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гельпроникающую, обратнофазную, высокого давления и быстрой подвижности белков в жидкости), дифференциальное центрифугирование, дифференциальное осаждение или любой другой стандартный метод, применяемый для очистки белков.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кНА8БСР можно очистить до гомогенности из химически определённой культуральной среды трансфицированных ΗΖ24 и селектированных на фоне метатрексата клеток ЭС44 путём
1) диафильтрации с тангенциальным потоком,
2) связывания и элюирования при анионообменной хроматографии,
3) хроматографии в потоке на фенилсефарозе,
4) связывания и элюирования при хроматографии на оксиапатите.
Функциональные свойства могут быть определены с помощью любого подходящего анализа, известного в данной области.
В качестве альтернативы, как только идентифицированы полипептид кНАЗНСР, или его домен, или производное, аминокислотная последовательность белка может быть выведена из нуклеотидной последовательности гена, их кодирующего. В итоге белок, или его домен, или производное можно синтезировать известными в данной области стандартными химическими методами (см., например, НипкарШег е! а1. //книге. 1984, ν. 310, р. 105-111) с последующим гликозилированием т νίΙΐΌ.
Манипуляции с последовательностями полипептида кНАЗБСР могут быть выполнены на уровне белка. В настоящей работе рассматриваются также белки полипептида кНАЗНСР, его домены, производные или аналоги, или их фрагменты, избирательно модифицированные в ходе или после трансляции, например путём гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, ПЭГилирования, модификации путём введения известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или иного клеточного лиганда.
Любую из множества химических модификаций можно осуществить известными методами, включающими (но не ограниченными этим) специфическое химическое расщепление цианоген-бромидом, трипсином, химотрипсином, папаином, У8, NаΒΗ4, ацетилирование, формилирование, окисление, восстановление, метаболический синтез в присутствии туникамицина или модификацию другими подобными агентами.
Кроме того, домены, аналоги и производные полипептида кНАЗБСР могут быть синтезированы химически. Например, пептид, соответствующий части полипептида кНАЗНСР, включающий требуемый домен или направляющий требуемую активность т уНго, может быть синтезирован с помощью пептидного синтезатора.
Более того, при необходимости, в полипептидную последовательность кНАЗБСР могут быть введены неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот в виде замещений или добавок. Неклассические аминокислоты включают (но не ограничиваются ими) Ό-изомеры обычных аминокислот, α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту (АЬи), 2-аминомасляную кислоту (ε-АЬи), 6-аминогексанойную кислоту (ε-Айх), 2-аминоизомасляную кислоту (А1Ь), 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, оксипролин, саркозин, ситруллин, цистеиновую кислоту, третбутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтор-аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как Са-метиламинокислоты, №-метиламинокислоты и, вообще, аналоги аминокислот. Кроме того, аминокислоты могут быть Ό (правовращающими) или Ь (левовращающими).
В тех случаях, когда ожидается, что природные продукты являются мутантными, или когда они выделены из новых видов, аминокислотную последовательность полипептида кНАЗНСР, выделенного из
- 31 009383 природного источника, а также экспрессированного ш νίίτο, или экспрессированного с синтезированных экспрессирующих векторов ш νίνο или ш νίίτο, можно определить из анализа последовательности ДНК или, альтернативно, прямым секвенированием выделенного белка. Такой анализ может быть произведён секвенированием вручную или с помощью автоматического секвенатора аминокислот.
Модификации.
В настоящей работе рассматриваются различные модификации полипептидов и доменов зНА8ЕОР. Кодирующую зНА8ЕОР молекулу нуклеиновой кислоты можно модифицировать на основе любой из многочисленных стратегий, известных в данной области (8ащЬ^οοк еί а1. ΜοΕαιΕπ С^пт^, А ^аЬο^аίο^у Мапиа1, 2-е изд. СоН 8рппд На^т ^аЬο^аίο^у Ргезз, С'о1б 8рппд На^т, №\ν ΥοιΈ, 1989). Последовательности могут быть расщеплены в подходящих местах с помощью рестрикционной эндонуклеазы (эндонуклеаз) с последующей, если это требуется, ферментативной модификацией, выделены и лигированы 1п νίίτο. При получении гена, кодирующего домен, производное или аналог зНА8ЕОР, следует озаботиться тем, чтобы обеспечить в модифицированном гене - в той его области, которая кодирует требуемую активность, сохранение исходной трансляционной рамки считывания, не прерванной стопсигналами трансляции.
Кроме того, кодирующие зНА8ЕОР молекулы нуклеиновой кислоты могут быть мутированы ш νίίτο или ш νίνο, чтобы создать и/или разрушить последовательности, необходимые для инициации или терминации трансляции, или чтобы получить вариации в кодирующей области, и/или сформировать новые сайты для рестрикционных эндонуклеаз, или разрушить предсуществующие сайты, чтобы облегчить дальнейшую модификацию ш νίίτο. Также рассматриваются, как в настоящей работе описано, мутеины с изменениями первичной структуры, такими как замещения остатков Суз и удаление или добавление сайтов гликозилирования; зНА8ЕОР с последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1 имеет семь сайтов потенциального гликозилирования. Такие мутации могут быть получены с помощью любой известной в данной области техники мутагенеза, включая (но не ограничиваясь ими) химический мутагенез, сайтспецифический мутагенез ш νίίτο (Ниίсй^η8οη еί а1. //ί. Βίο1. Сйет. 1978, ν. 253, р. 6551-6558) и использование линкеров ТАВЕ (Рйаттас1а). В одном из осуществлений, например, полипептид зНА8ЕОР или его домен модифицирован так, чтобы включить флуоресцентную метку. В других конкретных осуществлениях полипептид зНА8ЕОР модифицирован так, чтобы получить гетеробифункциональный агент, причём такой гетеробифункциональный агент может быть использован для сшивания участников образования комплекса.
Р. Создание функционально активного гликозилированного зНА8ЕОР с Ν-связанными фрагментами молекулы сахара
Для создания каталитически стабильного белка необходим должным образом Ν-гликозилированный зНА8ЕОР человека. Гликозилирование зНА8ЕОР с Ν-связью можно осуществить различными способами. зНА8ЕОР можно гликозилировать введением кодирующих зНА8ЕОР нуклеиновых кислот в клетки эукариотического происхождения, способные осуществлять правильное гликозилирование с Ν-связыванием, или в качестве альтернативы приведением полипептида зНА8ЕОР в контакт с бесклеточными экстрактами или очищенными ферментами, способными вставлять требуемые Ν-связанные фрагменты молекулы сахара.
Селекция экспрессирующей системы.
Системы экспрессии эукариотических клеток различаются по степени и типу гликозилирования, которое они вводят в эктопический (смещенный) экспрессированный полипептид. Клетки СНО, например, с высокой эффективностью вводят Ν-связанное гликозилирование в активный полипептид зНА8ЕОР.
Дополнительные эукариотические системы экспрессии, вводящие несвязанное гликозилирование с созданием продукта - функционального зНА8ЕОР, можно тестировать, вводя в указанные клетки экспрессирующую плазмиду с последовательностью для человеческого зНА8ЕОР и определяя активность в нейтральных условиях. Надлежащее Ν-связанное гликозилирование можно обнаружить с помощью анализа методом РАСЕ высвобожденных РНСазой олигосахаридов. Далее в настоящей работе предлагаются параметры (профили) гликозилирования каталитически активных зНА8ЕОР. Проверить гликозилирование можно также, обрабатывая зНА8ЕОР из указанных клеток РНСазой Р или выращивая такие клетки на среде с туникамицином после введения кодирующих зНА8ЕОР нуклеиновых кислот.
Ν-гликозилирование полипептида зНА8ЕОР ш νίίτο.
Полипептид зНА8ЕОР может быть Ν-гликозилирован путём контакта полипептида зНА8ЕОР с бесклеточным экстрактом (например, с мембранами микросом собак), содержащим активность, способную переносить Ν-связанные сахара на полипептид зНА8ЕОР, или в коммерчески доступной системе сопряжённых транскрипции и трансляции (Рютена, Μаб^зοη, VI).
Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, вне зависимости от того, является ли сахарид на редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с принятой номенклатурой олигосахариды изображены в настоящей работе с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные в настоящей работе олигосахариды приведены с названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Оа1),
- 32 009383 за которым следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), связь в кольце, положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в связи, и затем название или аббревиатура редуцирующего сахарида (например, С1сNАс). Связь между двумя сахарами может быть обозначена, например, как 2, 3, 2^.3 или (2, 3). Каждый сахарид является пиранозой.
Термин «Ν-связанный фрагмент молекулы сахара», как он использован в настоящей работе, относится к олигосахариду, присоединённому к кНАЗЕСР посредством амидного азота в остатках Акп. Ν-связанные олигосахариды подразделяются на несколько главных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфированные), которые все имеют сердцевины (Мап)3,-С1сНЛс-СЕсНЛс-. присоединённые через атом амидного азота в остатках Акп, находящихся в пределах последовательностей -АкпХаа-ТЬг/Зег- (где Хаа - это не Рго). Часто сайты с Ν-связью косвенно различимы по появлению «пустого» цикла при секвенировании. Позитивная идентификация может быть осуществлена после высвобождения олигосахарида ферментом РNСазой Б, которая превращает гликозилированный Акп в Акр. После удаления РСNазы Б Ν-связанные олигосахариды могут быть очищены с помощью хроматографии на биогеле Р-6, а олигосахаридный пул подвергается препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (ЫдЬ рН ашоп ехсНапде сЬгота1одгарЬу, НРАЕС) (То\упкепй е1 а1. //Апа1. ВюсЬет. 1989, ν. 182, р. 1-8). С помощью НРАЕС можно разделить некоторые изомеры олигосахаридов. На хроматограммах НРАЕС остатки фукозы смещаются к более раннему элюированию, тогда как остатки дополнительной сиаловой кислоты выходят при большем времени элюирования. Путём сопутствующей обработки гликопротеинов с известной олигосахаридной структурой (например, фетуин крупного рогатого скота, кислый гликопротеин α-1, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) можно улучшить идентификацию олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды можно охарактеризовать сочетанием анализов состава и метилирующих связей (УаедЬе е1 а1. //СагЬоЬубг. Век. 1983, ν. 123, р.281-304), различая аномерные конфигурации с помощью спектроскопии ЯМР (Уап На1Ьеек //Ме11юйк ЕпхутоЬ 1993, ν. 230).
В качестве альтернативы можно идентифицировать олигосахариды с помощью соединённого с флуоресценцией электрофореза углеводов (Дцогексепсе акк1к!еН сагЬоЬуйга1е е1ес1горЬогек1к, БАСЕ) (см. Са11е^аей е1 а1. //С1усоЬю1оду. 2001, ν. 11, р. 275-281).
С. Детектирование и получение характеристик Ν-связанных фрагментов молекулы сахара на кНАЗЕСР
Определение того, действительно ли белок гликозилирован является первым этапом в анализе гликана гликопротеина. В качестве конечного этапа перед секвенированием белка наилучшим методом стал электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ЗОЗ-РАСЕ). При ЗЭЗ-РАСЕ гликозилированные белки часто движутся как размытые зоны. Считают, что существенное уменьшение ширины зоны и изменение положения зоны после обработки пептид-Ы4-(№ацетил-Оглюкозаминил)аспарагин амидазой (РNСазой Б) является хорошей диагностикой Ν-связанного гликозилирования. Если преобладают другие типы гликозилирования, необходимо использовать другие подходы. Методы блотирования (отпечатывания) с использованием лектинов представляют собой подход, не зависящий от класса гликозилирования (Ν или О). Лектины (связывающие углеводы белки) из разных растительных тканей имеют и высокое сродство, и узкую специфичность по отношению к широкому кругу определённых сахарных эпитопов, обнаруженных в гликанах гликопротеинов (Ситттдк ΚΌ. //Ме11юйк ш ЕпхутоЬ 1994, ν. 230, р. 66-86). Если они конъюгированы с биотином или дигоксигенином, их легко идентифицировать на мембранных отпечатках (блотах) по колориметрической реакции с использованием антител к авидину или дигоксигенину, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Наке1Ьеск е1 а1. //Ме11юйк ш Мо1. Вю1. 1993, ν. 14, р. 161-173); этот метод аналогичен реакциям с конъюгатами вторичные антитела-щелочная фосфатаза, применяемым при вестерн-блотировании. Скрининг с набором лектинов, имеющих хорошо установленную специфичность, может дать важную информацию об углеводной добавке в гликопротеине. Важно, что интенсивность окраски достаточно высока, так что на мембранном отпечатке после ЗЭЗ-РАСЕ легко обнаруживаются 10-50 нг гликопротеина. Хотя лектины проявляют очень высокое сродство к соответствующим им лигандам, некоторые из них обнаруживают значительную склонность соединяться со структурно родственными эпитопами. Поэтому важно при выборе набора лектинов тщательно учитывать возможность перекрёстной реакционности и применять те лектины, у которых наиболее высока способность отличать комплексные, гибридные и содержащие большое количество маннозы Ν-связанные гликаны от О-связанных структур.
Анализ моносахаридов можно также использовать для того, чтобы определить, гликозилирован ли кНАЗЕСР, и он, так же, как в случае анализа с лектинами, даёт дополнительную информацию о структурных особенностях. Количественный анализ состава моносахаридов:
ί) идентифицирует гликозилированные белки, ίί) даёт молярное отношение индивидуальных сахаров к белку, ϊϊΐ) позволяет предположить, в ряде случаев, наличие различных олигосахаридных классов, ίν) является первым этапом в выборе стратегии установления структуры,
ν) даёт меру соответствия продукции задачам терапии с помощью рекомбинантного гликопротеина.
- 33 009383
В последние годы для определения моносахаридного состава широко применяли анионообменную хроматографию при высоком рН с импульсным амперометрическим детектированием (Ыдй-рН οηίοηехсНанде сй^οтаΐοд^арйу \νί11ι рнЕей атреготейлс Йе1ес1ющ НРАЕС-РАЭ) (Το\νη^ι^ е! а1. //Саг^НуЙ!^ Ληαΐλ'δίδ: Н^дй-ре^Гο^таηсе 1й|шй сНготаЮдгарНу аий сарШагу е1ес1гор1юге515. Под ред. 2.Е.1. Кака. 1995, р. 181-209). Совсем недавно были предложены методы с введением флуорофорной метки, многие из них уже доступны в виде наборов. Отчётливым преимуществом флуоресцентных методов является повышение чувствительности (в 50 раз). Один потенциальный недостаток состоит в том, что различные моносахариды могут иметь различную чувствительность к флурофору в реакции связывания - либо в гидролизате, либо во внешней стандартной смеси. Однако этот подход привлекателен из-за повышения чувствительности и способности идентифицировать в малой части общего количества имеющегося гликопротеина, какие моносахариды в нём присутствуют, а также перспективы дальнейшего повышения чувствительности при индукции флуоресценции лазером.
Анализ состава моносахаридов в малых количествах &НА8ЕСР лучше всего проводить на мембранах РУЭБ (Р8О) после либо электроблотирования (^ейζйаий1е^ е! а1. //ί. ΒίοΙ. СНет. 1993, ν. 268, р. 5121-5130), либо (если предстоит анализировать меньшие аликвоты) на точечных блотах (ώοΐ Μοΐδ). РУЭБ - это идеальный матрикс для анализа углеводов, поскольку ни моносахариды, ни олигосахариды не связываются с мембраной, когда они высвобождены кислотным или ферментативным гидролизом.
Анализ методом РАСЕ - это эффективный способ определения параметров гликозилирования &НА8ЕСР. Одним из таких механизмов является РАСЕ® - определение профилей Ν-связанных олигосахаридов (Рго/уше) с помощью 30% олигосахаридных гелей. Для детектирования параметров гликозилирования &НА8ЕСР можно использовать олигосахариды, отщепленные от 100 мкг гликопротеинов ферментативным расщеплением Ν-гликаназой (известна также как РN^аза), меченые флуорофором АКТС и разделённые электрофорезом. Относительные положения зон олигосахаридов определяют параллельным прогоном образца и разбавлений образца со стандартной смесью олигосахаридов, дающей после электрофореза так называемую «лестницу» зон, где определённое пройденное расстояние соответствует определённой степени полимеризации (СП).
H. Способы скрининга для идентификации соединений, модулирующих активность &НА8ЕСР
В настоящей работе приведены для примера и описаны несколько типов анализа. Понятно, что в других анализах могут быть использованы гиалуронидазные домены. В настоящей работе показано, однако, что гиалуронидазные домены проявляют каталитическую активность. Сами по себе они идеальны для анализов скрининга ίη νίίτο. Они могут быть также использованы в анализах связывания.
Предполагается использование зимогенов &НА8ЕСР полной длины, активированных ферментов и гиалуронидазных доменов в любых известных специалистам в данной области анализах скрининга, в том числе тех, которые предлагаются в настоящей работе. Поэтому подразумевается, что в дальнейшем описании, если оно ориентировано на анализ гиалуронидазы, применяется использование одноцепочечного гиалуронидазного домена или каталитически активной части любой гиалуронидазы, включая &НА8ЕСР. В настоящей работе предлагаются и другие способы анализа, такие как способы анализа связывания, в особенности для использования с 5НА8ЕСР, включая его любые варианты, такие как его варианты, полученные сплайсингом.
I. Анализы каталитической активности для идентификации агентов, модулирующих гиалуронидазную активность белка &НА8ЕСР.
В настоящей работе предлагаются способы идентификации модулятора каталитической активности 5НА8ЕСР, в особенности одноцепочечного гиалуронидазного домена или его каталитически активной части. Способы могут быть осуществлены следующим образом: приведение &НА8ЕСР - зимогена полной длины или активной формы, и в особенности его одноцепочечного домена, в контакт с субстратом для 5НА8ЕСР в присутствии испытуемого вещества и определение протеолиза субстрата, причём оценивается активность &НА8ЕСР, которая сравнивается с активностью контроля.
Например, контролем может быть активность &НА8ЕСР, определяемая путём контактирования 5НА8ЕСР, в том числе зимогена полной длины или активированной формы, и в особенности его одноцепочечного домена, с субстратом для &НА8ЕСР и определения протеолиза субстрата, причём оценивается активность &НА8ЕСР. Сравниваются результаты, полученные в присутствии и в отсутствие испытуемых соединений. Разница в активности указывает на то, что испытуемое вещество модулирует активность &НА8ЕСР. Активаторы расщепления под действием &НА8ЕСР также имеются в виду; такие анализы обсуждаются ниже.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения множество испытуемых соединений подвергаются просмотру (скринингу) одновременно в описанном выше способе скрининга. В другом осуществлении 5НА8ЕСР выделен из клетки-мишени как средство для последующей идентификации агентов, которые потенциально специфичны к клетке-мишени.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения испытуемым соединением является лекарственное соединение, и в соответствии с этим разница в активности &НА8ЕСР, измеренной в присутствии и в отсутствие испытуемого соединения указывает на то, что клетка-мишень реагирует на действие лекарственного соединения.
- 34 009383
Один из способов включает этапы (а) контактирования полипептида кНАБЕСР или его гиалуронидазного домена с одним или с множеством из испытуемых соединений в условиях, способствующих взаимодействию между лигандом и соединениями, и (Ь) идентификации одного или более соединений из множества, которое(ые) специфически связывается(ются) с лигандом.
Другой предлагаемый в настоящей работе способ включает этапы (а) контактирования полипептида кНАБЕСР или его гиалуронидазного домена с субстратом для полипептида кНАБЕСР и определения разрушения субстрата, посредством чего оценивается активность полипептида кНАБЕСР; (Ь) контактирования полипептида кНАБЕСР с субстратом для полипептида кНАБЕСР в присутствии испытуемого вещества и определения степени разрушения субстрата, посредством чего оценивается активность полипептида кНАБЕСР; и (с) сравнения активности полипептида кНАБЕСР, оцененной на этапах (а) и (Ь), причём если активность, измеренная на этапе (а), отличается от активности, измеренной на этапе (Ь), это означает, что испытуемое соединение модулирует активность полипептида кНАБЕСР.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения множество испытуемых соединений подвергаются скринингу одновременно. При сравнении активности полипептида кНАБЕСР в присутствии и в отсутствие испытуемого вещества для оценки того, является ли испытуемое вещество модулятором активности полипептида кНАБЕСР, нет необходимости измерять активность параллельно, хотя такие параллельные измерения являются типичными. Можно измерить активность полипептида кНАБЕСР в один момент времени и сравнить измеренную активность с установленной ранее величиной активности полипептида кНАБЕСР.
Например, можно измерить активность полипептида кНАБЕСР в присутствии испытуемого вещества и сравнить с полученным ранее значением активности полипептида кНАБЕСР, измеренным ранее в отсутствие испытуемого вещества, и наоборот. Для этого, например, активность полипептида кНАБЕСР может быть указана во вкладыше или инструкции, прилагаемым к набору для проведения анализа.
Способы отбора субстратов для конкретного кНАБЕСР описаны в примерах, и конкретные анализы гиалуронидазы приведены в качестве примеров.
Предлагаются наборы и содержащие наборы комплекты, по усмотрению включающие инструкции для проведения анализов. Наборы включают полипептид кНАБЕСР и субстрат для полипептида кНАБЕСР, подлежащего анализу, и, по усмотрению, реагенты для определения протеолиза субстрата. Субстраты, которыми могут быть хромогенные или флуорогенные молекулы, в том числе гликозаминогликаны, подвергаемые протеолизу конкретным полипептидом кНАБЕСР, могут быть идентифицированы эмпирически путём тестирования способности полипептида кНАБЕСР расщеплять испытуемый субстрат. Определяют субстраты, расщепляемые наиболее эффективно, т. е. при наименьшей концентрации и/или с наибольшей скоростью (или при требуемых условиях).
Дополнительно в настоящей работе предлагается комплект, содержащий описанный выше набор. Комплект по усмотрению может включать инструкции для идентификации модулятора активности полипептида кНАБЕСР.
2. Анализ связывания.
В настоящей работе предлагаются также способы идентификации и выделения агентов, конкретнее соединений, связывающихся с кНАБЕСР. Способы анализа разработаны для того, чтобы идентифицировать агенты, которые связываются с выделенным гиалуронидазным доменом (или иным, чем полипептид кНАБЕСР, белком, содержащим гиалуронидазный домен полипептида кНАБЕСР) и с активированной формой, в том числе с активированной формой, полученной из зимогена полной длины или из удлинённого гиалуронидазного домена. Идентифицированные соединения являются кандидатами или средствами для идентификации соединений для лечения расстройств и заболеваний, связанных с нарушением гиалуронидазной активности. Использованные в данных способах полипептиды кНАБЕСР включают любой полипептид кНАБЕСР, как он определён в настоящей работе, в том числе одноцепочечный гиалуронидазный домен кНАБЕСР или его протеолитически активную часть.
В настоящей работе предусматриваются разнообразные способы. Эти способы могут быть осуществлены либо в реакциях в растворе, либо в реакциях в твёрдой фазе, в которых полипептид(ы) кНАБЕСР или его (их) гиалуронидазный(ые) домен(ы) связан(ы) (либо непосредственно, либо через мостик) с твёрдым носителем. Анализы скрининга описаны в примерах и использованы для идентификации соединений-кандидатов.
Для установленных в настоящей работе задач все описанные выше анализы связывания предлагаются для кНАБЕСР.
В настоящей работе предусматриваются способы идентификации агента, такого как соединение, которое специфически связывается с одноцепочечным гиалуронидазным доменом кНАБЕСР, активированным кНАБЕСР полной длины, или его двухцепочечным гиалуронидазным доменом. Способ может быть осуществлён путём (а) контактирования кНАБЕСР с одним испытуемым агентом или с множеством испытуемых агентов в условиях, способствующих связыванию между кНАБЕСР и агентом; и (Ь) идентификации одного или более агентов в пределах множества, специфически связывающегося(ихся) с кНАБЕСР.
- 35 009383
Например, при практическом применении таких способов полипептид &НА8ЕСР смешивают с потенциальным партнёром в связывании или с фракцией клеток в условиях, обеспечивающих ассоциацию потенциально связывающихся партнёров с полипептидом. После смешивания пептиды, полипептиды, белки или другие молекулы, которые оказались связанными с кНА8ЕСР, отделяют от смеси. Затем связывающийся партнёр, который связался с кНА8ЕСР, может быть удалён и подвергнут дальнейшему анализу. Для того чтобы идентифицировать и выделить связывающегося партнёра, может быть использован полный белок, например полный раскрытый в настоящей работе белок с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1. В качестве альтернативы может быть использован фрагмент белка.
Разнообразные методы могут быть использованы для получения клеточных экстрактов или биологических жидкостей, таких как кровь, сыворотка, моча, пот, синовиальная жидкость, цереброспинальная жидкость и другие подобные жидкости.
Например, клетки могут быть разрушены (лизированы) с использованием либо физических, либо химических методов лизирования. Примеры физических методов лизирования включают (но не ограничиваются ими) обработку ультразвуком и механическое иссечение. Примеры способов химического лизиса включают (но не ограничиваются ими) лизис детергентами и лизис ферментами. Опытный специалист в данной области может легко адаптировать методы получения клеточных экстрактов для получения экстрактов, используемых в предлагаемых способах.
Как только клеточный экстракт приготовлен, экстракт смешивают с кНА8ЕСР в условиях, в которых может произойти ассоциация белка со связывающимся партнёром. Могут быть использованы разнообразные условия, в том числе условия, напоминающие условия, имеющиеся в цитоплазме клеток человека или в биологической жидкости, такой как кровь. Параметры, такие как осмолярность, рН, температура и использованная концентрация клеточного экстракта, можно варьировать, чтобы оптимизировать ассоциацию белка со связывающимся партнёром. Точно также известны методы выделения представляющих интерес молекул из биологических жидкостей.
После смешивания при подходящих условиях комплекс связавшихся партнёров отделяют от смеси. Для разделения смеси могут быть применены разнообразные методы. Например, может быть произведена иммунопреципитация (иммуноосаждение) комплекса связавшихся партнёров с помощью антител, специфичных к кНА8ЕСР. В качестве альтернативы могут быть применены стандартные химические методы разделения, такие как хроматография и седиментация (скоростная или в градиенте плотности).
После удаления присутствующих в экстракте не принявших участия в ассоциации клеточных компонентов связавшийся партнёр может быть диссоциирован из комплекса с помощью общепринятых методов. Например, диссоциацию можно осуществить, изменяя в смеси концентрацию соли или рН.
Для того чтобы помочь в отделении ассоциированных пар связывающихся партнёров от смешанного экстракта, кНА8ЕСР можно иммобилизовать на твердофазном носителе. Например, белок может быть прикреплён к нитроцеллюлозному матриксу или к акриловым гранулам. Прикрепление белка или его фрагмента к твердофазному носителю способствует отделению пар пептид/связывающийся партнёр от других компонентов, находящихся в экстракте. Идентифицированными связывающимися партнёрами могут быть либо индивидуальный белок, либо комплекс, образованный двумя или более белками.
В качестве альтернативы молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие одноцепочечные гиалуронидазы, могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе. Дрожжевая двухгибридная система может быть применена для идентификации других пар белковых партнёров и может быть легко адаптирована к применению описанных в настоящей работе молекул нуклеиновой кислоты.
В другом способе анализа связывания ίη νίίτο, в особенности для &НА8ЕСР, использована смесь полипептидов, которая содержит, по меньшей мере, каталитический домен одного из этих белков и один или более из потенциально связывающихся мишеней или субстратов. После инкубирования смеси при подходящих условиях оценивают способность &НА8ЕСР или его полипептидного фрагмента, содержащего каталитический домен, связываться или взаимодействовать с потенциальным субстратом. Для бесклеточных анализов связывания один из компонентов включает пригодную для обнаружения метку или соединён с ней. Метка может обеспечивать прямое обнаружение (детектирование), например радиоактивная метка, люминесцентная метка, оптическая или электронная плотность и т.д., или опосредованное обнаружение, как в случае эпитопной метки, фермента и т. д. Для обнаружения метки могут быть применены разнообразные способы, в зависимости от природы метки и других подлежащих анализу компонентов. Например, метку можно обнаруживать в связанном с твердофазным субстратом состоянии или же часть связанного комплекса, содержащую метку, можно отделить от твердофазного субстрата и после этого обнаруживать метку.
3. Обнаружение переноса сигнала.
&НА8ЕСР, являющийся закреплённым (заякоренным) в мембране белком, может прямо или косвенно участвовать в передаче сигнала, либо прямо - как рецептор клеточной поверхности, либо косвенно путём активации белков (таких, как предростовые факторы, которые могут инициировать передачу сигнала).
Кроме того, секретированный &НА8ЕСР, такой как растворимый домен &НА8ЕСР, описанный последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 4, может участвовать в передаче сигнала либо прямо - связываясь или
- 36 009383 взаимодействуя с рецептором клеточной поверхности, либо косвенно - путём активации белков (таких, как предростовые факторы, которые могут инициировать передачу сигнала). Методы анализа для оценки передачи сигнала хорошо известны специалистам в данной области и могут быть адаптированы для применения к полипептиду кНА8ЕСР.
Предлагаются способы анализа для идентификации агентов, воздействующих на передачу сигнала или изменяющих передачу сигнала, в чём они участвуют прямо или косвенно, как, например, путём активации &НА8ЕСР стимулирующего рост фактора, в особенности полипептидом &НА8ЕСР полной длины или его частью, достаточной для заякоривания внеклеточного домена или его функциональной части на клеточной поверхности. Такие способы анализа включают, например, анализ на основе транскрипции, в котором оценивается модуляция передаваемого сигнала путём детектирования влияния на экспрессию репортерного гена (см., например, патент США № 5436128).
4. Способы идентификации агентов, модулирующих экспрессию кодирующей кНА8ЕСР нуклеиновой кислоты.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способы идентификации агентов, модулирующих экспрессию кодирующей кНА8ЕСР нуклеиновой кислоты. В таких анализах используются любые доступные средства мониторинга изменений в уровне экспрессии кодирующих КНА8ЕСР нуклеиновых кислот.
Для мониторинга способности агента модулировать экспрессию кодирующей &НА8ЕСР нуклеиновой кислоты могут быть использованы различные виды анализа. Например, можно проводить прямой мониторинг экспрессии мРНК путём гибридизации с нуклеиновыми кислотами. Для детектирования агентов, модулирующих экспрессию кНА8ЕСР, могут быть также применены ферментативные анализы, как они описаны в настоящей работе.
Линии клеток повергают воздействию подлежащих исследованию агентов при подходящих условиях и длительности и выделяют стандартными методами общую РНК или мРНК (см., например, 8атЬгоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2-е изд. СоИ 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, №\ν Уогк, 1989). Для обнаружения различий в уровнях экспрессии РНК в клетках, экспонированных с агентом, и контрольных клетках из нуклеиновых кислот могут быть приготовлены зонды. Обычно, хотя и не обязательно, конструируют зонды, гибридизирующиеся только с целевыми нуклеиновыми кислотами в условиях высокой степени строгости. В соответствии с этим строгость условий анализа определяет степень комплементарности, которая должна существовать между двумя нитями нуклеиновой кислоты, чтобы они образовали гибрид. Степень строгости следует выбирать так, чтобы максимизировать разницу в стабильности между гибридом зонд/мишень и возможными гибридами зонд/не мишень.
Например, Ν- и С-концевые фрагменты &НА8ЕСР могут быть экспрессированы в бактериях и использованы для поиска белков, связывающихся с этими фрагментами. Для использования в качестве субстрата могут быть приготовлены слитые белки, такие как слияния метки Н1к или С8Т с Ν- или С-концевыми областями &НА8ЕСР. Эти слитые белки могут быть пришиты, например, к гранулам глутатион-сефарозы и затем подвергнуты воздействию клеточных лизатов или биологических жидкостей. Перед лизисом клетки или биологические жидкости можно обработать агентом-кандидатом, который может модулировать &НА8ЕСР, или белками, которые взаимодействуют с его доменами. Белки лизата, связывающиеся со слитыми белками, могут быть разделены 8П8-РАСЕ, выделены и идентифицированы методами белкового секвенирования или масс-спектроскопии, известными в данной области.
Антитела-зонды готовят, иммунизируя подходящих млекопитающих-хозяев в подходящем иммунизационном режиме, используя пептиды, полипептиды или белки, если они имеют достаточную длину (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более последовательных аминокислот полипептида &НА8ЕСР, или конъюгируя их с подходящими носителями, чтобы повысить их иммуногенность. Методы приготовления иммуногенных конъюгатов с носителями, такими как бычий сывороточный альбумин (БСА), гемоцианин затворного отверстия моллюска (ГЗМ) или другие белки-носители, хорошо известны в данной области. В некоторых случаях может оказаться эффективным прямое конъюгирование с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в других случаях для обеспечения доступности гаптена могут потребоваться сшивающие реагенты, такие как поставляемые фирмой Р1егсе Сйетка1 Со., КоскГогб, Ш. Гаптеновые пептиды могут быть удлинены на амино- или карбоксильном конце остатком Сук или же остатки цистеина могут быть вкраплены в них, например, чтобы улучшить связывание с носителем.
Введение иммуногена обычно производят путём инъекции в течение подходящего периода времени и с использованием подходящих адъювантов, как это обычно принято в данной области. В ходе графика иммунизации определяют титры антител, чтобы удостовериться в достаточном образовании антител.
Антитела к пептидам могут быть получены с помощью синтетических пептидов, соответствующих, например, аминокислотам карбоксильного конца &НА8ЕСР.
Синтетические пептиды могут быть короткими, например длиной 1-3 аминокислоты, обычно длиной по меньшей мере 4 или более аминокислотных остатка. Пептиды могут быть спарены с ГЗМ с помощью стандартных методов и введены для иммунизации животным, таким как кролики или копытные
- 37 009383 животные. Затем поликлональные антитела могут быть очищены, например, с помощью гранул АсДдс1, содержащих ковалентно связанный пептид.
Хотя полученные таким путём поликлональные антисыворотки могут быть пригодными для некоторых применений, для фармацевтических композиций используют, как правило, моноклональные антитела. Линии бессмертных клеток, секретирующие необходимые моноклональные антитела, могут быть приготовлены, как хорошо известно, с помощью стандартного метода (КоЫсг с! а1. //ЫаШгс. 1975, ν. 256, р. 495-497) или его модификаций, позволяющих получить бессмертные лимфоциты или клетки селезёнки. Линии бессмертных клеток, секретирующих необходимые антитела, отбирают с помощью иммуноанализа, в котором антигеном является пептидный гаптен, полипептид или белок.
Если подходящая культура бессмертных клеток, секретирующих необходимые антитела, идентифицирована, клетки можно культивировать ίη νίίΐΌ или осуществлять продукцию ίη νί\Ό с помощью асцитной жидкости. Особый интерес представляют моноклональные антитела, распознающие в кНАБЕСР каталитический домен или сайт (участок) активации расщепления.
Могут быть также продуцированы антитела или фрагменты. В среде с химерными клетками, ведущими происхождение от нескольких видов, могут также продуцироваться участки, связывающиеся специфически с необходимыми участками рецептора.
Анализируемые указанным выше способом агенты могут быть селектированы случайным образом или же селектированы или сконструированы целенаправленно.
Агентами могут быть, например, пептиды, малые молекулы и углеводы. Специалисту в данной области понятно, что не существует ограничений в структурной природе агентов.
Пептидные агенты, как известно в данной области, могут быть получены с помощью стандартных твердофазных методов синтеза пептидов (или синтезом в растворе). Кроме того, кодирующую эти пептиды ДНК можно синтезировать с помощью имеющихся в продаже установок для синтеза олигонуклеотидов или получить рекомбинантным способом, используя стандартные рекомбинантные системы продукции. Если в пептид необходимо включить некодируемые генетически аминокислоты, необходима продукция с применением твердофазного пептидного синтеза.
I. Способы лечения &НА8ЕОР, идентифицированные приведёнными в настоящей работе способами, применены для лечения или предотвращения ненормального накопления субстратов кНАБЕСР у животного, особенно млекопитающего, включая человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает введение млекопитающему эффективного количества гликопротеина кНАБЕСР, посредством чего заболевание или расстройство излечивается или предотвращается.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор кНАБЕСР может быть применён для лечения избыточного количества гиалуронидазной активности в нейтральных условиях. Подвергающимся лечению млекопитающим может быть человек. Предложенные в настоящей работе ингибиторы - это такие ингибиторы, которые идентифицированы анализом скрининга. Кроме того, рассматриваются антитела и антисмысловые нуклеиновые кислоты или двунитевые РНК (бкКЫА), такие как ΚΝΛΐ.
1. Антисмысловое воздействие.
В конкретном осуществлении, как описано выше в настоящей работе, функцию полипептида кНАБЕСР ослабляют или подавляют (ингибируют) антисмысловыми нуклеиновыми кислотами для полипептида кНАБЕСР или ослабляют или предотвращают избыточную хондроитиназную активность. Предлагается терапевтическое или профилактическое применение нуклеиновых кислот длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов, обычно до 150 нуклеотидов, которые являются антисмысловыми по отношению к гену или к кДНК, кодирующим полипептид кНАБЕСР или его часть.
Термин «антисмысловая» нуклеиновая кислота полипептида кНАБЕСР, как он использован в настоящей работе, относится к нуклеиновой кислоте, способной гибридизироваться с РНК для части полипептида кНАБЕСР (как правило, мРНК) вследствие некоторой комплементарности последовательностей и, как правило, при условиях высокой степени строгости. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарна кодирующей и/или некодирующей области мРНК полипептида кНАБЕСР. Такие антисмысловые нуклеиновые кислоты находят применение как лекарства, снижающие или ингибирующие функцию полипептида кНАБЕСР, и могут быть использованы в лечении или предотвращении расстройств, описанных выше.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты полипептида кНАБЕСР имеют длину по меньшей мере 6 нуклеотидов и обычно являются олигонуклеотидами (с длиной от 6 до приблизительно 150 нуклеотидов, в том числе от 6 до 50 нуклеотидов). Антисмысловая молекула может быть комплементарна всему гиалуронидазному домену или его части. Например, олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов или по меньшей мере 125 нуклеотидов. Олигонуклеотидами могут быть ДНК или РНК, или их химерные смеси или производные, или модифицированные версии, однонитевые или двунитевые. Олигонуклеотид может быть модифицирован в основаниях, сахарах или фосфатном скелете. Олигонуклеотид может включать другие добавочные группы, такие как пептиды или агенты, способствующие транспорту через клеточную мем- 38 009383 брану (см., например, Ье!ктдег е! а1. /Жгос. №!1. Асаб. 8α. υ8Α. 1989, ν. 86, р. 6553-6556; Ьетайге е! а1. /Жгос. №!1. Асаб. 8α. υδΑ. 1987, ν. 84, р 648-652; международную публикацию \¥О 88/09810, опубликованную 15 декабря 1988 г.) или через гематоэнцефалический барьер (см., например, международную публикацию \¥О 89/10134, опубликованную 25 апреля 1988 г.), агенты для запускаемого гибридизацией расщепления (см., например, Кго1 е! а1. //ВюТесйшциек. 1988, ν. 6, р. 958-976) или интеркалирующие агенты (см., например, 2оп. /Жйагт. Кек. 1988, ν. 5, р. 539-549).
Антисмысловая нуклеиновая кислота для полипептида кΗΑ8ΕСΡ является, как правило, олигонуклеотидом, обычно однонитевой ДНК или РНК или их аналогом, или их смесями. Например, олигонуклеотид включает последовательность, антисмысловую по отношению к части нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид кΗΑ8ΕСΡ человека. Олигонуклеотид может быть модифицирован в любом месте его структуры заместителями, широко известными в данной области.
Антисмысловой олигонуклеотид для полипептида кΗΑ8ΕСΡ может включать по меньшей мере одно модифицированное гетероциклическое основание, которое выбрано из группы, содержащей (но не ограниченной ими) 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-О-галактозилквеозин, инозин, ^-изопентиладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Ш-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил,
5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-маннозилквеозин, 5-апосметоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио^6-изопентиладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, урацил-5-оксиуксусной кислоты метиловый эфир, 3-(3-амино-3-н-2-карбоксипропил)урацил (АСР3) (те) и 2,6-диаминопурин.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид включает по меньшей мере один модифицированный сахар, выбранный из группы, включающей (но не ограниченной ими) арабинозу, 2-фторарабинозу, ксилозу и гексозу. Олигонуклеотид может включать по меньшей мере один модифицированный фосфат в скелете, выбранный из фосфотиоата, фосфодитиоата, фосфамидотиоата, фосфамидата, фосфодиамидата, метилфосфоната, алкил-фосфотриэфира и формацеталя или его аналога.
Олигонуклеотид может быть α-аномерным олигонуклеотидом. α-Аномерный олигонуклеотид образует специфические двунитевые гибриды с комплементарной РНК, в которых нити параллельны друг другу (Саийег е! а1. //№с1. Αα6§ Кек. 1987, ν. 15, р. 6625-6641).
Олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, такой, как (но не исключительно) пептид, запускаемый гибридизацией сшивающий агент, транспортный агент или запускаемый гибридизацией расщепляющий агент. Олигонуклеотиды могут быть синтезированы известными в данной области стандартными способами, например с помощью автоматического ДНК-синтезатора (такого, как поставляемый фирмой Вюкеагсй, ЛррКеб Вюкук!етк и т.д.). В качестве примеров фосфотиоатные олигонуклеотиды могут быть синтезированы способом Штейна (8!ет е! а1. //Νπο1. Αο6κ Кек. 1988, ν. 85, р. 7448-7451), метилфосфонатные олигонуклеотиды можно приготовить с использованием носителей для полимеров из стекла с контролируемым размером пор (8апп е! а1. /Жгос. №!1. Αсаб. δα. υδΑ. 1988, ν. 85, р. 7448-7451) и т.д. В специфическом осуществлении антисмысловой олигонуклеотид для полипептида кΗΑδΕСΡ включает каталитическую РНК или рибозим (см., например, международную публикацию \¥О 90/11364, опубликованную 4 октября 1990 г.; 8агуег е! а1. //8аепсе. 1990, ν. 247, р. 1222-1225). В другом осуществлении олигонуклеотид представляет собой 2'-о-метилрибонуклеотид (1поие е! а1. //Νπο1. Αο6κ. Кек. 1987, ν. 15, р. 6131-6148) или химерный РНК-ДНК аналог (1поие е! а1. //ΕΕΒ8 Ье!!. 1987, ν. 215, р. 327-330).
В качестве альтернативы олигонуклеотидом может быть двунитевая РНК (6κΒΝΑ), такая, как ΒΝΑί.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения антисмысловая нуклеиновая кислота для полипептида кΗΑ8ΕСΡ продуцируется внутриклеточно путём транскрипции с эндогенной последовательности нуклеотидов.
Например, вектор может быть введён ш νίΐΌ таким образом, что он захватывается клеткой, внутри этой клетки вектор или его часть транскрибируется, образуя антисмысловую нуклеиновую кислоту (РНК). Такой вектор должен содержать последовательность, кодирующую антисмысловую нуклеиновую кислоту для полипептида кΗΑ8ΕСΡ. Такой вектор может оставаться эписомным или быть интегрированным в хромосому всё время, пока он может транскрибироваться, производя требуемую антисмысловую РНК. Такие векторы могут быть сконструированы с помощью стандартных для данной области методов технологии рекомбинантной ДНК. Векторами могут быть плазмиды: вирусные или иные, известные в данной области, используемые для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих. Экспрессия последовательности, кодирующей антисмысловую РНК для полипептида кΗΑ8ΕСΡ, может запускаться любым известным в данной области промотором, работающим в клетках млекопитающих, включая клетки человека. Такие промоторы могут быть индуцибельными или конститутивными. Такие промоторы включают (но не ограничены ими) раннюю промоторную область 8У40 (Вето1к! апб СйатЬоп //№Циге. 1981, ν. 290, р. 304-310), промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Роуза
- 39 009383 (УататоЮ е! а1. //Се11. 1980, ν. 22, р. 787-797), промотор гена тимидин-киназы вируса герпеса (^адпег е! а1. //Ргос. Асай. Бс1. ИБА. 1981, ν. 78, р. 1441-1445), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Вгшк!ег е! а1. //№1Шге. 1982, ν. 296, р. 39-42) и т.д.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты включают последовательность, комплементарную по меньшей мере части РНК-транскрипта гена полипептида кНАБЕСР, в том числе гена полипептида кНАБЕСР человека. Абсолютная комплементарность не требуется. Количество антисмысловой нуклеиновой кислоты для полипептида кНАБЕСР, эффективное в лечении или предотвращении опухолевого заболевания, зависит от природы заболевания и может быть определено опытным путём с помощью стандартных клинических методов.
Если это возможно, желательно перед тестированием и применением у людей определить цитотоксичность антисмысловой последовательности в клетках ш уИго, а затем проверить в пригодных модельных системах на животных.
2. Интерференция РНК.
Интерференция РНК (интерферирующая РНК - ВХА|) (см., например, Скиапд е! а1. //Ргос. Асай. Бс1. ИБА. 2000, ν. 97, р. 4985) может быть применена для ингибирования экспрессии гена, кодирующего кНАБЕСР. Фрагменты интерферирующей РНК (КЫА1), в частности двунитевой (йк) РУАе могут быть использованы для получения утраты функции кНАБЕСР. Известны способы, связанные с использованием КИА1 для приведения генов к молчанию (выключению) в организмах, включающих млекопитающих, С. е1едапк, Эгокоркйа и растения, а также людей (см., например, Иге е! а1. //№1Шге. 1998, ν. 391, р. 806-811; Иге //Тгепйк Сепе!. 1999, ν. 15, р. 358-363; Бкагр //Сепек 1)е\. 2001, ν. 15, р. 485-490; Наттопй е! а1. //№11иге Веу., Сепе!. 2001, ν. 2, р. 110-119; ТиксЫ //СНет. Вюскет. 2001, ν. 2, р. 239-245; НатШоп е! а1. //Баепсе. 1999, ν. 286, р. 950-952; Наттопй е! а1. //№1Шге. 2000, ν. 404, р. 293-296; 2атоге е! а1. //Се11. 2000, ν. 101, р. 25-33; Вегпк!ет е! а1. //№11иге. 2001, ν. 409, р. 363-366; Е1ЬакЫг 411, р. 494-498; международная публикация \У0 01/29058; международная публикация \У0 99/32619).
Конструкции, экспрессирующие двунитевую РНК (йкКЫА), вводят в хозяина, такого, как животное или растение, с помощью способного к репликации вектора, который остаётся в виде эписомы или интегрируется в геном. Выбирая подходящие последовательности, можно получить интерференцию экспрессии йкКНА с накоплением эндогенной мРНК, кодирующей кНАБЕСР. Можно также применить КЫА1 для ингибирования экспрессии ш νίΙΐΌ.
Для получения КИА1 используют участки, содержащие по меньшей мере около 21 (или 21) нуклеотида, селективные (т.е. уникальные) для кНАБЕСР. Меньшие фрагменты длиной около 21 нуклеотида можно трансформировать непосредственно в клетки (т.е. ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό); молекулы ВНА| большей длины (йкКНА) вводят, как правило, с помощью векторов, их кодирующих. Молекулы йкКЫА имеют длину по меньшей мере около 21 пары нуклеотидов (п. н.) или больше, как, например, 50, 100, 150, 200 и более п. н. Способы, реагенты и прописи для введения молекул нуклеиновой кислоты в клетки ш νίΙΐΌ и 1п νί\Ό известны специалистам в данной области.
3. Генная терапия.
В приводимом для примера осуществлении настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, включающие последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид кНАБЕСР или его функциональные домены или производные, вводят для поддержания функции полипептида кНАБЕСР путём генной терапии. Генная терапия относится к терапии, осуществляемой введением индивидууму нуклеиновой кислоты. В данном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота обеспечивает продукцию кодируемого ею белка, который является посредником в терапевтическом эффекте, поддерживая функцию полипептида кНАБЕСР. Может быть использован любой из способов генной терапии, доступный в данной области (см. Со1йкр1е1 е! а1. //С11шса1 Ркагтасу. 1993, ν. 12, р. 488-505; XVи апй XVи //ВюШегару. 1991, ν. 3, р. 87-95; То1к1оккеу //Апп. Веу. Ркагтасо1. Тохюо1. 1993, ν. 32, р. 573-596; МиШдап //Баепсе. 1993, ν. 260, р. 926-932; и Могдап апй Апйегкоп //Апп. Веу. Вюскет. 1993, ν. 62, р. 191-217; Тгепйк 1п Вю!ескпо1. 11. 1993, ν. 5, р. 155-215). Например, одна из терапевтических композиций для генной терапии включает кодирующую полипептид кНАБЕСР нуклеиновую кислоту, которая является частью экспрессирующего вектора, экспрессирующего в подходящем хозяине полипептид кНАБЕСР или его домен, фрагмент или химерный белок. В частности, такая нуклеиновая кислота содержит промотор, функционально присоединённый к кодирующей области для полипептида кНАБЕСР, причём промотор является индуцибельным или конститутивным и, по усмотрению, тканеспецифичным. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения используется молекула нуклеиновой кислоты, в которой кодирующие полипептид кНАБЕСР последовательности и любые другие необходимые последовательности фланкированы участками, которые способствуют гомологичной рекомбинации в требуемом участке генома, обеспечивая таким путём внутрихромосомную экспрессию нуклеиновой кислоты для белка кНАБЕСР (Ко11ег апй БтИЫек //Ргос. Асай. Бс1. ИБА. 1989, ν. 86, р. 8932-8935; 2у1к1га е! а1. //ХаИие. 1989, ν. 342, р. 435-438).
Доставка нуклеиновой кислоты в организм пациента может быть либо прямой (в этом случае организм пациента непосредственно приводится в контакт с нуклеиновой кислотой или несущим нуклеиновую кислоту вектором), либо непрямой (в этом случае сначала клетки трансформируют нуклеиновой
- 40 009383 кислотой ш У11го, а затем пересаживают их пациенту). Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия т νί\Ό или генная терапия ех νί\Ό.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят непосредственно ш νίνΌ, где она экспрессируется, давая кодируемый продукт. Это можно осуществить любым из известных в данной области многочисленных способов, например делая её частью подходящего экспрессирующего нуклеиновую кислоту вектора и вводя её так, что она становится внутриклеточной, например путём заражения дефектным или аттенуированным ретровирусным или иным вирусным вектором (см. патент США № 4980286), или путём инъекции «голой» ДНК, или путём бомбардировки микрочастицами (например, с помощью «генного ружья» фирмы Вюбкбс, Пироп!), или покрывая нуклеиновую кислоту липидами или имеющими сродство к клеточным рецепторам или трансфицирующими агентами, путём инкапсулирования в липосомы, микрочастицы или микрокапсулы, или же вводя её связанную с пептидом, про который известно, что он проникает в ядро, или вводя её связанную с лигандом, подвергающимся опосредованному рецепторами эндоцитозу (см., например, Аи апб Аи //1. Вю1. Скет. 1987, ν. 262, р. 4429-4432), который может быть использован для нацеливания на типы клеток, специфически экспрессирующие рецептор, и т.д. В другом варианте осуществления настоящего изобретения может быть приготовлен комплекс нуклеиновой кислоты с лигандом, в котором лигандом является способный к слиянию вирусный пептид, чтобы разрушить эндосомы, что позволит нуклеиновой кислоте избежать липосомной деструкции. Ещё в другом варианте осуществления настоящего изобретения можно обеспечить клеточно-специфичный захват нуклеиновой кислоты т νί\Ό и её экспрессию в этих клетках путём нацеливания на специфический рецептор (см., например, международные публикации АО 92/06180, датированную 16 апреля 1992 г. (Аи е! а1.); АО 92/22635, датированную 23 декабря 1992 г. (Абкоп е! а1.); АО 92/20316, датированную 26 ноября 1992 г. (Етбек е! а1.); АО 93/14188, датированную 22 июля 1993 г. (С1агке е! а1.); АО 93/20221, датированную 14 октября 1993 г. (Уоипд)). В качестве альтернативы нуклеиновая кислота может быть введена внутрь клеток и инкорпорирована для экспрессии в ДНК клетки-хозяина путём гомологичной рекомбинации (Ко11ег апб 8пйбиек //Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А. 1989, ν. 86, р. 8932-8935; Ζί^^ е! а1. //№!иге. 1989, ν. 342, р. 435-438).
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения используют вирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту полипептида кНАЗБСР. Например, можно использовать ретровирусный вектор (см. Мб1ег е! а1. //Ме!к. Εηζутο1. 1993, ν. 217, р. 581-599). Эти ретровирусные векторы были модифицированы, чтобы изъять ретровирусные последовательности, не являющиеся необходимыми для упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Подлежащую использованию в генной терапии нуклеиновую кислоту полипептида кНАЗБСР клонируют в вектор, который способствует доставке гена пациенту. Дополнительные детали, касающиеся ретровирусных векторов, можно найти в работе Воекеп е! а1. //ВюШегару. 1994, ν. 6, р. 291-302, в которой описано применение ретровирусного вектора для доставки гена тбг1 в кроветворные стволовые клетки с целью сделать стволовые клетки более устойчивыми к химиотерапии.
Другими ссылками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: С1о\\'ек е! а1. //1. С11п. ипуек! 1994, ν. 93, р. 644-651; К1ет е! а1. //В1ооб. 1994, ν. 83, р. 1467-1473; 8а1топк апб СипхЬегд //Нитап Пепе Тбегару. 1993, ν. 4, р. 129-141; и Сгокктап апб Абкоп //Сигг. Орш.ш Сепебск апб Эеуе1. 1993, ν. 3, р. 110-114.
Другими вирусными векторами, которые могут быть применены в генной терапии, являются аденовирусы. Аденовирусы - это особенно привлекательные носители для доставки генов в эпителий дыхательных путей. Аденовирусы в природе заражают эпителий дыхательных путей, где они вызывают слабое заболевание. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовирусов являются печень, центральная нервная система, клетки эндотелия и мышцы. Преимущество аденовирусов заключается в том, что способны заражать неделящиеся клетки. В работе Кохагкку апб Абкоп //Сигг. Орш. ш Сепебск апб Эеуек 1993, ν. 3, р. 499-503 представлен обзор генной терапии на основе аденовирусов. Вой! е! а1. //Нитап Сепе Тбегару. 1994, ν. 5, р. 3-10 продемонстрировали применение аденовирусных векторов для переноса генов в эпителий дыхательных путей макак-резусов. Другие примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в работах Вокепке1б е! а1. //8аепсе. 1991, ν. 252, р. 431-434; Вокепке1б е! а1. //Се11. 1992, ν. 68, р. 143-155; и Макбапдеб е! а1. //1. Сйп. 1пуек1. 1993, ν. 91, р. 225-234.
Для применения в генной терапии был также предложен аденоассоциированный вирус (ААВ) (Аа1кк е! а1. //Ргос. 8ос. Εxр. Вю1. Меб. 1993, ν. 204, р. 289-300).
Другой подход к генной терапии включает перенесение гена в клетки в культуре клеток такими способами, как электропорация, липофекция, трансфекция в присутствии фосфата кальция или вирусная инфекция. Обычно способ перенесения включает перенесение в клетки селектируемого маркера. Затем клетки помещают на селективную среду, чтобы выделить те клетки, которые захватили и экспрессировали перенесённый ген. Затем эти клетки вводят пациенту.
В данном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят в клетку до введения 1п νί\Ό получаемой рекомбинантной клетки. Такое введение можно осуществить любым известным в данной области способом, в том числе (но не ограничиваясь ими) трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, инфекцией содержащим последовательности нуклеиновой кислоты вирусным
- 41 009383 или бактериофаговым вектором, слиянием клеток, направляемым хромосомами переносом гена, направляемым микроклетками переносом гена, слиянием сферопластов и т.д. Для введения чужеродных генов в клетки в данной области существуют многочисленные способы (см., например, ЬоеГДег апб ВеЕг //Ме111. Εηζутο1. 1993, ν. 217, р. 599-618; СоЕеп е! а1. //Ме111. Εηζутο1. 1993, ν. 217, р. 618-644; С1те //ГЕагтас. !Ъег. 1985, ν. 29, р. 69-92). Эти способы могут быть использованы при условии, что необходимые связанные с развитием и физиологические функции реципиентных клеток при этом не нарушаются. Способ должен обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, так что нуклеиновая кислота может быть экспрессирована клеткой и, как правило, может быть унаследована и экспрессирована в клетках-потомках этой клетки.
Полученные рекомбинантные клетки можно ввести пациенту различными способами, известными в данной области. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вводят клетки эпителия, например, подкожно. В другом варианте осуществления пациенту могут быть введены рекомбинантные клетки кожи в виде кожного имплантата. Рекомбинантные клетки крови (например, кроветворные стволовые клетки или клетки-предшественники) можно ввести внутривенно. Количество клеток для предусматриваемого введения зависит от требуемого эффекта, состояния пациента и т. д. и может быть определено специалистом в данной области.
Клетки, в которые может быть введена нуклеиновая кислота для целей генной терапии, охватывают любые необходимые и доступные типы клеток и включают (но не ограничиваются ими) клетки эпителия, клетки эндотелия, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты;
различные стволовые клетки или клетки-предшественники, в особенности кроветворные стволовые клетки или клетки-предшественники, например, такие как стволовые клетки, полученные из костного мозга, крови пупочного жгута, периферической крови, печени плода и других их источников.
Например, используемые для генной терапии клетки являются аутологичными для пациента. В осуществлении, где в генной терапии используются рекомбинантные клетки, нуклеиновую кислоту для полипептида κΗΑδΕΟΡ вводят в клетки так, что она может экспрессироваться клетками или их потомством, и затем рекомбинантные клетки вводят ш νί\Ό для получения лечебного эффекта. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения используют стволовые клетки или клеткипредшественники. В соответствии с этим вариантом осуществления, потенциально могут быть использованы любые стволовые клетки или клетки-предшественники, которые могут быть выделены и поддерживаться 1п νίΙΐΌ.
Такие стволовые клетки включают (но не ограничиваются ими) кроветворные стволовые клетки (КСК), стволовые клетки тканей эпителия, таких как кожа или выстилка кишечника, клетки сердечной мышцы эмбриона, стволовые клетки печени (международная публикация XVО 94/08598, датированная 28 апреля 1994 г.) и стволовые клетки нервной ткани (8!етр1е апб Αηбе^кοη //Се11. 1992, ν. 71, р. 973-985).
Эпителиальные стволовые клетки (ЭСК) или кератиноциты можно получить из таких тканей, как кожа и выстилка кишечника, известными способами (И11ет\уа1б //Ме111. Се11 Вю1. 1980, ν. 21А, р. 229). В слоистой ткани эпителия, такой как кожа, обновление происходит путём митоза стволовых клеток внутри зародышевого слоя - слоя, наиболее близкого к расположенному у основания тонкому слою. Стволовые клетки в выстилке кишечника обеспечивают высокую скорость обновления этой ткани. ЭСК или кератиноциты, полученные из кожи или выстилки кишечника пациента или донора, можно выращивать в культуре ткани (ИНет\уа1б //Ме111. Се11 Вю1. 1980, ν. 21А, р. 229; ПИеП^у апб 8со11 //С1шю кгос. 1986, ν. 61, р. 771). Если ЭСК получены от донора, может быть также применён метод подавления реакции отторжения имплантата (например, облучением, введением лекарств или антител для обеспечения умеренной иммуносупрессии).
Что касается кроветворных стволовых клеток, в данном варианте осуществления может быть использована любая техника, обеспечивающая выделение, воспроизводство и поддержание КСК ш νίΙΐΌ. Техника, с помощью которой это может быть достигнуто, включает (а) выделение и введение в обиход культур КСК из клеток костного мозга, выделенных у будущего хозяина или у донора, или (Ь) использование ранее введённых в обиход культур КСК длительного поддерживания, которые могут быть аллогенными или ксеногенными.
Не аутологичные КСК обычно используют вместе с методом подавления иммунных реакций трансплантации у будущего хозяина/пациента. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки костного мозга человека могут быть получены из заднего подвздошного гребня отсасыванием через иглу (см., например, Кобо е! а1. //1. С1т. 1пуек1. 1984, ν. 73, р. 1377-1384). Например, можно получить КСК в высокой степени обогащенными или в существенно чистом виде. Это обогащение может быть проведено до, в ходе или после длительного культивирования и может быть осуществлено с помощью любой известной в данной области техники. Долговременные культуры клеток костного мозга могут быть введены в обиход и поддерживаться с помощью, например, модифицированной техники культур клеток Декстера (ЭехЮг е! а1. //1. Се11 Мгу^оЕ 1977, ν. 91 р. 335) или техники культивирования Витлока-Витте (ЭД1Иоск-ЭД1бе) (V^(1οск апб ΧνίΙ^ /^гос. №И. Αсаб. δα. υδΑ. 1982, ν. 79, р. 3608-3612).
- 42 009383
В конкретном осуществлении нуклеиновая кислота, подлежащая введению для целей генной терапии, включает индуцибельный промотор, функционально присоединённый к кодирующей области, так что экспрессия нуклеиновой кислоты может контролироваться путём регулирования наличия или отсутствия подходящего индуктора транскрипции.
4. Пролекарства.
Предлагается способ лечения опухолевых заболеваний. Способ осуществляется на практике введением пролекарства (предшественника лекарства), которое расщепляется в специфическом месте под действием &ΗΑ8Ε6Ρ с высвобождением активного лекарства или предшественника, который может превращаться в активное лекарство ίη νίνο. При контакте с клетками, экспрессирующими активный κΗΑδΕΟΡ, пролекарство превращается в активное лекарство. Пролекарством может быть конъюгат, содержащий активный агент, такой как противоопухолевое лекарство (как, например, цитотоксичный агент), или другой терапевтический агент (ТА), присоединённый к субстрату для адресованного расщепляющего действия κΗΑδΕΟΡ, так что лекарство или агент в конъюгате неактивны или неспособны к вхождению в клетку, но активируются при отщеплении. Продлекарство, например, может содержать молекулу хондроитин-сульфата - обычно сравнительно короткую, содержащую менее чем приблизительно 20 дисахаридных единиц, которая каталитически расщепляется адресованным κΗΑδΕΟΡ. Цитотоксические агенты включают (но не ограничены ими) алкилирующие агенты, антипролиферативные агенты и тубулин-связывающие агенты. Другие агенты включают лекарства из барвинка, митомицины, блеомицины и таксаны.
1. Фармацевтические композиции и способы их введения
1. Компоненты композиций.
В настоящей работе предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие активный κΗΑδΕΟΡ. Предусматриваются также комбинации соединений, модулирующих активность полипептида κΗΑδΕΟΡ, с другим воздействием или другим соединением для воздействия на расстройство, связанное с гиалуронидазой, с таким, как соединение, представляющее собой антитело.
Полипептид κΗΑδΕΟΡ и второй агент могут быть упакованы как раздельные композиции для введения вместе, или последовательно, или периодически. В качестве альтернативы они могут быть выполнены как единая композиция для введения или как две композиции для введения в виде одной композиции. Комбинации могут быть упакованы как наборы.
2. Рецептуры и путь введения.
Предлагаемые в настоящей работе полипептиды κΗΑδΕΟΡ человека и их растворимые гиалуронидазные домены могут быть составлены как фармацевтические композиции, как правило, для введения в виде однократной дозы. Концентрации полипептидов в композициях эффективны, при введении, для доставки такого количества, которое эффективно для намеченного лечения. Как правило, композиции составлены для введения в виде однократной дозы. Для того чтобы составить композицию, необходимую массовую порцию полипептида κΗΑδΕΟΡ человека, его растворимых гиалуронидазных доменов или его смеси растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают в выбранном носителе при эффективной концентрации, такой, что подвергающееся воздействию болезненное состояние ослабляется или улучшается.
В настоящей работе предусматриваются фармацевтические носители или переносчики, пригодные для введения κΗΑδΕΟΡ человека или его растворимых гиалуронидазных доменов, в том числе любые такие носители, известные специалистам в данной области как пригодные для конкретного способа введения.
Кроме того, рецептура может быть составлена таким образом, что полипептиды являются единственным фармацевтически активным ингредиентом в композиции, или же они могут быть в комбинации с другими активными ингредиентами. В качестве фармацевтически активных носителей могут быть также пригодны липосомные суспензии, в том числе липосомы с тканевым адресованием. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Например, липосомные составы могут быть приготовлены, как описано в патенте США № 4522811.
Активный κΗΑδΕΟΡ человека или его растворимый гиалуронидазный домен включён в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для того, чтобы проявить у подвергающегося лечению пациента терапевтически полезное действие без нежелательных побочных эффектов. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена опытным путём при тестировании полипептидов в известных системах испытаний ίη νίΐτο и ίη νίνο, таких как системы с использованием предложенных в настоящей работе способов анализа или системы, описанные, например, в следующих работах: ТаЛаш еΐ а1. ΙΙ Αла1. ВюсЬет. 1996, ν. 240, р. 60-67;
Εί^ηιηο еΐ а1. //1. νίτο1ο^. 1997, ν. 71, р. 1417-1427;
δυάο еΐ а1. /МНгуи^ Кек. 1996, ν. 32, р. 9-18;
ВиТТагЛ еΐ а1. //νίτο1ο^. 1995, ν. 209, р. 52-59;
В1аг1с1н еΐ а1. //Αла1. ВюсЬет. 1996, ν. 237, р. 239-244;
Ηатаΐаке еΐ а1. //ЩеМгоЦду. 1996, ν. 39, р. 249-258; δΐе^ηкиН1е^ еΐ а1. //ВюсЬет. 1998, ν. 37, р. 8899-8905;
- 43 009383
В'Зоига е1 а1. //1. беи. У1го1. 1995, ν. 76, р. 1729-1736;
Такекййа е1 а1. //Аиа1. Вюсйет. 1997, ν. 247, р. 242-246;
81ιίιηίζι.ι е1 а1. //1. У1го1. 1994, ν. 68, р. 8406-8408;
\1ί/ιιΙ;ιιιί е1 а1. //1. Упо1. 1996, ν. 70, р. 7219-7223;
М|/и1аш е1 а1. //Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттии. 1996, ν. 227, р. 822-826;
Ьи е1 а1. //Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А. 1996, ν. 93, р. 1412-1417;
Найт е1 а1. //Уйо1оду. 1996, ν. 226, р. 318-326;
Йо е1 а1. //1. беи. Уйо1. 1996, ν. 77, р. 1043-1054;
М|/и1аш е1 а1. //Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттии. 1995, ν. 212, р. 906-911;
Сйо е1 а1. //1 У1го1. Ме1й. 1997, ν. 65, р. 201-207.
Полученные в этих системах данные затем экстраполируют для определения дозировок для человека.
Как правило, рассматривается терапевтически эффективная дозировка. Вводимые количества могут быть в интервале от 0,001 до 1 мг/мл (на 1 мл объёма крови), в том числе приблизительно 0,005-0,05 мг/мл и приблизительно 0,01 мг/мл. Фармацевтические формы разовой дозировки готовят так, чтобы получить приблизительно 1-1000 мг, включая приблизительно 10-500 мг, в том числе приблизительно 25-75 мг основного активного ингредиента или комбинации основных активных ингредиентов в разовой дозе. Точную дозировку можно определить опытным путём.
В некоторых случаях предпочтительна высокая разовая доза кНА8ЕОР человека, выраженная в единицах. Например, при внутривенном введении &НА8ЕОР предпочтительны концентрации &НА8ЕОР от 500 до 100000 ед./мл. Лиофилизированные композиции &НА8ЕОР идеальны также для хранения высоких разовых доз кНА8ЕОР. Для внутривенной доставки предусматриваются флаконы с 200000 ед. лиофилизированного кНА8Е6Р.
Дозировки с высокой концентрацией предусматриваются также для доставки малых объёмов кНА8ЕОР. Для растворения введённых ранее вязкоупругих веществ при хирургических операциях, в случаях катаракты и имплантации внутриглазных линз, предусматривается введение инъекцией в переднюю камеру 10-100 мкл кНА8ЕОР с концентрацией 5000 ед./мл. Инъекции в малом объёме доз 50-200 ед./мл предусматриваются также при процедурах со стекловидным телом, таких как лечение кровоизлияний в стекловидное тело или отслоения сетчатки при диабетической ретинопатии.
Активный ингредиент может быть введён сразу весь или же он может быть разделён на несколько меньших доз для введения через различные интервалы времени. Понятно, что точная дозировка и длительность лечения зависят от подлежащего лечению заболевания и могут быть определены опытным путём на основе известных режимов испытаний или путём экстраполяции данных испытаний ш νί\Ό или 1и νίίΐΌ. Следует отметить, что значения концентраций и дозировок также могут варьировать в зависимости от серьёзности подлежащего снятию болезненного состояния. Необходимо далее понимать, что для каждого конкретного индивидуума следует распределить во времени специфические схемы дозировок, в зависимости от индивидуальной потребности и профессионального решения лица, вводящего композиции или наблюдающего за введением композиций, и что приводимые в настоящей работе далее интервалы концентраций являются лишь примерными и не предназначаются для ограничения возможностей или применения заявляемых композиций и содержащих их комбинаций.
Фармацевтически приемлемые производные включают следующие формы: кислоты, соли, эфиры, гидраты, сольваты и пролекарства. Производное обычно выбрано так, чтобы по своим фармакокинетическим свойствам оно превосходило нейтральный человеческий &НА8ЕОР или его растворимый гиалуронидазный домен.
Итак, один или более из заявляемых в настоящей работе полипептидов или фармацевтически приемлемых их производных в эффективных концентрациях или количествах смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или переносчиком с образованием фармацевтических композиций для системного, поверхностного или местного введения. Полипептиды человеческого кНА8ЕОР или их растворимые гиалуронидазные домены включают в количестве, эффективном для улучшения болезненного состояния или лечения расстройства, для которого предполагается лечение. Концентрация активного полипептида в композиции зависит от абсорбции, инактивации, скоростей выведения активного полипептида, от плана введения доз, вводимого количества, конкретной рецептуры, а также от других факторов, известных специалистам в данной области.
Терапевтические агенты для применения в заявляемых способах можно вводить любым известным специалистам в данной области способом, таким как (но не ограничиваясь ими) поверхностный, внутрисуставной, внутриполостной, внутриглазной, внутрижелудочковый, внутриоболочечный, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, внутритрахеальный пути введения, а также любой комбинацией любых двух или более из них. Могут также быть предусмотрены композиции в виде сухих порошков для лёгочного введения.
Наиболее подходящий путь введения может изменяться в зависимости от предполагаемого применения, такого как, например, применение в качестве средства доставки для облегчения подкожной доставки жидкостей, применение для снижения внутриглазного давления в глазах пациентов с глаукомой, получающих вязкоупругие препараты, или применение в качестве «распределяющего средства» для уси
- 44 009383 ления активности химиотерапевтических веществ, а также в зависимости от локализации представляющей интерес мишени, такой как конкретный внутренний орган, место роста опухоли, внутриглазная полость и эпидермис. Способы введения включают (но не ограничиваются ими) поверхностный, местный, внутрисуставной, внутриполостной, внутриглазной, внутрижелудочковый, внутриоболочечный, внутривенный, внутримышечный, внутритрахеальный, внутрибрюшинный, внутрикожный, пути введения, а также любую комбинацию любых двух или более из них. Например, при лечении различных типов рака, таких как карцинома простого плоского эпителия, рак молочной железы, рак мочевого пузыря и рак желудочно-кишечного тракта, местное применение, в том числе введение в место роста опухоли (например, внутриоболочечным, внутрижелудочковым или внутриполостным путями), даёт то преимущество, что терапевтическое средство может быть введено в высокой концентрации без риска осложнений, которые могут сопровождать системное введение терапевтического средства.
Предлагаемые в настоящей работе фармацевтические и косметические носители или переносчики для введения полипептидов кНА8ЕСР человека или их растворимого гиалуронидазного домена включают любые такие носители, известные специалистам в данной области как подходящие для конкретного способа введения. Кроме того, рецептура может быть составлена таким образом, что полипептиды являются единственным фармацевтически активным ингредиентом в композиции, или же они могут быть в комбинации с другими активными ингредиентами, не ослабляющими требуемой активности, или с материалами, дополняющими требуемую активность, известными специалистам в данной области. Например, предлагаемые в настоящей работе полипептиды кНА8ЕСР могут быть использованы как доставляющее или «распределяющее» средство в комбинации со вторым активным соединением, таким как терапевтически эффективное средство, включающее лекарство или пролекарство (но не ограниченное ими). Это делается для облегчения доставки или для усиления активности второго активного ингредиента. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид кНА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен может быть включён в рецептуру вместе с анестезирующим средством, таким как лигнокаин (Ыдпосате), бупивикаин (ВирМсате) или смесь их обоих, и, по усмотрению, с гормональным средством, таким как эпинефрин, для снижения или остановки поглощения в крови в ходе офтальмологической хирургической операции. Полипептид кНА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен может быть также включён в рецептуру вместе с различными химиотерапевтическими средствами, такими как токсин и фактор некроза опухолей, для усиления активности химиотерапевтического средства и/или для повышения доступности опухолей-мишеней для химиотерапевтического средства. Активное соединение включают в носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного действия, при отсутствии серьезных токсических проявлений у подвергаемого лечению индивидуума. Эффективную концентрацию можно определить опытным путём, испытывая соединения с применением систем ш νίΙΐΌ и ш у|уо, в том числе описанных в настоящей работе животных моделей.
Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного применения, могут включать любой из следующих компонентов:
стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой физиологический раствор, нелетучее масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или иной синтетический растворитель;
антимикробные средства, такие как бензиловый спирт и метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетраацетат (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты;
средства для поддержания тонуса, включающие (но не ограниченные ими) хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния, декстрозу, глицерин или борную кислоту.
Препараты для парентерального введения могут быть заключены в ампулы, разовые шприцы или во флаконы для разовой дозы или нескольких доз, сделанные из стекла, пластика или другого подходящего материала.
Полипептиды кНА8ЕСР человека или их растворимые гиалуронидазные домены могут быть суспендированы в микронизованной или другой приемлемой форме, или же могут быть приготовлены их производные для получения активного продукта с улучшенной растворимостью или для получения пролекарства. Форма получаемой смеси зависит от большого числа факторов, в том числе от намеченного способа введения и растворимости полипептида в выбранном носителе или переносчике. Эффективная концентрация достаточна для улучшения назначенного к лечению болезненного состояния и может быть определена опытным путём с помощью методов, известных специалистам в данной области.
Для составления композиции взвешенную порцию полипептида растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают с выбранным носителем при эффективной концентрации, такой, что намеченное к лечению болезненное состояние снимается или улучшается.
В тех случаях, когда растворимость полипептидов кНА8ЕСР человека или их растворимого гиалуронидазного домена недостаточна, могут быть использованы методы растворения полипептидов. Такие методы известны специалистам в данной области и включают (но не ограничены ими) использование добавочных растворителей, таких как диметилсульфоксид (ДМСО), использование поверхностно
- 45 009383 активных веществ, таких как Твин (Тетееп®) и Плюроник (Р1игошс®) Р68; или растворение в водном растворе бикарбоната натрия. В составлении эффективной фармацевтической композиции могут быть также использованы производные полипептидов, такие как полипептид в форме пролекарства. Для офтальмологических назначений композиции составляют в офтальмологически приемлемом носителе. Для указанных в настоящей работе офтальмологических применений предусматривается местное введение: путём поверхностного нанесения либо путём инъекции. Желательны также композиции с постепенным высвобождением лекарства. Как правило, композиции составляют с расчётом введения однократной дозы, так что в однократной дозе вводится эффективное количество.
При смешивании с носителем или при добавлении полипептида к носителю получаемая смесь может быть раствором, суспензией, эмульсией или иной композицией и может быть составлена как водные смеси, кремы, гели, мази, эмульсии, растворы, эликсиры, лосьоны, суспензии, настойки, пасты, пенки, аэрозоли, промывания, аэрозоли (спреи), свечи, бандажи или в иной лекарственной форме, пригодной для системного, поверхностного или местного введения.
Форма полученной в результате смеси зависит от многих факторов, в том числе от намеченного способа введения и от растворимости соединения в выбранном носителе или переносчике. При необходимости готовят фармацевтически приемлемые соли или иные производные соединений. Для местного внутреннего введения, такого как внутримышечное, парентеральное или внутрисуставное введение, соединения предпочтительно вводят в композицию в виде растворённой суспензии в среде на основе воды, в такой как изотонический забуференный солевой раствор, или комбинируют с биосовместимой плёнкой или клейкой лентой, предназначенной для внутреннего введения.
Полипептид зНА8ЕОР человека или его растворимый гиалуронидазный домен включают в фармацевтически приемлемый носитель в количествах, достаточных для проявления у подвергаемого лечению пациента терапевтически полезного действия без нежелательных побочных эффектов. Понятно, что число и степень побочных эффектов зависят от болезненного состояния, для лечения которого вводят соединения. Например, при лечении угрожающего жизни заболевания можно пренебречь некоторыми токсическими и нежелательными побочными проявлениями, которые недопустимы при лечении расстройств с менее опасными последствиями. Эффективные для терапевтического применения количества зависят, конечно, от тяжести заболевания и от массы и общего состояния индивидуума, а также от пути введения. Для местного введения терапевтического средства обычно требуется меньшая дозировка, чем при любом виде системного введения, хотя локальная концентрация терапевтического средства в некоторых случаях после местного введения может быть выше, чем достигаемая без опасных последствий при системном введении.
Поскольку отдельные индивидуумы могут обнаруживать широкий спектр тяжести симптомов, а каждое терапевтическое средство имеет свои особенные терапевтические характеристики, практикующему врачу надлежит определить индивидуальную реакцию индивидуума на лекарственное воздействие и соответственно с этим варьировать дозировки. Используемые ш νίίτο дозировки могут быть полезны в определении количеств, пригодных для введения ш зйи фармацевтической композиции, и в некоторых случаях для определения эффективных дозировок для лечения конкретных расстройств могут быть использованы животные модели. Как правило, однако, предполагается, что для местного введения эффективное количество терапевтического средства должно быть в интервале приблизительно 0,1 пг-1 нг на 1 кг массы тела. Различные соображения для достижения эффективного количества средства хорошо известны специалистам в данной области и приведены в литературе (см., например, Сοοбщаη апб СПтап //Тйе Рйа^щасο1οд^са1 Βазез ο£ Тйетареийсз, 8-е изд. Ре^дащοη Ргезз, 1990; ВеттдФп //Р11аппасеиЦса1 8аепсез, 17-е изд. Маск РиЬНзЫпд Οο., ЕазЮп, РА., 1990 и Майуй еί а1. //8с1епсе. 1997, ν. 278, р. 275279, где проводили внутриоболочечную инъекцию нейроспецифического лиганда-токсина; каждая из ссылок включена в настоящей работе ссылкой во всей её полноте).
Предлагаемые в настоящей работе композиции с полипептидами зНА8ЕОР человека или их растворимыми гиалуронидазными доменами включают композиции, пригодные для перорального, ректального, поверхностного, ингаляционного внутриротового (например, подъязычного), парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного), чрескожного введения или любого пути введения. В каждом данном случае наиболее пригодный путь введения зависит от природы и тяжести подлежащего лечению болезненного состояния и от природы подлежащего применению конкретного активного компонента. Для введения людям и животным композиции предлагаются в форме разовых дозировок, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные растворы или суспензии для парентерального введения, растворы или суспензии для перорального введения и водномасляные эмульсии, содержащих подходящие количества полипептидов и/или других средств или их фармацевтически приемлемых производных. Фармацевтические терапевтически активные полипептиды и/или другие средства и их производные обычно составляются и вводятся в формах разовой дозировки или в формах множественной дозировки.
Термин «форма разовой дозировки», как он использован в настоящей работе, относится к физически дискретным единицам, пригодным для человеческих и животных индивидуумов и упакованным индивидуально, как это известно в данной области.
- 46 009383
Фармацевтические композиции предоставляются для введения людям и животным в формах разовой дозировки, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные растворы или суспензии для парентерального введения, растворы или суспензии для перорального введения и водномасляные эмульсии, содержащих подходящие количества полипептида &НА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена и, по усмотрению, другого средства или его фармацевтически приемлемых производных. Фармацевтические терапевтически активные соединения и их производные обычно составляются и вводятся в формах разовой дозировки или в формах множественной дозировки.
Каждая единичная доза содержит предварительно определённое количество терапевтически активного соединения, достаточное для получения желательного терапевтического эффекта, в соединении с необходимыми фармацевтическим носителем, переносчиком или разбавителем. Примеры форм разовой дозировки включают (но не ограничены ими) ампулы, шприцы и индивидуально упакованные таблетки или капсулы. Для примера, композиция малого объёма, содержащая стабилизированный раствор &НА8ЕСР (от 1 до 5000 ед.) в малом объёме, таком как объём в пределах 5-50 мкл, может быть предварительно заключена в шприц для использования, например, после инъекции вязкоупругого вещества.
Формы разовой дозировки могут вводиться порциями или их кратным числом. Форма множественной дозировки представляет собой множество идентичных форм разовой дозировки, помещённых в один контейнер с назначением введения отдельными формами разовой дозировки. Примеры форм множественной дозировки включают флаконы, бутылки с таблетками или капсулами, или бутылки с жидкостью объёмом в пинты или галлоны. Таким образом, форма множественной дозировки представляет собой множество единичных доз, которые не разделены упаковкой (не упакованы раздельно).
Композиция вместе с активным ингредиентом, таким, как полипептид кНАБЕСР, может содержать: разбавитель, такой как лактоза, сахароза, двузамещённый фосфат кальция или карбоксиметилцеллюлоза, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция и тальк, и связывающее вещество, такое как крахмал, натуральные камеди, такие как гуммиарабик, желатин, глюкоза, патоки, поливинилпирролидон, целлюлозы и их производные, повидон, кроссповидоны и иные такие связывающие вещества, известные специалистам в данной области. Пригодные для фармацевтического введения жидкие композиции могут быть приготовлены, например, растворением, диспергированием или иным смешиванием активного соединения, как оно определено выше, и добавляемых по усмотрению фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, солевой физиологический раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, гликоли, этанол и подобные им, чтобы таким образом получить раствор или суспензию. Если требуется, подлежащая введению фармацевтическая композиция может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких, как увлажняющие средства, эмульгирующие средства, солюбилизирующие средства, буферные агенты для поддержания рН и подобные им - например, ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, сорбитан-монолаурат, триэтаноламин, ацетат натрия, триэтаноламин-олеат и другие подобные агенты. Способы приготовления таких дозировочных форм известны или должны быть очевидны специалистам в данной области (см., например, КеттдЮп //РйагтасеиБса1 8аепсек. 15-е изд. Маск РиЬйкйтд Сотрапу, ЕакЮп. РА, 1975). Предназначенная для введения композиция или рецептура содержит активный компонент в количестве, достаточном для ослабления болезненных симптомов у подвергающегося лечению индивидуума. Например, стандартная стабилизированная композиция с &НА8ЕСР человека или его растворимым гиалуронидазным доменом, как она предлагается в настоящей работе, включает 150 ед./мл растворимого гликопротеина, включённого в рецептуру вместе с ЭДТА, №10'1 и СаС12. В добавление к этому, в композиции может присутствовать антибактериальное или антигрибковое средство, в том числе (но не ограничиваясь им) тиомерзаль. Другая предлагаемая здесь композиция представляет собой стабилизированный раствор или лиофилизированную форму кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена в ЭДТА, №1С1 и СаС12, который(ая) содержит эффективное активное количество растворимого гликопротеина (например, 150 ед./мл) с добавкой лактозы, такой как 13 мг/мл. В настоящей работе также предлагается композиция, содержащая стабилизированный раствор или лиофилизированную форму &НА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена в ЭДТА, №1С1 и СаС12, которая содержит эффективное активное количество растворимого гликопротеина (такое как 150 ед./мл) с добавкой лактозы, такой как 13 мг/мл, а также альбумина, Плюроник Р68, Твин и/или другого детергента. Другая предлагаемая в настоящей работе композиция, либо в лиофилизированной форме, либо в виде стабилизированного раствора, содержит эффективное количество &НА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, такое как от 1 до 300 ед./мл, в ЭДТА, №1С1 и СаС12.
Могут быть приготовлены дозировочные формы или композиции, содержащие активный ингредиент в количестве от 0,005 до 100% по отношению к нетоксичному носителю. Для перорального введения фармацевтическая композиция может быть форме, например, таблеток или капсул, приготовленных обычным образом с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связывающие агенты (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или оксипропилметилцеллюлоза);
наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или кислый фосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или квасцы);
- 47 009383 дезинтегрирующие средства (например, картофельный крахмал или натриевый гликолат крахмала); или увлажняющие средства (например, лаурилсульфат натрия).
Таблеткам можно придать покрытие хорошо известными в данной области методами.
Композиции с ЗНА8ЕСР человека или его растворимым гиалуронидазным доменом или фармацевтически приемлемыми производными могут быть приготовлены с носителями, защищающими растворимый гликопротеин от быстрого выведения из организма. Это могут быть композиции с дозированным во времени высвобождением лекарства или покрытия. Композиции могут включать, для получения желательной комбинации свойств, другие фармацевтически эффективные средства, про которые повсеместно известно, что они полезны в лечении одного или более заболевания или медицинских болезненных состояний, в том числе (но не ограничиваясь ими): химиотерапевтическое средство, болеутоляющее средство, противовоспалительное средство, антимикробное средство, трихомоноцидное средство, средство против болезни Паркинсона, антималярийное средство, амёбоцидное средство, антидепрессантное средство, противоартритное средство, противогрибковое средство, антигипертензивное средство, антигипертермическое средство, антипаразитное средство, антигистаминное средство, средство - альфаадренергический агонист, средство - альфа-блокатор, анестезирующее средство, бронхолитическое средство, биоцидное средство, бактерицидное средство, бактериостатическое средство, средство - бетаадренергический блокатор, средство - блокатор кальциевых каналов, сердечнососудистое средство, противозачаточное средство, деконденсирующее средство, диуретическое средство, депрессантное средство, диагностическое средство, электролитное средство, гипнотическое средство, гормональное средство, гипергликемическое средство, расслабляющее мускулы средство, сокращающее мускулы средство, офтальмологическое средство, парасимпатомиметическое средство, психомоторное (тимолептическое) средство, успокаивающее (седативное) средство, симпатомиметическое средство, антифобическое средство (транквилизатор), средство для мочевого пузыря, вагинальное средство, противовирусное средство, витаминное средство, нестероидное противовоспалительное средство, средство - ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, полипептид, белок, нуклеиновая кислота, лекарство, пролекарство, органическая молекула и снотворное вещество. Должно быть понятно, что такая комбинированная терапия составляет ещё один аспект предлагаемых в настоящей работе композиций и способов лечения.
3. Композиции для перорального введения.
Формы фармацевтических дозировок для перорального введения представляют собой твёрдое вещество, гель или жидкость. Твёрдыми дозировочными формами являются таблетки, капсулы, гранулы и объёмные порошки. Типы пероральных таблеток включают прессованные жевательные лепешки и таблетки, которые могут быть покрыты растворимой в кишечнике оболочкой, покрыты сахаром или покрыты плёнкой. Капсулами могут быть твёрдые или мягкие желатиновые капсулы, тогда как гранулы и порошки могут быть предложены в нешипучей или шипучей форме, с комбинацией других ингредиентов, известных специалистам в данной области.
Фармацевтические композиции, содержащие ЗНА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен, могут быть в жидкой форме, например в виде растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть предоставлены как лекарственный продукт, подлежащий перед применением воссозданию с помощью воды или другого подходящего носителя. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные съедобные жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, эфиры масел или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-оксибензоаты или сорбиновая кислота).
В определённых осуществлениях композиции представляют собой твёрдые дозировочные формы, предпочтительно капсулы или таблетки. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и подобные им могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений подобной природы: связующее вещество, разбавитель, дезинтегрирующее средство, смазывающее средство, облегчающее скольжение вещество, подслащивающее средство и ароматизирующее средство.
Примеры связующих веществ включают микрокристаллическую целлюлозу, камедь траканта, раствор глюкозы, гуммиарабик акации, раствор желатина, сахарозу и пасту крахмала. Смазывающие вещества включают тальк, крахмал, магнезию или стеарат кальция, ликоподий и стеариновую кислоту. Разбавители включают, например, лактозу, сахарозу, крахмал, каолин, соль, маннитол и двузамещённый фосфат кальция. Облегчающие скольжение вещества включают (но не ограничены ею) коллоидную двуокись кремния. Дезинтегрирующие агенты включают натриевую соль кросскармелозы, натрий-гликолат крахмала, альгиновую кислоту, пшеничный крахмал, картофельный крахмал, бентонит, метилцеллюлозу, агар и карбоксиметилцеллюлозу. Окрашивающие агенты включают, например, любой из разрешённых сертифицированных водорастворимых красителей РО и С, их смеси и водонерастворимые красители РО и С, суспендированные на гидроокиси алюминия. Подслащивающие агенты включают сахарозу, лактозу, маннитол, искусственные подслащивающие агенты, такие как сахарин, и любое число высушенных распылительной сушкой ароматизаторов. Ароматизирующие вещества включают природные ароматизаторы, экстрагированные из растений, такие как ароматизаторы из фруктов, и синтетические смеси соеди
- 48 009383 нений, придающих приятное ощущение, таких как мятное масло и метилсалицилат. Увлажняющие вещества включают пропиленгликоль-моностеарат, сорбитан-моноолеат, диэтиленгликоль-монолаурат и лауриловый эфир полиоксиэтилена. Покрытия растворимой в кишечнике оболочки включают жирные кислоты, жиры, воски, шеллак, насыщенный аммиаком шеллак и фталаты ацетата целлюлозы. Плёночные покрытия включают оксиэтилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликоль 4000 и фталат ацетата целлюлозы.
Если желательно пероральное введение, кНАЗЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен могут быть предоставлены в композиции, которая защищает их от кислой среды желудка. Например, композиция может быть заключена в растворимую в кишечнике оболочку, которая обеспечивает её целостность в желудке и высвобождает активное соединение в кишечнике. Композиция может быть также составлена в комбинации с антацидом или другим подобным ингредиентом.
Если форма разовой дозировки является капсулой, она может, кроме материала указанных выше типов, содержать жидкий носитель, такой как жирное масло. Кроме того, формы разовой дозировки могут содержать различные другие материалы, модифицирующие физическую форму дозировочной единицы. Например, они могут быть покрыты сахаром или другими растворимыми в кишечнике веществами. Композиции могут также вводиться как компоненты эликсира, суспензии, сиропа, облатки, разбрызгиваемой формы, жевательной резинки и тому подобного. Сироп может содержать, в добавление к активным соединениям, сахарозу в качестве подслащивающего агента и некоторые консерванты, красители и окрашивающие вещества, и ароматизаторы.
кНАЗЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен могут быть также смешаны с другими активными материалами, не снижающими требуемого действия, или с материалами, которые дополняют требуемое действия, с такими как антациды, блокаторы Н2 и диуретики. Активный ингредиент представляет собой соединение или его фармацевтически приемлемое производное, как они описаны выше. Могут быть использованы более высокие концентрации активного ингредиента, до 98% по массе.
Включёнными в таблетки фармацевтически приемлемыми носителями являются связующие вещества, смазки, разбавители, дезинтегрирующие вещества, окрашивающие вещества, ароматизирующие вещества и увлажняющие вещества. Имеющие растворимое в кишечнике покрытие таблетки, благодаря этому покрытию, устойчивы к действию кислоты кишечника и растворяются или дезинтегрируются в нейтральной или щелочной среде кишечника. Покрытые сахаром таблетки - это спрессованные таблетки, на которые нанесены различные слои фармацевтически приемлемых веществ. Покрытые плёнкой таблетки - это спрессованные таблетки, покрытые полимером или другим подходящим покрытием. Множественно спрессованные таблетки - это спрессованные таблетки, полученные более чем одним циклом прессования с использованием ранее упомянутых фармацевтически приемлемых веществ. В указанных выше формах дозировки могут быть также использованы окрашивающие вещества. В спрессованных, покрытых сахаром, многократно спрессованных и жевательных таблетках используются ароматизирующие и подслащивающие вещества. Ароматизирующие и подслащивающие вещества особенно полезны при получении жевательных таблеток и лепёшек.
Жидкие формы дозировки для перорального применения включают водные растворы, эмульсии, суспензии, растворы и/или суспензии, реконструированные из нешипучих гранул, и шипучие препараты, реконструированные из шипучих гранул. Водные растворы включают, например, эликсиры и сиропы. Эмульсии бывают типа вода-в-масле или типа масло-в-воде.
Эликсиры - это прозрачные, подслащенные водно-спиртовые препараты. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в эликсирах, включают растворители. Сиропы - это концентрированные растворы сахара, например сахарозы, они могут содержать консерванты. Эмульсия - это двухфазная система, в которой одна жидкость диспергирована в виде мелких капель в толще другой жидкости. Используемые в эмульсиях фармацевтически приемлемые носители - это не водные жидкости, эмульгирующие вещества и консерванты. В суспензиях используют фармацевтически приемлемые суспендирующие вещества и консерванты. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в нешипучих гранулах, подлежащих реконструированию в жидкую форму дозировки для перорального применения, включают разбавители, подслащивающие и увлажняющие вещества. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в шипучих гранулах, подлежащих реконструированию в жидкую форму дозировки для перорального применения, включают органические кислоты и источник двуокиси углерода. Во всех из перечисленных выше форм дозировки используют окрашивающие и ароматизирующие вещества.
Растворители включают глицерин, сорбитол, этиловый спирт и сироп. Примеры консервантов включают глицерин, метил- и пропилпарабен, бензойную кислоту, бензоат натрия и спирт. Примерами неводных жидкостей, используемых в эмульсиях, являются минеральное масло и масло семян хлопчатника. Примеры эмульгирующих веществ включают желатин, камедь акации, камедь трагаканта, бентонит и поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилен-сорбитанмоноолеат. Суспендирующие агенты включают натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, пектин, камедь трагаканта и акации, вигум. Разбавители включают лактозу и сахарозу. Подслащивающие вещества включают сахарозу, сиропы, глицерин и искусственные подслащивающие вещества, такие как сахарин. Увлажняющие вещества включают пропиленгликоль-моностеарат, сорбитан-моноолеат, диэтиленгликоль-монолаурат и лаурило
- 49 009383 вый эфир полиоксиэтилена. Органические добавки включают лимонную кислоту и винную кислоту. Источники двуокиси углерода включают бикарбонат натрия и карбонат натрия. Окрашивающие вещества включают любой из разрешённых сертифицированных водорастворимых красителей ЕИ и С и их смеси. Ароматизирующие вещества включают природные ароматизаторы, экстрагированные из растений, такие как ароматизаторы из фруктов, и синтетические смеси соединений, придающих приятное вкусовое ощущение.
Для получения твёрдой дозировочной формы раствор или суспензию в приводимых для примера пропиленкарбонате, растительных маслах или триглицеридах инкапсулируют в желатиновую капсулу. Такие растворы, а также их приготовление и инкапсулирование раскрыты в патентах США № 4328245, 4409239 и 4410545. Для получения жидкой дозировочной формы раствор (например, в полиэтиленгликоле) может быть разбавлен в достаточном количестве фармацевтически приемлемого жидкого носителя, например воды, чтобы его было легко отмеривать для введения.
В качестве альтернативы жидкие или полутвёрдые композиции для перорального введения могут быть приготовлены растворением или диспергированием кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена в растительных маслах, гликолях, триглицеридах, эфирах пропиленгликоля (например, пропиленкарбонате) и других подобных носителях и инкапсулированием этих растворов или суспензий в оболочки жёстких или мягких желатиновых капсул. Другие полезные композиции включают таковые, представленные далее в патентах США № 4328819 и 4358603.
Композиции, подходящие для защёчного (подъязычного) введения включают, например, лепёшки, содержащие кНА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен в ароматизированной основе, обычно сахарозе и камеди акации или трагаканта, и пастилки, содержащие соединение на инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и камедь акации.
Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения композиции в виде таблеток и капсул могут иметь покрытие, как это известно специалистам в данной области, чтобы модифицировать или задержать растворение активного ингредиента. Так, например, они могут быть покрыты обычным перевариваемым в кишечнике покрытием, таким как фенилсалицилат, воски и фталат ацетата целлюлозы.
4. Растворы и эмульсии, предназначенные для инъекций.
В настоящей работе предусматривается также парентеральное введение кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, в основном характеризуемое инъекцией: подкожной, внутримышечной или внутривенной. Инъецируемые композиции могут быть приготовлены в обычных формах в виде либо жидких растворов, либо суспензий; в виде твёрдых форм, пригодных для растворения перед инъекцией, или суспензий в жидкости, получаемых перед инъекцией; или в виде эмульсий. Подходящие наполнители - это, например, вода, солевой физиологический раствор, декстроза, глицерин или этанол. Кроме того, по желанию, подлежащая введению фармацевтическая композиция может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, буферные вещества для поддержания рН, стабилизаторы, усилители растворимости и другие подобные вещества, такие как, например, ацетат натрия, сорбитан-монолаурат, триэтаноламинолеат и циклодекстрины. В настоящей работе рассматривается также имплантация систем с медленным высвобождением или с непрерывным высвобождением, обеспечивающих поддержание постоянного уровня дозировки (см., например, патент США № 3710795). Процентное содержание кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена в таких композициях для парентерального введения зависит от их конкретной природы, а также от активности соединения и потребностей индивидуума.
Парентеральное введение композиций включает внутривенное, подкожное и внутримышечное введения. Препараты для парентерального введения включают готовые к инъекции стерильные растворы, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые к объединению непосредственно перед использованием с растворителем или стерильным раствором, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые к объединению непосредственно перед использованием с переносчиком, и стерильные эмульсии. Растворы могут быть либо водными, либо не водными.
В случае внтривенного введения подходящие носители включают физиологический солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор (РВ8) и растворы, содержащие загущающие и растворяющие вещества, такие как глюкозу, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль и их смеси.
Используемые в препаратах для парентерального введения фармацевтически приемлемые носители включают водные переносчики, неводные переносчики, антимикробные средства, изотонические вещества, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие вещества, эмульгирующие вещества, изолирующие или хелатирующие вещества и другие фармацевтически приемлемые вещества.
Примеры водных переносчиков включают хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильную воду для инъекций, раствор Рингера с декстрозой и лактозой для инъекций. Неводные переносчики для парентерального введения включают нелетучие масла растительного происхождения, масло семян хлопчатника, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. К препаратам для парентерального введения, упакованным в контейнеры для множественной дозировки, следует добавлять антимикробные средства бактериостатического или фун
- 50 009383 гистатического действия, которые включают фенолы или крезолы, ртутные препараты, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый эфиры п-оксибензойной кислоты, тиомерзаль, бензалконий-хлорид и бензетоний-хлорид. Изотонические агенты включают хлорид натрия и декстрозу. Буферы включают фосфат и цитрат. Антиоксиданты включают бисульфит натрия. Местные анестетики включают прокаин-гидрохлорид. Суспендирующие и диспергирующие вещества включают натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропил-метилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгирующие вещества включают Полисорбат 80 (Ттеееп® 80). Изолирующее ионы металлов или образующее с ними хелатные связи вещество включает ЭДТА. Фармацевтические носители включают также этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль для смешивающихся с водой переносчиков и гидроокись натрия, соляную, лимонную или молочную кислоты для установления рН.
Концентрацию фармацевтически активного соединения устанавливают таким образом, что инъекция обеспечивает его эффективное количество для получения требуемого фармакологического эффекта. Точная доза зависит, как это известно в данной области, от возраста, массы и состояния пациента или животного.
Однократные дозировки препаратов для парентерального введения упаковывают в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными, как известно и практикуется в данной области.
В качестве иллюстрации эффективным способом введения является внутривенное или внутриартериальное вливание стерильного водного раствора, содержащего активное соединение. Другим вариантом осуществления является стерильный водный или масляный раствор или суспензия, содержащие активное соединение, инъецируемые так, как необходимо для получения требуемого фармакологического эффекта.
Инъецируемые препараты предназначаются для местного и системного введения. Как правило, терапевтически эффективная дозировка составляется таким образом, чтобы она содержала, по меньшей мере приблизительно от 0,1 до приблизительно 90 мас.% или более предпочтительно более 1% соотношения по массе активного ингредиента к подвергаемой воздействию ткани. Активный ингредиент, такой как &НА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен, может быть введён однократно или же может быть разделён на некоторое число меньших доз для введения их через интервалы времени. Понятно, что точная дозировка и продолжительность лечения зависят от подлежащей воздействию ткани и могут быть определены экспериментальным путём с помощью известных протоколов испытаний или путём экстраполяции данных испытаний ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ. Следует отметить, что величины концентраций и дозировок могут также зависеть от возраста подвергаемого лечению индивидуума. Далее необходимо понимать, что для каждого конкретного индивидуума конкретные схемы приёма лекарства должны со временем корректироваться в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональной квалификацией лица, назначающего или контролирующего введение композиций, и что приведённые в настоящей работе далее диапазоны концентраций являются лишь примерными и не предназначены ограничить границы возможностей или практическое осуществление заявляемых композиций.
Предлагаемые в настоящей работе соединения могут быть составлены для парентерального введения путём инъекции, например, разовой инъекцией ударной дозы или непрерывным вливанием. Композиции для инъекции могут быть представлены в форме разовых дозировок (например, в ампулах) или в многодозовых контейнерах с добавлением консерванта. Композиции могут быть суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных носителях и могут содержать способствующие составлению композиции вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В качестве альтернативы активный ингредиент может быть в форме порошка, подлежащего перед применением растворению в подходящем носителе, например стерильной апирогенной водой или другими растворителями. Например, в настоящей работе предлагаются для парентерального введения композиции, содержащие эффективное количество &НА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, такое как от 500 до 500000 ед., в виде стабилизированного раствора или в лиофилизированной форме.
Соединение может быть суспендировано в микронизованной или иной подходящей форме, или может быть получено его производное для создания более растворимого активного продукта или для создания пролекарства. Форма итоговой смеси зависит от многих факторов, включая предполагаемую форму введения и растворимость соединения в выбранном носителе или переносчике. Эффективная концентрация достаточна для ослабления симптомов болезненного состояния и может быть определена опытным путём.
5. Лиофилизированные порошки.
В настоящей работе предлагаются также лиофилизированные порошки, содержащие &НА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен, которые могут быть для введения воссозданы как растворы, эмульсии или другие смеси. Эти композиции могут быть также воссозданы как твёрдые вещества или гели.
Стерильный лиофилизированный порошок готовят растворением твёрдой порции кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена или смешиванием аликвоты раствора, содержащего
- 51 009383 &НА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен, в подходящем растворителе. Растворитель может содержать наполнитель, повышающий стабильность, или другой фармакологический компонент порошка или воссозданного раствора, приготовленного из порошка. Наполнители, которые могут быть использованы, включают (но не ограничены ими) декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу, лактозу или иное подходящее вещество. Растворитель может также содержать буфер, такой как цитратный или калий-фосфатный, или иной подобный буфер с рН вблизи нейтрального, известный специалистам в данной области. Затем стерильная фильтрация раствора с последующей лиофилизацией в стандартных условиях, известных специалистам в данной области, дают лиофилизированную композицию. Как правило, получаемый после стерильной фильтрации раствор распределяют по флаконам для лиофилизации. Каждый флакон может содержать единичную дозу соединения, такую как 10-1000 или 100-500 мг, или множество доз.
Вкратце, лиофилизированный порошок готовят, растворяя декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу, лактозу или иное подходящее вещество, в количестве приблизительно 1-20%, в подходящем буфере, таком как цитратный или калий-фосфатный, или иной подобный буфер с рН вблизи нейтрального, известный специалистам в данной области. Затем к полученной смеси при температуре выше комнатной (такой как приблизительно 30-35°С) добавляют выбранную соль, такую как, например, натриевую соль 5НА8Е6Р (около 1 г соли на 1-100 г буферного раствора, обычно около 1 г соли на 30 г раствора) и перемешивают до растворения. Полученную смесь разбавляют добавлением буфера, чтобы снизить получаемую концентрацию соли приблизительно на 10-50%, обычно приблизительно на 15-25%. Полученную смесь подвергают стерильной фильтрации или обрабатывают для удаления частиц и обеспечения стерильности, после чего распределяют по флаконам для лиофилизации. Лиофилизированный порошок можно хранить при подходящих условиях, таких как температура от приблизительно 4°С до комнатной.
Воспроизведение этого лиофилизированного порошка с водой для инъекции даёт композицию для использования в парентеральном введении. Для воссоздания добавляют терапевтически эффективное количество (в расчёте на 1 мл воды или иного подходящего носителя) лиофилизированного порошка, содержащего &НА8ЕСР человека или его растворимый гиалуронидазный домен. Точное количество зависит от выбранного соединения и может быть определено опытным путём с помощью способов, известным специалистам в данной области.
6. Местное применение.
Смеси для местного применения готовят так, как описано для местного и системного применения. Получаемые смеси могут быть растворами, суспензиями, эмульсиями или тому подобным и входят в рецептуры в виде кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, лосьонов, суспензий, настоек, паст, пенок, аэрозолей, обмываний, спреев, свечей, бандажей, кожных наклеек (пластырей) или в виде любых других рецептур, пригодных для местного применения.
Композиции с 5НА8ЕСР человека, или его растворимым гиалуронидазным доменом, или с его фармацевтически приемлемыми производными могут быть составлены как аэрозоли для местного применения, такого как ингаляция (см., например, патенты США № 4044126, 4414209 и 4364923, в которых описаны аэрозоли для доставки стероида, полезные для лечения воспалительных заболеваний, в особенности астмы). Эти композиции для введения в респираторный тракт могут быть в форме аэрозоля или раствора для распылителя, или в виде микродисперсного порошка для вдувания: либо сами по себе, либо в комбинации с инертным носителем, таким как лактоза. В этом случае частицы композиции обычно имеют диаметр менее 50 мкм, такой как менее 10 мкм.
Для введения ингаляцией предназначенные в настоящей работе для использования композиции могут доставляться в форме аэрозольного спрея, вносимого из герметизированных упаковок или из распылителя с использованием подходящего движущего вещества, включающего (но не ограниченного ими) дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, двуокись углерода и другие подходящие газы. В случае аэрозоля из герметичной упаковки можно определить единичную дозировку, снабжая ёмкость вентилем для введения отмеренного количества. Капсулы и патроны из, например, желатина для использования в ингаляторе или вдувателе могут содержать порошковую смесь соединения из подходящей порошковой основы, такой, как лактоза или крахмал.
Композиции могут быть составлены для местного или поверхностного применения, такого, как поверхностное нанесение на кожу и слизистые оболочки (такие, как слизистая оболочка глаза), в форме гелей, кремов и лосьонов и для внесения в глаза, и для внутриполостного введения, и для введения в спинно-мозговой канал. Поверхностное применение предусматривается в случае чрескожного введения, а также для введения в глаза или в слизистую оболочку либо для ингаляционной терапии. Растворы могут также вводиться интраназально и содержать только активное соединение или его комбинацию с другими фармацевтически приемлемыми наполнителями.
Например, композиции, пригодные для поверхностного нанесения на кожу или в глаза, могут быть составлены в виде мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля и масла. Носители, которые могут быть использованы, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты и комбинации двух или
- 52 009383 более из них. Композиции для поверхностного применения могут дополнительно содержать полезные добавки от 0,05 до 15 мас.% загустителей, включая (но не ограничиваясь ими) оксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, поли(алкиленгликоли), поли/оксиалкил, (мет)акрилаты или поли(мет)акриламиды. При местном применении композицию часто вводят в виде обмываний или мази в конъюнктивальный мешок. Её также можно использовать для орошения или смазывания глаз, лицевых полостей и внешнего слухового прохода. Композиции для поверхностного применения в жидкой форме могут также присутствовать в трёхмерной матрице гидрофобного полимера в форме полосок, контактных линз и подобных им, откуда высвобождаются активные компоненты. Их можно также вводить инъекцией в переднюю камеру глаза и в другие места. Например, в настоящей работе предлагается композиция для внутриглазного применения после инъекции вязкоупругого вещества, содержащая стабилизированный раствор эффективного количества кНАБЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, такого как от 1 до 5000 ед. растворимого гликопротеина с удельной активностью от 30 до 150 000 ед./мг, в малом объёме, таком как от 5 до 50 мкл.
Эти растворы, особенно те, которые предназначены для офтальмологического применения, могут быть составлены в виде 0,01-10% изотонических растворов, рН приблизительно 5-7 с добавлением подходящих солей.
7. Композиции для других путей введения.
В настоящей работе рассматриваются также другие пути введения, такие как поверхностное нанесение, чрескожные пластыри и ректальное введение.
Например, формы фармацевтической дозировки для ректального введения - это ректальные свечи, капсулы и таблетки для системного действия.
Термин «ректальные свечи», как он использован в настоящей работе, означает твёрдые тела для введения в прямую кишку, которые плавятся или размягчаются при температуре тела, высвобождая один или более из фармакологически или терапевтически активных ингредиентов. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в ректальных свечах, - это основания или носители и агенты для повышения точки плавления. Примеры оснований включают масло какао, глицерин-желатин, карбовакс (полиоксиэтиленгликоль) и подходящие смеси моно-, ди- и триглицеридов жирных кислот. Могут быть использованы комбинации разных оснований, вещества для повышения точки плавления свечей включают спермацет и воск. Ректальные свечи могут быть приготовлены либо способом прессования, либо способом отливки. Типичная масса ректальной свечи составляет примерно от 2 до 3 г.
Таблетки и капсулы для ректального введения производят с использованием таких же фармацевтически приемлемых веществ и теми же способами, как и для композиций для перорального введения.
Композиции, пригодные для чрескожного введения, могут быть представлены как дискретные наклейки, приспособленные для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Такие наклейки, соответственно, содержат активное соединение как забуференный, по желанию, водный раствор с концентрацией активного соединения, например, от 0,1 до 0,2 М. Пригодные для чрескожного введения композиции могут быть также введены ионофорезом (см., например, Рйагтассийса1 Всксагсй. 1986, ν. 3, № 6, р. 318) и обычно имеют форму забуференного (по усмотрению) водного раствора активного соединения.
Фармацевтические композиции можно также вводить с помощью средств для контролируемого высвобождения и/или приёмов доставки (см., например, в патентах США № 3536809, 3598123, 3630200, 3845770, 3847770, 3916899, 4008719, 4687610, 4769027, 5059595, 5073543, 5120548, 5354566, 5591767, 5639476, 5674533 и 5733566). Активные соединения или фармацевтически приемлемые производные могут быть приготовлены с носителями, защищающими соединение от быстрого выведения из организма. Так, это могут быть композиции с заданным временем высвобождения или с покрытиями.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагаемых в настоящей работе композиций и способов терапевтическое средство вводят местно в переносчике для доставки с медленным высвобождением, например инкапсулированным в коллоидной дисперсной системе или в стабилизированных полимерами кристаллах. Пригодные коллоидные дисперсные системы включают нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, в том числе эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Например, коллоидной дисперсной системой могут быть липосомы или микросферы. Липосомы - это искусственные мембранные везикулы, полезные как средства доставки с медленным высвобождением при их инъекции или имплантации. Некоторые примеры липидполимерных конъюгатов и липосом раскрыты в патенте США № 5631018, который полностью включён в настоящую работу ссылкой. Другими примерами средств доставки с медленным высвобождением являются биодеструктируемые гидрогелевые матриксы (патент США № 5041292), конъюгаты с дендритными полимерами (патент США № 5714166) и многопузырчатые липосомы (ЭсроГоат® фирмы □сроШт Бап Ию^о, СА) (патенты США №№ 5723147 и 5766627). Одним из типов микросфер, пригодных для инкапсулирования терапевтических агентов для местного введения (например, в подкожную ткань), являются микросферы из поли(П,Ь)лактида, описанные в работе Е1с1с11сг Ό. //Апск111. Апа1д. 1977, ν. 84, р. 90-94. Например, для различных применений или для лечения различных болезненных состояний (в том числе, но не ограничиваясь этими примерами, для косметических композиций или для лечения повреждений
- 53 009383 спинного мозга) может быть использована композиция с медленным высвобождением, содержащая эффективное количество кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, такое как 1-5000 ед./мл.
Необходимые уровни содержания в крови можно поддерживать постоянным вливанием активного агента с проверкой уровней содержания в плазме. Следует отметить, что лечащий врач будет знать, как и когда завершить, прервать или снизить дозу лекарства из-за его токсичности или из-за дисфункций в спинном мозге, печени или почках. Наоборот, лечащий врач будет знать, как и когда повысить дозировку лечебного средства, если не достигнут адекватный клинический эффект (но с предотвращением токсических побочных эффектов).
Эффективность и/или токсичность полипептида кНА8ЕСР и/или его ингибитора (ингибиторов), одного или в комбинации с другими средствами, такими как терапевтически эффективные средства, также можно оценить с помощью методов, известных в данной области (см., например, О'ЯеШу //1пуек11да1юпа1 №\ν Эгидк. 1997, ν. 15, р. 5-13).
8. Изделия промышленного производства.
Полипептиды кНА8ЕСР человека, или их растворимые гиалуронидазные домены, или содержащие любые из упомянутых выше агентов композиции могут быть упакованы как изделия промышленного производства, содержащие упаковочный материал, находящееся внутри упаковочного материала предложенное в настоящей работе соединение или его пригодное производное, которые эффективны для лечения рассмотренных в настоящей работе заболеваний или расстройств, и маркировку, которая указывает, что соединение или его пригодное производное предназначены для лечения рассмотренных в настоящей работе заболеваний или расстройств. По усмотрению маркировка может содержать перечисление расстройств, для которых разрешена эта терапия.
Предлагаемые в настоящей работе изделия промышленного производства содержат упаковочные материалы. Упаковочные материалы, используемые для упаковки фармацевтических продуктов, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, патенты США № 5323907, 5052558 и 5033352). Примеры упаковочных материалов для фармацевтики включают (но не ограничены ими) пузырчатые упаковки (блистеры), бутылочки, тюбики, ингаляторы, нагнетатели, мешки, флаконы, контейнеры, шприцы, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранной композиции и выбранного способа введения и лечения. Предусматривается широкий набор предлагаемых в настоящей работе соединений и композиций, поскольку существуют различные способы лечения любого расстройства, в котором участвует в качестве посредника или участника в развитии симптомов или причины инфекция вирусом гепатита С (НСУ).
В настоящей работе предлагаются также комплекты, содержащие композиции и/или наборы вместе с инструкциями по их применению. Комплект может дополнительно включать иглу или шприц, обычно упакованные в стерильном виде, для инъекции комплекса и/или упакованную подушечку со спиртом. По усмотрению вкладываются инструкции для врача или пациента по введению активного средства. Например, в настоящей работе предлагается комплект, содержащий шприц небольшого объёма с эффективным количеством кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, таким, как от 1 до 5000 ед. растворимого гликопротеина, в объёме от 5 до 50 мкл; по усмотрению комплект содержит второй шприц с вязкоупругим веществом. В настоящей работе предлагается также комплект, содержащий шприц небольшого объёма с эффективным количеством кНА8ЕСР человека или его растворимого гиалуронидазного домена, таким как от 1 до 500 ед. растворимого гликопротеина, и терапевтическое количество второго активного ингредиента, такого как лекарство, небольшая молекула, белок или нуклеиновая кислота.
К. Животные модели
В настоящей работе предлагаются модели трансгенных животных и животные, такие как грызуны (в том числе мыши и крысы), коровы, куры, свиньи, козы, овцы, обезьяны (в том числе гориллы) и другие приматы. В частности, предлагаются трансгенные животные (не люди), содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид кНА8ЕСР, или трансгенное животное, у которого экспрессия полипептида была изменена, например, путём замены или модификации промоторной области или другой регуляторной области эндогенного гена. Такое животное может быть получено путём рекомбинации (акта гомологичной или иной рекомбинации) между эндогенной нуклеиновой кислотой и экзогенным геном кНА8ЕСР, который может быть сверхэкспрессирован или недоэкспрессирован как в случае экспрессии под сильным промотором.
Трансгенных животных можно получить введением нуклеиновой кислоты с помощью любого известного способа доставки, в том числе (но не ограничиваясь ими) с помощью микроинъекции, липофекции и других способов доставки гена в половые или соматические клетки, такие как стволовые клетки эмбриона. Как правило, нуклеиновую кислоту вводят в клетку, такую как стволовую клетку эмбриона (СКЭ), с последующей инъекцией СКЭ в бластоцисту и имплантированием бластоцисты суррогатной матери, после чего рождается трансгенное животное. Вообще введение молекулы гетерологичной нуклеиновой кислоты в хромосому животного происходит вследствие рекомбинации между гетерологичной нуклеиновой кислотой, кодирующей кНА8ЕСР, и эндогенной нуклеиновой кислотой. Гетерологичная
- 54 009383 нуклеиновая кислота может быть адресованно нацелена на определённую хромосому. В некоторых случаях могут быть получены животные с нокаутом гена (нокаутированные животные). Такое животное может быть вначале получено с помощью гомологичной рекомбинации между геном полипептида кНАЗЕСР в его хромосоме и эндогенным геном полипептида кНАЗЕСР, который был сделан биологически неактивным (обычно путём вставки гетерологичной последовательности, например, гена устойчивости к антибиотику). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такую гомологичную рекомбинацию осуществляют, трансформируя полученные из эмбриона стволовые клетки вектором, содержащим инактивированный вставкой ген полипептида кНАЗЕСР, так что происходит гомологичная рекомбинация. После этого производят инъекцию СКЭ в бластоцисту и имплантируют бластоцисту суррогатной матери. В итоге рождается химерное животное (нокаутированное животное), у которого ген полипептида кНАЗЕСР был инактивирован (см. Сареса //Заепсе. 1989, ν. 244, р. 1288-1292). Химерное животное можно размножить, чтобы получить гомозиготных нокаутированных животных, которых дальше можно использовать для получения дополнительных нокаутированных животных. Нокаутированные животные включают (но не ограничены ими) мышей, хомячков, овец, свиней, коров и других животных, не являющихся людьми. Например, получают нокаутированную мышь. Полученных животных, проявляющих подавленную экспрессию полипептида кНАЗЕСР, можно использовать в качестве моделей специфических заболеваний, таких как рак. Таких нокаутированных животных можно использовать как животные модели таких заболеваний, например, для поиска (скрининга) или испытания молекул на способность лечить или предотвращать такие заболевания или расстройства.
Могут быть получены также другие типы трансгенных животных, в том числе таких, у которых полипептид кНАЗЕСР сверхэкспрессируется. Такие животные включают «нокаутированных» животных, которые представляют собой животных, у которых нормальный ген замещён вариантом, таким как мутантный ген, его сверхэкспрессируемая форма или иная форма. Например, эндогенный ген одного вида, такого как грызуны, может быть замещён геном из другого вида, такого, как человек. Можно также получить животных с помощью негомологичной рекомбинации в других сайтах хромосомы, в том числе животных, у которых произошло множество интеграционных событий.
После получения трансгенного животного первого поколения химерное животное можно размножить, чтобы получить дополнительных животных со сверхэкспрессией или с подавленной экспрессией полипептида кНАЗЕСР. Такие животные включают (но не ограничены ими) мышей, хомячков, овец, свиней, коров и других животных, не являющихся людьми. Таких животных, проявляющих сверхэкспрессию или подавленную экспрессию полипептида кНАЗЕСР, можно использовать в качестве моделей специфических заболеваний, таких как рак. Таких животных можно использовать как животные модели таких заболеваний, например, для поиска (скрининга) или испытания молекул на способность лечить или предотвращать такие заболевания или расстройства. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения получают мышь со сверхэкспрессией или подавленной экспрессией полипептида кНАЗЕСР.
Следующие примеры приведены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения области охвата изобретения.
Ь. Терапевтические применения кНАЗЕСР
В течение более 40 лет скотобойни являются основным источником ферментных препаратов для клинического применения. Основной источник этого материала - яички быков и баранов. Однако эти клинические ферментные препараты очень плохо очищены, степень чистоты продаваемых препаратов составляет 0,5-5% (оценка на основании известных значений удельной активности от 30 до 100000 ед./мг). Низкая степень чистоты, вместе с происхождением из скотобоен, делает эти препараты иммуногенными для человека, вдобавок они могут быть потенциальной причиной болезни Крейтцфельда-Якоба и источником других коровьих и овечьих патогенов. Известно, что препараты гиалуронидазы быков и баранов дают анафилактические реакции.
Гиалуронидазу крупного рогатого скота или полученную из бактерий гиалуронидазу применяли для лечения заболеваний, связанных с избытком гиалуроновой кислоты, и для усиления циркуляции физиологических жидкостей и/или терапевтических агентов. Например, бычью гиалуронидазу можно вводить инъекцией в перибульбарный, ретробульбарный и подсухожильный отделы совместно с процедурами офтальмохирургии. Кроме того, без такого введения повышается частота хирургических осложнений (Вготеп З.М. е1 а1. //1. Са1агас1 ВеГгас! Зигд. 1999, ν. 25, 9, р. 1245-1249). Бычью гиалуронидазу применяют также как антидот в локальных некрозах после вневенозной инъекции некротических веществ, таких как алкалоидов барвинка (Бете В.Т //Атег. 1. Ма1егп. 0Ίιί1ά Мнк. 1987, ν. 12, р. 23-26). Гиалуронидаза из бычьих тестикул полезна также для лечения кист запястья (Раи1 е1 а1. //1. Напб Зигд. 1997, ν. 22, 2, р. 219-221). Гиалуронидазу можно также использовать для облегчения подкожной доставки жидкостей при гиподермоклизе (Вегдег В.У. //Ат. Сепа1г. Зос. 1984, ν. 32, 3, р. 199-201). Можно также применять гиалуронидазу для снижения внутриглазного давления у пациентов с глаукомой и катарактой, получавших вязкоупругие вещества (патент США № 4820516, опубликован 11 апреля 1989 г.).
Гиалуронидазу крупного рогатого скота или полученную из бактерий гиалуронидазу применяли также как «распределяющее средство» для усиления активности химиотерапевтических веществ и/или повышения активности опухолей к химиотерапевтическим веществам (ЗсЬи11ег е1 а1. //Ргос. Атег. Аккос.
- 55 009383
Сапсег Вез. 1991, ν. 32, р. 173, тезис № 1034; Схе)ка е! а1. //Ркагтах1е. 1990, ν. 45, р. Н.9). Комбинационная терапия вместе с гиалуронидазой эффективна в лечении многих типов рака, включая рак мочевого пузыря (Нот е! а1. //1. 8игд. Опсо1. 1985, ν. 28, р. 304-307), карциному клеток плоского эпителия (КоЬпо е! а1. //1. Сапсег Вез. Опсо1. 1994, ν. 120, р. 293-297), рак молочной железы (Бескеи1ейие^ е! а1. //1. Сапсег Вез. Опсо1. 1992, ν. 118, р. 591-596) и рак желудочно-кишечного тракта (8сйеййаиег е! а1. //Апйсапсег Вез. 1988, ν. 8, р. 391-396). Гиалуронидаза эффективна как единственное терапевтическое средство в лечении рака мозга (глиом) (международная публикация VО 88/02261, опубликована 7 апреля 1988 г.). Введение гиалуронидазы также индуцирует чувствительность до этого устойчивых к химиотерапии опухолей поджелудочной железы, желудка, толстой кишки, яичников и молочной железы (ВаитдагШег е! а1. //Вед. Сапсег Тгеа!. 1988, ν. 1, р. 55-58; 2апкег е! а1. //Ргос. Атег. Аззос. Сапсег Вез. 1986, ν. 27, р. 390). К сожалению, примеси и нечеловеческая природа таких гиалуронидаз приводят к анафилактическим реакциям.
Гиалуронидаза из крупного рогатого скота, помимо её непрямого антиракового действия, обладает прямым антиканцерогенным действием. Гиалуронидаза предотвращает рост трансплантированных мышам опухолей (Эе Маеуег е! а1. //1п!. 1. Сапсег. 1992, ν. 51, р. 657-660) и ингибируют образование опухолей после действия канцерогенов (Ра\\'1о\\'зк| е! а1. //1п!. 1. Сапсег. 1979, ν. 23, р. 105-109; НаЬегтап е! а1. //Ргосеебтдз оГ 111е 17'1' Апииа1 Меейпд оГ 111е Атепсап 8ос1е1у оГ С11шса1 Опсо1оду, VазЫид!ои, Э.С. 1981, ν. 22, р. 105, тезис № 415).
Принимая во внимание значение гиалуронидаз из крупного рогатого скота как терапевтического средства, особенно в химиотерапии в сочетании с обычными химиотерапевтическими средствами, и самой по себе как химиотерапевтического средства, в данной области существует потребность в существенно чистых препаратах гиалуронидазы человеческого происхождения. Существует также потребность в эффективных, экономически выгодных способах получения гиалуронидазы для получения имеющих промышленное значение количеств фермента. Настоящее изобретение направлено на решение этих проблем.
Гиалуроновая кислота является важным компонентом внеклеточного матрикса. Гиалуроновая кислота обнаружена в соединительных тканях млекопитающих и является главной составляющей стекловидного тела глаза. В соединительной ткани связанная с гиалуроновой кислотой гидратная вода создаёт просветы между тканями, образуя окружение, способствующее перемещению и пролиферации клеток. Гиалуроновая кислота играет ключевую роль в биологических процессах, связанных с подвижностью клеток, включая быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, залечивание ран, ангиогенез и онкогенез (развитие опухолей) (Тоо1е //«Се11 Вю1. Ех!гасе11. Майях». Под ред. Нау. Р1епит Ргезз, №\ν Уогк, 1991, р. 1384-1386; Вейгапб е! а1. //1п!. 1. Сапсег. 1992, ν. 52, р. 1-6; Кпибзоп е! а1. //РА8ЕВ 1. 1993, ν. 7, р. 1233-1241). Кроме того, уровни гиалуроновой кислоты коррелируют с агрессивностью раковых опухолей (Охе11о е! а1. //Сапсег Вез. 1960, ν. 20, р. 600-604; ТакеисЫ е! а1. //Сапсег Вез. 1976, ν. 36, р. 2133-2139; К1та!а е! а1. //Сапсег Вез. 1983, ν. 43, р. 1347-1354).
После повреждения спинного мозга глиальные рубцы создаются астроцитами и содержат хондроитин-сульфат-протеогликаны (ХСПГ). ХСПГ играют ключевую роль в ингибировании роста аксонов (Ьеνί^, 1994; Ро\ге11 е! а1., 1997). Например, в ходе развития зародыша ХСПГ отклоняют аксоны и ингибируют адгезию нервных клеток. ХСПГ играют также важную роль в образовании пограничного слоя (8поте е! а1., 1990, 1992; Ро\ге11 апб Се11ег, 1999). Кроме того, экспрессия ХСПГ повышается после повреждения центральной нервной системы (МсКеоп е! а1., 1991; Оа\зез е! а1., 1997).
Исследования показывают, что ингибирующее действие ХСПГ преимущественно связано с сахарной цепью хондроитин-сульфат-гликозаминогликана (8поте е! а1., 1990; Со1е апб МсСаЬ1е, 1991; Се1зеп апб В^баизе!, 1993). Это подтверждается обнаружением того, что внутриоболочечное введение бактериальной ходроитиназы действительно способствует регенерации аксонов. Более того, в электрофизиологических опытах установлено, что регенерированные аксоны, подвергнутые электрошоку, устанавливают функциональные соединения (ВгабЬигу е! а1., 2002). Кроме прямого ингибирующего действия, ХСПГ могут также взаимодействовать с молекулами клеточной адгезии или нейротропными факторами, влияя на выпячивание отростков нейритов (ВоЬейз е! а1., 1988; Виоз1айй апб УатадисЫ, 1991; МПег е! а1., 1994). Поэтому рекомбинантные гиалуронидазы млекопитающих полезны для обращения ингибирующего действия ХСПГ в глиальных рубцах и для поддержки регенерации аксонов после повреждения.
Количество зНА8ЕСР, необходимое для существенного разрушения ХСПГ в глиальных рубцах, может варьировать. В некоторых случаях для удаления ХСПГ из рубцов может потребоваться повторное внутриоболочечное введение 10-5000 ед. зНА8ЕСР. В других случаях может быть предпочтительным длительное высвобождение зНА8ЕСР при использовании композиций с медленным высвобождением. В качестве альтернативы для усиления расщепления ХСПГ может быть эффективным введение векторов генной терапии, кодирующих зНА8ЕСР.
Можно также использовать зНА8ЕСР для лечения грыжевых дисков с помощью процесса, известного как хемонуклеолиз. Хондроитиназа АВС и фермент, расщепляющий подобные субстраты (такой как зНА8ЕСР), может индуцировать снижение внутридискового давления в поясничном отделе позвоночника (8азак1 е! а1., 2001; 1з1ика\га е! а1., 1999). Существуют три типа повреждений дисков. Выпяченный диск - это диск интактный, но выступающий. В вытесненном диске волокнистый покров разорван и нуклео
- 56 009383 плазма вытекла, но ещё соединена с диском. В изолированном диске фрагмент нуклеоплазмы разрушен и утрачен из диска и свободно располагается в позвоночном канале. Хемонуклеолиз эффективен при повреждениях выпяченных и вытесненных дисков, но не для изолированных дисков.
В США хемонуклеолиз разрешён только для использования в поясничном (нижнем) отделе позвоночника. В других странах он также был успешно применён для лечения шейных (в верхней части позвоночника) грыж. Таким образом, хемонуклеолиз - это консервативная альтернатива дисковой хирургии, если она предпочтительна для снижения давления в дисках.
Точный состав и структура углеводной цепи (углеводных цепей) в гликопротеине может непосредственно влиять на его время жизни в сыворотке, так как клетки печени и ретикулоэндотелиальная система могут связывать и интернализовать циркулирующие гликопротеины со специфическими углеводами. Гепатоциты имеют на своей поверхности рецепторы, распознающие олигосахаридные цепи с терминальными остатками Са1 (т.е. находящимися на наиболее удалённом конце (концах) гликанов относительно полипептида), макрофаги имеют рецепторы для терминальных остатков Маи или С1сNАс, и гепатоциты и лимфоциты имеют рецепторы для доступных остатков фукозы. Однако не были обнаружены рецепторы, специфичные по отношению к сиаловой кислоте. Хотя кое-что зависит от пространственного окружения олигосахаридов, основное правило гласит, что чем больше число экспонированных сахарных остатков, распознаваемых рецепторами поверхности клеток в печени и ретикуло-эндотелиальной системе, тем быстрее гликопротеин будет удалён из сыворотки. Однако, благодаря отсутствию специфичных к сиаловой кислоте рецепторов, олигосахариды, у которых все ветви завершены или «увенчаны» сиаловой кислотой, не способствуют расщеплению белка, к которому они прикреплены.
Наличие и природа олигосахаридной цепи (цепей) на гликопротеине может также, помимо его распознавания сахароспецифичными рецепторами на клетках печени и ретикуло-эндотелиальной системы, влиять на его важные биохимические свойства. Удаление углевода из гликопротеина обычно снижает его растворимость и может также повышать его восприимчивость к протеолитической деструкции путём дестабилизации правильного сворачивания (фолдинга) полипептида и/или демаскировки чувствительных к протеазам сайтов. По этим же причинам статус гликозилирования протеина может влиять на его распознавание иммунной системой.
Можно использовать кНА8ЕСР для удаления скопления клеток (кумулюсных клеток), окружающих яйцеклетку, перед криоконсервацией и другими процедурами фертилизации ίη νίΐτο (1УЕ), такими как внутрицитоплазматическая инъекция спермы (ВЦИС). К собранным овоцитам можно добавить гиалуронидазу в концентрации от 10 до 200 ед./мл в забуференных солевых растворах. Овоциты отделяют отсасыванием от высвобожденных кумулюсных клеток и промывают несколько раз средой без гиалуронидазы. Затем яйцеклетки можно обработать для криоконсервации или техники 1УЕ.
Полезно использовать также кНА8ЕСР для обеспечения более эффективного проникновения химиотерапевтических агентов в плотные (солидные) опухоли. Можно инъецировать кНА8ЕСР в опухоль вместе с противораковыми агентами или проводить инъекцию внутривенно в случае диссеминированных типов рака или опухолей, доступ к которым затруднён. Противораковым агентом может быть химиотерапевтическое соединение, антитело, пептид или осуществляющие генотерапию вектор, вирус или ДНК. Кроме того, можно использовать кНА8ЕСР для возвращения раковых клеток в циклический пул для повышения чувствительности до этого устойчивых к химиотерапии опухолей, приобретших множественную лекарственную устойчивость (8ΐ. Οϊοίχ еΐ а1. //Саисег Ьей. 1998, ν. 131, № 1, р. 35-44). Полезны кНА8ЕСР также для усиления доставки биологических средств, таких, как моноклональные антитела, цитокины и другие лекарственные средства, в опухоли, накапливающие гликозаминогликаны. У многих опухолей делетированы гены, отвечающие за катаболизм гликозаминогликанов, так что их локализованное накопление может мешать противоопухолевым агентам и иммунной системе достигать массы опухоли.
Можно также применять кНА8ЕСР для повышения чувствительности опухолей, устойчивых к обычной химиотерапии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кНА8ЕСР вводят пациенту, имеющему опухоль, ассоциированную с дефектом ЬиСа-1, в количестве, эффективном для повышения диффузии вокруг местонахождения опухоли, например, для повышения циркуляции химиотерапевтических средств, например, путём облегчения циркуляции и/или повышения концентрации химиотерапевтических средств внутри и вокруг местонахождения опухоли, ингибирования подвижности опухоли, например, путём расщепления гиалуронана (ГУ) и/или для понижения у опухолевой клетки (клеток) порога апоптоза, т.е. для приведения опухолевой клетки (клеток) в состояние аноикии, когда опухолевая(ые) клетка(и) становится более восприимчивой к действию химиотерапевтических средств или других средств, которые могут способствовать гибели клеток, более предпочтительно способствуя программированной гибели клеток в состоянии аноикии.
Термин «химиотерапевтические средства», как он использован в настоящей работе, подразумевает, что он охватывает все молекулы, синтетические (например, «цисплатин») и существующие в природе (например, фактор некроза опухолей), которые способствуют ингибированию роста опухолевых клеток и предпочтительно способствуют, предпочтительнее преимущественно способствуют гибели опухолевых клеток.
Особенный интерес представляет применение кНА8ЕСР для лечения метастазирующих и немета
- 57 009383 стазирующих раковых заболеваний, особенно метастазирующих типов рака, имеющих сниженную вплоть до неразличимости активность гиалуронидазы по сравнению с нераковыми (нормальными) клетками. Можно использовать κΗΑδΕΟΡ как химиотерапевтическое средство (само по себе или в комбинации с другими химиотерапевтическими препаратами) в лечении любого из множества типов рака, в частности инвазивных опухолей. Например, κΗΑδΕΟΡ можно использовать для лечения карциномы мелких клеток лёгких, карциномы сквамозных клеток лёгких, а также всех типов рака молочной железы, яичников, головы и шеи, или любого другого типа рака, ассоциированного с подавленными уровнями гиалуронидазы или с дефектным геном ЬиСа-1 (ЬрΗΑаза) (например, геном ЬиСа-1, который не обеспечивает адекватный уровень экспрессии ΙψΗΑη’ϊΕΐ (полипептида гиалуронидазы человека) или кодирует дефектную гиалуронидазу, которая не обеспечивает адекватный уровень гиалуронидазной активности), или с иным дефектом, связанным с подавлением катаболизма гиалуронана. κΗΑδΕΟΡ предпочтителен для лечения злокачественных опухолей, связанных с дефектным катаболизмом ГУ, поскольку в этом случае для деструкции не требуется участие клеток.
Специалист с обычной квалификацией в данной области может легко определить подходящую для введения специфическую дозировку, исходя из обсуждённых выше факторов (см., например: Ηπιτίκοη //^14^108 οΤ [п1егпа1 МеЛкте, 11-е изд., 1987). Кроме того, оценки подходящих дозировок для человека могут быть получены экстраполяцией из определений уровня ферментативной активности κΗΑδΕΟΡ ш νίΐτο и/или дозировок, эффективных в исследованиях на животных. Например, 70-300 ед. ТКИ гиалуронидазы эффективны в снижении опухолевого давления у мышей линии кс1Л. Принимая во внимание эту информацию, соответствующие дозировки для человека средним весом 70 кг должны быть в интервале от приблизительно 250000 до приблизительно 1200000 ТКИ гиалуронидазы. Количество вводимого пациенту-человеку κΗΑδΕΟΡ обычно находится в интервале от приблизительно 1 ТКИ до приблизительно 5000000 ТКИ ферментативной активности, предпочтительно от приблизительно 1000 ТКИ до приблизительно 2500000 ТКИ, более предпочтительно от приблизительно 100000 ТКИ до 1500000 ТКИ, нормально от приблизительно 250000 ТКИ до 1200000 ТКИ, при средних предписанных дозах около 725000 ТКИ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представлена композиция с κΗΑδΕΟΡ в 0,15 М растворе соли, содержащем κΗΑδΕΟΡ в концентрации около 150000 ТКи/мл. Композицию затем вводят внутривенной инъекцией при дозировке 15000 ТКИ/кг массы тела пациента. В качестве альтернативы ферментную композицию можно также ввести подкожной инъекцией, чтобы обеспечить возможность перфузии гиалуронидазы вокруг места опухоли. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения κΗΑδΕΟΡ инъецируют около опухоли или в толщу опухоли. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения κΗΑδΕΟΡ входит в состав липосомной композиции и доставляется инъекцией либо внутривенно, либо в месте, либо возле места роста раковых клеток, имеющих дефект гена ЬиСа-1 (ген ΙψΗΑη’ϊΕΐ). Внутривенная инъекция κΗΑδΕΟΡ приводит к попаданию κΗΑδΕΟΡ в место развития опухоли. Кроме того, сверхсиалированный κΗΑδΕΟΡ предпочтителен для парентерального введения, так как оконечные сиаловые кислоты на κΗΑδΕΟΡ предотвращают выведение фермента из циркуляции ретикуло-эндотелиальной системой. Сравнение сверхсиалированного κΗΑδΕΟΡ с несиалированной гиалуронидазой крупного рогатого скота и другими несиалированными гиалуронидазами показывает, что достигается гораздо более благоприятная фармакокинетика.
Помощь в генной терапии.
Эффективность большинства переносчиков для достаки генов ίη νίνο не соответствует их эффективности, достигнутой ίη νίΐτο. Гликозаминогликаны могут препятствовать переносу и диффузии ДНК и вирусных векторов во многих типах клеток. Этот материал внеклеточного матрикса может существенно подавить процесс. Дубенский с соавторами (Όπ4η^ е1 а1. //Ггос. №И. ΑсаЛ. 8ст υδΑ. 1984, ν. 81, № 23, р. 7529-7533) показали, что гиалуронидаза в соединении с коллагеназой может улучшить трансдукцию ДНК ίη νίνο. Было установлено, что аденоассоциированный вирус также может осуществлять генную терапию при посредстве гиалуронидазы (Рауте е1 а1. //Сене ТНег. 2000, ν. 7, № 16, р. 1417-1420).
Авторы настоящего изобретения установили, что κΗΑδΕСΡ открывает во внеклеточном матриксе каналы определённого размера. Эти поры не способны усилить диффузию веществ диаметром более 200-500 нм. Однако κΗΑδΕСΡ может усиливать диффузию молекул меньшего размера, таких как ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и комплексы ДНК.
В качестве альтернативы вирусы можно снабдить геном κΗΑδΕСΡ, чтобы способствовать их репликации и распространению, например, в целевой ткани. Целевой тканью может быть раковая ткань, в соответствии с чем вирус становится способным к селективной репликации внутри опухоли. Вирус может быть также нелитическим вирусом, причём вирус селективно реплицируется под контролем тканеспецифичного промотора. Когда вирус реплицируется, совместная экспрессия κΗΑδΕСΡ с вирусными генами будет способствовать распространению вируса ίη νίνο.
В качестве альтернативы представляющая интерес нуклеиновая кислота и κΗΑδΕСΡ могут применяться одновременно или последовательно или так, чтобы их введение было распределено во времени. Одновременно - относится к совместному введению. В этом случае два необходимых компонента могут
- 58 009383 быть смешаны с образованием композиции перед введением или они могут быть введены в клетку или в организм-хозяин в одно и то же время. Можно также вводить их последовательно, т.е. один после другого, вне зависимости от того, какой компонент комбинации по настоящему изобретению вводится первым. Наконец, можно использовать способ введения, который распределён во времени или прерывается, или же прерывается и возобновляется через интервалы времени, которые могут быть или могут не быть регулярными. Важно отметить, что пути и места введения двух компонентов могут быть различными. В соответствии с одним особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, кΗΑ8ΕСΡ вводят до нуклеиновой кислоты, причём путь введения двух компонентов предпочтительно один и тот же. Интервал времени между инъекциями не очень важен и может быть определён опытным специалистом. Можно рекомендовать интервал от 10 мин до 72 ч, полезно от 30 мин до 48 ч, предпочтительно от 1 до 24 ч и весьма предпочтительно от 1 до 6 ч.
Кроме того, композицию (продукт в соответствии с настоящим изобретением) можно также объединять с одной или более из молекул, которые предназначены для улучшения введения нуклеиновой кислоты. Этими молекулами могут быть молекулы, обладающие защитным действием по отношению к нуклеиновой кислоте (защита от разрушения в клетке), которые улучшают её проникновение в клеткухозяин или экспрессию её в клетке-хозяине (это могут быть способный к слиянию пептид, сигнал ядерной локализации и т.д.), обеспечивают нацеливание на определённый тип клеток (лиганд или антитело, распознающие белок клеточной поверхности и т.д.) или пролонгирующие терапевтический эффект (иммуносупрессирующее средство и т.д.). Композиция может быть также объединена с агентами, улучшающими трансфекцию (белки и т.д.).
Композицию по настоящему изобретению можно готовить с учётом местного или парентерального введения или для введения через пищеварительный тракт. Путями, которые следует особо упомянуть, являются внутрижелудочный, подкожный, внутрисердечный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрисуставной, внутриопухолевый, внутрилёгочный, интраназальный и внутритрахеальный и, в особенности, внутримышечный путь. Введение может быть произведено с помощью любой известной техники (инъекция, введение через рот, аэрозоль, закапывание и т.д.), единичной дозой или дозой, которая повторяется один или несколько раз через определённый интервал времени. Путь введения может быть выбран таким образом, чтобы он соответствовал возможности передачи целевого гена и лечения заболевания. Композиция может включать фармацевтически приемлемые носители (наполнители, адъюванты и т.д.). Вызывающее разрушение внеклеточного матрикса вещество и целевую нуклеиновую кислоту предпочтительно растворяют в буфере, подходящем для фармацевтического применения, который может быть гипертоническим, гипотоническим или изотоническим. Могут быть предусмотрены различные буферы. Для иллюстрации могут быть упомянуты следующие буферы:
физиологический солевой раствор (0,9% №С1), не физиологический солевой раствор (1,8% №С1), раствор Рингера с ΗΕΡΕ8 (оксиэтилпиперазин-этансульфонат), раствор Рингера с лактатом, буфер на основе трис-НС1 (10 мМ трис-НС1, рН от 7,5 до 8, 1 мМ ЭДТА; 10 мМ трис-НС1, рН от 7,5 до 8, 1 мМ М§С12), фосфатный буфер (фосфатный буфер с Н2О по Кребсу), раствор сахара (глюкозы, сахарозы, трегалозы и т.д.) или просто вода.
Подкожное введение жидкости.
Подкожное введение (вливание) жидкости - это удобный и лёгкий способ введения воды пациентам со слабым и умеренным обезвоживанием, особенно людям пожилого возраста. Способ считается безопасным и не связан с серьёзными трудностями. Наиболее частый побочный эффект - это небольшой подкожный отёк, с которым справляются местным массажем или системным введением диуретиков. За период 24 ч в два разных места можно ввести около 3 л. Обычными местами вливания являются грудная клетка, живот, бёдра и плечи. Предпочтительный раствор - это нормальный физиологический солевой раствор, хотя могут быть использованы и другие растворы, такие как половинный солевой раствор, глюкоза в физиологическом солевом растворе или 5% глюкоза. При необходимости в ёмкость с раствором может быть добавлен хлорид калия. Кроме того, подобным путём могут быть введены другие лекарства. Для усиления поглощения жидкости и повышения общей скорости введения можно добавить кΗΑ8ΕСΡ человека. Для повторяемого подкожного вливания жидкостей кΗΑ8ΕСΡ человека предпочтителен перед ферментами из скотобойни, так как он не иммуногенен, в отличие, как известно, от фермента крупного рогатого скота. Его могут вводить в домашних условиях члены семьи или медсестра, и с этой техникой должен быть знаком каждый семейный врач.
У амбулаторных пациентов места для подкожного вливания включают живот, грудную клетку (над молочными железами) межрёберное пространство и лопаточную область. Для лежачих пациентов предпочтительными местами являются бёдра, живот и наружная поверхность плеч. Через 1-4 дня иглу и трубки следует сменить, хотя устройства для вливания оставляли на месте без всяких проблем в течение более длительных периодов. Можно также провести введение ударных вливаний («болюсов») по 500 мл в течение 1-2 ч три раза в день с введением 150 ед. кΗΑ8ΕСΡ подкожно перед первым утренним вливанием.
- 59 009383
Улучшение терапевтических инъекций.
Многие молекулы, если они введены через кожу, попадают в кровоток медленно или с очень низкой эффективностью. Фармакокинетику и фармакодинамику молекул, введённых инъекцией подкожно (п/к) или внутримышечно (в/м), регулируют несколько факторов. Как правило, молекулы большего размера при отсутствии активного транспорта достигают кровотока медленнее и менее эффективно. Биологическую доступность при подкожном введении определяют, вычисляя отношение площадей под кривыми (ППК) для подкожного и внутривенного введений (ППКп.к/ППКв.в). Вторым фактором является заряд и сродство к молекулам матрикса, что может играть роль в подкожном накоплении молекул. Если эти материалы разрушаются в месте введения, они могут никогда не достигнуть своих желательных мишеней, что приведёт к снижению общей организменной биологической доступности по отношению к органам-мишеням.
Крупные белки обычно вводят внутривенно, так что медикамент прямо поступает в кровоток. Может, однако, оказаться удобным, чтобы медикамент можно было ввести подкожно, внутримышечно или внутрикожно, так как эти пути введения гораздо легче переносятся пациентом. Это особенно важно, если медикамент нужно вводить регулярно в течение всей жизни и лечение нужно начать рано, уже в детском возрасте пациента. Однако медикамент с очень большой и лабильной молекулой, такой как фактор коагуляции VIII с молекулярной массой от 170 до 300 кДа, обычно имеет низкую биологическую доступность, если он введён подкожно, внутримышечно или внутрикожно, так как усвоение недостаточно, а деструкция - сильная.
Кроме необходимости повысить биологическую доступность многих вводимых подкожно биологических веществ, в случаях экстренной медицинской помощи существенно важна также более быстрая фармакокинетика. У многих пациентов время, за которое достигается внутривенный доступ, таково, что это делает невозможным применение лекарства, которое при системном введении действует достаточно быстро. В некоторых случаях за неудачей в достижении внутривенного доступа следует подкожная инъекция, что ещё больше отодвигает достижение органа-мишени. Таким образом, более быстрая биологическая доступность подкожно вводимых лекарств дала бы преимущество этому способу первоочередного лечения, взамен риска получить слишком большое время достижения внутривенного доступа. Примеры молекул, которые можно вводить подкожно так же, как и внутривенно, включают эпинефрин, атропин, наркан, лигнокаин и декстрозу.
Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в способности доставлять п/к или в/м равные или большие объёмы растворов без боли и повреждений, связанных с давлением и большим объёмом раствора в месте инъекции.
Кровоизлияние в стекловидное тело.
В попытке минимизировать опасность дальнейшего отслоения или повреждения сетчатки при проведении витректомии Надетап ранее предложил (патент США № 5292509) инъецировать в стекловидное тело некоторые не содержащие протеаз гликозаминогликаназные ферменты, чтобы до удаления стекловидного тела предотвратить его связывание с сетчаткой или проникновение в сетчатку. Такое предотвращение проникновения или связывания стекловидного тела нацелено на минимизирование опасности того, что при удалении стекловидного тела может произойти дополнительное повреждение или отслоение сетчатки. Примеры специфических не содержащих протеаз гликозаминогликаназных ферментов, которые можно использовать для предотвращения такого проникновения стекловидного тела, включают хондроитиназу АБС, хондроитиназу АС, хондроитиназу Β, хондроитин-4-сульфатазу, хондроитин-6сульфатазу, гиалуронидазу и бета-глюкуронидазу.
Хотя было известно, что фермент гиалуронидаза полезен для различных офтальмологических применений, включая применение при витректомии, описанное в патенте США № 5292509 (Надетап), опубликованные результаты исследований указывали на то, что гиалуронидазный фермент сам может быть токсичен для сетчатки и/или других анатомических структур глаза (см. Сο((1е^Ь 1.Б. //Тйе 8аГе1у οΓ ШйиуйгеЦ Нуа1игошбазе; Аηίοзζук А.К, На1сйе11 О.Б. апб 8ο1οир^з Р. /Л^езк Οрйίа1щο1. V^з. 8с1. 1990. Ν. 31, № 11, р. 2345-2352). Более того, используемые неочищенные препараты гиалуронидазы со скотобоен могут вызывать увеит или воспаление глаза. Поэтому применение человеческого зНА8ЕОР предпочтительно из-за его более высокой эффективности и чистоты, а также из-за того, что он не имеет животного происхождения и поэтому не может вызвать при повторном применении иммунологических реакций и направляемой антителами нейтрализации. В другом осуществлении в глаз можно инъецировать ПЭГилированную форму зНА8ЕОР. Такой ПЭГилированный зНА8ЕОР не так быстро выводится из стекловидного тела и сохраняет свою активность в стекловидном теле в течение более длительного времени.
Офтальмологическая токсичность некоторых препаратов гиалуронидазы была подтверждена другими исследователями, которые предположили, что такие препараты гиалуронидазы следует использовать как токсический раздражитель в моделях токсичности у животных, чтобы вызывать экспериментально возбуждаемую неоваскуляризацию глаз (см. Аηίοзζук А.К, ΟοΙίΕΦ кЬ., Сазеу В.С., На1сйе11 О.Б апб Масйетег В. Ап Ехрептеп1а1 Μοбе1 οΓ Ргегейпа1 Nеονазси1а^^ζаί^οη т 1йе ВаЬЬ11. /Лпуез!. Οрйίа1щο1. V^з. 8с1. 1991, ν. 32, № 1, р. 46-51). Для внутриглазных процедур предпочтительно использовать высокоочищенный зНА8ЕОР, не содержащий связанных с ртутью и ведущих происхождение от скота или бак
- 60 009383 терий примесей. Более того, рекомбинантный человеческий кНА8ЕСР предпочтителен перед препаратами со скотобоен, благодаря его чистоте - отсутствию патогенов крупного рогатого скота, и сниженному риску иммуногенности. ПЭГилированный кНА8ЕСР рассматривается как наиболее предпочтительный.
Косметические применения кНА8ЕСР.
Известно, что гиалуронидаза имеет свойство деполимеризовать длинные мукополисахаридные цепи основного вещества, ответственные за удержание связанной воды и за замедление, вследствие сжатия капилляров, диффузии органических жидкостей, которая удаляет отходы метаболизма. Такое удержание воды и отходов, связанное с перегрузкой липоцитов жиром, дает классические водянки типа свиной кожи или апельсиновой корки. Поэтому такая деполимеризация разрезает длинные цепи мукполисахаридов на более короткие цепи, что приводит к удалению связанной воды и отходов, восстановлению венозной и лимфатической циркуляции и исчезновению местных водянок.
Вследствие этого для удаления гликозаминогликанов, участвующих в накоплении так называемого целлюлита и усиления лимфатического тока предпочтительно использование кНА8ЕСР с его подкожным введением. Для лечения целлюлита предпочтительно применение человеческого кНА8ЕСР, потому что он способен удалять указанные гликозаминогликаны, но не содержит ведущие к воспалению компоненты белков, получаемых на скотобойнях, имеет высокую степень чистоты и, по-видимому, не иммуногенен. Можно вводить кНА8ЕСР повторными подкожными инъекциями, с помощью чрескожной доставки в форме мазей или кремов или путём использования инъецируемых композиций с медленным высвобождением для обеспечения непрерывной деструкции гликозаминогликанов и предотвращения их возврата.
Трансплантация органов.
Гиалуронан обладает рядом биологических действий, которые частично зависят от его молекулярного размера (\Уек1 Э.С.. Китаг 8. //Ехр. Се11 Кек. 1989, ν. 183, р. 179-196). Содержание гиалуронана в органе повышается при различных состояниях воспаления этого органа. Так, было установлено, что концентрация гиалуронана повышена в тканях различных органов, для которых характерно воспалительноиммунологичское повреждение, такое как альвеолит (№ЦеЫаб1 О. еΐ а1. //Ат. Кеу. Кекр. Эк. 1989, ν. 139, р. 759-762) и инфаркт миокарда (\Уа1бепк1огт еΐ а1. //I. СБп. 1пуе8Ь 1991, ν. 88, № 5, р. 1622-1628). Другими примерами являются отторжение трансплантата (На11дгеп еΐ а1. //I. Ехр. Меб. 1990, ν. 171, р. 2063-2076; ^е11к еΐ а1. //Тгапкр1ап1аНоп. 1990, ν. 50, р. 240-243), пересадка тонкой кишки (^а11апбег еΐ а1. //Тгапкр1апк Ιηΐ. 1993, ν. 6, р. 133-137) или сердца (На11дгеп еΐ а1. //I. СБп. 1пуе8Ь 1990, ν. 85, р. 668673); или воспаление миокарда вирусного происхождения (\Уа1бепк1огш еΐ а1. //Еиг. I. С1ш. Ιηνοδΐ. 1993, ν. 23, р. 277-282).
В области трансплантационной хирургии серьёзную проблему представляет появление интерстициальных водянок при пересадке органов. До 25% трансплантатов набухают до такой степени, что функция на время утрачивается.
Более того, в 2-3% случаев набухание приводит к повреждению почек, приводя к массивному кровоизлиянию.
Можно использовать кНА8ЕСР для разрушения в пересаженном органе накопившихся гликозаминогликанов. Удаление таких гликозаминогликанов способствует удалению воды из трансплантата и, вследствие этого, нормальному функционированию органа. Для снятия интерстициального напряжения как такового можно вводить дозы в диапазоне от 500 до 10000 ед. на 1 кг массы тела.
Патологическое накопление гликозаминогликанов в мозге.
Уровни гиалуронана повышены при большом числе болезненных состояний спинного мозга. У взрослых в норме уровни спинно-мозгового гиалуронана составляют менее 200 мкг/л (Ьаигей еΐ а1. //Айа №иго1. 8сапб. 1996, ν. 94, № 3, р. 194-206). Этот уровень повышается, превышая 8000 мкг/л, при заболеваниях, таких как менингит, стеноз позвоночника, травмы головы и инфаркт спинного мозга. Поэтому для разрушения субстрата при критическом повышении его уровня можно использовать введение кНА8ЕСР либо внутриоболочечным путём, либо путём системной инъекции сверхсиалированного кНА8ЕСР.
Недостаток в мозгу эффективных лимфатиков может также приводить после травмы головы к угрожающей жизни водянке. Накопление гиалуронана является результатом его повышенного синтеза гиалуронан-синтазами и сниженной деструкции. Накопление гиалуронана служит целям повышения содержания воды в повреждённой ткани для облегчения выброса лейкоцитов, но оно может быть летальным. Поэтому введение человеческого кНА8ЕСР пациенту с травмой головы может прекратить тканевое накопление гиалуронана и связанной с ним воды. Человеческий кНА8ЕСР можно вводить внутриоболочечным способом через катетер или в качестве альтернативы сверхсиалированный кНА8ЕСР можно вводить внутривенно, чтобы он достиг мозговой ткани.
После инсульта и возникающей при нём ишемии содержание гиалуронана резко повышается вследствие повышения экспрессии ГУ-синтаз и сниженного катаболизма. Нарушение работы ионных насосов и накопление плазмы в межтканевом пространстве приводит к удержанию жидкости, не удаляемой в достаточной степени лимфатиками, результатом чего является некроз тканей. Некоторые группы пытались предотвратить интерстициальное накопление жидкости после ишемической повторной перфузии блокированием проницаемости сосудов. Однако, как только жидкость удалена из сосудов, нарушение проницаемости сосудов может препятствовать снятию отёка и усугубить болезненное состояние.
- 61 009383
Можно также использовать человеческий кНА8ЕСР для снятия отёков, сопровождающих опухоли мозга, в особенности связанные с множественными формами глиобоастомы. Связанные с опухолями мозга отёки возникают вследствие накопления гиалуронана в нераковых областях мозга, прилегающих к опухоли. Введение гиалуронидазы в места накопления гиалуронана (например, путём внутривенной инъекции или через катетер) может уменьшить связанные с такими злокачественными новообразованиями отёки путём разрушения в этих местах избыточного гиалуронана. Поэтому применение гиалуронидазы при лечении опухолей мозга полезно не только для снижения массы опухоли и подавления роста и/или метастазирования опухоли, но и для снятия отёка, сопровождающего новообразование. Для снятия отёков можно вводить человеческий кНА8ЕСР таким же образом, как вводят бычью тестикулярную гиалуронидазу для лечения отёков (см., например 8а Еагр //Агд. Вгах. Меб, ν. 44, р. 217-220).
Воздействие на накопление гликозаминогликана при сердечно-сосудистом заболевании.
Было установлено, что введение гиалуронидазы после экспериментального инфаркта миокарда в животных моделях может уменьшить размер зоны инфаркта (Мас1еап е! а1. //8с1епсе. 1976, ν. 194, № 4261, р. 199-200). Предполагаемый механизм, по которому бычья гиалуронидаза уменьшает размер зоны инфаркта у животных, состоит в снижении накопления гиалуронана, которое обнаруживается после повторной ишемической перфузии. Считают, что уменьшение размера зоны инфаркта происходит вследствие усиления лимфатического дренажа, усиления оксигенации ткани и снижения содержания воды в миокарде. Хотя на животных моделях можно было добиться уменьшения размера зоны инфаркта, этот успех не воспроизвёлся при расширенных клинических испытаниях на людях. У бычьей тестикулярной гиалуронидазы было очень короткое время полужизни в сыворотке у животных и человека - около 3 мин (\Уо1Г е! а1. //1. Рйагтасо1. Ехр. Т1ег. 1982, ν. 222, № 2, р. 331-337). Это короткое время полужизни объясняется наличием концевых остатков маннозы, которые легко распознаются чистящими рецепторами ретикулоэндотелиальной системы. Хотя у маленьких животных применение гиалуронидазы может быть успешным вследствие меньшей площади поверхности сосудов, необходимо иметь фермент с увеличенным временем полужизни. Сверхсиалированный кНА8ЕСР имеет более благоприятную фармакокинетику, благодаря сиалированию, для которого нет чистящих рецепторов. Сверхсиалированный &НА8ЕСР в дозах в диапазоне от 100 до 200000 ед./кг массы тела может быть применён для облегчения ликвидации избытка гиалуронана после ишемической реперфузии и уменьшения размера зоны инфаркта.
Сверхсиалированный &НА8ЕСР можно также использовать для ограничения развития коронарных бляшек при артериосклерозе. Такие бляшки накапливают гликозаминогликаны и являются посредниками в адгезии макрофагов и ксантомных клеток (Ко1обд1е е! а1. //Аг1епокс1ег. ТйготЬ. Уаке. Вю1. 2002, ν. 22, № 10, р. 1642-1648). Введение сверхсиалированного кНА8ЕСР можно использовать для снижения образования бляшек. Поскольку имеются в виду повторные введения гиалуронидазы в дозах от 100 до 100000 ед./кг, необходимо использовать человеческий рекомбинантный белок с низким риском иммуногенности и увеличенным временем полужизни. Это приведёт к весьма эффективному снижению размера бляшек.
Лечение некроза периферических тканей.
Некроз тканей возникает при многих заболеваниях вследствие венозной недостаточности. Одним из главных препятствий для восстановления роста ткани является недостаточная оксигенация. Было установлено, что внутриартериальное введение гиалуронидазы существенно улучшает клиническую картину у пациентов с окклюзионным поражением артерий (Е1бег е! а1. //Ьапсе!. 1980, р. 648-649). Можно инъецировать кНА8ЕСР внутриартериально 3-5 раз в неделю при дозировке от 10 до 200000 ед.
Улучшение анестезии.
Полученную со скотобоен гиалуронидазу обычно используют для перибульбарной блокады при местной анестезии перед офтальмологической хирургической операцией. Присутствие фермента предотвращает необходимость дополнительной блокады и сокращает время достижения акинезии (отсутствие движений глаз). Наиболее общим является перибульбарное и подсухожильное введение гиалуронидазы при офтальмологических процедурах. Со времени прекращения применения препарата дубаке® были опубликованы сообщения об усилении диплопии (двоения) и птоза (опущения верхнего века) при перибульбарной блокаде (Вготеп е! а1. //1. Са!агас!. КеГгас!. 8игд. 1999, ν. 25, р. 1245-1249).
После приостановки Виетом (\Ууе111) использования препарата дубаке® гиалуронидазный материал из бычьих тестикул поставляется сейчас в лекарственных препаратах составного применения. Однако есть некоторые сомнения по поводу применения составленного экспромтом стерильного продукта: й!!р://тетете.акйр. огс|/к1юг1ас|е/11уа1игошбаке.кГт?сПб= 11944667&СЕТокеп=9426953-геГ#геГ. Составные препараты не являются разрешёнными Фармакологическим комитетом (Еооб апб Эгид Аккошабоп, ЕЭА). Поэтому ЕЭА не контролирует качество или постоянство процесса производства.
&НА8ЕСР в количествах от 10 до 500 ед. может быть смешан непосредственно с 5 мл 2% лидокаина (Ху1осаше), 5 мл 0,5% бупивакаина (Магсате) и, по усмотрению, с эпинефрином в соотношении 1:200000. Можно использовать кНА8ЕСР для ускорения наступления акинезии и для исключения необходимости дополнительной блокады. &НА8ЕСР также идеален для получения акинезии при косметической хирургии (пластические операции на веках и подтягивание кожи лица). Можно также использовать
- 62 009383 κΗΑδΕΟΡ после таких хирургических операций для усиления диффузии противовоспалительных средств и для снижения отёка тканей.
Можно также смешивать κΗΑδΕΟΡ с забуференными растворами, такими как бикарбонат, для предотвращения дискомфорта в ходе процедуры инъекции, с препаратами для анестезии разрывов, чтобы уменьшить общий объём необходимого для инъекции материала и ослабить боль из-за набухания ткани.
Снижение внутриглазного давления.
Повышение внутриглазного давления, возникающее рано и иногда затягивающееся, является общим побочным эффектом, возникающим у пациентов после операции катаракты. Такое болезненное состояние иногда бывает серьёзным, особенно у пациентов с глаукомными изменениями хрусталика. Хотя повышение давления имеет тенденцию быть более серьёзным, когда в ходе операции в глаз водят вязкоупругие средства, такие как гиалуроновая кислота, внутриглазное давление может повышаться после операции, даже если такие средства не использовали. Более того, такое повышение давления может происходить даже тогда, когда в ходе хирургической процедуры вообще не использовали никаких дополнительных медикаментов. В некоторых случаях удобно оставлять вязкоупругое средство в глазу, из-за чего часто необходимо вводить пациентам большие дозы ингибитора карбоангидраз. Эти ингибиторы снижают внутриглазное давление, уменьшая образование водной тканевой жидкости, которую в норме секретирует в глаз реснитчатое тело. Обычные способы уменьшения послеоперационного подъёма внутриглазного давления включают различные типы глазных капель, таких как бета-адренергические блокаторы, симпатомиметические средства, миотики, альфа-11-селективные средства, ингибиторы карбоангидраз и простагландины.
Предпочтительный способ удаления вязкоупругого вещества, такого как гиалуроновая кислота, состоит в инъекции κΗΑδΕΟΡ в течение или сразу после хирургической операции на переднем сегменте или заднем сегменте, хотя возможны также и другие способы введения, известные в данной области. Предпочтительно вводить гиалуроновую кислоту и κΗΑδΕΟΡ путём инъекции в переднюю камеру в ходе хирургической операции на переднем сегменте глаза, чтобы дать возможность гиалуроновой кислоте действовать в качестве прослойки при начале хирургической процедуры. В некоторых случаях трансплантации роговицы комбинацию гиалуроновой кислоты и κΗΑδΕΟΡ можно помещать на поверхность внутриглазных структур перед пришивкой на место трансплантата роговицы. Эту комбинацию можно также использовать при хирургической операции на заднем сегменте, такой как операция на сетчатке или стекловидном теле.
В некоторых случаях может быть целесообразным по окончании хирургической операции оставить вязкоупругое средство, такое как Ыеа1оп®, У1ксоа1® или иные заполняющие пространство вещества, в передней камере глаза. Это особенно верно при положительном подъёме давления, когда содержимое глаза стремится переместиться вперёд и давить на заднюю поверхность роговицы. Если это происходит внутри глаза с поставленным на место синтетическим хрусталиком, давление на эндотелий роговицы может серьёзно повредить клетки. За этим может последовать набухание и помутнение роговицы, что приведёт к ухудшению зрения. Обычно, если внутриглазное давление пациента существенно повысилось к концу хирургической операции, для снижения образования воды и/или усиления её оттока необходимо ввести такому пациенту большие дозы ингибитора карбоангидраз, а также поверхностных глазных капель, таких как бета-блокаторы и альфа-11-агонисты. Все эти средства обладают значительными побочными эффектами и в некоторых случаях противопоказаны пациентам с различными типами медицинских болезненных состояний, таких как проблемы с дыханием, болезни сердца или высокое кровяное давление. Однако применение в таких ситуациях κΗΑδΕΟΡ исключит необходимость введения таким пациентам больших доз этих лекарств.
Кроме того, в трабекулярной сети содержится значительное количество гиалуроновой кислоты. κΗΑδΕΟΡ разрушит её и вследствие этого усилит отток воды через трабекулярную сеть. Это приведёт к снижению у пациента внутриглазного давления. Комбинация κΗΑδΕΟΡ с другими средствами для передней камеры, такими как метилцеллюлоза (например, Осисоа!®, поставляемая фирмой 81огх 1пк1гитеп1 Со.), используемыми как заполнители и/или защитные средства при хирургии катаракты, также будет эффективна для предотвращения существенного повышения давления, поскольку это будет способствовать открытию трабекулярной сети и усилению дренажа жидкости путём разрушения значительного количества гиалуроновой кислоты, присутствующей в трабекулярной сети.
Удаление гликозаминогликанов из трабекулярной сети полезно также для снижения внутриглазного давления у индивидуумов, страдающих открытоугольной глаукомой. Человеческий κΗΑδΕΟΡ можно вводить субконъюнктивальной инъекцией или инъекцией прямо в переднюю камеру.
Киста влагалища сухожилия.
Киста влагалища сухожилия (известная также как киста запястья, библейская киста или киста тыльных сухожилий) - это основная масса мягкой ткани руки. Это жидкость, заполняющая мешочек, который можно прощупать под кожей. Обычно она прикреплена к влагалищу сухожилия (выстилке, которая смазывает сухожилие) в руке или запястье или соединена с расположенным ниже суставом; в некоторых случаях, однако, нет видимой связи с какими-либо структурами. Кисты могут иметься также и на ногах.
- 63 009383
Часто киста возникает при наличии разрыва связок, покрывающих влагалище сухожилий или суставы, и влагалище выпячивается из дефекта связок, образуя выпуклость под кожей. Поскольку это часто связано с воспалением, воспалённая ткань испускает гелеподобную жидкость, заполняющую выпячивающийся мешочек. Кисты могут быть каменно-твёрдыми из-за высокого давления в заполняющей их похожей на слизь жидкости и часто их по ошибке можно принять за выступы кости.
Для лечения кист влагалища сухожилия можно применять кНАЗЕСР. Инъекция в место повреждения кНАЗЕСР в дозе от 5 до 1000 ед. с последующим отсасыванием тонкой иглой позволяет удалить кисту, не прибегая к хирургической операции. По усмотрению, с кНАЗЕСР могут вводиться кортикостероиды. Некоторым пациентам может понадобиться повторная инъекция.
Микседема.
Инфильтрация кожи гликозаминогликаном (ГАГ) - это характерный признак гипертиреоза, гипотиреоза, узловатого муциноза кожи, склеромикседемы и отёчной склеродермии. При всех болезненных состояниях и в нормальной коже основным ГАГ является гиалуроновая кислота. В распределении ГАГ в коже имеется незначительная гистологическая вариабельность. В приобретённых кожных микседемах в коже наблюдаются похожие распределение ГАГ и их биохимический состав. Морфологические различия, проявляющиеся в активности фибробластов, позволяют предположить, что муцинозы кожи при отёчной склеродермии и склеромикседеме являются локальным процессом, тогда как инфильтрация ГАГ при заболеваниях щитовидной железы может иметь системное происхождение. Эти расстройства могут быть сняты с помощью кНАЗЕСР как при местном, так и при системном путях введения. При лечении хронического заболевания можно предусмотреть применение ПЭГилированного кНАЗЕСР.
Лёгочные применения кНАЗЕСР.
Уровни содержания гиалуронана в бронхоальвеолярных промываниях (БАП) у нормальных индивидуумов обычно ниже 15 нг/мл. Однако при респираторных заболеваниях эти уровни в БАП резко повышаются (В_)егтег //Вг. Мей. 1. (С1т. Кек. Ей.). 1987, ν. 295, № 6602, р. 803-806). Например, при респираторном дистресс-синдроме у взрослых (АКЭЗ) уровни гиалуронана могут повышаться до 500 нг/мл, а в лёгких фермеров уровни гиалуронана в БАП могут превышать 1000 нг/мл (На11д^еи е! а1. II Ат. I. Кекрц·. Όίκ. 1989, ν. 193, № 3, р. 682-687; Επη^οη е! а1. //СНек!. 1992, ν. 101, № 1, р. 109-114). Повышенное содержание гиалуронана в лёгких может препятствовать диффузии кислорода и газообмену, а также активации реакций с участием нейтрофилов и макрофагов.
По многим причинам препараты бычьего кНАЗЕСР для лечения таких болезненных состояний также не очень желательны. Во-первых, известно, что тестикулярные препараты гиалуронидазы со скотобоен загрязнены сериновыми протеазами, такими, как акрозин. Во-вторых, чужеродность бычьих ферментов повышает вероятность анафилактической реакции, которая может привести к смерти пациента. Поэтому либо лёгочным путём, либо внутривенно можно вводить высоко очищенные препараты рекомбинантного человеческого кНАЗЕСР. Человеческий кНАЗЕСР можно также вводить пациентам, страдающих другими лёгочными расстройствами, связанными с повышением содержания гликозаминогликанов, или использовать для усиления доставки в лёгкие других совместно введённых молекул.
Далее изобретение будет описано более детально со ссылкой на нижеследующие не ограничивающие примеры.
Описание примеров осуществления изобретения
Пример 1.
Анализ гиалуронидаз методом микротитрования.
Следующий пример предлагает быстрый способ анализа для измерения гиалуронидазной активности кНАЗЕСР. Этот анализ может быть соотнесён с единицами ТКИ, ГО или ΝΡυ при использовании стандартного препарата гиалуронидазы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).
Анализ методом микротитрования биотинилированного гиалуронана.
Свободные карбоксильные группы остатков глюкуроновой кислоты в гиалуронане (ГУ) биотинилируют в одностадийной реакции с помощью биотин-гидразида (Р1егсе), сульфо-ПНЗ (Р1егсе) и 1этилдиметиламинопропилкарбодиимида (З1дта). Этот субстрат, биотинилированный ГУ, ковалентно пришивают в ячейки микротитровального планшета на 96 ячеек во второй реакции. После завершения ферментативной реакции остаточный субстрат определяют с помощью авидинпероксидазной реакции, итоги которой можно регистрировать в стандартном устройстве для просмотра планшетов ЕБ1ЗА. Поскольку субстрат ковалентно связан с микротитровальным планшетом, искажения, такие как рНзависимое замещение биотинилированного субстрата, исключаются. Высокая чувствительность позволяет быстро измерять активность гиалуронидазы в культивируемых клетках и биологических образцах с разбросом между различными измерениями менее 10%.
а. Протокол.
Приготовление субстрата биотинилированного ГУ.
Растворяли 100 мг ГУ (Зщта СНет1са1к) в 0,1 М МЕЗ (метилэтансульфонат), рН 5,0 до конечной концентрации 1 мг/мл и оставляли растворяться не менее чем на 24 ч при 4°С перед связыванием с биотином. К раствору СЗО4-МЕЗ добавляли сульфо-ПНЗ (Р1егке; КοскГο^й, ГО) до конечной концентрации 0,184 мг/мл. Биотин-гидразид (Р1егсе) растворяли в ДМСО, получая базовый раствор с концентраци
- 64 009383 ей 100 мМ, и добавляли его к раствору С804 до конечной концентрации 1 мМ. Базовый раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭЛС) готовили как базовый раствор в дистиллированной воде с концентрацией 100 мМ и добавляли к раствору ГУ-биотина до конечной концентрации 30 мМ. Этот раствор оставляли перемешиваться в течение ночи при 4°С. Несвязанные биотин и ЕЭАС удаляли диализом против воды при 3 сменах 1000-кратного объёма воды. Диализованный, биотинилированный ГУ (бГУ) разделяли на аликвоты и хранили при -20°С до нескольких месяцев.
Сульфо-ПН8 разбавляли до концентрации 0,184 мг/мл водой с бГУ (с концентрацией 0,2 мг/мл) и распределяли пипеткой в ячейки планшетов на 96 ячеек С0VЛ^INΚ-NН (NυNС; Р1асегуй1е, N1) - по 50 мкл в каждую ячейку. ЕЭАС разбавляли водой до концентрации 0,123 мг/мл и пипетировали в планшеты С0VА^INΚ-NН с раствором бГУ, получая в итоге в каждой ячейке 10 мкг бГУ и 6,15 мкг ЕЭАС. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С или в течение 2 ч при 23 °С, результаты были сравнимыми. После ковалентной иммобилизации бГУ в микротитровальных планшетах пришивающий раствор удаляли встряхиванием и промывали планшеты 3 раза РВ8 (забуференный фосфатом солевой раствор), содержащим 2 М №С1 и 50 мМ Мд804 (буфер А). Планшеты могли храниться до 1 недели при 4°С.
Планшеты С0VА^INΚ-NН с иммобилизованным бГУ уравновешивали буфером для анализа (100 мкл на ячейку) либо 0,1 М формиат, рН 3,7, 0,1 М №С1, 1% детергент тритон Х-100, 5 мМ сахаролактон для лизосомной гиалуронидазы, либо 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,4 с 1 мМ СаС12 и 1 мг/мл человеческого сывороточного альбумина (ΙΟΉ) для активных в нейтральных условиях ферментов. Набор стандартов для калибровки ферментативной активности в «относительных снижающих мутность единицах» (ге1аЦуе ТигЫбйу Вебистд Иийк, гТВИ) получали, разбавляя бычью тестикулярную гиалуронидазу (81дта, тип νΙ-8) в нейтральном буфере для фермента, внося в ячейки от 1,0 до 1 х 10-6 гТВИ и анализируя пробы 100 мкл на ячейку с тройным повтором. Пробы активной в кислых условиях гиалуронидазы разбавляли в буфере для анализа лизосомного фермента с коэффициентом разбавления от 1:10 до 1:130000 и пипетировали с тройным повтором по 100 мкл на ячейку. Для большинства анализов экстрактов тканей и плазмы человека была достаточной инкубация в течение 30 мин при 37°С. С тройным повтором включали также ячейки с позитивным и негативным контролями (без фермента или без АВС (см. далее) соответственно).
Реакцию останавливали добавлением 200 мкл на ячейку 6 М гуанидина-НС1, после чего трижды промывали раствором (300 мкл на ячейку): РВ8, 2 М №С1, 50 мМ Мд804, 0,05% детергент Твин 20 (буфер В). Набор для комплекса авидин-биотин (АВС) ^есЮг ЬаЬк, ВигЕидате, СА) готовили в 10 мл РВ8, содержащего 0,1% детергент Твин 20, который предварительно инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли раствор АВС (100 мкл на ячейку) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшет промывали 5 раз буфером В, затем добавляли раствор субстрата офенилендиамина (ОФД) (100 мкл на ячейку), который получали растворением одной таблетки 10 мг ОФД в 0,1 М буфере цитрат-Р04, рН 5,3 и добавляя 7,5 мкл 30% Н202. Планшет инкубировали в темноте в течение 10-15 мин, затем считывали показания в устройстве для считывания планшетов ЕЫ8А (Т11ег1ек МиШксаи РЬИ8; ΙΟΉ), используя фильтр с полосой 492 нм. Прибор был сопряжён с компьютером, где использовалась программа для считывания планшетов Эе11а 8ой ΙΙ от фирмы Вюте1аШск (Ргтсе1ои, N1). Стандартную кривую получали для бычьей тестикулярной гиалуронидазы с помощью четырехпараметрического построения кривой, а неизвестные пробы интерполировали по их поглощению при 492 нм.
Для анализа зависимости активности гиауронидаз от рН использовали очищенный рекомбинантный кНА8ЕСР и бычью тестикулярную гиалуронидазу. Зависимость ферментативной активности от рН определяли, разбавляя очищенный кНА8ЕСР или частично очищенную бычью тестикулярную гиалуронидазу до 0,1 гТВи в следующих буферах: 50 мМ формиат, рН 3-4,5; 50 мМ ацетат, рН 5-6; 50 мМ МЕ8, рН 6-7; или 50 мМ НЕРЕ8, рН 7-8. Пробы анализировали в течение 30 мин при 37°С и активность выражали в процентах от максимальной активности. №1С1 в буферах не использовали, так как он может изменять рНоптимум препаратов тестикулярной гиалуронидазы (Со1б //Вюсйет. 1. 1982, ν. 205, р. 69-74; Сасека е1 а1. //Вюсйет. 8ос. Тгаик. 1979, ν. 7, р. 1287-1289). Физиологические концентрации соли (0,15 М) снижают кажущийся рН-оптимум, этот эффект более выражен у очищенных препаратов тестикулярного фермента, чем у исходного неочищенного образца.
Ь. Результаты.
Гиалуронан был биотинилирован в одноступенчатой реакции с помощью биотин-гидразида и ЕЭАС. Путём ограничения количества ЕЭАС, который связывает свободные карбоксильные группы на ГУ с биотин-гидразидом, была помечена лишь малая часть всех остатков глюкуроновой кислоты в ГУ. Это количество ЕЭАС (3х10-5 М), добавленного к ГУ (2,8х10-3 М), обеспечило пришивку максимум 1 молекулы биотин-гидразида на 93 дисахаридных единицы ГУ.
По измеренным при рН 3,7 стандартным реакциям для бычьей тестикулярной гиалуронидазы, разбавленной до количеств от 1,0 до 1 х 10-6 ТВИ на ячейку, получена четырехпараметрическая аппроксимация кривой.
- 65 009383
Четырёхпараметрические приближения были установлены из уравнения у = [(А-О)/(1+(сопс/С)ЛВ)]+П, где 1о§йу = 1п(у'/1-у'), у' = (у-О)/(А-Э),
В = -Ь/1п10,
С = ехр(А/В).
Четыре параметра (А, В, С, Ό) были рассчитаны с помощью компьютерной программы, использующей алгоритм 2+2 с линейной регрессией (ВобЬагб е! а1. //С1т. Скет. 1976, ν. 22, р. 350). В этой аппроксимации учтён сигмоидный характер стандартной кривой. Оптимальная точность измерения активности образца обычно получается при количестве фермента от 0,001 до 0,01 ТВИ на ячейку и инкубации в течение 30 мин. При инкубации в течение 60 мин можно определить 1/1000 ТВИ. Для установления аппроксимации стандартной кривой можно для более короткого интервала значений использовать стандартную логарифмическую кривую. Хотя данное изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными примерами осуществления, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не следует ошибочно ограничивать этими конкретными примерами.
Пример 2. Клонирование кДНК кНАЖСР.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую кНАЖСР, специалисты в данной области могут получить большим числом способов, включающих (но не ограниченных ими) синтез искусственного гена, ОТ-ПЦР и гибридизацию с библиотекой кДНК (для примера см. Стаск1 е! а1. //ΕΕΕ8 Ье!!. 1993, ν. 336, № 3; К1тте1 е! а1. //Ргос. Асаб. 8сЕ И8А. 1993, ν. 90, р. 10071-10075). В качестве альтернативы кодирующие человеческий кΗΑ8ΕСΡ можно получить от IМΑСΕ или других поставщиков последовательностей генов человека (Чпуйгодеп С1опе, ГО 1ОН10647).
Было вычислено, что кДНК для РН20 человека полной длины имеет длину 2009 нуклеотидов и содержит открытую рамку считывания длиной 1530 нуклеотидов. 5'ИТВ (5' нетранслируемая область) необычно велика, что может указывать на сохранённый интрон и может ингибировать трансляцию, препятствуя связыванию рибосомы с правильным метиониновым инициирующим кодоном из-за наличия в 5'ИТВ 9 некодирующих стартовых кодонов. Предсказано, что белок (СепЬапк, номер доступа № 003108) содержит 509 аминокислот последовательности 8ΕΟ ГО NО: 1 с расчётной молекулярной массой 58 кДа.
Для секвенирования клонов вырезали амплифицированные в ПЦР зоны, элюировали их набором реагентов Се1 Εxί^ас!^οπ К1! (Ошадеп) и клонировали в подходящие векторы с совместимыми концами, полученными после расщепления рестриктазами. Все реакции секвенирования проводили на двунитевой ДНК с помощью набора для секвенирования с полимеразой Тад и обрывом цикла с красителем на дезокси-конце (Арркеб Вюкук!етк), в соответствии с инструкциями производителя. Затем пробы помещали в автоматический секвенатор АВ1 Рпкт™ (Арркеб Вюкук!етк).
Открытую рамку считывания РН20 человека получали, амплифицируя библиотеку кДНК из яичек человека (С1оп!еск, Ра1о А1!о, СА) в ПЦР с праймерами последовательностей 8ΕΟ ГО NО: 14 и 8ΕΟ ГО NО: 47. Продукты ПЦР расщепляли рестриктазами Ше1 и ВатН1 и клонировали в сайты ΝΙκΙ и ВатН1 вектора 1^8)311142 (С1оп!еск).
Пример 3. Выделение кΗΑ8ΕСΡ из кДНК гена РН20 человека.
Экспрессирующий вектор для получения каталитически активного секретируемого рекомбинантного человеческого кΗΑ8ΕСΡ с возможностью его эффективного гликозилирования в клетках млекопитающих был создан, как описано ниже. Рассматриваются также другие экспрессирующие конструкции с промоторами и селектирующими генами для клеток различных видов, таких как клетки дрожжей и насекомых, также способные производить кΗΑ8ΕСΡ. Гены для позитивной селекции, такие как гены глутамин-синтазы или дигидрофолат-редуктазы (ДГФР, ОНЕВ), также могут быть использованы. Приводимые далее примеры не предназначены для ограничения, но скорее служат примером некоторых плазмидных систем экспрессии, которые могут быть использованы.
Для того чтобы сконструировать секретируемые формы кΗΑ8ΕСΡ, были сконструированы усечённые мутанты, лишённые гидрофобного С-концевого участка. С помощью программы, предсказывающей расщепление гликозилфосфатидилинозитола (СР1), в белке полной длины с заякориванием СР1 был помещён вблизи аминокислотной позиции N483 сайт расщепления якоря СР1. Набор из семи гнездовых 3' праймеров был использован для конструирования набора из семи усечённых делеционных мутантов, утративших предсказанный сайт заякоривания СР1, начинающийся в положении Υ482 и делетированный дальше на одну аминокислоту. Эти праймеры были сконструированы таким образом, чтобы иметь совместимые сайты ΝΙκΙ (5') и ВатН1 (3) для клонирования усечённых мутантов в вектор IВΕ8ри^ο2 либо с отменённой меткой стоп-кодона в 3' праймере, либо с меткой Н1к на С-конце белка для облегчения его очистки и детектирования. Например, обратные праймеры с последовательностями 8ΕΟ ГО NО: 8, 8ΕΟ ГО NО: 9 и 8ΕΟ ГО NО: 10 были использованы для создания делеционных мутантов, оканчивающихся в позициях Υ482, Е481 и Ι480 без метки из 6 остатков Н1к. Другие мутантные праймеры были созданы с тем же самым конструированием нуклеотидов, с соответствующими модификациями для вставления и исключения определённых аминокислот. Для создания помеченных Н1к-вариантов использован тот же набор праймеров, что и для вариантов без меток, за тем исключением, что соответствующие обратные
- 66 009383 праймеры были без стоп-кодона, а прямой праймер оставался тем же самым для конструкций с меткой Н1к (это относится к праймерам с последовательностями БЕО ΙΌ N0: 19, БЕО ΙΌ N0: 20, БЕО ΙΌ N0: 21, БЕО ΙΌ N0: 22, БЕО ΙΌ N0: 23, БЕО ΙΌ N0: 24 и БЕО ΙΌ N0: 25, которые являются обратными праймерами без стоп-кодона, соответствующими немеченым обратным праймерам для соответствующих им конструкций). Для конструирования мостика из 6 аминокислот, следующего за гексагистидином между сайтами ВатШ и НоП в векторе [ВЕБригоЗ, были использованы перекрывающиеся праймеры, так что мутанты с меткой Н1к получались лигированием амплифицированных ПЦР и расщеплённых рестриктазами продуктов в сайты ΝΙκΙ и ВатШ в содержащем последовательность для метки Шк векторе ЖЕБриго2.
Для того чтобы идентифицировать, может ли человеческий кНАБЕСР быть модифицирован на его карбоксильном конце для получения секретируемого фермента, активного в нейтральных условиях, между сайтом прикрепления якоря СРI и предсказанным «каталитическим доменом» была произведена серия усечений с учётом гомологии с ферментом из пчелиного яда.
В качестве матрицы для создания различных усечённых делеционных мутантов был использован клон в векторе IВЕБри^ο2 ДНК, кодирующий человеческий кНАБЕСР полной длины с заякоренным СРЕ Компьютерные программы моделирования дали для полипептида полной длины несколько предсказанных сайтов расщепления. Один из таких предсказанных сайтов - это аминокислотная позиция N483 (последовательность БЕО ΙΌ N0: 1). Были сконструированы ПЦР праймеры для последовательного усечения белка с N483, чтобы получить 6 делеционных мутантов, начиная с Υ482 (утрата Ν) и кончая в Е477 (утрата Р).
а. Протокол.
Создание усечённого мутанта, лишённого N483.
В качестве матрицы был использован клон кНАБЕСР полной длины с заякоренным СРI между сайтами ΝΙκΙ и ВатШ в плазмиде IВЕБри^ο2. Эту матрицу амплифицировали с 5' праймером, содержащим сайт ΝΙκΕ который начинался у стартового метионинового кодона для нативного сигнального пептида в М1 (последовательность БЕО ΙΌ N0: 14), и 3' праймер, содержащий сайт ВатШ, оканчивающийся у Υ482 (последовательность БЕО ΙΌ N0: 8). Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в геле 1% агарозы, чтобы выделить и подтвердить наличие зоны амплифицированного продукта точного размера, очищали его, расщепляли рестриктазами ΝΙκΙ и ВатШ и клонировали в вектор IВЕБри^ο2 (С1оп!еск) между сайтами ΝΙκΙ и ВатШ, получая экспрессирующий вектор для экспрессии этого усечённого мутанта кНАБЕСР, оканчивающегося аминокислотой в положении N483 и утратившего заякоривание СРЕ с указанными аминокислотной последовательностью (последовательность БЕО ΙΌ N0: 5 для последовательности полученного полипептида кНАБЕСР до аминокислоты Υ482) и нуклеотидной последовательностью (последовательность БЕО ΙΌ N0: 48 - кодирующие нуклеотиды для полипептида с последовательностью БЕр ΙΌ N0: 5), как указано.
Создание других усечённых мутантов, утративших соответственно Υ482, Ε481,Ι480, 0479 и Р478
Была использована та же самая стратегия с единственным отличием: для каждого мутанта был взят соответствующий 3' праймер. Соответствующими 3' праймерами являются следующие:
3' праймер для мутанта кНАБЕСР, лишённого Υ482, - последовательность БЕО ΙΌ N0: 9;
3' праймер для мутанта, лишённого Е481, - последовательность БЕО ΙΌ N0: 10;
3' праймер для мутанта, лишённого Ι480, - последовательность БЕО ΙΌ N0: 11;
3' праймер для мутанта, лишённого 0479, - последовательность БЕО ΙΌ N0: 12; 3' праймер для мутанта, лишённого Р478, - последовательность БЕО ΙΌ N0: 13.
Создание дальнейших делеционных мутантов для определения минимального активного домена кНАБЕСР.
Дополнительные делеции, блоками от 10 до 20 аминокислот, были произведены с 3'-конца самого активного при нейтральном рН усечённого мутанта кНАБЕСР, который представляет собой кНАБЕСР вплоть до Е477. Прямой праймер с сайтом ΝΙκΙ (последовательность БЕО ΙΌ N0: 14) был взят вместе с соответственно позиционированным 3'-праймером для ПЦР-амплификации делеционного мутанта кНАБЕСР необходимой длины от карбоксильного конца. Например, ПЦР с праймерами, описанными в последовательностях БЕО ΙΌ N0: 14 и БЕО ΙΌ N0: 26 как соответственно 5'- и 3'-праймеры, была применена для получения при экспрессии с экспрессирующей конструкции в векторе IВЕБри^ο2. Подобным же образом ПЦР с обратными 3' праймерами, описанными последовательностями БЕО ΙΌ N0: 27, БЕР ΙΌ N0: 28, БЕр ΙΌ N0: 29, БЕр ΙΌ N0: 30, БЕр ΙΌ N0: 31 и БЕр ΙΌ N0: 32, была применена для создания делеционных мутантов, заканчивающихся соответственно у аминокислотных позиций А447, Б430, С413, Б394, А372 и Б347 зрелого кНАБЕСР. В каждом случае ПЦР-продукты расщепляли ферментами ΝΙκΙ и ВатШ и расщеплённый продукт клонировали в вектор рIΚЕБри^ο2 между сайтами ΝΙκΙ и ВатНЕ Несколько независимых клонов в конечной эспрессирующей конструкции из каждой группы тестировали на секрецию активного в нейтральных условиях кНАБЕСР путём преходящей трансфекции клеток СН0 в среде СЭ-СН0 без сыворотки (^йгодеп, СА); в указанные моменты времени отбирали пробы для анализа. М1шргер ДНК, полученную из ночных культур, трансфицировали с реагентом для трансфекции Сепе_)шсе (Ноуадеп, СА), следуя рекомендованной производителем прописи. Активность
- 67 009383 гиалуронидазы измеряли методом микротитрования, как описано выше.
Ь. Результаты.
Гиалуронидазную активность измеряли у усечённых мутантов кНАБЕСР, чтобы идентифицировать минимальный активный домен для секретируемой активной в нейтральных условиях гиалуронидазы (табл. 5).
Таблица 5
Аминокислоты с 1 по:
347
372
394
413
430
447
467
477
478
479
480
481
482
483
509
Ед./мл/24 ч при рН 7,4
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,089
0,567
0,692
0,750
0,575
0,740
0,329
0,800
0,044
Эти результаты показывают, что все 6 мутантов с делецией аминокислот, оканчивающихся указанной аминокислотой с Υ482 по Е477, дают секрецию с более высокой активностью, чем кНАБЕСР с заякориванием СР!.
Результаты показывают также, что делеции за аминокислотой А467 ликвидируют секретируемую активность полностью. Секретируемая активность в нейтральных условиях у клонов А467 снижалась приблизительно до 10% от активности, обнаруженной у клонов Р478 или N483. Поэтому было сделано заключение, что более значительная часть карбоксильного концевого домена человеческого кНАБЕСР нужна для получения гиалуронидазного домена с активностью в нейтральных условиях, чем ранее предполагалось на основании данных для фермента пчелиного яда. Таким образом, цистеины в карбоксильном концевом домене необходимы для нейтральной активности. Поэтому минимальный активный домен определяется очень узкой протяжённостью, длиной приблизительно 10 аминокислот, перед сайтом отщепления СРЕ начинающегося с N483.
Пример 4. Влияние модификаций сигнального пептида на секреторную активность кНАБЕСР.
Человеческий кНАБЕСР имеет необычно длинный предсказанный нативный лидерный пептид. Кроме того, наличие в лидерном пептиде двух соседствующих остатков цистеина может приводить при высоком уровне экспрессии к агрегации мультимеров полипептида внутри эндоплазматического ретикулума и вследствие этого препятствовать высокому уровню экспрессии кНАБЕСР. Поэтому испытывали набор более эффективных обеспечивающих секрецию лидерных пептидов с целью оценить их способность усиливать понуждение кНАБЕСР к секреции.
а. Протокол.
Каппа-лидирующий пептид конструировали путём гибридизации перекрывающихся праймеров и осуществления ПЦР с праймерами, соответствующими последовательностям БЕЦ Ш N0: 37, БЕЦ Ю N0: 38, БЕЦ Ю N0: 39 и БЕЦ Ю N0: 40. Полученную последовательность Каппа, амплифицированную в ПЦР, амплифицировали с фланкирующими праймерами, содержащими сайт N116 на 5'-конце (как описано в последовательности БЕЦ Ш N0: 41) и сайт ЕсоП на 3'-конце (как описано в последовательности БЕЦ Ш N0: 42). Это позволило клонировать лидирующий пептид Каппа (полипептидная последовательность описана в последовательности БЕЦ Ш N0: 43) в вектор Ьйтик 39 (NЕΒ) между сайтами N16 и ЕсоКЕ кНАБЕСР имеет внутренний сайт ЕсоКЕ поэтому эту конструкцию Каппа между сайтами N16 и ЕсоШ дополнительно амплифицировали с содержащим БрС 5'-праймером (описанным в последовательности БЕЦ Ш N0: 44) и содержащим МЫ 3'-праймером (описанным в последовательности БЕЦ Ю N0: 45). Последовательность для кНАБЕСР без сайта заякоривания СРЕ заканчивающегося аминокислотой Р478, вырезали из рШЕБригоЬ рестриктазами N116 и ЕсоШ и клонировали в вектор Ьйтик 39 (АЕВ) между сайтами N116 и ВатН вектора Ьйтик 39. Полученный таким образом вектор Ейтик, содержащий последовательность для кНАБЕСР, расщепляли рестриктазами Брс1 и МЫ и клонировали в него конструкцию для лидера Каппа, амплифицированную между Брб и МЫ. На этом векторе Ейтик 39, содержащем последовательности и Каппа, и кНАБЕСР, проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы создать единую рамку считывания для слитой последовательности для лидера Каппа со зрелым полипептидом кНАБЕСР. Пары праймеров, соответствующие последовательностям БЕЦ Ш N0: 34
- 68 009383 и 8Е0 ΙΌ N0: 35, использовали для создания лидера Каппа с нативным Акр в качестве оконечной аминокислоты, слитого с Р38 полипептида кНА8ЕСР (до аминокислоты Р478) (как описано в последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 46 для полипептидной последовательности слитого белка). Другая комбинация пары праймеров, такая как осуществлена последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 33 и 8Е0 ΙΌ N0: 35, была использована для создания лидера Каппа, оканчивающегося Акр (Ό), слитого с Ь36 кНА8ЕСР; последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 33 и 8Е0 ΙΌ N0: 36 были использованы для создания лидера Каппа, заканчивающегося аминокислотой С1у (С) (перед оконечным Акр (О)), слитого с Ь36 кНА8ЕСР; и последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 34 и 8Е0 ΙΌ N0: 36 были использованы для создания лидера Каппа, заканчивающегося аминокислотой С1у (С) (перед оконечным Акр (Ό)), слитого с Р38 кНА8ЕСР. Слияния Каппа-кНА8ЕСР, полученные сайт-направленным мутагенезом, были очищены электрофорезом в геле, расщеплены ферментом Эрпк чтобы удалить всю перенесённую родительскую ДНК, а затем расщеплены рестриктазами ΜκΙ и ВатШ и клонированы в расщеплённый МШ/ВатШ остов ШкШЕ8риго2, имеющего гистидиновую метку (мостик из 6 аминокислот, за которыми следуют 6 гистидинов), клонированный между сайтами ВатШ и в вектор рШЕ8риго2. Были получены 4 набора такой конструкции, которые соответствуют комбинациям С или Ό на конце лидера Каппа и Ь36 или Р38 в начале зрелого кНА8ЕСР. Для каждого типа конструкции несколькими независимыми клонами были трансфицированы клетки СН0 в среде СЭ-СН0 Диуйгодеп, СА), чтобы проверить, способствует ли наличие лидера секреции Каппа повышенным уровням секреции белка в сравнении с действием нативного лидера секреции. М1шргер ДНК, полученную из ночных культур, трансфицировали с реагентом для трансфекции Сепе_)шсе (Nονадеη, СА), следуя рекомендованной производителем прописи, и в указанные выше моменты времени отбирали пробы для тестирования активности методом микротитрования. Активность гиалуронидазы измеряли методом микротитрования, как описано выше.
Были испытаны слитые конструкции лидерного пептида Каппа-цепи мышиного ЦС с кНА8ЕСР для проверки высоких уровней активности секретированного кНА8ЕСР.
Ь. Результаты.
Таблица 6
Генная конструкция с еНАЗЕСР человека Ед./мл/24 ч при рН 7,4
Лидер 1дС Каппа-зНАЗЕСР, а.к. 38-478, ΗΪ5 6 3,0257
Нативный лидер-бНАЗЕОР, а.к. 1-478, Ηΐε 6 0,4857
Анализ активности фермента показал, что лидер ЦС Каппа способен усиливать секрецию кНА8ЕСР приблизительно в 7-8 раз по сравнению с нативным лидером секреции, если сравнивать с клонами Р478, Υ482 или N483, у которых нет такого лидера. Другие конструкции с лидером Каппа с вариациями места слияния с лидером в результате комбинаций Акр или С1у лидера Каппа с Ь36 или Р38 кНА8ЕСР также дали повышенные уровни секреции активной гиалуронидазы с нейтральной активностью. Назначение этих примеров - расширить, но не ограничить область охвата настоящего изобретения, и с применением такой же технологии могут быть использованы другие эффективные последовательности лидера секреции.
Пример 5. Создание экспрессирующего вектора для кНА8ЕСР человека.
Последовательность для кНА8ЕСР без эпитопной метки создавали клонированием в бицистронную экспрессирующую кассету Н224 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 47). Плазмидный вектор Н224 для экспрессии кНА8ЕСР содержит векторный скелет рС'Ч (Рготеда), последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты 1-482 гиалуронидазы РН20 человека, внутренний сайт вхождения в рибосому (т!егпа1 йЬокоте еп!гу кйе, ΙΚΗ8) из вируса цитомегаловируса лошадей ЕСМУ (С1оп!есБ) и мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (ЭНЕЕ). Скелет вектора рС'Ч включает также ДНК, содержащую ген устойчивости к бета-лактамату (АтрИ), начало репликации £1, непосредственно раннюю область энхансера/промотора цитомегаловируса (СМУ), химерный интрон и сигнал позднего полиаденилирования вируса 8У40 (8У40). ДНК, кодирующая конструкцию с кНА8ЕСР, содержала консенсусную последовательность Кохаск перед метионином нативного сигнального лидера и стоп-кодон возле тирозина-482. Полученная в итоге конструкция рСI-РН20-ШЕ8-^НРΚ.-8V40ра (ΉΖ-24) давала одну мРНК, синтез которой запускался промотором СМУ, кодирующую аминокислоты 1-482 РН20 и аминокислоты 1-187 дигидрофолатредуктазы, разделённые внутренним сайтом вхождения в рибосому.
Открытую рамку считывания РН20 человека амплифицировали из клона ЕтгЦгодеп 0ИЕ (ЮН10647, ^йгодеп, Саг1кЬаб, СА) с 5'-праймером, который вводил сайт МС и консенсусную последовательность Кохаск перед метионином РН20, и обратным праймером, который вводил стоп-кодон после тирозина-482 и сайт рестрикции ВатШ. Полученный в итоге ПЦР-продукт вшивали лигазой в плазмиду рШЕ8риго2 (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА) с последующим расщеплением ПЦР-фрагмента РН20 рестриктазами ΜκΙ и ВатШ.
Пример 6. Создание линии клеток, экспрессирующих кНА8ЕСР.
Нетрансфицированные клетки ЭС44 СН0, выращенные в модифицированной среде СЭ-СН0 фирмы СШС0 для клеток ПСЕЯ(-), дополненной 4 мМ глутамином и 18 мл Р1игюшс Е68/Б (СШС0), были
- 69 009383 при приготовлении к трансфекции высеяны во встряхиваемый флакон в количестве 0,5х106 кл./мл. Клетки выращивали при 37°С в термостате с увлажнением в атмосфере 5% СО2 и встряхиванием при скорости 120 об/мин. Перед трансфекцией у экспоненциально растущих нетрансфицированных клеток ЭС44 СНО проверяли жизнеспособность.
млн жизнеспособных клеток культуры нетрансфицированных клеток ЭС44 СНО осаждали центрифугированием и ресуспендировали при плотности 20 млн клеток в 0,7 мл буфера для трансфекции двойной концентрации (2хНеВ8=40 мМ ΗΕΡΕ8, рН 7,0, 274 мМ №С1, 10 мМ КС1, 1,4 мМ Nа2ΗΡО4, 12 мМ декстроза). К каждой аликвоте ресуспендированных клеток добавляли 0,09 мл линейной плазмиды ΗΖ24 (250 мкг) и растворы клетки/ДНК переносили при комнатной температуре в кюветы для электропорации ВТХ (Сеп1гошск) с зазором 0,4 см. Негативный контроль электропорации проводили с клетками без добавления плазмидной ДНК. Смеси клетки/плазмида подвергали электропорации при разряде конденсатора 330 В и 960 мкФ или при 350 В и 960 мкФ.
После электропорации клетки удаляли из кюветы, переносили в 5 мл модифицированной среды СИ-СНО для клеток ОСЕК(-), дополненной 4 мМ глутамином и 18 мл Е1иг1оп1с Е68/Ь (С1ВСО), и давали расти в ячейках 6-ячеечного планшета для культур ткани без селекции в течение 2 дней при 37°С в термостате с увлажнением в атмосфере 5% СО2.
Через 2 дня после электропорации из каждой ячейки отбирали по 0,5 мл среды для культур ткани и проводили определение гиалуронидазной активности.
Начальная гиалуронидазная активность трансфицированных ΗΖ24 клеток ЭС44 СНО через 40 ч после трансфекции приведена в табл. 7.
Таблица 7
Разбавление Активность (ед./мл)
Трансфекция 1, 330 В 1:10 0,25
Трансфекция 2, 350 В 1:10 0,52
Негативный контроль 1:10 0,015
Клетки после трансфекции 2 (350 В) собирали из ячейки, где они культивировались, подсчитывали и разбавляли до 10000-20000 жизнеспособных клеток в 1 мл. В каждую из 5 ячеек (планшеты для культур ткани на 96 ячеек с круглым дном) вносили по аликвоте 0,1 мл суспензии клеток. В содержащие клетки ячейки добавляли по 0,1 мл среды СИ-СНО (С1ВСО), содержащей 4 мМ С1и1атах-1, но без добавления гипоксантина и тимидина (конечный объём 0,2 мл).
Из 5 планшетов, где клетки росли без метотрексата, идентифицировали 10 клонов (табл. 8).
Таблица 8
Шесть клонов ΗΖ24 доводили до культуры и переносили как суспензии одиночных клеток во флаконы на встряхивающем устройстве. Клоны 3Ό3, 3Е5, 2С8, 2Ό9, 1Е11 и 4Ό10 высевали в планшеты для культур ткани на 96 ячеек с круглым дном, используя стратегию 2-мерного бесконечного разбавления. Разбавленные клоны растили на фоне 500 нетрансфицированных клеток ЭС44 СНО на ячейку, чтобы обеспечить в первые дни культивирования необходимые ростовые факторы. На каждый субклон делали 10 планшетов.
Клон 3Ό3 дал 24 видимых субклона. В надосадочных жидкостях 8 из 24 субклонов была измерена значительная гиалуронидазная активность (>50 ед./мл) и рост этих 8 субклонов расширяли во флаконах Т-25 для культур ткани в присутствии 50 нМ метотрексата. Рост клона 3Ό3 50 нМ далее расширяли в присутствии 500 нМ метотрексата, получив клоны, продуцировавшие во флаконах со встряхиванием активность более 1000 ед./мл (клон 3Ό3 5М).
- 70 009383
Пример 7. Продуцирование кНА8ЕСР.
Флакон с 3Ό3 5М размораживали и рост клеток расширяли из флаконов Т во вращаемые флаконы объёмом 1 л в среде СО СН0 (Iпν^ΐ^οдеп, Саг1кЬаб, СА) с добавлением 100 нМ метотрексата и СйПатах (ΙηνίΙΐΌ^η). Из вращаемых флаконов клетки переносили в биореактор объёмом 5 л (Вгаии) при плотности инокуляции 4,0х105 жизнеспособных клеток в 1 мл. Параметрами были: установка температуры 37°С, рН 7,2 (стартовая установка), с установкой значения растворённого кислорода 25% и потоком воздуха над культурой 0-100 см3/мин. Через 168 ч добавляли 250 мл среды Еееб №1 (СО СН0+50 г/л глюкоза). В момент времени 215 ч добавляли 250 мл среды Еееб № 2 (СО СН0+50 г/л глюкоза+10 мМ бутират натрия), а в момент 264 ч добавляли 250 мл среды Еееб №2. Этот процесс привёл к итоговой гиалуронидазной активности (продуктивности) 1600 ед./мл с максимальной плотностью клеток 6 млн клеток в 1 мл. Было обнаружено, что добавление бутирата натрия резко повышает продукцию кНА8ЕСР на конечных стадиях процесса.
Рост 3Э3-5М и продукция кНА8ЕСР, реактор на 5 л показаны в табл. 9.
Таблица 9
Время, ч Жизнеспособные клетки Х105 Доля жизнеспособных кеток, % Активость, Ед./мл Объём, мл Концентр, глюкозы Добавка среды
0 4,4 100 0 4500 547
24 5,7 100 0 4500 536
48 10,1 100 37 4500 501
72 17,1 99 62 4500 421
96 28,6 99 118 4500 325
120 28,8 99 240 4500 274
144 60,2 100 423 4500 161
168 55 100 478 4500 92 250 мл Реей №
192 66,6 98 512 4750 370
216 55,2 92 610 4750 573 250 мл Реей №2
240 53 88 710 5000 573
264 49,8 84 852 5000 474 250 мл Геей N22
288 40 70 985 5250 770
312 31 61 1467 5250 773
336 25,4 52 1676 5250 690
Пример 8. Очистка кНА8ЕСР.
Культуральную среду клона 3Ό3 осветляли глубинной фильтрацией и диафильтрацией с тангенциальным потоком в 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,0. Затем растворимый НА8ЕСР очищали последовательными стадиями хроматографии: ионообменной хроматографией на Ц-сефарозе (Рйатааа), гидрофобной хроматографией на фенилсефарозе (Рйаташа), хроматографией на фенилборонате (Рготебск) и оксиапатите (ВгоВаб, ΒχΙιιπογΛ СА).
кНА8ЕСР связывался с Р-сефарозой и элюировался при 400 мМ №ιΟΊ в том же буфере. Элюат разбавляли 2 М сульфатом аммония до конечной концентрации 500 мМ аниона 804 2- и пропускали через колонку с фенилсефарозой (с малой высотой набивки), после чего при тех же условиях проводили связывание на колонке с фенилборонатной смолой. кНА8ЕСР элюировался с фенилсефарозы в НЕРЕ8 рН 6,9 после промывки колонки при рН 9,0 50 мМ бицином без аниона 804. Элюат наносили на смолу керамического оксиапатита при рН 6,9 в 5 мМ Р04, 1 мМ СаС12 и элюировали 80 мМ Р04 рН 7,4 с 0,1 мМ СаС12.
Полученный очищенный кНА8ЕСР имел удельную активность свыше 65 тыс. ед. И8Р на 1 мг белка, определённую способом микротурбидиметрии с референсным стандартом И8Р. Очищенный кНА8ЕСР элюировался одним пиком в позиции между 24 и 26 мин с колонки со стирол-дивинилбензольной смолой 5ВРС (Рйатааа) градиентом ацетонитрила в 0,1% трифторацетате (ТФА) от 0,1% ТФА/Н20 до 0,1% ТФА/90% ацетонитрил/10% Н20и был при электрофорезе с 8Ό8 виден как одна широкая линия 61 кДа, которая превращалась в узкую линию 51 кДа после обработки РNСазой Е. Секвенирование Ν-концевых аминокислот показало эффективное удаление лидерного пептида.
Последовательность Ν-концевых аминокислот биохимически очищенного кНА8ЕСР приведена в табл. 10.
Таблица 10
Позиция 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Теория Ьеи Азп РНе Агд А1а Рго Рго Уа1 Не Рго Азп
Обнаружено - Азп РЬе Агд А!а Рго Рго Уа! Не Рго Азп
Пример 9. Анализ полученного в клетках ЭС44 СНО гликозилирования кНА8ЕСР.
Существуют противоречивые данные относительно того, необходимо ли гликозилирование кНА8ЕСР из разных видов для его каталитической активности. Например, были опубликованы данные о том, что ферментативно активная гиалуронидаза пчелиного яда может синтезироваться в клетках, лишённых
- 71 009383 аппарата гликозилирования, например, таких как клетки Е. со11. Более того, обработка очищенной бычьей тестикулярной гиалуронидазы РNСазой не инактивировала ферментативную активность (Уатада1а е1 а1., 1997). В других исследованиях было отмечено, что активность утрачивается после дегликозилирования и дополнительно нужны дисульфидные связи.
Поскольку все указанные выше более ранние испытания проводились на неочищенных либо частично очищенных препаратах, не было очевидным, является ли утрата активности результатом воздействия на дегликозилированный фермент сопутствующих протеаз в неочищенных препаратах или же она отражает прямую функциональную связь между гликозилированием и каталитической активностью.
a. Протокол.
Для того чтобы определить, может ли функциональное гликозилирование с Ν-связью быть введённым в человеческий кНАЗЕСР с помощью системы экспрессии на основе клеток СН0 в условиях отсутствия белка, кодирующую человеческий кНАЗЕСР-Н1к6 кДНК экспрессировали в клетках СН0 в химически определённой среде, используя бицистронную кассету ГВЕЗриго. Клетки выращивали в течение 72 ч в среде СО СН0 (Г^йгодеп/СГВСО), проводя затем концентрирование и диафильтрацию с тангенциальным потоком в модуле РеШсоп ТББ (М1Шроге) с мембранами с пределом отсечения 30 кДа. Среду в концентрате заменяли на 10 мМ НЕРЕЗ рН 7,4 с 50 мМ №С1. Затем диафильтрат наносили на плёночный сорбент ДЭАЭ-сефарозы и элюировали градиентом №С1: 0-1 М №1С1 на смоле БРЬС (РЬагташа). Человеческий кНАЗЕСР элюировался в интервале 10-30% №С1. Основная часть фермента обнаруживалась в этих фракциях. Фермент из градиента 10-30% №1С1 затем дополнительно очищали аффинной хроматографией на смоле 1МАС, заряженной Νί. Человеческий кНАЗЕСР элюировался со смолы 1МАС после промывки 10 мМ имидазолом с 50 мМ ацетатом рН 5,0. Затем белок концентрировали и диализовали против 10 мМ НЕРЕЗ рН 7,4. Было определено, что фермент с высокой степенью очистки обладает удельной активностью 97000 ед./мг белка в присутствии 1 мМ кальция и 1 мг/мл человеческого сывороточного альбумина (НАЗ) при анализе микротитрованием методом ЕЬГЗА с биотинилированным субстратом.
Для того чтобы установить изменения относительной молекулярной массы белка, очищенный человеческий кНАЗЕСР обрабатывали в течение ночи РNСазой или нейраминидазой с последующим электрофорезом в геле, электропереносом и анализом вестерн-блотов с помощью связанных с пероксидазой хрена моноклональных антител к Н1к6 (Ошадеп) и детектирования люминесценции ЕСЬ.
b. Результаты.
Анализ вестерн-блотированием показал, что продуцированный в клетках СН0 человеческий кНАЗЕСР чувствителен к обработке РNСазой. Относительная молекулярная масса человеческого кНАЗЕСР свидетельствует, что белок в высокой степени гликозилирован. После полного расщепления в течение ночи РNСазой размер человеческого кНАЗЕСР снижался, давая монодисперсный образец, подтверждая таким образом, что некоторую гетерогенность зоны до расщепления можно приписать наличию Νсвязанных сахарных остатков. Частичное расщепление РNСазой Б дало набор промежуточных компонентов, сдвигающихся при электрофорезе относительно зоны необработанного кНАЗЕСР, и этот сдвиг прогрессировал при увеличении времени обработки. Хотя в 7% геле зоны несколько размыты, можно видеть по меньшей мере 6 различных промежуточных изоформ.
Обработка кНАЗЕСР нейраминидазой показала, что клетки СН0 действительно способны синтезировать сиалированный человеческий кНАЗЕСР. После обработки нейраминидазой и анализа вестернблотированием кНАЗЕСР после электрофореза в 7% гелях обнаруживался сдвиг в подвижности полученного в клетках СН0 человеческого рекомбинантного кНАЗЕСР приблизительно на 1-3 кДа по сравнению с необработанным кНАЗЕСР. Таким образом, это первое сообщение о продукции, по существу, сиалированного человеческого кНАЗЕСР. Это очень важно и для стабильности, и для увеличения времени полужизни в сыворотке человеческого кНАЗЕСР, поскольку нативный кНАЗЕСР из спермы многих видов лишён сиалирования и не реагирует с лектинами, специфичными к сиаловой кислоте.
Пример 10. Анализ кНАЗЕСР методом БАСЕ.
Анализ олигосахаридов активного кНАЗЕСР методом БАСЕ позволяет быстро определять распределение каталитически активных кНАЗЕСР.
Протокол.
Очищенную гиалуронидазу из клона 3Ό3 5М характеризовали с помощью метода профилирования Ν-связанных олигосахаридов (Ргохуте) БАСЕ®. Олигосахариды отщепляли из 128,7 мкг гликопротеина ферментативным расщеплением Ν-гликаназой (известной также как РNСаза), метили флуорофором АКГЗ и разделяли электрофорезом. Относительные положения олигосахаридных зон определяли путём прогона образца и его разбавлений параллельно с олигосахаридным стандартом, дающим «лестницу» зон, которая выражает расстояние миграции в единицах степени полимеризации (СП).
Результаты.
Ν-профиль образца гиалуронидазы состоит из 10 зон, из которых 6, идущих согласованно с зонами олигосахаридного стандарта С5-С12, имели интенсивности более 9%. Кроме того, зона, подвижность которой согласуется с подвижностью зоны С9 стандарта, имела наибольшую интенсивность, равную 3546%.
- 72 009383
Анализ олигосахаридов профилированием при гель-электрофорезе показан в табл. 11.
Таблица 11
Пример 11. Зависимость ферментативной активности κΗΑδΕΟΡ от Ν-связанного гликозилирования.
a. Протокол.
Образцы очищенного κΗΑδΕ6Ρ-Ηίκ6 смешивали с буфером, содержащим нейраминидазу и ΡN6азу в присутствии и без 50 мМ октилглюкозида (ОГ) и выдерживали в течение ночи при 37°С. Полнота удаления олигосахаридов была проверена по сдвигу положения зоны при электрофорезе в геле, определённому вестерн-блотированием.
b. Результаты.
Таблица 12
Образец Активность, ед./мл
Без обработки 22,01
Нейраминидаза ночь с 50 мМ ОГ 23,57
РЫОаза ночь с 50 мМ ОГ 0,0
РЫОаза ночь без ОГ 10,74
Пример 12. Активность κΗΑδΕΟΡ по отношению к сульфированным и несульфированным гликозаминогликанам.
В дополнение к анализу на основе микротитрования с использованием ГУ субстратную специфичность κΗΑδΕΟΡ по отношению к другим гликозаминогликанам и протеогликанам можно тестировать по изменению подвижности в геле при электрофорезе с использованием очищенных субстратов, чтобы определить активность κΗΑδΕΟΡ по отношению к другим гликозаминогликанам. Многие анализы гиалуронидазной активности основывались на измерении продукции новых редуцирующих Νацетиламиногрупп (Воппег апб Сап!еу //С1ш. ΟΊιίιη. Α^η. 1966, ν. 13, р. 746-752) или снижении вязкости (Эе 8а1еди1 е! а1. /МлсЕ. ВюсЬет. ВюрЬук. 1967, ν. 121, р. 548-554) или мутности (ЭогГтап апб Ой //1. Вю1. СЬет. 1948, ν. 172, р. 367). С очищенными субстратами все эти способы годятся для определения присутствия или отсутствия эндоглюкозамидазной активности.
a. Протокол.
Анализ изменения подвижности в геле.
Очищенные субстраты смешивали с рекомбинантным κΗΑδΕΟΡ с целью анализа эндоглюкозидазной активности, которая приводит к повышению подвижности субстрата в геле. Хондроитин-сульфат Α, и Ό были фирмы Са1ЬюсЬет. Гиалуронан (из пупочного жгута человека), хондроитин-сульфат С, дерматан-сульфат и гепаран-сульфат получены из Са1ЬюсЬет. Гиалуронан пупочного жгута человека получен из фирмы ΙΟ'Ν. Каждый испытуемый субстрат разбавляли до концентрации 0,1 мг/мл. Пробы объёмом 10 мкл очищенного κΗΑδΕΟΡ или культуральной жидкости клеток, экспрессирующих κΗΑδΕΟΡ, смешивали с 90 мкл испытуемого субстрата в требуемом буфере и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. По окончании инкубации пробы нейтрализовали буфером для образцов (трис-ЭДТА рН 8,0, Бромфенол голубой и глицерин) и проводили электрофорез в 15% полиакриламидных гелях.
Гликозаминогликаны выявляли окрашиванием гелей 0,5% альцианом голубым в 3% уксусной кислоте в течение ночи, после чего отмывку краски проводили в 7% уксусной кислоте. Степень деструкции определяли, сопоставляя подвижность субстрата в присутствии и в отсутствие фермента.
b. Результаты.
100 ед. κΗΑδΕ6Ρ-Ηίκ6 в 10 мкл инкубировали с 90 мкл буфера с 10 мМ ΗΕΡΕδ и 50 мкг/мл человеческого сывороточного альбумина, содержащего 10 мкг различных гликозаминогликанов и протеогликанов в течение 2 ч при 37°С. Электрофоретический анализ с последующим окрашиванием гелей альцианом голубым выявил увеличение сдвигов подвижности в сторону одиночных блоков у хондроитинсульфата А, С и Ό, у аггрекана и гиалуронана, но не выявил ни у гепаран-сульфата, ни у хондроитинсульфата В. В то время как нерасщеплённые гликозаминогликаны при электрофорезе располагаются
- 73 009383 размазанным пятном в середине геля, у продуктов расщепления основная часть окраски альцианом голубым перемещается с фронтом, а малая часть материала располагается лесенкой с повышающейся СП.
Пример 13. Влияние ионов металлов на активацию κΗΑδΕСΡ.
Было установлено, что помимо необходимости гликозилирования для оптимальной ферментативной активности человеческий κΗΑδΕСΡ активируется до оптимальной ферментативной активности ещё и катионами. Было обнаружено, что в процессе очистки κΗΑδΕСΡ после последовательных хроматографических этапов имеет низкую удельную активность. Было найдено, что κΗΑδΕСΡ с меткой Ηίκ6 имеет очень низкую удельную активность, когда он очищен до гомогенности на ДЭАЭ-сефарозе и затем в этапах очистки Ηί-ΙΜΑΟ Поскольку смолы ΙΜΑ6 могут связывать клешневидными (хелатными) связями ионы металлов, различные ионы металлов вновь добавляли к κΗΑδΕСΡ, чтобы после этого определить относительную ферментативную активность.
a. Протокол.
Тестировали активность очищенного κΗΑδΕСΡ после инкубации с 0,1 мМ солями никеля (N1), кобальта (4), цинка (Ζη), кальция (Са) и магния (Мд) в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим определением гиалуронидазной активности в анализе на основе микротитрования.
b. Результаты.
Таблица 13
Добавка соли металла Нейтральная активность, ед./мл
Без добавок 11,909
100 мкМ Νί 6,0306
100 мкМ Со 8,972
100 мкМ Ζη 3,7476
100 мкМ Са 101,9892
Было установлено значительное повышение гиалуронидазной активности после инкубации κΗΑδΕСΡ с 0,1 мМ кальция или 0,1 мМ магния. После инкубации с другими металлами такая активация не наблюдалась. Добавление кальция к κΗΑδΕСΡ повышало удельную активность фермента до приблизительно 97000 ед. на 1 мг белка, концентрацию которого определяли по оптической плотности при 280 нм. Затем определяли дозовую зависимость активности от концентрации ионов металлов кальция и магния, чтобы установить оптимальную для фермента концентрацию ионов металлов.
Таблица 14
Было установлено, что активация κΗΑδΕСΡ происходит в микромолярном интервале концентраций. Концентрации и кальция, и магния выше 10 мМ оказались ингибирующими. Для того чтобы исключить неспецифическую активацию субстрата, а не фермента, хлористый кальций в буфере 10 мМ ΗΕΡΕδ инкубировали с биотинилированным субстратом, иммобилизованным в планшете для микротитрований, затем отмывали. Когда фермент добавляли к преинкубированному с кальцием и затем к отмытому планшету, никакой активации не наблюдалось. Активацию проверяли также на нативном κΗΑδΕСΡ, высвобожденном фосфолипазой С. Наблюдалась такая же активация кальцием, что исключило возможность искажения эпитопной метки Ηίκ6.
Пример 14. Влияние альбумина на активность κΗΑδΕСΡ.
Было установлено, что при разбавлении рекомбинантной гиалуронидазы человека γΗπΡΗ20 и других препаратов тестикулярных гиалуронидаз со скотобоен для оптимальной активности необходимо добавление не только кальция, но и альбумина.
а. Протокол.
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) фирмы IСN разбавляли в 10 мМ буфере ΗΕΡΕδ с
- 74 009383 кальцием, чтобы определить влияние белка альбумина на ферментативную активность. Определения ферментативной активности зНА8ЕОР и коммерческих препаратов проводили в присутствии 1 мМ СаС12 и 1 мг/мл ЧСА.
Ь. Результаты.
При больших разбавлениях в присутствии альбумина было обнаружено повышение активности гиалуронидазы. Неясно, является ли эта активация результатом предотвращения денатурации фермента, или же альбумин влияет на доступность субстрата. Таким образом, предпочтительная композиция с человеческим зНА8ЕОР может включать альбумин и соль металла - кальция или магния.
Пример 15. Распространение активности очищенного зНА8ЕОР ш νίνο.
a. Протокол.
Очищенный зНА8ЕОР в 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,1% Р1игошс разбавляли до 0,5 ед./мкл в апирогенной воде с 0,15 М №С1. Делали серийные разбавления в физиологическом солевом растворе (конечный объём разбавлений составлял 20 мкл), получая дозы 0,01, 0,05, 0,1 ед. на инъекцию. Добавляли 20 мкл раствора трипанового голубого до конечного объёма 40 мкл и проводили подкожную инъекцию в каждый бок мышей Βа1ЬNи/Nи, которых перед этим анестезировали введением в/б смеси кетамин/ксилазин. С помощью микрометра измеряли в 2 направлениях размер областей распространения красителя с временем от 0 до 45 мин. Площадь областей выражали в квадратных миллиметрах. В качестве контроля включали рекомбинантную человеческую гиалуронидазу НУАРЕ которая секретируется, но не обладает активностью в нейтральных условиях.
b. Результаты.
Таблица 15
Предмет испытания Площадь красителя через 45 мин.
А. Солевой раствор (контроль) 51,5 мм2
В. зНАЗЕОР 0,01 ед. 76,8 мм2
С. зНАЗЕСР 0,05 ед. 98,22 мм2
ϋ. зНАЗЕСР 0,10 ед. 180,4 мм2
Е. ΗΥΑΜ 100 ед. 67,48 мм2
Пример 16. Кинетика инактивации диффузионной активности зНА8ЕОР.
a. Протокол.
Рекомбинантный очищенный зНА8ЕОР-Н1з6 разделяли на 2 аликвоты. Одну прогревали при 95°С в течение 15 мин в термоциклере с нагреваемой крышкой. Вторую оставляли при комнатной температуре. Термическую инактивацию ферментативной активности проверяли с помощью анализа активности на основе микротитрования. Для кинетического анализа тестировали инактивированный прогревом материал в сравнении с нативным. Четыре единицы очищенного зНА8ЕОР или эквивалентное количество инактивированного прогревом материала инъецировали под кожу с красителем трипановым голубым. В различные моменты времени (вплоть до 15 мин) измеряли площадь распространения красителя.
b. Результаты.
Таблица 16
Площадь распространения красителя, мм2
Время после инъекции, мин. 4 ед. 4 ед., инактивированные прогревом
( = 0 52,38 50,58
1 = 3 116,51 65,48
1 = 6,5 181,93 63,87
1 = 10 216,96 65,80
1 = 16 279,99 74,3
Пример 17. Восстановление кожного барьера, нарушенного зНА8ЕОР.
а. Протокол.
Для того чтобы определить время регенерации пор, открытых зНА8ЕОР после его подкожного введения, 2 ед. очищенного зНА8ЕОР или контрольного солевого раствора вводили животным подкожной инъекцией в два расположенных на противоположных боках места в момент времени ί=0, после чего в те же места вводили инъекцией трипановый голубой в моменты времени 30, 60 мин и 24 ч. Для каждого момента времени определяли в сравнении с контролем площадь диффузии красителя в момент ί=15 мин после его инъекции.
- 75 009383
Ь. Результаты.
Таблица 17
Площадь распространения красителя, мм2
Время после инъекции зНАЗЕОР 2 ед. зНАЗЕСР Солевой раствор (контроль)
0,5 ч 183 54
1 ч 167 50
22 ч 61 48
Результаты показывают, что кожный барьер восстанавливается в пределах 24 ч после введения 2 ед. фермента.
Пример 18. Определение размера каналов, открываемых кНА8ЕСР.
Было установлено, что человеческий кНА8ЕСР открывает каналы в интерстициальном пространстве, достаточные для обеспечения диффузии малых молекул, например красителя трипанового голубого. Однако оставалось неизвестным, каков верхний предел размера частиц, которые могут диффундировать в присутствии кНА8ЕСР.
а. Протокол.
Для определения размера каналов, открываемых человеческим кНА8ЕСР, были использованы флуоресцирующие молекулы различного размера. Декстраны с флуоресцентной меткой и средней молекулярной массой 4400 и 2 млн Да (81дта), а также меченые флуоресцеином гранулы определённого диаметра от 20 до 500 нм (молекулярные зонды) вводили подкожно в объёме 40 мкл, после чего в те же места производили инъекцию кНА8ЕСР или контрольного солевого раствора. Затем через 15 мин после инъекции измерениями в двух направлениях определяли площадь распространения окрашивания. Ь. Результаты.
Таблица 18
Агент воздействия на диффузию Размер частиц для тестирования диффузии Площадь через 15 мин., мм2 Стандартное отклонение
зНАЗЕСР 4400 Да 84,2 25,7
Контроль 4400 Да 38,0 5,8
зНАЗЕСР 2x106 Да 141,2 4,5
Контроль 2x106 Да 51,7 8,1
зНАЗЕСР Диаметр 20 нм 92,3 20,6
Контроль Диаметр 20 нм 51,6 3,0
зНАЗЕСР Диаметр 100 нм 61,0 5,7
Контроль Диаметр 100 нм 40,0 7,0
зНАЗЕСР Диаметр 200 нм 35,5 1,6
Контроль Диаметр 200 нм 27,9 8,2
зНАЗЕСР Диаметр 500 нм 44,8 13,6
Контроль Диаметр 500 нм 41,2 9,8
Результаты показывают, что после введения кНА8ЕСР усиливается диффузия молекул размером от приблизительно 1 кДа (трипановый голубой) до 50 нм диаметром (гранулы латекса). В то время как кинетика диффузии бычьего сывороточного альбумина (66 кДа) подобна кинетике диффузии трипанового голубого, гранулам латекса диаметром 50 нм требуется для диффузии гораздо больше времени. Диффузия гранул диаметром 500 нм не обнаруживалась вплоть до 480 мин.
Пример 19. Профили сывороточной фармакокинетики биотнилированных антител после совместного подкожного введения человеческого кНА8ЕСР.
a. Протокол.
Мышей-самок линии аВа1Ь/с анестезировали смесью кетамин/ксилазин. Затем мышам вводили подкожной инъекцией 20 мкл раствор с концентрацией 0,5 мг/мл биотинилированного мышиного 1дС, смешанного с 20 мкл, или солевой раствор, либо кНА8ЕСР с активностью 4 ед.
b. Результаты.
Таблица 19
Содержание 1дС в сыворотке
Время после инъекции Контроль зНАЗЕСР (4 ед.)
( = 0 0 0
( = 2х 0 360 нг/мл
1 = 51 х 4152 нг/мл 4176 нг/мл
- 76 009383
Результаты показывают, что кΗΑ8ΕСΡ ускоряет кинетику проникновения в сыворотку больших молекул в кровотоке. В то время как в контрольной группе биотинилированный 1дС в сыворотке через 2 ч не обнаруживается, в группе, в которой вводили кΗΑ8ΕСΡ, на момент 2 ч в сыворотке было 360 нг/мл 1дС.
Пример 20. Активность распределения введённых подкожно молекул после внутривенной инъекции человеческого кΗΑ8ΕСΡ.
a. Протокол.
Для каждой дозы в каждом пункте испытаний и для контроля носителя использовали 4 места инъекции красителя. Инъекцию красителя производили через 45 мин после внутривенной инъекции препарата. Каждую дозу в пункте испытаний или контроля вводили в/в двум животным. Измерения и расчёты площади, охватываемой фронтом красителя через 45 мин после введения фермента, проводили для каждой дозы или контроля носителя через 2,5; 5; 10 и 15 мин.
b. Результаты.
Результаты показали, что высоко очищенный кΗΑ8ΕСΡ при внутривенном введении хорошо достигает в организме удалённых тканей. Активность распространения системно введённого кΗΑ8ΕСΡ зависит от дозы, причём данные для инъекции 10 ед. не отличаются от данных для контроля носителя.
Таблица 20
Тип Доза в/в Время, мин. Средняя площадь, мм2 Стандартное отклонение
РН20 1000 2,5 86,417 2,834193
РН20 1000 5 102,17 2,221146
РН20 1000 10 124,53 6,304944
РН20 1000 15 129,81 1,434319
РН20 300 2,5 59,137 7,218615
РН20 300 5 73,638 7,51197
РН20 300 10 87,092 8,686008
РН20 300 15 92,337 10,66466
РН20 100 2,5 56,308 7,741934
РН20 100 5 63,156 11,42052
РН20 100 10 76,519 16,18449
РН20 100 15 77,432 17,32264
РН20 30 2,5 50,534 10,64287
РН20 30 5 59,493 5,163971
РН20 30 10 68,102 11,11171
РН20 30 15 71,118 9,934212
РН20 10 2,5 36,4 3,807072
РН20 10 5 39,859 6,680932
РН20 10 10 45,649 4,44936
РН20 10 15 48,41 6,546835
Контроль 0 2,5 34,652 5,935037
Контроль 0 5 36,279 3,614544
Контроль 0 10 44,687 5,821216
Контроль 0 15 53,002 2,812439
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (131)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. По существу, очищенный гликопротеин, содержащий растворимый гиалуронидазный полипептид РН-20, активный в нейтральных условиях, причем полипептид РН-20 усечён у С-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного СΡI (гликозилфосфатидил-инозитола) и содержит по меньшей мере один Ν-связанный фрагмент молекулы сахара, характеризующийся тем, что Νсвязанный фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к остатку аспарагина полипептида.
  2. 2. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид выбран из:
    а) полипептида, содержащего кодируемую нуклеотидной последовательностью последовательность аминокислот, которая имеет степень идентичности аминокислотной последовательности по меньшей мере приблизительно 74% с последовательностью аминокислот 1-483, приведённой в последовательно
    - 77 009383 сти 8ЕО ΙΌ 1;
    b) полипептида, содержащего последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов 1-1499, представленной в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 6;
    c) полипептида, содержащего последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов, по меньшей мере 85% от полной длины которой гибридизируется при условиях высокой степени строгости, с последовательностью нуклеотидов, представленной как последовательность 8Е0 ΙΌ NО: 6, или
    б) полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая является полученным при сплайсинге вариантом последовательности нуклеотидов, включающей последовательность, представленную как последовательность 8Е0 ΙΌ NО: 50.
  3. 3. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к остатку аспарагина, выбранному из аминокислот 82, 166, 235, 254, 368 или 393, указанных в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 1.
  4. 4. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара ковалентно присоединен к полипептиду связью, чувствительной к РNСазе.
  5. 5. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу фрагментов молекулы сахара, содержащих большое количество маннозы.
  6. 6. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу комплексов.
  7. 7. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара относится к типу гибридов.
  8. 8. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что фрагмент молекулы сахара дополнительно содержит по меньшей мере один фрагмент молекулы сахара, заканчивающийся сиаловой кислотой.
  9. 9. Гликопротеин по п.8, отличающийся тем, что полипептид сверхсиалирован.
  10. 10. Гликопротеин по п.9, отличающийся тем, что полипептид содержит последовательность аминокислот, представленную как аминокислоты 1-450 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 3, аминокислоты 1438 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 3 или аминокислоты 1-459 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 3.
  11. 11. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что он имеет степень идентичности последовательности, большую чем приблизительно 80% с полипептидом, содержащим последовательность аминокислот, приведённую в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 3, а также отличающийся тем, что полипептид представляет собой гиалуронидазу.
  12. 12. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид кодируется полинуклеотидом, по меньшей мере 70% полной длины которого гибридизируется при условиях высокой степени строгости с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, которая приведена в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 6, или по меньшей мере с одним её доменом либо с каталитически активной частью домена.
  13. 13. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что представляет собой гликопротеин человека.
  14. 14. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид представляет собой растворимый полипептид, представленный в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 4.
  15. 15. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что полипептид не содержит полной последовательности, приведённой в последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 1, и включает, по меньшей мере, аминокислоты 1429 последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 4.
  16. 16. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что представляет собой мутеин (мутированный белок), причем приблизительно до 50% аминокислот полипептида замещены другими аминокислотами; при этом полученный полипептид (мутеин) имеет каталитическую активность, составляющую по меньшей мере 10% от активности немутированного полипептида.
  17. 17. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что приблизительно до 10% аминокислот полипептида замещены другими аминокислотами.
  18. 18. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что полученный полипептид (мутеин) имеет каталитическую активность, составляющую по меньшей мере 50% активности немутированного полипептида.
  19. 19. Гликопротеин по п.16, отличающийся тем, что свободный цистеин в гиалуронидазном домене замещён другой аминокислотой.
  20. 20. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что к полипептиду гликопротеина функционально присоединена сигнальная последовательность, способная направить полипептид из клетки наружу.
  21. 21. Изолированный растворимый гликопротеин гиалуронидазы РН-20 человека (зНА8ЕСР), причем гликопротеин РН-20 усечён у С-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного СРЕ характеризующийся тем, что эффективность зНА8ЕСР превышает 40000 единиц и8Р (ед.) на 1 мг белка.
  22. 22. зНА8ЕСР по п.21, отличающийся тем, что гиалуронидаза сиалирована.
  23. 23. зНА8ЕСР по п.21, отличающийся тем, что эффективность превышает приблизительно 45000, 55000, 60000, 80000, 90000, 95000 или 100000 ед./мг.
  24. 24. зНА8ЕСР по п.21, отличающийся тем, что эффективность составляет приблизительно от 60000
    - 78 009383 до 80000 ед./мг.
  25. 25. Гликопротеин по п.1 или 21, отличающийся тем, что полипептид модифицирован полимером.
  26. 26. Гликопротеин по п.25, отличающийся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
  27. 27. Композиция, включающая гликопротеин, как он определен в п.21.
  28. 28. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид гликопротеина, как он определен в п.1.
  29. 29. Изолированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимый гиалуронидазный полипептид РН-20, активный в нейтральных условиях, причем полипептид РН-20 усечён у Сконцевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного СР1, включающая последовательность, выбранную из:
    a) полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот, которая имеет степень идентичности аминокислотной последовательности по меньшей мере приблизительно 74%, с последовательностью аминокислот 1-483, приведённой в последовательности 8ЕО ГО N0: 1;
    b) полинуклеотидной последовательности нуклеотидов 1-1499, представленной в последовательности 8ЕО ГО N0: 6;
    c) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере 85% от полной длины которой гибридизируется при условиях высокой степени строгости с последовательностью нуклеотидов, приведённой в последовательности 8Е0 ГО N0: 6, или (ά) полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая является полученным при сплайсинге вариантом последовательности нуклеотидов, включающей последовательность, представленную как последовательность 8Е0 ГО N0: 50.
  30. 30. Вектор, имеющий последовательность, представленную в последовательности 8Е0 ГО N0: 51.
  31. 31. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как она определена в п.29.
  32. 32. Вектор по п.31, отличающийся тем, что представляет собой экспрессирующий вектор.
  33. 33. Вектор по п.31, отличающийся тем, что представляет собой вектор эукариот.
  34. 34. Вектор по п.31, отличающийся тем, что включает последовательность нуклеотидов, которая направляет секрецию любого полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, функционально к ней присоединённой.
  35. 35. Вектор по п.31, отличающийся тем, что это вектор Р1сЫа, вектор Е. со11 или вирусный вектор.
  36. 36. Изолированная клетка, содержащая вектор, как он определен в п.31.
  37. 37. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что это прокариотическая или эукариотическая клетка.
  38. 38. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что выбрана из бактериальной, дрожжевой, растительной клеток, из клетки насекомого или клетки животного.
  39. 39. Клетка по п.36, отличающаяся тем, что является клеткой млекопитающего.
  40. 40. Антитело, связывающееся с гликопротеином, как он определен в п.1, характеризующееся тем, что не обладает реактивностью по отношению к бычьей, овечьей или бактериальной гиалуронидазе.
  41. 41. Трансгенное животное, не являющееся человеком, отличающееся тем, что эндогенный ген, кодирующий полипептид гликопротеина, как он определен в п.1, был разрушен гомологичной рекомбинацией или мутагенезом по типу вставок у животного или его предка.
  42. 42. Способ получения растворимого полипептида, содержащего полипептид &НА8ЕСР, включающий введение нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид гликопротеина, как он определен в п.1, функционально присоединённой к подходящему промотору, в клетку, которая содержит в кНА8ЕСР ^связанные фрагменты молекулы сахара;
    культивирование клетки в условиях, при которых кодируемый полипептид экспрессируется клеткой, и выделение экспрессированного полипептида.
  43. 43. Способ по п.42, отличающийся тем, что клетка представляет собой эукариотическую клетку.
  44. 44. Способ по п.43, отличающийся тем, что эукариотическая клетка выбрана из клетки млекопитающего, клетки насекомого, дрожжевой или растительной клеток.
  45. 45. Способ по п.44, отличающийся тем, что клетка представляет собой клетку СН0.
  46. 46. Способ получения растворимого полипептида, содержащего полипептид &НА8ЕСР, включающий культивирование клетки, как она определена в п.36, в условиях, при которых кодируемый полипептид экспрессируется клеткой, и выделение экспрессированного полипептида.
  47. 47. Применение гликопротеина по п.1 в медицине.
  48. 48. Способ генной терапии ех νίνΌ, включающий введение ш νίΙΐΌ нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин, как он определен в п.1, и функционально присоединённой к подходящему промотору, в клетку, не являющуюся клеткой человека, которая способна включать в &НА8ЕСР ^связанные фрагменты молекулы сахара;
    создание таким путём генетически модифицированной клетки, не являющейся клеткой человека,
    - 79 009383 содержащей нуклеиновую кислоту.
  49. 49. Способ получения овоцита млекопитающего, не являющегося человеком, для оплодотворения ίη νίΐΓο, включающий приведение нечеловеческого овоцита в контакт с гликопротеином, как он определен в п.1, взятым в количестве, эффективном для удаления кумулюсного матрикса.
  50. 50. Способ по п.49, отличающийся тем, что кумулюс эффективно удаляют без применения пипетки с узким отверстием для манипулирования с овоцитом.
  51. 51. Способ получения гликопротеина, включающий приведение полипептида гликопротеина, как он определен в п.1, в контакт с гликозилтрансферазными ферментами, способными вводить Ν-связанные фрагменты молекулы сахара в полипептид, создавая таким путём гликопротеин, как он определен в п.1.
  52. 52. Способ по п.51, отличающийся тем, что гликозилтрансферазные ферменты получают из микросомных мембран псовых.
  53. 53. Композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1, и подходящий фармацевтический носитель.
  54. 54. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, в лечении избытка субстрата кНАЗЕСР у индивидуума, включающего удаление субстрата кНАЗЕСР.
  55. 55. Применение по п.54, отличающееся тем, что избыток субстрата продуцируется тканью рубцов.
  56. 56. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой глиальные рубцы, возникшие вследствие повреждения спинного мозга.
  57. 57. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой результат хирургической операции.
  58. 58. Применение по п.55, отличающееся тем, что ткань рубцов представляет собой келоидные рубцы.
  59. 59. Применение по п.58, отличающееся тем, что субстрат связан с образующим грыжу диском.
  60. 60. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для усиления у индивидуума диффузии терапевтического вещества с диаметром, меньшим чем приблизительно 0,5 мкм, включающее открытие или формирование у указанного индивидуума каналов с диаметром менее 0,5 мкм.
  61. 61. Применение по п.60, отличающееся тем, что гликопротеин вводят инъекцией в дозе от 0,1 до 1500 ед.
  62. 62. Применение по п.60, отличающееся тем, что полипептид гликопротеина смешивают с терапевтическим веществом до инъекции.
  63. 63. Комплект, содержащий:
    a) гликопротеин по п.1 в дозе от 0,1 до 1500 ед./мл в приемлемом носителе;
    b) по меньшей мере одно терапевтическое вещество в приемлемом носителе; и (с) по усмотрению, инструкции по введению терапевтических веществ.
  64. 64. Комплект по п.63, отличающийся тем, что гликопротеин и терапевтическое вещество представляются в виде смеси.
  65. 65. Применение по п.47 для лечения сердечно-сосудистого расстройства, включающее удаление избытка гликозаминогликанов.
  66. 66. Применение по п.65, отличающееся тем, что сердечно-сосудистое расстройство выбрано из инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности или артериосклероза.
  67. 67. Применение по п.47 для лечения опухоли, включающее удаление избытка гликозаминогликанов.
  68. 68. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для доставки молекулы в ткань, содержащую избыточные количества гликозаминогликана, включающее разрушение гликозаминогликанов в степени, достаточной для открытия каналов диаметром менее чем приблизительно 500 нм.
  69. 69. Применение по п.68, отличающееся тем, что полипептид модифицирован полимером.
  70. 70. Применение по п.69, отличающееся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
  71. 71. Фармацевтическая композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1, и фармацевтический носитель.
  72. 72. Фармацевтическая композиция, содержащая, по существу, очищенный гликопротеин, как он определен в п.1.
  73. 73. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что полипептид в композиции использован в качестве вещества, распределяющего фармацевтически активное средство.
  74. 74. Фармацевтическая композиция по п.73, отличающаяся тем, что фармацевтически активное средство выбрано из группы средств, состоящей из химиотерапевтического, анальгезирующего, противовоспалительного, антимикробного, амёбоцидного, трихомоноцидного, антипаркинсонного, антималярийного, антиконвульсионного, антидепрессивного, противоартритного, противогрибкового, антигипертензивного, жаропонижающего, противопаразитного, антигистаминного, альфа-адренергического агониста, альфа-блокирующего, обезболивающего, бронхолитического, биоцидного, бактерицидного, бактериостатического, бета-адренергоблокирующего, блокирующего кальциевые каналы, сердечнососудистого лекарства, противозачаточного, противозастойного, мочегонного, депрессантного, диагно
    - 80 009383 стического, электролитического, гипнотического, гормонального, гипергликемического, мышцерасслабляющего, мышцесокращающего, офтальмологического, парасимпатомиметического, тимолептического, седативного, симпатомиметического, транквилизатора, мочевого, вагинального, противовирусного, витаминного, нестероидного противовоспалительного и ингибирующего ангиотензинпреобразующий фермент средств, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарства, органической молекулы или снотворного средства.
  75. 75. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что химиотерапевтическим средством является токсин или фактор некроза опухолей.
  76. 76. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что анестезирующим средством является лигнокаин или бупивикаин.
  77. 77. Фармацевтическая композиция по п.74, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гормональное средство.
  78. 78. Фармацевтическая композиция по п.77, отличающаяся тем, что гормональным средством является эпинефрин.
  79. 79. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что фармацевтический носитель представляет собой стабилизирующий раствор.
  80. 80. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор содержит №1С1 и металл, выбранный из СаС12 и МдС12.
  81. 81. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).
  82. 82. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор дополнительно содержит носитель, выбранный из группы, содержащей альбумин, детергент или поверхностно-активное вещество.
  83. 83. Фармацевтическая композиция по п.79, отличающаяся тем, что стабилизирующий раствор содержит фенол красный, человеческий сывороточный альбумин, ΗΕΡΕδ, №1С1 и металл, выбранный из СаС12 и МдС12.
  84. 84. Фармацевтическая композиция по п.83, отличающаяся тем, что концентрация гликопротеина составляет приблизительно 80 ед./мг.
  85. 85. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
  86. 86. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество выбрано из сорбитан-монолаурата; сорбитан-моноолеата; сорбитан-пальмитата; сорбитанмоностеарата; сорбитан-сесквитолата; сорбитан-триолеата; производных эфира полиоксиэтиленолеиновой кислоты; производных полиоксиэтилен-лауриламина; производных полиоксиэтилен- стеариламина; производных полиоксиэтилен-олеиламина; полиоксиэтиленовых производных касторового масла; полиоксиэтиленовых производных гидрогенизированного касторового масла; полиоксиэтиленовых производных бис-фенольного эфира; полиоксиэтиленгликолей; сорбитановых производных эфиров жирных кислот; полиоксиэтиленовых производных эфиров жирных кислот; производных полиоксиэтилен-полиоксипропилена; полиэтиленгликоль-гексадецилового эфира (Вгу® 56); полиэтиленгликольоктадецилового эфира (Вгу® 72); полиоксиэтилен-10 олеилового эфира (Вгу® 97); третоктилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритон® Х-100); полиэтиленгликоль-сорбитан-монолаурата (Твин® 20); полиоксиэтилен-сорбитан-монопальмитата (Твин® 40); полиэтиленгликоль-сорбитан-моностеарата (Твин® 60); полиоксиэтилен-сорбитан-тристеарата (Твин® 65); полиэтиленгликоль-сорбитанмоноолеата (Твин® 80); полиоксиэтилен-сорбитан-триолеата (Твин® 85); трис-(оксиметил)аминометанлаурилсульфата (Тризма® додецилсульфат); блочного сополимера полиэтилен- и полипропиленгликолей (Плюроник® Р68) или альбумина.
  87. 87. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся находится в интервале приблизительно 1-5000 ед./мг.
  88. 88. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся находится в интервале приблизительно 1-300 ед./мг.
  89. 89. Фармацевтическая композиция по п.85, отличающаяся находится в интервале приблизительно 1-150 ед./мг.
  90. 90. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ион металла, выбранного из кальция и магния.
  91. 91. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена для заданного высвобождения во времени или для высвобождения при контакте с местом введения или тканью-мишенью.
  92. 92. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена для местного, локального, брюшного, парентерального, внутрицистного, внутрикожного, внутрь стекловидного тела, тем, тем, тем, что что что концентрация концентрация концентрация гликопротеина гликопротеина гликопротеина подкожного, внутримышечного или внутривенного введения.
  93. 93. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что составлена в виде спрея, пены или аэрозоля, таблетки или капсулы.
    - 81 009383
  94. 94. Фармацевтическая композиция по п.90, отличающаяся тем, что дополнительно содержит растворимое в кишечнике покрытие.
  95. 95. Фармацевтическая композиция по п.94, отличающаяся тем, что покрытие выбрано из фталата ацетата целлюлозы, полиэтиленгликоля, полиоксиэтилен-сорбитана, касторового масла, псевдолатекса этилцеллюлозы фенилсалицилата, н-бутилстеарата, стеариновой кислоты и карнаубского воска.
  96. 96. Фармацевтическая композиция по п.71, отличающаяся тем, что представляет собой лиофилизированный порошок.
  97. 97. Фармацевтическая композиция по п.96, отличающаяся тем, что лиофилизованный порошок получают способом, включающим:
    a) перенесение фармацевтической композиции в буферный раствор;
    b) стерильное фильтрование полученного раствора;
    c) лиофильную сушку фильтрованного раствора при стандартных условиях, чтобы получить стерильный порошок.
  98. 98. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что буферный раствор выбран из НЕРЕБ, фосфата, цитрата и бикарбоната.
  99. 99. Фармацевтическая композиция по п.98, отличающаяся тем, что буферный раствор дополнительно содержит сахар или углевод.
  100. 100. Фармацевтическая композиция по п.99, отличающаяся тем, что сахар или углевод представляет собой декстрозу или лактозу.
  101. 101. Фармацевтическая композиция по п.100, отличающаяся тем, что лактоза присутствует в концентрации приблизительно 1-15 мг/мл.
  102. 102. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что буферный раствор дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
  103. 103. Фармацевтическая композиция по п.97, отличающаяся тем, что поверхностно-активное веще- ство выбрано из сорбитан-монолаурата; сорбитан-моноолеата; сорбитан-пальмитата; сорбитанмоностеарата; сорбитан-сесквитолата; сорбитан-триолеата; производных эфира полиоксиэтиленолеиновой кислоты; производных полиоксиэтилен-лауриламина; производных полиоксиэтиленстеариламина; производных полиоксиэтилен-олеиламина; полиоксиэтиленовых производных касторового масла; полиоксиэтиленовых производных гидрогенизированного касторового масла; полиоксиэтиленовых производных бис-фенольного эфира; полиоксиэтиленгликолей; сорбитановых производных эфиров жирных кислот; полиоксиэтиленовых производных эфиров жирных кислот; производных полиоксиэтилен-полиоксипропилена; полиэтиленгликоль-гексадецилового эфира (Вгу® 56); полиэтиленгликольоктадецилового эфира (Вгу® 72); полиоксиэтилен-10 олеилового эфира (Вгу® 97); третоктилфеноксиполиэтоксиэтанола (Тритон® Х-100); полиэтиленгликоль-сорбитан-монолаурата (Твин® 20); полиоксиэтилен-сорбитан-монопальмитата (Твин® 40); полиэтиленгликоль-сорбитан-моностеарата (Твин® 60); полиоксиэтилен-сорбитан-тристеарата (Твин® 65); полиэтиленгликоль-сорбитанмоноолеата (Твин® 80); полиоксиэтилен-сорбитан-триолеата (Твин® 85); трис(оксиметил)аминометанлаурилсульфата (Тризма® додецилсульфат); блочного сополимера полиэтилен- и полипропиленгликолей (Плюроник® Е68) или альбумина.
  104. 104. Набор, включающий стерильный флакон и фармацевтическую композицию, как она определена в п.71, характеризующийся тем, что композиция находится во флаконе.
  105. 105. Набор по п.104, отличающийся тем, что стерильный флакон содержит количество фармацевтической композиции, предназначенное для введения одной дозы.
  106. 106. Набор, включающий стерильный флакон, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.92.
  107. 107. Набор по п.104, отличающийся тем, что стерильный флакон дополнительно содержит необходимое для инъекции количество стерильной воды, и конечная концентрация гликопротеина составляет приблизительно 1-5000 ед./мл.
  108. 108. Набор, включающий стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.71.
  109. 109. Набор по п.108, отличающийся тем, что стерильный шприц имеет объём приблизительно 5-50 мкл.
  110. 110. Набор по п.108, отличающийся тем, что конечная концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-5000 ед./мл.
  111. 111. Набор, включающий стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию, как она определена в п.92.
  112. 112. Набор по п.111, отличающийся тем, что конечная концентрация гликопротеина находится в интервале приблизительно 1-5000 ед./мл.
  113. 113. Набор по п.111, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция растворена в стерильной воде объёмом приблизительно 5-50 мкл.
  114. 114. Набор по п.111, отличающийся тем, что он дополнительно содержит второй шприц, содержа
    - 82 009383 щий фармацевтически эффективное средство.
  115. 115. Набор по п.111, отличающийся тем, что фармацевтически эффективное средство выбрано из группы средств, состоящей из химиотерапевтического, анальгезирующего, противовоспалительного, антимикробного, амёбоцидного, трихомоноцидного, антипаркинсонного, антималярийного, антиконвульсионного, антидепрессивного, противоартритного, противогрибкового, антигипертензивного, жаропонижающего, противопаразитного, антигистаминного, альфа-адренергического агониста, альфаблокирующего, обезболивающего, бронхолитического, биоцидного, бактерицидного, бактериостатического, бета-адренергоблокирующего, блокирующего кальциевые каналы, сердечно-сосудистого лекарства, противозачаточного, противозастойного, мочегонного, депрессантного, диагностического, электролитического, гипнотического, гормонального, гипергликемического, мышцерасслабляющего, мышцесокращающего, офтальмологического, парасимпатомиметического, тимолептического, седативного, симпатомиметического, транквилизатора, мочевого, вагинального, противовирусного, витаминного, нестероидного противовоспалительного, ингибирующего ангиотензин-преобразующий фермент средств, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарства, органической молекулы или снотворного средства.
  116. 116. Набор по п.115, отличающийся тем, что фармацевтически эффективным средством является вязкоупругое вещество.
  117. 117. Комплект, содержащий набор, как он определен в п.104 или 111, и одно или более из следующего:
    упаковочный материал и инструкции по пользованию комплектом для применения фармацевтической композиции.
  118. 118. Комплект по п.117, отличающийся тем, что упаковочный материал включает лёд, сухой лёд, пенополистирол, пенопласт, пластмассу, целлофан, плотную обёртку, пупырчатую обёртку, бумагу, картон, арахисовый крахмал, скрученные стяжки, металлические скрепки, металлические контейнеры, осушители, стекло и резину.
  119. 119. Применение по п.47 для лечения патологического накопления гликозаминогликанов, причём гликопротеин не содержит бычьего, овечьего или бактериального ферментов и исправляет или снижает накопление гликозаминогликанов.
  120. 120. Применение по п.119, отличающееся тем, что накопление выбрано из сердечно-сосудистого, церебрального накопления, парафимоза, микседемы, склеромикседемы и лимфедемы.
  121. 121. Применение по п.47 для облегчения восстановления сосудов в некротической ткани, включающего введение и индуцирующее прорастание новых кровеносных сосудов в некротическую ткань.
  122. 122. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, для удаления гликозаминогликанов из жидкой части стекловидного тела.
  123. 123. Гликопротеин по п.1, отличающийся тем, что ^связанный гликан имеет степень полимеризации, равную приблизительно 15,6; 13,7; 11,6; 10,0; 8,37; 7,32; 6,1; 5,6; 3,8 или 3,2.
  124. 124. Способ получения, по существу, очищенного растворимого гиалуронидазного полипептида РН-20, активного в нейтральных условиях, усечённого у С-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного СРЕ состоящий в выращивании клеток яичника китайского хомячка в подходящей ростовой среде и в присутствии 0,1-1 мМ бутирата натрия в условиях, подходящих для продуцирования полипептида.
  125. 125. Способ очистки гликопротеина по п.1, включающий приведение содержащей кНА8ЕСР среды при низкой ионной силе в контакт с анионообменной смолой при нейтральном рН;
    элюирование кНА8ЕСР солью с концентрацией приблизительно 400 мМ;
    приведение кНА8ЕСР в контакт со смолой для хроматографии с гидрофобным взаимодействием в присутствии приблизительно 0,5 М сульфата аммония;
    приведение кНА8ЕСР в сульфате аммония в контакт с фенилборонатной смолой;
    элюирование кНА8ЕСР в низкой концентрации соли при нейтральном рН;
    приведение кНА8ЕСР в контакт со смолой оксиапатитом;
    элюирование кНА8ЕСР фосфатом натрия с концентрацией приблизительно 100 мМ, что приводит в результате к получению кНА8ЕСР, причём кНА8ЕСР является, по существу, очищенным.
  126. 126. Применение по п.47 для лечения расстройства глаза млекопитающего посредством индукции разжижения жидкой части стекловидного тела.
  127. 127. Применение по п.126, отличающееся тем, что протеин модифицирован полимером.
  128. 128. Применение по п.127, отличающееся тем, что полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
  129. 129. Применение человеческого кНА8ЕСР для снижения внутриглазного давления в глазу индивидуума, включающее введение его нуждающемуся в этом субъекту, причем указанный человеческий кНА8ЕСР характеризуется тем, что он представляет собой полипептид РН-20, усечённый у С-концевого остатка в пределах 10 аминокислот от сайта отщепления эндогенного СРЕ по существу, не содержит бычьего, овечьего или бактериального ферментов;
    имеет активность более 40000 единиц И8Р на 1 мг белка.
    - 83 009383
  130. 130. Применение по п.129, отличающееся тем, что человеческий кНА8БСР дополнительно характеризуется тем, что не содержит 1дС.
  131. 131. Применение гликопротеина, как он определен в п.1, в производстве медикамента для лечения сердечно-сосудистого расстройства, включающего инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность и артериосклероз, накопления гликозаминогликанов, кровоизлияния в стекловидное тело, грыжи межпозвоночного диска, рака, внутриглазного давления и микседемы.
EA200501384A 2003-03-05 2004-03-05 РАСТВОРИМЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ГИАЛУРОНИДАЗЫ (sHASEGP), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ EA009383B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45236003P 2003-03-05 2003-03-05
PCT/US2004/006656 WO2004078140A2 (en) 2003-03-05 2004-03-05 SOLUBLE HYALURONIDASE GLYCOPROTEIN (sHASEGP), PROCESS FOR PREPARING THE SAME, USES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEREOF

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501384A1 EA200501384A1 (ru) 2006-06-30
EA009383B1 true EA009383B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=32962713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501384A EA009383B1 (ru) 2003-03-05 2004-03-05 РАСТВОРИМЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ГИАЛУРОНИДАЗЫ (sHASEGP), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ

Country Status (27)

Country Link
US (14) US7767429B2 (ru)
EP (7) EP2330213A1 (ru)
JP (3) JP4464395B2 (ru)
KR (4) KR20050118273A (ru)
CN (2) CN102943067B (ru)
AT (1) ATE448323T1 (ru)
AU (2) AU2004218354B2 (ru)
BR (1) BRPI0408116B1 (ru)
CA (1) CA2517145C (ru)
CY (6) CY1109750T1 (ru)
DE (1) DE602004024041D1 (ru)
DK (4) DK2163643T3 (ru)
EA (1) EA009383B1 (ru)
ES (4) ES2532399T3 (ru)
FR (1) FR16C0030I1 (ru)
HK (4) HK1086746A1 (ru)
HU (2) HUE027661T2 (ru)
IL (2) IL170300A (ru)
LU (2) LU92780I2 (ru)
MX (1) MXPA05009429A (ru)
NZ (1) NZ542873A (ru)
PL (4) PL2177620T3 (ru)
PT (3) PT2163643E (ru)
SG (2) SG2012041067A (ru)
SI (4) SI2163643T1 (ru)
WO (1) WO2004078140A2 (ru)
ZA (1) ZA200507978B (ru)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651756C1 (ru) * 2017-05-10 2018-04-23 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего Образования Кубанский Государственный Медицинский Университет Министерства Здравоохранения Российской Федерации, КубГМУ Препарат для предотвращения образования глиальных рубцов
US10556961B2 (en) 2014-02-28 2020-02-11 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10604580B2 (en) 2014-09-09 2020-03-31 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10668149B2 (en) 2015-06-22 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-CD38 antibodies and survivin inhibitors
US10766965B2 (en) 2015-05-20 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US10793630B2 (en) 2014-12-04 2020-10-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
US10800851B2 (en) 2014-02-28 2020-10-13 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US11021543B2 (en) 2015-06-24 2021-06-01 Janssen Biotech, Inc. Immune modulation and treatment of solid tumors with antibodies that specifically bind CD38
US11566079B2 (en) 2015-11-03 2023-01-31 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma

Families Citing this family (241)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
EP1636248A4 (en) 2002-12-16 2006-09-06 Halozyme Inc HUMAN CHONDROITINASE GLYCOPROTEIN (CHASEGP), PROCESS FOR PREPARING THE SAME, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING SAID GLYCOPROTEIN
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
DK2163643T3 (en) 2003-03-05 2015-03-23 Halozyme Inc Soluble hyaluronidaseglycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, pharmaceutical compositions and uses thereof covered
US7572613B2 (en) * 2004-06-25 2009-08-11 Klein Jeffrey A Drug delivery system for accelerated subcutaneous absorption
CN101094680A (zh) * 2004-12-30 2007-12-26 建新公司 用于关节内粘弹性补充的方案
CN103172739A (zh) 2005-06-30 2013-06-26 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
EP2500357A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
JP2009510002A (ja) 2005-09-30 2009-03-12 アボット ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
JP5475994B2 (ja) 2005-11-30 2014-04-16 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗Ａβグロブロマー抗体、その抗原結合部分、対応するハイブリドーマ、核酸、ベクター、宿主細胞、前記抗体を作製する方法、前記抗体を含む組成物、前記抗体の使用及び前記抗体を使用する方法。
RS53270B2 (sr) 2005-11-30 2018-05-31 Abbvie Deutschland Monoklonalna antitela protiv amiloidnog beta proteina i njihova upotreba
KR20090006153A (ko) * 2006-03-31 2009-01-14 큐엘티 플러그 딜리버리, 인코포레이티드 비루관계에 대한 약물 전달 방법, 구조, 및 조성물
SG174782A1 (en) 2006-09-08 2011-10-28 Abbott Lab Interleukin - 13 binding proteins
TWI414531B (zh) 2006-10-12 2013-11-11 Genentech Inc 淋巴毒素α之抗體
US20080160003A1 (en) * 2006-10-31 2008-07-03 University Of Delaware Fertility Enhancement Using Lipid Carriers and Bioactive Molecules
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
RU2471867C2 (ru) * 2007-06-19 2013-01-10 Тамара П. Уваркина Гиалуронидаза и способ ее применения
RU2010112417A (ru) * 2007-09-07 2011-10-10 Клт Плаг Диливери, Инк. (Us) Обнаружение лакримальных имплантатов
CN102159183A (zh) * 2007-11-06 2011-08-17 斯图亚特·L·韦格 麻醉药组合物、制剂和使用方法
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
ES2537340T3 (es) 2008-03-06 2015-06-05 Halozyme, Inc. Producción a gran escala de hialuronidasa soluble
TWI532498B (zh) 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
KR20100135291A (ko) 2008-04-14 2010-12-24 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
WO2009128918A1 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102089430B (zh) 2008-05-09 2015-02-04 Abbvie公司 针对渐进性糖化终极产物受体(rage)的抗体及其用途
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102112494A (zh) 2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
EP2310049A4 (en) 2008-07-08 2013-06-26 Abbvie Inc PROSTAGLANDIN E2 BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AR077718A1 (es) * 2008-07-15 2011-09-21 Genentech Inc Metodos para tratar enfermedades autoinmunes usando anticuerpos anti cd4. formulacion farmaceutica
ES2413492T3 (es) * 2008-10-14 2013-07-16 Burgard, Gunther, Dr. Uso de hialuronidasa para la prevención o el tratamiento de la hipertensión arterial
GB0819883D0 (en) 2008-10-29 2008-12-03 Azyme Res As Product and uses
PT3037529T (pt) 2008-12-09 2019-05-31 Halozyme Inc Polipéptidos ph20 estendidos solúveis e suas utilizações
AU2013202000B2 (en) * 2008-12-09 2015-07-30 Halozyme, Inc. Extended soluble PH20 polypeptides and uses thereof
US20100209558A1 (en) * 2009-02-19 2010-08-19 General Nutrition Corporation Dietary ingredient with enhanced bioavailability
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
CA2754461A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 and uses thereof
US8283162B2 (en) 2009-03-10 2012-10-09 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKAII and uses thereof
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
DE102009003291A1 (de) * 2009-05-20 2010-12-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Kosmetische Zusammensetzung und Verformungsverfahren für keratinische Fasern
US20100305500A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
SG177424A1 (en) * 2009-06-29 2012-02-28 Univ Singapore Synthesis and use of fluorophore-tagged antimalarials
US8263581B2 (en) 2009-07-03 2012-09-11 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US8513259B2 (en) 2009-07-03 2013-08-20 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
JP2013503607A (ja) 2009-09-01 2013-02-04 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
WO2011034604A2 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Baxter Healthcare, S.A. Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
AR078651A1 (es) 2009-10-15 2011-11-23 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TW201121568A (en) 2009-10-31 2011-07-01 Abbott Lab Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
EP2510001B1 (en) 2009-12-08 2015-12-02 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
ES2635594T3 (es) 2010-05-14 2017-10-04 Abbvie Inc. Proteínas de unión a IL-1
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MX348420B (es) 2010-07-20 2017-06-12 Halozyme Inc Efectos secundarios adversos asociados con la administracion de agentes anti-hialuronano y metodos para mejorar o prevenir los efectos secundarios.
US9120862B2 (en) 2010-07-26 2015-09-01 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKA-II and uses thereof
NZ607480A (en) 2010-08-03 2014-10-31 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6147665B2 (ja) 2010-08-14 2017-06-14 アッヴィ・インコーポレイテッド アミロイドベータ結合タンパク質
EP2608803A4 (en) 2010-08-26 2014-01-15 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
KR20130096731A (ko) 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
US8740982B2 (en) 2010-10-26 2014-06-03 Kyphon Sarl Devices containing a chemonucleolysis agent and methods for treating an intervertebral disc or spinal arachnoiditis
US8404268B2 (en) 2010-10-26 2013-03-26 Kyphon Sarl Locally targeted anti-fibrotic agents and methods of use
US9414930B2 (en) 2010-10-26 2016-08-16 Kyphon SÀRL Activatable devices containing a chemonucleolysis agent
WO2012058483A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Pacira Pharmaceuticals, Inc. A sustained release formulation of a non-steroidal anti-inflammatory drug
US8580264B2 (en) 2010-11-08 2013-11-12 Genentech, Inc. Subcutaneously administered anti-IL-6 receptor antibody
WO2012121775A2 (en) 2010-12-21 2012-09-13 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012106363A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
EP2672958A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
AU2012271359B2 (en) 2011-06-17 2016-05-19 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
BR112013032265A2 (pt) 2011-06-17 2016-12-20 Halozyme Inc métodos de infusão de insulina subcutânea contínua com uma enzima de degradação do hialuronano
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
AU2012283039A1 (en) 2011-07-13 2014-01-30 Abbvie Inc. Methods and compositions for treating asthma using anti-IL-13 antibodies
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
EP2771361A1 (en) 2011-10-24 2014-09-03 AbbVie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
TW201323440A (zh) 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）之免疫結合物
SG11201401797TA (en) 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
AU2012352168C1 (en) 2011-12-14 2018-01-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
US9636398B2 (en) 2011-12-14 2017-05-02 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
LT3130347T (lt) 2011-12-30 2019-10-25 Halozyme Inc Ph20 polipeptido variantai, kompozicijos ir jų panaudojimas
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
PL2807192T3 (pl) 2012-01-27 2019-02-28 Abbvie Deutschland Kompozycja oraz sposób diagnostyki i leczenia chorób związanych ze zwyrodnieniem neurytów
JP6042527B2 (ja) 2012-04-04 2016-12-14 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
CN104379741B (zh) 2012-04-23 2021-07-20 基因先端领域株式会社 抗人cd69抗体及其用于医疗目的的用途
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR101454646B1 (ko) * 2012-11-05 2014-10-27 (주)한국비엠아이 히알루로니다아제의 안정화 제제 및 이를 포함하는 액상제제
EP2918678B1 (en) 2012-11-09 2019-01-30 GeneFrontier Corporation Anti-adam28 antibody for treating cancer
WO2014107745A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Halozyme, Inc. Metal sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
US9789091B2 (en) 2013-03-14 2017-10-17 University Of Massachusetts Methods of inhibiting cataracts and presbyopia
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
MX2015013166A (es) 2013-03-15 2015-12-11 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-1 beta y/o il-17.
TWI476203B (zh) 2013-03-18 2015-03-11 Ind Tech Res Inst 醣類的分離方法
WO2014165713A2 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Cedars-Sinai Medical Center Treatment of inflammatory conditions by modulation of hyaluronan and hyaluronidase activity
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
CN105407974A (zh) 2013-07-03 2016-03-16 希望之城 抗癌组合
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
US9387151B2 (en) 2013-08-20 2016-07-12 Anutra Medical, Inc. Syringe fill system and method
US9968623B2 (en) * 2013-08-29 2018-05-15 Lanny Leo Johnson Prepackaged sterile syringe or containers with various substance concentrations with or without bioactive reagent
KR102651018B1 (ko) 2013-09-11 2024-03-27 이글 바이오로직스 인코퍼레이티드 점도저하제를 함유하는 액체 단백질 제형
AU2014335251B2 (en) 2013-10-15 2020-04-30 Genefrontier Corporation Human antibody against aggrecanase-type ADAMTS species for therapeutics of aggrecanase-related diseases
WO2015057622A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Sialylated glycoproteins
CA2931978A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating osteoarthritis
US20150291689A1 (en) 2014-03-09 2015-10-15 Abbvie, Inc. Compositions and Methods for Treating Rheumatoid Arthritis
BR112016021717A2 (pt) 2014-03-21 2018-07-10 Abbvie Inc anticorpos anti-egfr e conjugados anticorpo-fármaco
US10117886B2 (en) 2014-05-30 2018-11-06 Hao Cheng Hyaluronidase and a low density second PEG layer on the surface of therapeutic-encapsulated nanoparticles to enhance nanoparticle diffusion and circulation
USD750768S1 (en) 2014-06-06 2016-03-01 Anutra Medical, Inc. Fluid administration syringe
USD774182S1 (en) 2014-06-06 2016-12-13 Anutra Medical, Inc. Anesthetic delivery device
USD763433S1 (en) 2014-06-06 2016-08-09 Anutra Medical, Inc. Delivery system cassette
US20160002326A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
US10307467B2 (en) * 2014-07-16 2019-06-04 New York University Use of hyaluronidase for treatment of muscle stiffness
PL3186281T3 (pl) 2014-08-28 2019-10-31 Halozyme Inc Terapia skojarzona enzymem rozkładającym hialuronian i inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej
EA035414B1 (ru) * 2014-09-18 2020-06-10 Шондронест Са Комбинация, содержащая гликозаминогликаны и белки
US11471479B2 (en) 2014-10-01 2022-10-18 Eagle Biologics, Inc. Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
EA201700181A1 (ru) 2014-10-14 2017-09-29 Галозим, Инк. Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016137471A1 (en) * 2015-02-26 2016-09-01 Nantpharma, Llc Method for enhanced heparin quality
US9981021B1 (en) 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
PE20180193A1 (es) 2015-05-29 2018-01-26 Abbvie Inc Anticuerpos anti-cd40 y sus usos
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
PE20181090A1 (es) 2015-06-24 2018-07-09 Janssen Biotech Inc Modulacion y tratamiento inmunes de tumores solidos con anticuerpos que se unen especificamente a cd38
EP4324476A2 (en) 2015-09-11 2024-02-21 AbbVie Inc. Methods for treating relapsing forms of multiple sclerosis
PE20181070A1 (es) 2015-11-13 2018-07-04 Univ Massachusetts Moleculas bifuncionales que contienen peg para uso en la inhibicion de cataratas y presbicia
ITUB20159209A1 (it) * 2015-12-21 2017-06-21 Fidia Farm Spa Nanosistemi per il trasporto controllato di molecole attive a fini diagnostici, prognostici e terapeutici
US10493247B2 (en) 2016-03-15 2019-12-03 Medtronic Holding Company Sàrl Devices for delivering a chemical denervation agent and methods of use
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
AU2017238172A1 (en) 2016-03-21 2018-09-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
MX2018014920A (es) 2016-06-01 2019-08-26 Abbvie Inc Anticuerpos antagonistas antimolécula de orientación repulsiva a (rgma) para el tratamiento de lesion y dolor de la medula espinal.
PL3458479T3 (pl) 2016-06-08 2021-07-26 Abbvie Inc. Przeciwciała anty-b7-h3 i koniugaty przeciwciało-lek
JP2019524651A (ja) 2016-06-08 2019-09-05 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ９８抗体及び抗体薬物コンジュゲート
AU2017279539A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-B7-H3 antibodies and antibody drug conjugates
EP3474895A1 (en) 2016-06-28 2019-05-01 UMC Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
EP3436054B2 (en) 2016-09-13 2022-07-27 Allergan, Inc. Stabilized non-protein clostridial toxin compositions
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR102618948B1 (ko) 2016-11-17 2023-12-27 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 잔유 종양 침윤 림프구 및 그의 제조 및 사용 방법
CN109982709A (zh) * 2016-11-17 2019-07-05 Vcn生物科学有限公司 病毒载体在治疗视网膜母细胞瘤中的用途
EP3541815A4 (en) 2016-11-18 2020-07-15 Pacira Pharmaceuticals, Inc. ZINC MELXICAM COMPLEX MICROPARTICLE MULTIVESICULAR LIPOSOME FORMULATIONS AND METHODS OF MAKING THE SAME
CN108367075B (zh) 2016-11-23 2022-08-09 免疫方舟医药技术股份有限公司 4-1bb结合蛋白及其用途
TW202138007A (zh) 2017-01-17 2021-10-16 美商建南德克公司 皮下her2抗體調配物
KR20190133213A (ko) 2017-03-31 2019-12-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
EP3620531A4 (en) 2017-05-02 2021-03-17 National Center of Neurology and Psychiatry METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
JP2020536894A (ja) 2017-10-15 2020-12-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍処置法
CN111315397A (zh) 2017-11-06 2020-06-19 百时美施贵宝公司 治疗肿瘤的方法
US20210369819A1 (en) * 2017-12-29 2021-12-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hyaluronidase for the prevention, treatment, reduction and/or abolishment of cerebral edema and intracranial pressure
JP2021517588A (ja) 2018-03-13 2021-07-26 フンダシオン・パラ・ラ・インベスティガシオン・ビオメディカ・デル・オスピタル・ウニベルシタリオ・ラ・パスＦｕｎｄａｃｉｏｎ Ｐａｒａ Ｌａ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｄｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ Ｌａ Ｐａｚ 癌免疫療法のための活性化および拡張ナチュラルキラー細胞と組み合わせた抗ｃｘｃｒ４抗体
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019182745A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Bryn Pharma, LLC Epinephrine spray formulations
CN111886256A (zh) 2018-03-23 2020-11-03 百时美施贵宝公司 抗mica和/或micb抗体及其用途
CN111971306A (zh) 2018-03-30 2020-11-20 百时美施贵宝公司 治疗肿瘤的方法
WO2019195452A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti-cd27 antibodies and uses thereof
LT3681500T (lt) 2018-04-24 2022-06-27 Allergan, Inc. Pilokarpino hidrochlorido naudojimas presbiopijos gydymui
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
BR112020023187A2 (pt) 2018-05-16 2021-04-20 Janssen Biotech, Inc. métodos para tratamento de cânceres e de aumento da eficácia de agentes terapêuticos de redirecionamento de células t
US20210208156A1 (en) * 2018-06-01 2021-07-08 Musc Foundation For Research Development Glycan analysis of proteins and cells
WO2020003210A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation Anti-l1cam antibodies and uses thereof
CN112955465A (zh) 2018-07-03 2021-06-11 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
KR20210023798A (ko) * 2018-07-25 2021-03-04 (주)알테오젠 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
KR20210072059A (ko) 2018-10-09 2021-06-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암을 치료하기 위한 항-MerTK 항체
JP2022512722A (ja) 2018-10-17 2022-02-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体の皮下投与を提供する方法
JP2022505647A (ja) 2018-10-23 2022-01-14 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 腫瘍の処置方法
WO2020092546A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
JP2022513018A (ja) 2018-11-13 2022-02-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体の生成中の微量金属の制御
CN109679823B (zh) * 2018-11-19 2022-03-15 江苏汇先医药技术有限公司 一种用于生物分子、细胞或细菌的捕获材料及捕获筛
CA3131014A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Andreas Loew Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN117100867A (zh) * 2019-03-25 2023-11-24 阿特根公司 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物
EP3946628A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
US20220041733A1 (en) 2019-03-28 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
CA3135170A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Tauc3 Biologics Limited Anti-tauc3 antibodies and uses thereof
KR20220005561A (ko) * 2019-05-07 2022-01-13 젠자임 코포레이션 전구약물 조성물에서 약물 농도를 정량화하는 방법
WO2020241340A1 (ja) * 2019-05-24 2020-12-03 株式会社糖鎖工学研究所 新規な人工タンパク質触媒
EP3977132A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
US20220363760A1 (en) 2019-05-30 2022-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signature for suitability to immuno-oncology therapy
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
CA3150224A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
JP2022549337A (ja) 2019-09-25 2022-11-24 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー がん療法のための複合バイオマーカー
EP4017524A4 (en) * 2019-10-15 2022-09-21 Standard of Care Corporation COMPOSITIONS WITH HYALURONIDASE AND/OR COLLAGENASE AND/OR 4-METHYLUMBELLIFERONE (4-MU) AND METHODS OF TREATMENT THEREOF
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
MX2022005474A (es) 2019-11-08 2022-06-02 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de melanoma con antagonistas del gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3).
AU2020399619A1 (en) 2019-12-09 2022-06-09 Genentech, Inc. Anti-PD-L1 antibody formulations
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
CN114929261A (zh) 2020-02-17 2022-08-19 生物测试股份公司 凝血因子viii的皮下施用
WO2021194942A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ccr8 antibodies for treating cancer
CN111529685A (zh) * 2020-04-21 2020-08-14 厦门诺康得生物科技有限公司 抗呼吸道病毒感染的鼻腔喷雾制剂
EP4171748A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Genentech, Inc. Pertuzumab plus trastuzumab fixed dose combination
EP4182688A1 (en) 2020-07-14 2023-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Assays for fixed dose combinations
MX2023000760A (es) * 2020-07-17 2023-02-13 Geron Corp Composiciones subcutaneas del inhibidor de la telomerasa y metodos para su uso.
BR112022019726A2 (pt) * 2020-08-07 2023-03-07 Alteogen Inc Método para produzir hialuronidase recombinante
CA3190755A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN116761818A (zh) 2020-08-26 2023-09-15 马伦戈治疗公司 检测trbc1或trbc2的方法
BR112023003427A2 (pt) 2020-08-28 2023-03-21 Bristol Myers Squibb Co Terapia com antagonista de lag-3 para carcinoma hepatocelular
JP2023538955A (ja) 2020-08-31 2023-09-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在シグネチャーおよび免疫療法
EP4232019A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for lung cancer
CN112168838A (zh) * 2020-10-23 2021-01-05 中国科学院动物研究所 透明质酸及其盐的治疗用途
US20220133861A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Standard Of Care Corporation Hyaluronidase compositions and methods of using same to treat edema
CN116437901A (zh) 2020-11-17 2023-07-14 爱尔兰詹森科学公司 疾病或病症的治疗或预防
TW202233192A (zh) 2020-11-17 2022-09-01 愛爾蘭商健生科學愛爾蘭無限公司 Hiv感染之治療或預防
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
CA3201348A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Masano HUANG Antibody compositions and methods of use thereof
CA3196999A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Masano HUANG Methods of treating tumors
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
US20220275090A1 (en) 2021-02-22 2022-09-01 Janssen Biotech, Inc. Combination Therapies with Anti-CD38 Antibodies and PARP or Adenosine Receptor Inhibitors
CN114350639B (zh) * 2021-03-05 2023-06-02 华熙生物科技股份有限公司 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
CN113025599B (zh) * 2021-04-02 2023-09-12 重庆科润生物医药研发有限公司 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用
JP2024515591A (ja) 2021-04-08 2024-04-10 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔｃｒに結合する多機能性分子およびその使用
EP4323404A1 (en) 2021-04-16 2024-02-21 Tiziana Life Sciences PLC Subcutaneous administration of antibodies for the treatment of disease
TW202308689A (zh) 2021-04-21 2023-03-01 美商健生生物科技公司 高濃度的雙特異性抗體調配物
WO2022251645A1 (en) 2021-05-27 2022-12-01 Steiner Ventures Llc Hyaluronidase composition for intravenous administration and method of using the same
CN115671267A (zh) 2021-07-23 2023-02-03 上海宝济药业有限公司 一种皮下抗生素药物组合物
WO2023011502A1 (zh) * 2021-08-02 2023-02-09 甘李药业股份有限公司 含有抗il-4r抗体的稳定制剂
IL310608A (en) 2021-08-02 2024-04-01 argenx BV Dosage forms for subcutaneous administration
TW202327644A (zh) 2021-09-14 2023-07-16 日商武田藥品工業股份有限公司 經促進之濃縮抗體調配物之遞送
IL309227A (en) 2021-10-29 2024-02-01 Bristol Myers Squibb Co LAG-3 antagonist therapy for hematological cancer
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023134613A1 (zh) * 2022-01-14 2023-07-20 天津键凯科技有限公司 一种透明质酸衍生物或其盐及其制备方法和应用
WO2023147371A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for hepatocellular carcinoma
WO2023164638A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma
WO2023168305A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
CN114634920B (zh) * 2022-03-24 2024-02-27 江南大学 一种产人源透明质酸酶ph20的重组毕赤酵母及其构建方法
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2023203257A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Freeze dried compositions
WO2023203258A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Liquid compositions
WO2023230473A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies that bind to human ccr8
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721348A (en) * 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
US5854046A (en) * 1996-07-03 1998-12-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase

Family Cites Families (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US53247A (en) * 1866-03-13 Improved process for disintegrating fibers
US172892A (en) * 1876-02-01 Improvement in restaurant check-boxes
US345770A (en) * 1886-07-20 Halp to nathan s
US8309A (en) * 1851-08-26 Washing-machine
US305500A (en) * 1884-09-23 Window-bead fastener
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3639200A (en) * 1969-12-19 1972-02-01 Armin Elmendorf Textured wood panel
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
USRE28819E (en) * 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
JPS6033474B2 (ja) * 1978-05-11 1985-08-02 藤沢薬品工業株式会社 新規なヒアルロニダ−ゼｂｍｐ−８２３１およびその製造法
US4573994A (en) 1979-04-27 1986-03-04 The Johns Hopkins University Refillable medication infusion apparatus
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4328245A (en) 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
EP0162007A1 (de) 1984-04-18 1985-11-21 Geriaco AG Stabiles, lagerungsfähiges Insulinpräparat zur Behandlung von Akne vulgaris
US4769027A (en) * 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
GB8504025D0 (en) 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4687610A (en) 1986-04-30 1987-08-18 E. I. Du Pont De Neumours And Company Low crystallinity polyester yarn produced at ultra high spinning speeds
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
EP0263417A1 (de) 1986-09-30 1988-04-13 BIOCHEMIE Gesellschaft m.b.H. Verwendung von Hyaluronidase
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5723147A (en) 1987-02-23 1998-03-03 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
US5041292A (en) 1988-08-31 1991-08-20 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
DE3921528A1 (de) * 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5215899A (en) 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
ZA912770B (en) 1990-04-16 1992-01-29 Bethesda Eye Inst Enzymatic disinsertion of vitreous body
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5401629A (en) 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
EP0553235A1 (en) 1990-10-01 1993-08-04 The University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
DE69218811T2 (de) * 1991-01-23 1997-07-17 Matsushita Electric Ind Co Ltd Wasser- und ölabweisender adsorbierter Film und Verfahren zu dessen Herstellung
JP3476455B2 (ja) 1991-03-18 2003-12-10 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ＮｅｕＡｃα２、６Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ及びシアリルＬｅｘの合成法
DK0584279T3 (da) 1991-05-14 2001-06-11 Immune Response Corp Inc Målrettet aflevering af gener, som koder for immunogene proteiner
ES2149774T3 (es) 1991-06-05 2000-11-16 Univ Connecticut Aportacion dirigida de genes que codifican proteinas secretoras.
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
CA2133411A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Alexander T. YOUNG Gene therapy using targeted viral vectors
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5496718A (en) * 1992-06-26 1996-03-05 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896
JP3980657B2 (ja) 1992-06-26 2007-09-26 生化学工業株式会社 コンドロイチナーゼａｂｃ、その製造法及び医薬組成物
JP3789930B2 (ja) 1992-10-09 2006-06-28 アドバンスド ティシュー サイエンシズ，インコーポレーテッド 肝予備細胞
US5591767A (en) * 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5354566A (en) 1993-06-02 1994-10-11 Kraft General Foods, Inc. Preparation of yeast-leavened dough crusts
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5766627A (en) 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
ZA951877B (en) 1994-03-07 1996-09-09 Dow Chemical Co Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
CA2167090C (en) * 1994-03-31 2002-05-14 Timothy D. Bartley Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5747027A (en) * 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
NZ322686A (en) * 1995-10-19 2000-01-28 Univ Washington Discrete-length polyethene glycols
US6610292B2 (en) 1995-11-22 2003-08-26 Ista Pharmaceuticals, Inc. Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders
US6828431B1 (en) * 1999-04-09 2004-12-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US6784023B2 (en) * 1996-05-20 2004-08-31 Micron Technology, Inc. Method of fabrication of stacked semiconductor devices
AU737078C (en) 1996-05-24 2002-05-02 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing diseases of body passageways
US5665069A (en) * 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6123938A (en) * 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6103525A (en) * 1996-10-17 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
US6258351B1 (en) * 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CN1257430A (zh) * 1997-05-22 2000-06-21 先进角膜系统公司 透明质酸酶在制备用于治疗眼科疾病中液化玻璃体液的眼用制剂中的应用
FR2763958A1 (fr) * 1997-05-29 1998-12-04 Transgene Sa Produit de combinaison associant un acide nucleique a une substance desorganisant la matrice extracellulaire pour la therapie genique
SE512633C2 (sv) * 1997-07-09 2000-04-17 Cecilia Johnsson Användning av hyaluronidas för reduktion av inflammatoriska cellinfiltrat
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AU2903899A (en) * 1998-03-12 1999-09-27 Shearwater Polymers Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
US6420339B1 (en) * 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
PL344745A1 (en) 1998-12-23 2001-11-19 Id Pharma Gmbh Pharmaceutical formulation containing a microbial enzyme which digests hyaluronic acid
US6528797B1 (en) * 1999-04-16 2003-03-04 The Regents Of The University Of Michigan Method and system for determining depth distribution of radiation-emitting material located in a source medium and radiation detector system for use therein
DK1173198T3 (da) 1999-04-29 2004-04-13 Ista Pharmaceuticals Inc Anvendelse af en bestemt hyaluronidase til eliminering af ar på, uigennemsigtighed og uklarhed på hornhinden
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6461802B1 (en) * 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
ATE317868T1 (de) * 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
AU784155B2 (en) 2000-01-25 2006-02-09 Halozyme, Inc. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
US20030212021A1 (en) 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
DE10013735A1 (de) * 2000-03-23 2001-10-11 Bakelite Ag Härter für Epoxidverbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
TWI246524B (en) * 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6745776B2 (en) 2001-04-10 2004-06-08 David B. Soll Methods for reducing postoperative intraocular pressure
FR2827377B1 (fr) * 2001-07-13 2003-12-05 Poudres & Explosifs Ste Nale Dispositif d'allumage pour microcharges pyrotechniques
US20040224012A1 (en) 2001-10-05 2004-11-11 Pichit Suvanprakorn Topical application and methods for administration of active agents using liposome macro-beads
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
AU2002352524B2 (en) * 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
EP1461444A2 (en) * 2001-11-28 2004-09-29 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
US7064110B2 (en) * 2002-05-13 2006-06-20 Enanta Pharmaceuticals, Inc. 6-11 bicycle ketolide derivatives
US7049483B1 (en) 2002-07-15 2006-05-23 Bruce Eric Hudkins Transgenic bioluminescent plants
US6682904B1 (en) * 2002-08-15 2004-01-27 Deliatroph Pharmaceuticals, Inc. Specific inhibitors of hyaluronidase 2, and methods of identifying and using same
KR20040040782A (ko) * 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
EP1636248A4 (en) * 2002-12-16 2006-09-06 Halozyme Inc HUMAN CHONDROITINASE GLYCOPROTEIN (CHASEGP), PROCESS FOR PREPARING THE SAME, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING SAID GLYCOPROTEIN
US6969514B2 (en) * 2003-02-05 2005-11-29 Soll David B Method for treating elevated intraocular pressure, including glaucoma
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
DK2163643T3 (en) * 2003-03-05 2015-03-23 Halozyme Inc Soluble hyaluronidaseglycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, pharmaceutical compositions and uses thereof covered
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
WO2004099422A2 (en) 2003-03-28 2004-11-18 The Scripps Research Institute Adenovirus particles with enhanced infectivity of dendritic cells and particles with decreased infectivity of hepatocytes
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
EP1616004A1 (en) 2003-04-15 2006-01-18 Ista Pharmaceuticals, Inc Process for isolating and purifing ovine hyaluronidase
MXPA05011681A (es) * 2003-04-30 2006-06-27 Trine Pharmaceuticals Inc Antibioticos de carbacefen (-lactama.
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
ES2616749T3 (es) 2003-05-16 2017-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC
ES2412489T3 (es) 2003-08-14 2013-07-11 Thrombogenics N.V. Anticuerpos contra el factor VIII con glucosilación modificada en la región variable
WO2005030927A2 (en) 2003-09-23 2005-04-07 Uab Research Foundation Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring
WO2005118799A1 (en) 2004-04-15 2005-12-15 Ista Pharmaceuticals, Inc. Ovine hyaluronidase
KR20070057767A (ko) 2004-06-15 2007-06-07 앤드류 셴 천 인지질 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법
US7572613B2 (en) 2004-06-25 2009-08-11 Klein Jeffrey A Drug delivery system for accelerated subcutaneous absorption
JP3912395B2 (ja) 2004-07-12 2007-05-09 セイコーエプソン株式会社 半導体集積回路、検査装置および半導体集積回路の検査方法
US20060292682A1 (en) 2004-07-22 2006-12-28 Hawkins Lynda K Addition of transgenes into adenoviral vectors
US20060181032A1 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Riggs Robert A Hybrid gasket
WO2007047242A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Soll David B Ophthalmic surgical irrigating solutions containing hyaluronidase
WO2007059473A2 (en) 2005-11-12 2007-05-24 Introgen Therapeutics, Inc. Methods for the production and purification of adenoviral vectors
US7763582B2 (en) 2006-02-21 2010-07-27 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Localized insulin delivery for bone healing
WO2008024815A2 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Dimensions Imaging Method and system for providing tolerance to interference and obstructions of line of sight observation
CN102317374A (zh) 2007-06-05 2012-01-11 帝人株式会社 聚碳酸酯树脂组合物
RU2471867C2 (ru) * 2007-06-19 2013-01-10 Тамара П. Уваркина Гиалуронидаза и способ ее применения
JP4931230B2 (ja) 2007-06-22 2012-05-16 新菱冷熱工業株式会社 クリーンルームの空調方法及び空調装置
US8956412B2 (en) 2007-06-22 2015-02-17 Axiomed, LLC Artificial disc
US20080314349A1 (en) 2007-06-25 2008-12-25 Robert Bosch Gmbh Green start engine control systems and methods
WO2009001455A1 (ja) 2007-06-27 2008-12-31 Hitachi, Ltd. プラズマディスプレイ装置
ES2537340T3 (es) * 2008-03-06 2015-06-05 Halozyme, Inc. Producción a gran escala de hialuronidasa soluble
TWI395593B (zh) * 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
TWI532498B (zh) 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
KR20100135291A (ko) 2008-04-14 2010-12-24 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
WO2009128918A1 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
US8315366B2 (en) * 2008-07-22 2012-11-20 Shoretel, Inc. Speaker identification and representation for a phone
PT3037529T (pt) * 2008-12-09 2019-05-31 Halozyme Inc Polipéptidos ph20 estendidos solúveis e suas utilizações
CA2754461A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 and uses thereof
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
US20100305500A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
WO2011034604A2 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Baxter Healthcare, S.A. Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
MX348420B (es) 2010-07-20 2017-06-12 Halozyme Inc Efectos secundarios adversos asociados con la administracion de agentes anti-hialuronano y metodos para mejorar o prevenir los efectos secundarios.
KR20130096731A (ko) 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
EP2672958A1 (en) * 2011-02-08 2013-12-18 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US20130011378A1 (en) * 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
BR112013032265A2 (pt) * 2011-06-17 2016-12-20 Halozyme Inc métodos de infusão de insulina subcutânea contínua com uma enzima de degradação do hialuronano
JP6029674B2 (ja) 2011-10-18 2016-11-24 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 第ｖｉｉｉ因子のバイオアベイラビリティを改善するための、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼの組み合わせ使用
SG11201401797TA (en) * 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
LT3130347T (lt) 2011-12-30 2019-10-25 Halozyme Inc Ph20 polipeptido variantai, kompozicijos ir jų panaudojimas
JP6042527B2 (ja) 2012-04-04 2016-12-14 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
CN105727267B (zh) 2016-02-05 2020-05-26 苏州康聚生物科技有限公司 一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用
KR20210023798A (ko) 2018-07-25 2021-03-04 (주)알테오젠 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721348A (en) * 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
US5854046A (en) * 1996-07-03 1998-12-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US5958750A (en) * 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US6057110A (en) * 1996-07-03 2000-05-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHER G.N. et al. The dual functions of GPI anchored PH-20: hyaluronidase and intracellular signalling, Matrix Biol. December 2001, vol. 20, No. 8, pages 515-525 *
CHER G.N. et al. The PH-20 protein in cynomolgus macaque spermatozoa:identification of two different forms exhibiting hyaluronidase activity, Dev. Biol. 1996, vol. 175, No. 1, pages 142-153 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10556961B2 (en) 2014-02-28 2020-02-11 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US11713355B2 (en) 2014-02-28 2023-08-01 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10800851B2 (en) 2014-02-28 2020-10-13 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10604580B2 (en) 2014-09-09 2020-03-31 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10793630B2 (en) 2014-12-04 2020-10-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
US10766965B2 (en) 2015-05-20 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
US10668149B2 (en) 2015-06-22 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-CD38 antibodies and survivin inhibitors
US11021543B2 (en) 2015-06-24 2021-06-01 Janssen Biotech, Inc. Immune modulation and treatment of solid tumors with antibodies that specifically bind CD38
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11566079B2 (en) 2015-11-03 2023-01-31 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11708419B2 (en) 2015-11-03 2023-07-25 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11708420B2 (en) 2015-11-03 2023-07-25 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11732051B2 (en) 2015-11-03 2023-08-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
RU2651756C1 (ru) * 2017-05-10 2018-04-23 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего Образования Кубанский Государственный Медицинский Университет Министерства Здравоохранения Российской Федерации, КубГМУ Препарат для предотвращения образования глиальных рубцов
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma

Also Published As

Publication number Publication date
HK1086746A1 (en) 2006-09-29
EP1603541A2 (en) 2005-12-14
EP3009517A1 (en) 2016-04-20
EP2177620B1 (en) 2014-11-19
IL227867A0 (en) 2013-09-30
IL227867A (en) 2015-09-24
US9562223B2 (en) 2017-02-07
US20120251620A1 (en) 2012-10-04
US8431124B2 (en) 2013-04-30
EP2177620A1 (en) 2010-04-21
EA200501384A1 (ru) 2006-06-30
ES2335005T5 (es) 2013-04-17
US7767429B2 (en) 2010-08-03
HK1138883A1 (en) 2010-09-03
JP5538770B2 (ja) 2014-07-02
EP2311973A1 (en) 2011-04-20
ES2532399T3 (es) 2015-03-26
EP1603541B1 (en) 2009-11-11
AU2009245838A1 (en) 2010-01-07
SG2012041067A (en) 2014-08-28
SI1603541T2 (sl) 2013-04-30
DK1603541T3 (da) 2010-03-29
US10286044B2 (en) 2019-05-14
US11723959B2 (en) 2023-08-15
EP2405015B1 (en) 2016-01-06
NZ542873A (en) 2008-07-31
US9677061B2 (en) 2017-06-13
ES2526536T3 (es) 2015-01-13
KR20130135986A (ko) 2013-12-11
SI1603541T1 (sl) 2010-03-31
CN102943067B (zh) 2016-06-22
CY1116110T1 (el) 2017-02-08
US20130058893A1 (en) 2013-03-07
US20090214505A1 (en) 2009-08-27
AU2004218354A1 (en) 2004-09-16
CN1942588B (zh) 2013-06-12
PL2177620T3 (pl) 2015-05-29
US8431380B2 (en) 2013-04-30
EP1603541A4 (en) 2006-11-22
US20090181013A1 (en) 2009-07-16
BRPI0408116B1 (pt) 2022-09-20
DK2177620T3 (en) 2015-01-26
FR16C0030I1 (fr) 2016-08-26
EP2405015A3 (en) 2012-03-07
PL2405015T3 (pl) 2016-09-30
EP1603541B2 (en) 2013-01-23
US8765685B2 (en) 2014-07-01
KR101233457B1 (ko) 2013-02-15
HUE027661T2 (en) 2016-10-28
JP4464395B2 (ja) 2010-05-19
CY2016024I1 (el) 2017-06-28
US8450470B2 (en) 2013-05-28
SI2405015T1 (sl) 2016-04-29
PL1603541T5 (pl) 2013-06-28
KR20120094493A (ko) 2012-08-24
PT2163643E (pt) 2015-05-18
CY2016024I2 (el) 2017-06-28
US10898551B2 (en) 2021-01-26
SI2163643T1 (sl) 2015-03-31
SG177008A1 (en) 2012-01-30
EP2405015A2 (en) 2012-01-11
US20190224286A1 (en) 2019-07-25
PT2177620E (pt) 2015-02-16
ES2564103T3 (es) 2016-03-17
KR101363658B1 (ko) 2014-02-14
US20210023184A1 (en) 2021-01-28
PT1603541E (pt) 2010-02-19
DK2163643T3 (en) 2015-03-23
DE602004024041D1 (de) 2009-12-24
AU2004218354B2 (en) 2009-10-01
JP2010029190A (ja) 2010-02-12
AU2009245838B2 (en) 2013-05-09
US8772246B2 (en) 2014-07-08
CA2517145C (en) 2017-08-01
MXPA05009429A (es) 2005-12-12
CY2015033I1 (el) 2016-06-22
US20230321203A1 (en) 2023-10-12
HK1138885A1 (en) 2010-09-03
JP2013031446A (ja) 2013-02-14
IL170300A (en) 2016-06-30
US20110152359A1 (en) 2011-06-23
US20040268425A1 (en) 2004-12-30
US20090253175A1 (en) 2009-10-08
PL1603541T3 (pl) 2010-04-30
US20090181032A1 (en) 2009-07-16
EP2163643A1 (en) 2010-03-17
LU93138I2 (fr) 2016-09-05
CA2517145A1 (en) 2004-09-16
CN102943067A (zh) 2013-02-27
CY1109750T1 (el) 2014-09-10
WO2004078140A3 (en) 2005-11-17
DK2405015T3 (en) 2016-03-21
KR20110114692A (ko) 2011-10-19
CY2015033I2 (el) 2016-06-22
DK1603541T4 (da) 2013-04-15
ZA200507978B (en) 2007-03-28
EP2330213A1 (en) 2011-06-08
ES2335005T3 (es) 2010-03-18
CN1942588A (zh) 2007-04-04
HK1165834A1 (zh) 2012-10-12
WO2004078140A2 (en) 2004-09-16
LU92780I2 (fr) 2015-09-21
HUS1600031I1 (hu) 2016-08-29
KR20050118273A (ko) 2005-12-16
ATE448323T1 (de) 2009-11-15
US20120148555A1 (en) 2012-06-14
JP5756785B2 (ja) 2015-07-29
CY1117358T1 (el) 2017-04-26
US9677062B2 (en) 2017-06-13
US8202517B2 (en) 2012-06-19
BRPI0408116A (pt) 2006-03-01
PL2163643T3 (pl) 2015-06-30
EP2163643B1 (en) 2015-01-21
SI2177620T1 (sl) 2015-02-27
US20140199282A1 (en) 2014-07-17
US20170246264A1 (en) 2017-08-31
JP2006524507A (ja) 2006-11-02
CY1116370T1 (el) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009383B1 (ru) РАСТВОРИМЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ГИАЛУРОНИДАЗЫ (sHASEGP), СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ
EA011654B1 (ru) Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ
AU2013202475B2 (en) SOLUBLE HYALURONIDASE GLYCOPROTEIN (sHASEGP), PROCESS FOR PREPARING THE SAME, USES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEREOF