EA011654B1 - Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ - Google Patents

Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ Download PDF

Info

Publication number
EA011654B1
EA011654B1 EA200701791A EA200701791A EA011654B1 EA 011654 B1 EA011654 B1 EA 011654B1 EA 200701791 A EA200701791 A EA 200701791A EA 200701791 A EA200701791 A EA 200701791A EA 011654 B1 EA011654 B1 EA 011654B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
agent
hyaluronidase
agents
acids
vaccines
Prior art date
Application number
EA200701791A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701791A1 (ru
Inventor
Луис Х. Букбиндер
Анирбан Кунду
Грегори И. Фрост
Майкл Ф. Хэллер
Джилберт А. Келлер
Тайлер М. Дайлан
Original Assignee
Хелозайм Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36927767&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011654(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US11/065,716 external-priority patent/US7871607B2/en
Application filed by Хелозайм Терапьютикс, Инк. filed Critical Хелозайм Терапьютикс, Инк.
Publication of EA200701791A1 publication Critical patent/EA200701791A1/ru
Publication of EA011654B1 publication Critical patent/EA011654B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к открытию новых растворимых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы (sHASEGP), способам их получения и их применению для облегчения введения других молекул или для ослабления ассоциированных с гликозаминогликанами патологий. Описаны минимально активные полипептидные домены доменов растворимого нейтрально-активного sHASEGP, которые включают в себя связанные с аспарагином сахарные группы, необходимые для функционального нейтрально-активного домена гиалуронидазы. Описаны модифицированные аминоконцевые лидерные пептиды, которые усиливают секрецию sHASEGP. Кроме того, это изобретение включает в себя сиалированные и ПЭГилированные формы рекомбинантного sHASEGP для улучшения стабильности и сывороточной фармакокинетики в сравнении с природными, получаемыми из скотобойни ферментами. Описаны также подходящие готовые формы, по существу, очищенного рекомбинантного гликопротеина sHASEGP, полученного из эукариотической клетки, которая генерирует правильное гликозилирование, необходимое для его оптимальной активности.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данный патент является частичным продолжением заявки США с регистрационным номером 11/238171, поданной 27 сентября 2005 г., которая является частичным продолжением заявки США с регистрационным номером 11/065716, поданной 23 февраля 2005 г., каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме.
Уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение главным образом относится к гликозаминогликаназным ферментам, включающим в себя нейтрально-активные, растворимые гликопротеины гиалуронидазы (зНА8ЕСР) и их части, в частности, домены гиалуронидазы. Более конкретно, это изобретение относится к химическим модификациям, фармацевтическим композициям, экспрессионным плазмидам, способам получения и терапевтическим способам, использующим гликозамингликаназы (и их домены и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот) для терапевтической модификации гликозаминогликанов, в лечении заболевания и для применения для увеличения диффузии других молекул, например инъецируемых молекул, у животных.
Информация предыдущего уровня техники
Гликозаминогликаны (СЛС) являются сложными линейными полисахаридами внеклеточного матрикса (ЕСМ). СЛС характеризуются повторяющимися дисахаридными структурами Ν-замещенного гексозамина и уроновой кислоты (в случае гиалуронана (НА), хондроитинсульфата (С8), хондроитина (С), дерматансульфата (Ό8), гепарансульфата (Н8) и гепарина (Η)) или галактозы (в случае кератансульфата (К8)). За исключением НА, все существуют ковалентно связанными с сердцевинным белком (кором). САС с их сердцевинными белками структурно относятся к протеогликанам (РС).
Гиалуронан (НА) обнаруживается у млекопитающих преимущественно в соединительных тканях, коже, хряще и синовиальной жидкости. Гиалуронан является также основным компонентом стекловидного тела глаза. В соединительной ткани вода гидратации, ассоциированная с гиалуронаном, создает гидратированные матриксы между тканями. Гиалуронан играет ключевую роль в биологических явлениях, ассоциированных с подвижностью клеток, включающих в себя быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, заживление ран, ангиогенез и онкогенез (Тоо1е 1991 Се11 Бю1. Ех!гасе11. Ма!пх, Нау (еб.), Р1епит Ргезз, №\ν Уогк, 1384-1386; Вебгапб е! а1. 1992 1п!. 1. Сапсег 52:1-6; Кпибзоп е! а1., 1993 ЕА8ЕВ 1. 7:1233-1241). Кроме того, уровни гиалуронана коррелируют с агрессивностью опухоли (Охе11о е! а1. 1960 Сапсег Кез. 20:600-604; ТакеисЫ е! а1. 1976, Сапсег Вез. 36:21332139; К1та!а е! а1. 1983 Сапсег Вез. 43:1347-1354).
НА обнаружен во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в мягких соединительных тканях. НА приписывали различные физиологические функции, такие как гомеостаз воды и белка плазмы (Ьаигеп! Т.С. е! а1. (1992) ЕА8ЕВ 1 6:2397-2404). Продуцирование НА увеличивается в пролиферирующих клетках и может играть роль в митозе. Предполагается также его участие в передвижении и миграции клеток. НА, по-видимому, играет важную роль в регуляции, развитии и дифференцировке клеток (Ьаигеп! е! а1., выше).
НА использовали в клинической медицине. Его тканезащитные и реологические свойства оказались применимыми в офтальмической хирургии (например, для защиты роговичного эндотелия во время операции катаракты). Сывороточный НА является диагностическим для заболеваний печени и различных воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит. Интерстициальный отек, вызванный накоплением НА, может вызывать дисфункцию в различных органах (Еаитеп! е! а1. выше).
Взаимодействия гиалуронан-белок также участвуют в структуре внеклеточного матрикса или «основного (промежуточного) вещества».
Гиалуронидазы являются группой обычно нейтрально- или кислотно-активных ферментов, обнаруживаемых во всем царстве животных. Гиалуронидазы варьируются в отношении субстратной специфичности и механизма действия.
Существует три основных класса гиалуронидаз.
1. Гиалуронидазы типа ферментов млекопитающих (ЕС 3.2.1.35), которые являются эндо-бета-Νацетилгексозаминидазами с тетрасахаридами и гексасахаридами в качестве основных конечных продуктов. Они имеют и гидролитические, и трансгликозидазные активности и могут расщеплять гиалуронан и хондроитинсульфаты (С8), обычно С4-8 и С6-8.
2. Бактериальные гиалуронидазы (ЕС 4.2.99.1) расщепляют гиалуронан и, в различной степени, С8 и Ό8. Они являются эндо-бета-№ацетилгексозаминидазами, которые действуют посредством реакции бета-элиминирования, которая прежде всего дает дисахаридные конечные продукты.
3. Гиалуронидазы (ЕС 3.2.1.36) из пиявок, других паразитов и ракообразных являются эндо-бетаглюкуронидазами, которые генерируют тетрасахаридные и гексасахаридные конечные продукты посредством гидролиза бета-1-3-связи.
Гиалуронидазы млекопитающих могут быть дополнительно подразделены на две группы: нейтрально-активные и кислотно-активные. Существует шесть гиалуронидаза-подобных генов в геноме человека, НУАЬ1, НУАЬ2, НУАЬ3, НУАЬ4, НУАЬР1 и РН20/8РАМ. НУАЬР является псевдогеном, и не было показано, что НУАЕ3 обладал активностью в отношении каких-либо известных субстратов.
- 1 011654
ΗΥΑΕ4 является хондроитиназой и проявляет небольшую активность в отношении гиалуронана. ΗΥΑΕ4 является прототипом кислотно-активного фермента, а РН20 является прототипом нейтрально-активного фермента. Кислотно-активные гиалуронидазы, такие как ΗΥΑΕΙ и ΗΥΑΕ2, обычно не имеют каталитической активности при нейтральном ρΗ (т.е. ρΗ 7). Например, ΗΥΑΕ1 имеет небольшую каталитическую активность ίη νίΐτο при ρΗ, более высоком чем 4,5 (Ρτοδΐ с1 а1. Апа1 ВюсйешЫту, 1997). ΗΥΆΕ2 является кислотно-активным ферментом с очень низкой удельной активностью ίη νίΐτο.
Гиалуронидаза-подобные ферменты могут быть также охарактеризованы как ферменты, которые обычно присоединены к плазматической мембране через гликозилфосфатидилинозитольный якорь, такие как ΗΥΆΕ2 человека и РН20 человека (Όαηί11<ονίΐθι-Μίαβ1<ονα еΐ а1. Ргос Ναΐ1 Асаб 8с1 И8А 2003 Апрель 15; 100(8):4580-5, Рйе1р8 еΐ а1., 8аепсе 1988), и ферменты, которые являются обычно растворимыми, такие как ΗΥΆΕ1 человека (Ρτοκΐ еΐ а1., Вюсйеш Вюрйук Кек Сοттиη. 1997 Июль 9; 236(1):10-5). Однако имеются вариации от вида к виду: например, бычий фермент РН20 очень свободно присоединен к плазматической мембране и не закреплен посредством чувствительного к фосфолипазе якоря (Еа1апсебе еΐ а1., Βίο1 Кергоб. 2001 август; 65(2):628-36). Этот уникальный признак бычьей гиалуронидазы сделал возможным использование этого растворимого фермента гиалуронидазы бычьих яичек в виде экстракта для клинического применения (\У|баке™, Ыуа1а8е™). Другими разновидностями РН20 являются липидные заякоренные ферменты, которые являются обычно нерастворимыми без использования детергентов или липаз. Например, РН20 человека прикреплен к плазматической мембране через ΟΡΙ-якорь. Попытки получения ДНК-конструкций РН20 человека, которые не вводили липидный якорь в этот полипептид, приводили либо к каталитически неактивному ферменту, либо к нерастворимому ферменту (Аттшд еΐ а1. Еиг 1 Вюсйет. 1997 Август 1; 247 (3):810-4). Природная гиалуронидаза спермы макаки обнаружена как в растворимой форме, так и в мембраносвязанной форме. Хотя мембраносвязанная форма 64 кДа обладает ферментативной активностью при ρΗ 7,0, форма 54 кДа активна только при ρΗ 4,0 (СНегг еΐ а1., Эеу Вю1. 1996 А]эг 10; 175 (1): 142-53). Таким образом, растворимые формы РН20 часто не имеют ферментативной активности при нейтральных условиях.
Хондроитиназы являются ферментами, обнаруживаемыми во всем царстве животных. Эти ферменты расщепляют гликозаминогликаны посредством эндогликозидазной реакции. Конкретные примеры известных хондроитиназ включают хондроитиназу АВС (полученную из Ρ^οΐеиκ мбдапк; опубликованная заявка на патент Японии № 6-153947, Т. Υатадаΐа, Η. 8αίΐο, О. ИзЬисЫ, апб 8. 8ιιζιι1<ί. 1. Вю1. СНет., 243, 1523 (1968), 8. 8ίζι.ι1<ί, Η. 8αίΐο, Т. Υатадаΐа, К. Ашю, N. 8еш, Υ. 1<а\\'ак апб Т. РитийакЫ, 1. Вю1. СНет., 243, 1543 (1968)); Хондроитиназу АС (полученную из Ρ1аνοЬасΐе^^ит Ικραιϊηιιιη; N. Υатадаΐа, Η. 8αίΐο, О. ΗαΕ^Ηί, анб 8. 8игик1, 1. Вю1. СНет., 243, 1523 (1968)); Хондроитиназу АС11 (полученную из АцНгоЬаЩег ангексеак; К. Шуата, анб 8. Окаба, 1. Вю1. СНет., 250, 1824 (1975), К. И|уата анб 8. Окаба, 1. Вюсйет. (Тοкуο), 80, 1201 (1976)); Гиалуронидазу АСШ (полученную из Ρ1аνοЬасΐе^^ит κρ. Ηρ102; ΗίτοΓιιιηί Μί.ναζοηο, ΗίΓοκΠί К1кисЫ, КепсЫ Υοκί^α, Ι<ί\Όκ1ιί ΜοπίΜπνα, аиб К^уοсН^ка ^киуа^, 8е1кадаки, 61, 1023 (1989)); Хондроитиназу В (полученную из Ρ1аνοЬасΐе^^ит ^ραπι-ιι.!!!!; Υ.Μ. МюНе1асс1 ааб С.Р. П1ейгсН, Вюсйет. В^зНук. Кек. ^!!ηη., 56, 973 (1974), Υ.Μ. Мюйе1асс1 ааб С.Р. П1еШсй, Вюсйет. 1., 151, 121 (1975), КешсЫ Маеуата, Акпа Тараба, АкПю Ием, ааб КепсЫ ΥοκЫба, 8е1кадаки, 57, 1189 (1985)); Хондроитиназу С (полученную из Ρ1аνοЬасΐе^^ит 8ρ. Ηρ102; ΗίΐΌΓιιιηί Μί.ναζοηο, ШгокЫ К1кисЫ, КепсЫ ΥοκЫба, К^уοκЫ ΜοπίΜηνα, и Ι<ί\Όθιί1<α ^к^аки, 8е1кадаки, 61, 1023 (1989)) и т.п.
Гликопротеины состоят из полипептидной цепи, ковалентно связанной с одной или несколькими углеводными группами. Существуют две обширных категории гликопротеинов, которые имеют углеводы, связанные через Ν-гликозидные или О-гликозидные связи с их компонентом-белком. Эти Ν- и Освязанные гликаны присоединены к полипептидам через аспарагин-№ацетил-Э-глюкозамин и серин(треонин)-№ацетил-О-галактозамин в качестве связей, соответственно. Сложные Ν-связанные олигосахариды не содержат концевых маннозных остатков. Они содержат только концевые Νацетилглюкозаминовые, галактозные остатки и/или остатки сиаловой кислоты. Гибридные олигосахариды содержат концевые маннозные остатки также как и Ν-ацетилглюкозаминовые, галактозные остатки и/или остатки сиаловой кислоты.
В случае Ν-связанных гликопротеинов, олигосахаридный предшественник присоединяется к аминогруппе аспарагина во время пептидного синтеза в эндоплазматическом ретикулуме (эндоплазматической сети). Затем эта олигосахаридная часть молекулы последовательно процессируется рядом специфических ферментов, которые делетируют и добавляют сахарные части. Этот процессинг происходит в эндоплазматическом ретикулуме и продолжается с прохождением через цис-, медиальный и транс-аппарат Гольджи.
Сущность изобретения
Здесь обеспечены растворимые гликозаминогликаназные ферменты, в частности, члены семейства растворимых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы (также называемых здесь &ИА8ЕОР), причем предпочтительными членами являются растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы человека, в частности, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека (также называемые здесь γΗι^ΗΣΙ)). Каждая из растворимых нейтрально активных гиалуронидаз, обеспеченная здесь, является членом семейства &ИА8ЕОР, обозначаемым здесь как &ИА8ЕОР. Обеспечены также рас
- 2 011654 творимый домен гиалуронидазы и его применения. Хотя ряд применений и приложений растворимых гликозаминогликаназ (иногда называемых ферментами ОАО) проиллюстрированы здесь с использованием гНиРН20 в качестве примера гликозаминогликаназы (например, в стимуляции доставки фармакологических веществ и других агентов в тканях тела млекопитающего), специалистам в данной области будет понятно, что и другие гликозаминогликаназы, такие как описанные здесь, или другие, известные в данной области, могут применяться в ряде таких приложений. Предпочтительные в настоящее время растворимые гликозаминогликаназы, такие как &НА8ЕОР, проявляют некоторую гиалуронидазную активность и могут также проявлять другие гликозаминогликаназные активности. Растворимые гликозаминогликаназы человека являются в настоящее время предпочтительными для приложений, в которых этот фермент должен быть применен в теле человека, в том числе во многих медицинских приложениях, описанных и проиллюстрированных здесь.
Один аспект этого изобретения основан на открытии того, что растворимая нейтрально-активная гиалуронидазная активность может быть продуцирована с высоким выходом в экспрессионной системе млекопитающего введением нуклеиновых кислот, которые лишены узкого района, кодирующего аминокислоты в карбоксиконце кДНК РН20 человека. Обеспечены также дополнительные модификации 8НА18ЕОР для усиления секреции с использованием неприродных лидерных пептидов. Кроме того, обеспечены способы для модификации &НА8ЕОР для пролонгирования полупериода существования этого фермента посредством маскирования этого белка полиэтиленгликолем (ПЭГ) и/или посттрансляционными модификациями природного гликозилирования. Предшествующие попытки генерирования растворимых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы человека не принесли успеха. Был сделан вывод, что укорочения полипептида гиалуронидазы человека приводили как к потере нейтральной ферментативной активности, так и к неспособности клеток секретировать этот рекомбинантный белок в системах экспрессии млекопитающих (Агтшд, с( а1. Еиг 1 Вюейеш 1997 Аид 1; 247 (3):810-4). Крайне важным является генерирование нейтрально-действующего (действующего при нейтральном рН) секретируемого &НА8ЕОР для коммерческого производства и терапевтического использования в качестве гиалуронидазы. Описанное здесь изобретение решает эти и другие задачи.
Кроме того, это изобретение относится к каталитически активному гликопротеину &НА8ЕОР человека, причем этот &НА8ЕОР имеет по меньшей мере одну Ν-связанную сахарную часть. Приведенные здесь исследования демонстрируют, что РН20 человека требует Ν-связанных гликанов для каталитической активности, в то время как гиалуронидазы быка и пчелиного яда остаются активными без таких Νсвязанных гликанов. Домен гиалуронидазы РН20 человека, лишенный Ν-связанных частей, является каталитически неактивным. Таким образом, классическая технология рекомбинантных ДНК не позволяет получать каталитически активный &НА8ЕОР человека, в отличие от гиалуронидазы пчелиного яда, которая может продуцироваться в Е. сой.
Это изобретение включает способы и клетки для генерирования Ν-связанного полипептида гликопротеина &НА8ЕОР с использованием клетки, способной вводить Ν-связанные сахарные части, или введением указанных Ν-связанных частей на полипептид &НА8ЕОР. Кроме того, описаны способы идентификации правильно гликозилированных &НА8ЕОР.
Обеспечены также каталитически активные ПЭГилированные и/или сверхсиалированные гликопротеины &НА8ЕОР. ПЭГилированные и/или сверхсиалированные &НА8ЕОР имеют более высокие полупериоды существования в сыворотке в сравнении с природными несиалированными 5НА8ЕОР бычьих и овечьих яичек, и являются, следовательно, предпочтительными в отношении как ферментативной стабильности, так и применения в качестве лекарственных средств или адъювантов в обстоятельствах, в которых желательными являются пролонгированные полупериоды существования (например, как это обычно имеет место в случае внутривенной доставки). Это изобретение обеспечивает способы получения ПЭГилированных и/или сверхсиалированных &НА8ЕОР, их композиции и применения. Без ограничения конкретными приложением или механизмом действия, обычно предполагается, что присоединение ПЭГчастей к &НА8ЕОР и другим гликозаминогликаназам может быть использовано для эффективной защиты этих молекул, уменьшения их относительной чувствительности к протеазам и потенциально также уменьшения степени и скорости их клиренса и элиминирования из тела. Применение этих принципов и способов к другим гликозаминогликаназам, ПЭГилированным, сверхсиалированным и/или другим образом модифицированным версиям таких других гликозаминогликаназ может быть получено таким же образом и использовано в контексте описанных и проиллюстрированных здесь методов и способов (например, способов усиления диспергирования (распределения) фармакологических веществ и других агентов в тканях тела).
Обеспечены также белки, кодируемые сплайсинговыми вариантами, природно дефектными в отношении ОР1-якоря 5НА8ЕОР.
Кроме того, обеспечены композиции &НА8ЕОР, содержащие растворимый гликопротеин &НА8ЕОР с ионом металла, где ионом металла являются кальций, магний или натрий. Обычно 5НА8ЕОР являются оптимально активными в присутствии указанных металлов. Обеспечены также препараты, состоящие из 5НА8ЕОР в присутствии указанных ионов металлов.
Обеспечены модификации &НА8ЕОР и других гликозаминогликаназ для дополнительного пролон
- 3 011654 гирования их полупериодов существования. Обеспечены химические модификации &НЛЗЕОР и других гликозаминогликаназ с полимерами, такими как полиэтиленгликоль и декстран. Такие модификации защищают (экранируют) &НЛЗЕОР и другие гликозаминогликаназы от удаления из кровотока и иммунной системы, а также от рецепторов гликозилирования для маннозы и асиалогликопротеина. Кроме того, обеспечены способы связывания со специфическими функциональными группами, такими как сайты гликозилирования, положительно заряженные аминокислоты и цистеины.
Здесь обеспечены также анализы для идентификации эффекторов, таких как соединения, в том числе малые молекулы, и условий, например, рН, температуры и ионной силы, которые модулируют активацию, экспрессию или активность &НЛЗЕОР. В примерах анализов оцениваются эффекты тестируемых соединений на способность домена гиалуронидазы &НЛЗЕОР расщеплять известный субстрат, обычно гликозаминогликан или протеогликан. Агенты, обычно соединения, в частности, малые молекулы, которые модулируют активность домена гиалуронидазы, являются кандидатными соединениями для модуляции активности &НЛЗЕОР. Домены гиалуронидазы могут быть также использованы для получения гиалуронидаза-специфических антител с нарушающей функцию активностью. Обеспеченные здесь домены гиалуронидазы включают в себя, но не ограничиваются ими, Ν-концевой гликозилгидролазный домен с С-концевыми укороченными частями этого домена, который проявляет каталитическую активность ίη νίίτο.
Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки и домены гиалуронидазы. Обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют растворимый домен гиалуронидазы или его каталитически активные части, а также молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полноразмерный &НЛЗЕОР. Нуклеиновая кислота, кодирующая примерный домен гиалуронидазы и расположенную далее по ходу транскрипции нуклеиновую кислоту, представлена в ЗЕО ΙΌ N0:6; а домен гиалуронидазы примерного кНЛЗЕОР представлен в ЗЕО ΙΌ N0:1 (аминокислоты 35-464). Последовательность белка и кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты примерного полноразмерного &НЛЗЕОР представлены в ЗЕО ΙΌ N0:1 и 6.
Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с такой нуклеиновой кислотой &НЛЗЕОР вдоль их полной длины или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% полной длины и кодируют домен гиалуронидазы или его часть. Гибридизацию обычно выполняют в условиях, по меньшей мере, низкой, обычно, по меньшей мере, умеренной и часто высокой жесткости.
Выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты является ДНК, включающая в себя геномную ДНК или кДНК либо РНК, или он может включать в себя другие компоненты, такие как протеиннуклеиновая кислота или другие нуклеотидные аналоги. Эта выделенная нуклеиновая кислота может включать в себя дополнительные компоненты, такие как гетерологичные или природные промоторы, энхансеры и другие регуляторные последовательности транскрипции и трансляции, эти гены могут быть связаны с другими генами, такими как репортерные гены или другие индикаторные гены или гены, которые кодируют индикаторы.
Обеспечена также выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает в себя последовательность молекул, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей кНЛЗЕОР или его часть.
Обеспечены также ее фрагменты или олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в качестве зондов или праймеров и которые содержат по меньшей мере приблизительно 10-16 нуклеотидов, обычно по меньшей мере 20 нуклеотидов и обычно менее чем 1000, обычно менее чем приблизительно 100 нуклеотидов, представленных в ЗЕО ΙΌ N0:6 (или ее комплементе); или содержат по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов (или их комплемент) или содержат олигонуклеотиды, которые гибридизуются вдоль их цепи (или по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% цепи) с любыми такими фрагментами или олигонуклеотидами. Длина этих фрагментов зависит от функции, для которой их используют, и/или от сложности представляющего интерес генома. Обычно зонды и праймеры содержат меньше чем приблизительно 50, 150 или 500 нуклеотидов.
Обеспечены также плазмиды, содержащие любую из молекул нуклеиновых кислот, обеспеченных здесь. Обеспечены также клетки, содержащие эти плазмиды. Такие клетки включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных.
Обеспечены также усиленные экспрессионные системы млекопитающих, использующие сигнальные лидеры, способные к эффективной секреции &НЛЗЕОР. Пример аминокислотной последовательности такого эффективного секреторного лидерного пептида и слитого белка с &НЛЗЕОР можно найти в ЗЕО ΙΌ N0:43 и 46.
Обеспечен также способ получения &НЛЗЕОР выращиванием вышеуказанных клеток в условиях, посредством которых &НЛЗЕОР экспрессируется этими клетками, и выделение экспрессированного полипептида или гликопротеина &НЛЗЕОР. Способы выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей другие кНЛЗЕОР, также обеспечены.
Обеспечены также клетки, обычно эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих или дрожжевые клетки, в которых полипептид &НЛЗЕОР экспрессируется на поверхности этих клеток. Такие
- 4 011654 клетки могут быть использованы в анализах скрининга лекарственных средств для идентификации соединений, которые модулируют активность полипептида, κΗΑδΕΟΡ. Эти анализы включают в себя анализы связывания ίη νίίτο и анализы на основе транскрипции, в которых оценивается трансдукция сигнала, опосредованная прямо или косвенно, например, посредством активации профакторов роста, полипептидом κΗΑδΕΟΡ.
Обеспечены также пептиды, кодируемые такими молекулами нуклеиновых кислот. Среди этих полипептидов включены домен гиалуронидазы или полипептид κΗΑδΕΟΡ с аминокислотными заменами, которые по существу не изменяют специфичность и/или активность гиалуронидазы. В частности, обеспечен по существу очищенный гликопротеин κΗΑδΕΟΡ, который содержит секретируемый нейтральноактивный фермент.
Данное изобретение относится также к каталитическому домену гиалуронидазы и может дополнительно включать другие домены. κΗΑδΕΟΡ может образовывать гомодимеры и может также образовывать гетеродимеры с некоторым другим белком, таким как мембраносвязанный белок. Обеспечен также по существу очищенный гликопротеин, включающий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности относительно примерного κΗΑδΕΟΡ, где процентную идентичность определяют с использованием стандартных алгоритмов и штрафов за пропуск, которые максимизируют процентную идентичность.
Здесь рассматриваются также сплайсинговые варианты κΗΑδΕΟΡ, в частности, сплайсинговые варианты с каталитически активными доменами гиалуронидазы.
В других вариантах осуществления обеспечены по существу очищенные полипептиды, которые включают в себя домен гиалуронидазы полипептида κΗΑδΕΟΡ или его каталитически активную часть, но не включают в себя полную последовательность аминокислот, представленную в 8ΕΟ ГО N0:1. Среди этих полипептидов находятся полипептиды, которые включают в себя последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичность с 8ΕΟ ГО N0:1 или 3.
В конкретном варианте осуществления обеспечена нуклеиновая кислота, которая кодирует эукариотический гликопротеин гиалуронидазы, названный эукариотическим κΗΑδΕΟΡ. В частности, эта нуклеиновая кислота включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную в 8Ε0 ГО N0:6, в частности представленную в виде нуклеотидов 106-1446 8Ε0 ГО N0:6, или ее часть, которая кодирует каталитически активный полипептид.
Обеспечены также молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях, по меньшей мере, низкой жесткости, обычно умеренной жесткости, более часто высокой жесткости с 8Ε0 ГО N0:6 или ее вырожденными последовательностями.
В одном варианте осуществления выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0:6 (или ее вырожденные последовательности) в условиях высокой жесткости. Полноразмерный κΗΑδΕΟΡ представлен в 8Ε0 ГО N0:1 и кодируется последовательностью 8Ε0 ГО N0:6 или ее вырожденными последовательностями.
Обеспечены также мутеины домена гиалуронидазы κΗΑδΕΟΡ, в частности, мутеины, в которых один или несколько остатков Сук в домене гиалуронидазы, которые являются свободными (т.е. не образуют дисульфидных связей с любым другим остатком Сук в домене гиалуронидазы), заменены другой аминокислотой, обычно (хотя и необязательно), консервативной аминокислотной заменой или заменой, которая не элиминирует активность, и мутеины, в которых элиминирован специфический сайт гликозилирования.
Здесь обеспечены полипептиды κΗΆδΕΟΡ, в том числе, но не только, их сплайсинговые варианты, и нуклеиновые кислоты, кодирующие κΗΆδΕΟΡ, и их домены, производные и аналоги. Обеспечены также одноцепочечные секретируемые гликопротеины гиалуронидазы, которые имеют №конец, функционально эквивалентный №концу, генерируемому активацией сигнальной пептидазы с образованием κΗΑ8Ε0Ρ. Имеются семь потенциальных сайтов ^связанного гликозилирования в N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 κΗΑδΕΟΡ ΡΗ20 человека, приведенного в качестве примера в 8Ε0 ГО N0:1. Дисульфидные связи образуются между остатками Сук С60-С351 и остатками Сук С224-С238 с образованием сердцевинного домена гиалуронидазы. Однако требуются дополнительные цистеины на карбоксиконце для каталитической активности нейтрального фермента, так что домен κΗΑδΕΟΡ от аминокислоты 36 до Сук 464 в 8Ε0 ГО N0:1 содержит минимально активный домен гиалуронидазы κΗΑδΕΟΡ ΡΗ20 человека. Таким образом, ^связанный сайт гликозилирования N-490 не требуется для правильной активности κΗΑδΕΟΡ. Как будет понятно специалистам в данной области, минорные изменения могут быть произведены в отношении таких композиций, которые описаны и проиллюстрированы здесь, без существенного элиминирования или в некоторых случаях без существенного уменьшения (или потенциально даже с улучшением) их полезной активности, и, следовательно, они могут быть сходным образом использованы в различных описанных здесь приложениях.
№связанное гликозилирование некоторых κΗΑδΕΟΡ (таких как κΗΑδΕΟΡ, содержащий аминокислотную последовательность 8Ε0 ГО N0:1), может быть очень важным для их каталитической активности
- 5 011654 и стабильности. Хотя изменение типа гликана, модифицирующего гликопротеин, может в значительной степени влиять на антигенность, структурную укладку, растворимость и стабильность белка, считается, что большинство ферментов не требуют гликозилирования для оптимальной активности фермента. Таким образом, кНАЗЕОР являются уникальными в этом отношении, в связи с тем, что удаление Νсвязанного гликозилирования может приводить к почти полной инактивации гиалуронидазной активности. Для таких кНАЗЕОР присутствие Ν-связанных гликанов является решающим в отношении генерирования активного фермента. В изобретение включены системы экспрессии белков, пригодные для введения необходимых Ν-связанных остатков гликозилирования на кНАЗЕОР. Кроме того, в данное изобретение включено введение дегликозилированного полипептида кНАЗЕОР в присутствии экстрактов, способных к введению Ν-связанных гликанов. В одном аспекте этого изобретения описано комплексное гликозилирование, кэппированное (заканчивающееся) сиалированием, в то время как обсуждаются также другие, кэппированные свободными остатками маннозы. Предпочтительно, остатки сиаловой кислоты обнаруживаются в концевых остатках Ν-связанного гликозилирования на кНАЗЕОР.
Ν-связанные олигосахариды подразделяются на несколько основных групп (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфатированные), все из которых имеют (Мап) 3-О1сNАс-О1сNАс-кора, присоединенные через амидный азот к остаткам Акп, которые находятся в последовательностях -Акп-ХааТ1г/Зег (где Хаа не является Рго). Гликозилирование в сайте -Акп-Хаа-Сук сообщалось для белка С коагуляции. Ν-связанные сайты часто непосредственно связывают с появлением «холостого» цикла во время секвенирования. Положительная идентификация может быть выполнена после высвобождения этого олигосахарида ферментом РХОаке Р, который превращает гликозилированный Акп в Акр. После высвобождения ферментом РС№вой Р Ν-связанный олигосахарид может быть очищен, например, с использованием Вю-Ое1 Р-6-хроматографии, причем олигосахаридный пул подвергают препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (НРАЕС) (То\тпкепб е1 а1., (1989) Апа1. ВюсНет. 182, 1-8). Некоторые олигосахаридные изомеры могут быть разделены с использованием НРАЕС. Остатки фукозы будут смещать положения элюции в более ранние положения на хроматограмме НРАЕС, тогда как дополнительные остатки сиаловой кислоты будут увеличивать время удерживания. Одновременная обработка гликопротеинов, олигосахаридные структуры которых являются известными (например, бычьего фетуина, кислотного гликопротеина а-1, овальбумина, РНКазы В, трансферрина), могут облегчать отнесение олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды могут быть охарактеризованы комбинацией анализов состава и метилирующих связей (ХУаедйе е1 а1., (1983) СатЬойубт Век. 123, 281-304) с аномерными конфигурациями, приписываемыми ЯМР-спектроскопией (Уап На1Ьеек (1993) ш Ме11юбк Епхуто1 230).
В случае некоторых кНАЗЕОР, примером которых является кНАЗЕОР человека гНиРН20, описанный здесь, кНАЗЕОР может содержать как Ν-гликозидные, так и О-гликозидные связи. Например, было обнаружено, что гНиРН20 (продуцируемый в линии 3Ό3 СНО ЭО44, как описано в примерах ниже) имеет О-связанные олигосахариды, а также Ν-связанные олигосахариды. Гликозидные модификации таких кНАЗЕОР (например, модификации, содержащие одно или несколько добавлений, удалений или изменений таких Ν-связанных и/или О-связанных олигосахаридов) могут быть использованы для генерирования гликозидных вариантных кНАЗЕОР, проявляющих измененные фармакокинетические и/или фармакодинамические профили, которые делают их желаемыми для конкретных приложений. В качестве иллюстрации, но без ограничения конкретным механизмом действия, удалением или изменением (например, посредством кэппирования или деэкспонирования другим образом), один или несколько Νсвязанных и/или О-связанных олигосахаридов, которые участвуют в связывании с клеточными или другими рецепторами, могут быть использованы для изменения степени и/или скорости, с которыми кНАЗЕОР связывается или поглощается конкретной тканью, что, в свою очередь, может быть использовано, например, для изменения его фармакокинетического профиля (например, увеличением его полупериода существования в сыворотке или другим изменением его биоабсорбции).
Обеспечены также готовые формы кНАЗЕОР. кНАЗЕОР может быть приготовлен, например, в лиофилизированных формах и стабилизированных растворах. Готовые формы, содержащие специфические ионы металлов, таких как кальций, магний или натрий, применимы для оптимальной активности при нейтральном рН. Наряду с формами стабилизированных растворов, формы замедленного высвобождения рассматриваются здесь для пролонгированного удаления гликозаминогликанов или пролонгированного стимулирования распределения или диффузии таких агентов, как фармакологические вещества. Здесь обеспечены также наборы, обеспечивающие предварительно упакованные шприцы кНАЗЕОР для введения малых объемов кНАЗЕОР для внутриглазных хирургических процедур и других использующих малые объемы процедур. Обеспечены также сбалансированные солевые формы для использования ех У1уо в процедурах искусственных репродуктивных технологий.
Обеспечены также способы применения гликозаминогликаназ, в том числе кНАЗЕОР, в удалении гликозаминогликанов. Гликозаминогликаназы, включающие в себя кНАЗЕОР, открывают каналы в интерстициальном пространстве посредством расщепления гликозаминогликанов, которые обычно делают возможной диффузию молекул с размером, меньшим чем приблизительно 500 нм. Эти каналы могут оставаться открытыми в течение периода 24-48 ч в зависимости от дозы и формы композиции. Такие каналы могут быть использованы для облегчения диффузии экзогенно введенных молекул, таких как жидко
- 6 011654 сти, малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты и векторы генотерапии и другие молекулы с размером, меньшим чем приблизительно 500 нм. Кроме того, без ограничения конкретной теорией или механизмом действия, авторы считают, что образование таких каналов может облегчать протекание общей жидкости в интерстициальном пространстве, что может, в свою очередь, стимулировать диспергирование или передвижение растворенного вещества (такого как детектируемая молекула или другой диагностический агент, анестезирующий или другой модифицирующий ткань агент, фармакологический или фармацевтически активный агент или косметический или другой эстетический агент), который эффективно переносится этой жидкостью в процессе, называемом иногда здесь «конвективным транспортом» или просто конвекцией. Такой конвективный транспорт может существенно повышать скорость и кумулятивные эффекты молекулярной диффузии и, следовательно, может заставлять терапевтическую или другую введенную молекулу более быстро и эффективно перфузировать ткань. Кроме того, когда такую молекулу, как терапевтический или другой агент (например, лекарственное средство с малой молекулой или более крупную молекулу или комплекс) готовят вместе или вводят вместе с 8ΗΆ8ΕΟΡ (или другой гликозаминогликаназой) и обе инъецируют в относительно ограниченный локальный сайт, такой как сайт невнутривенного парентерального введения (например, интрадермального, подкожного, внутримышечного введения, или во внутренние ткани, органы или другие относительно ограниченные пространства в теле или вблизи от них), то жидкость, связанная с вводимой дозой, может обеспечивать как локальную движущую силу (т.е. гидростатическое давление), так и более низкое полное сопротивление (импеданс) потоку (посредством открывания каналов в интерстициальном матриксе), - оба из которых имеют тенденцию увеличения потока жидкости, а вместе с ней и конвективного транспорта терапевтического агента или другой молекулы, содержащейся в этой жидкости. Как обсуждалось и иллюстрировалось более подробно здесь, и как будет понятно специалистам в данной области, эти аспекты использования 8ΗΆ8ΕΟΡ и других гликозаминогликаназ могут иметь существенную применимость для улучшения биодоступности, а также манипулирования другими фармакокинетическими и/или фармакодинамическими характеристиками совместно приготовленных или совместно вводимых агентов.
8ΗΆ8ΕΟΡ и другие гликозаминогликаназы могут быть также использованы для удаления избыточных гликозаминогликанов, таких как избыточные гликозаминогликаны, которые имеют место после ишемической реперфузии, при воспалении, артериосклерозе, эдеме, раке, повреждении спинного мозга и других формах образования рубцов. В некоторых случаях, 8ΗΆ8ΕΟΡ и другие гликозаминогликаназы могут доставляться системно внутривенной инфузией. Это может быть полезным, когда локальный доступ не является легко доступным, например, в случае сердца или головного мозга или в случае диссеминированной неоплазмы, при которой заболевание рассеяно по всему телу. Для таких внутривенных или других внутрисосудистых приложений часто являются предпочтительными сверхсиалированные 8ΗΑ8ΕΟΡ для увеличения полупериода существования в сыворотке и распределения, превосходящего нативные гиалуронидазные ферменты, которые не имеют концевых сиаловых кислот.
В некоторых обстоятельствах, таких как повреждение спинного мозга и другие нарушения нервной системы, глаукома и некоторые другие нарушения глаза, а также аутоиммунные, воспалительные состояния, раковые заболевания и другие хронически прогрессирующие заболевания и состояния, и косметические лечения, предпочтительной является пролонгированная доставка. Как будет понятно специалистам в данной области, ряд различных композиций и способов были разработаны для обеспечения готовых форм замедленного высвобождения или поддерживаемого высвобождения или депо представляющих интерес молекул.
В случае других показаний предпочтительной является единственная действующая в течение короткого времени доза. Временное удаление гликозаминогликанов может быть использовано для усиления доставки растворов и лекарственных средств в и/или через интерстициальные пространства. Это может быть полезным для диффузии анестезии и для введения терапевтических жидкостей, молекул и белков. Подкожное, внутрикожное и внутримышечное введение молекул в присутствии 8ΗΑ8ΕΟΡ (и/или других гликозаминогликаназ) также способствует их более быстрому системному распределению. Такие способы являются очень полезными, когда внутривенный доступ является недоступным или когда требуется более быстрая системная доставка молекул. В качестве иллюстрации, другие большие молекулы, такие как фактор VIII, которые являются трудно биодоступными после подкожного введения, могут инъецироваться с 5ΗΆ8ΕΟΡ для увеличения их доступности.
Обеспечены также применения 5ΗΆ8ΕΟΡ для ферментативного удаления матрикса Сити1и8 оорйоШ5 8. ргойдешв, окружающего ооциты. Удаление матрикса кумулуса с использованием очищенного 5ΗΛ8ΕΟΡ без токсичных примесей полученного из экстракта гиалуронидазы делает возможным более мягкое извлечение ооцита с более высокой жизнеспособностью. Кроме того, 8ΗΆ8ΕΟΡ могут быть приготовлены без использования экстрактов крупного рогатого скота или других организмов, которые несут вирусы и другие патогены, такие как вирусы трансмиссивных губчатых энцефалопатий.
Инъекции малых объемов 8ΗΆ8ΕΟΡ для внутриглазного применения могут быть также использованы для малых пространств. Например, 8ΗΆ8ΕΟΡ и/или другие гликозаминогликаназы могут быть инъецированы в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, которые вводят во время хирургии. Внутриглазная инъекция 8ΗΆ8ΕΟΡ может быть также использована для уменьшения
- 7 011654 внутриглазного давления в случае глаукомы, для растворения агрегатов стекловидного тела, или «мушек летающих», для очистки кровоизлияния стекловидного тела, для лечения макулярной дегенерации, для стимуляции витреоретинального отслоения в диабетической ретинопатии и для смешивания с другими ферментами для стимуляции придания новой формы роговице вместе с корректирующими линзами. Как описано здесь, &НЛБЕСР и/или другие гликозаминогликаназы могут быть также инъецированы в глаз или в окружающие периорбитальные пространства в форме «распространяющего агента», т.е. для стимуляции доставки диагностических, анестезирующих или фармакологических агентов к сайтам в тканимишени и/или около ткани-мишени. Например, инъекция &НЛБЕСР, одновременно или в близких временных точках с инъекцией диагностических, анестезирующих или фармакологических агентов в субтеноново или эписклеральное пространство может быть использована для усиления транссклеральной доставки фармакологического агента во внутренние части глаза (такие как хороид, сетчатка и стекловидное тело). Эписклеральное пространство является содержащим лимфу пространством между Ба§С1а Ви1Ы (капсулой Тенона) и склерой, которая является относительно плотной защитной тканью, окружающей хороид и сетчатку и внутреннее пространство глаза. Суб-теноново или эписклеральное пространство, которое иногда называют перисклеральным содержащим лимфу пространством, является обычно также непрерывным с субдуральной и субарахноидальной полостями и пересекается полосами соединительной ткани, простирающимися от фасции к склере. Как будет понятно специалистам в данной области, способность доставлять композиции через этот защитный склеральный слой, покрывающий глаз, делает возможной удобную и эффективную доставку большого разнообразия фармакологических и других агентов в нижележащие ткани в глазу, такие как хороид, сетчатка или жидкая часть стекловидного тела. Посредством применения композиций этого изобретения к таким способам доставки ίη νίνο, даже относительно трудные для доступа ткани, такие как ткани на обратной стороне глаза, могут лечиться минимально инвазивными средствами. Должно быть понятно, что в некоторых случаях будет желательным более долго сохраняющийся кНЛБЕСР, такой как ПЭГилированный кНЛБЕСР.
Важно отметить, что, хотя полученные от животных гиалуронидазы могут быть и были использованы для лечения определенных состояний глаза и в качестве распространяющего фактора для стимуляции доставки анестезирующих средств и других терапевтических или фармакологических агентов, несколько важных соображений относятся к применению полученных от животных ферментов и потенциально либо ограничивают их применение, либо вызывает обеспокоенность в отношении безопасности или дополнительный риск, когда эти гиалуронидазы используются для лечения людей. Среди этих соображений находится беспокойство в отношении того, что белки или другие примеси, присутствующие в этих композициях, могут приводить к иммуногенным и/или другим проблемам при применении к тканям человека ίη νίνο. Кроме того, в том смысле, что используются ферменты животного, не являющегося человеком, даже очищенные ферменты могут сами дополнительно способствовать иммуногенности, так как они не происходят от человека. Кроме того, в этом отношении, потенциал в отношении расщепляющих ферментов, таких как гиалуронидазы, для эффективной стимуляции их собственного диспергирования (описанного здесь) мог бы увеличивать вероятность того, что эти иммуногенные версии или композиции таких полученных от животных продуктов контактируют с иммунной системой.
Беспокойства, связанные с полученными от животных и/или примесными факторами, являются также еще более значимыми в ряде ситуаций; например, в ситуациях, в которых ткань-мишень уже подвергалась хирургическим или другим процедурам, в ситуациях, в которых этот агент вводят в относительно иммунопривилегированное пространство (такое как части глаза, сердце, нервная система и многие другие ткани и органы, которые обычно не экспонированы наружной среде), и/или в ситуациях, в которых пациент имеет ослабленный иммунитет или иным образом находится при повышенном риске, связанном с инфекцией. Таким образом, применение таких происходящих от животного композиций можно избежать в ряде приложений, в которых риск инфицирования или других осложнений снижает их потенциальную применимость. В этих ситуациях и в других ситуациях применение рекомбинантно полученных &НЛБЕСР этого изобретения может обеспечивать применения, которые являются высокоэффективными и также имеют благоприятные профили безопасности и, следовательно, улучшает и расширяет условия и ситуации, в которых могут быть успешно использованы эти ферменты.
В контексте невнутривенных парентеральных инъекций (таких как внутрикожная, подкожная, внутримышечная и другие инъекции в пространства, другие, чем сосудистая сеть) &НЛБЕСР (и/или другая гликозаминогликаназа) и другой агент (например, совместная композиция или смесь, содержащая &НЛБЕСР и другой агент, такой как диагностический агент, анестезирующий агент, фармакологический агент, эстетический агент или их комбинации) в объеме жидкости (например, фармацевтического эксципиента или другого раствора) могут быть введены в место или места в теле инъекцией или инфузией. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что могут быть приведены в действие несколько сил для усиления доставки фармакологического или другого агента (степень которого, например, зависит частично от конкретных композиции, объема и места введения). Эти движущие силы могут включать в себя увеличение гидростатического давления, когда объем жидкости эффективно вводится в ограниченное пространство (такое как вышеуказанное суб-теноново пространство, или место внутрикожной, подкожной, внутримышечной или другой не-ΐν парентеральной инъекции, последующее увели
- 8 011654 чение конвективного транспорта растворенных веществ (или конвекции), когда поток жидкости увеличивается вдоль его градиента давления (и растворенные молекулы или макромолекулярные комплексы переносятся им), а также увеличение диффузии и/или проницаемости, опосредованное расщеплением гликозаминогликанов и сопутствующим образованием каналов в расположенном ниже по потоку межклеточном матриксе или интерстициальном пространстве.
В случае 8НА8ЕОР, инъецируемых в переднюю камеру глаза для удаления избытка вязкоупругих субстратов, таких как содержащие гликозаминогликан композиции (которые обычно используются в качестве офтальмохирургических добавок в различных процедурах для переднего сегмента), специалистам в данной области будет понятно, в связи с описаниями этого изобретения, что 8НА8ЕОР может быть использован для дополнения или для устранения необходимости послеоперационных процедур, таких как промывание и аспирация, которые обычно используют для уменьшения количества вязкоупругих веществ, остающихся в глазу после завершения хирургии. Вязкоупругие вещества обычно используют во время хирургии переднего сегмента для поддержания глубокой передней камеры, позволяющей более эффективные манипулирования, и потенциальной защиты эндотелия роговицы и других тканей во время хирургии. Различные вязкоупругие вещества, содержащие гиалуронат и/или хондроитинсульфат, используют в хирургических процедурах, таких как процедуры для переднего сегмента глаза (см., например, Ргоуйс™. У18соа(™ и Эиоуйс™ (доступные из А1соп ЬаЬога(опе8, 1пс., те^те.а1соп1аЬ8.сот); Неа1оп™, Неа1оп 5™ и Неа1оп СУ™ (доступные из Айуапей Мей1еа1 Ор(1С8, \\л\лг.йеа1оп.сот); Ату18СЕМ & Ату18СЕМ Р1и8 (доступные из Вашей & ЬотЬ, тетете.Ьаи8СЙ.сот); 1-У18С™, 1-У18С™ Р1и8, 1-У18С™ 18 и IУ18С™ Рйаео (доступные из Ι-ΜΕΌ Рйагта, \\л\лу.йпейрйагта.сот); Ьа Ьоп™ (доступный из Сепега1 1ппоуа(юп8, тетете.депегайгайе.пе()). Однако, как известно в данной области, удержанное вязкоупругое вещество в передней камере после хирургических процедур, таких как хирургия катаракты, может привести к нарушенному вытеканию из передней камеры (потенциально посредством уменьшения вытекания через трабекулярную сеть), которое может вызывать повышения во внутриглазном давлении (1ОС-спайки), которые могут привести к глаукоме.
Таким образом, 8НА8ЕОР этого изобретения может быть введен, например, инъекцией в переднюю камеру глаза в качестве «антидота вязкоупругого вещества» в отношении ранее введенных вязкоупругих композиций, содержащих гликозаминогликаны, такие как гиалуронан. Для применения в качестве антидота вязкоупругого вещества 8НА8ЕОР будет обычно вводиться послеоперационной инъекцией в переднюю камеру (с предварительной ирригацией или аспирацией для удаления некоторой части ранее введенного вязкоупругого вещества) после процедур в переднем сегменте, таких как хирургия катаракты и имплантация внутриглазного хрусталика (например, посредством факоэмульсификации или внекапсульной хирургии), фильтрационная хирургия глаукомы (трабекулэктомия), хирургия для трансплантации роговицы (например, сквозная кератопластика), посттравматическая хирургия глаза, и т.п. Как будет понятно специалистам в данной области, количество введенного 8НА8ЕОР в таком контексте будет зависеть, т(ег айа, от его удельной активности, а также от количества используемого вязкоупругого агента и от того, удаляют или не удаляют некоторое количество вязкоупругого вещества сначала физически (например, ирригацией и аспирацией). Таким образом, каждое применение будет оптимизироваться для конкретных обстоятельств, как будет понятно специалистам в данной области в связи с обеспеченными здесь описаниями и иллюстрациями.
Некоторые вязкоупругие агенты, такие как У18соа(™ и Эно^ше™ (доступные из А1еоп ЬаЬ8), содержат как гиалуронат, так и хондроитинсульфат. Выгодным образом, многие 8НА8ЕОР этого изобретения являются ферментативно активными как в качестве гиалуронидаз, так и в качестве хондроитиназ, что делает их особенно подходящими в отношении таких имеющих двойной состав вязкоупругих агентов.
Гиалуронидазы, включающие в себя 8НА8ЕОР, могут быть также объединены с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами (такими как хондроитиназы) для таких применений, как предыдущие применения, или для дополнительного открывания каналов в интерстициальных пространствах для других приложений, таких как приложения, описанные и проиллюстрированные здесь.
В том смысле, что вязкоупругие вещества используют также в других процедурах, 8НА8ЕОР данного изобретения может быть подобным образом использован вместе со способами или в качестве замены способов уменьшения или элиминирования количеств примененного вязкоупругого вещества, т. е. в качестве антидота вязкоупругого вещества.
В применениях 8НА8ЕОР в качестве распространяющих агентов в тканях, таких как глаз, композицию, содержащую один или несколько 8НА8ЕОР, описанную здесь, обычно применяют к ткани-мишени до применения или одновременно с применением анестезирующего, диагностического, фармакологического или другого агента, который должен быть доставлен в эту ткань-мишень или в участок вблизи этой ткани-мишени. В некоторых контекстах, 8НА8ЕОР могут быть использованы для усиления доставки фармакологических или других агентов через первую ткань к одной ткани-мишени или нескольким тканям-мишеням, расположенных дистально от первой ткани. В качестве иллюстрации, введение 8НА8ЕОР в эписклеральное пространство, окружающее глаз, до введения или одновременно с введением фармако
- 9 011654 логического или другого агента в это эписклеральное пространство, может быть использовано для стимуляции доставки этого агента через эту защитную склеральную ткань и в хороид, сетчатку и стекловидное тело. Таким образом, ряд фармакологических и/или других агентов, которые применимы для лечения состояний хороида, сетчатки и/или стекловидного тела, могут доставляться относительно локализовано в ткани-мишени, но в то же самое время с использованием неинвазивного подхода, такого как инъекция в суб-теноново пространство. Аналогичные ситуации существуют в других ситуациях, в которых хНАБЕСР могут быть применены к одной ткани или к одному местоположению в теле для облегчения доставки фармакологического или другого агента в эту ткань или это местоположение и/или к дистальным участкам, как описано и проиллюстрировано здесь.
Хотя степень и скорость диспергирования совместно приготовленного или совместно вводимого агента зависит частично от участвующих ткани и агента, такое диспергирование может быть обычно увеличено, ш1ег аба, увеличением количества примененного хНАБЕСР, использованием хНАБЕСР, имеющего более высокую удельную активность, использованием хНАБЕСР, который является более устойчивым к расщеплению или другой инактивации, например, ПЭГилированного, сверхсиалированного или другим образом модифицированного хНАБЕСР, с обеспечением пролонгированного высвобождения или депо-композиции хНАБЕСР, или другими подобными подходами для увеличения эффективной активности и/или длительности действия примененного хНАБЕСР. Кроме того, когда желательно, чтобы хНАБЕСР облегчал диспергирование (рассеяние) агента в ткань или местоположение, дистальные, например, относительно места инъекции, тогда может быть использовано обеспечение хНАБЕСР и/или агента в значительном объеме жидкости (так чтобы частично заполнить или даже слегка расширить место инъекции) для дополнительного усиления диспергирования посредством процесса конвективного транспорта, как описано и проиллюстрировано здесь.
Как будет понятно специалистам в данной области, хНАБЕСР могут быть использованы для эффективного ускорения доставки ряда анестезирующих средств, фармакологических веществ и/или других агентов к задним сегментам глаза для лечения состояний, таких как отслойки сетчатки, закупорки ретинальных вен, пролиферативные ретинопатии, диабетические ретинопатии, воспалительные состояния (такие как увеит, хороидит, ретинит и т.п.), а также дегенеративные заболевания, сосудистые заболевания и различные опухоли. Опять-таки, как будет понятно специалистам в данной области, различные фармакологические или фармацевтически эффективные агенты могут быть с пользой использованы для лечения таких состояний и заболеваний заднего сегмента, в том числе, в качестве иллюстрации, анестезирующие и фармакологические агенты, таких как описанные и проиллюстрированные ниже агенты.
Совместные композиции или совместные введения хНАБЕСР с другими веществами могут также ожидаться для инъекционных «карандашей» для малого объема или быстрого подкожного введения. В качестве примеров, могут быть приготовлены Ер1реп™, инсулин и другие жидкости. Способы этого изобретения включают в себя введение полипептида или фармацевтической композиции хНАБЕСР, содержащих хНАБЕСР, до введения, одновременно с введением или после введения других терапевтических молекул. хНАБЕСР может вводиться в место, другое, чем место введения терапевтической молекулы, или хНАБЕСР может вводиться в то же самое место, в какое вводится терапевтическая молекула.
Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что способность хНАБЕСР и других гликозаминогликаназ вызывать деградацию части гликозаминогликанов в интерстициальных пространствах между клетками приводит к временному открыванию каналов в этом интерстициальном пространстве, которое, в свою очередь, имеет тенденцию увеличивать протекание интерстициальной жидкости и одновременно облегчать диффузию и/или конвективный транспорт растворенных компонентов (конвекцию) в интерстициальной жидкости (таких как анестезирующие агенты, лекарственные средства и другие фармакологические агенты, метки и диагностические агенты, и т.п.). Как будет понятно специалистам в данной области, хНАБЕСР этого изобретения могут быть использованы для повышения биодоступности (и потенциально улучшения других фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств) ряда фармакологических или других агентов, которые применимы для лечения или диагностики различных патологических состояний, или для модификации иным образом одной или нескольких тканей ίη νίνο. Иллюстративные категории таких агентов включают в себя: противораковые агенты, противоинфекционные агенты, анестезирующие средства, противовоспалительные агенты, цитокины, антитела и другие белки, нуклеиновые кислоты, макромолекулярные комплексы и многочисленные другие молекулы и фармакологические агенты (и их примерные члены), описанные здесь и в данной области.
Хотя диффузия и конвективный транспорт даже малых молекул может быть усилен открыванием интерстициальных каналов и увеличением протекания жидкости, в случае более крупных фармакологических или других агентов, таких как многие биотерапевтические вещества (в том числе антитела и другие белки, большие нуклеиновые кислоты, макромолекулярные комплексы (такие как липосомы и другие макромолекулярные носители), а также векторы генотерапии и т. п.), размер этих молекул и присутствие интерстициальных компонентов, таких как гликозаминогликаны, существенно ухудшает диффузию и/или конвекцию этих агентов. Могут возникать несколько последствий, потенциально ограничивающих применимость такого агента. Например, фармакокинетика этого агента может быть эффективно нарушена замедлением абсорбции и, следовательно, распространения этого агента. Кроме того, захват части
- 10 011654 этого агента в месте введения или вблизи него ограничивает в обоих случаях его биодоступность и может также вызывать токсичность в результате потенциально непрерывной и высокой локальной дозы. В последнем случае, локальная токсичность, которая может быть ассоциирована с болезненными или другими побочными эффектами, является проблемой при использовании многих больших биомолекул, которые вводят невнутривенной инъекцией, такой как подкожная, внутрикожная или внутримышечная инъекция. В результате, ряд фармакологических агентов имеют фармакокинетические (РК) и/или фармакодинамические (РЭ) профили, которые могут быть усилены совместным приготовлением этого агента с 5НА8ЕСР (или другой гликозаминогликаназой) и/или совместным введением этого агента с 5НЛ8ЕСР (или другой гликозаминогликаназой), которые могут быть обеспечены до этого агента, одновременно с этим агентом или после этого агента, и введены в одно и то же место или в другое место, причем эти параметры могут быть предметом оптимизации в стандартных моделях (таких как модели животных, обычно используемые для оценки фармакокинетики и фармакодинамики этого агента). Таким образом, любое разнообразие терапевтических агентов и фармакологических агентов, а также других агентов (таких как косметические или эстетические композиции), которые обычно вводят парентеральным введением, могут быть усилены с использованием &НА8ЕСР.
Хотя внутрисосудистое введение, в частности, внутривенная (IV) инъекция, может обычно обеспечивать быструю биодоступность, IV инъекции часто являются неудобными, связанными с риском или неприменимыми (и даже, когда они практикуются, могут быть ассоциированы с менее чем оптимальными общими профилями РК/РЭ). Поскольку 5НЛ8ЕСР могут быть использованы для повышения биодоступности агентов, вводимых не-ΐν парентеральными способами (такими как подкожный, внутрикожный, внутримышечный и другие способы доставки агентов интерстиций), агенты, которые доставлялись IVинъекцией, могут быть приготовлены для доставки не-ΐν парентеральными способами. Такие улучшения композиций могут обеспечить существенную пользу, например, создание возможности использования агентов, в случае которых ΐν-введение является неудобным, неприменимым, небезопасным, слишком дорогостоящим или имеющим другие недостатки. Это изменение ΐν-агентов с получением не-ΐν парентеральных композиций сможет также позволить пациентам самим производить введение этих агентов и сможет позволить оптимизацию введения доз (например, улучшенным приспособлением к параметрам РК/РЭ этого агента) посредством устранения необходимости введения внутривенной инъекцией.
Как будет понятно специалистам в данной области, параметры РК/РЭ. которые могут быть улучшены с использованием &НА8ЕСР (и/или других гликозаминогликаназ), включают в себя такие критерии, как Стах (максимальную концентрацию агента, достигаемую после абсорбции, например, в кровотоке), Ттах (максимальное время, необходимое для достижения максимальной концентрации), Т1/2 (время, необходимое для уменьшения концентрации наполовину), Стт (минимальную концентрацию агента после метаболизма и экскреции), АИС (площадь под кривой зависимости концентрации от времени, критерий общей величины биодоступности), концентрации в различных представляющих интерес тканях (в том числе, например, скорость достижения желаемых концентраций, общие уровни и продолжительность поддержания желаемых уровней) и Етах (максимальный достигнутый эффект). В качестве иллюстрации, приготовление лекарственного средства или другого фармакологического агента с &НА8ЕСР или совместное введение этого агента с 5НА8ЕСР (который может быть введен локально или системно и до этого агента, вместе с этим агентом или после этого агента) может быть использовано для увеличения Стах, уменьшения его Ттах, уменьшения его Т1/2, увеличения его АИС и/или увеличения его Етах. Как будет понятно, способность легко и пропорционально манипулировать такими ключевыми параметрами РК и РЭ (например, применением большего и меньшего количества единиц &НА8ЕСР и изменением хронометрирования (тайминга) и/или места введения) позволяет улучшить ряд фармакологических и других агентов. Оценка уровней этих параметров может быть выполнена в моделях, например, в моделях животных, используемых для измерений РК/РЭ этого агента, и совместных композиций и/или совместных введений, которые повышают относительную эффективность в отношении профиля безопасности, выбранного таким образом для конкретного введения.
Среди не-ΐν парентеральных агентов, &НА8ЕСР (и/или другие гликозаминогликаназы) могут быть также использованы для создания возможности введения этих агентов более удобными способами и/или с более высокой эффективностью. В качестве иллюстрации (и без ограничения), посредством улучшения композиции введением в нее &НА8ЕСР и/или совместного введения агентов с &НА8ЕСР (либо локально, либо системно и до этого агента, вместе с этим агентом или после этого агента) агенты, которые обычно вводят подкожной инъекцией, могут быть вместо этого введены внутрикожной инъекцией, а агенты, которые вводят внутримышечной инъекцией, могут быть вместо этого введены подкожной или внутрикожной инъекцией. Альтернативно, агенты могут быть введены тем же самым способом, но с улучшенными фармакокинетикой и фармакодинамикой с использованием &НА8ЕСР.
Применение 5НА8ЕСР (и/или других гликозаминогликаназ) для улучшения композиции вводимых ΐν лекарственных средств и других агентов в качестве не-ΐν парентеральных агентов делает также возможной доставку этих агентов с использованием любого из разнообразных новых инъекционных устройств, предназначенных для легкой и/или быстрой доставки, и для облегчения самостоятельного введения. Такие устройства включают в себя, например, устройства с ультраострыми иглами или микроигла
- 11 011654 ми (такие, как разработанные ВесЮп ΩίοΚιηδοη и другими), а также инъекционные устройства без иглы (такие как В|о)сс1ог™ и другие устройства, доступные из В1о|сс1; 1п1та1ес1™, и другие устройства, доступные из ЛтаФдт; устройства Мебуес1от™ и т.п.). Ряд устройств (например, В1о)ес1ог) применимы, в частности, для облегчения внутридермальных инъекций, которые обычно требуют большего опыта при использовании стандартных игл (из-за потенциальной возможности прокалывания дермы во время помещения иглы и доставки этого агента в участок нижележащей ткани, например, в подкожный слой). Для некоторых фармакологических агентов, таких как, например, вакцины (например, вакцины на основе ДНК или другой вакцины), может быть особенно предпочтительной доставка этого агента в дермальные, а не в субдермальные слои, так как в дерме обычно имеется относительно высокая концентрация антигенпредставляющих клеток (АРС).
В контексте агентов, которые обычно доставляются внутрикожной инъекцией (независимо от того, доставляются ли они стандартными иглами или другими более новыми иглами), или многих других агентов, которые в настоящее время не доставляются внутрикожной инъекцией, но могли бы доставляться внутрикожной инъекцией, локальное совместное введение &НА8ЕОР (и/или другой гликозаминогликаназы) может использоваться для ускорения доставки фармакологического или другого доставляемого агента или для усиления его распространения или распределения в дерме. В случае вакцины, где дерма может быть первичной тканью-мишенью, вследствие локального обилия АРС, &НА8ЕОР (и/или другая гликозаминогликаназа) может, следовательно, облегчать распространение этой вакцины в тканимишени, увеличивая посредством этого вероятность и степень взаимодействий между вакциной и АРС (что может значительно потенцировать генерирование иммуномодуляторного ответа). В случае других агентов, дерма может не быть первичной тканью-мишенью, а является скорее тканью, в которую вводят дозу этого агента, из которой этот агент предпочтительно абсорбируется в другую ткань, обычно в кровоток. В последнем случае, кровоток может быть сам представляющей интерес тканью-мишенью (например, для модулирующих кровь факторов, описанных здесь и в данной области), или кровоток может быть сам доставляющей тканью, при помощи которой этот агент транспортируется к дистальной тканимишени (например, к ткани в теле, снабжаемой этим кровотоком). В любом из этих последних случаев (в которых доставка является внутрикожной, но желательно, чтобы этот агент был доставлен в кровоток), &НА8ЕОР (и потенциально объем жидкости, в которой его инъецируют) может облегчать распространение этого агента сначала в дерме и отсюда в сосудистую сеть, дренирующую дерму, и в конечном счете в более крупные кровеносные сосуды, как описано и проиллюстрировано здесь.
Применение &НА8ЕОР для усиления фармакокинетики и/или фармакодинамики других терапевтических или фармакологических агентов может быть также использовано для агентов, доставляемых другими способами, чем не-ίν парентеральное введение. Например, не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что присутствие 5НА8ЕСР в интерстициальных пространствах в теле (которое может достигаться локальным и/или системным введением &НА8ЕОР) ведет к активации интерстициальных каналов и увеличению потока жидкости в интерстициальном пространстве, что, в свою очередь, облегчает как диффузию, так и конвективный транспорт растворенных агентов интерстициальной жидкостью (например, фармакологических и других агентов). В качестве иллюстрации, агенты, которые вводят непосредственно в кровоток (например, внутривенной инъекцией) или перорально (и, следовательно, они входят в кровоток, например, после поглощения из желудочно-кишечного тракта), могут быть все еще предметом ограничений в послеабсорбционной, т.е. распределительной фазе их фармакокинетики. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что 5НА8ЕСР могут усиливать доставку к клеткам-мишеням посредством увеличения интерстициальной проницаемости и тока жидкости и, следовательно, увеличения диффузии и/или конвекции агентов в интерстициальном пространстве, которое эффективно образует промежуточную среду между почти всеми фармакологическими способами доставки и клетками-мишенями.
Кроме того, считается, что изменения в онкотическом давлении, вызываемые введением &НА8ЕОР, могут способствовать ускорению доставки фармакологических агентов. Опять, не желая быть связанными теорией, авторы считают, что присутствие &НА8ЕОР и сопутствующее расщепление вдоль интерстициальной стороны васкуляризованной ткани, имеет тенденцию уменьшения онкотического давления в интерстициальном пространстве, которое, в свою очередь, усиливает фильтрацию жидкости из сосудистой сети в интерстициальное пространство.
Считается, что потенциал уменьшения интерстициального давления является особенно важным в связи со многими раковыми заболеваниями, в которых интерстициальное давление в опухоли (опухолевое интерстициальное давление ΤΙΕ) является повышенным. Высокое ΤΙΕ может приводить к относительному импедансу (полному сопротивлению) в отношении потока текучей среды из сосудистой сети в направлении центра опухоли, что ограничивает количество противоракового агента, которое достигает опухоли, в частности, участков, которые являются более глубокими в массе опухоли. Введение &НА8ЕОР в интерстиции опухоли могло бы, следовательно, способствовать ускорению доставки локально доставляемых, а также системно доступных противораковых агентов, которые могут более легко проникать в опухоль при уменьшенном онкотическом давлении и увеличенных диффузии и/или конвективном
- 12 011654 транспорте. Измерения ΤΙΡ и гидравлической проводимости (К) в опухолях (например, с использованием меченых молекул, таких как альбумин, меченый красителем Ενπη'δ В1ие) может быть использовано для количественной оценки действия различных концентраций 5НА8ЕСР на динамику текучей среды опухолей ίη νίνο, как проиллюстрировано здесь и/или в этой области.
Дополнительным ярким доказательством уменьшенной динамики текучей среды во многих опухолях и выдвижением на первый план дополнительной пользы применения §НА8ЕСР к опухолям является тот факт, что многие опухоли обнаруживают накопление гликозаминогликанов, в частности, гиалуронана (что может быть обусловлено тем фактом, что лимфатические сосуды, которые являются преобладающим путем для катаболизма гиалуронана, являются нарушенными или отсутствующими во многих опухолях). Такой избыточный гиалуронан может способствовать сопротивлению гидравлической проводимости. Введение &НА8ЕСР может, следовательно, использоваться для противодействия накоплению гликозаминогликанов во многих опухолях для улучшения гидравлической проводимости в этих опухолях и эффективного придания им большей чувствительности к противораковым агентам (независимо от того, является ли их доставка локальной или системной).
Как будет понятно специалистам в данной области, описанные здесь принципы могут быть также применены для многочисленных других фармакологических веществ и других агентов, которые желательно доставлять к участкам в теле, например, для предупреждения, диагностики и/или лечения заболевания или для модуляции иным образом физиологических функций. Здесь обеспечены иллюстративные классы таких агентов (и примеры их членов), и многие другие известны в данной области или находятся в стадии разработки.
Кроме их применения в потенциальных улучшениях и/или изменениях в приготовлении различных парентерально вводимых фармакологических веществ и/или агентов, §НА8ЕСР могут быть также с пользой применены в связи с непарентеральными агентами (такими как агенты, приготовленные в виде пилюль, жидкостей или других форм для приема внутрь и обычной абсорбции через желудочно-кишечный тракт). Например, поскольку большинство непарентеральных лекарственных средств должны в конечном счете достигать клеток в интерстиции для проявления их желаемых действий, использование &НА8ЕСР для усиления диффузии и/или конвективного транспорта в интерстиции (либо системно, либо локально (например, локальным или нацеленным введением &НА8ЕСР)), может быть применено для улучшения степени и/или скорости, с которой непарентеральные агенты (а также парентеральные) достигают клеток-мишеней.
Кроме того, ряд агентов, которые обычно вводят непарентерально (например, перорально), могут быть приготовлены улучшенным образом или их ингредиенты могут быть приготовлены улучшенным образом, для применения в парентеральных введениях, которые становятся более эффективными и/или безопасными в комбинации с &НА8ЕСР. Для иллюстрации этого широко применимого подхода, способность &НА8ЕСР облегчать нацеленную доставку к конкретным тканям (например, способность &НА8ЕСР обеспечивать транссклеральную доставку к тканям в задней камере глаза) может быть использована для доставки любого из разнообразных агентов (в том числе агентов, ранее вводимых системно) прямо и преимущественно в локализованный представляющий интерес участок в теле. Это может не только обеспечивать более желательные и/или более быстро достигаемые концентрации в представляющем интерес участке, но и может существенно уменьшать потенциальные проблемы и недостатки, ассоциированные с системным введением, при котором концентрации в нежелательных участках могут быть равными концентрациям или даже превышающими концентрации в желаемом участке-мишени (с потенциальным запуском нежелательных побочных действий, а также с излишней тратой агента). В некоторых случаях, агенты, которые не используются широко или являются неприменимыми, например, для определенных показаний или в определенных пациентах, могут быть эффективно применены с пользой к дополнительным пациентам, при совместном приготовлении этих агентов или при совместном введении их с 5НА8ЕСР. как описано и проиллюстрировано здесь.
Как будет понятно специалистам в данной области, возможность применения &НА8ЕСР для повышения скорости и/или нацеленного биораспределения совместно приготовленных и/или совместно вводимых агентов и для манипулирования другими аспектами их фармакокинетики или фармакодинамики (например, для улучшения профиля риск:польза или облегчения их применения пациентами, семьей или профессионалами медико-санитарной помощи), обеспечивает большую благоприятную возможность для улучшения лекарственных средств и других агентов, которые используются для лечения, диагностики или предупреждения заболеваний.
Без ограничения каким-либо конкретным перечнем применений, гликозаминогликаназы, в том числе &НА8ЕСР, описанные здесь (а также другие гиалуронидазы и другие гликозаминогликаназы), могут быть использованы для эффективного достижения болюсной или болюс-подобной доставки (доставки ударной дозы) любого числа фармакологических и других агентов невнутривенными парентеральными способами введения, а также другими способами введения (например, посредством усиления доставки агентов в ткань-мишень и/или через ткань-мишень после выхода их из кровотока (независимо от того, вводят ли их непосредственно в кровоток (например, 1У-введением), или опосредованно (например, пероральным или не-ΐν парентеральным введением)).
- 13 011654
Без ограничения конкретным механизмом действия или его аспектом, авторы считают, что способность этих ферментов временно разрушать компоненты интерстициального матрикса между клетками (который ответственен за значительную часть жидкого пространства в теле и, соответственно, большого пространства, которое должно быть пересечено фармакологическими и другими агентами для достижения большинства клеток-мишеней) может значительно активировать доставку агентов к клеткаммишеням с использованием одного или нескольких потенциально синергических способов. Во-первых, хотя масса интерстициальной жидкости проявляет некоторую степень потока, этот поток часто затруднен или испытывает сопротивление со стороны гликозаминогликанов, таких как гиалуронан и другие интерстициальные компоненты. Способность гликозаминогликаназ, в том числе &НЛ8ЕСР (а также других гиалуронидаз и других гликозаминогликаназ), открывать каналы в таких интерстициальных пространствах, как описано и проиллюстрировано здесь, может быть использована для уменьшения полного сопротивления и увеличения степени и скорости потока, «направленного вниз по потоку», происходящего из любого конкретного давления «выше по потоку». Во-вторых, в случае не-ΐν парентеральных инъекций 8НЛ8ЕСР (или другой гликозаминогликаназы) и других фармакологических или других агентов, объем не-ΐν парентерального инъекционного раствора может быть использован для увеличения расположенного выше по потоку движущего давления или гидравлического напора (например, посредством увеличения гидростатического давления в ограниченном пространстве), которое может дополнительно усиливать поток. В-третьих, поскольку объем жидкости, содержащий введенный 8НЛ8ЕСР (или другую гликозаминогликаназу) и другой агент, эффективно перемещает по увеличенному градиенту давления (т.е. увеличенному градиенту, созданному повышением гидростатического давления, ассоциированным с инъецированным «болюсом» и одновременным уменьшением интерстициального давления в окружающей ткани), растворенные вещества в этом болюсе могут быть эффективно перенесены (например, посредством конвективного транспорта) в соседнюю ткань. Таким образом, эта инъецированная жидкость, или болюс, может эффективно и относительно быстро перемещаться в соседнюю ткань и доставлять любой фармакологический или другой агент, введенный в том же самом месте введения или вблизи того же самого места введения (например, совместным приготовлением или совместным введением этого агента в комбинации с 8НЛ8ЕСР или другой гликозаминогликаназой).
В качестве иллюстрации, применение гликозаминогликаназ, таких как 8НЛ8ЕСР, для открывания каналов в интерстициальных пространствах, как описано и проиллюстрировано здесь, может быть использовано для увеличения интерстициального потока в ткани и через ткани, такие как опухоли и другие ткани, в которых этот поток обычно затруднен, а интерстициальные давления повышены. Иллюстративные примеры описанных здесь принципов включают в себя применение 8НЛ8ЕСР для уменьшения интерстициального давления в опухоли ίη νίνο.
Увеличенный поток может быть также применен к нормальной ткани, например, для возможности доставки анестезирующего, диагностического, косметического или другого эстетического или фармакологического или другого агента в ткань (например, для модификации этой ткани или введения депопрепарата в ткань). Увеличенный поток может быть также использован к первой или проксимальной ткани для активации доставки агента через эту ткань или введения в дистальную ткань, причем дистальная ткань сама быть желаемой тканью-мишенью или путем к желаемой ткани-мишени. Иллюстративные примеры описанных здесь принципов включают в себя, например, (ί) применение 8НЛ8ЕСР, введенных в эписклеральное пространство, окружающее глаз, для активации доставки агентов через склеру для попадания в дистальные ткани-мишени во внутреннем пространстве глаза, такие как сетчатка и хороид; и (ίί) применение 8НЛ8ЕСР, введенных внутрикожно, для активации доставки агентов через субдермальные слои в кровоток, который сам может быть тканью-мишенью (например, для модифицирующих кровь агентов) или путем, при помощи которого этот агент (эти агенты) может(гут) быть доставлен(ы) к другим тканям-мишеням в теле.
В качестве дополнительной иллюстрации этих способов и композиций для активации доставки фармакологических веществ и других агентов к желаемым тканям в теле обеспечены следующие дополнительные примеры. При помощи способов, описанных и проиллюстрированных здесь, могут быть повышены или модифицированы иным образом фармакокинетические и/или фармакодинамические профили фармакологических агентов и профили абсорбции, распределения и/или эффективности других агентов. Кроме того, агенты, которые были существенно или практически ограничены доставкой по одному способу (например, ΐν-инъекцией), могут доставляться другими, более безопасными, менее инвазивными, менее дорогостоящими и/или более удобными способами.
В качестве дополнительной иллюстрации и без ограничения каким-либо конкретным типом применения, объем (V) жидкости (Ь), содержащей 8НЛ8ЕСР или другую гликозаминогликаназу (Фермент СЛС), может быть введен в участок ткани в теле (Ткань для введения Дозы). Описанными и проиллюстрированными здесь способами Фермент ОАО может быть доставлен в Ткань для введения Дозы и до некоторой степени через Ткань для введения Дозы. Без ограничения конкретным механизмом действия, Фермент ОАО может эффективно переноситься в Ткань для введения Дозы конвективным транспортом посредством объема жидкости (Ъ). Конвективный транспорт может быть, в свою очередь, активирован отчасти гидростатическим давлением, ассоциированным с Ь (которое может обеспечивать запускающее
- 14 011654 движение давление), и отчасти способностью Фермента ОАО открывать каналы в интерстициальных пространствах Ткани для введения Дозы (которые могут уменьшать сопротивление напорному (нагнетательному) потоку, и тем самым понижать давление сопротивления). Таким образом может быть создан движущий жидкость перепад давлений и до некоторой степени он может быть увеличен, например, одним или обоими из следующих действий: (ί) введением и, если желательно, увеличением запускающего движение гидростатического давления, например, введением Ь в ограниченное пространство, и, если желательно, увеличением V; и (ίί) уменьшением сопротивления напорному (нагнетательному) потоку (например, введением Фермента ОАО и, если желательно, увеличением его эффективности, например, увеличением его концентрации, увеличением его резистентности к расщеплению (например, ПЭГилированием, сверхсиалированием или другой модификацией), и/или увеличением его доставки конвективным транспортом (например, увеличением V)).
В некоторых вариантах осуществления (например, в которых желательна увеличенная степень или скорость доставки), V является объемом, достаточным для временного расширения участка в Ткани для введения Дозы, в котором вводят Фермент ОАО. Как будет понятно специалистам в данной области, объем (V), который может быть предоставлен, и полученная степень расширения (Ό) зависят от конкретной ткани. Для целей иллюстрации, но не для ограничения, степень, до которой имеет место расширение, варьируется, например, от ситуаций, в которых (ί) Ткань для введения Дозы является относительно большим и/или быстро движущимся заполненным жидкостью пространством (таким как кровоток в связи с внутривенной или внутриартериальной доставкой), и в этом случае Ь может быть большим (например, порядка многих мл, если желательно), но Ό имеет тенденцию быть минимальным; (ίί) Ткань для введения Дозы является относительно меньшим и/или менее быстро движущимся заполненным жидкостью пространством (таким как цереброспинальная жидкость в связи с внутриоболочечной доставкой), и в этом случае Ь может быть все еще относительно большим, но Ό может быть большим, чем минимальное Ό, в зависимости от точного места и объема инъекции; (ίίί) Ткань для введения Дозы является относительно меньшим, но несколько растяжимым пространством (таким как эписклеральное пространство, окружающее глаз, для целей иллюстрации); или (ίν) Ткань для введения Дозы является более плотным и/или более ограниченным пространством с более высоким сопротивлением давлению (таким как дерма в связи с внутрикожной доставкой, для целей иллюстрации).
Как будет понятно специалистам в данной области, V может быть в диапазоне от объемов, меньших чем 0,1 мл, до объемов, больших чем 100 мл, причем для многих применений он находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до 20 мл и для многих применений в диапазоне 1-10 мл, часто от 2 до 5 мл; но может варьироваться для конкретных ситуаций, как проиллюстрировано здесь. V может быть также специально оптимизирован в пределах таких диапазонов для конкретного применения, как желательно; например, сравнением стандартных фармакокинетических и/или фармакодинамических профилей на протяжении диапазона тест-объемов.
Как будет понятно специалистам в данной области в связи с этими описаниями, посредством комбинирования быстро действующей и реинициирующей открывание каналов активности Фермента ОАО (который как активирует, так и активируется его собственной доставкой), может быть, следовательно, генерирована система доставки множества синергических лекарственных средств; как дополнительно описано и проиллюстрировано здесь.
В первом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащей 8НА8ЕОР или другую гликозаминогликаназу (Фермент ОАО) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты) (таких как детектируемые молекулы или другие диагностические агенты, анестезирующие агенты или другие модифицирующие ткани агенты, фармакологическте агенты или фармацевтически приемлемые агенты, косметические или другие эстетические агенты, и другие агенты, которые желательно ввести в одну или несколько тканей в теле), вводят в участок первой ткани (Ткани для введения Дозы), которая сама является желаемой тканью-мишенью (Ткань-Мишень) для этого агента. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются в эту Ткань-Мишень или через эту Ткань-Мишень в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента ОАО.
Как будет понятно специалистам в данной области в связи с этим и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Тканью для введения Дозы может быть любая из разнообразия тканей, к которым возможен легкий доступ снаружи тела (например, с использованием различных способов введения, описанных и проиллюстрированных здесь, и/или способов, известных в данной области) или изнутри тела (например, в связи с хирургией или с использованием любого разнообразия нехирургических или минимально инвазивных подходов и устройств для доступа к тканям в теле). Такие Ткани для введения Дозы включают в себя Ткани для введения Дозы, описанные и проиллюстрированные здесь, а также другие, известные в данной области.
Как будет также понятно специалистам в данной области в связи с этим и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Тканью-Мишенью может быть любая из разнообразия тканей, к которым желательно доставить Фермент ОАО и потенциально другой Агент (другие Агенты) (например, (ί) ткани, которые являются предметом приложений усилий для диагностики, предупреждения или лече
- 15 011654 ния патологического состояния (независимо от того, обусловлено ли оно внутренними причинами, например, является наследственным или приобретенным патологическим состоянием, или наружными причинами, например, вызвано инфекцией); (ίί) ткани, которые желательно анестезировать или иным образом модулировать (например, в связи с хирургией и/или другими процедурами); (ίίί) ткани, в которых желательным является запуск иммунной реакции (например, связанной с вакцинацией); (ίν) ткани, которые должны служить в качестве участка-депо для высвобождения агента (агентов) в другие ткани; (ν) ткани, подлежащие модификации для эстетических или косметических процедур; и (νί) ткани или участки в теле, подлежащие модификации для других целей. Такие Ткани-Мишени включают в себя описанные и проиллюстрированные здесь ткани, а также другие ткани, известные в этой области.
Как будет также понятно специалистам в данной области в связи с предыдущими и другими иллюстративными аспектами, описанными здесь, Агентом (Агентами) могут быть любые из разнообразия молекул, макромолекул и макромолекулярных комплексов, которые используются или могут быть использованы для изменения или модуляции условий в теле (например, (ί) для целей диагностики, предупреждения или лечения патологического состояния (независимо от того, обусловлено ли оно внутренними причинами, например, является наследственным или приобретенным патологическим состоянием, или наружными причинами, например, вызвано инфекцией), поражающим Ткань-Мишень и/или соседние ткани; (ίί) для целей анестезии или модуляции иным образом физиологии этой Ткани-Мишени; (ίίί) для целей запуска иммунной реакции, связанной с вакцинацией; (ίν) для целей использования ТканиМишени в качестве участка-депо для высвобождения агента (агентов) в другие ткани; (ν) для эстетических или косметических целей; и/или (νί) для других целей, обслуживаемых доставкой Фермента САС и потенциально другого Агента (других Агентов) к ткани или к другому участку в теле). Такие Агенты включают в себя различные классы агентов и их члены, описанные и проиллюстрированные здесь, а также другие члены таких классов агентов и другие агенты (и их члены), известные в этой области.
Во втором иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий зНА8ЕСР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент САС) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты) вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является сама желаемой тканью-мишенью). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А в Ткань-мишень В в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента САС.
В третьем иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий зНА8ЕСР или другую гликозаминогликаназу (Фермент САС) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты) вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей (Промежуточных Тканей), расположенных между Тканями А и другой тканью или тканями (Дистальными Тканями), которые сами являются желаемыми тканямимишенями или включают в себя желаемую ткань-мишень (ткани-мишени). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А и через одну или несколько Промежуточных Тканей для достижения одной или нескольких Тканей-Мишеней в более высокой степени и/или при скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) САС).
В четвертом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий зНА8ЕСР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент САС) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты)), вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые являются тканями-мишенями или включают в себя желаемую ткань-мишень. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А к одной или нескольким Тканям Доставки в большей степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) САС.
В пятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий зНА8ЕСР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент САС) и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты)), вводят в участок ткани в теле (Ткани для введения Дозы), которая является проксимальной относительно одной или нескольких тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые доставляют жидкость в одной или нескольким желаемым тканяммишеням (Тканям-Мишеням) в теле. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) доставляются из Ткани А к одной или нескольким Тканям Доставки и из них к одной или нескольким Тканям-Мишеням, расположенным далее в этом процессе, в большей степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) САС.
В шестом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий зНА8ЕСР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент САС) вместе с одним или несколькими фармакологическими или другими агентами (Агентом (Агентами)), вводят в одну или несколько тканей доставки, таких как кровоток, лимфа или цереброспинальная жидкость (Ткани Доставки), которые подают жидкость к одной или несколь
- 16 011654 ким желаемым Тканям-Мишеням (например, через кровоток, снабжающий Ткань-Мишень). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) проникают в эту ТканьМишень в большей степени и при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) ОАО.
В седьмом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий &НАЗЕОР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент ОАО), вводят в участок ткани в теле (Ткани А), которая является желаемой тканью-мишенью или находится вблизи желаемой ткани-мишени (Ткани-Мишени), и один или несколько фармакологических или других агентов (Агент (Агенты)) вводят в тело другим способом введения (например, пероральной доставкой или внутривенной инъекцией), который позволяет этому Агенту (Агентам) достичь Ткани-Мишени (например, через кровообращение Ткани-Мишени, после абсорбции или инъекции в кровь). При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, этот Агент (эти Агенты) проникают в эту Ткань-Мишень в большей степени и при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) ОАО.
В восьмом проиллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий &НАЗЕОР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент ОАО), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которая имеет повышенное интерстициальное давление. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, интерстициальное давление в этом Участке (Участках) Ткани уменьшается посредством расщепляющей активности Фермента (Ферментов) ОАО.
В девятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий &НАЗЕОР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент ОАО), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которая имеет избыток гиалуронана или другого гликозаминогликана. При помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов избыток гиалуронана или другого гликозаминогликана в этом Участке (Участках) Ткани уменьшается посредством расщепляющей активности Фермента (Ферментов) ОАО.
В десятом иллюстративном аспекте объем жидкости (V), содержащий &НАЗЕОР (или другую гликозаминогликаназу) (Фермент ОАО), вводят в участок или участки ткани в теле (Участок (Участки) Ткани), которые находятся в желаемой точке доступа или вблизи желаемой точки доступа для подкожного введения жидкости (Участка введения жидкости). Затем, при помощи описанных и проиллюстрированных здесь способов, жидкости могут доставляться в и через этот Участок для введения жидкости в более высокой степени и/или при большей скорости, чем степень и скорость, которые имели бы место в отсутствие Фермента (Ферментов) ОАО.
Как будет понятно специалистам в данной области в связи с обеспеченными здесь подробными описаниями и проиллюстративными вариантами, любой из большого разнообразия агентов может вводиться совместно (например, посредством совместного приготовления или совместного введения с Ферментом ОАО) и любой из разнообразия Ферментов ОАО может использоваться в концентрациях в диапазонах, таких как диапазоны, приведенные здесь, но обычно оптимизированных для используемой конкретной ткани и конкретной цели. Объем жидкости (V), применяемый в приведенных выше иллюстративных аспектах, будет обычно зависеть от характера участка введения и будет также обычно оптимизирован для конкретной используемой ткани и конкретной цели. Как описано и проиллюстрировано здесь, в случае не-Ш парентеральных введений V может быть увеличен (в пределах конкретных ограничений участка ткани) для обеспечения повышенного гидростатического напорного давления, которое, в сопряжении с уменьшенным сопротивлением, связанным с расщеплением гиалуронана или другого гликозаминогликана, может эффективно заставит объем жидкости действовать в качестве болюса, несущего любое растворенное вещество, которое он содержит, в лежащее ниже по потоку интерстициальное пространство и потенциально далее.
Таким образом, здесь обеспечены множество способов, использующих гиалуронидазы (и/или другие гликозаминогликаназы) для активации доставки фармакологических и других агентов к участкам в теле, а также семейство эукариотических секретируемых нейтрально-активных гликопротеинов гиалуронидазы, названных &НАЗЕОР, и их функциональных доменов, в частности, их гиалуронидазных (или каталитических) доменов, мутеинов и других производных и их аналогов. Здесь обеспечены также нуклеиновые кислоты, кодирующие эти &НАЗЕОР. Кроме того, обеспечены композиции, совместные композиции и терапевтические применения указанных &НАЗЕОР (в том числе совместное введение с другими агентами) для лечения, предупреждения или диагностики заболевания и для применения в качестве модифицирующих ткани ферментов.
Краткое описание чертежа
Чертеж является векторной картой Вектора 4Ζ24 вНАЗЕОР.
Подробное описание изобретения
А. Определения.
Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, какое обычно понимается специалистом в области, к которой относится это изобретение. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности ОепВапк, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые даются ссылки во всем этом описании, если
- 17 011654 нет других указаний, включены в качестве ссылки в их полном объеме. В случае, когда имеется множество определений для используемых здесь терминов, предпочтительными являются определения, приведенные в этом разделе.
Когда делается ссылка на ИНЬ (унифицированный указатель информационного ресурса, т.е. стандартизованную строку символов, указывающую местонахождение документа в сети Интернет) или другой подобный идентификатор или адрес, понятно, что такие идентификаторы могут меняться и конкретная информация в Интернете может поступать и исчезать, но поиском в Интернете может быть найдена эквивалентная информация. Ссылка на нее служит доказательством доступности и публичного распространения такой информации.
В данном контексте аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений находятся, если нет другого указания, в соответствии с их обычным применением, общепризнанными аббревиатурами или ГОРЛС-ГОВ ΟοιηιηΝδίοη οη Вюсйешюа1 Иотепс1а1иге (см. (1972) Вюсйет. 11: 942944).
В данном контексте эукариотической гиалуронидазой называют разнообразное семейство гликозаминогликан-эндоглюкозаминидаз, где остаток глутамата в гиалуронидазе гидролизует бета-1,4-связи гиалуронан- и хондроитинсульфатов посредством кислотного-основного каталитического механизма.
Особый интерес представляют растворимые нейтрально-активные гиалуронидазы или &НА8ЕСР млекопитающего, в том числе человека. Специалистам в этой области известно, что, обычно, замены отдельных аминокислот в заменимых районах полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, νηίδοη е1 а1., (1987) ΜοΚαιΕπ Βίοίοβν ο£ 1йе Семе. 41Н ΗάίΙίοη. ТНе Вещаιηίη/Οιιιηιηίηβδ РиЬ. ^., р. 224).
В данном контексте мембранозаякоренными §НА8ЕСР называют семейство мембранозаякоренных гиалуронидаз, которые имеют описанные здесь общие структурные признаки. Как описано и проиллюстрировано здесь, гиалуронидазы (т.е. гликозаминогликаназы, способные расщеплять гиалуронан, предпочтительно гликозаминогликаназы, проявляющие, по меньшей мере, некоторую активность в области нейтрального рН), которые обычно заякорены в мембране, могут быть превращены в растворимые НА8ЕСР, или &НА8ЕСР, удалением или модификацией иным образом одного или нескольких районов, которые ассоциированы с заякориванием гиалуронидазы в мембране.
В данном контексте растворимой гиалуронидазой называют полипептид, характеризующийся его растворимостью при физиологических условиях. Растворимые НА8ЕСР можно отличить, например, по их распределению в водной фазе раствора Тритона Х-114, нагретого до 37°С (Έογ^γ е! а1. 1 Вю1 СНет. 1981 РеЬ 25; 256 (4):1604-7). Заякоренные липидом НА8ЕСР, с другой стороны, будут распределяться в богатую детергентом фазу, но будут распределяться в бедную детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой С.
Таким образом, ссылка, например, на кНАЗЕСР включает в себя все гликопротеины, кодируемые семейством генов &НА8ЕСР, в том числе, но не только: &НА8ЕСР человека, &НА8ЕСР мыши или эквивалентная молекула, полученная из любого другого источника, или молекула, которая была получена синтетически, или молекула, которая проявляет такую же активность. Последовательности кодирующих молекул нуклеиновых кислот и кодируемые аминокислотные последовательности примерных &НА8ЕСР и/или их доменов представлены, например, в 8ЕО ΙΌ N0:4. Этот термин включает в себя также &НА8ЕСР с аминокислотными заменами, которые по существу не изменяют активность каждого члена, и также включает в себя их сплайсинговые варианты. Подходящие замены, в том числе, хотя и необязательно, консервативные замены аминокислот, известны специалистам в этой области и могут быть получены без элиминирования биологической активности, такой как каталитическая активность, полученной молекулы.
В данном контексте &НА8ЕСР, в каждом случае упоминания, включает в себя по меньшей мере один полипептид или любую комбинацию из полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:6, или последовательностью нуклеотидов, которая включает в себя нуклеотиды, которые кодируют аминокислоты 1-509 8Е0 ΙΌ N0:1; полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях низкой, средней или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:6; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-509 8Е0 ΙΌ N0:1; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, имеющих по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:1, или аминокислотами 1-448 8Е0 ΙΌ N0:4.
В частности, обеспечен полипептид &НА8ЕСР с доменами гиалуронидазы, показанный в 8Е0 ΙΌ N0:4. Этот полипептид является одноцепочечным или двухцепочечным полипептидом. Обеспечены также его меньшие части, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Домены гиалуронидазы из &НА8ЕСР варьируются по размеру и структуре, включающей в себя инсерции и делеции в поверхностных петлях. Таким образом, для целей этого изобретения, каталитический домен является частью &НА8ЕСР, определенного здесь, и он является гомологичным домену других гиалуронидаза-подобных по
- 18 011654 следовательностей, таких как ΗΥΑΕ1, ΗΥΑΕ2, ΗΥΑΕ3, которые были идентифицированы ранее; однако, не было известно, что выделенная одноцепочечная форма домена гиалуронидазы человека может функционировать в анализах ίη νίΐτο. Аспартатные и глутаматные остатки, необходимые для активности, присутствуют в консервативных мотивах.
В данном контексте «нейтральный домен гиалуронидазы растворимого &ΗΑ8ΕΟΡ» обозначает бета1,4-эндоглюкозаминидазный домен &ΗΑ8ΕΟΡ, который проявляет гиалуронидазную активность при нейтральном ρΗ, является растворимым в описанных условиях и имеет гомологию и общие структурные признаки с доменами семейства гиалуронидаза-гликозилгидролаз, но содержит дополнительные последовательности в карбоксиконце, которые требуются для нейтральной активности. Таким образом, он является по меньшей мере минимальной частью домена, который проявляет гиалуронидазную активность, как оценено стандартными анализами ίη νίΐτο, и остается растворимым. Здесь обсуждаются такие домены гиалуронидазы и их каталитически активные части. Обеспечены также укороченные формы домена гиалуронидазы, которые включают в себя его наименьший фрагмент, который действует каталитически в одноцепочечной форме. В данном контексте и в этой области, нейтральным или нейтрально-активным называют белок, проявляющий активность при нейтральном ρΗ (например, проявляющим активность при приблизительно ρΗ 7) и который, следовательно, является активным в диапазоне ρΗ, характерном для многих физиологических тканей. Как будет также понятно специалистам в этой области, белок обычно обнаруживает некоторый диапазон активности около его оптимального ρΗ. Оптимальный ρΗ нейтрально-активного белка будет обычно находиться в пределах одной-нескольких единиц ρΗ выше или ниже ρΗ 7, но его диапазон активности может простираться на протяжении многих единиц ρΗ.
Домен гуалуронидазы &ΗΑ8ΕΟΡ, в каждом случае упоминания, включает в себя по меньшей мере один или все или любую комбинацию или каталитически активную часть Ν-связанного полипептида гликопротеина, который включает в себя последовательность аминокислот, представленную в 8ΕΟ Ш N0:1; полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях низкой, средней или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, представленной в 8Ε0 Ш N0:6; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, представленную в 8Ε0 Ш N0:1; полипептида, который включает в себя последовательность аминокислот, имеющих по меньшей мере приблизительно 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот, представленной в 8Ε0 Ш N0:1; и/или домен гиалуронидазы полипептида, кодируемого сплайсинговым вариантом 5ΗΑ8ΕΟΡ.
Таким образом, для целей этого изобретения домен гиалуронидазы является частью 5ΗΑ8ΕΟΡ, определенной здесь, и является гомологичным домену других 5ΗΑ8ΕΟΡ. Как и в случае большего класса ферментов семейства гиалуронидаз, каталитические домены &ΗΑ8Ε0Ρ имеют высокую степень идентичности аминокислотной последовательности. Остатки Αφ и 01и, необходимые для активности, присутствуют в консервативных мотивах.
Под активной формой имеют в виду форму, активную ίη νίνο и/или ίη νίίτο. Как описано здесь, домен гиалуронидазы также может существовать в виде растворимого секретируемого гликопротеина. Здесь показано, что, по меньшей мере, ίη νίΐτο, одноцепочечные формы &ΗΑ8Ε0Ρ и их каталитические домены или ферментативно активные части (обычно С-концевые укорочения) проявляют гиалуронидазную активность. Таким образом, здесь обеспечены выделенные формы доменов гиалуронидазы &ΗΑ8Ε0Ρ и их применение в анализах скрининга лекарственных средств ίη νίίτο для идентификации агентов, которые модулируют их активность.
В данном контексте каталитически активным доменом &ΗΑ8Ε0Ρ называют домен нейтральноактивной эндогликозаминидазы, определенный по активности ίη νίίτο в отношении гликозаминогликана в качестве субстрата.
Представляющие интерес &ΗΑ8Ε0Ρ включают в себя &ΗΑ8Ε0Ρ, которые являются активными против хондроитинсульфатов и хондроитинсульфатпротеогликанов (ί'δΡΟ) ίη νίνο и ίη νίίτο; и &ΗΑ8Ε0Ρ, которые являются активными против гиалуронана. В этом контексте &ΗΑ8Ε0Ρ человека является &ΗΑ8Ε0Ρ, кодируемым нуклеиновой кислотой, такой как ДНК, присутствующей в геноме человека, включающей в себя все аллельные варианты и консервативные вариации, пока они не являются вариантами, обнаруживаемыми в других млекопитающих.
В данном контексте термин «нуклеиновая кислота, кодирующая домен гиалуронидазы или каталитически активную часть &ΗΑ8Ε0Ρ» должен пониматься как относящийся к нуклеиновой кислоте, кодирующей только указанный одноцепочечный домен гиалуронидазы или его активную часть, а не другие смежные часть &ΗΑ8Ε0Ρ в виде непрерывной последовательности.
В данном контексте «заболеванием» или «нарушением» называют патологическое состояние в организме, возникающее, например, в результате инфекции или генетического дефекта, и характеризующееся идентифицируемыми симптомами.
В данном контексте сплайсинговым вариантом называют вариант, производимый отличающимся процессингом первичного транскрипта геномной нуклеиновой кислоты, например, ДНК, который приводит к более чем одному типу мРНК. Здесь обеспечены сплайсинговые варианты &ΗΑ8Ε0Ρ.
В данном контексте доменом белка гиалуронидазы &ΗΑ8Ε0Ρ называют домен гиалуронидазы &ΗΑ
- 19 011654
БЕСР, который проявляет нейтральную эндоглюкозаминидазную активность. Таким образом, он является по меньшей мере минимальной частью белка, которая проявляет эндоглюкозаминидазную активность, оцениваемую стандартными анализами ίη νίίτο. Примеры доменов гиалуронидазы человека включают в себя по меньшей мере достаточную часть последовательностей аминокислот, представленную в БЕО Ш N0:4, для проявления эндоглюкозаминидазной активности.
Рассматриваются также молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, который имеет эндоглюкозаминидазную активность в анализе гиалуронидазы ίη νίίτο, и которые имеют по меньшей мере 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с полной длиной домена гиалуронидазы полипептида хНАБЕСР или которые гибридизуются вдоль их полной длины или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% полной длины с нуклеиновыми кислотами, которые кодируют домен гиалуронидазы, в частности, в условиях средней, обычно высокой, жесткости.
Например, для доменов гиалуронидазы РН20 остатки в Ν-концевом районе могут быть решающими, но еще не достаточными для активности. С использованием таких способов, какие описаны здесь, можно генерировать домены гиалуронидазы хНАБЕСР, которые являются каталитически активными. В качестве иллюстрации, в то время как домен гиалуронидазы РН20 человека требует Ν-концевых аминокислот для активности, С-концевая часть может быть укорочена до последнего остатка цистеина, но все еще требует дополнительных аминокислот для того, чтобы быть оптимально активной. Количество, которое может быть удалено, может быть определено эмпирически испытанием этого полипептида на гиалуронидазную активность в анализе ίη νίίτο, который оценивает каталитическое расщепление.
Таким образом, обсуждаются меньшие части доменов гиалуронидазы, в частности, их одноцепочечные домены, которые сохраняют гиалуронидазную активность. Такие меньшие версии обычно являются укороченными на С-конце версиями доменов гиалуронидазы. Домены гиалуронидазы варьируются по размеру и структуре, включающей в себя инсерции и делеции в поверхностных петлях. Такие домены обнаруживают консервативную структуру, включающую в себя по меньшей мере один структурный признак, такой как донор протона, и/или другие признаки доменов гиалуронидазы эндоглюкозаминидаз. Таким образом, для целей этого изобретения домен гиалуронидазы является одноцепочечной частью хНАБЕСР, как определено здесь, но является гомологичным по его структурным признакам и сохранению последовательности сходства или гомологии домена гиалуронидазы других гиалуронидазаподобных последовательностей. Этот гликопротеин проявляет гиалуронидазную активность в виде отдельной цепи.
В данном контексте термин «гомологичный» обозначает приблизительно большую чем 25% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, такую как 25, 40, 60, 70, 80, 90 или 95%. Если необходимо, будет указываться процентная гомология. Термины «гомология» и «идентичность» часто используются взаимозаменяемо. Обычно, последовательности сопоставляют таким образом, что получают совпадение наивысшего порядка (см., например, Сοтриίаί^οηа1 Μο^οπίατ Βίοίοβγ, Ьехк, А. М., еб., ОхГбтб ишуетхбу Ргехх, №\ν ΥοτΕ 1988; В^^триЕ^: 1п[огтаисх апб Сегюте Рго.)еЛх, Бтбк Ό. V., еб., Асабетгс Ргехх, №\ν Υοτίν 1993; ^трЩет Апа1ух1х οί Баепсе ОаЕт Ратк СпГЕп, А. М., апб Сг1ГГ1п, Н. С., ебх., Нитапа Ргехх, №\ν .Тетхеу, 1994; Бециепсе Апа1ух1х ш Μο^υΗτ Βίοίοβγ, νοη Нет)е, С., Асабетю Ргехх, 1987; и Бес.|иепсе Апа1ух1х Рптет, Οποίον, М апб Вегетеих, к, ебх., М 8ЮскЮп Ргехх, №\ν Υοτί, 1991; ί'ηπ11ο еί а1. (1988) Б1ат I АррЕеб Ма111 48: 1073).
По идентичности последовательности, количества консервативных аминокислот определяют при помощи стандартных программ алгоритмов сопоставления и используют штрафы за гэп по умолчанию, устанавливаемые каждым поставщиком. По существу, гомологичные молекулы нуклеиновых кислот обычно гибридизуются в условиях средней жесткости или в условиях высокой жесткости вдоль всей длины нуклеиновой кислоты или вдоль по меньшей мере приблизительно 70, 80 или 90% представляющей интерес полноразмерной нуклеиновой кислоты. Обсуждаются также молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующейся молекуле нуклеиновой кислоты.
Имеют ли любые две молекулы нуклеиновых кислот нуклеотидные последовательности, которые являются по меньшей мере, например, на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% «идентичными», может быть определено с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа ЕАБТА, использующая, например, параметры по умолчанию, описанные в Реат^п еί а1. (1988) Ргос. №111. Асаб. Бск ИБА 85: 2444 (другие программы включают в себя пакет программ ССС (^еνе^еиx, к, еί а1., №1с1ею Ас1бх Вехеатск 12: 387 (1984)), ВЬАБТР, ВЬАБТН ЕАБТА (АЕхсктб, Б. Е. й а1., I Μο1ес Вго1 215:403 (1990); Сшбе ίο Ниде ^тр^его, Матбп ί. Β^хкοр. |ЕЭ.| Асабеттс Ргехх, Бап Όιο^ο, 1994 и [САВ1ЕЬ0 еί а1.] (1988) Б1АМ ί АррЕеб Ма111 48: 1073). Например, функция ВЬАБТ базы данных Национального Центра Информации по Биотехнологии может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески или публично доступные программы включают в себя ^NАБТАВ МЕСАШС^1 РВ0СВАМ (Μаб^хοη, XVI) и программу Сар (Μаб^хοη XVI) Компьютерной Группы Генетики Висконсинского Университета (И^С). Процентная гомология или идентичность молекул белков и/или нуклеиновых кислот может быть определена, например, сравнением информации последовательности с использованием ком
- 20 011654 пьютерной программы САР. например, №еб1етап е! а1. (1970), ί Мо1 Вю1. 48: 443, обновленную 8тйЬ апб \Уа1егтап Абу. Арр1. Ма111 (1981) 2:482. Вкратце, программа САР определяет сходство как количество сопоставленных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее количество символов в более короткой из этих двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы САР могут включать в себя: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую величину 1 для идентичности и 0 для неидентичностей) и взвешенного сравнения СпЬккоу е! а1. (1986) №с1. АсДбк Век. 14: 6745, описанную 8с11\\'аг1х апб ИауйоГГ, ебк., А(1а< о£ Рго1ет 8ес.|иепсе апб 8!гис!иге, №1бопа1 В1отеб1са1 Векеагск Еоипбайоп, рр. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом гэпе; и (3) отсутствие штрафа для концевых гэпов. Таким образом, в данном контексте, термин «идентичность» представляет сравнение между тестируемым полипептидом или полинуклеотидом и ссылочным полипептидом или полинуклеотидом.
В данном контексте термин по меньшей мере «на 90% идентичная» относится к процентным идентичностям от 90 до 99,99 относительно ссылочных полипептидов. Идентичность на уровне 90% или более указывает на тот факт, что, предположим, с целью примера, сравнивают тестируемый и ссылочный полипептид с длиной 100 аминокислот. Не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в тестируемом полипептиде отличаются от аминокислот ссылочных полипептидов. Подобные сравнения могут быть произведены между тестируемым и ссылочным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точковых мутаций, распределенных на протяжении всей длины аминокислотной последовательности, или они могут быть в виде кластеров в одном или нескольких местоположениях варьирующейся длины до максимально позволяемой, например, различие 10/100 аминокислот (приблизительно 90% идентичность). Различия определяют как замены нуклеиновых кислот или аминокислот, или делеции. При уровне гомологий или идентичностей, более высоких, чем приблизительно 85-90%, этот результат должен быть независимым от программы и набора параметров гэпа; такие высокие уровни идентичности могут быть легко определены, часто без применения программного обеспечения.
В данном контексте праймером называют олигонуклеотид, содержащий два или более дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, обычно более чем три нуклеотида, от которых может быть инициирован синтез продукта удлинения праймера. Экспериментальные условия, благоприятные для синтеза, включают в себя присутствие нуклеозидтрифосфатов и агента полимеризации и удлинения, такого как ДНК-полимераза, и подходящие буфер, температуру и рН.
В данном контексте животные включают в себя любое животное, такое как, но не только, козы, коровы, олени, овцы, грызуны, свиньи и люди. Термин «животные, не являющиеся человеком» исключает человека в качестве рассматриваемого животного. Обеспеченные здесь &НА8ЕСР получены из любого источника, животного, растительного, прокариотического или грибного происхождения. Предпочтительные &НА8ЕСР происходят от животного, в том числе человека, и, более предпочтительно, происходят от человека в случае их применения в людях.
В данном контексте генетическая терапия (генотерапия) включает в себя перенос гетерологичной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в определенные клетки, клетки-мишени, млекопитающего, в частности, человека, с нарушением или состояниями, для которых ведется поиск такой терапии. Нуклеиновую кислоту, такую как ДНК, вводят в выбранные клетки-мишени таким образом, что эта гетерологичная нуклеиновая кислота, например, ДНК, экспрессируется, и образуется терапевтический продукт, кодируемый ею.
Альтернативно, гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может некоторым образом опосредовать экспрессию ДНК, которая кодирует этот терапевтический продукт, или она может кодировать продукт, например, пептид или РНК, который некоторым образом опосредует, прямо или косвенно, экспрессию терапевтического продукта. Генетическая терапия может быть также использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена, который вытесняет дефектный ген или дополняет продукт гена, продуцируемый млекопитающим или клеткой, в которые ее вводят. Введенная нуклеиновая кислота может кодировать терапевтическое соединение, такое как фактор роста или его ингибитор, или фактор некроза опухолей или его ингибитор, например, его рецептор, который в норме не продуцируется в млекопитающем-хозяине или который не продуцируется в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически приемлемое время. Эта гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, кодирующая этот терапевтический продукт, может быть модифицирована перед введением в клетки пораженного хозяина для увеличения или другим образом изменения этого продукта или его экспрессии. Генетическая терапия может также включать в себя доставку ингибитора или репрессора или другого модулятора экспрессии генов.
В данном контексте гетерологичной нуклеиновой кислотой является нуклеиновая кислота, которая кодирует белки (или, если она является ДНК, то она кодирует РНК, которая кодирует белки), которые в норме не продуцируются ίη у1уо клеткой, в которой она экспрессируется, или которая опосредует или кодирует медиаторы, которые изменяют экспрессию эндогенной нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, действием на транскрипцию, трансляцию или другие регулируемые биохимические процессы. Гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, может также называться чужеродной нуклеиновой кислотой, такой как ДНК. Любая нуклеиновая кислота, такая как ДНК, которая известна специалисту в этой
- 21 011654 области, и рассматривается им как гетерологичная или чужеродная для клетки, в которой она экспрессируется, считается здесь гетерологичной нуклеиновой кислотой; гетерологичная нуклеиновая кислота включает в себя экзогенно добавленную нуклеиновую кислоту, которая также экспрессируется эндогенно. Примеры гетерологичной нуклеиновой кислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, нуклеиновую кислоту, которая кодирует прослеживаемые маркерные белки, такие как белок, придающий устойчивость к лекарственному средству, нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтически эффективные вещества, такие как противораковые агенты, ферменты и гормоны, и нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК), которые опосредованно или непосредственно кодируют другие типы белков, такие как антитела. Антитела, которые кодируются гетерологичной нуклеиновой кислотой, могут быть секретируемыми или экспрессируемыми на поверхности клетки, в которую была введена гетерологичная нуклеиновая кислота.
Гетерологичная нуклеиновая кислота является обычно не эндогенной для клетки, в которую ее вводят, а была получена из другой клетки или получена синтетически.
Обычно, хотя и необязательно, такая нуклеиновая кислота кодирует РНК и/или белки, которые в норме не продуцируются клеткой, в которой она экспрессируется.
В данном контексте терапевтически эффективный продукт является продуктом, который кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, обычно ДНК, которая после введения этой нуклеиновой кислоты в хозяина экспрессирует продукт, который ослабляет или элиминирует симптомы, проявления наследственного или приобретенного заболевания или который излечивает это заболевание.
В данном контексте фраза, что гликопротеин состоит в основном из домена гиалуронидазы, означает, что только часть кНАЗЕОР этого полипептида является доменом гиалуронидазы или его каталитически активной частью. Этот полипептид может, необязательно, и обычно будет включать в себя происходящие не из кНАЗЕОР последовательности аминокислот.
В данном контексте доменом называют часть молекулы, например, гликопротеинов или кодирующих нуклеиновых кислот, которая структурно и/или функционально отличается от других частей этой молекулы.
В данном контексте гиалуронидаза является ферментом, катализирующим гидролиз гликозаминогликанов, в том числе гиалуронанов.
Для ясности, ссылка на гиалуронидазу относится ко всем формам, и конкретные формы будут особо обозначены. Для целей этого изобретения домен гиалуронидазы включает в себя мембраносвязанные и растворимые формы белка кНАЗЕОР.
В данном контексте нуклеиновые кислоты включают в себя ДНК, РНК и их аналоги, в том числе протеиннуклеиновые кислоты (ПРК) и их смесь. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. При упоминании зондов или праймеров, необязательно меченых детектируемой меткой, такой как флуоресцентный краситель или радиоактивная метка, обычно обсуждаются одноцепочечные молекулы. Такие молекулы имеют обычно такую длину, что их мишень является статистически уникальной, или имеют низкое число копий (обычно менее чем 5, в общем, менее чем 3) для зондирования или праймирования библиотеки. Как известно в этой области, обычно зонд или праймер содержит по меньшей мере 14, 16, 20 или 30 остатков смежной или почти смежной последовательности, комплементарной или идентичной представляющему интерес гену. Зонды и праймеры могут иметь длину 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов.
В данном контексте нуклеиновую кислоту, кодирующую фрагмент или часть кНАЗЕОР, называют нуклеиновой кислотой, кодирующей только указанный фрагмент или указанную часть кНАЗЕОР, а не другие смежные части этого кНАЗЕОР.
В данном контексте функциональное связывание гетерологичной нуклеиновой кислоты с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы, энхансеры, стопсайты транскрипции и трансляции и другие сигнальные последовательности, обозначают связь между такой нуклеиновой кислотой, например, ДНК, и такими последовательностями нуклеотидов. Например, функциональной связью гетерологичной ДНК с промотором является функциональная (и обычно физическая) связь между этой ДНК и этим промотором, так что транскрипция такой ДНК инициируется от промотора РНК-полимеразой, которая специфически узнает эту ДНК, связывается с ней и транскрибирует эту ДНК в рамке считывания. Таким образом, функционально или оперативно связанные обозначает функциональную связь нуклеиновой кислоты, например, ДНК, с регуляторными и эффекторными последовательностями нуклеотидов, такими как промоторы, энхансеры, стоп-сайты транскрипции и трансляции и другими сигнальными последовательностями. Для оптимизации экспрессии и/или транскрипции ш νίΙΐΌ может быть необходимым удаление, добавление или изменение 5'-нетранслируемых частей этих клонов для элиминирования лишних, потенциально неподходящих альтернативных кодонов инициации трансляции, т. е. стартовых кодонов или других последовательностей, которые препятствуют экспрессии или уменьшают экспрессию либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно, консенсусные сайты связывания рибосом (см., например, Кохак ί. Вю1. С1ет. 266: 19867-19870 (1991)) могут быть встроены непосредственно 5' (слева) от стартового кодона и могут усиливать экспрессию. Желательность (или необходимость) такой модификации может быть определена эмпирически.
- 22 011654
В данном контексте последовательность, комплементарная по меньшей мере части РНК, со ссылкой на антисмысловые олигонуклеотиды, означает последовательность, имеющую достаточную комплементарность, чтобы быть в состоянии гибридизоваться с этой РНК, обычно в условиях средней или высокой жесткости, с образованием стабильного дуплекса; в случае двухцепочечных антисмысловых нуклеиновых кислот κΗΑδΕΟΡ, одна цепь этой дуплексной ДНК (или бкЭНЛ) может быть испытана таким образом, или может быть анализировано образование триплекса. Способность гибридизоваться зависит от степени комплементарности и длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Обычно, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше ошибочных спариваний с кодирующей κΗΑδΕΟΡ ΡΗΚ она может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс, в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области может определить допустимую степень ошибочного спаривания с использованием стандартных процедур для определения точки плавления гибридизованного комплекса.
Для целей этого изобретения могут быть произведены аминокислотные замены в любом из κΗΑ8ΕΟΡ и доменов гиалуронидазы, при условии, что полученный белок проявляет гиалуронидазную активность. Рассматриваемые аминокислотные замены включают в себя консервативные замены, такие как замены, представленные в табл. 1, и другие модификации, которые не элиминируют протеолитическую активность. Как описано здесь, рассматриваются также замены, которые изменяют свойства этих белков, такие как удаление сайтов расщепления и других подобных сайтов, такие замены обычно являются неконсервативными, но могут быть легко выполнены специалистами в этой области.
Подходящие консервативные замены аминокислот известны специалистам в этой области и могут быть произведены обычно без элиминирования (и предпочтительно по существу без изменения) биологической активности, например, ферментативной активности, полученной молекулы. Специалистам в данной области известно, что обычно отдельные аминокислотные замены в заменимых районах полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, \Уа1коп с1 а1. Мо1еси1аг Βίо1оду о£ (Не Сепе, 4'1' Εάίίίοη, 1987, ТНе Вещатп/Сишттдк ΡιιΗ. Со., р. 224). В это определение включен также каталитически активный фрагмент κΗΑδΕΟΡ, в частности, одноцепочечная часть гиалуронидазы. Консервативные аминокислотные замены производят, например, в соответствии с заменами, представленными в табл. 1, следующим образом.
Таблица 1. Консервативная замена исходного остатка
А1а (А)
<31у; Зег, АЬи Агд (К) Ьуз, Огп Азп (Ν) <31п; Н1з Суз (С) Зег С1п
(0) Азп С1и (Е) Азр С1у (С) А1а; Рго Нхз (Н) Азп; С1п Не (I)
Ьеи; Уа1; Мек; Νΐε; ЦУа Ьеи (Ь) ; Уа1; Мек; И1е; №/а Ьуз (К)
Агд; <31п; <31и Мек (М) Ьеи; Туг; Не; Ν1Θ \Га1 Огп Ьуз; Агд РЬе
(Р) Мек; Ьеи; Туг Зег (3) ТЬг ТЬг (Т) Зег Тгр (И) Туг Туг (Υ)
Тгр; РЬе Уа1 (V) 11е; Ьеи; Мек; И1е; ВЫа.
Другие замены являются также пермиссивными и могут быть определены эмпирически или в соответствии с известными консервативными заменами.
В данном контексте ΑΕιι обозначает 2-аминомасляную кислоту; Ме обозначает норлеуцин, Жа обозначает норвалин; 0т обозначает орнитин. В данном контексте аминокислоты, которые встречаются в различных аминокислотных последовательностях, представленных здесь, идентифицируются в соответствии с их хорошо известными, трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды, которые встречаются в различных ДНК-фрагментах, обозначаются стандартными однобуквенными обозначениями, используемыми рутинным образом в этой области.
В данном контексте зонд или праймер, основанные на нуклеотидной последовательности, описанной здесь, включает в себя последовательность по меньшей мере 10, 14, обычно последовательность по меньшей мере 16 смежных нуклеотидов 8Ε0 ΙΌ N0:6 и даже более предпочтительно, последовательность по меньшей мере 20, 30, 50 или 100 смежных нуклеотидов 8Ε0 ΙΌ N0:6. Длина зонда или праймера для уникальной гибридизации зависит от сложности представляющего интерес генома.
В данном контексте ослаблением симптомов конкретного нарушения посредством введения конкретной фармацевтической композиции называют любое ослабление, независимо от того, является ли оно перманентным или временным, продолжительным или транзиторным, которое может быть приписано введению или ассоциировано с введением этой композиции.
В данном контексте антисмысловыми полинуклеотидами называют синтетические последовательности нуклеотидных оснований, комплементарные мРНК или смысловой цепи двухцепочечной ДНК. Смешивание смысловых и антисмысловых полинуклеотидов при подходящих условиях приводит к связыванию этих двух молекул, или гибридизации. Когда эти полинуклеотиды связываются с мРНК (гибридизуются с мРНК), происходит ингибирование синтеза белка (трансляции). Когда эти полинуклеотиды связываются с двухцепочечной ДНК, происходит ингибирование синтеза РНК (транскрипции).
Полученное ингибирование трансляции и/или транскрипции приводит к ингибированию синтеза
- 23 011654 белка, кодируемого смысловой цепью. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты обычно содержит достаточное число нуклеотидов для специфического связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью, обычно по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, часто по меньшей мере 14 или 16 или 30 смежных нуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, комплементарных кодирующей части молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует представляющий интерес ген, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечный домен гиалуронидазы &НА8ЕСР.
В данном контексте матрицей (массивом) называют собрание элементов, таких как антитела, содержащее три или более членов. Адресной матрицей является матрица, в которой члены этой матрицы являются идентифицируемыми, обычно по положению на твердофазном носителе. Таким образом, обычно члены этой матрицы иммобилизованы на дискретных идентифицируемых локусах на поверхности твердой фазы.
В данном контексте антителом называют иммуноглобулин, независимо от того, является ли он природным или частично или полностью полученным синтетически, в том числе любое его производное, которое сохраняет способность специфического связывания этого антитела. Таким образом, антитело включает в себя любой белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или по существу гомологичным иммуноглобулинсвязывающему домену. Антитела включают в себя члены любых классов иммуноглобулина, в том числе 1дС. 1дМ, 1дА, Ι§Ό и 1дЕ.
В данном контексте фрагмент антитела является любым производным антитела, которое является меньшим, чем полная длина антитела, сохраняющим по меньшей мере часть специфической связывающей способности полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, одноцепочечные Εν (8θΕν), Εν, άδΕν-диатела и Εά. Фрагмент может включать в себя множественные цепи, связанные вместе, например, при помощи дисульфидных мостиков. Фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот и обычно по меньшей мере 200 аминокислот.
В данном контексте Εν-фрагмент антитела состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи (νΗ) и одного вариабельного домена легкой цепи (УО, связанных нековалентными взаимодействиями.
В данном контексте άδΕν обозначает Εν со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью.
В данном контексте Ε(аЬ')2-фрагмент является фрагментом антитела, который происходит из расщепления иммуноглобулина пепсином при рН 4,0-4,5; он может быть экспрессирован рекомбинантно с получением эквивалентного фрагмента.
В данном контексте ΕаЬ-фрагменты являются фрагментами антител, которые происходят из расщепления иммуноглобулина папаином; они могут быть экспрессированы рекомбинантно с получением эквивалентного фрагмента.
В данном контексте 8сΕν обозначает фрагменты антител, которые содержат вариабельный домен легкой цепи (УД и вариабельный домен тяжелой цепи (νΗ), ковалентно соединенные полипептидным линкером в любом порядке. Этот линкер имеет такую длину, что эти два вариабельных домена соединяются мостиком без существенной интерференции. Включенными линкерами являются η остатков (С1у8ет) с несколькими остатками С1и или Ьуз, рассеянными по всей молекуле, для увеличения растворимости.
В данном контексте гуманизированными антителами называют антитела, которые модифицированы таким образом, что они включают в себя последовательности аминокислот человека, так что введение человеку не провоцирует иммунный ответ. Способы получения таких антител известны. Например, для получения таких антител гибридому или другую прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетка Е. сой или СНО, которая экспрессирует моноклональное антитело, изменяют способами рекомбинантных ДНК для экспрессии антитела, в котором аминокислотный состав невариабельного района основан на антителах человека. Созданы компьютерные программы для идентификации таких районов.
В данном контексте диателами являются димерные 8сΕν; диатела обычно имеют более короткие пептидные линкеры, чем 8сΕν, и они обычно димеризуются.
В данном контексте получение рекомбинантными способами при помощи способов рекомбинантных ДНК обозначает применение хорошо известных способов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированными ДНК.
В данном контексте термин оценка включает в себя количественное и качественное определение для получения абсолютной величины для активности 5НА8ЕОР или его домена, присутствующих в пробе, а также получения индекса, степени, процента, визуальной или другой величины, являющейся показателем уровня этой активности. Оценка может быть прямой или непрямой, и химические молекулярные частицы, фактически детектируемые, не должны быть, конечно, самим продуктом протеолиза, но могут быть, например, производным этого продукта или некоторым другим веществом.
В данном контексте биологической активностью называют активности ίη νί\Ό соединения или физиологические реакции, которые получают после введения ίη νί\Ό соединения, композиции или другой смеси. Таким образом, биологическая активность включает в себя терапевтические эффекты и фармацев
- 24 011654 тическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологические активности могут наблюдаться в системах ίη νίίτο, предназначенных для тестирования или использования таких активностей. Таким образом, для целей этого изобретения биологической активностью люциферазы является ее оксигеназная активность, посредством которой, после окисления субстрата, образуется свет.
В данном контексте термин функциональная активность относится к полипептиду или его части, которая проявляет одну или несколько активностей, ассоциированных с полноразмерным белком.
Функциональные активности включают в себя, но не ограничиваются ими, биологическую активность, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связываться или конкурировать с полипептидом за связывание с антителом против полипептида), иммуногенность, способность образовывать мультимеры, способность специфически связываться с рецептором или лигандом этого полипептида.
В данном контексте конъюгатом называют обеспеченные здесь соединения, которые включают в себя один или несколько НА8ЕОР, в том числе 5НА8ЕОР, в частности, его одноцепочечные домены, и один или несколько нацеливающих агентов. Эти конъюгаты включают в себя конъюгаты, полученные химическими способами, такими как химическое связывание, например, посредством связывания с сульфгидрильными группами, и конъюгаты, полученные любым другим способом, посредством которого по меньшей мере один &НА8ЕОР или его домен связывается прямо или опосредованно через линкер (линкеры) с нацеливающим агентом.
В данном контексте нацеливающим агентом является любая часть молекулы, такая как белок или его эффективная часть, которые обеспечивают специфическое связывание этого конъюгата с рецептором клеточной поверхности, который интернализует этот конъюгат или его кНАБЕОР-часть. Нацеливающим агентом может также быть агент, который активирует или облегчает, например, аффинное выделение или очистку этого конъюгата; присоединение этого конъюгата к поверхности или детектирование этого конъюгата или комплексов, содержащих этот конъюгат.
В данном контексте конъюгатом антитела называют конъюгат, в котором нацеливающим агентом является антитело.
В данном контексте производное или аналог молекулы является частью, произведенной из этой молекулы или модифицированной версией этой молекулы.
В данном контексте эффективным количеством соединения для лечения конкретного заболевания является количество, которое является достаточным для улучшения симптомов или в некоторой степени уменьшения симптомов, связанных с этим заболеванием. Такое количество может быть введено в единственной дозе или может быть введено в соответствии со схемой введения, при которой оно является эффективным. Это количество может лечить это заболевание, но обычно его вводят для улучшения симптомов этого заболевания. Для достижения желаемого улучшения симптомов может быть необходимым повторяемое введение.
В данном контексте термин «эквивалентные» при ссылке на две последовательности нуклеиновых кислот обозначает, что эти две рассматриваемые последовательности кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность или эквивалентные белки. При использовании этого термина в отношении двух белков или пептидов он означает, что эти два белка или пептида имеют по существу одно и ту же аминокислотную последовательность, имеющую только аминокислотные замены (такие как, но не только, консервативные замены, такие как представленные в табл. 1 выше), которые по существу не изменяют активность или функцию этого белка или пептида. Когда термин «эквивалентные» относится к свойствам, это свойство не должно присутствовать в той же самой степени (например, два пептида могут проявлять разные скорости одного и того же типа ферментативной активности), но эти активности обычно являются по существу одинаковыми. Термин «комплементарные», при ссылке на две нуклеотидные последовательности, означает, что эти две последовательности нуклеотидов способны гибридизоваться, обычно с менее чем 25, 15, 5 или 0% ошибочных спариваний между противостоящими нуклеотидами. Если необходимо, будет указываться процент комплементарности. Обычно эти две молекулы выбирают таким образом, что они будут гибридизоваться в условиях высокой жесткости.
В данном контексте агент, который модулирует активность белка или экспрессии гена или нуклеиновой кислоты, либо уменьшает, либо увеличивает или другим образом изменяет активность этого белка или, каким-либо образом, повышает или понижает или другим образом изменяет экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетке.
В данном контексте ингибитор активности &НА8ЕОР включает в себя любое вещество, которое препятствует продуцированию, посттрансляционной модификации (посттрансляционным модификациям), созреванию или мембранной локализации 5НА8ЕОР или уменьшает эти процессы, или любое вещество, которое препятствует протеолитической эффективности или уменьшает протеолитическую эффективность &НА8ЕОР, в частности, одноцепочечной формы, в анализе-скрининге ίη νίίτο.
В данном контексте способ лечения или предупреждения неопластического заболевания означает, что любые из его симптомов, такие как опухоль, ее метастазирование, васкуляризация опухолей или другие параметры, которыми характеризуется это заболевание, уменьшаются, улучшаются, предотвращаются, переходят в состояние ремиссии или поддерживаются в состоянии ремиссии. Это означает также, что
- 25 011654 отличительные признаки неопластического заболевания и метастазирование могут быть элиминированы, уменьшены или предупреждены этим лечением. Неограничивающие примеры этих отличительных признаков заболевания включают в себя неконтролируемое разрушение базальной мембраны и проксимального внеклеточного матрикса, миграцию, деление и организацию эндотелиальных клеток в новые функционирующие капилляры и персистирование таких функционирующих капилляров.
В данном контексте фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или другие производные этих конъюгатов включают в себя любые соли, сложные эфиры или производные, которые могут быть легко получены специалистами в этой области с использованием известных способов для такой дериватизации и которые дают соединения, которые могут вводиться животным или людям без существенных токсических эффектов и которые являются фармацевтически активными или являются пролекарствами.
В данном контексте пролекарством является соединение, которое, после введения ίη νίνο, метаболизируется или другим образом превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически активную форму этого соединения. Для получения пролекарства фармацевтически активное соединение модифицируют таким образом, что это активное соединение регенерируется метаболическими процессами. Это пролекарство может быть предназначено для изменения метаболической стабильности или характеристик транспорта лекарственного средства, для маскирования побочных действий или токсичности, для улучшения вкуса лекарственного средства или для изменения других характеристик или свойств лекарственного средства. Благодаря знанию фармакологических процессов и метаболизма лекарственного средства ίη νίνο, специалисты в этой области, как только фармацевтически активное соединение идентифицировано, могут создавать пролекарства этого соединения (см., например, Ыодгайу (1985) Мей1С1па1 СБешИйу, А Вюсйетюа1 Арргоасй, ОхГогй ишуегкйу Ргекк, Νο\ν Уогк, радек 388-392).
В данном контексте лекарственным средством, идентифицированным способами скрининга, обеспеченными здесь, называют любое соединение, которое является кандидатом для применения в качестве терапевтического средства или в качестве соединения-примера для создания терапевтического средства. Такими соединениями могут быть малые молекулы, в том числе малые органические молекулы, пептиды, миметики пептидов, антисмысловые молекулы или йкКНА. (двухцепочечные РНК), такие как κίΡΝΛ (малые интерферирующие РНК), антитела, фрагменты антител, рекомбинантные антитела и другие подобные соединения, которые могут служить в качестве кандидатов лекарственных средств или соединений-примеров.
В данном контексте пептидомиметиком является соединение, которое имитирует конформацию и некоторые стереохимические признаки биологически активной формы конкретного пептида. Обычно, пептидомиметики создают для имитации некоторых желаемых свойств соединения, но без нежелательных свойств, таких как пластичность, которые приводят к потере биологически активной конформации и разрыву связей. Пептидомиметики могут быть получены из биологически активных соединений заменой определенных групп или связей, которые способствуют нежелательным свойствам, биоизостерами. Биоизостеры известны специалистам в этой области. Например, биоизостер метилена СН28 был использован в качестве замены амида в аналогах энкефалина (см., например, 8раЮ1а (1983) рр. 267-357 ίη С11ет1кПу апй Вюсйетщйу оГ Атто Ас1йк, РерИйек, анй Рго1етк, ХУеМет, Ей. №1ите 7, Магсе1 Эеккег, №\ν Уогк). Морфин, который может вводиться перорально, является соединением, которое является пептидомиметиком пептида эндорфина. Для целей этого изобретения среди пептидомиметиков включены циклические пептиды.
В данном контексте промоторным районом или промоторным элементом называют сегмент ДНК или РНК, который регулирует транскрипцию ДНК или РНК, с которой он функционально связан. Этот промоторный район включает в себя специфические последовательности, которые являются достаточными для узнавания РНК-полимеразой, связывания и инициации транскрипции.
Часть этого промоторного района называют промотором. Кроме того, промоторный район включает в себя последовательности, которые модулируют узнавание, связывание и активность инициации транскрипции РНК-полимеразы. Эти последовательности могут быть цис-действующими или могут быть чувствительными к транс-действующим факторам. Промоторы, в зависимости от природы их регуляции, могут быть консервативными или регулируемыми. Примеры промоторов, рассматриваемых для применения в прокариотах, включают в себя промоторы бактериофагов Т7 и Т3.
В данном контексте рецептором называют молекулу, которая имеет аффинность в отношении конкретного лиганда. Рецепторы могут быть природными или синтетическими молекулами. Рецепторы могут также называться в данной области антилигандами. В данном контексте термины рецептор и антилиганд являются взаимозаменяемыми. Рецепторы могут быть использованы в их неизмененном состоянии или в виде агрегатов с другими молекулярными частицами. Рецепторы могут быть соединены, ковалентно или нековалентно, или находиться в физическом контакте, со связывающим членом, прямо или опосредованно через вещество специфического связывания или линкер. Примеры рецепторов включают в себя, но не ограничиваются ими: антитела, рецепторы клеточной мембраны, поверхностные рецепторы и интернализующие рецепторы, моноклональные антитела и антисыворотки, реактивные со специфическими антигенными детерминантами, например, на вирусах, клетках или других материалах, лекарственными средствами, полинуклеотидами, нуклеиновыми кислотами, пептидами, факторами, лектинами,
- 26 011654 сахарами, полисахаридами, клетками, клеточными мембранами и органеллами.
Примеры рецепторов и применений с использованием таких рецепторов включают в себя, но не ограничиваются ими: а) ферменты: белки или ферменты специфического транспорта, важные для выживания микроорганизмов, которые могут служить в качестве мишеней для отбора антибиотиков [лигандов]; Ь) антитела: может быть исследована идентификация лигандсвязывающего сайта на молекуле антитела, который объединяется с эпитопом представляющего интерес антигена; определение последовательности, которая имитирует антигенный эпитоп, может привести к развитию вакцин, причем их иммуноген основан на одной или нескольких из таких последовательностей, или привести к развитию родственных диагностических агентов или соединений, применимых в терапевтических способов лечения, например, для аутоиммунных заболеваний; с) нуклеиновые кислоты: идентификация лиганда, такого как белок или РНК, сайтов связывания; б) каталитические полипептиды: полимеры, в том числе полипептиды, которые способны активировать химическую реакцию, участвующую в превращении одного или нескольких реагирующих веществ в один или несколько продуктов; указанные полипептиды обычно включают в себя сайт связывания, специфический в отношении по меньшей мере одного реагирующего вещества или промежуточного продукта, и активную функциональную группу вблизи этого сайта связывания, причем эта функциональная группа способна химически модифицировать связанное реагирующее вещество (см., например, патент США № 5215899); е) рецепторы гормонов: определение лигандов, которые связываются с высокой аффинностью с рецептором, применимо в развитии гормональных заместительных терапий; например, идентификация лигандов, которые связываются с такими рецепторами, может привести к развитию лекарственных средств для регуляции кровяного давления; и ί) опиатные рецепторы: определение лигандов, которые связываются с опиатными рецепторами в головном мозгу, применимо в развитии вызывающих меньшее привыкание заменителей морфина и родственных лекарственных средств.
В данном контексте пробой называют все, что может содержать аналит, который желательно подвергнуть анализу. Этой пробой может быть биологическая проба, такая как биологическая проба или биологическая ткань. Примеры биологических жидкостей включают в себя мочу, кровь, плазму, сыворотку, слюну, семенную жидкость, мокроту, цереброспинальную жидкость, слезы, слизь, сперму, амниотическую жидкость или т.п. Биологические ткани являются агрегатами клеток, обычно конкретного типа, вместе с их межклеточным веществом, которые образуют один из структурных материалов структуры человека, животного, растения, бактериальной, грибной или вирусной структуры, в том числе соединительную ткань, эпителий, мышечную и нервную ткани.
Примеры биологических тканей включают в себя также органы, опухоли, лимфатические узлы, артерии и отдельные клетки.
В данном контексте условия жесткости гибридизации в определении процента ошибочных спариваний являются следующими: 1) условия высокой жесткости: 0,1х8§рЕ, 0,1% ДСН, 65°С; 2) условия средней жесткости: 0,2х8§рЕ, 0,1% ДСН, 50°С; 3) условия низкой жесткости: 1,0х8§рЕ, 0,1% ДСН, 50°С. Специалистам в этой области известно, что эта стадия промывания производит отбор на стабильные гибриды, в также им известны ингредиенты 8§рЕ (см., например, 8атЬгоок, I., Ргйксй, Е.Р. апб Матабк, Т. ίη: Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б кргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, 1989, νοί 3, р. В. 13, см. также многочисленные каталоги, которые описывают обычно используемые лабораторные растворы). 8§рЕ является забуференным фосфатом рН 7,4 0,18 ? ЫаС1. Кроме того, специалистам в данной области известно, что стабильность гибридов определяется ТтТ, которая является функцией концентрации иона натрия и температуры (Тт=81,5°С-16,6+0,41(%6+С)-600/л), так что единственными параметрами в условиях промывки, решающими для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в 8§рЕ (или 88С) и температура.
Понятно, что эквивалентные условия жесткости могут быть достигнуты с использованием других буферов, солей и температур. В качестве примера, но не ограничения, процедуры, использующие условия низкой жесткости, являются следующими (см. также 811бо апб ХУетЬегд, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 78: 6789-6792 (1981)): фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 40°С в растворе, содержащем 35% формамид, 5Х 88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,1% Рур, 0,1% Фиколл, 1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. (10х) 88С обозначает 1,5 М хлорид натрия и 0,15 М цитрат натрия, доведенные до рН 7.
Гибридизации проводят в том же самом растворе со следующими модификациями: 0,02% РУГ, 0,02% Фиколл, 0,2% БСА, 100 νθ/М ДНК спермы, 10% (мас./об.) декстрансульфат и используют 520х106 имп/мин 32Р-меченого зонда. Фильтры инкубируют в смеси для гибридизации в течение 18-20 ч при 40°С и затем промывают в течение 1,5 ч при 55°С в растворе, содержащем 2Х 88С, 25 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1 % ДСН. Этот промывочный раствор заменяют свежим раствором и инкубируют дополнительно в течение 1,5 ч при 60°С. Фильтры блоттируют досуха и экспонируют для авторадиографии. Если необходимо, фильтры промывают в третий раз при 65-68°С и повторно экспонируют на пленке. Другие условия низкой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области, например, условия, используемые для перекрестно-видовых гибридизаций.
В качестве примера, но не для ограничения, процедуры, использующие условия средней жесткости,
- 27 011654 включают в себя, например, но не только, процедуры, использующие такие условия средней жесткости, которые являются следующими: фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 55°С в растворе, содержащем 6Х ББС, 5Х раствор Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизации проводят в том же самом растворе и используют 5-20х106 имп/мин 32Рмеченого зонда. Фильтры инкубируют в смеси для гибридизации в течение 18-20 ч при 55°С и затем промывают дважды в течение 30 мин при 60°С в растворе, содержащем 1Х ББС и 0,1% ДСН. Фильтры блоттируют досуха и экспонируют для авторадиографии. Другие условия средней жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области. Промывку фильтров выполняют при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2Х ББС, 0,1% ДСН.
В качестве примера и не для ограничения, процедуры, использующие условия высокой жесткости, являются следующими: предгибридизацию фильтров, содержащих ДНК, проводят в течение 8 ч - в течение ночи при 65°С в буфере, состоящем из 6Х ББС, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% РУР, 0,02% Фиколл, 0,02% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтры гибридизуют в течение 48 ч при 65°С в предгибридизационной смеси, содержащей 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 5-20х106 имп/мин 32Р-меченого зонда. Промывку фильтров выполняют при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2Х ББС, 0,01% РУР, 0,01% Фиколл и 0,01% БСА. Затем следует промывка в 0,1Х ББС при 50°С в течение 45 мин перед авторадиографией. Другие условия высокой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в этой области.
Термин «по существу идентичные или по существу гомологичные или сходные» варьируется в зависимости от контекста, как понятно специалистам в этой области, и обычно обозначает по меньшей мере 60 или 70%, предпочтительно обозначает по меньшей мере 30, 85% или более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность.
В данном контексте термин «по существу идентичный относительно продукта» обозначает достаточно сходный, так что представляющее интерес свойство является достаточно неизмененным, так что по существу идентичный продукт может быть использован вместо этого продукта.
В данном контексте термин «по существу чистое» обозначает вещество, достаточно гомогенное, чтобы быть свободным от легко детектируемых примесей, как определено стандартными способами анализа, такими как тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ), используемые специалистами в этой области для оценки такой чистоты, или достаточно чистое, так что дополнительная очистка не могла бы детектируемо изменить физические и химические свойства, такие как ферментативные и биологические активности, этого вещества. Способы очистки этих соединений для получения по существу чистых соединений известны специалистам в этой области. Однако по существу химически чистые соединения могут быть, например, смесью стереоизомеров или изомеров. В таких случаях, дополнительная очистка может увеличивать удельную активность этого соединения.
В данном контексте клеткой-мишенью называют клетку, которая экспрессирует 8НАБЕСР (в связи с получением 8НАБЕСР, описанным здесь), или клетку, которая является мишенью 8НАБЕСР или совместно приготовленного или совместно вводимого агента ίπ у1уо (в связи с использованием 8НАБЕСР для активации доставки фармакологических и других агентов в клетки-мишени, как описано здесь).
В данном контексте тест-веществом (или тест-соединением) называют химически определенные соединения (например, органические молекулы, неорганические молекулы, органические/неорганические молекулы, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, липиды, полисахариды, сахариды или гибриды между этими молекулами, такие как гликопротеины, и т.д.) или смеси соединений (например, библиотеку тест-соединений, природные экстракты или культуральные супернатанты, и т.д.), действие которых на 8НАБЕСР, в частности, на одноцепочечную форму, которая включает в себя домен гиалуронидазы или его часть, достаточную для активности, определяют способом ш уйго, таким как обеспеченные здесь анализы.
В данном контексте термины «терапевтический агент», «схема лечения», «радиотерапевтический агент» или «химиотерапевтический агент» обозначают общепринятые лекарственные средства и лекарственные терапии, включающие в себя вакцины, которые известны специалистам в этой области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в данной области.
В данном контексте терапия обозначает любой способ, в котором симптомы состояния, нарушения или заболевания улучшаются или выгодно изменяются другим образом.
Терапия включает в себя также любое фармацевтическое применение описанных здесь композиций.
В данном контексте вектором (или плазмидой) называют дискретные элементы, которые применяют для введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки либо для их экспрессии, либо для их репликации. Векторы обычно остаются эписомными, но могут быть сконструированы для выполнения интеграции гена или его части в хромосому генома. Обсуждаются также векторы, которые являются искусственными хромосомами, такие как дрожжевые искусственные хромосомы и искусственные хромосомы млекопитающих. Селекция и применение таких векторов хорошо известны специалистам в данной области. Термин экспрессирующий вектор включает в себя векторы, способный экспрессировать ДНК,
- 28 011654 которая функционально связана с регуляторными последовательностями, такими как промоторные районы, которые способны выполнять экспрессию таких ДНК-фрагментов. Таким образом, экспрессирующим вектором называют рекомбинантную конструкцию ДНК или РНК, такую как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, который после введения в подходящую клетку-хозяина приводит к экспрессии этой клонированной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя векторы, которые являются реплицируемыми в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках и которые остаются эписомными или которые интегрируются в геном клетки-хозяина.
В данном контексте белоксвязывающей последовательностью называют последовательность белка или пептида, которая способна специфически связываться с другими последовательностями белка или пептида, обычно с набором последовательностей белков и пептидов или с конкретной последовательностью белка или пептида.
В данном контексте эпитопной меткой (тэгом) называют короткий отрезок аминокислотных остатков, соответствующий эпитопу, для облегчения последующего биохимического и иммунологического анализа меченого эпитопом белка или пептида. Эпитопное мечение достигается включением последовательности эпитопной метки в протеинкодирующую последовательность в подходящем экспрессирующем векторе. Меченые эпитопом белки могут быть аффинно очищены с использованием высокоочищенных антител, индуцированных против этих меток (тэгов).
В данном контексте металлсвязывающей последовательностью называют последовательность белка или пептида, которая способна специфически связываться с ионами металлов, обычно с набором ионов металлов или с конкретным ионом металла.
В данном контексте комбинацией называют любую ассоциацию между двумя или большим количеством компонентов.
В данном контексте текучей средой называют любую композицию, которая может течь. Таким образом, термин текучие среды включает в себя композиции, которые находятся в форме полутвердых веществ, паст, растворов, водных смесей, гелей, лосьонов, кремов и других подобных соединений.
В данном контексте клеточным экстрактом называют препарат или фракцию, которая приготовлена из лизированной или разрушенной клетки.
В данном контексте говорят, что агент выбран случайным образом, когда этот агент выбран случайным образом без учета конкретных последовательностей, участвующих в ассоциации одного белка или белка с ассоциированными субстратами, партнерами связывания и т. д. Примером выбранных случайным образом агентов является использование химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки или бульона для выращивания организма или кондиционированной среды.
В данном контексте говорят, что агент является логически выбранным или сконструированным, когда этот агент выбран не на случайной основе, которая учитывает последовательность сайта-мишени и/или его конформацию в связи с действием этого агента. Как описано в примерах, предложены сайты связывания для гиалуронидазы и (каталитические) сайты в гликопротеине, имеющем 8ЕЦ ΙΌ N0:1 или 8ЕЦ ΙΌ N0:4. Агенты могут быть логически выбраны или логически сконструированы с использованием пептидных последовательностей, которые образуют эти сайты. Например, логически выбранным пептидным агентом может быть пептид, аминокислотная последовательность которого идентична сайтам связывания или доменам АТФ или кальмодулина.
Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, независимо от того, является или не является сахарид на этом редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с общепринятой номенклатурой, олигосахариды обозначены здесь с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные здесь олигосахариды описаны названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Са1), за которой следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), кольцевая связь, положение в кольце редуцирующего сахарида, участвующего в этой связи, и затем название или аббревиатура редуцирующего сахарида (например, С1сNАс). Связь между двумя сахарами может быть выражена, например, как 2,3, 2. ίν баг\\'.3. или (2,3). Каждый сахарид является пиранозой.
В данном контексте Ν-связанной сахарной частью называют олигосахарид, присоединенный к зНА8ЕСР через амидный азот остатков Азп. Ν-связанные олигосахариды делятся на несколько основных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфатированные), все из которых имеют (Мап) 3С1сNАс-С1сNАс-кора, присоединенные через амидный азот остатков Азп, которые находятся в пределах -Азп-Хаа-Тйг/8ег-последовательностей (где Хаа не является Рго). Ν-связанные сайты часто определяют непрямым путем по появлению «холостого» цикла во время секвенирования. Положительная идентификация может быть выполнена после высвобождения олигосахарида при помощи ΡNСазе Р, которая превращает гликозилированный Азп в Азр. После высвобождения при помощи фермента ΡNСазе Р, Νсвязанные олигосахариды могут быть очищены с использованием Вю-Се1 Р-6-хроматографии, причем пул олигосахаридов подвергают препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (НРАЕС) (Тоνηзеηб е! а1., (1989) Апа1. Вюсйет. 182, 1-8). Некоторые изомеры олигосахаридов могут быть разделены с использованием НРАЕС. Фукозные остатки будут смещать положения элюции в сто
- 29 011654 рону более ранней элюции в хроматограмме НРАЕС, тогда как дополнительные остатки сиаловой кислоты будут увеличивать время удерживания. Конкурентная обработка гликопротеинов, структуры олигосахаридов которых известны (например, бычий фетуин, а-1 кислотный гликопротеин, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) могут облегчать расшифровку (соотнесение) олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды могут быть охарактеризованы комбинацией анализов состава и анализов метилированных связей (\Уаед11е е! а1., (1983) СагЬоНубг Кек. 123, 281-304), причем аномерные конфигурации определяют ЯМР-спектроскопией (Уап На1Ьеек (1993) ίη Мебюбк Еп/ушо1 230).
Альтернативно, олигосахариды могут быть идентифицированы электрофорезом углеводов с использованием флуоресценции (РАСЕ) С’а11е\уаег1 е! а1. (2001) О1усоЬю1оду 11, 275-281.
В данном контексте термин «сиаловая кислота» относится к любому члену семейства 9-углеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее обычным членом семейства сиаловых кислот является Νацетилнейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидеокси-О-глицеро-О-галактононулопираноз-1оновая кислота (часто сокращаемая как №и5Ас, №иАс или NАNА)). Вторым членом этого семейства является Ν-гликолилнейраминовая кислота (№и5Ос или №иОс), в которой Ν-ацетильная группа №иАс является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3деоксинонулосоновая кислота (ΚΌΝ) (№бапо е! а1. (1986) I. Вю1. СНет. 261: 11550-11557; Капатоп е! а1. (1990) I. Вю1. СНет. 265: 21811-21819). В это семейство включены также 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-С.киЬ.1 - С.киЬ.6 ацил-Ыеи5Ас, такие как 9-О-лактил-Ыеи5Ас или 9-О-ацетил-Ыеи5Ас, 9-деокси-9-фтор-Ыеи5Ас и 9-азидо-9-деокси-Ыеи5Ас. В отношении обзора семейства сиаловых кислот см., например, Уабл (1992) О1усоЬю1оду 2: 25-40; 81абс Ас1бк: СбетЦбу, Ме!аЬо11кт апб Рипсбоп, К. 8сбаиег, Еб. (8р^^ηде^-Vе^1ад, Ν.Υ. (1992). Синтез и применение производных сиаловых кислот в процедуре сиалирования описаны в Международной заявке \УО 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г.
В данном контексте РХСаке (ПНГаза) обозначает специфическую в отношении пептида аспарагина Ν-гликозидазу Р, такую как пептид-Ы-гликозидаза Р Р1ауоЬас!епит ташпдокерШт. ПНГазные ферменты характеризуются их специфичностью в отношении Ν-связанных, а не О-связанных олигосахаридов. Характеристика ПНГазной эффективности может быть выполнена при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза или электрофореза углеводов с использованием флуоресценции.
В данном контексте термин «по существу терминированное сиалирование» относится к Νсвязанным олигосахаридам, терминирующимся остатком сиаловой кислоты, в качестве терминального (конечного) сахара. Терминальные сиаловые кислоты могут быть идентифицированы анализом РАСЕ высвобожденных углеводов после обработки нейраминидазой.
Время пребывания в кровотоке гликопротеинов в крови в высокой степени зависит от состава и структуры их Ν-связанных углеводных групп. Этот факт имеет прямое отношение к терапевтическим гликопротеинам, которые предназначены для парентерального введения. Обычно, максимальный полупериод существования в кровотоке гликопротеина требует, чтобы его Ν-связанные углеводные группы заканчивались последовательностью NеиАс-Оа1-О1сNАс. Без терминальной сиаловой кислоты (№иАс) гликопротеин быстро выводится из крови при помощи механизма узнавания лежащих в его основе остатков Ν-ацетилгалактозамина (ОаШАс) или галактозы (Оа1) (ОоосНее е! а1. (1991) Вю1/Тесбпо1оду 9: 1347-1355). По этой причине, гарантия присутствия терминальной сиаловой кислоты на Ν-связанных углеводных группах терапевтических гликопротеинов является важным моментом, который должен учитываться, для их коммерческого развития.
Циркулирующие гликопротеины подвергают действию сиалидазы (или нейраминидазы), которая удаляет терминальные (концевые) остатки сиаловых кислот. Обычно удаление сиаловой кислоты обнажает галактозные остатки, и эти остатки узнаются и связываются галактоза-специфическими рецепторами в гепатоцитах (обзор в Ак11\уе11 апб НагГогб (1982) Апп. Κν. Вюсбет. 51:531). Печень содержит также другие сахарспецифические рецепторы, которые опосредуют удаление гликопротеинов из кровотока. Такие рецепторы включают в себя рецепторы, специфические в отношении Ν-ацетилглюкозамина, маннозы, фукозы и фосфоманнозы. Гликопротеины, выводимые галактозными рецепторами гепатоцитов, подвергаются существенному расщеплению и затем поступают в желчь; гликопротеины, выводимые рецептором маннозы в клетках Купффера, поступают в ретикулоэндотелиальную систему (обзор в АкНхуеН апб НагГогб (1982) Апп. Κν. Вюсбет. 51:53).
В данном контексте нейтрально-активным называют гликопротеин &НА8ЕОР с каталитической активностью в отношении гликозаминогликанового субстрата ш νίΙΐΌ при рН 5-8 в условиях соли, меньшей чем 150 мМ, и буферящей силы, меньшей чем 50 мМ.
В данном контексте стабилизированным раствором называют &НА8ЕОР, который сохраняет более чем 60% его начальной активности после хранения при комнатной температуре в течение 30 дней.
В данном контексте, если нет другого указания, единица выражена в уменьшающих мутность единицах (ТКИ). Одна ТКИ определена как величина гиалуронидазной активности, необходимая для уменьшения мутности подкисленного раствора гуалуроновой кислоты и эквивалентна единицам (ΝΡυ) И.8.Р. через кривую стандартов образца гиалуронидазы/№11юпа1 Рогти1агу (ΝΡ XIII). ЕЫ8А-подобный ферментный анализ, описанный здесь, относят к единице ТКи, ΝΡυ и и.8.Р. (например, и8Р или \УНО стандарт), стандартизованной через Фармакопею США (и.8.Р.). Таким образом, активности этого фер
- 30 011654 мента, определенные ЕЫЗА-подобным ферментным анализом, является фактически относительными ТКИ, так как активность фермента фактически не измеряются с использованием турбидиметрического анализа (ЭогГтап е! а1., 1948, ί. ΒίοΙ. СНет. 172:367).
В данном контексте активность определяется количеством белка вНАЗЕОР, требующимся для разрушения субстрата ίη νίίτο, на основе уменьшающей мутность единицы или относительной уменьшающей мутность единицы.
В данном контексте удельной активностью называют единицы активности на мг белка. Количество белка вНАЗЕОР определяют по поглощению раствора вНАЗЕОР при 280 нм при принятии коэффициента молярной экстракции приблизительно 1,7, в единицах М-1 см-1.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) широко используется в биоматериалах, биотехнологии и медицине, прежде всего потому, что ПЭГ является биосовместимым, нетоксичным, неиммуногенным и водорастворимым полимером (Ζΐιαο апй Натв, АСЗ Зутровшт Зепев 680: 458-72, 1997). В области доставки лекарственных средств производные ПЭГ широко использовались в ковалентном присоединении (т.е. «ПЭГилировании») к белкам для уменьшания иммуногенности, протеолиза и почечного клиренса и для повышения растворимости ^аНрвку, Айт. Эгид Эе1. Кет. 16:157-82, 1995). Подобным образом, ПЭГ присоединяли к низкомолекулярным, относительно гидрофобным лекарственным средствам для увеличения растворимости, уменьшения токсичности и изменения биораспределения. Обычно, ПЕГилированные лекарственные средства инъецируют в виде растворов.
Близким применением является синтез сшитых деградируемых ПЭГ-сетчатых структур или композиций для использования в доставке лекарственных средств, так как большое количество одних и тех же химических способов, используемых в конструировании деградируемых, растворимых носителей лекарственных средств, могут быть также использованы в создании деградируемых гелей (Заетйпеу е! а1., Масгото1еси1ев 26: 581-87, 1993). Известно также, что могут быть образованы межмолекулярные комплексы смешиванием двух комплементарных (дополняющих один другой) полимеров. Такие комплексы обычно стабилизируются электростатическими взаимодействиями (полианион-поликатион) и/или водородными связями (поликислота/полиоснование) между участвующими полимерами и/или гидрофобными взаимодействиями между этими полимерами в водном окружении (Ктиретв е! а1., Еиг. Ро1ут. ί. 32:785-790, 1996). Например, смешивание растворов полиакриловой кислоты (РААс) и полиэтиленоксида (РЕ0) при подходящих условиях приводит к образованию комплексов большей частью на основе образования водородных связей. Диссоциацию этих компоексов при физиологических условиях использовали для доставки свободных лекарственных средств (т.е. не-ПЭГилированных). Кроме того, комплексы комплементарных полимеров были образованы как из гомополимеров, так и из сополимеров.
В одном аспекте полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в диапазоне приблизительно 3 кДприблизительно 50 кД и предпочтительно приблизительно 5 кД-приблизительно 30 кД. Ковалентное присоединение ПЭГ к лекарственному средству (известное как «ПЭГилирование») может выполняться известными способами химического синтеза. Например, в одном аспекте этого изобретения, ПЭГилирование белка может выполняться реакцией NНЗ-активированного ПЭГ с белком при подходящих условиях реакции.
Хотя были описаны многочисленные реакции для ПЭГилирования, реакции, которые являются наиболее часто применимыми, придают направленность, используют мягкие условия реакций и не требуют дорогостоящей последующей обработки для удаления токсичных катализаторов или побочных продуктов. Например, монометокси-ПЭГ (мПЭГ) имеет только один реакционноспособный концевой гидроксил, и, следовательно, его применение ограничивает некоторую часть гетерогенности полученной смеси ПЭГ-белковых продуктов. Активация гидроксильной группы в конце этого полимера, противолежащей концевой метоксигруппе, является обычно необходимой для выполнения эффективного ПЭГилирования белка, причем целью является получение дериватизованного ПЭГ, который является более чувствительным к нуклеофильной атаке. Атакующим нуклеофилом является обычно эпсилон-аминогруппа остатка лизила, но могут также реагировать другие аминогруппы (например, ^концевая альфааминогруппа или аминогруппы кольца гистидина), если локальные условия являются благоприятными. Более направленное присоединение является возможным в белках, содержащих единственный лизин или цистеин. Последний остаток может быть мишенью ПЭГ-малеимида для тиол-специфической модификации. Альтернативно, ПЭГ-гидразид может реагировать с окисленным периодатом вНАЗЕОР и восстанавливаться в присутствии NаСNΒНз. Более конкретно, ПЭГилированные СМР-сахара могут реагировать с вНАЗЕОР в присутствии подходящих гликозилтрансфераз. Одним способом «ПЭГилирования», в котором ряд полимерных молекул связывают, является способ рассматриваемым полипептидом. При использовании этого способа иммунная система имеет трудности в узнавании эпитопов на поверхности этого полипептида, ответственных за образование антител, что уменьшает иммунный ответ. Для полипептидов, вводимых непосредственно в кровеносную систему тела человека для обеспечения конкретного физиологического действия (т.е. фармацевтического действия), типичной потенциальной иммунной реакцией является реакция в виде Ιβ6 и/или Ι§Μ, в то время как полипептиды, которые вводятся ингаляционно через дыхательную систему (т.е. промышленный полипептид), потенциально могут вызывать ответ в виде ΙβΞ (т.е. аллергическую реакцию). Одна из теорий, объясняющих эту уменьшенную иммун
- 31 011654 ную реакцию, заключается в том, что эта полимерная молекула (полимерные молекулы) экранирует (экранируют) эпитоп (эпитопы) на поверхности этого полипептида, ответственные за иммунную реакцию, приводящую к образованию антител. Другой теорией или, по меньшей мере, частичным фактором является то, что чем более тяжелым является конъюгат, тем более уменьшенный иммунный ответ возникает.
В случае &ЫА8ЕСР человека, использующихся в теле человека, в виде предпочтительной описанной здесь комбинации, тенденция индукции &ЫА8ЕСР иммунного ответа может быть значительно уменьшена в сравнении, например, с ферментами, полученными от животного, не являющегося человеком, такими как бычья или овечья гиалуронидазы (т.е. даже, если эти полученные от животных ферменты могут быть полностью очищенными от белков, происходящих из других животных, что является трудно достижимым или вообще недостижимым на практике). Таким образом, хотя &ЫА8ЕСР человека представляют существенное и очень важное улучшение в сравнении с полученными от животных продуктами, они могут быть для многих случаев улучшены дополнительно посттрансляционными модификациями (РТМ), такими как ПЭГилирование, для повышения их устойчивости к деградации или элиминированию и/или для улучшения других свойств, делающих их еще более благоприятными для конкретных применений.
Например, хотя предпочтительные композиции для людей (такие как &ЫА8ЕСР человека) обнаруживают уменьшенную иммуногенность в сравнении с полученными от животных гиалуронидазами или кИА8ЕСР не человека, ПЭГилирование таких &ЫА8ЕСР человека может быть использовано, например, для продления их полупериода существования в кровотоке и/или других тканях в теле. Без ограничения конкретным механизмом действия, обычно считается, что присоединение ПЭГ -частей к &ЫА8ЕСР может быть использовано для эффективной защиты этой молекулы, уменьшения ее относительной чувствительности к протеазам и потенциально также уменьшения степени и скорости ее клиренса и выведения из тела.
Полимерной молекулой, связанной с этим полипептидом, может быть любая подходящая полимерная молекула с молекулярной массой, определенной в соответствии с этим изобретением, в том числе природные и синтетические гомополимеры, такие как полиолы (т.е. поли-ОН), полиамины (т.е. полиΝΗ2) и поликарбоновые кислоты (т.е. поли-СООН) и, кроме того, гетерополимеры, т.е. полимеры, содержащие одну или несколько различных групп связывания, например, гидроксильную группу и аминогруппы.
Примеры подходящих полимерных молекул включают в себя полимерные молекулы, выбранные из группы, содержащей полиалкиленоксиды (РАО), такие как полиалкиленгликоли (РАС), в том числе полиэтиленгликоли (РЕС), метоксиполиэтиленгликоли (тРЕС) и полипропиленгликоли, ПЭГглицидиловые простые эфиры (Еροx-ΡЕС), ПЭГ-оксикарбонилимидазол (СЭ1-РЕС), разветвленные полиэтиленгликоли (РЕС), поливиниловый спирт (РУА), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, полиΌ,Ε-аминокислоты, сополимер полиэтилена и малеинового ангидрида, сополимер полистирола и малеинового ангидрида, декстраны, в том числе карбоксиметилдекстраны, гепарин, гомологичный альбумин, целлюлозы, в том числе метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиэтилцеллюлозу и гидроксипропилцеллюлозу, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмалы и гидроксипропилкрахмалы, гликоген, агарозы и их производные, гуаровую смолу, пуллулан, инулин, ксантановую камедь, каррагенан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты и биополимеры.
Предпочтительными полимерными молекулами являются нетоксичные полимерные молекулы, такие как (м)полиэтиленгликоль (тРЕС), который, кроме того, требует относительно простого химического способа для его ковалентного связывания с группами присоединения на поверхности фермента.
Обычно используемые полиалкиленоксиды (РАО), такие как полиэтиленоксиды, например, ПЭГ и особенно мПЭГ, являются предпочтительными полимерными молекулами, так как эти полимерные молекулы, в сравнении с полисахаридами, такими как декстран, пуллулан и т.п., имеют мало реакционноспособных групп, способных сшиваться, что является нежелательным.
Улучшения в ПЭГилировании и других типах посттрансляционных модификаций (РТМ) были дорогостоящими, и в настоящее время имеется большое количество способов и реагентов РТМ, известных в данной области, и регулярно развиваются новые способы. Способы и реагенты для ПЭГилирования включают в себя, например, (ί) специализированные линкеры и химические способы связывания (см., например, реагенты и технологии, обсуждаемые Иашк, ЕМ., Абν. Эгид ЭеНу. 54: 459-476 (2002) и первичные ссылки, рассматриваемые в этой статье); (ίί) разветвленные ПЭГ, которые позволяют эффективно присоединять дополнительные ПЭГ-группы к единственному сайту конъюгации (см., например, Уего^^, Б.М. еΐ а1., В^тд. Меб. СНет. Бей. 12: 177-18 0 (2002)); (ίίί) сайтспецифическое ПЭГилирование, в том числе сайт-специфическое моно-ПЭГилирование (см., например, Οιαριηαη, А.Р. еΐ а1., ΝαΐιιΐΌ В^есН. 17: 780-783 (1999); и (ίν) сайт-направленное ферментативное ПЭГилирование (например, использование трансглутаминазной реакции, как описано 8αΐο, Η., Абν. Эгид Эеку. Кет. 54: 487-504 (1002)). Имеются также дополнительные технологии и реагенты, доступные от увеличивающегося числа коммерческих поставщиков (см., например, Nекΐа^/8йеа^νаΐе^ (\ν\ν\ν.ι·κ1<ΐαΓχοιη), 8ιιηόίο (\ν\ν\ν.κиηЬ^ο.сοт и ν\ν\ν.κиηЬ^ο.сοт/ρед-κ1юρ. Се1агек СтЬУ (\ν\ν\ν.се1а^еκ.сοт) и другие).
- 32 011654
B. Профили экспрессии кНАЗЕОР в тканях.
Хотя ранее считали, что кНАЗЕОР человека является специфическим для яичка, он экспрессируется во многих тканях в человеке, как было показано более чувствительными способами, такими как ОТ-ПЦР. Транскрипт кНАЗЕОР обнаружен в мозговом веществе, микроваскулярном эндотелии, предстательной железе, молочной железе, сетчатке, смешанных меланоцитах человека, сердце плода и матке беременных. кНАЗЕОР экспрессируется также в опухолях зародышевых клеток. Детектирование транскриптов кНАЗЕОР на основе ОТ-ПЦР обычно требуется для детектирования уровней в тканях, других, чем яичко.
C. Анализы на активность фермента кНАЗЕОР.
Турбидиметрический анализ на гиалуронидазную активность.
Гиалуронидазная активность может быть детектирована при помощи модифицированного турбидиметрического анализа в подкисленном растворе сыворотки. Требуемые реагенты являются следующими:
УФ-стерилизованная 2Хдеионизированная вода или стерильный раствор для ирригации Вгаип К5000-01
НуХишеЦ МеШса1 - гиалуронат Сепгуте АсГуапсес! 4876
натрия, высокомолекулярная НА В1отабег1а15
Ссылочный стандарт гиалуронидазы ЦЗР 31200
Ацетат калия, гранулярный, ϋ3Ρ, АСЗ ЦТВакег 2914-01
Ледяная уксусная кислота, 99+% 31дта А6283
Одноосновный моногидрат фосфата натрия, ЦЗР, гранулярный МаШпкгобб 7774
Безводный двухосновный фосфат натрия иЗР МаШпкгосИ: 7771
Хлорид натрия, кристаллы, СК, АСЗ ЕМЗсгепсе 3X0420-5
Ферментативный гидролизат желатина 31дта С-0262
Лошадиная сыворотка, донорское стадо, тестируемая в культуре клеток, тестируемая в гибридомной культуре, происходящая из США Згдта Н-1270
Сывороточный альбумин человека 20% Сг1££о1з
Хлористоводородная кислота, АСЗ-реагент ЗХдта Р-7020
Хлорид кальция, дигидрат, гранулярный, ЦЗР, -РОС ЦТВакег 1336-01
Готовили следующие реагенты: раствор ацетатного буфера - 14,0 г ацетата калия и 25,0 мл ледяной уксусной кислоты в воде до 1000 мл. Раствор фосфатного буфера - 2,5 г одноосновного фосфата натрия, 1,0 г безводного двухосновного фосфата натрия и 8,2 г хлорида натрия в воде до 1000 мл. Исходный раствор разбавителя фермента - 500 мл раствора фосфатного буфера с 500 мл воды. Рабочий раствор разбавителя фермента - 33 мг гидролизованного желатина в 50 мл исходного раствора разбавителя фермента приготовленный в пределах 2 ч использования. Буферный раствор для стабилизации пробы (раствор ЗЗВ) - 125 микролитров (мкл) 20% сывороточного альбумина человека и 50 мкл 1 М раствора хлорида кальция в 50 мл рабочего раствора для разведения фермента, смешивается тщательно. Исходный раствор сыворотки - разводится 1 объем лошадиной сыворотки и 9 объемов раствора ацетатного буфера. Доводится 4 н. хлористо-водородной кислотой до рН 3,1 и дается этому раствору стоять при комнатной температуре в течение 18-24 ч. Хранится этот раствор при 4°С и используется в пределах 30 дней. Рабочий раствор сыворотки - 10 мл исходного раствора сыворотки в 30 мл раствора ацетатного буфера, доведенный до комнатной температуры. Исходный раствор гиалуроновой кислоты - натрий-гиалуроновая кисло
- 33 011654 та до концентрации 5,0 мг/мл в воде. Рабочий раствор гиалуроновой кислоты - 0,75 мл исходного раствора гиалуроновой кислоты в 4,25 мл раствора фосфатного буфера. Стандартный исходный раствор - один контейнер ссылочной стандартной гуалуронидазы И8Р доводится до концентрации 1000 Единиц/мл в воде, берутся аликвоты в виде порций по 50 мкл и хранятся при -20°С. Стандартный рабочий раствор 40 мкл стандартного исходного раствора в 960 мкл холодного рабочего раствора растворителя фермента с получением раствора, имеющего известную концентрацию 40 Единиц/мл, приготовленный непосредственно перед использованием в анализе.
Все пробы фермента разводят в 96-луночном планшете для «низкого связывания белка» в соответ ствии со следующими указаниями.
a) Диапазон максимальной чувствительности этого анализа находится между 10 и 30 Единицами/мл. Для минимизации числа повторений, поскольку анализ должен повторяться, для получения результатов, которые находятся в указанном диапазоне, сначала определите приблизительное количество общих Единиц/мл для этой пробы и затем выберите разведение (в виде целого числа) таким образом, чтобы конечная концентрация была равна приблизительно 20 Единиц/мл.
b) Минимальные объемы проб, необходимые для выполнения анализа, являются следующими: фракции 1;РЕС50 мкл, Супернатанты культур ткани=1 мл, Очищенный/Концентрированный/Материал конечной стадии=10 мкл.
c) Для проб с серийными разведениями, разведения 1:10 в 96-луночном планшете для «низкого связывания белка» выполняют в трех повторностях пипетированием 360 мкл раствора 88В и 40 мкл пробы в каждую лунку.
Для приготовления Стандарта И8Р готовят Кривую Стандартов И8Р в 96-луночном планшете для «низкого связывания белка» следующим образом:___________________________________
Лунки:
Стандарт:
А1-АЗ
В1-ВЗ
С1-СЗ ~Р1-Р3
Е1-ЕЗ
Р1-РЗЗ <31-03
3601
3602
3603
3604
3605
3606
3607
Раствор разбавителя фермента (в мкл): 0 . 20
100
Кривая стандартов ЦЗР:
Рабочий раствор Стандарта(в мкл)____
100
Конечная концентрация (в Е/мл):
Для приготовления Контроля гиалуроновой кислоты в столбцах 1-3 готовят Н.А.-контроль (Контроль гиалуроновой кислоты) в «плоскодонном» 96-луночном планшете следующим образом:
Конт роли Н.А.
Лунки: Контроль: Рабочий раствор гиалуроновой кислоты (в мкл): Рабочий раствор разбавителя фермента (в мкл):
Н1-НЗ Со01 0 60
Реакционный планшет: 30 мкл на лунку рабочего раствора гиалуроновой кислоты пипетируют с использованием 8-канальной пипетки на 50 мкл для переноса в «плоскодонный» 96-луночный планшет, оставляя пустыми лунки Н1-Н3. 60 мкл на лунку рабочего раствора разбавителя фермента пипетируют в лунки Н1-Н3 того же планшета, на котором находится контроль НА.
Рабочий раствор сыворотки: 40 мл рабочего раствора сыворотки разливают в резервуар для переноса и затем в тепловой блок.
Стадия предварительного подогрева: после приготовления обоих планшетов 96-луночный планшет для низкого связывания белка, содержащий разведенные пробы, стандарты, контроли, и плоскодонный 96-луночный планшет, содержащий рабочий раствор гиалуроновой кислоты, помещают на тепловой узел и дают им нагреваться в течение 5 мин при 37°С.
Реакцию начинают добавлением фермента к субстрату: 30 мкл из планшета с ферментом во все лунки в столбце № 1 96-луночного плоскодонного планшета (содержащего субстрат) с использованием 8-канального пипеттора на 5-50 мкл. Реакционную смесь фермент/субстрат аспирируют 5 раз вытягиванием этого раствора вверх и опусканием вниз пипеттором для переноса в течение первых 15 с для гарантии полного смешивания пробы. После смешивания фермента и субстрата наконечники выбрасывают, и новый набор наконечников помещают в пипеттор для переноса для следующего столбца. Таймер запускают снова, и при времени (1)=0:30 этот процесс повторяют для колонки 2. При следующем 30секундном интервале=1:00 этот процесс повторяют для колонки 3. Этот процесс повторяют, перемещаясь слева направо поперек планшета, каждые 30 с, пока все лунки не будут содержать как фермент, так и субстрат.
Остановка реакции: когда таймер достигает 6 мин (1)=6:00, 240 мкл рабочего раствора сыворотки пипетируют в каждую лунку, с использованием 8-канального пипеттора для переноса на 50-300 мкл, в столбец 1 96-луночного плоскодонного планшета из соседнего резервуара на 50 мл. Эту смесь аспири
- 34 011654 руют 3 раза (вытягиванием раствора вверх и опусканием вниз пипеттором для переноса) во время первых 10 с для гарантии полного смешивания. Этот процесс повторяют каждые 30 с, переходя от колонки 1 до колонки 12. После завершения последней колонки (колонки 12) реакционный планшет вынимают из блока для подогрева на лоток для считывания планшет-ридера при 640 нм. Построение линейной кривой генерируют из кривой стандартов, и она позволяет выполнять экстраполяцию тест-проб.
Альтернативные анализы для гиалуронидазы.
Микротитрационный анализ с биотинилированным гиалуронаном.
Свободные карбоксильные группы на остатках глюкуроновой кислоты гиалуронана биотинилируют в одностадийной реакции с использованием гидразида биотина (Р1егсе), Сульфо-ΝΉδ (Р1егсе) и 1этилдиметиламинопропилкарбодиимида (81дта). Этот биотинилированный субстрат НА ковалентно связывают с 96-луночным микротитрационным планшетом во второй реакции. При завершении этой ферментативной реакции остаточный субстрат детектируют с использованием авидин-пероксидазной реакции, которая может быть считана в стандартном планшет-ридере ЕЬ18А. Поскольку субстрат ковалентно связан с микротитрационным планшетом, артефакты, такие как рН-зависимое вытеснение биотинилированного субстрата, не имеют места. Чувствительность позволяет производить быстрое измерение гиалуронидазной активности из культивируемых клеток и биологических проб с вариациями между анализами, меньшими чем 10%.
Удельную активность гиалуронидазы выражают в уменьшающих мутность единицах (ТВи). Одна ТВи определяется как количество гиалуронидазной активности, требуемое для уменьшения мутности подкисленного раствора гиалуроновой кислоты, и эта единица эквивалентна единицам (ΝΕϋ) и.8.Р./№11юпа1 Еогти1агу (ΝΡ XIII). ЕЫ8А-подобный ферментный анализ, используемый для очистки, относят к единице ТВИ, ΝΡυ и И.8.Р. посредством кривой стандартов пробы гиалуронидазы (например, И8Р), стандартизованных через Фармакопею США (и.8.Р.). Таким образом, активности этого фермента, определенные ЕЫ8А-подобным ферментным анализом, является фактически относительными ТВи, так как активность фермента фактически не измеряется с использованием турбидиметрического анализа (ЭогГтап е! а1., 1948, I. Вю1. СНет. 172:367). Всех этих методов с очищенными субстратами достаточно для определения присутствия или отсутствия активности эндоглюкозамидазы.
Многие анализы гиалуронидазы были основаны на измерении генерирования новых редуцирующих Ν-ацетиламиногрупп (Воппег апб Сап!еу, С1т. СЫт. Ас!а 13:746-752, 1966) или потери вязкости (Эе 8а1едш е! а1., АгсН. ВюНсет. Вюрйук. 121:548-554, 1967) или мутности (ЭогГтап апб Θΐΐ, I. Вю1. СНет. 172:367, 1948).
По существу очищенные гликозаминогликановые субстраты могут быть также использованы в анализе смещения в геле. Гликозаминогликаны смешивают с рекомбинантным &НА8ЕСР для испытания эндоглюкозидазной активности, которая приводит к смещению подвижности субстрата в этом геле. Хондроитин-4- и 6-сульфат, дерматансульфат, гепарансульфат могут быть получены из 81дта СЬет1са1. Гиалуронан пупочного канатика человека может быть получен из Ιί'Ν. Каждый тест-субстрат разбавляют до 0,1 мг/мл в буферном диапазоне рН 3,5-7,5. Пробы по 10 мкл очищенного &НА8ЕСР или кондиционированных сред от экспрессирующих §НА8ЕСР клеток смешивают также с 90 мкл тест-субстрата в желаемом буфере и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. После инкубации пробы нейтрализуют буфером для проб (Трис-ЭДТА рН 8,0, бромфеноловый синий и глицерин) с последующим электрофорезом. Гликозаминогликаны детектируют окрашиванием гелей в 0,5% красителе Алциановом синем в 3% ледяной уксусной кислоте в течение ночи с последующим удалением красителя в 7% ледяной уксусной кислоте. Расщепление определяют сравнением подвижности субстрата в присутствии и в отсутствие фермента.
Гиалуронидазная активность может быть детектирована зимографией геля с субстратом (Сиеп!епНопег е! а1., 1992, Ма1пх 388-396). В этом анализе пробу наносят на гель для электрофореза в ДСН-ПААГ, содержащий гиалуроновую кислоту, и белки в этой пробе разделяют при помощи электрофореза. Затем этот гель инкубируют в буфере для анализа фермента и затем окрашивают для детектирования гиалуроновой кислоты в геле. Гиалуронидазную активность визуализируют в виде прозрачной зоны в геле с субстратом.
Ό. Идентификация и выделение генов полипептидов &НА8ЕСР.
Ген полипептида &НА8ЕСР и/или его доменов может быть получены способами, хорошо известными в данной области для выделения ДНК. Может быть использован любой способ, известный специалистам в данной области, для идентификации нуклеиновых кислот, которые кодируют желаемые белки. Любой способ, доступный в данной области, может быть использован для получения клона полноразмерной (т.е. включающей в себя весь кодирующий район) кДНК или геномной ДНК, кодирующей полипептид &НА8ЕСР. Например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) может быть использована для амплификации последовательности, которая экспрессируется в нормальных тканях, например, нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид &НА8ЕСР (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1 и 2), в библиотеке геномных или кДНК. Олигонуклеотидные праймеры, которые гибридизуются с последовательностями на 3'- и 5'-концах идентифицированных последовательностей, могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации при помощи ПЦР последовательностей из пробы нуклеиновой кислоты (РНК- или ДНК-, обычно кДНКбиблиотеки, из подходящего источника (например, яичка, предстательной железы, молочной железы)).
- 35 011654
ПЦР может проводиться, например, с использованием термоциклера Регкш Е1тег СеШз и полимеразы Тад (Сене Атр). Амплифицируемая ДНК может включать в себя мРНК или кДНК либо геномную ДНК из любого эукариотического вида. Можно синтезировать несколько разных вырожденных праймеров для использования в этих ПЦР-реакциях.
Жесткость условий гибридизации, используемых в праймировании реакций ПЦР, можно также варьировать для амплификации гомологов нуклеиновых кислот (например, для получения полипептидных последовательностей зНАЗЕСР из видов, других, чем человек, или для получения последовательностей человека с гомологией в отношении полипептида зНАЗЕСР) для создания большей или меньшей степеней сходства нуклеотидной последовательности между известной последовательностью и выделяемым гомологом нуклеиновой кислоты. Для перекрестно-видовой гибридизации используют условия низкой жесткости. Для гибридизации одного и того же вида используют условия средней жесткости. Эти условия могут быть определены эмпирически.
После успешной амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей всю последовательность идентифицированного полипептида зНАЗЕСР или часть последовательности идентифицированного полипептида зНАЗЕСР, или нуклеиновой кислоты, кодирующей весь гомолог полипептида зНАЗЕСР или часть гомолога полипептида зНАЗЕСР, этот сегмент может быть молекулярно клонирован и секвенирован и использован в качестве зонда для выделения полного клона кДНК или геномного клона. Это, в свою очередь, делает возможным определение полной нуклеотидной последовательности гена, анализ его экспрессии и получение его белкового продукта для функционального анализа. После определения этой нуклеотидной последовательности, открытая рамка считывания, кодирующая белковый продукт гена полипептида зНАЗЕСР, может быть определена любым способом, хорошо известным в этой области, для определения открытых рамок считывания, например, с использованием публично доступных компьютерных программ для анализа нуклеотидных последовательностей. После определения открытой рамки считывания, определение аминокислотной последовательности белка, кодируемого этой открытой рамкой считывания, является рутиной. Таким путем, могут быть идентифицированы нуклеотидные последовательности целых генов полипептидов зНАЗЕСР, а также аминокислотные последовательности белков и аналогов полипептидов зНАЗЕСР.
Любая эукариотическая клетка потенциально может служить в качестве источника нуклеиновых кислот для молекулярного клонирования гена полипептида зНАЗЕСР. Эти нуклеиновые кислоты могут быть выделены из позвоночного, млекопитающего, человека, свиньи, кошачьих, птиц, лошадиных, собачьих, а также дополнительных источников приматов, насекомых, растений и других организмов. Эти ДНК могут быть получены стандартными процедурами, известными в данной области, из клонированной ДНК (например, из библиотеки ДНК), химическим синтезом, клонированием кДНК или клонированием геномных ДНК или их фрагментов, очищенных из желаемой клетки (см., например, ЗатЬгоок еί а1. 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А РаЬогаЮгу Матиак 26 Еб., Со1б Зргтд НагЬог РаЬогаЮгу Ргезз, Со1б Зргтд НайЬог, Ыете Уогк; С1оуег Ц.М. Еб., 2б Еб., 1985, ΩΝΛ С1ошп§: А Ргас11са1 Арргоасй, МКЬ Ргезз, Мб., ОхРогб, и.К. ^1. 1, 11). Клоны, полученные из геномной ДНК, могут содержать интроны ДНК, кроме кодирующих районов; клоны, полученные из кДНК, будут содержать только последовательности экзонов. Для любого источника, этот ген клонируют в подходящий вектор для его размножения.
В молекулярном клонировании гена из геномной ДНК генерируют ДНК-фрагменты, некоторые из которых будут кодировать желаемый ген.
Эта ДНК может быть расщеплена в специфических сайтах с использованием различных рестрикционных ферментов.
Альтернативно, можно использовать ДНКазу в присутствии марганца для фрагментирования ДНК, или эта ДНК может быть физически разрезана, например, обработкой ультразвуком. Затем линейные ДНК-фрагменты могут быть разделены в соответствии с размером стандартными способами, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле и колоночную хроматографию.
После генерирования ДНК-фрагментов идентификация специфического ДНК-фрагмента может быть выполнена рядом способов.
Например, часть гена полипептида зНАЗЕСР (из любого вида) (например, продукт ПЦРамплификации, полученный, как описано выше, или олигонуклеотид, имеющий последовательность части известной нуклеотидной последовательности), или его специфическая РНК, или ее фрагмент, должны быть очищены и помечены, и эти генерированные ДНК-фрагменты могут быть подвергнуты скринингу при помощи гибридизации нуклеиновой кислоты с меченым зондом (Веηίοη апб Цау18, Заенсе 196: 180 (1977); Сгииз^ш апб Нодие88, Ргос. Асаб. 8ск ИЗА 72: 3961 (1975)). ДНК-фрагменты с существенной гомологией в отношении этого зонда будут гибридизоваться. Можно также идентифицировать подходящий фрагмент расщеплением рестриктазой (рестриктазами) и сравнением размеров фрагмента с размерами, ожидаемыми в соответствии с известной картой рестрикции, если она является доступной, или анализом последовательности ДНК и сравнением с известной нуклеотидной последовательностью полипептида зНАЗЕСР. Дополнительный отбор может быть проведен на основе свойств этого гена. Альтернативно, присутствие этого гена может быть детектировано анализами на основе физических, хими
- 36 011654 ческих или иммунологических свойств его экспрессированного продукта. Например, могут быть отобраны кДНК-клоны или ДНК-клоны, которые отбирают посредством гибридизации подходящую мРНК, которая продуцирует белок, имеющий, например, сходную или идентичную электрофоретическую подвижность, поведение при изоэлектрическом фокусировании, карты протеолитического расщепления, антигенные свойства, гиалуронидазную активность. Если имеется в распоряжении антиполипептид зНА8ЕСР-антитело, этот белок может быть идентифицирован посредством связывания меченого антитела с предположительно синтезирующими полипептид зНА8ЕСР клонами, в процедуре типа ЕЬ18А (твердофазного иммуноферментного анализа).
Альтернативы выделению геномной ДНК полипептида зНА8ЕСР включают в себя, но не ограничиваются ими, химический синтез последовательности этого гена из известной последовательности или получение кДНК к мРНК, которая кодирует полипептид зНА8ЕСР.
Например, РНК для клонирования кДНК гена полипептида зНА8ЕСР может быть выделена из экспрессирующих этот белок клеток. Затем эти идентифицированные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть встроены в подходящий клонирующий вектор. В данной области известно большое количество систем вектор-хозяин. Возможные векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, плазмиды или модифицированные вирусы, но эта векторная система должна быть совместима с используемой клеткой-хозяином. Такие векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, бактериофаги, такие как производные бактериофага лямбда, или плазмиды, такие как производные плазмид рВВ322 или рИС или вектор В1ие8спр! (81га1адепе, Ьа 1о11а, Са). Встраивание в клонирующий вектор может, например, быть выполнено лигированием ДНК-фрагмента в клонирующий вектор, который имеет комплементарные липкие концы.
Если комплементарные сайты рестрикции, используемые для фрагментирования ДНК, не присутствуют в этом клонирующем векторе, концы этих молекул ДНК могут быть модифицированы ферментативно. Альтернативно, любой желаемый сайт может быть образован лигированием нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК; эти лигированные линкеры могут включать в себя специфические химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательности узнавания рестрикционных эндонуклеаз. В альтернативном способе расщепленный вектор и ген полипептида зНА8ЕСР могут быть модифицированы присоединением гомополимерного хвоста.
Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки-хозяева посредством трансформации, трансфекции, инфекции электропорации, осаждения кальцием и другими способами, так что генерируются копии этой генной последовательности.
В конкретных вариантах осуществления трансформация клеток-хозяев рекомбинантными молекулами ДНК, которые включают в себя выделенный ген полипептида зНА8ЕСР, кДНК или синтезированную последовательность ДНК, позволяет генерировать множественные копии этого гена.
Таким образом, этот ген может быть получен в больших количествах выращиванием трансформантов, выделением рекомбинантных молекул ДНК из этих трансформантов и, когда необходимо, извлечением встроенного гена из выделенной рекомбинантной ДНК.
Е. Векторы, плазмиды и клетки, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид зНА8ЕСР или его домен гиалуронидазы, и экспрессия полипептидов зНА8ЕСР этими векторами и клетками.
Для рекомбинантной экспрессии одного или нескольких полипептидов зНА8ЕСР нуклеиновые кислоты, содержащие всю нуклеотидную последовательность или часть нуклеотидной последовательности, кодирующую полипептид зНА8ЕСР, могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей белок последовательности. Эти необходимые сигналы транскрипции и трансляции могут быть также обеспечены природным промотором для генов зНА8ЕСР и/или их фланкирующими районами.
Обеспечены также векторы, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую зНА8ЕСР, которые могут быть введены в систему экспрессии, способную продуцировать растворимый нейтральноактивный зНА8ЕСР.
Обеспечены также клетки, содержащие эти векторы. Эти клетки включают в себя эукариотические и прокариотические клетки и векторы, пригодные для применения в них.
Обеспечены эукариотические клетки, в том числе дигидрофолатредуктаза-недостаточные клетки яичника Китайского хомячка (ОС44), содержащие эти векторы. Подходящие клетки включают в себя клетки дрожжей, клетки грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных. Эти клетки используют для получения полипептида зНА8ЕСР или его домена гиалуронидазы (а) выращиванием вышеуказанных клеток в условиях, посредством которых кодируемый полипептид зНА8ЕСР или гиалуронидазный домен полипептида зНА8ЕСР экспрессируется этой клеткой, и затем (Ь) извлечением экспрессированного белка гиалуронидазного домена. В вариантах-примерах этот гиалуронидазный домен секретируется в среду.
В одном варианте осуществления обеспечены векторы, включающие в себя последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид, который имеет гиалуронидазную активность и содержит весь домен гиалуронидазы или часть домена гиалуронидазы или их множественные копии, белка зНА
- 37 011654
8ЕСР. Обеспечены также векторы, которые содержат последовательность нуклеотидов, которая кодирует домен гиалуронидазы и дополнительные части белка 8НА8ЕСР до полноразмерного белка 8НА8ЕСР и в том числе полноразмерный белок 8НА8ЕСР, а также его множественные копии. Эти векторы могут быть отобраны на экспрессию белка 8НА8ЕСР или его домена гиалуронидазы в клетке, или таким образом, что белок 8НА8ЕСР экспрессируется в виде секретируемого белка. Альтернативно, эти векторы могут включать в себя сигналы, необходимые для секреции кодируемых белков. При экспрессии домена гиалуронидазы эту нуклеиновую кислоту связывают с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал секреции, например, сигнальной последовательностью фактора спаривания 8аеейаготуее8 еегеу181ае или ее частью, или с природной сигнальной последовательностью.
Для того чтобы генерировать растворимый, нейтрально-активный 8НА8ЕСР, требуются клетки, способные к введению Ν-связанного гликозилирования. В предпочтительном варианте осуществления клетки яичника Китайского хомячка, недостаточные в отношении дигидрофолатредуктазы, такие как ЭС44. электропорируют с плазмидой, содержащей сильный промотор млекопитающего, такой как промотор СМУ, нуклеиновую кислоту, кодирующую 8НА8ЕСР, за которой следуют внутренний сайт вхождения рибосом, ген мышиной дигидрофолатредуктазы и последовательность полиаденилирования 8У40, как показано в 8Е0 ΙΌ N0:51. Затем такие клетки культивируют в среде с определенным химическим составом в отсутствие гипоксантина и тимидина, с последующей амплификацией с увеличивающимися концентрациями метотрексата.
Различные системы хозяин-вектор могут быть использованы для экспрессии кодирующей белок последовательности. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, системы клеток млекопитающих, инфицированных вирусом, например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом и т.д.; системы клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие как дрожжи, содержащие векторы дрожжей; или бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Экспрессионные элементы векторов варьируются по их силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин-вектор может быть использован любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции. Отмечено что бактериальная экспрессия ДНК 8НА8ЕСР не будет приводить к каталитически активному 8НА8ЕСР рег 8е, но в комбинации с подходящим аппаратом гликозилирования он может быть искусственно гликозилирован.
Любые способы, известные специалистам в области встраивания фрагментов нуклеиновых кислот в вектор, могут быть использованы для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих химерный ген, содержащий подходящие сигналы регуляции транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности. Эти способы могут включать в себя способы рекомбинантных ДНК ш уйго и синтетические способы и 1п у1уо рекомбинанты (генетическую рекомбинацию). Экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид 8НА8ЕСР или его домены, производные, фрагменты или гомологи, может регулироваться второй последовательностью нуклеиновой кислоты таким образом, что эти гены или их фрагменты экспрессируются в хозяине, трансформированном рекомбинантной молекулой ДНК (рекомбинантными молекулами ДНК). Например, экспрессия этих белков может регулироваться любым промотором/энхансером, известным в этой области. Промоторы, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, ранний промотор 8У40 (Вегпо18( апй СйатЬоп. №-11иге 290: 304-310 (1981), промотор, содержащийся в З'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (УататоЮ е! а1., Се/722 ; 787-797 (1980), промотор тимидинкиназы герпесвируса (^адпег е! а1., Ргое. Аеай. 8ег И8А 78: 1441-1445 (1981), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Вг1П8(ег е! а1., №-11иге 296: 39-42 (1982)); векторы прокариотической экспрессии, такие как промотор βлактамазы (УШа-КатагоГГе! а1., Ргое. Аеай. 8ег И8А 75: 3727-3731 (1978)) или промотор ТАС (ЭеЬоег е! а1., Ргое. Аеай. 8е1. И8А 80: 21-25 (1983)); см. также и8еГи1 Рго(еш8 Ггот ВееотЬтап! Вае1епа: 1п 8е1епййе Атейеап 242: 79-94 (1980)); векторы экспрессии растений, содержащие промотор опалинсинтетазы (Неггаг-Е8(ге11а е! а1., УШие 303: 209-213 (1984)) или промотор РНК 358 вируса мозаики цветной капусты (Сагйег е! а1., Ше1е1С Ае1Й8 Ве8. 9: 2871 (1981)) и промотор фотосинтетического фермента рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Неггега-Е81ге11а е! а1., УШие 310: 115-120 (1984)); промоторные элементы из дрожжей и других грибов, такие как промотор Са14, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицеролкиназы, промотор щелочной фосфатазы, и следующие регуляторные районы транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы в трансгенных животных: регуляторный район гена эластазы I, который является активным в панкреатических ацинарных клетках (8уу1Г( е1 а1., Се11 38: 639-646 (1984); Огпйх е! а1., Со1й 8рппд НагЬог 8утр. Оиап1. Вю1. 50: 399-409 (1986); Маейопа1й, Нера(о1оду 7: 425-515 (1987)); регуляторный район гена инсулина, который является активным в панкреатических бета-клетках (Напайап е! а1., УШие 315: 115-122 (1985)), регуляторный район гена иммуноглобулина, который является активным в лимфоидных клетках (Сго88ейей1 е! а1., Се11 38: 647-658 (1984); Айат8 е! а1., Уинге 318: 533-538 (1985); А1ехапйег е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 7: 1436-1444 (1987)), регуляторный район вируса опухоли молочной железы мыши, который является активным в клетках яичек, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Ьейег е! а1., Се11 45: 485-495 (1986)), регуляторный район гена альбумина, который является активным в печени (Ртекей е! а1., Сепе8 апй Оеуе1. 1: 268-276 (1987)), регуляторный район гена альфа-фетопротеина, который является активным
- 38 011654 в печени (Кгит1аиГ е! а1., Μο1. Се11. Βίο1. 5: 1639-1648 (1985); Иаттег е! а1., 8с1епсе 235: 53-58 (1987)), регуляторный район гена альфа-1-антитрипсина, который является активным в печени (Ке1§еу е! а1., Сеиех апй Эеуе1. 1: 161-171 (1987)), регуляторный район гена бета-глобина, который является активным в миелоидных клетках (Μοд^ат е! а1., №11иге 315: 338-340 (1985); Κο11ΪΗ8 е! а1., СЕ//46: 89-94 (1986)), регуляторный район гена миелинового основного белка, который является активным в олигодендроцитах головного мозга (Веабйеаб е! а1., Се11 48: 703-712 (1987)), регуляторный район гена легкой цепи-2 миозина, который является активным в скелетной мышце (8аш, №!иге 314: 283-286 (1985)), и регуляторный район гена гонадотропин-высвобождающего гормона, который является активным в гонадотропоцитах гипоталамуса (Μа8οη е! а1., 8с1ег1се 234: 1372-1378 (1986)).
В одном конкретном варианте осуществления используют вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептид 8ΗЛδΕСΡ или его домен, фрагмент, производное или гомолог, один или несколько сайтов инициации репликации и, необязательно, один или несколько селектируемых маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику).
Для эффективной трансляции последовательности 8ΗΑδΕСΡ могут также требоваться специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают в себя кодон инициации ЛТС и смежные последовательности. В случаях, когда 8ΗΑδΕСΡ, его инициирующий кодон и расположенные слева последовательности встроены в подходящий экспрессирующий вектор, дополнительные сигналы регуляции трансляции могут не требоваться. Однако, в случаях, когда встроена только кодирующая последовательность или ее часть, должны быть обеспечены экзогенные регуляторные сигналы транскрипции, в том числе инициирующий кодон ΑΤΠ Кроме того, этот инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания для гарантии транскрипции всего инсерта. Экзогенные элементы транскрипции и инициирующие кодоны могут быть разного происхождения, как природные, так и синтетические. Эффективность экспрессии может быть увеличена включением энхансеров, подходящих для используемой системы клеток (8с11агГ Ό. е! а1. (1994) Ве8и1!8 ΡγοΜ Се11 01ГГег 20: 125-62; ВйШег е! а1. (1987) МеРюбк ίη Εпζутο1 153:516-544).
Кроме того, штамм клетки-хозяина может быть отобран на его способность модулировать экспрессию инсертированных последовательностей или процессировать экспрессированный белок желаемым образом. Такие модификации этого полипептида включают в себя, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, который расщепляет препро-форму белка, может быть также важным для правильного встраивания, укладки (фолдинга) и/или функции. Различные клетки-хозяева, такие как СИ0 (ЭС44, ΌΧΒ11, СИ0-К1), ИеЬа, МОСК, 293, ^138 и т.д., имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для гарантии правильных модификации и процессинга введенного чужеродного белка.
Для долгосрочного продуцирования с высоким выходом рекомбинантных белков предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют 8ΗΑδΕСΡ, могут быть трансформированы экспрессирующими векторами, которые содержат вирусные сайты инициации репликации или эндогенные элементы экспрессии и ген селектируемого маркера. После введения вектора клеткам дают расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед переключением на селективную среду. Целью селектируемого маркера является придание устойчивости к отбору, и его присутствие делает возможными выращивание и извлечение клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Устойчивые скопления стабильных трансформированных клеток могут быть пролиферированы с использованием способов культуры ткани, подходящих для данного типа клеток.
Любое число систем отбора может быть использовано для извлечения трансформированных клеточных линий. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (^1§кег М. е! а1. (1977) Се11 11:223-32) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Εο\\ύ I. е! а1. (1980) Се11 22:817-23), которые могут быть использованы в клетках ТК или ΑΡΚΤ, соответственно. Антиметаболиты, устойчивость к антибиотикам или гербицидам также могут быть использованы в качестве основы для отбора; например, ΌΗΕΒ, который придает устойчивость к метотрексату (^1§1ег М. е! а1. (1980) Ггос №111 Αсаά δα 77:3567-70); ηρ!, который придает устойчивость к аминогликозидам неомицину и С418 (Сο1Ье^е-Са^аρ^η Е. е! а1. (1981) ί Μο1 Βίο1 150:1-14) и а18 или ρηΐ. которые придают устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицину, ацетилтрансферазе, соответственно (Миггау, выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например, !τρΒ, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана, или ΗίδΌ, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (ИаПтам δ. С. ηηά В.С. Μи11^дап (1988) Бгос N6 Αсаά δα 85:8047-51). Недавно, применение видимых маркеров получило популярность с такими маркерами, как антоцианины, бета-глукуронидаза и ее субстрат, СШ, и люцифераза и ее субстарт, люциферин, широко используемое не только для идентификации трансформантов, но также для количественного определения экспрессии транзиторного или стабильного белка, связанной с конкретной векторной системой (Р1ю6е8 С. Α. е! а1. (1995) МеРюбк Μο1 Βίο1 55:121-131).
Идентификация трансформантов, содержащих эту полинуклеотидную последовательность.
- 39 011654
Хотя присутствие/отсутствие экспрессии маркерных генов предполагает, что представляющий интерес ген также присутствует, это присутствие и экспрессия активного кНА8ЕОР должны быть подтверждены. Например, если ген &НА8ЕОР встроен в пределах последовательности гена маркера, рекомбинантные клетки, содержащие &НА8ЕОР, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может быть помещен в тандеме с последовательностью кНА8ЕСР под контролем единственного промотора. Экспрессия этого маркерного гена в ответ на индукцию или отбор обычно указывает также на экспрессию этого тандемного &НА8ЕОР. Детектирование правильно гликозилированного нейтрально-активного кНА8ЕОР может быть определено тестированием кондиционированной среды на ферментативную активность &НА8ЕОР при подходящих условиях.
Очистка кНА8ЕОР.
Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью &НА8ЕОР, могут культивироваться в условиях, подходящих для экспрессии и извлечения кодируемого белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, предпочтительно секретируется, но может содержаться внутриклеточно в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Как будет понятно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие кНА8ЕОР, могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые облегчают прямую секрецию &НА8ЕОР через мембрану прокариотической или эукариотической клетки. Другие рекомбинантные конструкции могут соединять &НА8ЕОР с нуклеотидной последовательностью, кодирующий полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков (Кго11 Ό. ί. е1 а1. (1993) ЭИА Се11 Вю1 12:441-53; см. обсуждение векторов, содержащих слитые белки, ίηΓπι).
&НА8ЕОР может быть также экспрессирован в виде рекомбинантного белка с одним или несколькими дополнительными доменами, добавленными для облегчения очистки белка. Такие облегчающие очистку домены включают в себя, но не ограничиваются ими, металл-хелатирующие пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые делают возможной очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности ЕЬАО8 Отпишех Согр, 8еа111е \Уак11.). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор ХА или энтерокиназа (Iην^ί^οдеη, 8аη О|едо СаБГ.) между доменом очистки и &НА8ЕОР применимо для облегчения очистки. Один такой экспрессирующий вектор обеспечивает экспрессию слитого белка, ухудшающего &НА8ЕОР, и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 остатков гистидина, за которыми следуют тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназы. Остатки гистидина облегчают очистку на 1М1АС (аффинной хроматографией с иммобилизованным ионом металла, описанной в РогаШ е1 а1. (1992) Рго1ет Ехргеккюн анй РипПсаНон 3: 263-281), тогда как сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает средство для очистки этого хемокина из слитого белка.
Кроме рекомбинантного получения, фрагменты &НА8ЕОР могут быть получены прямым пептидным синтезом с использованием твердофазных способов (см., например, 81е\\'аг1 е1 а1. (1969) 8о11й-Рйаке РерЕйе 8уп1Нск1к, V Н Егеетаа Со, 8аη Вта^^со; МетГ1е1й 1 (1963) 1 Ат Сйет 8ос 85: 2149-2154). Синтез белков ίη νίΙΐΌ может выполняться мануальными способами или с использованием автоматизации. Автоматизированный синтез может быть выполнен, например, с использованием пептидного синтезатора 431А Аррйей Вюкук1етк (Регкш Е1тег, Еок1ег С11у Са11Г.) в соответствии с инструкциями, обеспеченными изготовителем. Различные фрагменты &НА8ЕОР могут быть химически синтезированы по отдельности и соединены с использованием химических способов с получением полноразмерной молекулы.
Экспрессирующие векторы, содержащие кодирующие последовательности или их части полипептида &НА8ЕОР, получают, например, субклонированием кодирующих частей в сайт рестрикции ЕсоР1 каждого из трех векторов РОЕХ (векторов экспрессии глутатион-8-трансферазы (8тйй аий йойпкоп, Оспс 7: 31-40 (1988)). Это делает возможной экспрессию продуктов в правильной рамке считывания. Примеры векторов и систем для экспрессии доменов гиалуронидазы полипептидов &НА8ЕОР включают в себя хорошо известные векторы РюЫа (доступные, например, из Iην^ΐ^οдеη, 8аη О1едо, СА), в частности, векторы, которые сконструированы для секреции этих кодируемых белков. Этот белок может быть также экспрессирован цитоплазматически, например, в телах включения. Один пример вектора описан в примерах.
Плазмиды для трансформации клеток Е. соБ включают в себя, например, экспрессирующие векторы рЕТ (см. патент США 4952496; доступный из Nονадеη, Май1кощ VI; см. также литературу, опубликованную Штадеи, описывающую эту систему).
Такие плазмиды включают в себя рЕТ 11а, которая содержит промотор 1ас Т7, терминатор Т7, индуцируемый оператор 1ас Е. сой и ген-репрессор 1ас; рЕТ12А-С, который содержит промотор Т7, терминатор Т7 и сигнал секреции ОМРТ Е. соБ; и рЕТ 15В и рЕТ 19В (Nονадеη, Май1кощ VI), которые содержат лидерную последовательность Ηίκ-Тад для использования в очистке с Н1к-колонкой и сайт расщепления тромбина, который делает возможным расщепление после очистки через эту колонку; промоторный район 1ас Т7 и терминатор Т7.
Эти векторы вводят в клетки-хозяева, такие как клетки РюЫа, и бактериальные клетки, такие как Е. со11, и эти белки экспрессируются в них. Примеры штаммов РюЫа включают в себя штамм О8115. При
- 40 011654 мерные бактериальные хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей РНК-полимеразу Т7, функционально связанные с индуцируемым промотором, таким как промотор ΕΑΕυν (см. патент США № 4952496). Такие хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими лизогенный штамм Ε. сой ВЬ21 (ΌΕ3).
Домены, производные и аналоги κΗΑδΕΟΡ могут быть получены разными способами, известными в этой области. Например, после идентификации рекомбинантной клетки, экспрессирующей полипептид κΗΑδΕΟΡ, или его домен, фрагмент или производное, продукт этого индивидуального гена может быть выделен и анализирован. Это достигается анализами, основанными на физических и/или функциональных свойствах этого белка, в том числе, но не только, радиоактивным мечением продукта с последующим анализом гель-электрофорезом, иммуноанализом, сшиванием с меченым маркером продуктом и анализами протеолитической активности.
Полипептиды κΗΑδΕΟΡ могут быть выделены и очищены стандартными способами, известными в данной области (либо из природных источников, либо из рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих эти комплексы или белки), включающими в себя, но не ограничивающимися ими, колоночную хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гель-фильтрационную, жидкостную хроматографию высокого давления с обращенной фазой или жидкостную хроматографию для быстрого разделения белков), дифференциальное центрифугирование, дифференциальную растворимость, или любым другим стандартным способом, используемым для очистки белков.
В одном варианте осуществления κΗΑδΕΟΡ может быть очищен до гомогенности из кондиционированных сред химически определенного состава ΗΖ24-трансфицированных и амплифицированных с использованием метотрексата клеток ЭС44 1) диафильтрацией с тангенциальным током, 2) связыванием и элюцией с использованием анионообменной хроматографии, 3) протеканием через колонку посредством фенил-сефарозной хроматографии и 4) связыванием и элюцией с использованием хроматографии на колонке с гидроксиапатитом.
Функциональные свойства могут оцениваться с использованием любого подходящего анализа, известного в данной области.
Альтернативно, после идентификации полипептида κΗΑδΕΟΡ или его домена или производного аминокислотная последовательность этого белка может быть выведена из нуклеотидной последовательности гена, который ее кодирует. В результате этот белок или его домен или производное могут быть синтезированы стандартными химическими способами, известными в этой области (например, см. ИипкарШег е( а1., №11иге 310: 105-111 (1984)) с последующим гликозилированием ίη νίύΌ.
Манипуляции полипептидными последовательностями κΗΑδΕΟΡ могут быть выполнены на уровне белка. Здесь также рассматриваются белки полипептида κΗΑδΕΟΡ, их домены, производные или их аналоги или фрагменты, которые дифференциально модифицированы во время или после трансляции, например, гликозилированием, ацетилированием, фосфорилированием, амидированием, ПЭГилированием, дериватизацией известными защитными/блокирущими группами, протеолитическим расщеплением, образованием связи с молекулой антитела или другим клеточным лигандом.
Любые многочисленные химические модификации могут проводиться известными способами, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, специфическое химическое расщепление цианогенбромидом, трипсином, химотрипсином, папаином, У8, NаΒΗ4, ацетилирование, формилирование, окисление, восстановление, метаболический синтез в присутствии туникамицина и других подобных агентов.
Кроме того, домены, аналоги и производные полипептида κΗΑδΕΟΡ могут быть синтезированы химически. Например, пептид, соответствующий части полипептида κΗΑδΕΟΡ, который включает в себя желаемый домен или который опосредует желаемую активность ίη уйго, может быть синтезирован с использованием пептидного синтезатора.
Кроме того, если желательно, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть введены в виде замены или добавления в последовательность полипептида κΗΑδΕΟΡ. Неклассические аминокислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, Ό-изомеры обычных аминокислот, α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, ΑΜ, 2-аминомасляную кислоту, ΕΑΒυ, е-ΑΗχ, 6-аминогексановую кислоту, ΑίΒ, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, конструирующие аминокислоты, такие как β-метиламинокислоты, Са-метиламинокислоты, №1метиламинокислоты и аналоги аминокислот в целом. Кроме того, эти аминокислоты могут быть б (правовращающими) или 1 (левовращающими).
В случаях, когда есть подозрение, что природные продукты являются мутантными или выделенными из новых видов, аминокислотная последовательность полипептида κΗΑδΕΟΡ, выделенная из природного источника, а также аминокислотная последовательность, экспрессированная ίη νίύΌ или из синтезированных экспрессирующих векторов ίη νί\Ό или ίη уйго, может быть определена из анализа последовательности ДНК или, альтернативно, прямым секвенированием выделенного белка. Такой анализ может
- 41 011654 выполняться мануальным секвенированием или с использованием автоматизированного секвенатора аминокислот.
Модификации - Ряд модификаций полипептидов и доменов кНАЗЕСР обсуждается здесь. Кодирующая кНАЗЕСР молекула нуклеиновой кислоты может быть модифицирована любой из многочисленных стратегий, известных в этой области (8атЬ^οοк е! а1., (1990), ΜοΕαιΕίΓ Ο1οηίη§: А ^аЬο^аίο^у Магша1 26 еб., ^1б Зргшд На^г ^аЬο^аίο^у, СЫб Зргшд Наг^т, №\ν ΥογΕ). Эти последовательности могут быть расщеплены в подходящих сайтах рестриктазой (рестриктазами) с последующей дополнительной ферментативной модификацией, если желательно, выделены и лигированы ίη νίίτο. При получении гена, кодирующего домен, производное или аналог &НА8ЕСР, следует предпринять меры, чтобы гарантировать, что модифицированный ген сохраняет исходную трансляционную рамку считывания, не прерываемую стоп-сигналами трансляции, в области этого гена, где кодируется желаемая активность.
Кроме того, кодирующие &НА8ЕСР молекулы нуклеиновых кислот могут быть мутированы ίη νίίτο или ίη νίνο для создания и/или разрушения трансляции, инициации и/или терминации последовательностей или для создания вариаций в кодирующих районах и/или образования новых сайтов рестриктаз или разрушения предсуществующих сайтов рестриктаз, для облегчения дальнейшей модификации ίη νίίτο. Как описано здесь, рассматриваются также мутеины с изменениями первичной последовательности, такими как замены остатков Сук и элиминирование или добавление сайтов гликозилирования; &НА8ЕСР 8ЕО ΙΌ N0:1 имеет семь потенциальных сайтов гликозилирования. Такие мутации могут быть выполнены любым способом мутагенеза, известным в этой области, в том числе, но не только, химическим мутагенезом и сайт-направленным мутагенезом ίη νίίτο (ΉιιΦίιίηκοη е! а1., ί. Είο1. СНет. 253: 6551-6558 (1978)), применением линкеров ТАВЕ (РНагтас1а). В одном варианте осуществления, например, полипептид &НА8ЕСР или его домен модифицируют таким образом, что он включает в себя флуоресцентную метку. В других конкретных вариантах осуществления полипептид &НА8ЕСР модифицирован таким образом, что он имеет гетеробифункциональный реагент; такие гетеробифункциональные реагенты могут быть использованы для сшивания членов этого комплекса.
Кроме того, домены, аналоги и производные &НА8ЕСР могут быть синтезированы химически. Например, пептид, соответствующий части полипептида кНАЗЕСР, который включает в себя желаемый домен или который опосредует желаемую активность ίη νίίτο, может быть синтезирован с использованием пептидного синтезатора. Кроме того, если желательно, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть введены в виде замены или добавления в последовательность полипептида кНАЗЕСР. Неклассические аминокислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, Όизомеры обычных аминокислот, α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, АЬи, 2аминомасляную кислоту, 8-АВИ, е-АНх, 6-аминогексановую кислоту, А1Ь, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, конструирующие аминокислоты, такие как Τί-метиламинокислоты, Саметиламинокислоты, №-метиламинокислоты и аналоги аминокислот в целом. Кроме того, эти аминокислоты могут быть б (правовращающими) или 1 (левовращающими).
Р. Генерирование функционально активного гликозилированного кНАЗЕСР с ^связанными сахарными частями молекул.
Для генерирования каталитически стабильного белка необходим правильно ^гликозилированный кНАЗЕСР человека. ^связанное гликозилирование кНАЗЕСР может быть достигнуто посредством различных способов. Гликозилирование кНАЗЕСР может быть достигнуто введением нуклеиновых кислот, кодирующих &НАЗЕСР, в клетки эукариотического происхождения, способные к правильному N связанному гликозилированию, или, альтернативно, контактированием полипептида кНАЗЕСР с бесклеточными экстрактами или очищенными ферментами, способными вводить желаемые ^связанные сахарные части молекул.
Выбор системы экспрессии.
Системы экспрессии эукариотических клеток варьируются в отношении степени и типа гликозилирования, которое они вводят в эктопически экспрессируемый полипептид. Клетки СН0, например, являются высокоэффективными в введении ^связанного гликозилирования в активный полипептид кНА8ЕСР.
Дополнительные эукариотические системы экспрессии, которые вводят ^связанное гликозилирование для генерирования функционального продукта, могут быть испытаны введением экспрессирующей кНАЗЕСР человека плазмиды в указанные клетки и тестированием на нейтральную активность. Правильное ^связанное гликозилирование может быть определено при помощи анализа РАСЕ высвобождаемых ПНГазой олигосахаридов. Профили гликозилирования каталитически активных кНАЗЕСР обеспечены дополнительно здесь. Верификация гликозилирования может быть также выполнена обработкой кНАЗЕСР из указанных клеток ПНГазой-Р или выращиванием таких клеток в туникамицине с последующим введением кодирующих кНАЗЕСР нуклеиновых кислот.
^гликозилирование полипептида кНАЗЕСР ίη νίίτο.
- 42 011654
Полипептид &НА8ЕСР может быть Ν-гликозилирован контактированием полипептида кНАЯЕСР с бесклеточными экстрактами, содержащими активность, способную переносить Ν-связанные сахара к полипептиду &НА8ЕСР, такими как микросомные мембраны собаки, или посредством сопряженной транскрипции и трансляции, что является коммерчески доступным (Рготеда Мабйоп νΐ).
Считается, что олигосахариды имеют редуцирующий конец и нередуцирующий конец, независимо от того, является или не является сахарид на этом редуцирующем конце действительно редуцирующим сахаром. В соответствии с общепринятой номенклатурой, олигосахариды изображены здесь с нередуцирующим концом слева и редуцирующим концом справа. Все описанные здесь олигосахариды оборзначены названием или аббревиатурой для нередуцирующего сахарида (например, Са1), за которой следует конфигурация гликозидной связи (альфа или бета), кольцевая связь, положение в кольце редуцирующего сахарида (например, С1сХАс). Связь между двумя сахарами может быть выражена, например, как 2,3,
2.Г\г баго.3, или (2,3). Каждый сахарид является пиранозой.
В данном контексте Ν-связанной сахарной частью называют олигосахарид, присоединенный к кНАЯЕСР через амидный азот остатков Акп. Ν-связанные олигосахариды делятся на несколько основных типов (олигоманнозные, комплексные, гибридные, сульфатированные), все из которых имеют (Мап) 3С1сNЛс-С1сNЛс-кора. присоединенные через амидный азот остатков Акп, которые находятся в пределах -Акп-Хаа-ТЬг/8ег-последовательностей (где Хаа не является Рго). Ν-связанные сайты часто определяют непрямым путем по появлению «холостого» цикла во время секвенирования. Положительная идентификация может быть выполнена после высвобождения олигосахарида при помощи фермента РХСаке Р, который превращает гликозилированный Акп в Акр. После высвобождения при помощи ПНГазы Р, Νсвязанные олигосахариды могут быть очищены с использованием Вю-Се1 Р-6-хроматографии, причем пул олигосахаридов подвергают препаративной анионообменной хроматографии при высоком рН (НРАЕС) (То\упкепб е! а1., (1989) Апа1. ВюсРет. 182, 1-8). Некоторые изомеры олигосахаридов могут быть разделены с использованием НРАЕС. Фукозные остатки будут смещать положения элюции в сторону более ранней элюции в хроматограмме НРАЕС, тогда как дополнительные остатки сиаловой кислоты будут увеличивать время удерживания. Конкурентная обработка гликопротеинов, структуры олигосахаридов которых известны (например, бычий фетуин, а-1 кислотный гликопротеин, овальбумин, РНКаза В, трансферрин) могут облегчать расшифровку (соотнесение) олигосахаридных пиков. Собранные олигосахариды могут быть охарактеризованы комбинацией анализов состава и анализов метилированных связей ^аедРе е! а1., (1983) СагЬоРубг Кек. 123, 281-304), причем аномерные конфигурации определяют ЯМР-спектроскопией (У;ш На1Ьеек (1993) ш Ме!Робк Епхуто1 230).
Альтернативно, олигосахариды могут быть идентифицированы электрофорезом углеводов с использованием флуоресценции (РАСЕ) СаРе^аей е! а1. (2001) 61усоЬю1оду 11, 275-281.
С. Детектирование и характеристика Ν-связанных сахарных частей молекул на &НА8ЕСР.
Определение, является ли белок на самом деле гликозилированным, является начальной стадией в анализе гликопротеингликанов. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (электрофорез в ДСН-ПААГ) стал предпочтительным способом в качестве конечной стадии перед секвенированием белка. Гликозилированные белки часто мигрируют в виде диффузных полос при электрофорезе в ДСН-ПААГ. Заметное уменьшение ширины полос и изменения в положении миграции после обработки пептид-Ы4-(№ацетил-О-глюкозаминил)аспарагинамидазой (ПНГазой Р) считается диагностикой Ν-связанного гликозилирования. Если другие типы гликозилирования являются преобладающими, должны быть использованы другие подходы. Способы блоттинга лектинов обеспечивают подход, который является независимым от класса гликозилирования (Ν против О). Лектины, углеводсвязывающие белки из различных тканей растений, имеют как высокую аффинность, так и узкую специфичность в отношении большого диапазона определенных сахарных эпитопов, обнаруженных на гликопротеингликанах (Ситтшдк, К. Ό. (1994) Ме!Робк ш ЕпхутоР 230, 66-86). При конъюгировании с биотином или дигоксигенином они могут быть легко идентифицированы на мембранных блотах посредством колориметрических реакций, использующих авидин или антидигоксигениновые антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой (Наке1Ьеск е! а1. (1993) Ме!Робк ш Мо1. Вю. 14, 161-173), аналогично реакциям вторичное антитело-щелочная фосфатаза, используемым в Вестерн-блоттинге. Скрининг с панелью лектинов с хорошо определенной специфичностью может обеспечивать важную информацию об углеводном комплементе гликопротеина. Важно, что усиление развития окраски является достаточно высоким, так что 10-50 нг гликопротеина можно с легкостью наблюдать на мембранном блоте электрофореза в ДСН-ПААГ. Хотя лектины обнаруживают очень высокую аффинность в отношении их когнатных лигандов, некоторые из них действительно проявляют значительную авидность в отношении структурно родственных эпитопов. Таким образом, важно внимательно отмечать возможность перекрестной реактивности при выборе панели лектинов и использовать панели с самой высокой вероятностью индивидуального различения комплексных, гибридных и имеющих высокое содержание маннозы Ν-связанных гликанов и О-связанных структур.
Анализ моносахаридов может быть также использован для определения, является ли &НА8ЕСР гликозилированным, и, как и в случае анализа лектина, обеспечивает дополнительную информацию о структурных признаках. Количественный анализ состава моносахаридов ί) идентифицирует гликозилирован
- 43 011654 ные белки, ίί) дает молярное отношение отдельных сахаров к белку, ίίί) предполагает, в некоторых случаях, присутствие классов олигосахаридов, ίν) является первой стадией в создании стратегии выяснения структуры и ν) обеспечивает меру логичности получения для рекомбинантных гликопротеиновых терапевтических средств. В недавние годы анионообменная хроматография с высоким рН с импульсным амперометрическим детектированием (НРАЕС-РАР) была использована интенсивно для определения состава моносахаридов (Тονηхеηб еί а1. (1995) ш Са^Ьοкуб^аίе Апа1ух1х: Н^дк-ре^Гο^таηсе 1к|шб скготаЮдгарку апб сарШагу е1ес1гор1югех1х (ΖΈ1 Вахх1 еб.), рр. 181-209). Ранее, были введены способы мечения на основе флуорофора и многие из них доступны в форме наборов. Явным преимуществом флуоресцентных способов является увеличение чувствительности (в 50 раз). Одним потенциальным недостатком является то, что различные моносахариды могут демонстрировать различную селективность в отношении флуорофора во время реакции связывания, либо в гидролизате, либо в наружной стандартной смеси. Однако, увеличение чувствительности и возможность идентифицировать, какие моносахариды присутствуют, из малой части общего количества доступного гликопротеина, а также возможность более высокой чувствительности с использованием лазера индуцированной флуоресценции, делает этот подход привлекательным.
Анализ состава моносахаридов небольших количеств хНАБЕСР наилучшим образом выполняется на поливинилиденфторидных мембранах (РУОЕ (РБО)) либо после электроблоттинга (^еП/11апб1ет еί а1., (1993) I. Вю1. Скет. 268, 5121-5130), либо, если должны анализироваться меньшие количества, на дотблотах. РУОЕ является идеальным матриксом для анализа углеводов, так как ни моно-, ни олигосахариды не связываются с этой мембраной после высвобождения либо кислотным, либо ферментативным гидролизом.
Анализ ЕАСЕ является эффективным способом детектирования профилей гликозилирования хНАБЕСР. Одним таким механизмом является ЕАСЕ™ Ν-Ьшкеб Ο1^дοхасска^^бе РюГШпд (Рго/уше) с 30%ными олигосахаридными гелями. Олигосахариды, отщепленные от 100 мкг гликопротеинов ферментативным расщеплением Ν-гликаназой (также называемой ПНГазой), меченые с использованием флуорофора АЭТБ и разделенные электрофорезом, могут быть использованы для детектирования профилей гликозилирования хНАБЕСР. Относительные положения полос олигосахаридов определяют электрофорезом пробы и разведений пробы рядом с лестницей (лэддером) стандартов олигосахаридов, которые определяют расстояние миграции в единицах Степени Полимеризации (ЭР).
H. Способы скрининга для идентификации соединений, которые модулируют активность хНАБЕСР.
Несколько типов анализов приведены в качестве примеров и описаны здесь. Понятно, что домены гиалуронидазы могут быть использованы в других анализах. Однако здесь показано, что домены гиалуронидазы проявляют каталитическую активность.
Вследствие этого они являются идеальными для скрининг-анализов ш νίίτο.
Они могут быть также использованы в анализах связывания.
Полноразмерные зимогены, активированные ферменты и домены гиалуронидазы хНАБЕСР обсуждаются для применения в любом скрининг-анализе, известном специалистам в этой области, в том числе в обеспеченных здесь анализах. Таким образом, следующее описание, если оно относится к анализам гиалуронидазы, предназначено для применения одноцепочечного домена гиалуронидазы или его каталитически активной части любой гиалуронидазы, в том числе хНАБЕСР. Другие анализы, такие как анализы связывания, обеспечены здесь, в частности, для применения с хНАБЕСР, в том числе любых его вариантов, таких как его сплайсинговые варианты.
I. Каталитические анализы для идентификации агентов, которые модулируют гиалуронидазную активность белка хНАБЕСР. Здесь обеспечены способы идентификации модулятора каталитической активности хНАБЕСР, в частности, одноцепочечного домена гиалуронидазы или его каталитически активной части. Эти способы могут выполняться контактированием хНАБЕСР, полноразмерного зимогена или активированной формы, и, в частности, его одноцепочечного домена, с субстратом хНАБЕСР в присутствии тест-вещества и детектированием протеолиза этого субстрата, посредством чего оценивается активность этого хНАБЕСР, и сравнением этой активности с контролем. Например, контролем может быть активность хНАБЕСР, оцениваемая контактированием хНАБЕСР, в том числе полноразмерного зимогена или активированной формы, и, в частности, его одноцепочечного домена, с субстратом хНАБЕСР и детектированием протеолиза этого субстрата, посредством чего оценивается активность этого хНАБЕСР. Эти результаты в присутствии и в отсутствие тест-соединений сравнивают. Различие в активности указывает на то, что это тест-вещество модулирует активность этого хНАБЕСР. Активаторы активирующего расщепления хНАБЕСР также обсуждаются здесь; такие анализы обсуждаются ниже.
В одном варианте осуществления множество тест-соединений подвергают скринингу одновременно в вышеописанном способе скрининга. В другом варианте осуществления хНАБЕСР выделяют из клеткимишени в качестве средства для последующей идентификации агентов, которые являются потенциально специфическими для этой клетки-мишени.
В другом варианте осуществления этим тест-веществом является терапевтическое соединение, и вследствие этого различие активности хНАБЕСР, измеренной в присутствии и в отсутствие этого тест
- 44 011654 вещества, указывает на то, что эта клетка-мишень отвечает на данное терапевтическое соединение.
Один способ включает в себя стадии (а) контактирования полипептида кНАЗЕОР или его домена гиалуронидазы с одним тест-соединением или с множеством тест-соединений в условиях, способствующих взаимодействию между этим лигандом и этими соединениями; и (Ь) идентификации одного или нескольких соединений в этом множестве, которые связываются с этим лигандом.
Другой обеспеченный здесь способ включает в себя стадии а) контактирования полипептида кНАЗЕОР или его домена гиалуронидазы с субстратом полипептида кНАЗЕОР и детектирования расщепления субстрата, посредством чего оценивается активность полипептида кНАЗЕОР; Ь) контактирования полипептида кНАЗЕОР с субстратом полипептида кНАЗЕОР в присутствии тест-вещества и детектирования расщепления этого субстрата, посредством чего оценивается активность полипептида кНАЗЕОР; и с) сравнения активности полипептида кНАЗЕОР, оцененной в стадиях а) и Ь), причем, если активность, измеренная в стадии а), отличается от активности, измеренной в стадии Ь), это указывает на то, что это тест-вещество модулирует активность полипептида кНАЗЕОР.
В другом варианте осуществления множество тест-веществ подвергают одновременному скринингу. В сравнении активности полипептида кНАЗЕОР в присутствии и в отсутствие тест-вещества для оценки, является ли это тест-вещество модулятором полипептида кНАЗЕОР, необязательно анализировать эту активность параллельно, хотя такое параллельное измерение является обычным. Можно измерить активность полипептида кНАЗЕОР в одной временной точке и сравнить эту измеренную активность с ранее установленной величиной активности этого полипептида кНАЗЕОР.
Например, можно измерить активность полипептида кНАЗЕОР в присутствии тест-вещества и сравнить с прежней величиной активности этого полипептида кНАЗЕОР, измеренной ранее в отсутствие этого тест-вещества, и наоборот. Это может выполняться, например, обеспечением активности полипептида кНАЗЕОР на вкладыше или в проспекте, обеспеченном с набором для проведения этого анализа.
Способы выбора субстратов для конкретного кНАЗЕОР описаны в примерах, и в качестве примеров приведены анализы конкретных гиалуронидаз.
Обеспечены комбинации и наборы, содержащие комбинации, необязательно включающие в себя инструкции для выполнения этих анализов. Эти комбинации включают в себя полипептид кНАЗЕОР и субстрат полипептида кНАЗЕОР, подлежащего анализу; и, необязательно, реагенты для детектирования протеолиза субстрата. Субстраты, которыми могут быть хромогенные или флурогенные молекулы, в том числе гликозаминогликаны, предмет протеолиза конкретным полипептидом кНАЗЕОР, могут быть идентифицированы эмпирически тестированием способности полипептида кНАЗЕОР расщеплять этот тестсубстрат. Идентифицированы субстраты, которые расщепляются наиболее эффективно (т.е. при самых низких концентрациях и/или при наивысшей скорости или при желательных условиях).
Здесь дополнительно обеспечен набор, содержащий вышеописанную комбинацию. Этот набор, необязательно, включает в себя инструкции для идентификации модулятора активности полипептида кНАЗЕОР. Любой полипептид кНАЗЕОР рассматривается в качестве мишени для идентификации модуляторов его активности.
2. Анализы связывания. Здесь обеспечены также способы идентификации и выделения агентов, в частности, соединений, которые связываются с кНАЗЕОР. Эти анализы предназначены для идентификации агентов, которые связываются с выделенным доменом гиалуронидазы (или белком, другим, отличным от полипептида кНАЗЕОР, который содержит домен гиалуронидазы полипептида кНАЗЕОР) и с его активированной формой, в том числе активированной формой, полученной из полноразмерного зимогена или из удлиненного домена гиалуронидазы. Эти идентифицированные соединения являются кандидатами или соединениями-примерами для идентификации соединений для лечения нарушений и заболеваний, включающих в себя отклоняющуюся от нормы гиалуронидазную активность. Полипептиды кНАЗЕОР, используемые в этих способах, включают в себя любой определенный здесь полипептид кНАЗЕОР, в том числе одноцепочечный домен гиалуронидазы кНАЗЕОР или его протеолитически активную часть.
Здесь обеспечены разнообразные способы. Эти способы могут выполняться в растворе или в твердофазных реакциях, в которых полипептид кНАЗЕОР (полипептиды кНАЗЕОР) или его домен гиалуронидазы (домены гиалуронидазы) связаны, прямо или опосредованно через линкер, с твердым носителем. Скрининг-анализы описаны в примерах, и эти анализы были использованы для идентификации кандидатных соединений.
Для целей этого изобретения все вышеописанные анализы связывания обеспечены для кНАЗЕОР.
Здесь обеспечены способы идентификации агента, такого как соединение, которое специфически связывается с одноцепочечным доменом гиалуронидазы кНАЗЕОР, полноразмерным активированным кНАЗЕОР или его двухцепочечным доменом гиалуронидазы. Этот способ может выполняться (а) контактированием кНАЗЕОР с одним тест-агентом или с множеством тест-агентов в условиях, способствующих связыванию между кНАЗЕОР и агентом; и (Ь) идентификацией одного или нескольких агентов среди этого множества, которые специфически связываются с кНАЗЕОР.
Например, в выполнении таких способов полипептид кНАЗЕОР смешивают с потенциальным партнером связывания или экстрактом или фракцией клетки в условиях, которые делают возможной ассоциа
- 45 011654 цию потенциальных партнеров связывания с этим полипептидом. После смешивания пептиды, полипептиды, белки или другие молекулы, которые становятся ассоциированными с вНАЗЕОР, выделяют из этой смеси. Затем партнер связывания, который связан с вНАЗЕОР, извлекают и дополнительно анализируют. Для идентификации и выделения партнера связывания может быть использован целый белок, например, полный описанный белок ЗЕО ΙΌ N0:1. Альтернативно, может быть использован фрагмент этого белка.
Различные способы могут быть использованы для получения клеточных экстрактов или жидкостей тела, таких как кровь, сыворотка, моча, пот, синовиальная жидкость, СЗЕ и другие подобные жидкости.
Например, клетки могут быть разрушены с использованием либо физических, либо химических способов разрушения. Примеры способов физического разрушения включают в себя, но не ограничиваются ими, обработку ультразвуком и механическое рассечение. Примеры способов химического лизиса включают в себя, но не ограничиваются ими, лизис при помощи детергентов и ферментативный лизис. Специалист в данной области может легко подобрать способы получения клеточных экстрактов для получения экстрактов для использования в этих способах.
После получения экстракта клеток этот экстракт смешивают с вНАЗЕОР в условиях, в которых может происходить ассоциация этого белка с партнером связывания. Могут быть использованы различные условия, в том числе условия, которые сходны с условиями, обнаруживаемыми в цитоплазме клеток человека или в жидкости тела, такой как кровь. Такие признаки, как осмолярность, рН, температура и концентрация используемого клеточного экстракта, могут варьироваться для оптимизации ассоциации этого белка с партнером связывания. Подобным образом, известны также способы выделения представляющих интерес молекул из жидкостей тела.
После смешивания при подходящих условиях этот связанный комплекс выделяют из этой смеси. Ряд способов может быть использован для разделения этой смеси. Например, антитела, специфические в отношении вНАЗЕОР, могут быть использованы для иммунопреципитации этого комплекса партнера связывания. Альтернативно, могут быть использованы стандартные химические способы разделения, такие как хроматография и центрифугирование в градиенте плотности/осадительное центрифугирование.
После удаления неассоциированных клеточных компонентов в этом экстракте партнер связывания может быть диссоциирован из этого комплекса при помощи общепринятых способов. Например, диссоциация может выполняться изменением концентрации соли или рН этой смеси.
Для облегчения выделения ассоциированных пар партнеров связывания из смешанного экстракта вНАЗЕОР может быть иммобилизован на твердом носителе. Например, этот белок может быть иммобилизован на нитроцеллюлозном матриксе или акриловых гранулах. Присоединение этого белка или его фрагмента к твердому носителю способствует отделению пар пептид/партнер связывания от других компонентов, обнаруживаемых в этом экстракте. Идентифицированные партнеры связывания могут быть либо единственным белком, либо комплексом, образованным из двух или нескольких белков.
Альтернативно, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие одноцепочечные гиалуронидазы, могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе. Дрожжевая двухгибридная система была использована для идентификации других пар белок-партнер и может быть легко адаптирована для использования описанных здесь молекул нуклеиновых кислот.
Другой анализ связывания ίη νίΐΓο, в частности, для вНАЗЕОР, использует смесь полипептида, который содержит, по меньшей мере, каталитический домен одного из этих белков, и одной или нескольких кандидатных мишеней или субстратов связывания. После инкубирования этой смеси при подходящих условиях оценивают способность вНАЗЕОР или его полипептидного фрагмента, содержащего каталитический домен, связываться или взаимодействовать с этим кандидатным субстратом. Для бесклеточных анализов связывания один из этих компонентов включает в себя детектируемую метку или связан с детектируемой меткой. Эта метка может обеспечивать прямое детектирование, например, радиоактивность, люминесценция, оптическая или электронная плотность и т.д., или непрямое детектирование, например, эпитопная метка, фермент и т.д. Ряд способов может быть использован для детектирования метки, в зависимости от характера метки и других компонентов анализа. Например, эта метка может быть детектирована в виде связанной метки с твердым субстратом, или часть связанного комплекса, содержащего эту метку, может быть отделена от твердого субстрата и после этого метка может быть детектирована.
3. Детектирование трансдукции сигнала вНАЗЕОР, который является заякоренным в мембране белком и может участвовать прямо или опосредованно в трансдукции сигнала, непосредственно в качестве рецептора поверхности клетки или опосредованно активацией белков, таких как профакторы роста, которые могут инициировать трансдукцию сигнала.
Кроме того, секретированный вНАЗЕОР, такой как растворимый домен вНАЗЕОР, представленный в ЗЕО ΙΌ N0:4, может участвовать в трансдукции сигнала либо непосредственно связыванием с рецептором клеточной поверхности или взаимодействием с рецептором клеточной поверхности, либо опосредованно активацией белков, таких как профакторы роста, которые могут инициировать трансдукцию сигнала. Анализы для оценки трансдукции сигнала хорошо известны специалистам в данной области и могут быть адаптированы для использования с полипептидом вНАЗЕОР.
Обеспечены анализы для идентификации агентов, которые влияют на трансдукцию сигнала или из
- 46 011654 меняют трансдукцию сигнала, опосредованную прямо или косвенно, например, через активацию профактора роста, посредством κΗА8ЕСΡ, в частности, полноразмерным &ЫА8ЕСР или достаточной частью, для заякоривания внеклеточного домена или его функциональной части &ЫА8ЕСР на поверхности клетки. Такие анализы включают в себя, например, анализы на основе транскрипции, в которых модуляцию трансдуцированного сигнала оценивают детектированием действия на экспрессию из репортерного гена (см., например, патент США № 5436128).
4. Способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих &ЫА8ЕСР. Другой вариант обеспечивает способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих &ЫА8ЕСР. Такие анализы используют доступные средства для мониторинга изменений в уровне экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих &ЫА8ЕСР.
Разные форматы анализов могут быть использованы для мониторинга способности агента модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей &ЫА8ЕСР. Например, экспрессия мРНК может быть подвергнута мониторингу непосредственно по гибридизации с этими нуклеиновыми кислотами. Ферментные анализы, такие как уже описанные здесь, могут быть использованы для детектирования агентов, которые модулируют экспрессию &ЫА8ЕСР.
Клеточные линии подвергают действию тестируемого агента при подходящих условиях и времени и тотальную РНК или мРНК выделяют стандартными процедурами (см., например, 8αιη0Γοο1< еΐ а1. 1989, Μο1еси1а^ Ο1οηίη§: А ΕαόοπιΐοΐΎ Мапиа1, 2б Еб., С.о1б 8ριϊη§ ΗπγΕογ ΕαόοπιΐοΐΎ Ргекк). Зонды для детектирования различий в уровнях экспрессии РНК между клетками, подвергнутыми действию этого агента, и контрольными клетками, могут быть приготовлены из этих нуклеиновых кислот. Обычно, но необязательно, конструируют зонды, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями только в условиях высокой жесткости. Только высококомплементарные гибриды нуклеиновых кислот образуются в условиях высокой жесткости. Альтернативно, жесткость условий анализа определяет величина комплементарности, которая должна существовать между двумя цепями нуклеиновой кислоты для образования гибрида. Жесткость должна быть выбрана таким образом, чтобы максимизировать различие в стабильности между парами зонд:гибрид-мишень и потенциальный зонд:гибриды, не являющиеся мишенями.
Например, Ν- и С-концевые фрагменты ША8ЕСР могут быть экспрессированы в бактериях и использованы для поиска на белки, которые связываются с этими фрагментами. Слитые белки, такие как слияние Жк-метки или С8Т с Ν- или С-концевыми районами κΗА8ЕСΡ, могут быть получены для использования в качестве субстрата. Эти слитые белки могут быть связаны, например, с гранулами глутатион-сефароза и затем зондированы клеточными лизатами или жидкостями тела. Перед лизисом, эти клетки или жидкости тела могут быть обработаны кандидатным агентом, который может модулировать &ЫА8ЕСР или белки, которые взаимодействуют с доменами на нем. Белки лизата, связывающиеся со слитыми белками, могут быть разделены электрофорезом в ДСН-ПААГ, выделены и идентифицированы секвенированием белка или масс-спектрометрией, как известно в данной области.
Зонды антител получают иммунизацией подходящих млекопитающих-хозяев в подходящих протоколах иммунизации с использованием пептидов, полипептидов или белков, если они имеют достаточную длину (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более последовательных аминокислот полипептида κΗА8ЕСΡ), или, если требуется повышение иммуногенности, конъюгируют с подходящими носителями. Способы получения иммуногенных конъюгатов с носителями, такими как бычий сывороточный альбумин (БСА), гемоцианин фиссуреллы (КШ) или другими белкаминосителями, хорошо известны в данной области. В некоторых обстоятельствах может быть эффективным прямое конъюгирование с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в некоторых случаях для обеспечения доступа к гаптену могут быть желательными связывающие реагенты, такие как реагенты, поставлемые Р1егсе Сйетюа1 ^., КοскΓο^б, 1Ь. Пептиды гаптенов могут быть удлинены либо на амино-конце, либо на карбоксиконце остатком Сук или перемежающимся остатками цистеина для облегчения связывания с носителем.
Введение иммуногенов проводят обычно инъекцией на протяжении подходящего периода времени и с использованием подходящих адъювантов, как обычно является понятным в этой области. Во время схемы иммунизации определяют титры антител для определения адекватности образования антител.
Антипептид-антитела могут быть генерированы с использованием синтетических пептидов, соответствующих, например, карбоксиконцевым аминокислотам &ЫА8ЕСР.
Синтетические пептиды могут быть такими малыми, как пептиды с длиной 1-3 аминокислоты, обычно с длиной по меньшей мере 4 или более аминокислотных остатков. Эти пептиды могут быть связаны с КЬ-Η с использованием стандартных способов и могут быть использованы для иммунизации животных, таких как кролики или копытные. Затем поликлональные антитела могут быть очищены, например, с использованием гранул Асйде1, содержащих ковалентно связанный пептид.
Хотя поликлональные антисыворотки, полученные таким путем, могут быть удовлетворительными для некоторых применений, для фармацевтических композиций обычно используют моноклональные препараты. Иммортализованные клеточные линии, которые секретируют желаемые моноклональные антитела, могут быть получены с использованием стандартного способа ^Шег еΐ а1. (ΝαΐιιΐΌ 256: 495-7
- 47 011654 (1975)) или модификаций, которые выполняют иммортализацию лимфоцитов или клеток селезенки, как это обычно известно. Эти иммортализованные клеточные линии, секретирующие желаемые антитела, подвергают скринингу при помощи иммуноанализа, в котором антигеном является пептидный гаптен, полипептид или белок.
После идентификации подходящей культуры иммортализованных клеток, секретирующих желаемое антитело, эти клетки могут культивироваться ш νί!ΐΌ или могут быть получены ш νί\Ό с использованием асцитной жидкости. Особый интерес представляют моноклональные антитела, которые узнают каталитический домен или сайт активации расщепления зНА8ЕСР.
Могут быть также получены антитела или их фрагменты. Районы, которые связываются специфически с желаемыми районами рецептора, также могут быть получены в контексте химер, происходящих из множественных видов.
Агенты, которые анализируют в вышеуказанном способе, могут быть выбраны случайным образом или выбраны или сконструированы логическим образом.
Этими агентами могут быть, например, пептиды, малые молекулы и углеводы. Специалист в данной области может легко понять, что нет ограничений в отношении характера структуры.
Пептидные агенты могут быть получены с использованием способов синтеза пептидов в твердой фазе (или в фазе раствора), известных в данной области. Кроме того, ДНК, кодирующая эти пептиды, может быть синтезирована с использованием коммерчески доступных инструментов (оборудования) и получена рекомбинантно с использованием стандартных систем получения рекомбинантов. Получение с использованием твердофазного пептидного синтеза является необходимым, если должны быть включены не кодируемые генами аминокислоты.
Ι. Способы лечения.
зНА8ЕСР, идентифицированные описанными здесь способами, используют для лечения или предупреждения аномальных накоплений субстратов зНА8ЕСР у животных, предпочтительно млекопитающих, в том числе у человека. В одном варианте осуществления этот способ включает в себя введение млекопитающему эффективного количества гликопротеина зНА8ЕСР, посредством чего это заболевание или нарушение лечится или предупреждается.
В другом варианте осуществления ингибитор зНА8ЕСР может быть использован в лечении избыточного количества нейтральной гиалуронидазной активности. Млекопитающим, получающим лечение, может быть человек. Обеспеченными здесь ингибиторами являются ингибиторы, идентифицированные при помощи скрининг-анализов. Кроме того, обсуждаются антитела и антисмысловые нуклеиновые кислоты или двухцепочечные РНК (бзВNА), такие как ΚΝΛί.
1. Антисмысловое лечение: в конкретном варианте осуществления, описанном здесь выше, функция полипептида зНА8ЕСР уменьшается или ингибируется антисмысловыми нуклеиновыми кислотами полипептида зНА8ЕСР для лечения или предупреждения избыточной хондроитиназной активности. Обеспечено терапевтическое или профилактическое использование нуклеиновых кислот из по меньшей мере шести нуклеотидов обычно до приблизительно 150 нуклеотидов, которые являются антисмысловыми относительно гена или кДНК, кодирующих полипептид зНА8ЕСР или его часть. «Антисмысловой» нуклеиновой кислотой полипептида зНА8ЕСР называют в данном контексте нуклеиновую кислоту, способную гибридизоваться с частью РНК (обычно мРНК) полипептида зНА8ЕСР, вследствие некоторой комплементарности последовательности и обычно в условиях высокой жесткости. Эта антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарна кодирующему и/или некодирующему району мРНК полипептида зНА8ЕСР. Такие антисмысловые нуклеиновые кислоты применимы в качестве терапевтических средств, которые уменьшают или ингибируют функцию полипептида зНА8ЕСР и могут быть использованы в лечении или предупреждении описанных выше нарушений.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты полипептида зНА8ЕСР содержат по меньшей мере шесть нуклеотидов и являются обычно олигонуклеотидами (в диапазоне от 6 до приблизительно 150 нуклеотидов, в том числе 6-50 нуклеотидов). Эта антисмысловвя молекула молжет быть комплементарна всему домену гиалуронидазы или части домена гиалуронидазы. Например, этот олигонуклеотид имеет по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20, 40, 80, по меньшей мере 100 нуклеотидов или по меньшей мере 125 нуклеотидов. Этими олигонуклеотидами могут быть ДНК или РНК или химерные смеси или производные или их модифицированные версии, одноцепочечные или двухцепочечные. Этот олигонуклеотид может быть модифицирован в части основания, сахарной части или в фосфатном скелете. Этот олигонуклеотид может включать в себя другие присоединенные группы, такие как пептиды или агенты, облегчающие транспорт через клеточную мембрану (см., например, Ье!зтдег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. И8А 86: 6553-6556 (1989); Ьетайге е! а1., Ргос. Асаб. δα. И8А 84: 648-652 (1987); Публикацию РСТ № νθ 88/09810, опубликованную 15 декабря 1988 г.) или гематоэнцефалический барьер (см., например, Публикацию РСТ № XVО 89/10134, опубликованную 25 апреля 1988 г.), запускаемые гибридизацией агенты расщепления (см., например, Кго1 е! а1., Вю1ес11пк.|иез 6: 958-976 (1988)) или интеркалирующие агенты (см., например, 2оп. Рйатт. Вез. 5: 539-540-549 (1988)).
Антисмысловая нуклеиновая кислота полипептида зНА8ЕСР обычно является олигонуклеотидом,
- 48 011654 обычно одноцепочечной ДНК или РНК или их аналогом или их смесью. Например, этот олигонуклеотид включает в себя последовательность, антисмысловую относительно части нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид зНА8ЕСР человека. Этот олигонуклеотид может быть модифицирован в его структуре заместителями, обычно известными в данной области.
Антисмысловой олигонуклеотид полипептида зНА8ЕСР может включать в себя по меньшей мере одно модифицированное основание, которое выбрано из группы, включающей в себя, но не ограничивающейся ими, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-иодурацил, гипоксантин, ксантин, 4ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-О-галактозилквеозин, инозин, N6изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Ш-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-О-маннозилквеозин, 5-апос-метоксикарбоксиметилурацил, 5метоксиурацил, 2-метилтио^6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты (ν), урацил-5-оксиуксусную кислоту (ν), 5-метил-2тиоурацил, 3-(3-амино-3-н-2-карбоксипропил)урацил, (АСР3) \ν и 2,6-диаминопурин.
В другом варианте осуществления этот олигонуклеотид включает в себя по меньшей мере одну модифицированную сахарную часть, выбранную из группы, включающей в себя, но не ограничивающейся ими, арабинозу, 2-фторарабинозу, ксилулозу и гексозу. Этот олигонуклеотид может включать в себя по меньшей мере один модифицированный фосфатный скелет, выбранный из фосфоротиоата, фосфородитиоата, фосфорамидотиоата, фосфорамидата, фосфордиамидата, метилфосфоната, алкилфосфотриэфира и формацеталя или его аналога.
Этот олигонуклеотид может быть а-аномерным олигонуклеотидом. А-аномерный олигонуклеотид образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которой эти цепи идут параллельно друг другу (Саийег е! а1., №с1. Ас1бз Кез. 15: 6625-6641 (1987)).
Этот олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, такой как, но не только, пептид; запускаемый гибридизацией сшивающий агент, транспортный агент или запускаемый гибридизацией агент расщепления. Эти олигонуклеотиды могут быть синтезированы стандартными способами, известными в данной области, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора (такого как синтезаторы, доступные из Вюзеагсй, Аррйеб В1озуз!етз, и т.д.). В качестве примеров, фосфоротиоатные олигонуклеотиды могут быть синтезированы по способу 8!ет е! а1., №с1. Ас1бз Кез. 16: 3209 (1988), метилфосфонатные олигонуклеотиды могут быть получены с использованием стеклянных полимерных носителей с регулируемыми порами (8агш е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 85: 7448-7451 (1988)), и т.д. В конкретном варианте осуществления антисмысловой олигонуклеотид полипептида зНА8ЕСР включает в себя каталитическую РНК или рибозим (см., например, Международную публикацию РСТ \УО 90/11364, опубликованную 4 октября 1990 г.; 8агуег е! а1., 8аег1се 247: 1222-1225 (1990)). В другом варианте осуществления этим олигонуклеотидом является 2'-О-метилрибонуклеотид (Итоне е! а1., №с1. Ас1бз Кез. 15: 6131-6148 (1987)) или химерные РНК-ДНК-аналоги (Ыоие е! а1., ΕЕВ8 Ьей. 215:327-330 (1987)).
Альтернативно, этим олигонуклеотидом может быть двухцепочечная РНК (ά^ΕΩΝΆ), такая как Шъ
В альтернативном варианте осуществления антисмысловую нуклеиновую кислоту полипептида зНА8ЕСР получают внутриклеточно транскрипцией из экзогенной последовательности.
Например, вектор может быть введен ίη νίνΌ, так что он поглощается клеткой, в которой этот вектор или его часть транскрибируется с образованием антисмысловой нуклеиновой кислоты (РНК). Такой вектор будет содержать последовательность, кодирующую антисмысловую нуклеиновую кислоту полипептида зНА8ЕСР. Такой вектор может оставаться эписомным или становиться хромосомно интегрированным, пока он может транскрибироваться для продуцирования желаемой антисмысловой РНК. Такие векторы могут быть сконструированы способами технологии рекомбинантных ДНК, стандартными в данной области. Векторы могут быть плазмидными, вирусными или другими, известными в данной области, используемыми для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих. Экспрессия последовательности, кодирующей антисмысловую РНК полипептида зНА8ЕСР может происходить с любым промотором, о котором известно в данной области, что он действует в клетках млекопитающих, в том числе человека. Такие промоторы могут быть индуцируемыми или конститутивными. Такие промоторы включают в себя, но не ограничиваются ими: район раннего промотора 8ν40 (Вето1з! апб СйатЬощ №1Шге 290: 304-310 (1981)), промотор, содержащийся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (УататоЮ е! а1., Се/22: 787-797 (1980)), промотор тимидинкиназы герписа (ХУащтог е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 78: 1441-1445 (1981)), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Вгшз!ег е! а1., №1Шге 296: 39-42 (1982)), и т.д.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты включают в себя последовательность, комплементарную по меньшей мере части РНК-транскрипта гена полипептида зНА8ЕСР, в том числе гена полипептида зНА8ЕСР человека. Абсолютная комплементарность не требуется. Количество антисмысловой нуклеиновой кислоты полипептида зНА8ЕСР, которое является эффективным в лечении или предупреждении неопла
- 49 011654 стического заболевания, зависит от природы этого заболевания и может быть определено эмпирически стандартными клиническими способами.
Когда возможно, желательно определять цитотоксичность антисмысловой нуклеиновой кислоты в клетках ш \'Нго и затем в применимых модельных системах животных перед тестированием и применением в людях.
2. Интерференция РНК. Интерференция РНК (Κ,ΝΛί) (см., например, СНиапд е! а1. (2000) Ргос. №И. Асаб. Зс1. ИЗА 97: 4 985) может быть использована для ингибирования гена, кодирующего кНАЗЕОР. Интерферирующие РНК-фрагменты, в частности, двухцепочечные (бк) РНК (кЖПА.) могут быть использованы для генерирования потери функции кНАЗЕОР. Способы, относящиеся к использованию ВЫА1 для сайленсинга генов в организмах, в том числе млекопитающих, С. е1едапк, ЭгокорНба и растениях и людях, известны (см., например, Р1ге е! а1. (1998) №1иге 391: 806-811; Р1ге (1999) Тгепбк Сепе1. 15: 358363; ЗНагр (2001) Оепек Эет. 15: 485-490; Наттопб е! а1. (2001) №1иге Веу. Оепе!. 2: 110-119; ТикН1 (2001) СНет. ВюсНет 2: 239-245; НатШоп е! а1. (1999) Зс1епсе 286: 950-952; Наттопб е! а1. (2000) №1иге 404: 293-296; 2атоге е! а1. (2000) Се11 101: 25-33; Ветк!ет е! а1., (2001) №1иге 409: 363-366; Е1ЬакН1г е! а1. (2001) Оепек Эет. 15: 188-200; Е1ЬакН1г е! а1. (2001) №1иге 411: 494-498; 1п!ета!юпа1 РСТ аррНсабоп №. \УО 01/29058; 1п!ета!юпа1 РСТ аррНсабоп №. \¥О 99/32619).
Экспрессирующие двухцепочечную РНК (бкВNА) конструкции вводят в хозяина, такого как животное или растение, с использованием реплицируемого вектора, который остается эписомным или интегрируется в геном. При отборе подходящих последовательностей, экспрессия бкВNА может препятствовать накоплению эндогенной мРНК, кодирующей кНАЗЕОР. ВNА^ может также использоваться для ингибирования экспрессии ш убго.
Районы, включающие в себя приблизительно 21 (или 21) нуклеотид, которые являются селективными (т.е. уникальными) в отношении кНАЗЕОР, используют для получения к^ВNА. Более короткие фрагменты из приблизительно 21 нуклеотида, могут быть трансформированы непосредственно (т.е. ш У1!го или ш у1уо) в клетки; более крупные бкВЫА-молекулы ВNА^ обычно вводят с использованием векторов, которые кодируют их. бкВЫА-молекулы имеют длину по меньшей мере 21 п.н. или более, например, 50, 100, 150, 200 и более п.н. Способы, реагенты и протоколы для введения молекул нуклеиновых кислот в клетки ш \'бго и ш νί\Ό известны специалистам в этой области.
3. Генотерапия. В варианте-примере нуклеиновые кислоты, которые включают в себя последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид кНАЗЕОР или его функциональные домены или его производное, вводят для активации функции полипептида кНАЗЕОР, посредством генотерапии. Генотерапией называют терапию, выполняемую введением нуклеиновой кислоты субъекту. В этом варианте осуществления эта нуклеиновая кислота продуцирует кодируемый ею белок, который опосредует терапевтическое действие активацией функции полипептида кНАЗЕОР. Может быть использован любой из способов генотерапии, доступных в этой области (см. Оо1бкр1е1 е! а1., С11шса1 РНагтасу 12: 488-505 (1993); \Уи апб XVи, Вю!Негару 3: 87-95 (1991); То1к1уокйеу, Ап. Веу. РНагтасо1. ТоХсо1. 32: 572-596 (1993); МиШдап, Заепсе 260: 926-932 (1993) и Могдап апб Апбегкоп, Ап. Веу. ВюсНет. 62: 191-217 (1993); Т1ВТЕСН 11 5: 155-215 (1993)). Например, одна терапевтическая композиция для генотерапии включает в себя кодирующую полипептид кНАЗЕОР нуклеиновую кислоту, которая является частью экспрессирующего вектора, который экспрессирует полипептид кНАЗЕОР или его домен, фрагмент или химерную часть в подходящем хозяине. В частности, такая нуклеиновая кислота имеет промотор, функционально связанный с кодирующим районом полипептида кНАЗЕОР, причем этот промотор является индуцируемым или конститутивным и, необязательно, тканеспецифическим. В другом конкретном варианте осуществления используют молекулу нуклеиновой кислоты, в которой кодирующие полипептид кНАЗЕОР последовательности и любые другие желаемые последовательности фланкированы районом, который активирует гомологичную рекомбинацию в желаемом сайте в геноме, обеспечивая интрахромосомную экспрессию нуклеиновой кислоты белка кНАЗЕОР (Во11ег апб ЗшйЫек, Ргос. №!1. Асаб. Зсг ИЗА 86: 8932-8935 (1989); 2ук!га е! а1., №!иге 342: 435-438 (1989)).
Доставка этой нуклеиновой кислоты в пациента может быть либо прямой, и в этом случае пациент непосредственно подвергают действию этой нуклеиновой кислоты или несущего эту нуклеиновую кислоту вектора, либо непрямой, и в этом случае клетки сначала трансформируют этой нуклеиновой кислотой 1п ν 11го. затем трансплантируют в пациента. Эти два подхода известны, соответственно, как генотерапия 1п νί\Ό или ех νί\Ό.
В конкретном варианте осуществления эту нуклеиновую кислоту непосредственно вводят ш νί\Ό. где она экспрессируется с образованием кодируемого продукта. Это может выполняться любым из многочисленных способов, известных в данной области, например, конструированием ее в виде части подходящего экспрессирующего вектора нуклеиновой кислоты и введением его таким образом, что он становится внутриклеточным, например, инфицированием с использованием дефектного или аттенуированного ретровирусного вектора или другого вирусного вектора (см. патент США № 4980286), или прямой инъекцией голой ДНК или с использованием бомбардировки микрочастицами (например, генным пистолетом; ВюНкНс, Пироп!) или нанесением покрытия из липидов или рецепторов клеточной поверхности или трансфицирующих агентов, инкапсулированием в липосомах, микрочастицах или микрокапсулах,
- 50 011654 или введением ее в связи с лигандом посредством опосредованного рецептором эндоцитоза (см., например, XVII апб ХУи, I. Вю1. СНет., 262: 4429-4432 (1987)) (что может быть использовано для нацеливания на типы клеток, специфически экспрессирующих эти рецепторы), и т.д. В другом варианте осуществления может быть образован комплекс нуклеиновая кислота-лиганд, в котором этот лиганд является фузогенным (способствующим слиянию) вирусным пептидом, для разрушения эндосом, что позволяет этой нуклеиновой кислоте избежать лизосомного разрушения. Еще в одном варианте осуществления эта нуклеиновая кислота может быть нацелена ш у1уо для специфического поглощения и экспрессии клеткой нацеливанием на специфический рецептор (см., например, Публикации РСТ XVΟ 92/06180, датированная 16 апреля 1992 г. (ХУи е! а1.); ХУО 92/22635, датированная 23 декабря 1992 г. (ХУПкоп е! а1.); ХУО 92/20316, датированная 26 ноября 1992 г. (Ешбе1к е! а1.); ХУО 93/14188, датированная 22 июля 1993 г. (С1агке е! а1.), ХУО 93/20221, датированная 14 октября 1993 г. (Уоипд)). Альтернативно, эта нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и включена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии гомологичной рекомбинацией (Ко11ег апб 8тйЫек, Ргос. Асаб. 8сг и8А 86: 8932-8935 (1989); Ζί)κΙπι е! а1., №11иге 342: 435438 (1989)).
В конкретном варианте осуществления используют вирусный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту полипептида &НА8ЕСР. Например, может быть использован ретровирусный вектор (см. МШег е! а1., Ме!Н. Епхуто1. 217: 581-599 (1993)). Эти ретровирусные векторы были модифицированы для делеции ретровирусных последовательностей, которые не являются необходимыми для упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Нуклеиновую кислоту полипептида кНА8ЕСР для использования в генотерапии клонируют в этот вектор, который облегчает доставку этого гена в пациента. Более подробное описание ретровирусных векторов может быть найдено в Воекеп е! а1., Вю!йегару 6: 291-302 (1994), где описано использование ретровирусного вектора для доставки гена тбг1 в гемопоэтические стволовые клетки для придания этим стволовым клеткам большей устойчивости к химиотерапии.
Другими ссылками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генотерапии, являются: С1о\\'ек е! а1., I. С1ш. 1пуек!. 93: 644-651 (1994); К1ет е! а1., В1ооб 83: 1467-1473 (1994); 8а1топк апб СипхЬегд, Нитап Сепе ТНегару 4: 129-141 (1993); и Сгокктап апб Уйкоп, Сигг. Орт. 1п Сепейск апб Беуе1. 3: 110-114 (1993).
Аденовирусы являются другими вирусными векторами, которые могут быть использованы в генотерапии. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями для доставки генов в респираторный эпителий. Аденовирусы природно инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают легкое заболевание. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовируса являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы имеют преимущество, заключающееся в том, что они способны инфицировать неделящиеся клетки. Кохагкку апб Уйкоп, Сштеп! Оршюп ш Сепейск апб Эеуе1ортеп1 3: 499-503 (1993) представляют обзор генотерапии на основе аденовируса. Вой! е! а1., Нитап Сепе ТНегару 5: 3-10 (1994) продемонстрировали применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макака-резуса. Другие случаи применение аденовирусов в генотерапии могут быть найдены в ВокепГе1б е! а1., 8аепсе 252: 431-434 (1991); ВокепГе1б е! а1., Се11 68: 143-155 (1992) и Мак!гапдей е! а1., I. С1т. 1пуек!. 91: 225-234 (1993).
Аденоассоциированный вирус (АЛУ) был также предложен для применения в генотерапии (ХУа1к11 е! а1., Ргос. 8ос. Ехр. Вю1. Меб. 204: 289-300 (1993)).
Другой подход к генотерапии включает в себя перенос гена в клетки в культуре ткани такими способами, как электропорация, липофекция, опосредованная фосфатом кальция трансфекция или вирусная инфекция. Обычно, способ переноса включает в себя перенос селектируемого маркера в эти клетки. Затем эти клетки подвергают отбору для выделения клеток, которые поглотили и экспрессируют перенесенный ген. Затем эти клетки доставляют в пациента.
В этом варианте осуществления нуклеиновую кислоту вводят в клетку перед введением ш у1уо полученной рекомбинантной клетки. Такое введение может проводиться любым способом, известным в данной области, в том числе, но не только, трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, инфекцией вирусным или бактериофаговым вектором, содержащим эти последовательности нуклеиновых кислот, клеточным слиянием, опосредованным хромосомами переносом генов, опосредованным микроклетками переносом генов, слиянием сферопластов и т.д. В данной области известны многочисленные способы введения чужеродных генов в клетки (см., например, йоеГПег апб ВеНг, Ме!Н. Епхуто1 217: 599-618 (1993); СоНеп е! а1., Ме!й. Епхуто1 217: 618-644 (1993); Сйпе, Рйагтас. ТНег. 29: 69-92 (1985)) и могут быть использованы, при условии, что необходимые относящиеся к развитию и физиологические функции реципиентных клеток не нарушаются. Этот способ должен обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, так что эта нуклеиновая кислота является экспрессируемой этой клеткой и обычно наследуемой и экспрессируемой ее потомством.
Полученные рекомбинантные клетки могут быть доставлены пациенту различными способами, известными в данной области. В одном варианте осуществления эпителиальные клетки инъецируют, например, подкожно. В другом варианте осуществления рекомбинантные кожные клетки могут использоваться в качестве кожного трансплантата на пациенте. Рекомбинантные клетки крови (например, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники) могут вводиться внутривенно. Предполагае
- 51 011654 мое для применения количество клеток зависит от желаемого эффекта, состояния пациента и т. д. и может быть определено специалистом в данной области.
Клетки, в которые может вводиться нуклеиновая кислота для целей генотерапии, охватывают любой желаемый доступный тип клеток и включают в себя, но не ограничиваются ими, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты; клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, зозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты; различные стволовые клетки или клетки-предшественники, в частности, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, например, стволовые клетки, полученные из костного мозга, крови пупочного канатика, периферической крови, фетальной печени и других источников стволовых клеток и клеток-предшественников.
Например, клетка, используемая для генотерапии, является аутологичной относительно пациента. В одном варианте осуществления, в котором рекомбинантные клетки используют в генотерапии, нуклеиновую кислоту полипептида &НА8ЕОР вводят в эти клетки таким образом, что она может экспрессироваться этими клетками или их потомством, и затем эти рекомбинантные клетки вводят т νί\Ό для терапевтического действия. В конкретном варианте осуществления используют стволовые клетки или клетки-предшественники (недифференцированные клетки). Любые стволовые и/или клеткипредшественники, которые могут быть выделены и могут поддерживаться ш У11го. могут быть потенциально использованы в соответствии с этим вариантом осуществления.
Такие стволовые клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, гемопоэтические стволовые клетки (Н8С), стволовые клетки эпителиальных тканей, таких как кожа или выстилка кишечника, клетки сердечных мышц эмбриона, печеночные стволовые клетки (Публикация РСТ \7О 94/08598, датированная 28 апреля 1994 г.) и нервные стволовые клетки (8!етр1е апб Апбегкоп, Се11 71: 973-985 (1992)).
Эпителиальные стволовые клетки (Е8С) или кератиноциты могут быть получены из тканей, таких как кожа и выстилка кишечника, известными процедурами (КЬештаШ, Ме!Н. Се11 Вю. 21А: 229 (1980)). В слоистой эпителиальной ткани, такой как кожа, обновление происходит в результате митоза стволовых клеток в зародышевом листке, слое, наиболее близком к базальной пластинке. Стволовые клетки в выстилке кишечника обеспечивают быструю степень обновления этой ткани. Е8С или кератиноциты, полученные из кожи или выстилки кишечника пациента или донора, могут выращиваться в культуре ткани (КЬешта1б, Ме!Н. Се11 Вю. 21А: 229 (1980); РШе1ко\у апб 8сой, Сапо. СНшс Ргос. 61: 771 (1986)). Если эти Е8С обеспечены донором, может быть также использован способ супрессии реактивности хозяин против трансплантата (например, облучение, введение лекарственных средств или антител для активации умеренной иммуносупрессии).
В отношении гемопотических стволовых клеток (Н8С) в этом варианте осуществления может быть использован любой способ, который обеспечивает выделение, размножение и поддержание т уйго Н8С. Способы, при помощи которых это может быть выполнено, включают в себя (а) выделение и установление культур Н8С из клеток костного мозга, выделенных из будущего хозяина или донора, или (Ь) применение установленных ранее долгосрочных культур Н8С, которые могут быть аллергенными или ксеногенными.
Неаутологичные Н8С обычно используют в способе супрессии иммунных реакций трансплантации будущего хозяина/пациента. В конкретном варианте осуществления клетки костного мозга человека могут быть получены из заднего подвздошного гребня аспирацией с использованием иглы (см., например, Кобо е! а1., I. С1ш. 1пуек1. 73: 1377-1384 (1984)). Например, эти Н8С могут быть получены высокообогащенными или по существу в чистом виде. Это обогащение может быть выполнено до, во время или после долгосрочного культивирования и может быть выполнено с использованием любого способа, известного в данной области. Долгосрочные культуры клеток костного мозга могут устанавливаться и поддерживаться с использованием, например, модифицированных способов культивирования клеток Декстера (ЭехЮг е! а1., I. Се11 Рйукю1, 91: 335 (1977)) или способов культивирования \Уй1оск-\Уй1е (^Й1оск апб №1йе, Ргос. №Й. Асаб. 8ск и8А 79: 3608-3612 (1982)).
В конкретном варианте осуществления нуклеиновая кислота, подлежащая введению для целей генотерапии, включает в себя индуцируемый промотор, функционально связанный с кодирующим районом, так что экспрессия этой нуклеиновой кислоты является регулируемой посредством регулирования присутствия или отсуствия подходящего индуктора транскрипции.
3. Пролекарства. Обеспечен способ лечения опухолей. Этот способ выполняют введением пролекарства, которое расщепляется в специфическом сайте кНА8ЕСР с высвобождением активного лекарственного средства или его предшественника, который может быть превращен в активное лекарственное средство ш νί\Ό. После контактирования с клеткой, которая экспрессирует активность &НА8ЕОР, это пролекарство превращается в активное лекарственное средство. Этим пролекарством может быть конъюгат, который содержит активный агент, такой как противоопухолевое лекарственное средство, такой как цитотоксический агент или другие терапевтический агент (ТА), связанный с субстратом для нацеливания &НА8ЕОР, так что это лекарственное средство или лекарственный агент является неактивным и неспособным входить в клетку, в конъюгате, но активируется после отщепления. Это пролекарство, например, может содержать молекулу хондроитинсульфата, обычно относительно короткую, меньшую, чем при
- 52 011654 близительно 20 дисахаридных единиц, которая каталитически отщепляется этим нацеленным зНАЗЕСР. Цитотоксические агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, алкилирующие агенты, антипролиферативные агенты и тубулинсвязывающие агенты. Другие агенты включают в себя лекарственные средства νίικη (выделенные из барвинка ^шса)), митомицины, блеомицины и таксаны.
1. Фармацевтические композиции и способы их введения.
1. Компоненты этих композиций. Здесь обеспечены фармацевтические композиции, содержащие комбинации соединений, которые модулируют активность полипептида зНАЗЕСР, и другого способа терапии или соединения для лечения гиалуронидазного нарушения, такого как соединение антитела.
Полипептид зНАЗЕСР и второй агент могут быть упакованы в виде отдельных композиций для введения вместе или последовательно или чередующимся образом. Альтернативно, они могут быть обеспечены в виде единой композиции для введения или в виде двух композиций для введения в виде единой композиции. Эти комбинации могут быть упакованы в виде наборов.
2. Приготовления и способ введения.
Полипептиды зНАЗЕСР и их растворимый домен гиалуронидазы человека, обеспеченные здесь, могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, обычно для введения единственной дозы. Концентрации этих полипептидов в готовых формах являются эффективными для доставки количества, которое, после введения, является эффективным для предполагаемого лечения. Обычно, эти композиции готовят для введения единственной дозы. Для приготовления композиции массовую долю полипептида зНАЗЕСР, его растворимых доменов гиалуронидазы человека или их смеси растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают в выбранном носителе при эффективной концентрации, так чтобы подвергаемое лечению состояние облегчалось или ослаблялось.
Фармацевтические носители или наполнители, подходящие для введения зНАЗЕСР или его растворимых доменов гиалуронидазы человека, обеспеченных здесь, включают в себя любые такие носители, о которых специалистам в данной области известно, что они пригодны для конкретного способа введения.
Кроме того, эти полипептиды могут быть приготовлены в виде единственного фармацевтически активного ингредиента в этой композиции или могут комбинироваться с другими активными ингредиентами. Липосомные суспензии, включающие в себя нацеленные на ткани липосомы, могут быть также подходящими в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Например, липосомная готовая форма может быть приготовлена, как описано в патенте США с номером 4522811.
Активный зНАЗЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека включают в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного действия в отсутствие нежелательных побочных действий на подлежащего лечению пациента. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически тестированием этих полипептидов в известных системах ίη νίίΐΌ и ίη νίνΌ, например, с использованием обеспеченных здесь анализов или описанных в литературе, см., например, Табаш еί а1. (1996) Аηа1. Вюсбет. 240: 60-67, Ебосато еί а1. (1997) ί. ^то1о§у 71: 1417-1427, Зибо й а1. (1996) АтМга1 Кез. 32: 9-18, Вийагб а а1.(1995) ^то1о§у 209: 52-59, В^аисЬ^ еί а1. (1996) Аηа1. Вюсбет. 237: 239-244, Ηатаίаке еί а1. (1996) 1йетго1оду 39: 249-258, ЗГеткиЫег еί а1. (1998) Вюсбет. 37: 8899-8905, Ц'Зои/а еί а1. (1995) I. Сем. νίΐΌ1 76: 1729-1736, Такезбба еί а1. (1997) Атк Вюсбет. 247: 242-246; зее а1зо, е.д., Зкт^и еί а1. (1994) I. νπΌ1. 68: 8406-8408; Μίζυίπηί еί а1. (1996) I. νίΐΌ1. 70: 1219-1223, Μίζπίπηί еίа1 (1996) Вюсбет. Вюрбуз. Кез. Соттии. 227: 822-826, Ьи й а1. (1996) Ргос. №6. Асаб. Зск (ИЗА) 93: 1412-1417, Набт й а1. (1996) ^го1о§у 226: 318-326, Йо а а1. (1996) I. Сем. νίΐΌ1. 77; 1043-1054, Μίζυίπηί еί а1. (1995) Вюсбет. Вюрбуз. Кез. Соттии. 212: 906-911, Сбо еί а1. (1997) ί. νίΐΌ1. Меίб. 65:201-207 с последующей экстраполяцией из них для определения доз для человека.
Обычно рассматривается терапевтически эффективная доза. Вводимые количества могут быть количествами порядка 0,001-1 мг/мл, в том числе приблизительно 0,005-0,05 мг/мл и приблизительно 0,01 мг/мл объма крови. Фармацевтические унифицированные формы доз готовят для обеспечения приблизительно 1 мг - приблизительно 1000 мг, в том числе приблизительно 10 - приблизительно 500 мг и в том числе приблизительно 25-75 мг основного активного ингредиента или комбинации основных ингредиентов на одну дозированную унифицированную форму. Точная доза может быть определена эмпирически.
В некоторых случаях, предпочтительной является высокая унифицированная (стандартная) доза зНАЗЕСР человека. Например, при внутривенном введении предпочтительными являются концентрации зНАЗЕСР 500-100000 Единиц на мл. Лиофилизированные готовые формы зНАЗЕСР являются также идеальными для хранения больших унифицированных доз зНАЗЕСР. Для внутривенной доставки предполагаются флаконы с 200000 единицами лиофилизированного зНАЗЕСР.
Дозы высокой концентрации также обсуждаются для доставки малых объемов зНАЗЕСР. Введение 10-100 мкл 5000 Единиц/мл зНАЗЕСР предполагается для инъекции в переднюю камеру глаза для растворения заранее введенных вязкоупругих веществ во время хирургий по поводу катаракты и внутриглазной имплантации хрусталика. Инъекции малого объема доз 50-200 Е/мл также предлагаются для интравитреальных процедур, таких как лечения витреального кровотечения или витреоретинальной от
- 53 011654 слойки в диабетической ретинопатии.
Инъекции несколько больших объемов (например, приблизительно 1-7 мл или более) обсуждаются для несколько больших и/или более легко дренируемых пространств в теле. Например, как иллюстрируется здесь, периорбитальные инъекции одного или нескольких мл или более могут выполняться в одно или несколько пространств, окружающих глаз, например, инъекцией в суб-теноново или эписклеральное пространство, для активации транссклеральной доставки фармакологических агентов к тканям на обратной стороне глаза, таким как хориоидальное сплетение и/или сетчатка. Как будет понятно специалистам в данной области, некоторые пространства в теле могут легко вмещать более высокие объемы. В качестве иллюстрации, эписклеральное, или суб-теноново пространство вокруг глаза может легко вмещать один-несколько мл или даже большие объемы (например, до более чем 5-10 мл, в зависимости, например, от характеристик конкретной ткани и скорости, при которой доставляется этот объем).
Кроме того, как описано и проиллюстрировано здесь, кажется, что введение вНАЗЕОР (потенциально в комбинации с одним или несколькими дополнительными фармакологическими или другими агентами) в более высоком объеме может быть использовано для дополнительной стимуляции доставки агентов к желаемым участкам-мишеням в теле. Без ограничения конкретным механизмом действия, авторы считают, что такие инъекции больших объмов могут дополнительно стимулировать проникновение или распределение как вНАЗЕОР, так и другого агента (других агентов), присутствующих в обрабатываемой ткани посредством процесса конвективного транспорта, который стимулируется увеличенным дифференциалом давления. Опять, без ограничения конкретным механизмом действия, авторы считают, что такой увеличенный дифференциал давления может вызываться в контексте этого изобретения, 1п1ег а11а, одним из следующих событий: (ί) увеличенным напорным давлением или повышенным «гидравлическим давлением» (например, обусловленным увеличенным гидростатическим давлением, связанным с инъекцией, которая в значительной степени наполняет или несколько переполняет или растягивает пространство или участок инъекции); и (ίί) уменьшенным давлением ниже по потоку или уменьшенным «импедансом» (например, вызываемым открыванием каналов в интерстициальном матриксе, ассоциированным с локализованной гиалуронидазной активностью и последующим расщеплением относительно гидратированного гуалуронана). Предпочтительными гиалуронидазами для использования в этом и других применениях этого изобретения (таких как облегчение доставки фармакологических и других агентов) являются вНАЗЕОР, в частности, вНАЗЕОР человека, в связи с доставкой агентов к одной или нескольким тканям в теле человека. Однако эти и другие подходы к использованию и применению гиалуронидаз могут быть также применены с использованием вНАЗЕОР не человека, таких как вНАЗЕОР млекопитающих, а также других гиалуронидаз человека или млекопитающих, предпочтительно растворимых форм таких гиалуронидаз.
Активный ингредиент может вводиться сразу или может быть разделен на ряд меньших доз для введения их с интервалами времени между ними. Понятно, что точная доза и продолжительность лечения зависит от подлежащего лечению заболевания и может быть определена эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или экстраполяцией из результатов тестирования ίη νίνο и ίη νίίτο. Следует отметить, что концентрации и величины доз могут также варьироваться в зависимости от тяжести состояния, которое должны быть облегчено. Кроме того, должно быть понятно, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы введения доз должны корректироваться на протяжении времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица, вводящего или контролирующего введение этих композиций, и что диапазоны концентраций, представленные здесь, являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленных композиций и содержащих их комбинаций.
Фармацевтически приемлемые производные включают в себя формы кислот, солей, сложных эфиров, гидратов, сольватов и пролекарств. Это производное обычно выбирают таким образом, что его фармакокинетические свойства являются превосходящими относительно свойств соответствующих нейтрального вНАЗЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека.
Таким образом, эффективные концентрации или количества одного или нескольких из описанных здесь полипептидов или их фармацевтически приемлемых производных смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или наполнителем для системного, местного или локального введения с образованием фармацевтических композиций. Полипептиды вНАЗЕОР или их растворимые домены гиалуронидазы человека включены в количестве, эффективном для уменьшения симптомов или лечения нарушения, для которого предлагается лечение. Концентрация активного полипептида в этой композиции зависит от абсорбции, инактивации, скоростей экскреции активного полипептида, схемы введения доз, вводимого количества, конкретной готовой формы, а также других факторов, известных специалистам в данной области.
Терапевтические агенты для применения в этих способах могут вводиться любым способом, известным специалистам в данной области, например, но не только, местным, внутрисуставным, интрацистернальным, внутриглазным, периорбитальным, интравентрикулярным, интратекальным, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным, подкожным, внутритрахеальным способами, а также любой комбинацией любых двух или нескольких из них. Могут ожи
- 54 011654 даться также легочные формы, состоящие из сухого порошка.
Наиболее подходящий способ для введения будет варьироваться в зависимости от предполагаемого применения, такого как, например, применение агента доставки для облегчения подкожной доставки текучих веществ, применение для уменьшения внутриглазного давления в глазах пациентов с глаукомой, получающих вязкоупругие вещества, или применение в качестве «распределяющего агента» для увеличения активности химиотерапевтических веществ или представляющего интерес размещения, например, в конкретном внутреннем органе, в месте роста опухоли, внутриглазной полости и эпидермисе. Способы введения включают в себя, но не ограничиваются ими, местный, локальный, внутрисуставный, интрацистернальный, внутриглазной, периорбитальный, интравентрикулярный, интратекальный, внутривенный, внутримышечный, внутритрахеальный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный способы и комбинацию любых двух или нескольких из них. Например, для лечения различных раковых заболеваний, таких как плоскоклеточный рак, рак молочной железы, рак мочевого пузыря и рак желудочно-кишечного тракта, местное введение, в том числе введение в участок роста опухоли (например, интратекально, интравентрикулярно или интрацистернально) обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что терапевтический агент может вводиться в высокой концентрации без риска осложнений, которые могут сопутствовать системному введению терапевтического агента.
В качестве примерного класса фармакологических агентов, которые могут комбинироваться с κΗΑ8ΕΟΡ (или другими гликозаминогликаназами) (например, комбинированием совместным приготовлением с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ или совместным введением с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ (которые могут вводиться до, вместе или после введения этого агента)), был описан ряд агентов, имеющих эффективность или потенциальную эффективность в лечении различных раковых заболеваний, и регулярно развиваются новые противораковые агенты, которые могут комбинироваться с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ (например, обеспеченными совместным приготовлением или совместным введением до, вместе и/или после введения этого агента) для улучшения фармакокинетики, фармакодинамики или других полезных свойств этого агента.
В качестве иллюстрации (и без ограничения) в настоящее время ряд противораковых или химиотерапевтических агентов был одобрен для лечения различных раковых заболеваниий, которые могут комбинироваться с κΗΑδΕΟΡ (или другими гликозаминогликаназами) совместным приготовлением или совместным введением (до, вместе и/или после введения этого противоракового агента). Такие агенты включают в себя, например, Альдеслейкины (например, ΡΚΌ^ΕυΚIN™); Алемтузумабы (например, САМРАТН™); Алитретиноины (например, ΡΑΜΠΕΤ^™); Аллопуринолы (например, ΖΥΕ0ΡΚΙΜ™); Алтретамины (например, ^ΧΑΡΕΜ™); Амифостины (например, ΕΤΗΥ0Ε™); Анастрозолы (например, ΑΚΙΜΙΌΕΧ™); Триоксиды мышьяка (например, ΤΚIδΕN0X™); Аспарагиназы (например, ΕΕδΡΑΚ™); ВСС Ыте (например, ПСБ™ ВСС); Бексаротены (например, ΤΑΚ6ΚΕΤIN™); Блеомицины (например, Β^ΕN0XΑNΕ™); Бусульфаны внутривенные (например, ΒυδυΕΕΕΧ™); Бусульфаны пероральны (например, ΜΥΕΕΚΑΧ™); Калустероны (например, ΜΕΤΗ08ΑΚΒ™); Капецитабины (например, ΧΕΕ0ΌΑ™); Карбоплатины (например, ΡΑΚΑΡΕΑΤΙΜ™); Кармустины (например, ΒСNυ™, Βιί-Ήυ™); Кармустины с Полифепрозаны (например, ΟΕΙΑΌΕΕ™ ХУаГег (облатки)); Целекоксибы (например, СБЕБΒΚΕΧ™); Хлорамбуцилы (например, ΕΤυΚΕΚΑΧ™); Цисплатины (например, Ρ^ΑΤIN0^™); Кладрибины (например, ΡΕ^ΤΑΤ^™, 2СάΑ™); циклофосфамиды (например, СΥΤ0XЛN™, NΕ0δЛΚ™); Цитарабины (например, СΥΤ0δЛΚ-υ™); Цитарабины липосомные (например, ΌΕΡ0ί.’νΙ™); Дакарбазины (например, ОПС-Эоте™); Дактиномицины (например, ^δΜΕΟΕΜ™); Дарбепоэтины Альфа (например, ЛΚΑNΕδΡ™); Даунорубицины липосомные (например, ^ΑNυ0X0ΜΕ™); Даунорубицины/Дауномицины (например, ΕΕΚυΒΙΟΙΧΕ™); Денилейкин-Дифтитоксы (например, 0NΤЛΚ™); Декстразоксаны (например, Ζ^Εί-ΆΡΌ™); Доцетакселы (например, ΤΑΧ0ΤΕΚΕ™); Доксорубицины (например, ΑΟ^^ΜΥ^^™, ΚυΒΕΧ™); Доксорубицины липосомные (например, Ό0ΧΙΕ™); пропионаты Дромастанолона (например, ^ΚΌΜΟδΤΑNΟ^ΟNΕ™ и ΜΑδΤΕΚ0NΕ™ инъекция); Растворы Эллиота В (например, БШоП'к Β 8о1ийоп™); Эпирубицины (например, Ε^^ΕСΕNΕ™); Эпоэтины Альфа (например, ΕΡ06ΕN™); Эстрамустины (например, ΕΜСΥΤ™); Этопозида фосфаты (например, ΕΤ0Ρ0ΡΗ08™); Этопозиды νΡ-16 (например, νΕΡΕδΙΌ™); Эксеместаны (например, ЛΚΌΜΑ8IN™); Филграстимы (например, NΕυΡ06ΕN™); Флоксуридины (например, ЕЦЭР™); Флударабины (например, ΡΕυΠΑΚΑ™); Фторурацилы, в том числе 5-ФУ (например, ΑΩΡΕί-ΊΕ™); Фулвестраны (например, ΕΑ8Ε0ΌΕΧ™); Гемцитабины (например, 6ΕΜΖΑΚ™); Гемтузумабы/Озогамицины (например, ΜΥΕ0ΤΑΚ6™); ацетаты Гозерелина (например, Ζ0^Л^ΕX™); Гидроксимочевины (например, ΗΥΌΚΕΑ™); Ибритумомабы/Тиуксетаны (например, ΖΕνΑΕΙΧ™); Идарубицины (например, ^ΑΜΥΟΥ™); Ифосфамиды (например, ΙΡΕΧ™); мезилаты Иматиниба (например, ΟΕΕΕνΕί.’™); Интерфероны Альфа-2а (например, Κ0ΕΕΚ0N-Α™); Интерфероны Альфа-2Ь (например, INΤΚ0N А™); Иринотеканы (например,
СЛΜΡΤ0δЛΚ™); Летрозолы (например, ΡΕΜΑΚΑ™); Лейковорины (например, \VΕ^^С0V0ΚIN™. ^ΕυС0V0ΚIN™); Левамизолы (например, ΕΚСΛΜIδ0^™); Ломустины/ССNυ (например, СееΒυ™); Меклоретамины/Азотные аналоги иприта (например, ΜυδΤΑΚ6ΕN™); Мегестрола ацетаты (например,
- 55 011654
МЕСАСЕ™); Мелфаланы/Ь-РАМ (например, АЬКЕКА№М); Меркаптопурины, в том числе 6-МП (например, РЕК^НТКОи™); Месны (например, МЕ8№Х™); Метотрексаты, Метоксалены (например, ИУАОЕХ™); Митомицины С (например, ΜυТΆΜΥСIN™, ΜIТОΖΥТКЕX™); Митотаны (например, ΕΥ8ОПКЕМ™); Митоксатроны (например, NОNАNТКОNЕ™); Нандролона фенпропионаты (например, ПиКАВОЕШ-50™); Нофетумомабы (например, УЕКБИМА™); Опрелвекины (например, №ИМЕСА™); Оксалиплатины (например, ЕБОХАТШ™); Паклитакселы (например, РАХЕ№™, ТАХОБ™); Памидронаты (например, АКЕБ1А™); Пегадемазы (например, АЭАСЕЖ™); Пегаспаргазы (например, ОNСА8ΡΆК™); Пегфилграстимы (например, №ИЕА8ТА™); Пентостатины (например, МРЕОТ™); Пипоброманы (например, УЕКСΥТЕ™); Пликамицин/Митрамицины (например, ΜIТΗКАСIN™); Порфимер-натрий (например, ΡΗОТОΕКIN™); Прокарбазины (например, МАТ^А^™); Хинакрины (например, АТАВК.ШЕ7™); Расбуриказы (например, ЕБ1ТЕК™); Ритуксимабы (например, КIТυXАN™); Сарграмостимы (например, ΡКОКINЕ™); Стрептозоцины (например, ΖАNО8АК™); Тальки (например, 8СБЕКО8ОБ™); Тамоксифены (например, NО^УΆ^ЕX™); Темозоломиды (например, ТЕМОБАК™); Тенипозиды/УМ-26 (например, УυΜОN™); Тестолактоны (например, ТЕ8БАС™); Тиогуанины, в том числе 6ТГ; Тиотепы (например, ТШОРБЕХ ™); Топотеканы (например, ΗΥСΆΜТIN™); Торемифены (например, ΕΆКЕ8ТОN™); Тозитумомабы (например, ВЕХХАК™); Трастузумабы (например, ΗЕКСЕΡТIN™); Третиноины/АТКА (например, УЕ8АNОI^™); Урацил-азотные аналоги иприта; Валрубицины (например, УАБ8ТАК™); Винбластины (например, УЕ^ΒАN™); Винкристины (например, ОNСОУIN™); Винорелбины (например, NАУЕ^ΒINЕ™); Золедронаты (например, ΖОΜЕТА™); а также другие агенты, описанные здесь и в данной области.
Как и в случае других классов фармакологических агентов, описанных здесь, κΗА8ЕСΡ (или другая гликозаминогликаназа) может быть использован вместе с введением (или при совместном приготовлении с ними) отдельного фармакологического агента (такого как, например, противоопухолевое средство или член другого класса агентов, описанных здесь и/или известных в данной области). Альтернативно, &ЫА8ЕСР (или другая гликозаминогликаназа) может быть использован вместе с введением (или при совместном приготовлении с ними) более чем одного фармакологического агента (например, множественных противоопухолевых агентов или множественных членов других классов агентов, описанных здесь и/или известных в данной области). В случае комбинаций с двумя или более агентами определенного класса часто бывает предпочтительно, чтобы эти два или более агентов действовали посредством двух или более механизмов действия. κΗА8ЕСΡ (или другая гликозаминогликаназа) может быть также использован вместе с введением (или при совместном приготовлении с ними) одного фармакологического агента первого определенного класса (такого как, например, противоопухолевое средство или член одного из других классов агентов, описанных здесь и/или известных в данной области), и одного или нескольких дополнительных фармакологических агентов одного или нескольких других классов, которые применимы для лечения любого разнообразия состояний. Таким образом, хотя некоторые принципы называются здесь в случае противораковых агентов для целей иллюстрации, эти принципы применимы также, например, к противоинфекционным агентам и многочисленным членам других классов агентов, которые описаны и проиллюстрированы здесь, а также дополнительным агентам, которые уже известны в данной области или заново разрабатываются.
В случае любых описанных здесь комбинаций и/или совместных готовых форм, описанных здесь (содержащих по меньшей мере один κΗА8ЕСΡ (или другую гликозаминогликаназу) и по меньшей мере один другой агент (такой как фармакологический агент, например, член одного из классов иллюстрированных здесь агентов)), также предполагается, что такая комбинация и/или совместная готовая форма может дополнительно содержать один или несколько агентов (таких как различные стабилизаторы, эксципиенты и т.п.), которые сами не проявляют существенных фармакодинамических эффектов, но которые стимулируют применимость этой комбинации и/или совместной готовой формы (например, стабилизацией одного или нескольких из компонентов или всей готовой формы, улучшением активации или нацеливания одного или нескольких из этих агентов или ША8ЕСР и/или уменьшением токсичности или улучшением иным образом профиля безопасности этой комбинации или совместной готовой формы).
Как будет понятно специалистам в данной области, постоянно разрабатываются новые версии и композиции этих и других противораковых агентов (а также членов других классов агентов, описанных здесь), которые могут также комбинироваться с κΗА8ЕСΡ (или другими гликозаминогликаназами). Кроме того, поскольку такие ферменты могут использоваться для улучшения фармакокинетических и/или фармакодинамических профилей большого разнообразия агентов и делают возможной доставку агентов различными (и потенциально более нацеленными) путями, например, κΗА8ЕСΡ (или другие гликозаминогликаназы) могут быть использованы для улучшения профилей РК и/или РБ ряда агентов, которые, как считалось прежде, имели субоптимальные профили. Испытание агентов в подходящих моделях животных вместе с κΗА8ЕСΡ и без сопутствующего ΗА8ЕСΡ может быть использовано для оценки относительной эффективности и токсичности конкретных агентов.
Как проиллюстрировано и описано в примерах здесь, ряд имеющих большие молекулы агентов (та
- 56 011654 ких как антитела и другие белки, в частности, антитела и белки, вводимые не-Ш парентеральной инъекцией), проявляют относительно плохие фармакокинетические профили и могут быть, в частности, улучшены совместным приготовлением или совместным введением с зНАБЕСР (или другими гликозаминогликаназами). Без ограничения конкретным механизмом действия, обычно считается, что агенты с малыми молекулами, проявляющие относительно низкую гидрофобность, являются более эффективно диспергируемыми, например, посредством конвективного транспорта в интерстициальных жидкостях, когда они стимулируются зНАБЕСР (или другими гликозаминогликаназами). Используемым обычно способом для предсказания таких признаков является оценка рассчитанных и/или приближенное определение коэффициентов распределения октанол:вода (Ко„), которые сообщались для ряда соединений. В этом отношении, предпочтительными являются агенты, проявляющие Ко„ <3, более предпочтительно <2 или <1, более предпочтительно <0, еще более предпочтительно <(-1). Как будет понятно специалистам в данной области, многие агенты могут быть также модифицированы ковалентно и/или нековалентно для увеличения их гидрофильности и/или для заключения таких агентов в везикулы или макромолекулярные комплексы для облегчения их проникновения и/или доставки.
Для целей дополнительной иллюстрации (и без ограничения) примерные противораковые или химиотерапевтические фармакологические агенты, которые могут комбинироваться с зНАБЕСР (или другими гликозаминогликаназами), включены в следующий перечень (и включают в себя другие, известные в данной области): Ацивицины; Акларубицины; Акодазолы; Акронины; Адозелезины; Альдеслейкины; Алитрениноины (9-цис-ретиноевые кислоты); Алтретамины; Алвоцидибы; Амбазоны; Амбомицины; Аметантроны; Аминоглютетимиды; Амсакрины; Анастразолы; Анаксироны; Анцитабины; Антрамицины; Апазиквоны; Аргимесны; Аспарагиназы; Асперлины; Атримустины; Азацитидины; Азетепы; Азотомицины; Баноксантроны; Батабулины; Батимастаты; Бенаксибины; Бендамустины; Бензодепы; Бексаротены; Бикалутамиды; Биэтазерпины; Бирикодары; Бисантрены; Бисантрены; Биснафида, Димезилаты; Бизелезины; Блеомицины; Бортезомибы; Бреквинары; Бропиримины; Будотитаны; Бусульфаны; Кактиномицины; Калустероны; Канертинибы; Капецитабины; Карацемиды; Карбетимеры; Карбоплатины; Карбоквоны; Кармофуры; Кармустины; Карубицины; Карзелезины; Цедефинголы; Цемадотины; Хлорамбуцилы; Циотеронелы; Циролемицины; Цисплатины; Кладрибины; Кланфенуры; Клофарабины; Криснатолы; Циклофосфамиды; Цитарабины; Дакарбазины; Дактиномицины; Даунорубицины; Децитабины; Декснигулдипины; Дексормаплатины; Дезагуанины; Диазиквоны; Диброспидиумы; Диеногесты; Диналины; Дисермолиды; Доцетакселы; Дофеквидары; Доксифлуридины; Доксорубицины; Дролоксифены; Дромосталона пропионаты; Дуазомицины; Экомустины; Эдатрексаты; Эдотекарины; Эфлорнитины; Элакридары; Элинафиды; Элсамитруцины; Эмитефуры; Энлоплатины; Энпроматы; Энзастаурины; Эпипропидины; Эпирубицины; Эпталопросты; Эрбулозолы; Эзорубицины; Эстрамустины; Этанидазолы; Этоглюциды; Этопозиды; Этоприны; Экзисулинды; Фадрозолы; Фазарабины; Фенретиниды; Флоксуридины; Флударабины; Фторурацилы; Флуоксиместероны; Фторцитабины; Фосквидоны; Фостриецины; Фотретамины; Галарубицины; Галоцитабины; Гемцитабины; Герохинолы; Гиматеканы; Гимерацилы; Глоксазоны; Глюфосфамиды; Гидроксимочевины; Идарубицины; Ифосфамиды; Илмофозины; Иломастаты; Имексоны; Импросульфаны; Индисуламы; Инпроквоны; Интерфероны; Интерфероны Альфа; Интерфероны бета; Интерфероны гамма; Интерлейкины 2 и другие Интерлейкины (в том числе рекомбинантные Интерлейкины); Интоплицины; Иобенгуаны [131-Ι]; Ипроплатины; Иринотеканы; Ирзогладины; Иксабепилоны; Иксабепилоны; Кетотрексаты; Ь-Аланозины; Ланреотиды; Лапатинибы; Ледоксандроны; Летрозолы; Лейпролиды; Лейпрорелины (Лейпрорелиды); Лексакалыдитолы; Лиарозолы; Лобаплатины; Лометрексолы; Ломустины; Лонафарнибы; Лозоксантроны; Луртотеканы; Мафосфамиды; Манносульфаны; Маримастаты; Мазопроколы; Майтансины; Мехлоретамины; Мегестролы; Меленгестролы; Мелфаланы; Меногарилы; Мепитиостаны; Меркаптопурины; Метезинды; Метотрексаты; Метомидаты; Метоприны; Метуредепы; Мибоплатины; Мипроксифены; Мизонидазолы; Митиндомиды; Митокарцины; Митохромины; Митофлаксоны; Митогиллины; Митогуазоны; Митомалцины; Митомицины; Митонафиды; Митоквидоны; Митосперы; Митотаны; Митоксантроны; Митозоломиды; Мивобулины; Мизорибины; Мофаротены; Мопидамолы; Мубритинибы; Микофеноловые кислоты; Недаплатины; Нелзарабины; Неморубицины; Нитракрины; Нокодазолы; Ногаламицины; Нолатрекседы; Нортоприксантроны; Октреотиды; Ормаплатины; Ортатакселы; Отерацилы; Оксисураны; Оксофенарсины; Паклитацелы; Памидронаты; Патубилоны; Пегаспаргазы; Пелдезины; Пелиомицины; Пелитрексолы; Пеметрекседы; Пентамустины; Пепломицины; Перфосфамиды; Перифозины; Пикоплатины; Пинафиды; Пипоброманы; Пипосульфаны; Пирфенидоны; Пироксантроны; Пиксантроны; Плевитрекседы; Пликамицины; Пломестаны; Порфимеры; Порфиромицины; Преднимустины; Прокарбазины; Пропамидины; Проспидиумы; Пумитепы; Пуромицины; Пиразофурины; Ранимустины; Рибоприны; Ритросульфаны; Роглетимиды; Роквинимексы; Руфокромомицины; Сабарубицины; Сафинголы; Сатраплатины; Себриплатины; Семустины; Симтразены; Сизофираны; Собузоксаны; Сорафенибы; Спарфозаты; Спарфозовые кислоты; Спарсомицины; Спирогермании; Спиромустины; Спироплатины; Спироплатины; Скваламины; Стрептонигрины; Стрептоварицины; Стрептозоцины; Суфосфамиды; Сулофенуры; Тацединалины; Талисомицины; Таллимустины; Тариквидары; Тауромустины; Текогаланы; Тегафуры; Телаксантроны; Темопорфины; Тенипозиды; Тероксироны; Тестолактоны; Тиамиприны; Тиогуанины; Тиотепы; Тиамиприны; Тиазофурины; Тиломизо
- 57 011654 лы; Тилороны; Тимкодары; Тимонацики; Тирапазамины; Топиксантроны; Торемифены; Трабектедины (Эктеинасцидин 743); Трастузумабы; Трестолоны; Трицирибины; Трицирибины; Трилостаны; Триметрексаты; Триплатина Тетранитраты; Трипторелины; Трофосфамиды; Тубулозолы; Убенимексы; Урацилазотные аналоги иприта; Уредепы; Валсподары; Вапреотиды; Вертепорфины; Винбластины; Винкристины; Виндезины; Винепидины; Винфлунины; Винформиды; Винглицинаты; Винлейцинолы; Винлейрозины; Винорелбины; Винросидины; Винтриптолы; Винзолидины; Ворозолы; Ксантомицины А (Гуамециклины); Зениплатины; Зиласкорбы [2-Н]; Зиностатины; Зорубицины; Зосуквидары; и т.п.
Фармацевтические и косметические носители и наполнители, подходящие для введения полипептидов хНАБЕСР или их растворимого домена гиалуронидазы человека, обеспеченных здесь, включают в себя любые такие носители, о которых специалистам в данной области известно, что они пригодны для конкретного способа введения. Кроме того, эти полипептиды могут быть приготовлены в виде единственного фармацевтически активного ингредиента в этой композиции или могут комбинироваться с другими активными ингредиентами, которые не ухудшают желаемое действие, или с материалами, которые дополняют это желаемое действие, известными специалистам в данной области. Например, обеспеченные здесь полипептиды хНАБЕСР могут быть использованы в качестве доставляющего или «распределяющего» агента в комбинации со вторым активным соединением, таким как терапевтически активный агент, в том числе, но не только, лекарственное средство или пролекарство, для облегчения доставки или для повышения активности второго активного ингредиента. В конкретном варианте осуществления полипептид хНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть совместно приготовлен или совместно введен с анастезирующим агентом, таким как лигнокаин, бупивикаин или смесь этих двух агентов, и, необязательно с гормональным агентом, таким как эпинефрин, для уменьшения или остановки поглощения кровью во время глазной хирургии. В другом конкретном варианте осуществления полипептид хНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть совместно приготовлен или совместно введен с фармакологическим агентом, таким как противовоспалительный агент, для усиления доставки этого фармакологического агента к тканям млекопитающего ш νίνο (например, к частям глаза), где такой агент является желательным для лечения конкретного состояния. Под совместным введением имеют в виду введение хНАБЕСР (или другой гликозаминогликаназы) вместе или в близкой временной точке относительно введения фармакологического агента. Обычно предпочтительно вводить хНАБЕСР (или другую гликозаминогликаназу) незадолго до введения фармакологического агента (например, за 5-60 мин до введения) или, для максимального удобства, вместе с фармакологическим агентом. Как будет понятно специалистам в данной области, желаемая близость совместного введения зависит в значительной степени от эффективных полупериодов существования этих агентов в условиях конкретной ткани и от конкретного подлежащего лечению заболевания и может быть легко оптимизирована испытанием эффектов введения этих агентов при варьируемых периодах времени в подходящих моделях, таких как модели животных. В некоторых ситуациях, оптимальный тайминг введения хНАБЕСР (или другой гликозаминогликаназы) будет превышать 60 мин. В качестве иллюстрации и без связывания себя теорией, авторы считают, что в ситуациях с некоторыми опухолями, например, максимальное вхождение химиотерапевтического агента в опухоль может происходить после по существу полного расщепления гуалуронана в опухоли для уменьшения интерстициального объема опухоли, после чего следует гиалуронан-регенеративная фаза, во время которой жидкость втягивается обратно в опухоль, что приводит к увеличенной адсорбции химиотерапевтического агента из плазмы. В последнем случае, оптимальное введение хНАБЕСР (или другой гликозаминогликаназы) может быть получено между приблизительно одним часом и двадцатью часами перед введением этого фармакологического агента. Для оптимизации тайминга (хронометрирования) предварительного введения относительно фармакологического агента для конкретной комбинации патологического состояния и фармакологического агента, специалист в данной области может провести рутинный курс предварительного введения, обычно сравнением одной или нескольких временных точек в течение часа или менее, с одной или несколькими временными точками, превышающими час (но обычно не превышающими периода одного дня), для оптимизации тайминга введения. Полипептид хНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть также совместно приготовлен или совместно введен с химиотерапевтическими агентами, такими как токсин и фактор некроза опухолей, для увеличения активности этого химиотерапевтического агента и/или доступности опухолей-мишеней для этого химиотерапевтического агента. Это активное соединение включают в носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного действия в отсутствие серьезных токсических действий на проходящего лечение индивидуума. Эффективная концентрация может быть определена эмпирически испытанием этих соединений с использованием систем ш νίίτο и ш νίνο, в том числе моделей животных, описанных здесь.
В случае фармакологических агентов, которые доставляют парентеральным введением (т.е. другими способами, чем доставка через пищеварительный тракт, такими как, например, подкожный, внутрикожный или внутривенный способы), хНАБЕСР (или другие гликозаминогликаназы) могут быть легко совместно приготовлены или совместно введены с любым из ряда таких фармакологических агентов для увеличения их доставки к желаемым участкам тела. Например, в зависимости от конкретной комбинации фармакологического агента и способа введения, доставка может быть увеличена посредством увеличе- 58 011654 ния степени и/или скорости, при которых этот агент диффундирует через ткань в участке доставки или вблизи участка доставки (например, после его инъекции) и/или степени (и/или скорости), при которых этот агент диффундирует и/или переносится конвективным транспортом через ткань-мишень (например, после высвобождения из кровотока, лимфы, цереброспинальной жидкости или другой жидкой системы). Степень, с которой увеличивается доставка, может быть легко оценена, например, в модельных системах животных, в которых добавление 8ΗЛδΕСΡ приводит к измеримому увеличению биодоступности этого агента в представляющих интерес тканях в теле.
Не желая быть связанными теорией, авторы считают, что в случае невнутривенных парентеральных агентов (таких как подкожные, внутрикожные и внутримышечные инъекционные растворы) присутствие 8ΗΑδΕСΡ (или другой гликозаминогликаназы) вблизи места инъекции и «лежащих ниже по потоку» участках, таких как участки между местом инъекции и дистальным сосудистым ложем, может увеличивать диффузию и/или конвективный транспорт этого агента в такую систему доставки, как сосудистая сеть. Увеличенная доставка в такой ситуации может быть ассоциирована с увеличением количества этого агента, которое эффективно проходит через участок начальной доставки и выходит из участка начальной доставки (потенциально увеличением как объема, так и скорости общего потока жидкости).
В случае многих фармакологических агентов, которые подвергаются расщеплению, удалению или другим формам инактивации в тканях, увеличение скорости их прохождения через ткань может, в свою очередь, значительно увеличивать количество эффективного агента, которое проходит через эту ткань, что дополнительно увеличивает его биодоступность. Как для невнутривенно вводимых парентеральных агентов, которые затем входят в кровоток или другой канал, так и для агентов, доставляемых непосредственно в сосуды канала (например, внутривенным введением, IV), способность агента диффундировать через ткань, обеспечиваемая этим каналом, может быть также увеличена присутствием 8ΗΑδΕСΡ в этой ткани. Независимо от того, присутствует ли 8ΗΑδΕСΡ в «доставляющей ткани», так, как это имеет место в первом случае, и/или в «ткани-мишени», как в последнем случае, присутствие 8ΗΑδΕСΡ может, следовательно, увеличивать эффективную степень и/или скорость доставки фармакологического агента к тканям-мишеням в теле. В каждом случае, 8ΗΑδΕСΡ может быть использован для увеличения эффектоивной биодоступности фармакологического агента, с которым он совместно приготовлен или совместно введен. В результате, 8ΗΑδΕСΡ может быть использован для достижения увеличенных и/или более быстро достигаемых концентраций этого агента с получением, например, более сильной и/или более быстрой реакции на предоставленную дозу. Альтернативно, 8ΗΑδΕСΡ может быть использован, например, для создания возможности достижения конкретной реакции с более низкой дозой введенного агента. Способность 8ΗΑδΕСΡ (или другой гликозаминогликаназы) увеличивать общий поток жидкости в месте инъекции и вблизи места инъекции может также улучшать другие аспекты ассоциированной фармакологической доставки. Например, увеличение общего потока жидкости может способствовать тому, что объем инъецированной жидкости будет более легко распространяться от места инъекции (уменьшая потенциально болезненные или другие неблагоприятные последствия инъекции). Действительно, давно было признано, что подобные неблагоприятные ощущения, ассоциированные с не-Ш парентеральными инъекциями, являются ключевой причиной, по которой пациенты могут сопротивляться не-Ш парентеральному введению или избегать не-Γν парентерального введения (которое может эффективно требовать, чтобы продукт был введен внутривенно, когда он может в противном случае предоставляться более удобно и/или безопасно через не-Ш-путь).
В использовании 8ΗΑδΕСΡ (или другой гликозаминогликаназы) данного изобретения для увеличения доставки одного или нескольких фармакологических или других агентов в теле (применения, которое иногда называют «распространением»), 8ΗΑδΕСΡ (или другая гликозаминогликаназа) может вводиться тем же способом, что и фармакологический агент, в этом случае он может быть совместно приготовлен или иным образом совместно введен с фармакологическим агентом, или может быть введен отдельно, предпочтительно раньше, чем фармакологический агент, как обсуждалось выше. Альтернативно или наряду с этим, 8ΗΑδΕСΡ (или другая гликозаминогликаназа) может вводиться другим способом введения. Например, фармакологический агент может быть введен локально не-Ш парентеральной инъекцией, а 8ΗΑδΕСΡ может быть введен внутривенно. В качестве другого иллюстративного и неограничивающего примера, 8ΗΑδΕСΡ может быть введен не-Ш парентеральной инъекцией (в ткани, которая должна быть мишенью фармакологического агента), а сам фармакологический агент может быть введен другим способом, таким как внутривенный, не-парентеральный (например, пероральный), или другим способом. Таким образом, как будет понятно специалистам в данной области, 8ΗΑδΕСΡ данного изобретения может быть использован для увеличения доставки и биодоступности различных фармакологических и других агентов, в том числе агентов, которые обычно доставляются парентеральным, а также непарентеральным способами.
Например, 8ΗΑδΕСΡ (или другие гликозаминогликаназы) могут быть совместно приготовлены или совместно введены с рядом фармакологических агентов, которые обычно вводят парентеральной доставкой, например, для увеличения их эффективности и/или улучшения профиля риск/польза в лечении заболевания.
В качестве иллюстрации разнообразных фармакологических агентов, которые могут быть паренте- 59 011654 рально введены и доставка и/или биодоступность которых увеличивается совместным приготовлением и/или совместным введением с кНАЗЕСР (или другими гликозаминогликаназами) этого изобретения, следующий перечень не является исчерпывающим (и, следовательно, не предназначен для ограничения), а просто приведен для обеспечения примерных агентов: Адалимумабы (например, НИМ1КА™), Агалзидазы Бета (например, РАВКАЕУМЕ™), Альдеслейкины (РКОЬЕиКГЫ™ 1Ь-2), Алефацепты (например, АМЕУГУЕ™), Ампициллины (например, иНАЗУН™ инъекция), Анакинры (например, К1ХЕКЕТ™), Антиполиомиелитные Вакцины (например, РЕИ1АК1Х™), Антитимоциты (например, ТНУМОСЬОВИЬГИ™), Азитромицины (например, 21ТНКОМАХ™ ΐν), Бекаплермины (например, КЕОКАКЕХ7™), Каспофунгины (например, САNСI^АЗ™), Цефазолины (например, АNСЕР™ и СЕРЛΖО^IN™), Цефепимы (например, МА.Х1Р1МЕтм), Цефотетаны (например, СЕРОТА^™), Цефтазидимы (например, РОКТА2™), Цефтриаксоны (например, КОСЕРЕИ™), Цетуксимабы (например, ЕКВ1ТИХ™), Циластатины (например, РКГМАХГЫ™ ΐν), Клавулановые кислоты (например, вместе с Амоксициллинами, такими как АИСМЕКПИ™), Клиндамицины (например, СЕЕОСГИ™), Дарбепоэтины Альфа (например, ЛКАNЕЗР™), Деаклизумабы (например, ΖЕNЛРЛX™), Дифтерийные Токсоиды (обычно в комбинациях, например, ИАРТАСЕЕ™, ΐΝΕΆΝΚΐΧ™ и РЕИ1АК1Х™), Эфализумабы (например, КАРТГУА™), Эпинефрины (например, ЕРIРЕN™), Эритропоэтины Альфа (например, ЕРОСЕN™ и РКОСК1Т™), Этанерцепты (например, ЕИВКЕЕ™), Филграстимы (например, NЕυРОСЕN™), Флуконазолы (например, ^IР^υСАN™ Инъекция), Фолликулостимулирующие гормоны, такие как Фоллитропины Альфа (например, СОNЛ^-Р™) и Фоллитропины Бета (например, РОЬЫЗТГМ™), Фосфенитоины (например, СЕКЕВУХ™), Флуконазолы (например, Гадодиамиды (например, ОММ^А^™), Гадопентетаты (например, МАСNЕVIЗТ™), Гатифлоксацины (например, ТЕОиГХ™), Глатирамеры (например, СОРАХОИЕ™), СМ-СЗР (например, ЬЕИКГИЕ™), Гозерелины (например, ΖО^Ά^ЕX™), Гранисетроны (например, КУТКГЬ™), НаеторРРик тПиепха В (например, СОМУАХ™ и Н1ЬТ1ТЕК™), Галоперидолы (например, НАЕИОЕ™), Вакцины Гепатита А (например, НАУКГХ™, ТVINКIX™ и УАРТА™), Вакцины Гепатита В (например, рекомбинанты СОМУАХ™, Е^ЕИХ™^ КЕСОМВГУАХМ-НВ, ТМЙШХ™ и нерекомбинанты ВАУНЕР™-В и NΆВI™-НВ), Ибритумомаб-Тиуксетаны (например, ΖЕVЛ^IN™), Иммуноглобулины (в том числе смеси иммуноглобулинов, такие как САММАСАКИ™ и т.п., а также любой из множества очищенных иммуноглобулинов), Вакцины вируса гриппа (например, РЬИМГЗТ™), Инфликсимабы (например, КЕМК-АВЕ7™), Инсулины (например, НиМАИОС™, НИМАЬОС™ М1Х 75/25™, продукты НИМИЬГИ™ (в том числе 50/50, 70/30, Кеди1аг, ИРН, ИРга и иРга1еп!е), и NОVО^IN™), Инсулин-Гларгины (например, ^АNТυЗ™), Интерфероны Альфа-2а (КОРЕКА^™^), Интерфероны Альфа-2и (например, ΙΝТКОN-А™), Интерфероны Альфакон-1 (например, INРЕКСЕN™), Интерфероны Альфа-п3 (например, АЕ-РЕКОХ Ν™), Интерфероны Бета (например, ВЕТА8ЕКОN™ и ВЕТАРЕКОN™), Интерфероны Бета-1а (например, АVОNЕX™ и КЕВ1Р™), Интерфероны Гамма (например, АСТIММυNЕ™), Иодиксанолы (например, УГЗГРАрИЕ™), Иогексолы (ОММРАриЕ™), Иопамидолы, Иоверсолы (например, ОРТУКАУ™), Кеторолаки (например, ТОКАИОЕ™), Ларонидазы (например, Л^^υКЛΖΥМЕ™), Левофлоксацины (например, ЬЕУ АрИЕИ™), Лидокаины, Линезолиды (например, ΖΥVОX™), Лоразепамы (например, АТIVАN™), Вакцины против кори (например, АТТЕNυVАX™), Вакцины против вирусов кори-эпидемического паротита-коревой краснухи (например, М-М-К™ II), Медроксипрогестероны (например, ИЕРО-РКОУЕКА™), Меропенемы (например, МЕККЕМ™ IV), Метилпреднизолоны (например, ЗОЬи-МЕИКОЕ™), Мидазоламы (например, УЕКЗЕИ™), Морфины (например, АЗтаАМОКРН/РР™), Октреотиды (например, ЗАИООЗТАТЕМ™), Омализумабы (например, ХОЬАГК™), Ондансетроны (например, ΖОРКАN™), Паливизумабы (например, ЗЕИАСГЗ™), Пантопразолы (например, РКОТОМХ™), Пегаспаргазы (например, ОNСА8РΆК™), Пегфилграстимы (например, NЕυ^АЗТА™), Пег-Интерфероны Альфа-2а (например, РЕСАЗУЗ™), Пег-Интерфероны Альфа-2Ь (например, РЕС-INТКОN™), Пегвисоманты (например, ЗОМАУЕКТ™), Вакцины коклюша, Пиперациллины (например, ΖОЗΥN™), Пневмококковые вакцины (например, РNЕυМОVΛX™ 23) и Пневмококковые конъюгатные вакцины (например, РКЕVNАК™), Прометазины (например, РНЕNЕКСАN™), Ретеплазы (например, КЕТАУАЗЕ™), Соматропины (например, СЕNОТКОРIN™, НИМАТКОРЕ™, NОК^IТКОРIN™, МиТКОРШ™, ЗАIΖЕN™, ЗЕКОЗТ1М™, ΖОКВТIУЕ™), Сулбактамы, Суматриптаны (например, 1М1ТКЕХ™), Тазобактамы, Тенектеплазы (например, ТИКАЗЕ™), Очищенные Токсоиды Столбняка, Тикарциллины (например, ТIМЕNТIN™), Тозитумомабы (например, ВЕХХАК™), Триамцинолона Ацетониды, Ванкомицины (например, VАNСОСIN™), Вакцины ветряной оспы (например, УАКГУАХ™), а также другие вакцины; и т. п.
Как описано и проиллюстрировано здесь, фармакологические агенты ряда различных классов и способов введения могут получить преимущество в результате совместного введения и/или совместного приготовления с кНАЗЕСР (или другими гликозаминогликаназами) для улучшения одного или нескольких аспектов их применения. Такие улучшения могут включать в себя одно улучшение или любую ком
- 60 011654 бинацию из следующих: (1) улучшения степени и/или скорости абсорбции и, следовательно, биодоступности агента (например, увеличением количества этого агента, достигающего кровотока, после не-ΐν парентерального введения и/или уменьшением его количества, расщепляемого после такого локального введения, посредством более быстрого проникновения), что может вызвать, например, ускоренный интерстициальный поток и потенциально конвективный транспорт после не-ΐν парентерального введения (например, применением гидростатического давления, ассоциированного с объемом инъекционного раствора в комбинации с уменьшением сопротивления (импеданса) потоку, ассоциированным расщеплением гиалуронана); (и) обеспечения более безопасного или более удобного способа введения (например, созданием возможности выполнения не-ΐν парентерального введения вместо IV или улучшенных или более удобных не-ΐν парентеральных введений, таких как внутридермальное или подкожное, вместо внутримышечного); (ш) более благоприятных схем введения доз, например, менее частого введения доз или более частого не-ΐν способа, но с меньшей дозой, в отличие от менее частого, но с более высокой дозой не-ΐν способа; (ίν) уменьшения побочного действия или уменьшения иным образом токсичности (например, эффекта, ассоциированного с начально высокой концентрацией (высокой Смакс), генерируемой ΐν-введением доз, или происходящего из высокой локальной дозы, генерируемой медленной и/или неполной абсорбцией после не-ΐν парентеральным введением); (ν) улучшения другим образом фармакокинетики и/или фармакодинамики, например, обеспечением возможности достижения большим количеством агента участка-мишени (например, увеличенным потоком интерстициальной жидкости и конвективным транспортом вследствие присутствия кНАЗЕСР в участке доставки или вблизи участка доставки, такого как место инъекции), и/или увеличением проникновения в месте-мишени (например, увеличенным потоком интерстициальной жидкости и конвективным транспортом вследствие присутствия кНАЗЕСР в участке-мишени доставки), или доставкой агента преимущественно в участок-мишень (например, локальным введением в участок-мишень в сочетании с локальным или системным введением кНАЗЕСР для стимуляции проникновения в мишень или с использованием носителей или макромолекулярных комплексов для преимущественного нацеливания агента на конкретный участок в сочетании с локальным или системным введением кНАЗЕСР для стимуляции проникновения в участок-мишень). Агенты, которые доставлялись перорально, могут также выигрывать в результате приготовления их для парентеральной доставки, чтобы, например, избежать потери агента в желудочно-кишечном тракте или последующего расщепления или токсичности, сделать возможной более эффективное нацеливание на желаемый участок действия и, следовательно, более высокую эффективность и/или меньшую токсичность, или иным образом обеспечить более благоприятные фармакокинетические и/или фармакодинамические профили. Кроме того, кНАЗЕСР могут быть использованы для улучшения фармакодинамики агентов, которые вводят перорально, например, увеличением проникновения перорально вводимого агента в его желаемом участке-мишени (например, увеличенным потоком интерстициальной жидкости и конвективным транспортом вследствие присутствия кНАЗЕСР в участке-мишени после системного введения кНАЗЕСР и/или после локального введения кНАЗЕСР в участок-мишень).
Даже в ситуациях, в которых желаемым участоком-мишенью для агента, такого как фармакологический агент, является сам кровоток, такие агенты могут быть усилены совместным введением и/или совместным приготовлением с кНАЗЕСР (или другими гликозаминогликаназами). Например, имеется ряд агентов, которые действуют в качестве модификаторов крови, которые могут вводиться одним из нескольких способов, в том числе пероральным введением дозы, а также парентеральным введением (например, ΐν-иинъекцией). Ряд агентов, которые вводят перорально или которые могут вводиться перорально, тем не менее проявляют относительно ограниченное или медленное поглощение и/или подвергаются нежелательному расщеплению (и имеются другие агенты, которые обычно являются безопасными и эффективными после введения в кровоток, но не вводятся перорально по этой причине). Парентеральное введение таких агентов (например, внутимышечным, подкожным, внутрикожны или чрескожным способами в комбинации с введением кНАЗЕСР, предпочтительно в участке или вблизи участка парентерального введения) может быть, следовательно, использовано для обеспечения введения в кровоток. Кроме того, имеется ряд срочных медицинских ситуаций, в которых быстрая доставка агента в кровоток является необходимой, но пероральное введение доз является слишком медленным, а внутривенное введение доз является либо неудобным, небезопасным или недоступным. Эти безотлагательные ситуации включают в себя ситуации, в которых кровь является мишенью, а также ситуации, в которых кровоток является просто способом доставки к другой ткани-мишени. В таких ситуациях, возможность комбинированного введения кНАЗЕСР (или применения готового совместного препарата с кНАЗЕСР) может сделать возможной быструю доставку агента через не-ΐν парентеральное введение. Как будет понятно специалистам в данной области, имеется ряд препаратов и устройств, предназначенных для не-ΐν парентеральных введений, которые могут обеспечивать, например, высвобождение в назначенных точках времени или иным образом запускаемое высвобождение агентов, а также вариабельно регулируемое введение доз и т.п. Большое количество таких фармакологических агентов (которые могут быть совместно приготовленными с кНАЗЕСР или используемыми в комбинации с кНАЗЕСР) постоянно применяют в медицинской практике, и аспекты их применения хорошо описаны (см., например, Р11ук1С1а1'1к' Эекк Ке£сгспсс, Τ11οтκοη 2003, 2004, 2005), и многие другие подобные агенты известны в данной области. В этой
- 61 011654 последней связи, как будет понятно специалистам в данной области, 8НА8ЕСР могут быть использованы в комбинации с агентами, используемыми в настоящее время (например, для улучшения их применимости, как описано здесь), с агентами, которые не используются в настоящее время (например, для улучшения их фармакокинетики и/или фармакодинамики и, следовательно, для того, чтобы сделать их применимыми) или с агентами, которые заново разрабатываются.
Таким образом, для фармакологических агентов (таких как противораковые агенты, модификаторы крови или члены других классов агентов, описанных здесь), которые обычно вводят парентерально (например, 1У-инъекцией), 8НА8ЕСР (или другие гликозаминогликаназы) могут быть использованы, например, для создания возможности введения таких агентов другими, потенциально более удобными и/или безопасными способами, такими как не-1У парентеральное введение (например, внутримышечным, подкожным, внутрикожным или чрескожным способами). Для агентов, которые уже доставляются не-1У парентеральным способом, 8НА8ЕСР могут быть использованы для увеличения степени и/или скорости их поглощения и доставки (например, стимуляцией их диспергирования (рассеяния) и последующего вхождения в кровоток, которые могут быть, вероятно, облегчены конвективным транспортом, как описано здесь). Преимущества подобных эффектов включают в себя наличие большей части этого агента, достигающей кровотока, наличие уменьшенного локального подвергания действию агента (в отношении концентрации и/или времени) (например, в участке или вблизи участка инъекции, что часто ограничивает введение доз или приводит к проблемам локальной токсичности), увеличение скорости, при которой агент доставляется в кровоток, другие улучшенные фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства и удобство введения. В последнем отношении, не-1У парентеральное введение может позволять введение многих агентов вне больницы, что в противном случае требовало бы госпитализации или другого медицинского внимания, требующегося для внутривенных введений.
Иллюстративные примеры модификаторов крови включают в себя такие агенты, как антигемофильные агенты и агенты недостаточности факторов крови (включающие в себя, например, антигемофильные факторы (например, АИУАТЕ™, НЕМОНЬ™, КОАТЕ™-ЭУ1, КО6ЕтТЕ™-Р8, ВЕСОМВ1NАNТΕ™ и ВЕРАСТО™), антиингибитор-коагулент-комплексы (например, РЕ1ВА™ УН), антитромбины III (например, ТНВОМВАТЕ™ III), Факторы коагуляции У11 (например, NОУО8ΕУΕN™), Факторы коагуляции УШ (например, АИУАТЕ™, КОСΕNАТΕ™-Р8 и ВЕСОМВШАКТЕ™), Факторы коагуляции IX (например, ВЕВИБШ™, ВЕЖРБХ™ и РВОРБЕХ™ Т), фракции белков плазмы (например, РБА8МАNАТΕ™), факторы фон Виллебранда); антитромбоцитарные агенты (в том числе, например, абциксимабы (например, ВЕОРВО™), анагрелиды (например, АСВУБШ™), цилостазолы (например, РЬЕТАЬ™), клопидогрела бисульфаты (например, РБАУБХ™), дипиридамолы (например, АССВΕNОX™ и РЕВ8А№ эпопростенолы (например, РЬОЬА№М), эптифибатиды (например, ЮТЕСВШШ™), тирофибаны (например, АССВА8ТАТ™)); колониестимулирующие факторы (С8Р) (в том числе, например, гранулоцитарные С8Р (например, №иЬА8ТА™ и ЖИВОСЕ^™) и гранулоцитарно-макрафагальные С8Р (например, БЕИКШЕ™)); стимуляторы эритропоэза (в том числе, например, эритропоэтины, такие как дарбепоэтины альфа (например, АВАКЕ8Р™) и эпоэтины альфа (например, ЕРОСЕ№™ и РВОСВШ™)); гемостатики и альбумины (в том числе, например, апротинины (например, ТВА8УБОБ™), комбинации антигемофильных факторов и плазмы (например, АИУАТЕ™), Десмопрессина ацетаты (например, ЭОАУР™) и альбумины (например, ВИМШАТЕ™ и РБА8ВиМШ™)); иммуноглобулины (например, ВАУСАМ™, САВШИЖ™ ΝΡ ГУ, РБЕВОСАММА™, САМПМИЖ™, САММАСА1Ш 8/Ό™, САМИ№Х™, [УЕЕСАМ™. [УЕЕСАМ™ ΕN КЙУ, ΜIСВНОСАΜ™, ВНОСАМ™, РАМС.ОВГ'иУ и ТНУМОСБОВиБШ™), а также иммуноглобулины гепатита В (например, ВАУНЕР™, NАВI-НВ™ и NОУАРБИ8™ NАВI-НВ); ингибиторы тромбина (в том числе, например, прямые ингибиторы тромбина (например, АВСАТВОВА№™) и лепирудин (например, ВЕРБИНА^™) и дротекогины альфа (например, XIСВК™)); антикоагулянты (в том числе, например, далтепарины, эноксаперины и другие гепарины (например, РВАСМШ™ и БОУГ^ОХ™), варфарины (например, СОиМАИШ™ и ^АNТОУΕN™)); и т.п.
В качестве дополнительной иллюстрации, примеры различных типов агентов, которые вводили парентерально и которые могут быть совместно введены и/или совместно приготовлены с 8НА8ЕСР (или другими гликозаминогликаназами), включены в следующий перечень: Ацетазоламиды; Ацикловиры; Адипиодоны; Алатрофлоксацины; Альдеслейкины; Алемтузумабы; Алфентанилы; Аллергеновые эестракты; Аллопуринолы; ингибиторы альфа-1-протеиназы; Алпростадилы; Амифостины; Амикацины; Аминокислоты; Аминокапроновые кислоты; Аминофиллины; Амитриптилины; Амобарбиталы; Амриноны; Анакинры; Анальгетйческие средства; Антиполиомиелитные вакцины; Антирабические сыворотки; Противостолбнячные иммуноглобулины; Антитромбин III; Противоядные сыворотки; Аргатрабаны; Аргинины; Содержащие мышьяк агенты; Аскорбиновые кислоты; Аспарагиназы; Атенололы; Атракурий (недеполяризующий миорелаксант промежуточной длительности действия); Атропины; Ауротиоглюкозы; Азатиоприны; Азитромицины; Азтреонамы; Вакцины ВаеШи8 Са1те((е-Сиегт (ВСС); Бацитрацины; Баклофены; Базиликсимабы; Бензойные кислоты; Бензтропины; Бетаметазоны; Биотины; Бивалирудины; Блеомицины; Антитоксины ботулизма; Бретилии; Буметаниды; Бупивакаины; Бупренорфины; Бусульфа
- 62 011654 ны; Буторфанолы; Кальцитонины; Кальцитриолы; Кальций; Капреомицины; Карбопросты; Кармустины; Карнитны; Каспофунгины; Цефамандолы; Цефазолины; Цефоперазоны; Цефотаксимы; Цефотетаны; Цефокситины; Цефтазидимы; Цефтизоксимы; Цефуроксимы; Хлорамфениколы; Хлорпрокаины; Хлорохины; Хлоротиазиды; Хлорпромазины; Хондроитинсерные кислоты; Хориогонадотропины Альфа; Хром; Цидофовиры; Цимецидины; Ципрофлоксацины; Цисатракурии; Цисплатины; Кладрибины; Клавулановые кислоты; Клиндамицины; Клонидины; Кодеины; Колхицины; Колистины; Коллагены; Кортикорелина овечьего трифлутаты; Кортикотропины; Косинтропины; Цианокобаламины; Циклофосфамиды; Циклоспорины; Цистеины; Цитарабины; Дакарбазины; Дакликсимабы; Дактиномицины; Далфопристины; Далтепарины; Данапароиды; Дантролены; Даунорубицины; Дефероксамины; Денилейкин-дифтитоксы; Десмопрессины; Дексаметазоны; Дексмедетомидины; Декспантенолы; Дексразоксаны; Декстраны; Диатризойные кислоты; Диазепамы; Диазоксиды; Дицикломины; Дигибинды; Дигоксины; Дигидроэрготамины; Дилтиаземы; Дифенгидрамины; Вакцины дифтерии, столбняка и коклюша; Дифтерийные антитоксины; Дипиридамолы; Добутамины; Допамины; Доксакурии; Доксапрамы; Доксеркальциферолы; Доксициклины; Дроперидолы; Дротрекогины Альфа; Дифиллины; Эдетовые (этилендиаминтетрауксусные) кислоты; Эдрофонии; Эналаприлаты; Эфедрины; Эпопростенолы; Эргокальциферолы; Эргоновины; Эртапенемы; Эритромицины; Эсмололы; Эстрадиолы; Эстрогенные средства; Этакриновые кислоты; Этаноламины; Этанолы; Этиодизированные масла; Этидроновые кислоты; Этомидаты; Этопозиды; Факторы νΐΐΐ; Фамотидины; Фенолдопамы; Фентанилы; Флоксуридины; Флударабины; Флумазенилы; Флуоресцеины; Фторурацилы; Флуфеназины; Фолиевые кислоты; Фолликулостимулирующие гормоны; Фомепизолы; Фомиверсены; Фондапаринуксы; Фоскарнеты; Фосфенитоины; Фулвестранты; Фуросемиды; Гадотеридолы; Гадоверсетамиды; Ганцикловиры; Гатифлоксацины; Гемтузумаб-озогамицины; Гентамицины; Глюкагоны; Глюкозы; Глицины; Гликопирролаты; Гонадорелины; Хорионические Гонадотропины; Полисахариды НаеторБу1ик В; Галоперидолы; Гемины; Вакцины НаеторБу1ик тПиев/а; Вакцины Гепатита; Лечебные средства из трав; Гистамины; Гидралазины; Гидрокортизоны; Гидроморфоны; Гидроксокобаламины; Гидроксизины; Гиосциамины; Ибутилиды; Идарубицины; Ифосфамиды; Имиглюцеразы; Иммуноглобулины; Индигокармины; Индометацины; Интерфероны Альфа-кон1; Интерфероны Альфа-2А; Интерфероны Альфа-И3; Интерфероны Бета-1А; Иодиды; Иопромиды; Иоталамовые кислоты; Иоксагловые кислоты; Иоксиланы; Инъекции Железо-декстрана; Изониазиды; Изопротеренолы; Вакцины Японского энцефалита; Канамицины; Кетамины; Кетеролаки; Лабеталолы; Леперудины; Лейковорины; Лейпролиды; Левобупивакаины; Левотироксины; Лидокаины; Линкомицины; Линезолиды; Лиотиронины; Лоразепамы; Лютеинизирующие гормоны; Вакцины болезни Лайма; Мангафодипиры; Манниты; Вирус кори; Меклоретамины; Мелфаланы; Менингококковые полисахаридные вакцины; Меперидины; Мепивакаины; Меропенемы; Месны; Мезоридазины; Метараминолы; Метадоны; Метокарбамолы; Метогекситали; Метотрексаты; Метилдопаты; Метилэргоновины; Метоклопрамиды; Метопрололы; Метронидазолы; Мидазоламы; Миноциклины; Митрамицины; Митомицины; Митоксантроны; Мивакурии; МоггБшс кислоты; Моксифлоксацины; Вирусы эпидемического паротита; Муромонаб-СО3; Микофенолат-мофетилы; Нафциллины; Налбуфины; Налмефены; Налоксоны; Нандролоны; Неостигмины; Ниацинамиды; Никардипины; Нитроглицерины; Нитропруссиды; Норепинефрины; Опрелвекины; Орфенадрины; Оксациллины; Оксалиплатины; Оксиморфоны; Окситетрациклины; Окситоцины; Панкуронии; Пантенолы; Пантотеновые кислоты; Папаверины; Пегаспаргазы; Пег-интерфероны Альфа-2А; Пенициллины О; Пентамидины; Пентазоцины; Пентобарбиталы; Пентостатины; Перфлутрены; Перфеназины; Вакцины Рег1икк1к; Фенобарбиталы; Фентоламины; Фенилэфрины; Фенилтоины; Физостигмины; Фитонадионы; Пневмококковые вакцины; Полимиксины Ь; Порфимеры; Пралидоксимы; Прилокаины; Прокаинамиды; Прокаины; Прохлорперазины; Прогестероны; Прометазины; Пропранололы; Пиридостигмин-гидроксиды; Пиридоксины; Хинидины; Хинупристины; Иммуноглобины бешенства; Вакцины вируса бешенства; Ранитидины; Расбуриказы; Ремифентанилы; Рибофлавины; Рифампины; Ропивакаины; Вакцины краснухи; Самарии; Скополамины; Селены; Серморелины; Синкалиды; Соматремы; Спектиномицины; Стрептокиназы; Стрептомицины; Стрептозоцины; Сукцинилхолины; Суфентанилы; Сулбактамы; Сульфаметоксазолы; Суматриптаны; Такролимусс; Тенипозиды; Тербуталины; Терипаратиды; Тестостероны; Антитоксины столбняка; Тетракаины; Тетрадецилсульфаты; Теофиллины; Тиамины; Тиэтилперазины; Тиопентали; Тиреоидстимулирующие гормоны; Тикарциллины; Тинзапарины; Тирофибаны; Тобрамицины; Толазолины; Толбутамиды; Топотеканы; Торсемиды; Транексамовые кислоты; Трепростинилы; ацептониды Триамцинолона; гексацетониды Триамцинолона; Триамцинолоны; Триэтилентиофосфорамиды (Тиотепа); Трифлуоперазины; Триметобензамиды; Триметопримы; Триметрексаты; Трипторелины; Трометамины; Туберкулины; Тифоидные вакцины; Урофоллитропины; Урокиназы; Валпроевые кислоты; Валрубицины; Иммуноглобины ветряной оспы; Вазопрессины; Векуронии; Верапамилы; Винбластины; Винкристины; Вориконазолы; Варфарины; Вакцины желтой лихорадки; Зидовудины; Цинки; гидрохлориды Зипрасидона; и агенты, родственные предыдущим агентам или относящиеся к тем же или сходным классам, что и предыдущие агенты.
Растворы или суспензии, используемые для парентерального введения (в том числе внутримышечного, внутрикожного, подкожного, местного введения и других не-пероральных способов), могут включать в себя любой из следующих компонентов: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции,
- 63 011654 солевой раствор, нелетучее масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другой синтетический растворитель; антимикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты; и агенты для коррекции тоничности, в том числе, но не только, хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния, декстрозу, глицерин или борную кислоту. Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или однодозовые или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла, пластика или другого подходящего материала.
Полипептиды зНА8ЕСР или их растворимые домены гиалуронидазы человека могут быть суспендированы в микронизированной или другой подходящей форме или могут быть дериватизованы для получения более растворимого активного продукта или для получения пролекарства. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе от предполагаемого способа введения и растворимости этого полипептида в выбранном носителе или наполнителе. Эффективная концентрация является достаточной для уменьшения симптомов состояния-мишени и может быть эмпирически определена с использованием способов, известных специалистам в данной области. Для приготовления композиции массовую долю полипептида растворяют, суспендируют, диспергируют или другим образом смешивают в выбранном наполнителе при эффективной концентрации, так что подлежащее лечению состояние облегчается или ослабляется.
В случаях, в которых полипептиды зНА8ЕСР или их растворимые домены гиалуронидазы человека проявляют недостаточную растворимость, могут быть использованы способы солюбилизации полипептидов. Такие способы известны специалистам в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, применение сорастворителей, таких как диметилсульфоксид (ДМСО), применение поверхностноактивных веществ, таких как Твин™ и Плуроник™ Ε68; или растворение в водном бикарбонате натрия. Производные этих полипептидов, такие как пролекарства этих полипептидов, могут также использоваться в приготовлении эффективных фармацевтических композиций. Для глазных показаний эти композиции готовят в приемлемом для глаз носителе. Для глазных применений с данным изобретением рассматривается локальное введение, либо местное введение, либо введение инъекцией. Желательными являются также формы с пролонгированным действием. Обычно эти композиции готовят для введения единственной дозы, так что единственная доза вводит эффективное количество.
После смешивания или дополнения этого полипептида носителем, полученной смесью может быть раствор, суспензия, эмульсия или другая композиция, и она может быть приготовлена в виде водных смесей, кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, лосьонов, суспензий, настоек, паст, пенок, аэрозолей, суппозиториев, перевязочных материалов или любой другой формы, подходящей для системного, местного или локального введения.
Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, включающих в себя предполагаемый способ введения и растворимость этого соединения в выбранном носителе или наполнителе. Если необходимо, готовят фармацевтически приемлемые соли или другие производные этих соединений. Для локального внутреннего введения, такого как внутримышечное, парентеральное или внутрисуставное введение, эти соединения предпочтительно готовят в виде раствора или суспензии в среде на водной основе, такой как изотонически забуференный солевой раствор, или объединяют с биосовместимым носителем или биодгезивом, предназначенными для внутреннего введения.
Полипептид зНА8ЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека включают в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного действия в отсутствие нежелательных побочных действий на получающего лечение пациента. Понятно, что число и степень побочных действий завсисит от состояния, для которого вводят эти соединения. Например, определенные токсичные и нежелательные действия допускаются при лечении угрожающих жизни болезней, причем эти действия не могли бы допускаться при лечении нарушений меньшего значения. Количества, эффективные для терапевтического использования, будут, конечно, зависеть от тяжести заболевания и массы и общего состояния субъекта, а также от способа введения. Локальное введение терапевтического агента будет обычно требовать меньшей дозы, чем любой способ системного введения, хотя локальная концентрация терапевтического агента может, в некоторых случаях, быть более высокой после локального введения, чем концентрация, которая может быть достигнута безопасно после системного введения.
Поскольку отдельные субъекты могут предоставлять большое разнообразие симптомов, и каждый терапевтический агент имеет свои уникальные терапевтические характеристики, практикующий врач должен сам определить реакцию субъекта на лечение и варьировать дозы соответствующим образом. Дозы, используемые ίη νί!ΐΌ, могут дать полезное указание в отношении количеств, полезных для введения ίη зйи конкретной фармацевтической композиции, а животные-модели могут быть в некоторых случаях использованы для определения эффективных доз для лечения конкретных нарушений. Однако обычно, для локального введения, предполагается, что эффективное количество терапевтического агента будет количеством в диапазоне приблизительно 0,1 пг (пикограммов)-приблизительно 1 нг на 1 кг массы тела. Различные соображения в достижении эффективного количества известны специалистам в данной
- 64 011654 области и описаны (см., например, Оοοйтаη апй СПтайв: ТНе Рйа^тасο1οд^са1 Вавев οί ТНегареийсв, 8|Н ей., Рег^аптом Ргевв, 1990; Кет^ηдιοη'в РНагтасеийса1 З^еисев, 17|Н ей., Маск РнЬПвНтд ^., ЕавФщ РА., 1990; и МагИуН е! а1., (Заеме, 278: 275-79, 1997), где описана интратекальная инъекция специфического для нейронов лиганда-токсина, причем каждая из этих ссылок включена в качестве ссылки в полном объеме).
Готовые формы полипептидов вНАЗЕОР или их растворимых доменов гиалуронидазы человека для применения здесь включают в себя формы, подходящие для перорального, ректального, топического, ингаляционного, буккального, сублингвального, другого парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного, чрескожного или внутривенного) введения или любого способа. Наиболее подходящий способ в каждом конкретном случае зависит от природы и тяжести подлежащего лечению состояния и от природы конкретного используемого активного соединения. Эти готовые формы обеспечиваются для введения людям и животным в унифицированных (стандартных) лекарственных формах, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и пероральные растворы или суспензии и эмульсии масло-вода, содержащие подходящие количества полипептидов и/или других агентов или их фармацевтически приемлемых производных. Эти фармацевтические терапевтически активные полипептиды и/или другие агенты и их производные обычно готовят и вводят в однодозовых формах (дозах для одного приема) или в многодозовых формах. Однодозовой формой называют здесь физически дискретные единицы, подходящие для субъектов-людей и субъектов-животных и упакованные по отдельности, как это известно в данной области.
Фармацевтические композиции обеспечены для введения людям и животным в однодозовых формах, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и пероральные растворы или суспензии и эмульсии масло-вода, содержащие подходящие количества полипептида вНАЗЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека и, необязательно, другой агент или его фармацевтически приемлемые производные. Фармацевтические терапевтически активные соединения и их производные обычно готовят и вводят в однодозовых формах (дозах для одного приема) или в многодозовых формах. Однодозовой формой называют здесь физически дискретные единицы, подходящие для субъектов-людей и субъектов-животных и упакованные по отдельности, как это известно в данной области. Каждая унифицированная доза содержит заранее опрделенное количество терапевтически активного соединения, достаточное для получения желаемого терапевтического действия, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем, наполнителем или разбавителем. Примеры однодозовых форм включают в себя, но не ограничиваются ими, ампулы, шприцы и по отдельности упакованные таблетки или капсулы. Например, готовая форма малого объема, содержащая стабилизированный раствор 1-5000 Единиц вНАЗЕОР в малом объеме, таком как 5-50 мкл, может быть упакована в шприц для использования, например, после вязкоупругой инъекции. Однодозовые формы могут вводиться в виде их долей или в виде их множеств. Многодозовая форма является множеством идентичных однодозовых форм, упакованным в едином контейнере для введения в сегрегированной однодозовой форме. Примеры многодозовых форм включают в себя флаконы, бутылочки таблеток или капсул или бутылки пинт или галлонов. Таким образом, многодозовая форма является множеством одноразовых доз, которые не разделены в упаковке.
Эта композиция может содержать вместе с активным ингредиентом, таким как полипептид вНАЗЕОР: разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальцийфосфат, или карбоксиметилцеллюлоза; смазывающее (скользящее) вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция и тальк; и связующее вещество, такое как крахмал, природные камеди, такие как аравийская камедь, желатин, глюкоза, мелассы, поливинилпирролидон, целлюлозы и их производные, повидон, кросповидоны и другие подобные связующие вещества, известные специалистам в данной области. Жидкие фармацевтически вводимые композиции могут быть, например, приготовлены растворением, диспергированием или смешиванием другим образом активного соединения, описанного выше, и необязательных фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, солевой раствор, водная декстроза, глицерин, гликоли, этанол и т.п., для образования посредством этого раствора или суспензии. Если желательно, фармацевтическая композиция для введения может содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ (добавок), таких как увлажняющие средства, эмульгирующие агенты или солюбилизирующие агенты, рН-буферящие агенты и т.п., например, ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, сорбитанмонолаурат, натрий-ацетат триэтаноламина, олеат триэтаноламина и другие подобные агенты. Способы получения таких дозированных форм известны, или будут очевидны, специалистам в данной области (см., например, Кет^ηдίοη'в РНагтасеийса1 Заемев, Маск РиЬНвНтд ^., ЕавФщ Ра., 15|Н Еййюп, 1975). Вводимая композиция или готовая форма содержит количество активного соединения, достаточное для уменьшения симптомов лечащегося субъекта. Например, стандартная стабилизированная готовая форма вНАЗЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, обеспеченная здесь, включает в себя 150 Единиц/мл растворимого гликопротеина, приготовленного в ЭДТА, №1С1 и СаС12. Кроме того, в этой готовой форме может присутствовать антибактериальный или противогрибковый агент, в том числе, но не только, тиомерсал. Другой готовой формой, обеспеченной здесь, является стабилизированный раствор или лиофилизированная форма вНАЗЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека
- 65 011654 в ЭДТА, №1С1 и СаС12, содержащая эффективное активное количество растворимого гликопротеина, такое как 150 Единиц/мл, с добавлением лактозы, например, 13 мг/мл. Здесь обеспечена также готовая форма, содержащая стабилизированный раствор или лиофилизированную форму зНАЗЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека в ЭДТА, №С1 и СаС12, содержащая эффективное активное количество растворимого гликопротеина, такое как 150 Единиц/мл, с добавлением лактозы, например, 13 мг/мл, и альбумин, Плуроник™ Р68, Твин™ и/или другой детергент. Другая готовая форма, обеспеченная здесь, либо лиофилизированная, либо в виде стабилизированного раствора, содержит эффективное количество зНАБЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, например, 1-300 Единиц/мл, в ЭДТА, №1С1 и СаС12.
Могут быть приготовлены дозированные формы или композиции, содержащие активный ингредиент в диапазоне 0,005-100% с доведением до необходимого объема нетоксичным носителем. Для перорального введения эта фармацевтическая композиция может иметь форму, например, таблеток или капсул, приготовленных общепринятыми способами, с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связующие агенты (например, предварительно желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтеграторы (например, картофельный крахмал или гликолат натрийкрахмала); или увлажняющие агенты (например, лаурилсульфат натрия). Эти таблетки могут иметь покрытие, нанесенное способами, хорошо известными в данной области.
зНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека или фармацевтически приемлемые производные могут быть приготовлены с носителями, которые защищают этот растворимый гликопротеин против быстрого элиминирования из тела, например, в виде готовых форм пролонгированного высвобождения или в виде готовых форм с покрытиями. Эти композиции могут включать в себя другие фармацевтически эффективные агенты, о которых известно, что они являются важными в лечении одного или нескольких заболеваний или медицинских состояний, в том числе, но не только, химиотерапевтический агент, анальгетический агент, противовоспалительный агент, антимикробный агент, амебоцидный агент, трихомоноцидный агент, антипаркинсонический агент, противомалярийный агент, противогрибковый агент, антигипертензивный агент, бронхорасширяющий агент, биоцидный агент, бактерицидный агент, жаропонижающего агента, антипаразитарного агента, антигистаминного агента, альфаадренергического агониста, альфа-блокатора, анестезирующего бактериостатического агента, бетаадреноблокатор, блокирующие кальциевые каналы агент, сердечно-сосудистый лекарственный агент, контрацептивный агент, противоотечный агент, диуретический (мочегонный) агент, депрессант, диагностический агент, электролитный агент, гипнотический агент, гормональный агент, гипергликемический агент, миорелаксант, агент мышечного сокращения, глазной агент, парасимпатомиметический агент, антидепрессант, седативный агент, симпатомиметический агент, транквилизирующий агент, мочевой агент, вагинальный агент, противовирусный агент, витаминный агент, нестероидный противовоспалительный агент, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, полипептид, белок, нуклеиновую кислоту, лекарственное средство, органическую молекулу и индуцирующий сон агент, для получения желаемых комбинаций свойств. Должно быть понятно, что такая комбинированная терапия составляет дополнительный аспект композиций и способов лечения, обеспеченных здесь.
1. Композиции для перорального введения.
Пероральные фармацевтические композиции являются твердыми веществами, гелями или жидкостями. Твердыми дозированными формами являются таблетки, капсулы, гранулы и объемные порошки. Типы пероральных таблеток включают в себя прессованные, жевательные лепешки и таблетки, которые могут иметь энтеросолюбильное покрытие, сахарное покрытие или пленочное покрытие. Капсулы могут быть твердыми или мягкими желатиновыми капсулами, в то время как гранулы и порошки могут быть обеспечены в нешипучей или шипучей форме с комбинацией других ингредиентов, известных специалистам в данной области.
Фармацевтические композиции, содержащие зНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека, могут быть в жидкой форме, например, в растворах, сиропах или суспензиях, или могут быть представлены в виде лекарственного продукта для воссоздания водой или другим подходящим наполнителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные годные в пищу масла); эмульгирующие агенты (например, лецитин или аравийская камедь); неводные наполнители (например, миндальное масло, маслянистые эфиры или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота).
В некоторых вариантах осуществления эти готовые формы являются твердыми дозированными формами, предпочтительно капсулами или таблетками. Эти таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т. п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходной природы: связующий агент; разбавитель; дезинтегрирующий агент; смазывающее вещество; скользящее вещество; подслащивающее вещество и улучшающий вкус агент.
- 66 011654
Примеры связующих агентов включают в себя микрокристаллическую целлюлозу, трагакантовую камедь, раствор глюкозы, Асааа тисбаде, раствор желатина, сахарозу и пасту крахмала. Смазывающие вещества включают в себя тальк, крахмал, стеарат магния или кальция, ^усοрοб^ит и стеариновую кислоту. Разбавители включают в себя, например, лактозу, сахарозу, крахмал, каолин, соль, маннит и дикальцийфосфат. Скользящие вещества включают в себя, но не ограничиваются ими, коллоидальный диоксид кремния. Дезинтегрирующие агенты включают в себя натрий-кросскармеллозу, гликолат натрийкрахмала, альгиновую кислоту, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, бентонит, метилцеллюлозу, агар и карбоксиметилцеллюлозу. Красящие агенты включают в себя, например, любой из одобренных сертифицированных водорастворимых носителей ΕΌ и С, их смеси; и водонерастворимые красители ΕΌ и С, суспендированные на гидрате оксида алюминия. Подслащивающие агенты включают в себя сахарозу, лактозу, маннит и искусственные подслащивающие агенты, такие как сахарин и любой из высушенных распылением вкусовых агентов. Вкусовые агенты включают в себя природные вкусовые агенты, экстрагированные из растений, например, фруктов, и синтетические смеси соединений, которые дают приятный вкус, например, но не только, мята перечная и метилсалицилат. Увлажняющие агенты включают в себя моностеарат пропиленгликоля, моноолеат сорбитана, монолаурат диэтиленгликоля и простой лауриловый эфир полиоксиэтилана. Вызывающие рвоту покрытия включают в себя жирные кислоты, жиры, воски, шеллак, обработанный аммиаком шеллак и ацетат-фталат целлюлозы. Пленочные покрытия включают в себя гидроксиэтилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, полиэтиленгликоль 4000 и ацетат-фталат целлюлозы.
Если желательным является пероральное введение, хНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть обеспечен в композиции, которая защищает его от кислотной среды желудка. Например, эта композиция может быть приготовлена в энтеросолюбильном покрытии, которое сохраняет ее целостность в желудке и высвобождает активное соединение в кишечнике. Эта композиция может быть также приготовлена в комбинации с антацидом или другим подобным ингредиентом.
Когда дозированная единица является капсулой, она может содержать, наряду с материалом описанного выше типа, жидкий носитель, такой как жирное масло (с высоким содержанием жира). Кроме того, формы дозированных единиц могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют эту физическую форму дозированной единицы, например, покрытия из сахара и другие энтеросолюбильные агенты. Эти соединения могут быть также введены в виде компонента эликсира, суспензии, сиропа, облатки, разбрызгиваемого раствора, жевательной резинки или т.п. Сироп может содержать, наряду с активными соединениями, сахарозу в качестве подслащивающего агента и некоторые консерванты, красители и вкусовые агенты.
хНАБЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть также смешан с другими активными веществами, которые не ухудшают желаемое действие, или с веществами, которые дополняют желаемое действие, такими как антациды, Н2-блокаторы и диуретики. Активным ингредиентом является соединение или его фармацевтически приемлемое производное, описанные здесь. Могут быть включены более высокие концентрации, до приблизительно 98 мас.% активного ингредиента.
Фармацевтически приемлемыми носителями, включаемыми в таблетки, являются связующие агенты, смазывающие вещества, разбавители, дезинтегрирующие агенты, красящие агенты, вкусовые агенты и увлажняющие агенты. Имеющие энтеросолюбильное покрытие таблетки, вследствие этого покрытия, противостоят действию кислоты желудка и растворяются или дезинтегрируются в нейтральном или щелочном кишечнике. Покрытые сахаром таблетки являются прессованными таблетками, которые были покрыты полимером или другим подходящим покрытием. Покрытые оболочкой таблетки являются прессованными таблетками, которые покрыты полимером или другими подходящими покрытиями. Многочисленные прессованные таблетки являются прессованными таблетками, изготовленными более чем одним циклом прессования, с использованием вышеуказанных фармацевтически приемлемых веществ. Красящие агенты могут быть также использованы в вышеуказанных дозированных формах. Вкусовые и подслащивающие агенты используют в прессованных таблетках, покрытых сахаром, прессованных несколько раз и жевательных таблетках. Вкусовые и подслащивающие агенты являются особенно применимыми в образовании жевательных таблеток и пастилок.
Жидкие пероральные дозированные формы включают в себя водные растворы, эмульсии, суспензии, растворы и/или суспензии, воссозданные из нешипучих (не вызывающих выделение газа при растворении) гранул, и шипучие препараты, воссозданные из шипучих (вызывающих образование газа) гранул. Водные растворы включают в себя, например, эликсиры и сиропы. Эмульсии являются либо эмульсиями типа масло-в-воде, либо эмульсиями типа вода-в-масле.
Эликсиры являются прозрачными, подслащенными, водно-спиртовыми препаратами. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в эликсирах, включают в себя растворители. Сиропы являются концентрированными водными растворами сахара, например, сахарозы, и могут содержать консервант. Эмульсия является двухфазной системой, в которой одна жидкость диспергирована в форме малых глобул в другой жидкости. Фармацевтически приемлемыми носителями, используемыми в эмульсиях, являются неводные жидкости, эмульгирующие агенты и консерванты. Суспензии используют фармацевтически приемлемые агенты и консерванты. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в
- 67 011654 нешипучих гранулах, для воссоздания в жидкую пероральную дозированную форму, включают в себя разбавители, подслащивающие вещества и увлажняющие агенты. Фармацевтически приемлемые вещества, используемые в шипучих гранулах, для воссоздания в жидкую пероральную дозированную форму, включают в себя органические кислоты и источник диоксида углерода. Во всех вышеуказанных дозированных формах используют красящие и вкусовые (ароматизирующие) агенты.
Растворители включают в себя глицерин, сорбит, этиловый спирт и сироп. Примеры консервантов включают в себя глицерин, метил- и пропилпарабен, бензойную кислоту, бензоат натрия и спирт. Примеры неводных жидкостей, используемых в эмульсиях, включают в себя минеральное масло и хлопковое масло. Примеры эмульгирующих агентов включают в себя желатин, аравийскую камедь, трагакант, бентонит и поверхностно-активные вещества, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Суспендирующие агенты включают в себя натрий-карбоксиметилцеллюлозу, пектин, трагакант, вигум и аравийскую камедь. Разбавители включают в себя лактозу и сахарозу. Подслащивающие агенты включают в себя сахарозу, сиропы, глицерин и искусственные подслащивающие агенты, такие как сахарин. Увлажняющие агенты включают в себя моностеарат пропиленгликоля, моноолеат сорбитана, монолаурат диэтиленгликоля и простой лауриловый эфир полиоксиэтилена. Органические добавки включают в себя лимонную и винную кислоты. Источники диоксида углерода включают в себя бикарбонат натрия и карбонат натрия. Красящие агенты включают в себя, например, любой из одобренных сертифицированных водорастворимых носителей ΕΌ и С и их смеси. Вкусовые агенты включают в себя природные вкусовые агенты, экстрагированные из растений, например, фруктов, и синтетические смеси соединений, которые придают приятный вкус.
Для твердой дозированной формы раствор или суспензию, например, в пропиленкарбонате, растительных маслах или триглицеридах инкасулируют в желатированной капсуле. Такие растворы и их приготовление и инкапсулирование описаны в патентах США с номерами 4328245; 4409239 и 4410545. Для жидкой дозированной формы раствор, например, в полиэтиленгликоле может быть разбавлен достаточным количеством фармацевтически приемлемого жидкого носителя, например воды, для легкого измерения или введения.
Альтернативно, жидкие или полутвердые готовые формы могут быть приготовлены растворением или диспергированием зНА8ЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека в растительных маслах, гликолях, триглицеридах, сложных эфирах пропиленгликоля (например, пропиленкарбонате) и других подобных носителях и инкапсулированием этих растворов или суспензий в твердых или мягких желатиновых капсульных оболочках. Другие применимые готовые формы включают в себя формы, представленные в патентах США с номерами Ке 28819 и 4358603.
Готовые формы, подходящие для буккального (сублингвального) введения, включают в себя, например, лепешки, содержащие зНА8ЕСР или его растворимый домен гиалуронидазы человека в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте; и пастилки, содержащие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.
Во всех вариантах осуществления таблетки и капсулы могут иметь покрытие, как это известно специалистам в данной области, для модификации или поддержания растворения активного ингредиента. Таким образом, например, они могут быть покрыты общепринятым расщепляемым в кишечнике покрытием, таким как фенилсалицилат, воски и ацетат-фталат целлюлозы.
2. Инъецируемые агенты, растворы и эмульсии.
Здесь обсуждается парентеральное введение зНА8ЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, обычно характеризующееся инъекцией, подкожной, внутримышечной или внутривенной. Инъецируемые агенты могут быть приготовлены в общепринятых формах, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; твердых формах, подходящих для растворения или суспендирования в жидкостях перед инъекцией, или эмульсий. Кроме того, если желательно, вводимые фармацевтические композиции, подлежащие введению, могут также содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ (добавок), таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферящие агенты, стабилизаторы, усилители растворимости и другие подобные агенты, такие как, например, ацетат натрия, монолаурат сорбитана, олеат триэтаноламина и циклодекстрины. Здесь обсуждается также имплантация системы замедленного высвобождения или поддерживаемого высвобождения, так что поддерживается постоянный уровень дозы (см., например, патент США № 3710795). Процент зНА8ЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, содержащийся в таких парентеральных композициях, зависит от их конкретной природы, а также от активности соединения и потребностей субъекта.
Парентеральное введение композиций включает в себя внутривенное, подкожное и внутримышечное введение. Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные растворы, готовые для инъецирования, стерильные сухие растворимые продукты, например, лиофилизированные порошки, готовые для объединения с растворителем или стерильным раствором непосредственно перед использованием, включающие в себя гиподермальные таблетки, стерильные суспензии, готовые для инъекции, стерильные сухие нерастворимые продукты, легко объединяемые с носителем, непосредственно перед использованием, и стерильные эмульсии. Эти растворы могут быть либо водными, либо неводными.
При внутривенном введении подходящие носители включают в себя физиологический солевой рас
- 68 011654 твор или забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР) и растворы, содержащие загущающие и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль и их смеси.
Фармацевтически приемлемые носители, используемые в парентеральных препаратах, включают в себя водные наполнители, неводные наполнители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, локальные анестетики, суспендирующие и диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты, секвестрирующие или хелатообразующие агенты и другие фармацевтически приемлемые вещества.
Примеры водных наполнителей включают в себя инъекционный раствор хлорида натрия, инъекционный раствор Рингера, изотонический инъекционный раствор декстрозы, стерильную воду для инъекций, инъекционный раствор декстрозы и лактозы Рингера. Неводные парентеральные наполнители включают в себя нелетучие масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. Антимикробные агенты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях должны добавляться к парентеральным препаратам, упакованным в многодозовых контейнерах, которые включают в себя фенолы и крезолы, ртутные препараты, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый эфиры п-гидроксибензойной кислоты, тиомерсал, хлорид бензалкония и хлорид бензэтония. Изотонические агенты включают в себя хлорид натрия и декстрозу. Буферы включают в себя фосфат и цитрат. Антиоксиданты включают в себя бисульфат натрия. Локальные анестетики включают в себя гидрохлорид прокаина. Суспендирующие и диспергирующие агенты включают в себя натрий-карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгирующие агенты включают в себя Полисорбат 80 (ТВИН™ 80). Секвестрирующий или хелатообразующий агент ионов металлов включает в себя ЭДТА. Фармацевтические носители включают в себя также этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль для смешивающихся с водой наполнителей и гидроксид натрия, хлористо-водородную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для доведения ρΗ.
Концентрацию фармацевтически активного соединения корректируют таким образом, что инъекция обеспечивает эффективное количество для получения желаемого фармакологического действия. Точная доза зависит от возраста, массы и состояния пациента или животного, как известно в данной области.
Однодозовые парентеральные препараты упаковывают в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными, как известно и как практикуется в данной области.
Иллюстративно, внутривенная или внутриартериальная инфузия стерильного водного раствора, содержащего активное соединение, является эффективным способом введения. Другим вариантом осуществления являются стерильный водный или масляный раствор или водная или масляная суспензия, содержащая активный материал, инъецируемый должным образом для получения желаемого фармакологического действия.
Инъецируемые вещества предназначены для локального и системного введения. Обычно терапевтически эффективную дозу готовят таким образом, что она содержит концентрацию по меньшей мере приблизительно 0,1% м/м - приблизительно 90% м/м или более, предпочтительно более чем 1% м/м активного соединения относительно обрабатываемой ткани (обрабатываемых тканей). Активный ингредиент, такой как &ΗΑδΕСΡ или его растворимый домен гиалуронидазы человека, может вводиться сразу или может быть разделен на ряд меньших доз для введения с интервалами времени. Понятно, что точная доза и продолжительность лечения зависят от подлежащей лечению ткани и могут быть определены эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или экстраполяцией из тестрезультатов, полученных ίη νίνο и ίη νίίτο. Следует отметить, что концентрации и величины доз могут также варьироваться в зависимости от возраста подлежащего лечению человека. Кроме того, должно быть понятно, что для любого конкретного индивидуума конкретные схемы введения доз должны корректироваться на протяжении времени в соответствии с потребностью индивидуума и профессиональным суждением лица, вводящего или контролирующего введение этих готовых форм, и что представленные здесь диапазоны концентраций являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или практики применения заявленных готовых форм.
Обеспеченные здесь соединения могут быть приготовлены для парентерального введения инъекцией, например, болюсной инъекцией (инъекцией ударной дозы) или непрерывной инъекцией. Готовые формы для инъекции могут быть представлены в однодозовой форме, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Эти композиции могут быть суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных носителях и могут содержать способствующие приготовлению агенты, например, суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для воссоздания с подходящим наполнителем, например, стерильной апирогенной водой или другими растворителями, перед использованием. Например, здесь обеспечены парентеральные готовые формы, содержащие эффективное количество &ΗΑδΕСΡ или его растворимого домена гиалуронидазы человека, такое как 500-500000 Единиц, в стабилизированном растворе или в лиофилизированной форме.
Это соединение может быть суспендировано в микронизированной или другой подходящей форме
- 69 011654 или может быть дериватизовано с получением более растворимого активного продукта для получения пролекарства. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе предполагаемого способа введения и растворимости этого соединения в выбранном носителе или наполнителе. Эффективная концентрация является достаточной для уменьшения симптомов этого состояния и может быть определена эмпирически.
3. Лиофилизированные порошки.
Здесь обеспечены также лиофилизированные порошки, содержащие &НА8ЕОР или его растворимый домен гиалуронидазы человека, которые могут быть воссозданы для введения в виде растворов, эмульсий и других смесей. Эти готовые формы могут быть также воссозданы и приготовлены в виде твердых веществ или гелей.
Стерильный лиофилизированный порошок получают растворением части твердого вещества или смешиванием аликвоты раствора, содержащего &НА8ЕОР или его растворимый домен гиалуронидазы человека, в подходящем растворителе. Этот растворитель может содержать эксципиент, который улучшает стабильность или другой фармакологический компонент порошка или воссозданного раствора, приготовленного из этого порошка. Эксципиенты, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу, лактозу или другой подходящий агент. Растворитель может также содержать буфер, такой как цитрат, фосфат натрия или калия или другой подобный буфер, известный специалистам в данной области, обычно с приблизительно нейтральным рН. Последующее стерильное фильтрование этого раствора с последующей лиофилизацией при стандартных условиях, известных специалистам в данной области, обеспечивает лиофилизированную готовую форму. Обычно раствор, полученный стерильным фильтрованием, распределяют во флаконы для лиофилизации. Каждый флакон может содержать единственную дозу, например 10-1000 мг или 100-500 мг, или множественные дозы этого соединения.
Вкратце, этот лиофилизированный порошок готовят растворением декстрозы, сорбита, фруктозы, кукурузного сиропа, ксилита, глицерина, глюкозы, сахарозы, лактозы или другого агента, приблизительно 1-20%, в подходящем буфере, таком как цитратный, натрий- или калий-фосфатный или другой подобный буфер, известный специалистам в данной области, при приблизительно нейтральном рН. Затем, выбранную соль, например, натриевую соль кНА8ЕОР (приблизительно 1 г соли на 10-100 г этого буферного раствора, обычно приблизительно 1 г/30 г), добавляют к полученной смеси при температуре, более высокой, чем комнатная температура, такой как приблизительно 30-35°С, и перемешивают до ее растворения. Полученную смесь разбавляют добавлением дополнительного количества буфера для уменьшения полученной концентрации этой соли на приблизительно 10-50%, обычно на приблизительно 15-25%. Полученную смесь стерильно фильтруют или обрабатывают для удаления частиц и для гарантии стерильности и распределяют во флаконы для лиофилизации. Лиофилизированный порошок может храниться при подходящих условиях, например, при приблизительно 4°С - комнатной температуре.
Воссоздание этого лиофилизированного порошка водой для инъекций обеспечивает готовую форму для применения в парентеральном введении. Для воссоздания терапевтически эффективное количество лиофилизированного порошка, содержащего &НА8ЕОР или его растворимый домен гиалуронидазы человека, добавляют на миллилитр стерильной воды или другого подходящего носителя. Точное количество зависит от выбранного соединения и может быть эмпирически определено способами, известными специалистам в данной области.
4. Местное введение.
Смеси для местного введения готовят, как описано для локального и системного введения. Местное введение, которое иногда называют в этой области чрескожным введением, обычно включает в себя применения, предназначенные для абсорбции через кожу, слизистые оболочки или другие поверхности тела (например, применения нанесением непосредственно на кожу, под язык (сублингвально) за щеку (буккально), в глаза, нос или уши или в легкие (ингаляционно)). Полученная смесь может быть раствором, суспензией, эмульсиями или т.п., и их готовят в виде кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, лосьонов, суспензий, тинктур, паст, пенок, аэрозолей, ирригационных растворов, спреев, суппозиториев, перевязочных материалов, кожных пластырей или любых других готовых форм, подходящих для местного применения.
Композиции &НА8ЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека или их фармацевтически приемлемых производных могут быть приготовлены в виде аэрозолей для местного применения, такого как ингаляция (см., например, патенты США с номерами 4044126, 4414209 и 4364923, которые описывают аэрозоли для доставки стероида, применимого для лечения воспалительных заболеваний, в частности, астмы). Эти композиции для введения в дыхательные пути могут быть в форме аэрозоля или раствора для распылителя или в виде мелкоизмельченного порошка для инсуффляции, одного или в комбинации с инертным носителем, таким как лактоза. В таком случае, частицы этой композиции будут обычно иметь диаметры, меньшие чем 50 микрон (мкм), например, меньшие чем 10 мкм.
Для введения ингаляцией композиции для применения здесь, могут доставляться в форме аэрозольного предоставления в виде спрея из находящихся под давлением упаковок или распылителя, с исполь
- 70 011654 зованием подходящего пропеллента, в том числе, но не только, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода и других подходящих газов. В случае находящегося под давлением аэрозоля, дозированная единица может определяться обеспечением клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть приготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и подходящую порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал.
Эти композиции могут быть приготовлены для локального или местного применения, например, для местного нанесения на кожу и слизистые оболочки, например, в глаз, в форме гелей, кремов и лосьонов, и для применения к глазу или для интрацистернального или интраспинального применения. Местное введение предполагается для чрескожной доставки, а также для введения в глаза или слизистую оболочку и для ингаляционных терапий. Назальные растворы этого активного соединения, одного или в комбинации с другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, также могут вводиться.
Например, готовые формы, подходящие для местного введения на кожу или в глаз, готовят в виде мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля и масла. Носители, которые могут быть использованы, включают в себя вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты и комбинации двух или более из них. Местные готовые формы могут дополнительно содержать 0,05-15 мас.% загустителей, в том числе, но не только, гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, поли(алкиленгликолей), поли/гидроксиалкил(мет)акрилатов или поли(мет)акриламидов. Местную готовую форму часто вводят инстилляцией или в виде мази в конъюнктивальный мешок. Ее используют также для ирригации или смазывания глаза, лицевых пазух и наружного слухового прохода. Местные композиции в жидком состоянии могут также присутствовать в гидрофильном трехмерном полимерном матриксе в форме полоски, котнактной линзы и т. п., из которых высвобождаются активные соединения. Местная композиция может также инъецироваться в переднюю камеру глаза, в эписклеральное пространство и другие места. Например, здесь обеспечена композиция для внутриглазного применения после вязкоупругой инъекции, содержащей стабилизированный раствор эффективного количества зНАЗЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, например, 1-5000 Единиц этого растворимого гликопротеина с удельной активностью 30-150000 Единиц/мг, в малом объеме, например, 550 мкл. В качестве другого примера, здесь обеспечена композиция для внутриглазного применения для увеличения доставки одного или нескольких фармакологических агентов в ткани внутри глаза после инъекции такими способами введения, как инъекция в суб-теноново пространство в эписклеральном пространстве, окружающем склеру, содержащая стабилизированный раствор эффективного количества зНАЗЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, например, 50-5000 Единиц этого растворимого гликопротеина с удельной активностью 30-150000 Единиц/мг в таком объеме, как 0,05-10 мл.
Эти растворы, в частности растворы, предназначенные для глазного применения, могут быть приготовлены в виде 0,01-10% изотонических растворов, с рН приблизительно 5-7, с подходящими солями.
Совместные применения с ионофорезом.
В случае местных применений и других применений к тканям, которые являются чувствительными к ионофорезу, применение одного или нескольких зНАЗЕСР (потенциально совместно приготовленных или совместно вводимых с другим фармакологическим или другим агентом) может комбинироваться с ионофоретическими способами для дополнительного содействия проникновению через ткань. В этом отношении, ионофорез и зНАЗЕСР могут функционировать согласованно благодаря тому, что ионофорез может стимулировать доставку зНАЗЕСР в ткань или другое местоположение в теле, и доставленный таким образом зНАЗЕСР может дополнительно содействовать проникновению этого фермента, а также совместно приготовленных или совместно вводимых или других молекул в ткани, т. е. ферментативным открыванием каналов, которые облегчают диффузию, а также стимулируют общий поток жидкости и, следовательно, конвективный транспорт растворенных веществ, таких как фармакологические вещества.
5. Композиции для других способов введения.
Здесь рассматриваются также другие способы введения, такие как местное нанесение, трансдермальные пластыри и ректальное введение.
Например, фармацевтическими дозированными формами для ректального введения являются ректальные суппозитории, капсулы и таблетки для системного действия. Ректальные суппозитории, используемые здесь, обозначают твердые тела для вставления в прямую кишку, которые плавятся или размягчаются при температуре тела, высвобождая один или несколько фармакологически или терапевтически активных ингредиентов. Фармацевтически приемлемыми веществами, используемыми в ректальных суппозиториях, являются основы или наполнители и агенты для увеличения точки плавления. Примеры основ включают в себя какао-масло (масло ТбеоЬгота), глицерин/желатин, карбовакс (полиоксиэтиленгликоль) и подходящие смеси моно-, ди- и триглицеридов жирных кислот. Могут быть использованы комбинации различных основ. Агенты для повышения точки плавления суппозиториев включают в себя спермацет и воск. Ректальные суппозитории могут быть приготовлены либо способом прессования, либо формованием. Обычная масса ректального суппозитория равна приблизительно 2-3 г.
Таблетки и капсулы для ректального введения готовят с использованием тех же самых фармацевтически приемлемых веществ и тех же самых способов, что и способы, описанные для готовых форм для
- 71 011654 перорального введения.
Готовые формы, подходящие для чрескожного введения, могут быть представлены в виде дискретных пластырей, адаптированных для оставления в плотном контакте с эпидермисом реципиента в течение пролонгированного периода времени. Такие пластыри предпочтительно содержат активное соединение в виде необязательно забуференного водного раствора, например, с концентрацией 0,1-0,2 М активного соединения. Готовые формы, подходящие для чрескожного введения могут также доставляться посредством ионофореза (см., например, РНагтасеийса1 ВекеагсН 3 (6): 318 (1986)) и обычно имеют форму необязательно забуференного раствора активного соединения.
Фармацевтические композиции могут также вводиться способами и/или устройствами доставки регулируемого высвобождения (см., например, патенты США с номерами 3536809; 3598123; 3630200; 3845770; 3847770; 3916899; 4008719; 4687610; 4769027; 5059595; 5073543; 5120548; 5354566; 5591767; 5639476; 5674533 и 5733566). Активные соединения или фармацевтически приемлемые производные могут быть приготовлены с носителями, которые защищают соединение против быстрого элиминирования из тела, например, формы пролонгированного высвобождения или покрытия.
В одном варианте композиций и способов, обеспеченных здесь, терапевтический агент вводят локально в доставляющем носителе замедленного высвобождения, например, в инкапсулированном виде в коллоидальной дисперсионной системе или в стабилизированных полимером кристаллах. Применимые коллоидальные дисперсионные системы включают в себя нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, в том числе эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Например, коллоидальной дисперсионной системой может быть липосома или микросфера. Липосомы являются искусственными мембранными пузырьками, которые применимы в качестве носителей доставки замедленного высвобождения при инъецировании или имплантировании. Некоторые примеры конъюгатов липид-полимер и липосом описаны в патенте США № 5631018, который включен здесь в качестве ссылки во всей полноте. Другими примерами носителей доставки замедленного высвобождения являются биодеградируемые гидрогелевые матриксы (патент США № 5041292), конъюгаты дендритных полимеров (патент США № 5714166) и многопузырьковые липосомы (ОероГоат™, Оеро!есН, Зап П1едо, СА) (патенты США с номерами 5723147 и 5766627). Одним типом микросфер, подходящих для инкапсулирования терапевтических агентов для локальной инъекции (например, в субдермальную ткань) являются поли(О,Ь)лактидные микросферы, описанные в Ό. Р1е!сНег, Апек!Н. Апа1д. 84:90-94 (1997). Например, композиция замедленного высвобождения, содержащая эффективное количество кНАЗЕОР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, например, 1-5000 Единиц/мл, может быть использована для различных применений или для лечения состояний, в том числе, но не только, для косметических композиций, лечения повреждений спинного мозга и других нарушений нервной системы, некоторых глазных нарушений, воспалительных или аутоиммунных состояний, раковых заболеваний и других хронических патологических состояний, в которых пролонгированная доставка кНАЗЕОР является полезной.
Желаемые уровни в крови могут поддерживаться непрерывной инфузией активного агента, как установлено определением уровней в плазме. Следует отметить, что лечащий врач будет знать, как и когда закончить, прервать или подвергнуть коррекции терапию для снижения дозы вследствие токсичности или дисфункций костного мозга, печени или почки. Напротив, лечащий врач будет знать, как и когда довести лечение до более высоких уровней, если клиническая реакция является недостаточной (для предотвращения токсических побочных действий).
Эффективность и/или токсичность полипептида кНАЗЕОР и/или его ингибитора (его ингибиторов), отдельно или в комбинации с другими агентами, такими как терапевтически эффективные агенты, также может быть оценена способами, известными в данной области (см., например, О & Арок; ВеШу, !пуек(1да!юпа1 №\ν Эгидк 15: 5-13 (1997)).
6. Изделия.
Полипептиды кНАЗЕОР или их растворимые домены гиалуронидазы человека или композиции, содержащие любой из предыдущих агентов, могут быть упакованы в виде изделий, содержащих упаковочный материал, соединение или его подходящее производное, обеспеченное здесь, которое является эффективным для лечения обсуждаемых здесь заболеваний или нарушений, в это упаковочном материале, и ярлык, который указывает, что это соединение или его подходящее производное предназначено для лечения обсуждаемых здесь заболеваний или нарушений. Этот ярлык может необязательно включать в себя те нарушения, для которых гарантирована эта терапия.
Обеспеченные здесь изделия содержат упаковочные материалы. Упаковочные материалы для применения в упаковке фармацевтических продуктов хорошо известны специалистам в данной области (см., например, патенты США с номерами 5323907, 5052558 и 4003352). Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают в себя, но не ограничиваются ими, блистерные упаковки, склянки, пробирки, ингаляторы, насосы, мешки, флаконы, контейнеры, шприцы, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранной композиции и предполагаемого способа введения и терапии. Обсуждается широкий ряд композиций этих соединений и обеспеченных здесь композиций, как и множество способов лечения для любого нарушения, в котором предполагается инфекция НСУ в качестве медиатора или предрасполагающего фактора в отношении симптомов или этиологического фактора.
- 72 011654
Здесь обеспечены также наборы, содержащие эти композиции и/или комбинации с инструкциями в отношении их применения. Эти наборы могут дополнительно включать в себя иглу или шприц, обычно упакованные в стерильную форму, для инъекции этого комплекса, и/или упакованную спиртовую подушечку. Необязательно включены инструкции для введения активного агента врачом или пациентом. Например, здесь обеспечен набор, содержащий шприц небольшого объема с эффективным количеством ША8ЕСР или его растворимого домена гиалуронидазы человека, таким как 1-5000 Единиц растворимого гликопротеина, в объеме 5-50 мкл, необязательно содержащий второй шприц, содержащий вязкоупругий материал. Здесь обеспечен также набор, содержащий шприц небольшого объема, содержащий эффективное количество κΗА8ЕСΡ или его растворимого домена гиалуронидазы человека, такое как 1-5000 Единиц растворимого гликопротеина, и терапевтическое количество второго активного ингредиента, например, лекарственного средства, малой молекулы, белка или нуклеиновой кислоты.
К. Модели животных.
Здесь обеспечены модели трансгенных животных и животные, такие как грызуны, в том числе мыши и крысы, коровы, куры, свиньи, козы, овцы, обезьяны, в том числе гориллы, и другие приматы. В частности, обеспечены трансгенные животные (не человек), которые содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид κΗА8ЕСΡ, или трансгенное животное, в котором экспрессия этого полипептида была изменена, например, заменой или модификацией промоторного района или другого регуляторного района эндогенного гена. Такое животное может быть получено стимуляцией рекомбинации между эндогенной нуклеиновой кислотой и экзогенным геном κΗА8ЕСΡ, который мог бы сверхэкспрессироваться или недостаточно экспрессироваться, например, экспрессией под контролем сильного промотора, через событие гомологичной или другой рекомбинации.
Трансгенные животные могут быть получены введением нуклеиновой кислоты с использованием любого известного способа доставки, в том числе, но не только, микроинъекции, липофекции и других способов доставки генов в зародышевую клетку или соматические клетки, такие как зародышевая (эмбриональная) стволовая клетка. Обычно эту нуклеиновую кислоту вводят в клетку, такую как зародышевая (эмбриональная) стволовая клетка (Е8), с последующей инъекцией Е8-клеток в бластоцисту и имплантированием этой бластоцисты в приемную мать, после чего следует рождение трансгенного животного. Обычно введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в хромосому животного происходит рекомбинацией между гетерологичной &ЫА8ЕСР-кодирующей нуклеиновой кислотой и эндогенной нуклеиновой кислотой. Гетерологичная нуклеиновая кислота может быть нацелина в специфическую хромосому. В некоторых случаях, могут быть получены животные с нокаутом гена. Такое животное может быть исходно получено стимуляцией гомологичной рекомбинации между геном полипептида κΗА8ЕСΡ в его хромосоме и экзогеннным геном полипептида κΗА8ЕСΡ, который был сделан биологически неактивным (обычно встраиванием гетерологичнной последовательности, например, гена устойчивости к антибиотику). В одном варианте осуществления эту гомологичную рекомбинацию выполняют трансформацией полученных из зародыша стволовых клеток (Е8) вектором, содержащим инсерционно инактивированный ген полипептида κΗА8ЕСΡ, так что происходит гомологичная рекомбинация, с последующей инъекцией этих Е8-клеток в бластоцисту и имплантацией этой бластоцисты в приемную мать с последующим рождением химерного животного («животного с нокаутом», в котором ген полипептида ША8ЕСР был инактивирован (см. СаρессН^, 8с1еасе 244: 1288-1292 (1989)). Это химерное животное может быть размножено для получения гомозиготных животных с нокаутом, которые затем могут быть использованы для получения дополнительных животных с нокаутом. Животные с нокаутом генов включают в себя, но не ограничиваются ими, мышей, хомячков, овец, свиней, крупный рогатый скот и других млекопитающих, не являющихся человеком. Например, получена мышь с нокаутом. Полученные животные могут служить в качестве моделей конкретных заболеваний, таких как рак, которые проявляют пониженную экспрессию полипептида κΗА8ЕСΡ. Такие животные с нокаутом могут быть использованы в качестве животных-моделей таких заболеваний, например, для скрининга или тестирования молекул на способность лечить или предотвращать такие заболевания или нарушения.
Могут быть получены другие типы трансгенных животных, в том числе животные, которые сверхэкспрессируют полипептид κΗА8ЕСΡ. Такие животные включают в себя животных с введенным геном (животных с кηοск-^η), которые являются животными, в которых нормальный ген был заменен вариантом, таким как мутантный ген, сверхэкспрессируемая форма или другая форма. Например, ген одного вида, например, эндогенный ген грызуна, может быть заменен геном другого вида, например, геном от человека. Животные могут быть также получены негомологичной рекомбинацией в другие сайты в хромосоме; в том числе животные, которые имеют множество событий интеграции.
После получения трансгенного животного первой генерации химерное животное может быть размножено для получения дополнительных животных со сверхэкспрессируемыми или недостаточно экспрессируемыми полипептидами κΗА8ЕСΡ. Такие животные включают в себя, но не ограничиваются ими, мышей, хомячков, овец, свиней, крупный рогатый скот и других млекопитающих, не являющихся человеком. Полученные животные могут служить в качестве моделей конкретных заболеваний, таких как рак, которые проявляют сверхэкспрессию или недостаточную экспрессию полипептида κΗА8ЕСΡ. Такие животные могут быть использованы в качестве животных-моделей таких заболеваний, например, для
- 73 011654 скрининга или тестирования молекул на способность лечить или предотвращать такие заболевания или нарушения. В конкретном варианте осуществления была получена мышь со сверхэкспрессированным или недостаточно экспрессированным полипептидом &НА8ЕСР.
Следующие примеры включены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема этого изобретения.
Ь. Терапевтические применения кНА8ЕСР.
Природные ферменты гиалуронидазы из (ското)бойни были основным источником клинических ферментных препаратов на протяжении сорока лет. Бычьи и овечьи яички являются основным источником этого материала. Однако эти клинические ферментные препараты являются неочищенными, продаваемыми в виде препаратов с чистотой 0,5-5% на основе известных удельных активностей 30-100000 Единиц/мг. Таким образом, отсутствие чистоты в соединении с их происхождением из (ското)бойни делало их как иммуногенными в отношении людей, так и потенциальным источником болезни Крейтцфельда-Якоба и других бычьих и овечьих патогенов. Известно, что имеют место анафилактические реакции на бычьи и овечьи преператы гиалуронидазы.
Полученную из крупного рогатого скота или бактерий гиалуронидазу использовали в лечении заболеваний, ассоциированных с избыточной гиалуроновой кислотой, и для усиления циркуляции физиологических жидкостей и/или терапевтических агентов. Например, бычья гиалуронидаза может быть совместно инъецирована с анестезией в перибульбарный, ретробульбарный и суб-теноновый участки для глазных хирургических процедур. Кроме того, в ее отсутствие встречаются увеличенные хирургические осложнения (Вго^п 8.М. е! а1. Д Са!агас! ВеГгас! 8игд. 1999 8ер; 25(9): 1245-9). Бычью гиалуронидазу использовали также в качестве антидота в отношении локального некроза вследствие паравенозной инъекции некротических веществ, таких как винкаалкалоиды (Еете, В.Т (1987) Атег. 1 Ма!егп. СЫ1б Мнк. 12, 23-26). Гиалуронидаза бычьего яичка применима также для лечения ганглионарных кист (Раи1 е! а1. Д Напб 8игд 1997 Арг; 22(2): 219-21). Гиалуронидаза может быть также использована для облегчения подкожной доставки жидкостей в гиподермоклизисе (Вегдег ЕУ, Ат Сепа!г 8ос 1984 Маг; 32 (3):199-203). Гиалуронидазу использовали также для уменьшения внутриглазного давления в глазах пациентов с глаукомой и пациентов с катарактой, получающих вязкоупругие вещества (Патент США № 4820516, поданный 11 апреля 1989 г.).
Полученные из крупного рогатого скота или бактерий гиалуронидазы использовали также в качестве «распространяющего (распределяющего) агента» для увеличения активности химиотерапевтических веществ и/или доступности опухолей для химиотерапевтических веществ (8с1ш11ег е! а1., 1991, Ргос. Атег. Аккос. Сапсег Век. 32:173, аЬк!гас! по. 1034; Схе)са е! а1., 1990, РНагта/1е 45:Н.9). Комбинированная химиотерапия с гиалуронидазой является эффективной в лечении различных типов рака, в том числе рака мочевого пузыря (Нот е! а1., 1985, I. 8игд. Опсо1. 28:304-307), плоскоклеточного рака (КоНпо е! а1., 94, I. Сапсег Век. Опсо1. 120:293-297), рака молочной железы (Вескеп1еНпег е! а1., 1992, I. Сапсег Век. Опсо1. 118:591-596) и желудочно-кишечного рака (8сНеййаиег е! а1., 1988, Апйсапсег Век. 8: 391-396). Гиалуронидаза является эффективной в качестве единственного терапевтического агента в лечении рака головного мозга (глиом) (Опубликованная заявка РСТ № УО 88/02261, опубликованная 7 апреля 1988 г.). Введение гиалуронидазы индуцирует также чуствительность ранее устойчивых к химиотерапии опухолей поджелудочной железы, желудка, ободочной кишки, яичников и молочной железы (Ваитдайпег, 1988, Вед. Сапсег Тгеа!. 1:55-58; 2апкег е! а1., 1986 Ргос. Агаег. Аккос. Сапсег Век. 27:390). К сожалению, загрязнения и природа таких гиалуронидаз (не человека) приводит к анафилактическим реакциям.
Кроме непрямых противораковых действий, полученная от крупного рогатого скота гиалуронидаза имеет прямые противораковые действия. Гиалуронидаза предотвращает рост опухолей, трансплантированных в мышей (Ие Маеуег е! а1., 1992, 1п!. 1 Сапсег 51:657-660) и ингибирует образование опухоли после воздействия канцерогенов (Ра\\'1о\\'кк| е! а1., 1979, 1п!. I Сапсег 23:105-109; НаЬегтап е! а1., 1981, Ргосеебтдк о£ (Не 17!Н Аппиа1 Меейпд о£ (Не Атепсап 8ос1е(у о£ С11шса1 Опсо1оду, УакЫпд!оп, И.С, 22:105, аЬк!гас! по. 415).
При условии важности полученных из крупного рогатого скота гиалуронидаз в качестве терапевтического агента, в частности, в химиотерапии вместе с общепринятыми химиотерапевтическими веществами или в качестве независимого химиотерапевтического вещества самого по себе, в этой области существует потребность по существу в чистых препаратах гиалуронидазы, происходящих от человека. Имеется также потребность в эффективных экономичных способах получения гиалуронидазы для обеспечения коммерчески значимых количеств этого фермента. Данное изобретение решает эти проблемы.
Гиалуронидаза является важным компонентом внеклеточного матрикса. Гиалуроновая кислота обнаружена в соединительной ткани млекопитающих и является главным компонентом стекловидного тела в глазу. В соединительной ткани, вода гидратации, ассоциированная с гиалуроновой кислотой, создает пространства между тканями, создавая посредством этого среду, способствующую движению и пролиферации клеток. Гиалуроновая кислота играет ключевую роль в биологических явлениях, ассоциированных с подвижностью клеток, включающих в себя быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбриологическое развитие, заживление ран, ангиогенез и онкогенез (Тоо1е, 1991, Се11 Вю1. Ех!гасе11. Ма!пх, Нау (еб.), Р1епит Ргекк, Νονν Уогк, 1384-1386; Вейгапб е! а1., 1992, 1п!. I. Сапсег 52:1-6; Кпибкоп е!
- 74 011654 а1., 1993, РА8ЕВ ί. 7:1233-1241). Кроме того, уровни гиалуроновой кислоты коррелируют с агрессивностью опухолей (Охе11о е! а1., 1960, Савсег Кек. 20:600-604; ТакеисЫ е! а1., 1976, Савкег Кек. 36:2133-2139; К1та!а е! а1., 1983, Савсег Кек. 43:1347-1354).
После повреждения спинного мозга астроцитами образуются глиальные рубцы, и они содержат хондроитинсульфатпротеогликаны (С8РО). С8РО играют решающую роль в ингибировании роста аксонов (Ъст1пс, 1994; Ро\уе11 е! а1., 1997). Например, во время фетального развития С8РО отталкивают аксоны и ингибируют адгезию нервных клеток. С8РО играют также важную роль в образовании границ (8по\у е! а1., 1990, 1992; Ро\\'с11 аай Ое11ег, 1999). Кроме того, экспрессия С8РО увеличивается после повреждения ЦНС (Мскеοη е! а1., 1991; Оау1ек е! а1., 1997).
Исследования показывают, что ингибирующие действия С8РО в основном обусловлены сахарной цепью гликозаминогликана (ОАО) хондроитинсульфата (С8) (8по\у е! а1., 1990; Со1е аай МсСаЬ1е, 1991; Ое1кег1 авй В^пкс!, 1993). Это подтверждается открытием, что введение бактериальной хондроитиназы действительно стимулирует регенерацию аксонов при интратекальном введении. Кроме того, электрофизиологические эксперименты определили, что регенерированные С8Т аксоны устанавливали функциональные связи (ВгайЬигу, е! а1. 2002).
Кроме их прямых ингибирующих действий, С8РО могли также взаимодействовать с молекулами клеточной адгезии или нейротрофическими факторами, влияя на разрастания невритов (КоЬейк е! а1., 1988; Киок1аШ1 аай УатадисЫ, 1991; МПеу е! а1., 1994). Таким образом, рекомбинантные гиалуронидазы млекопитающих применимы для обращения ингибирования С8РО в глиальном рубце и для стимуляции регенерации аксонов после повреждения.
Количество &НА8ЕОР, требуемое для достаточного расщепления С8РО в глиальном рубце, будет варьироваться. В некоторых случаях повторяемое введение 10-5000 Единиц &НА8ЕОР интратекальной доставкой будет необходимо для удаления С8РО в этом рубце. В других случаях может быть предпочтительным поддерживаемое высвобождение кНА8ЕОР через применение формы замедленного высвобождения. Альтернативно, введение векторов генотерапии, кодирующих &НА8ЕОР, может быть эффективным для усиления клиренса С8РО.
&НА8ЕОР могут быть также использованы для лечения грыж межпозвоночных дисков в процессе, известном как хемонуклеолиз. Хондроитиназа АВС и фермент, расщепляющий субстраты, сходные с субстратами кНА8ЕОР, могут индуцировать уменьшение междискового давления в поясничной области позвоночника (8акак1 е! а1., 2001, 1к1ика\\'а е! а1., 1999). Имеются три типа повреждений дисков. Грыжа межпозвоночного диска является повреждением, которое является интактным, но выпячивающимся вперед. В смещенном (выступающем) диске соединительная обертка разорвана и ИР просачивается наружу, но все еще соединен с диском. В отторженном диске фрагмент ИР полностью оторван от диска и является свободным в канале позвоночника. Хемонуклеолиз является эффективным на межпозвоночной грыже и выступающих (смещенных дисках), но не на подвергнутых секвестрации диска повреждениях. В Соединенных Штатах хемонуклеозис одобрен только для применения в поясничном (нижнем) отделе позвоночника. В других странах, хемонуклеозис был также успешно использован для лечения шейных грыж (верхнего отдела позвоночника). Таким образом хемонуклеозис является консервативной альтернативой хирургии дисков, когда предпочтительно уменьшение давления на диски.
Точный состав и структура углеводной цепи (углеводных цепей) на гликопротеине может непосредственно влиять на полупериод существования гликопротеина в сыворотке, так как клетки в печени и ретикулоэндотелиальной системе могут связывать и интернализовать циркулирующие гликопротеины с конкретными углеводами. Гепатоциты имеют рецепторы на их поверхностях, которые узнают олигосахаридные цепи с концевыми (т. е. на самом наружном конце (концах) гликанов относительно полипептида) остатками Оа1, макрофаги содержат рецепторы для концевых остатков Маа или О1сИАс, и гепатоциты и лимфоциты имеют рецепторы для экспонированных остатков фукозы. Однако не обнаружены специфические в отношении сиаловой кислоты рецепторы. Хотя и есть некоторая зависимость от пространственного размещения олигосахаридов, как общее правило, чем больше количество экспонированных сахарных остатков, узнаваемых рецепторами клеточной поверхности в печени и ретикулоэндотелиальной системе, тем быстрее гликопротеин будет выводиться из сыворотки. Однако, вследствие отсутствия рецепторов сиаловой кислоты, олигосахариды, имеющие все ветви, оканчивающиеся, или «кэппированные», сиаловой кислотой, не будут стимулировать клиренс белка, к которому они присоединены.
Присутствие и природа олигосахаридной цепи (олигосахаридных цепей) на гликопротеине может также влиять на важные биохимические свойства, наряду с их узнаванием сахар-специфическими рецепторами на клетках печени и ретикулоэндотелиальных клетках. Удаление углевода из гликопротеина будет обычно уменьшать его растворимость и может также увеличивать его чувствительность к протеолитическому расщеплению дестабилизацией правильного характера фолдинга полипептида и/или демаскированием чувствительных к протеаза сайтов. По сходным причинам, статус гликозилирования белка может влиять на его узнавание иммунной системой.
&НА8ЕОР могут быть использованы для удаления клеток кумулуса, окружающих ооцит, перед криоконсервированием и другими способами оплодотворения ίη νίϋΌ, такими как интрацитоплазматическая инъекция спермы (1С81). Гиалуронидаза может быть добавлена к собранным ооцитам в количестве
- 75 011654
10-200 Е/мл в забуференных солевых растворах. Ооциты отделяют от высвобожденных клеток кумулуса аспирацией и промывают несколькими промывками средой, не содержащей гиалуронидазы. Затем эти яйцеклетки могут быть обработаны для криоконсервирования или способов оплодотворения в пробирке (ΐνρ).
кНАЗЕСР применимы также для более эффективного проникновения химиотерапевтических агентов в солидные опухоли. кНАЗЕСР могут инъецироваться внутриопухолевым способом с противораковыми агентами или внутривенно для диссеминированных типов рака или труднодостигаемых опухолей. Противораковым агентом может быть химиотерапевтический агент, антитело, пептид или вектор генотерапии, вирус или ДНК. Кроме того, кНАЗЕСР могут быть использованы для рекрутинга опухолевых клеток в циклический пул для сенсибилизации ранее резистентных к химическому воздействию опухолей, которые имеют приобретенную многокультуральную резистентность к лекарственным средствам (3ί Сго1х с! а1. Сппссг Ьей 1998 Зер 11; 131(1): 35-44). кНАЗЕСР применимы также для увеличения доставки биологических агентов, таких как моноклональные антитела, цитокины и другие лекарственные средства, к опухолям, которые накапливают гликозаминогликаны. Многие опухоли делетируют гены, участвующие в катаболизме гликозаминогликанов, так что локализованное накопление может мешать противоопухолевым агентам и иммунной системе достигать массы опухоли.
кНАЗЕСР могут быть также использованы для увеличения чувствительности опухолей, которые являются резистентными в отношении общепринятой химиотерапии. В одном варианте осуществления кНАЗЕСР вводят пациенту, имеющему опухоль, ассоциированную с дефектом ЬиСа-1, в количестве, эффективном для увеличения диффузии около участка опухоли (например, увеличение циркуляции химиотерапевтических факторов (например, для облегчения циркуляции и/или концентраций химиотерапевтических агентов в участке опухоли и вокруг опухоли)), ингибирования подвижности опухолевых клеток (например, расщеплением НА) и/или для снижения порога апоптоза опухолевых клеток, т.е. приведения опухолевой клетки (опухолевых клеток) в состояние аноикиса (апоптоза нормальных эпителиальных и эндотелиальных клеток), состояния, которое делает опухолевую клетку (опухолевые клетки) более чувствительными к действию химиотерапевтических агентов или других агентов, которые могут способствовать гибели клеток, предпочтительно преимущественно способствовать программированной гибели клеток в аноикисе. Химиотерапевтические агенты обозначают в этом контексте все молекулы, синтетические (например, цисплатин), а также природные (например, фактор некроза опухолей ΐΡ), которые способствуют ингибированию роста опухолевых клеток и предпочтительно способствуют, более предпочтительно, преимущественно способствуют гибели опухолевых клеток.
Особый интерес представляет применение кНАЗЕСР для лечения метастатических и неметастатических типов рака, в частности, метастатических типов рака, имеющих уменьшенную недетектируемую гиалуронидазную активность относительно нераковых (нормальных) клеток. Например, кНАЗЕСР может быть использован в качестве химиотерапевтического агента (отдельно или в комбинации с другими химиотерапевтическими агентами) в лечении любого из различных типов рака, в частности, инвазивных опухолей. Например, кНАЗЕСР может быть использован в лечении мелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточного рака, а также рака молочной железы, рака яичников, рака головы и шеи или любого другого рака, ассоциированного с пониженными уровнями гиалуронидазы или с дефектным геном ЬиСа-1 (НрНАке) (например, гена ЬиСа-1, который не обеспечивает экспрессию достаточных уровней НрНАке или кодирует дефектную НрНАке, которая не обеспечивает достаточный уровень гиалуронидазной активности) или другим дефектом, ассоциированным с уменьшенным катаболизмом гиалуронана. кНАЗЕСР является предпочтительным для лечения злокачественностей, ассоциированных с недостаточным катаболизмом НА (гиалуроновой кислоты), так как он не требует клеточного участия для осуществления расщепления.
Конкретная доза, подходящая для введения, может быть легко определена специалистом в данной области в соответствии с факторами, обсуждаемыми выше (см., например, Рппс1р1ск ο£ 1п!сгпп1
Мебюте, 11'1' Еб., 1987). Кроме того, оценки для подходящих доз в людях могут быть экстраполированы из определений уровня ферментативной активности кНАЗЕСР ίη νίίτο и/или доз, эффективных в исследованиях на животных. Например, доза 70-300 ТКИ гиалуронидазы является эффективной в уменьшении общей опухолевой массы в мыши ЗСГО. В соответствии с этой информацией соответствующие дозы для человека со средней массой 70 кг будут находиться в диапазоне приблизительно 250000-1200000 ТКИ гиалуронидазы. Количество кНАЗЕСР, вводимое пациенту-человеку, находится обычно в диапазоне 1-5000000 ТКи ферментативной активности, предпочтительно приблизительно 1000-2500000 ТКИ, более предпочтительно приблизительно 100000-1500000 ТКИ, обычно приблизительно 250000-1200000 ТКИ, в качестве средних прописываемых доз.
В одном варианте осуществления кНАЗЕСР готовят в 0,15 М солевом растворе, содержащем кНАЗЕСР в концентрации приблизительно 150000 ТКИ/см3. Затем готовую форму инъецируют внутривенно при 15000 ТКи/кг массы тела пациента. Альтернативно, эта готовая форма фермента может быть также инъецирована подкожно, чтобы позволить гиалуронидазе перфузировать вокруг участка опухоли. В предпочтительном варианте осуществления кНАЗЕСР инъецируют около опухоли или в массу опухоли. В другом предпочтительном варианте осуществления кНАЗЕСР готовят в виде липосомы и доставляют
- 76 011654 инъекцией либо внутривенно, либо вблизи участка раковых клеток, ассоциированных с дефектом в гене ЬиСа-1 (крНАзе). Внутривенная инъекция зНА8ЕСР приводит к зНА8ЕСР в участке опухоли. Кроме того, сверхсиалированный зНА8ЕСР вводят предпочтительно парентеральным введением, поскольку концевые сиаловые кислоты на зНА8ЕСР предотвращают клиренс этого фермента из кровотока ретикулоэндотелиальной системой. Сравнения сверхсиалированного зНА8ЕСР с несиалированными бычьими и овечьими гиалуронидазами обнаружили, что достигается существенно более благоприятная фармакокинетика.
Облегчение генотерапии.
Эффективность большинства сред доставки генов ш νί\Ό не соответствует обнаруживаемой ш νίΙΐΌ эффективности.
Гликозаминогликаны могут препятствовать переносу и диффузии ДНК и вирусных векторов во многие типы клеток. Уровни такого материала внеклеточного матрикса могут существенно препятствовать этому процессу. ЭиЬепзку е! а1., (Ргос №111 Асаб 8а И8А 1984 декабрь; 81 (23):7529-33) продемонстрировали, что гиалуронидаза при объединении с коллагеназой может облегчать трансдукцию ДНК ш νί!ΐΌ. Было продемонстрировано, что аденоассоциированный вирус является также пригодным для опосредованной гиалуронидазой генотерапии (Рауге е! а1., Сепе Тйег 2000 август; 7(16):1417-20).
Авторы этого изобретения определили, что зНА8ЕСР открывает каналы определенного размера во внеклеточном матриксе. Эти поры обычно не усиливают диффузию веществ с диаметром, большим чем 200-500 нм. Однако меньшие молекулы, такие как ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и ДНК-комплексы, поддаются опосредованной зНА8ЕСР диффузии. Тот факт, что зНА8ЕСР обычно открывают каналы, которые являются по существу достаточно большими для создания возможности движения большинства представляющих интерес терапевтических и других фармакологических агентов (в том числе макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты, а также макромолекулярные комплексы, такие как векторы генотерапии) и в то же самое время являются не настолько большими, чтобы стимулировать смещение и движение клеток, обеспечивает особенно выгодные применения, например, в лечении, предупреждении и/или диагностике различных заболеваний.
Альтернативно, вирусы могут быть укреплены геном зНА8ЕСР для облегчения их репликации и распространения, например, в ткани-мишени. Этой тканью-мишенью может быть раковая ткань, вследствие чего этот вирус способен к селективной репликации в этой опухоли. Этим вирусом может также быть нелитический вирус, и в этом случае вирус селективно реплицируется под контролем тканеспецифического промотора. Поскольку эти вирусы реплицируются, коэкспрессия зНА8ЕСР с вирусными генами будет облегчать распространение этого вируса ш νί\Ό.
Альтернативно, представляющая интерес нуклеиновая кислота и зНА8ЕСР могут быть использованы одновременно или последовательно или таким образом, что их введение регулируется ступенчатым образом на протяжении времени. Термин «одновременно» обозначает совместное введение. В этом случае эти два важных компонента могут смешиваться для образования композиции перед введением или могут вводиться в одно и то же время в клетку или организм-хозяина. Их можно также вводить последовательно, то есть один за другим, независимо от того, какой компонент в этом комбинированном продукте в соответствии с данным изобретением вводится первым. Наконец, можно использовать способ введения, который является ступенчатым на протяжении времени или чередующимся и который останавливается и вновь начинается с интервалами, которые могут быть регулярными или могут не быть регулярными. Подчеркивается, что способы и участки введения этих двух компонентов могут быть различными. Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления зНА8ЕСР вводят перед нуклеиновой кислотой, причем способ введения этих двух компонентов предпочтительно является одинаковым. Временной интервал между этими инъекциями не является решающим и может быть определен специалистом в данной области. Может быть рекомендован интервал от 10 мин до 72 ч, благоприятно от 30 мин до 48 ч, предпочтительно от 1 до 24 ч, очень предпочтительно от 1 до 6 ч.
Кроме того, этот комбинированный продукт по данному изобретению может быть также объединен с одной или несколькими молекулами, которые предназначены для улучшения введения нуклеиновой кислоты. Этими молекулами могут быть молекулы, которые имеют защитное действие на нуклеиновую кислоту (с защитой в отношении расщепления в клетке), которые улучшают ее проникновение или ее экспрессию в клетке-хозяине (фузогенный пептид, сигнал ядерной локализации и т.д.), которые позволяют ей быть нацеленной на конкретный тип клеток (лиганд или антитело, которое узнает белок клеточной поверхности, и т.д.) или которые пролонгируют терапевтическое действие (иммуносупрессивный агент и т. д.). Этот комбинированный продукт может быть объединен также с агентами, облегчающими трансфекцию (белками и т.д.).
Комбинированный продукт в соответствии с данным изобретением может быть приготовлен с целью локального или парентерального введения или для введения через пищеварительный тракт. Способами, которые могут быть, в частности, упомянуты, являются внутрижелудочный, подкожный, внутрисердечный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрисуставный, внутриопухолевый, внутрилегочный, интраназальный и внутритрахеальный способы и, особенно, внутримышечный способ. Введение может выполняться с использованием любого способа данной области (инъекции, перорального способа, аэро
- 77 011654 зольного способа, инстилляцией и т.д.), в виде единственной дозы или в виде дозы, которую повторяют один раз или несколько раз после конкретного интервала времени. Способ введения может корректироваться для удобства переноса представляющего интерес гена и в зависимости от подлежащего лечению заболевания. Готовая форма может включать в себя фармацевтически приемлемые среды (эксципиенты, адъюванты и т.д.). Вещество, приводящее к дезорганизации внеклеточного матрикса и представляющей интерес нуклеиновой кислоты, предпочтительно растворяют в буфере, который пригоден для фармацевтического применения и который может быть гипертоническим, гипотоническим или изотоническим. Могут ожидаться различные буферы. Буферами, которые могут быть упомянуты для иллюстрации, являются физиологический солевой раствор (0,9% №С1), нефизиологический солевой раствор (1,8% №С1), содержащий Нерез раствор Рингера, содержащий лактат раствор Рингера, буфер на основе Трис-НС1 (10 мМ Трис-НС1, рН 7,5-8, 1 мМ ЭДТА; 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5-8, 1 мМ МдС12), фосфатный буфер (содержащий фосфат-Н2О буфер Кребса), раствор сахара (глюкозы, сахарозы, трегалозы и т.д.) или просто вода.
Гиподермоклизис.
Гиподермоклизис, подкожная инфузия жидкостей, является полезным и легким способом гидратации, подходящим для слабо-умеренно дегидратированных взрослых пациентов, особенно пожилых пациентов. Этот способ считается безопасным и не дает каких-либо серьезных осложнений. Наиболее частым неблагоприятным эффектом является легкий подкожный отек, который может быть снят локальным массажем или системными диуретическими средствами. Приблизительно 3 л может быть введено за 24часовой период времени в двух отдельных участках. Обычными участками инфузии являются грудная клетка, живот, бедра и плечи. Предпочтительным раствором является нормальный солевой раствор, но могут быть также использованы другие растворы, такие как разбавленный в 2 раза нормальный солевой раствор, глюкоза с солевым раствором или 5% глюкоза. В мешок для раствора может быть добавлен хлорид калия, если необходимо. Кроме того, другие лекарственные средства могут доставляться подобными способами. зНА8ЕСР человека может быть добавлен для усиления абсорбции жидкости и увеличения общей скорости введения. зНА8ЕСР человека является предпочтительным для повторяемого гиподермоклизиса относительно получаемых со скотобойни ферментов вследствие того, что он вряд ли является иммуногенным, каким, как известно, является бычий фермент. Он может вводиться дома членом семьи или медицинской сестрой; этот способ должен быть известным любому семейному врачу.
У амбулаторных пациентов участки гиподермоклизиса включают в себя живот, верхнюю часть грудной клетки, выше межреберья и лопаточной области. У прикованных к постели пациентов предпочтительными участками являются бедра, живот и наружная часть плеча. После одного-четырех дней игла и трубки должны быть заменены, хотя инфузионные установки оставляют на месте для гораздо более продолжительных периодов без осложнений. Может выполняться введение 500-миллилитровых болюсов (ударных доз) на протяжении одного или двух часов три раза в день, причем 150 Е зНА8ЕСР вводят в этот подкожный участок перед первой утренней инфузией.
Облегчение терапевтических инъекций.
Многие молекулы, инъецируемые чрескожно (например, с использованием иглы или другого приспособления, которое проникает через кожу и используется для помещения молекул в подкожный слой), достигают кровотока медленно или с очень низкой эффективностью. Несколько факторов регулируют фармакокинетику и фармакодинамику молекул, инъецируемых подкожно (8С) или внутримышечно (ΙΜ). Обычно, более крупные молекулы достигают кровотока более медленно и менее эффективно без активного транспорта в кровоток. Подкожную биодоступность определяют расчетом отношения площади под кривой для подкожного (8С) против внутривенного (IV) введения (АиСзс/АиС1У). Вторым фактором является заряд и аффинность в отношении молекул матрикса, которые могут играть роль в подкожной секвестрации молекул. Если эти материалы расщепляются локально, они могут никогда не достичь их желаемых мишеней и, следовательно, демонстрируют уменьшенную системную биодоступность для органов-мишеней.
Большие белки обычно вводят внутривенно, так чтобы это лекарственное средство было непосредственно доступным в кровотоке. Однако было бы полезным, если бы лекарственное средство могло предоставляться подкожно, внутримышечно или внутрикожно (ГО), так как эти формы введения могут более легко вводиться пациентом, особенно, если лекарственное средство должно приниматься постоянно в течение всей жизни и лечение должно начинаться рано, когда пациент является ребенком. Однако лекарственное средство с очень большой и лабильной молекулой, такое как фактор свертывания νΙΙΙ 170-300 кДа, имеет обычно очень низкую биодоступность при подкожном, внутримышечном или внутрикожном введении, так как поглощение является недостаточным и расщепление является сильным.
Кроме необходимости увеличения биодоступности вводимых биологических агентов, более быстрая фармакокинетика является также критически важной в случаях срочной медицины. Время, необходимое для внутривенного доступа во многих пациентах, может препятствовать использованию в ином случае быстро действующего лекарственного средства при системном введении. В некоторых случаях после неуспеха внутривенного доступа выполняют подкожную инъекцию, которая приводит к дополнительной задержке в достижении органов-мишеней. Таким образом, более быстрая доступность подкож
- 78 011654 ных лекарственных средств могла бы быть полезной в качестве лечения первой очереди, а не риском увеличения времени, требуемого для достижения внутривенного доступа. Примеры молекул, которые могут доставляться подкожно, а также внутривенно, включают в себя эпинефрин, атропин, наркан, лигнокаин и декстрозу.
Дополнительная польза этого изобретения заключается в возможности доставки эквивалентных или больших объемов растворов ΙΌ, ЗС или ГМ без причинения боли и болезненности, ассоциированных с давлением и объемом раствора в участке инъекции.
В качестве иллюстрации (и без ограничения) имеются ряд биологических агентов, которые могут быть улучшены комбинированием с одним или несколькими вНАЗЕОР (например, совместным приготовлением или совместным введением вНАЗЕОР до, во время или после введения этого биологического агента), включающих в себя, например, Абциксимабы (например, КЕ0РК0™), Адалимумабы (например, НИМША™), Агалзидазы Бета (например, ЕАΒКАΖΥΜЕ™), Алдеслейкины (например, РК0ЬЕиКШ™), Алефацепты (например, АМЕШУЕ™), Алемтузумабы (например, САМРАТН™), Альтеплазы (например, АСТШАЗЕ™); Альтеплазы (например, САТНЕЬ0, АСТЕУАЗЕ™); Анакинрары (например, ЫЖКЕТ™), Арцитумомабы (например, СЕА-Зспп™), Аспарагиназы (например, ЕЬЗРАК™), Базиликсимабы (например, ЗЕМИЕЕЗТ™), Бекаплермины (например, КЕОКАЖХ™), бевацизумабы (например, АVАЗТIN™), Токсины типа А Βοϊιιΐίηιιιιι (например, В0Т0Х™), Токсины типа В Βοΐи1^ηит (например, МУ0ВЬ0С™), Капромаб-пендетиды (например, РК0ЗТАЗСЮТ™), Цетуксимабы (например, ЕКВПиХ™), Даклизумабы (например, ΖЕNАРАX™), Дарбопоэтины Альфа (например, АКА№ЗР™), Денилейкин-дифтитоксы (например, 0ЭТАК™), Дорназы Альфа (например, Рυ^Μ0ΖΥΜЕ™), Дротрекогины Альфа (например, ХЮК1З™), Эфализумабы (например, КАРТША™), Эпоэтины Альфа (например, ЕР0ОЕ№М), Этанерцепты (например, Е^КЕЬ™), Филграстимы (например, NЕυРΟОЕN™), Ибритумомабы/Тиуксетаны (например, ΖЕVА^IN™), Имциромаб-Пентетаты (например, МУ0ЗСЮТ™), Инфликсимабы (например, ^ЕМШАНЕ™), Интерфероны Альфа-2а (например, К0ЕЕК0№А™), Интерфероны Альфа ^η-1 (например, ЮТЕКОЕ^™), Интерфероны Альфа-ГО (например, А^ЕЕК0N №™), Интерфероны Бета-1а (например, АV0NЕX™, ΒЕТАЗЕК0N™), Интерфероны Бета-1а (например, НЕВГО™), Интерфероны гамма-1Ь (например, АСГОММИЖ™), Ларонидазы (например, А^^υКАΖΥΜЕ™), Нофетумомабы (например, ’УЕКЬиМА™), Омализумабы (например, X0^АIК™), Опрелвекины (например, ЖИМЕОА™), Паливизумабы (например, З'^АОК™), Пегфилграстимы (например, ЖиЬАЗТА™), Пег-интерфероны Альфа2а (например, РЕОАЗУЗ™), Пег-интерфероны Альфа-2Ь (например, РЕО-INТКΟN™), Расбуриказы (например, ЕЫТЕК™), Ретеплазы (например, КЕТАVАЗЕ™), Ритуксимабы (например, ШТиХА^™), Тенектеплазы (например, ТNКаве™), Тозитумомабы и иод Ι-131 (например, ВЕХХАК™), Трастузумабы (например, НЕКСЕРТШ™), Урокиназы (например, АВВ0КШАЗЕ™).
Кровотечение стекловидного тела.
В попытке минимизации потенциала в отношении вызывания дополнительной отслойки или разрывания сетчатки во время выполнения витрэктомии, ранее в патенте США № 5292509 (Надетац) было предложено инъецировать определенные не содержащие протеаз гликозаминогликаназные ферменты в стекловидное тело, чтобы стекловидное тело стало несвязанным или «дезинсертированным (отделенным)» от сетчатки, перед извлечением стекловидного тела. Такое отделение или разобщение стекловидного тела имело целью минимизацию вероятности, что будут иметь место дополнительные разрывание или отслойка сетчатки при извлечении стекловидного тела. Примеры конкретных не содержащих протеаз гликозаминогликаназных ферментов, которые могут быть использованы для вызывания этого дезинсертирования (отделения) стекловидного тела, предположительно, включают в себя: хондроитиназу АВС, хондроитиназу АС, хондроитиназу В, хондроитин-4-сульфатазу, хондроитин-6-сульфатазу, гиалуронидазу и бета-глюкуронидазу.
Хотя было известно, что фермент гиалуронидазы применим для различных глазных применений, в том числе для вспомогательного применения в витрэктомии, описанного в патенте США № 5292509 (Надетац), опубликованные исследования указывали на то, что фермент гиалуронидаза сам может быть токсичным для сетчатки и/или других анатомических структур глаза. См. ТНе ЗаГе!у οί ΙηΙπινίΙΐΌη1 Нуа1игошйаве; Оοΐΐ1е^Ь, ЕЬ; Аηΐοвζук, А.К, НаЮНеГ О.Ь. зпй Зο1οир^в. Р., Муев! 0рН1а1пю1 V^в За 31:11, 234552 (1990). Кроме того, используемые неочищенные препараты гиалуронидазы из скотобойни могут вызывать увеит или воспаление глаза. Таким образом, применение вНАЗЕОР человека является предпочтительным как вследствие его увеличенной эффективности, так и вследствие отсутствия животного происхождения, которое может вызывать иммуногенные реакции и опосредованную антителами нейтрализацию после повторяемого введения. В другом варианте осуществления в глаз может быть инъецирована пэгилированная форма вНАЗЕОР. Такой пэгилированный вНАЗЕОР не выводится из стекловидного тела так быстро и сохраняет свою активность в стекловидном теле в течение более продолжительного периода времени.
Токсичность для глаз некоторых препаратов гиалуронидазы была подтверждена другими исследователями, которые предложили использовать такие препараты гиалуронидазы в качестве токсического
- 79 011654 раздражителя для экспериментальной индукции неоваскуляризации глаза, в моделях токсичности животных (см. Αη Εxρе^^теη!а1 Μοάе1 οΓ ΡιόιόΕικιΙ Nеονа8си1аπζаί^οη ίη (Не КаЬЬй; Αη!ο^^ Α.Κ, ^!ίΚώ, ТЬ., Сакеу, К.С., Ыа!сЬе11, Э.Ь. апб МасЕетег, К., ЕщеЧ 0ρ1ιΙη1ιηο1 νίδ δΉ 32:1, 46-51 (1991)).
Применение высокоочищенного 8ΗЛδΕСΡ. лишенного примесей на основе ртути и происходящих от скота или из бактериальных загрязнений, является предпочтительным для внутриглазных процедур. Кроме того, рекомбинантный 8ΗΑδΕСΡ является предпочтительным в сравнении с происходящими из скотобойни препаратами вследствие чистоты и отсутствия бычьих патогенов и уменьшенного риска иммуногенности. Наиболее предпочтительным представляется пэгилированный 8ΗΑδΕСΡ.
Таким образом, обеспечен ферментативный способ с использованием 8ΗΑδΕСΡ человека для лечения глазных нарушений глаза млекопитающего. В одном варианте осуществления указанный 8ΗΑδΕСΡ является ПЭГилированным для пролонгирования его пребывания в стекловидном теле и предупреждения локализованного поглощения. Предупреждение неоваскуляризации и увеличенной скорости клиренса из стекловидного тела материалов, токсичных для сетчатки, выполняют введением количества гиалуронидазы, эффективного для разжижения жидкой части стекловидного тела обрабатываемого глаза без токсического повреждения глаза. Разжижение жидкой части стекловиднрого тела увеличивает скорость обмена жидкости из витреальной камеры. Это увеличение обмена удаляет материалы и условия, присутствие которых вызывает повреждение глаза и сетчатки.
Косметические применения 8ΗΑδΕСΡ.
Известно, что гиалуронидаза имеет действие деполимеризации длинных мукополисахаридных цепей фундаментального вещества, ответственных за удерживание связанной воды и замедление, посредством сдавливания капилляров, диффузии органических жидкостей, которые элиминируют метаболические отходы. Такое удерживание воды и отходов, ассоциированное с жировой перегрузкой липоцитов, составляет классический отек «свиной кожи» или отек «апельсиновой корки». Таким образом, эта деполимеризация будет разрезать длинные цепи мукополисахаридов на более короткие цепи, вследствие чего будет происходить элиминирование связанной воды, отходов, восстановление венозной и лимфатической циркуляции и исчезновение локального отека.
Таким образом, применение 8ΗΑδΕСΡ посредством подкожного введения является предпочтительным для удаления гликозаминогликанов, участвующих в накоплении так называемого целлюлита, и для стимуляции лимфатической циркуляции. 8ΗΑδΕСΡ человека является предпочтительным для лечения целлюлита вследствие того, что он способен удалять указанные гликозаминогликаны без воспалительных компонентов полученных из скотобойни белков и является высокоочищенным и вряд ли является иммуногенным. 8ΗΑδΕСΡ могут вводиться посредством повторяемых подкожных инъекций, трансдермальной доставкой в форме мазей или кремов и с использованием инъецируемых форм замедленного высвобождения для стимуляции непрерывного расщепления гликозаминогликанов и предотвращения их возврата.
Трансплантация органов.
Гиалуронан имеет несколько биологических эффектов, которые отчасти связаны с его молекулярным размером (^ек!, Э.С., Китаг, δ. Εχρ. Се11. Кек. 183, 179-196, 1989). Содержание гиалуронана в органе увеличивается в различных состояниях воспаления этого органа. Так, увеличенная концентрация гиалуронана была показана в ткани из различных органов, характеризующихся воспалительноиммунологическим повреждением, таким как альвеолит (№!!е1Ь1аб! О. е! а1., Αт Кеу Ке8]э Όίκ 1989; 139: 759-762) и инфаркт миокарда (\Уа16еп81гот е! а1., I С1т Еггек! 1991; 88(5): 1622-1628). Другими примерами являются отторжение аллотрансплантата после трансплантации почки (Иа'Идгеп е! а1., ί Εχρ Мей 1990а; 171:2063-2076; ^е11к е! а1., Τ^аη8ρ1аηίаί^οη 1990; 50: 240-243), тонкой кишки (^а11апйег е! а1., Ш! 1991; 6: 133-137) или сердца (ИаПдгеп е! а1., I С11п Еггек! 1990Ь; 85:668-673); или воспаление миокарда вирусного происхождения (\Уа16еп81гот е! а1., Ειιγί С1т Еггек! 1993; 23: 277-282).
Проявление интерстициальных отеков в связи с пересадкой органа представляет серьезную проблему в области трансплантационной хирургии. Такое большое количество, как 25% трансплантатов, будет отекать до такой степени, что функция будет временно потеряна. Кроме того, в 2-3% случаев этот отек вызывает разрыв почки, приводя к сильному кровотечению.
8ΗΑδΕСΡ может быть использован для расщепления накопленных гликозаминогликанов в органетрансплантате. Удаление таких гликозаминогликанов стимулирует удаление воды из трансплантата и, следовательно, функцию органа. Для уменьшения интерстициального давления как такового может вводиться доза в диапазоне 500-10000 Единиц/кг.
Патологические накопления гликозаминогликанов в головном мозге.
Уровни гиалуронана являются повышенными в ряде цереброспинальных патологических состояний. Уровни цереброспинального гиалуронана являются в норме меньшими чем 200 мкг/л, у взрослых (Ъаигеп! е! а1., Ααη №иго1 δсапά 1996 δеρ; 94(3):194-206). Эти уровни могут увеличиваться до 8000 мкг/л в таких заболеваниях, как менингит, спинно-мозговой стеноз и церебральный инфаркт. Таким образом, 8ΗΑδΕСΡ (например, посредством интратекальной доставки или системной инъекции 8ΗΑδΕСΡ, ПЭГилированного 8ΗΑδΕСΡ или сверхсиалированного 8ΗΑδΕСΡ) может быть использован для уменьшения критически повышенных уровней субстрата.
- 80 011654
Отсутствие эффективной лимфатической системы в головном мозге может также приводить к угрожающему жизни отеку после травмы головы. Накопления гиалуронана является результатом увеличенного синтеза НА-синтазами и уменьшенного расщепления. Накопление гиалуронана может сначала служить полезной роли увеличения содержания воды в поврежденной ткани для облегчения экстравазации лейкоцитов, но продолжающееся накопление может быть летальным. Введение хНАБЕСР человека пациенту, страдающему от травмы головы, может, следовательно, приводить к удалению накопления гиалуронана в ткани и воды, связанной с ней. хНАБЕСР человека может вводиться интратекально через шунт, или, альтернативно, хНАБЕСР, ПЭГилированный хНАБЕСР или сверхсиалированный хНАБЕСР (предпочтительно версии хНАБЕСР человека) могут вводиться внутривенно для достижения ткани головного мозга.
После ишемии и реперфузии головного мозга, как это имеет место в случае инсульта, содержание гиалуронана обычно разительно увеличивается вследствие увеличенной экспрессии НА-синтаз и пониженного катаболизма. Недостаточность ионных насосов и утечка плазмы в интерстиций приводит к удерживанию жидкости, которая, если она не выводится должным образом лимфатической системой, приводит к некрозу ткани. Некоторые группы пытались предотвращать накопление интерстициальной жидкости после реперфузии ишемии блокированием проницаемости сосудов. Однако, как только жидкость экстравазируется, предотвращение проницаемости сосудов может препятствовать снятию отека и обострять эти состояния. Как отмечалось выше, хНАБЕСР человека может вводиться интратекально (например, через шунт) или хНАБЕСР, ПЭГилированный хНАБЕСР или сверхсиалированный хНАБЕСР (предпочтительно версии хНАБЕСР человека) могут вводиться внутривенно для достижения ткани головного мозга.
хНАБЕСР человека может быть также использован в лечении отека, ассоциированного с опухолями головного мозга, в частности, с опухолями головного мозга, которые ассоциированы с мультиформной глиобластомой. Отек, ассоциированный с опухолями мозга, происходит из накопления гиалуронана в нераковых частях головного мозга, смежных с опухолью. Введение гиалуронидазы в участки накопления гиалуронана (например, внутривенной инъекцией или через шунт) может облегчить отек, ассоциированный с такими злокачественностями, расщеплением избытка гиалуронана в этих участках. Таким образом, гиалуронидаза является успешной в лечении опухолей головного мозга не только в уменьшении массы опухоли и ингибировании роста и/или метастазирования опухоли, но также является применимой в облегчении отека, ассоциированного с этой злокачественностью. хНАБЕСР человека может вводиться для лечения отека подобно тому, что описано для введения бычьей тестикулярной гиалуронидазы для лечения отека (см., например, БаЕагр Агд. Вгах. Меб. 44:217-20).
Без связывания хНАБЕСР с конкретным применением или механизмом действия, авторы считают, что хНАБЕСР могут потенциально облегчать ишемический или геморрагический инсульт и/или другие повреждающие состояния ЦНС одним или несколькими из следующих механизмов действия: (ί) увеличением оксигенации поврежденной ткани понижением внутричерепного давления; (ίί) облегчением растворения сгустков и ресорбцией токсических метаболитов; (ίίί) супрессией экстравазации лейкоцитов в поврежденные или кровоточащие области (например, удалением гиалуронана, который является рецептором для ί.Ό44); (ίν) стимуляцией невральной регенерации поврежденной ткани; или (ν) увеличением церебрального образования и развития сосудов.
Лечение накопления гликозаминогликанов в сердечно-сосудистом заболевании.
Было показано, что введение гиалуронидазы животным моделям после экспериментального инфаркта миокарда может уменьшать размер инфаркта (Мас1еап, е1 а1., Бс1епсе 1976 0с1 8; 194 (426):199200). Предложенным механизмом, при помощи которого бычья гиалуронидаза уменьшает размер инфаркта у животных, является уменьшение накопления гиалуронана, которое имеет место после реперфузии ишемии. Считается, что уменьшение размера инфаркта происходить из увеличенного дренажа лимфы и увеличенной оксигенации ткани и уменьшения содержания воды миокарда. Хотя уменьшенный размер инфаркта мог быть получен у животных-моделей, выгоды не были реализованы в более крупных клинических исследованиях на людях. Гиалуронидаза бычьих яичек имеет удивительно короткий полупериод существования в сыворотке приблизительно 3 мин у животных и людей (νο1ί, е1 а1., ί Ркагта^ Ехр Ткег 1982 Аид; 222 (2):331-7). Этот короткий полупериод существования в сыворотке обусловлен концевыми остатками маннозы, которые легко узнаются утилизирующими рецепторами редикулоэндотелиальной системы. Хотя небольшие животные могут получать пользу от гиалуронидазы вследствие меньшего кровеносного ложа, необходим фермент с увеличенным полупериодом существования в сыворотке. Сверхсиалированный хНАБЕСР имеет более благоприятную фармакокинетику вследствие сиалирования, для которого нет утилизирующего рецептора. Сверхсиалированные хНАБЕСР в дозах в диапазоне 100-200000 Единиц/кг могут быть использованы для облегчения удаления избытка гиалуронана после ишемической реперфузии и для уменьшения размера инфаркта.
Сверхсиалированные хНАБЕСР могут быть также использованы для ограничения коронарных бляшек из артериосклероза. Такие бляшки накапливают гликозаминогликаны и опосредуют адгезию макрофагов и ксантомных (пенистых) клеток (Κο1ο6§ιο е1 а1., Аг1егюхс1ег ТкготЬ Уахе Вю1. 2002 0с1 1; 22 (10):1642-8). Введение сверхсиалированного хНАБЕСР может быть использовано для уменьшения бляш
- 81 011654 кообразования. Когда предполагается введение гиалуронидазы в дозах 100-1000000 Е/кг, необходимость использования рекомбинантного белка человека с более низким риском иммуногенности и увеличенным полупериодом существования в сыворотке будет приводить к лучшему уменьшению бляшек.
Лечение некроза периферических тканей.
Некроз тканей происходит во многих заболеваниях вследствие венозной недостаточности. Отсутствие достаточной оксигенации является одним из основных препятствий для возобновления роста ткани. Было показано, что внутриартериальная гиалуронидазная обработка значительно улучшает клиническую картину в пациентах с окклюзивным заболеванием периферических артерий (Е1бег е! а1., Ьапсе! (1980) 648-649). кНА8ЕОР может быть инъецирован внутриартериально 3-5 раз в неделю при дозах 10-200000 Единиц.
Увеличенная доставка анестезирующих и других фармакологических агентов в ткани человека.
Полученную из скотобойни гиалуронидазу обычно используют для перибульбарного блокирования в локальной анестезии перед глазной хирургией. Присутствие фермента предотвращает необходимость дополнительных блоков и ускоряет время до появления акинезии (потери движения глаза). Перибульбарный и суб-теноновый блок являются наиболее обычными применениями гиалуронидазы для глазных процедур. Со времени прекращения применения дубаке™, сообщались результаты увеличенной диплопии и птоза в случае перибульбарного блока (Вго\уп е! а1., I Са1агас1 КеГгас! 8игд 1999; 25:1245-9).
С прекращением ^уеГЬ применения дубаке™, полученный из бычьих яичек гиалуронидазный материал поставляется теперь компаундирующими аптеками. Однако существует ряд проблем с использованием случайным образом компаундированного стерильного продукта
1Шр:/Лу\у\у.ак11р.огд./к1юг1аде/11уа1игошбаке.сГ1п?сПб= 11944667&С РТокеп=942953-геГ#геГ. Компаундированные препараты являются не одобренными РОА продуктами. Как таковой, РОА не имеет контроля над качеством или постоянством процесса изготовления.
кНА8ЕОР из 10-500 Единиц может быть смешан непосредственно с 5 мл 2% лидокаина (Ху1осаше), 5 мл 0,5% бупивакаина (Магсаше) и необязательно с эпинефрином 1:200000. кНА8ЕОР может быть использован для увеличения появления акинезии и для удаления необходимости дополнительных блоков. кНА8ЕОР является также идеальным для акинезии для косметической хирургии в блефаропластике и в круговой пластике лица (лифтинге). кНА8ЕОР может быть также использован после таких хирургических процедур для диффузии противовоспалительных агентов и для уменьшения опухания ткани.
&НА8ЕОР может быть также смешан с буферящим раствором, таким как бикарбонатный буфер, для предотвращения дискомфорта во время процедуры инъекции. кНА8ЕОР может быть также смешан с анестетиком в отношении разрывов как для уменьшения общего материала, необходимого для инъекции, так и для уменьшения боли от распухания ткани.
Применение кНА8ЕОР для стимуляции дисперсии фармакологических и других агентов.
Как описано здесь, композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для стимуляции или усиления доставки анестетиков и других фармакологических агентов (таких как члены различных классов фармацевтически эффективных агентов, упоминаемых здесь) в различные ткани млекопитающего ш у|уо. В этом отношении, &НА8ЕОР или его растворимый домен гиалуронидазы человека может быть использован для облегчения диффузии и, следовательно, стимуляции доставки фармакологических агентов с малыми молекулами, таких как, например, анестетики, антиинфекционные и противовоспалительные агенты, а также фармакологических агентов с большими молекулами, таких как белки (в том числе ферменты, моноклональные антитела и т.п.) нуклеиновые кислоты (в том числе дезоксирибонуклеиновые кислоты (например, гены и антисмысловые молекулы и т.п.) и рибонуклеиновые кислоты (в том числе молекулы для интерференции РНК (КЛА) и т.п.) и макромолекулярных композиций, которые могут содержать комбинацию таких компонентов (в том числе комбинации нуклеиновых кислот, белков, углеводов, липидов и молекул на основе липидов и т. п.). В качестве иллюстрации и без ограничения, молекулы и макромолекулярные комплексы с диаметром в диапазоне от менее чем приблизительно 10 нм, до приблизительно 500 нм, в частности, от приблизительно 20 до приблизительно 200 нм, имеют вероятность проявления разительных улучшений в доставке через интерстициальные пространства при подвергании интерстициального пространства ранее или одновременно действию &НА8ЕОР, как описано и проиллюстрировано здесь.
Без ограничения себя конкретной теорией механизма действия, авторы считают, что кНА8ЕОР данного изобретения функционирует в основном посредством гидролиза гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе, окружающем клетки млекопитающих, создавая подобные порам проходы или каналы, которые облегчают диффузию или другое движение молекул в экспонированном внеклеточном матриксе; и, кроме того, авторы считают, что увеличение проницаемости таких частей внеклеточного матрикса оказывает огромнейшее влияние на диффузию или «распространение» молекул, которые являются не настолько большими, чтобы тормозиться другими макромолекулярными компонентами внеклеточного матрикса, такими как образующая свод коллагеновая сеть. Степень распространяющего действия, получаемая с конкретным &НА8ЕОР или его растворимым доменом гиалуронидазы человека, в конкретном тканевом окружении может быть легко определена, как показано здесь, оценкой действия &НА8ЕОР или
- 82 011654 его домена на диффузию детектируемых тест-молекул разных размеров (таких как меченые флуоросцеином или по-другому меченые гранулы) в тест-ткани, либо с предобработкой, либо без предобработки или с одновременной обработкой κΗΑδΕΟΡ или его доменом в диапазоне периодов времени и концентраций. В качестве иллюстрации, в случае рекомбинантного γΗηΡΗ20, инъецированного подкожно в латеральную кожу мышей, диффузионные тесты с мечеными флуоресцеином гранулами (приведенные в качестве примера здесь) показали, что действия на диффузию были наиболее высокими с частицами с диаметром, меньшим чем приблизительно 500 нм.
Кроме того, авторы считают, что более крупные макромолекулы (примерами которых являются гранулы 500 нм или более крупные) могут быть затруднены в диффузии не только вследствие их большего размера, но вследствие их потенциального взаимодействия с другими относительно более открытыми сетями внутри внеклеточного матрикса, образуемыми из цепей интерстициального коллагена. Кроме того, и в отличие от описанных полученных от животных гиалуронидаз, предпочтительные в настоящее время κΗΑδΕΟΡ данного изобретения не содержат агентов, которые стимулируют экстравазацию, или загрязняющих агентов, таких как коллагеназы (которые могут открывать большие каналы), или других примесей, которые могут провоцировать иммунные реакции. В конкретных применениях, в которых являются желательными более крупные поры или каналы, κΗΑδΕΟΡ или его растворимый домен гиалуронидазы человека могут быть комбинированы с предпочтительно относительно чистыми формами других разрушающих матрикс ферментами, такими как коллагеназы, для облегчения дополнительного распространения макромолекулярных комплексов или клеток большего размера. Для большинства применений, применение агента, который стимулирует проникаемость макромолекул, имеющих размер, меньший чем приблизительно 500 нм, и, более предпочтительно, меньший чем приблизительно 200 нм, является очень выгодным, чтобы этот агент по существу не стимулировал движение клеток в обработанной ткани, но стимулировал прохождение меньших комплексов и агентов.
Как описано и проиллюстрировано здесь, κΗΑδΕΟΡ могут быть использованы для увеличения доставки различных других фармакологических и/или других агентов в ткани в теле человека (в том числе такие ткани, как ткани на задней стороне глаза, которые обычно трудно достичь). Не желая быть связанными теорией, авторы считают, что κΗΑδΕΟΡ может улучшать фармакокинетические и/или фармакодинамические профили ряда таких агентов потенциально увеличением их диффузии или проникновения в ткани и/или усилением их конвективного транспорта посредством увеличения общего потока жидкости в интерстициальном пространстве ткани. Для целей иллюстрации (и без ограничения), примеры фармакологических агентов, которые могут комбинироваться с κΗΑδΕΟΡ этого изобретения (например, комбинироваться совместным приготовлением с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ или совместным введением с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ (которые могут вводиться до, во время или после введения этого агента), для лечения различных состояний, поражающих глаз, включают в себя, например, ингибиторы ангиогенеза (такие как ангиостатины, аг1есог1ауе-ацетаты (например, ΚΕΤΑΑNΕ™), эндостатины, тромбоспондины (например, тромбоспондин-1 и тромбоспондин-2), антиангиогенные антитела и другие антиангиогенные агенты или нацеленные на сосуды агенты (νΤΑ) (например, анти-УЕСЕ-антитела, такие как бевацизумабы (например, ΑνΑ^ΤΙΗ™), карбоксиамидотриазол (ΡΑΙ), Интерлейкин-12 (ΙΕ-12), 0ΡΤΙΡΚΑΖ™ (5-[2-пиразинил]-4-метил-1,2,3-тион), δυ-5416, ΤΧΡ-470, талидомид) и т.п.); действующие против катаракты и действующие против диабетической ретинопатии вещества (такие как ингибиторы альдозоредуктазы (ΑΚΙ), например, толрестаты (например, ΑΡΚΕΌΑδΕ™) и зополрестаты (например, Л^0N^™). мезиноприлы, эналоприлы, статилы и тиол перекрестно-сшитые вещества и т.п.); противовоспалительные агенты (в том числе стероидные и нестероидные противовоспалительные агенты, описанные здесь и в данной области); антиинфекционные агенты (в том числе соединения, описанные ниже, а также ряд их глазных препаратов, таких как ΒΡΕΡΗΑΜΙΌΕ™, СI^0XΑN™, Ρ0ΕΥΤΚΙΜ™, ΟΕΙΧΙΧ™, Τ0ΒΚΑΌΕΧ™, νΙ6ΑΜ0Χ™, ΖΥΜΑΚ™); бета-адреноблокаторы (такие как бетаксололы (например, ΒΕΤ0ΡΤΙΡ δ™), тимололы (например, ΒΕΤΙΜ0Ε™ и ΤΙΜ0ΡΤΙΟ™) и их комбинации (например, тимололы и ингибитор карбонатдегидрогеназы, такой как дорзоламид (например, С0δ0ΡΤ™); ингибиторы карбонатдегидрогеназы (такие как ацетазоламиды, бринзоламиды (например, ΑΖ0ΡΤ™), дихлорфенамиды, дорзоламиды (например, ΤΚυδ0ΡΤ™), и в комбинации с другими агентами, как, например, в С0δ0ΡΤ™), метазоламиды и т.п.); мидриатики (такие как атропинсульфаты, циклопентолаты, гоматропины, скополамины, тропикамиды, эукатропины и гидроксиамфетамины и т. п.); агенты фотодинамической терапии (такие как вертепорфин (например, νΙδυΡΥΧΕ™); аналоги простагландина (такие как биматопросты (например, ΡυΜΜΑ^™), латанопросты (например, ΧΑΡΑΤΑ^™), и травопросты (например, ΤΚΑVΑΤΑN™); симпатомиметики (такие как бримонидины (например, Ρ); а также их комбинации (такие как комбинации бета-адреноблокатора и ингибитора карбонатдегидрогеназы, как в С0δ0ΡΤ™); и многочисленные другие классы агентов, такие как антиинфекционные агенты и различные другие физиологические модуляторы, описанные ниже и в других местах здесь, и/или известные в данной области или заново развиваемые.
Ряд других фармакологических агентов, которые могут комбинироваться с κΗΑδΕΟΡ данного изобретения (например, комбинироваться совместным приготовлением с одним или несколькими κΗΑδΕΟΡ
- 83 011654 или совместным введением с одним или несколькими зНАЗЕСР (которые могут вводиться до, во время или после введения этого агента)), могут быть использованы для лечения различных состояний, поражающих глаз, или поражающих различные другие ткани тела. Для целей иллюстрации (и без ограничения) такие агенты включают в себя, например: анестетики; антиметаболиты, противоопухолевые и другие противораковые агенты; антивирусные агенты; антиинфекционные агенты, в том числе антибактериальные агенты и другие антибиотики, противогрибковые и другие антиинфекционные агенты; иммуномодуляторные агенты; стероидные и нестероидные противовоспалительные агенты; бета-блокаторы; симпатомиметики; дукосаноиды, простагландины и аналоги простагландинов; миотические агенты, холинергические агенты и антихолинэстеразы; противоаллергические агенты и противоотечные средства; гормональные агенты; факторы роста; другие синтетические и биологически полученные агенты; и их комбинации. Некоторые иллюстративные примеры агентов, имеющих такие свойства, которые позволяют им комбинироваться с зНАЗЕСР в композиции новых фармакологических агентов и/или новых композициях существующих фармакологических агентов, включают в себя различные категории вышеописанных и нижеописанных агентов (а также другие известные и новые агенты, которые постоянно идентифицируются, для диагностики, предупреждения или лечения различных заболеваний):
Анестетики, в частности, неингаляционные локальные анестетики (такие как амбукаины; амоксекаины; амилокаины; аптокаины; артикаины; беноксинаты; бензиловые спирты; бензокаины; бетоксикаины; бифенамины; букрикаины; бумекаины; бупивакаины; бутакаины; бутамбены; бутаниликаины; карбизокаины; хлоропрокаины; клибукаины; клодакаины; кокаины; дексивакаины; диамокаины; дибукаины; диклонины; элукаины; этидокаины; эупроцины; фексикаины; фомокаины; гептакаины; гексилкаины; гидроксипрокаины; гидрокситетракаины; изобутамбены; кетокаины; лейцинокаины; лидокаины; мепивакаины; меприлкаины; октокаины; ортокаины; оксетакаины; оксибупрокаины; фенакаины; пинолкаины; пиперокаины; пиридокаины; полидоканолы; прамокаины; прилокаины; прокаины; пропанокаины; пропипокаины; пропоксикаины; проксиметакаины; пиррокаины; кватакаины; хинизокаины; ризокаины; родокаины; ропивакаины; салициловые спирты; суикаины; тетракаины; трапенкаины; тримекаины) и т.п.; а также различные другие неингаляционные анестетики (такие как алфаксалоны; амоланоны; этоксадролы; фентанилы; кетамины; левоксадролы; метитуралы; метогекситалы; мидазоламы; минаксолоны; пропанидиды; пропоксаты; прамоксины; пропофолы; ремифентанилы; суфентанилы; тилетамины; золамин и т.п.);
Антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты (например, деноптерины, эдатрексаты, метотрексаты, пиритрексимы; птероптерины; Томудукс, триметрексаты), аналоги пурина (например, кладрибины; флударабины; 6-меркаптопурины, тиамиприны, тиагуанины), и аналоги пиримидина (например, анцитабины, азацитидины, 6-азауридины, кармофуры, цитарабины, доксифлуридины, эмитефуры, эноцитабины, флоксуридины, фторурацилы, гемцитабины, тегафуры) и т.п.;
Противоопухолевые средства (такие как аклациномицины, актиномицины, адриамицины, анцитабины, антрамицины, азацитидины, азасерины, 6-азауридины, бисантрены, блеомицины, кактиномицины, кармофуры, кармустины, карубицины, карзинофилины, хромомицины, цисплатины, кладрибины, цитарабины, дактиномицины, даунорубицины, деноптерины, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцины, доксифлуридины, доксорубицины, эдатрексаты, эмитефуры, эноцитабины, фепирубицины, флударабины, фторурацилы, гемцитабины, идарубицины, локсуридины, меногарилы, 6-меркаптопурины, метотрексаты, митрамицины, митомицины, микофеноловые кислоты, ногаламицины, оливомицины, пепломицины, пирарубицины, пиритрексимы, пликамицины, порфиромицины, птероптерины, пуромицины, ретиноевые кислоты, стрептонигрины, стрептозоцины, тагафуры, тамоксифены, тиамиприны, тиогуанины, трамцинолоны, триметрексаты, туберцидины, винбластины, винкристины, зиностатины, зорубицины и т. п.) (см., также описанные здесь иллюстративные противораковые агенты);
Антивирусные агенты (такие как абакавиры (например, 21АСЕ№М), ацикловиры (например, ΖΟνίКАХ™), амантадины и римантадины (например, ЗУММЕТКЕЬ™), ампренавиры (например, АСЕ№ ЕКАЗЕ™), цидофовиры (например, VIЗΤI^Ε™). делавирдины (например, КЕЗСКГРТОК™), диданозины (например, УГОЕХ™), эфавиренц (например, ЗИЗТГУА™), фамцикловиры (например, РАМУГК™), фомиверсены (например, VIΤКАVΕNΕ™), фоскарнеты (например, РОЗСАУГК™), ганцикловиры (например, СУТОУЕ№™) и валганцикловиры (например, УАЕСУТЕ™), идоксуридины (например, НЕКРЬЕХ™), индинавиры (например, СКГХГУАМ™), интерфероны (например, АЬРЕКОМ Ν™, ЮТКОМ™ А, РЕСАЗУЗ™, РЕС-ЮТКОМ™, КОРЕКОМ-А™ и комбинации интерферонов и других антивирусных агентов, такие как КОВЕТКОМ™ и РЕСАЗУЗ/СОРЕСИЗ™), ламивудины (например, 3ТС и ЕР1У1К™) и комбинации ламивудинов и зидовудинов (например, СОМВГУГК™), моноклональные антитела, такие как паливизумабы (например, ЗУМАСГЗ™), нелфинавиры (например, УГКАСЕРТ™), невирапины (например, УГКАМИМЕ™), оселтамивиры (ТАМГРЕи™), пенцикловиры (например, ЦЕМАУГК™), плеконарилы, рибавирины (например, СОРЕСИЗ™ и КЕВЕТОЬ™), римантадины (например, Р^υМΛ^INΕ™), ритонавиры (МОКУГК™), саквинавиры (например, ШУЕКАЗЕ™), ставудины (б4Т, например, ΖΕКIΤ™), валацикловиры (например, УАЕТКЕХ™), видарабины (например, УГКА-А™), залцитабины (например, НГУГО™), занамивиры (КЕЬЕ^А™), зидовудины (например, ΛΖΤ, КЕТКОУГК™) и т.п.);
- 84 011654
Антибактериальные агенты и другие антибиотики, включающие в себя, например, аминогликозиды; амфениколы; ансамицины; карбацефемы; карбапенемы; цефалоспорины или цефемы; цефамицины; клавамы; циклические липопептиды; диаминопиримидины; кетолиды; линкосамиды; макролиды; монобактамы; нитрофураны; оксацефемы; оксазолидиноны; пенемы; тиенамицины и разнообразные беталактамы; пенициллины; полипептидные антибиотики; хинолоны; сульфонамиды; сульфоны; тетрациклины и другие антибиотики, иллюстративные члены которых представлены ниже (и другие, известные в данной области или заново разрабатываемые);
Аминогликозиды (например, амикацины, апрамицины, арбекацины, бамбермицины, бутиросины, дибекацины, дигидрострептомицины; фортимицины; гентамицины; изепамицины, канамицины, микрономицины, неомицины, неомицина ундециленаты, нетилмицины, паромомицины, рибостамицины, сисомицины, спектиномицины, стрептомицины, тобрамицины, троспектомицины и т.п.);
Амфениколы (например, азидамфениколы, хлорамфениколы, фторфениколы, тиамфениколы и т. п.);
Ансамицины (например, рифамиды, рифампины или рифампицины (например, ВШАВ^™, ВГ ЕЛЭШ IУ™, а также комбинации, содержащие рифампины, такие как рифампин/изониазид (например, ШРАМАТЕ™) и рифампин/изониазид/пиразинамид (например, ВШАТЕВ™), рифамицины, рифапентины, рифаксимины (например, ХШАХАМ™) и т.п.);
Карбацефемы (например, лоракарбефы, 3-хлор-1-карбацефемы, 3-тиозамещенные карбацефемы, карбацефемы, описанные в опубликованной заявке на патент США № 20050004095, и т.п.);
Карбапенемы (например, биапенемы, имипенемы, меропенемы, панипенемы и т. п.);
Цефалоспорины или цефемы (например, цефаклоры (например, СЕСЬОВ™), цефадроксилы, цефамандолы, цефатризины, цефазедоны, цефазолины (например, АNСΕР™), цефкапен-пивоксилы, цефклидины, цефдиниры, цефдиторены, цефепимы (например, МАХ^МЕ™), цефатаметы, цефиксимы, цефиненоксимы, цефметазолы, цефодизимы, цефонициды, цефоперазоны, цефораниды, цефотаксимы, цефотиамы, цефотетаны, цуфокситины, цефозопраны, цефпимизолы, цефпирамиды, цефпиромы, цефподоксим-проксетилы, цефпрозилы, цефроксадины, цефсулодины, цефтазидимы (например, РОВТА2™), цефтерамы, цефтезолы, цефтибутены, цефтизоксимы, цефтриаксоны (например, ВОСНЕРНШ™), цефуроксимы (например, 2ШАСЕР™), цефузонамы, цефацетрилы, цефалексины, цефалоглицины, цефалоридины, цефалоспорины, цефалотины, цефаприны, цефрадины, пивцефалексины и т.п.);
Цефамицины (например, цефбуперазоны, цефинетазолы, цефининоксы, цефотетаны, цефокситины (например, МЕРОХШ™), и т.п.;
Клавамы (например, клавулиновая кислота или клавуланаты, 2- и 3-фенилклавамы и комбинации, содержащие такие агенты, как амоксициллин/клавуланаты (например, АυСΜΕNТIN™) и тикарциллин/клавуланаты (например, ТIΜΕNТIN™) и т.п.);
Циклические липопептиды (например, даптомицины (например, СЦШСШ™);
Диаминопиримидины, такие как 2,4-диаминопиримидины (например, бродимопримы, тетроксопримы, триметопримы и т. п.);
Кетолиды (например, телитромицины (например, КЕТЕК™) и связанные мостиковой связью бициклические кетолиды (например, Епап!а ЕР-013420 и 6-11 бициклические кетолиды, описанные в Опубликованной заявке на патент США 20040157787) и т.п.);
Линкосамиды (например, клиндамицины, линкомицины и т.п.);
Макролиды (например, азитромицины (например, ΖIТНВОΜАX™), карбомицины, кларитромицины, диритромицины, эритромицины, эритромицина ацистраты, эстолаты эритромицина, глюкогептонаты эритромицина, лактобионаты эритромицина, пропионаты эритромицина, стеараты эритромицина, жозамицины, лейкомицины, мидекамицины, миокамицины, олеандомицины, примицины, рокитамицины, розарамицины, рокситромицины, спирамицины, тролеандомицины и т.п.);
Монобактамы (например, азтреонамы (например, ЛΖЛСТЛΜ™). карумонамы, тигемонамы и т.п.);
Нитрофураны (например, фуралтадоны,- хлориды фуразолия, нифурадены, нифурателы, нифурфолины, нифурпиринолы, нифурпразины, нифуртоинолы, нитрофуирантоины и т.п.);
Оксацефемы (например, фломоксефы, латамоксефы или моксалактамы (например, МОХАМ™) и т.п.);
Оксазолидиноны (например, линезолиды (например, ΖΥУОX™), эперезолиды и т.п.);
Пенемы, тиенамицины и разнообразные бета-лактамы (например, эртапенемы (например, ШУА№™), имипенемы (например, с Циластатином, как в РШМАХШ™), меропенемы (например, МЕВВЕМ™) и т.п.);
Пенициллины (например, амидиноциллины, амидиноциллин-пивоксилы, амоксициллины, ампициллины (в том числе их комбинации (например, с сублактамами, как в υNА8ΥN™)), апалциллины, аспоксициллины, азидоциллины, азлоциллины, бакампициллины, бензилпенициллиновые кислоты, бензилпенициллин-натрий, карбенициллины, кариндациллины, клометоциллины, клоксациллины, коамоксиклавы, циклациллины, диклоксациллины, эпициллины, фенбенициллины, флоксациллины, хетациллины, ленампициллины, метампициллины, метициллин-натрий, мезлоциллины, нафциллины, оксациллины,
- 85 011654 пенамециллины, пенетамата гидроиодиды, пенициллин С-бенетамины, пенициллин С-бензатины (например, ВЮЬЫК™ Ь-А), пенициллин С-бензгидриламины, пенициллин С-кальций, пенициллин Сгидрабамины, пенициллин С-калий, пенициллин С-прокаины, пенициллин Ν, пенициллин О, пенициллин У, пенициллин У-бензатины, пенициллин У-гидрабамины, пенимепициклины, фенетициллин-калий, пиперциллины (в том числе их комбинации (например, с ингибиторами бета-лактамазы, такими как тазобактам, как в ΖО8УN™)), пивампициллины, пропициллины, хинациллины, сульбенициллины, султамициллины, талампициллины, тазоциллины, темоциллины, тикарциллины (например, с клавуланатами, как в ТПИЕОТШ™) и т.п.);
Полипептиды-антибиотики (например, амфомицины, бацитрацины, капреомицины, колистиметаты (например, СО^I-ΜΥСIN™ М), колистины, эндурацидины, энвиомицины, фузафунгины, грамицидины, микамицины, полимиксины, пристинамицины (и производные пристинамицина, такие как хинупристины и далфопристины (например, 8УNЕКСI^™), ристоцетины, тейкопланины, тиострептоны, туберактиномицины, тироцидины, тиротрицины, ванкомицины, виомицины, виргиниамицины, цинк-бацитрацины и т.п.);
Хинолоны (в том числе фторхинолоны и аналоги) (например, мезилаты алатрофлоксина, циноксацины, ципрофлоксацины (например, С1РКО™), клинафлоксацины, дифлоксацины, эноксацины, флероксацины, флумехины, гатифлоксацины (например, ТЕриШ™), грепафлоксацины, левофлоксацины (например, ЬЕУАрИШ™), ломефлоксацины, милоксацины, моксифлоксацины (например, АУЕЬОХ™), надифлоксацины, налидиксиновые кислоты, норфлоксацины, офлоксацины, оксолиновые кислоты, пазуфлоксацины, пефлоксацины, пипемидиновые кислоты, пиромидиновые кислоты, розоксацины, руфлоксацины, спарфлоксацины, темафлоксацины, тозуфлоксацины, мезилаты тровафлоксацина и т.п.);
Сульфонамиды (например, ацетилсульфаметоксипиразины, бензилсульфамиды, хлорамин-В, хлорамин-Т, дихлорамин-Т, формилсульфизомидины, бета-глюкозилсульфаниламиды, мафениды, 4'(метилсульфамоил)сульфаниланилиды, ноприлсульфамиды, фталилсульфацетамиды, фталилсульфатиазолы, салазосульфамидины, сукцинилсульфатиазолы, сульфабензамиды, сульфацетамиды, сульфахлорпиридазины, сульфахризоидины, сульфацитины, сулфадиазины, сульфадикрамиды, сульфадиметоксины, сульфадоксины, сульфаэтидолы, сульфагуанидины, сульфагуанолы, сульфалены, сульфалоксиновые кислоты, сульфамеразины, сульфаметеры, сульфаметазины, сульфаметизолы, сульфаметомидины, сульфаметоксазолы, сульфаметоксипиридазины, сульфаметролы, сульфамидохризоидины, сульфамоксолы, сульфаниламиды, 4-сульфаниламидосалициловые кислоты, сульфанилилсульфаниламиды, сульфанилмочевины, н-сульфанилил-3,4-ксиламиды, сульфанитраны, сульфаперины, сульфафеназолы, сульфапроксилины, сульфапиразины, сульфапиридины, сульфасомизолы, сульфасимазины, сульфатиазолы, сульфатиомочевины, сульфатоламиды, сульфизомидины, сульфизоксазолы и т.п.);
Сульфоны (например, ацедапсоны, ацедиасульфоны, ацетосульфон-натрий, дапсоны, диатимосульфоны, глюкосульфон-натрий, соласульфоны, сублактамы, сукцисульфоны, сульфаниловые кислоты, псульфанилилбензиламины, сульфоксон-натрий, тиазосульфоны и т.п.);
Тетрациклины (например, апициклины, хлортетрациклины, кломоциклины, демеклоциклины, доксициклины, гуамециклины, лимециклины, меклоциклины, метациклины, миноциклины, окситетрациклины, пенимепициклины, пипациклины, ролитетрациклины, санциклины, тетрациклин) и другие (например, циклосерины, мупироцины, туберины и т.п.);
и другие антибиотики (такие как клофоктолы, фусидовые кислоты, гекседины, метенамины (в том числе, например, метенамин, ангидрометилен-цитраты метенамина, гиппураты метенамина, манделаты метенамина, сульфосалицилаты метенамина), нитрофурантоины (например, ΕυКΆ^АNТIN™), нитроксолины, ритипенемы, тауролидины, ксибомолы и т.п.);
Противогрибковые агенты, в том числе полиены, такие как амфотерицины В (например, АВЕЬСЕТ™ и АМВ18ОМЕ™), кандицидины, дермостатины, филипины, фунгихромины, хахимицины, хамицины, луценсомицины, мепатрицины, натамицины (например, Nаΐасуη), нистатины, пецилоцины, перимицины, и другие (например, азасерины, гризеофульвины, олигомицины, неомицина ундециленаты, пирролнитрины, сикканины, туберцидины, виридины); а также синтетические противогрибковые агенты, такие как аллиламины (например, бутенафины, нафтифины, тербинафины); имидазолы (например, бифоназолы, бутоконазолы, хлордантоины, хлормидазолы, клоконазолы, клотримазолы, эконазолы, энилконазолы, фентиконазолы, флутримазолы, изоконазолы, итраконазол, кетоконазолы, ланоконазолы, миконазолы, омоконазолы, оксиконазола нитраты, сертаконазолы, сульконазолы, тиоконазолы, вориконазолы (например, Υ^εΝΩ7™)); тиокарбаматы (например, толциклаты, толиндаты, толнафтаты); триазолы (например, флуканазолы (например, ^IΕ^υСАN™), итраконазолы (например, 8ΡОКАNОX™), саперконазолы, терконазолы); и другие синтетические вещества (например, акризорцины, аморолфины, бифенамины, бромсалицилхлоранилиды, буклосамиды, пропионаты кальция, хлорфенезины, циклопироксы, клоксихины, копарафинаты, диамтазола дигидрохлориды, эксаламиды, флуцитозины, халетазолы, гексетидины, липопептиды, такие как эхинокандин (как в каспофунгине САNСI^А8™), лофлукарбаны, нифурателы, иодиды калия, пропионовые кислоты, пиритионы, салициланилиды, пропионаты натрия, сулбентины, тенонитрозолы, триацетины, ужотионы, ундециленовые кислоты, пропионат цинка) и т.п.);
- 86 011654
Амебоцидные и антипротозойные средства (в том числе, например, атовахон, хлорохина гидрохлорид, хлорохина фосфат, метронидазол, метронидазола гидрохлорид, пентамина изетионат и т.п.); противогельминтные (противоглистные) и противопаразитарные средства (в том числе, например, мебендазол, пирантела памоат, тиабендазол и т.п.); противомалярийные средства (в том числе, например, хлорохина гидрохлорид, хлорохина фосфат, доксициклин, гидроксихлорохина сульфат, мефлохина гидрохлорид, примахина фосфат, пириметамин, пириметамин с сульфадоксином; противотуберкулезные и противолепрозные средства (в том числе, например, клофазимин, циклосерин, дапсон, этамбутола гидрохлорид, изониазид, пиразинамид, рифабутин, рифампин, рифапентин, стрептомицина сульфат и т.п., а также их комбинации, такие как рифампин/изониазид (например, В1РАМАТЕ™) и рифампин/изониазид/пиразинамид (например, В1РАТЕВ™).
Для целей дополнительной иллюстрации (и без ограничения) примеры иммуномодуляторных агентов, которые могут комбинироваться с кНАЗЕОР данного изобретения (например, комбинироваться совместным приготовлением с одним или несколькими кНАЗЕОР или совместным введением с одним или несколькими кНАЗЕОР (которые могут вводиться до, во время или после введения этого агента), включают в себя, например, члены следующих классов агентов:
Иммуносупрессанты (в том числе, например, азатиоприн, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб, иммуноглобулин лимфоцитов, муромонаб-СО3, микофенолат-мофетил, гидрохлорид микофенолатамофетила, сиролимус, такролимус и т.п.);
Вакцины и токсоиды (в том числе, например, ВСО-вакцина, противохолерная вакцина, вакцина на основе дифтерийного и столбнячного токсоидов (адсорбированная), вакцина на основе дифтерийного и столбнячного токсоидов и бесклеточного РейиккЦ, адсорбированная, вакцина на основе дифтерийного и столбнячного токсоидов и целых клеток Рейикак, конъюгатные вакцины на основе капсульного полисахарида Ь НаеторНПшк, вакцина на основе вируса гепатита А (инактивированная), рекомбинантная вакцина против гепатита В, противогриппозные вакцины (на основе очищенных антигенов поверхности клеток), противогриппозные вакцины (на основе субвирионов или очищенных субварионов), вакцина вируса Японского энфефалита (инактивированная), вакцина против болезни Лайма (рекомбинантный ОкрА), вакцина против вируса кори, эпидемического паротита и краснухи (живая), вакцина против вируса кори, эпидемического паротита и краснухи (живая аттенуированная) противокоревая вакцмна (живая аттенуированная), менингококковая полисахаридная вакцина, вакцина против вируса эпидемического паротита (живая), противчумная вакцина, пневмококковая вакцина (поливалентная), полиомиелитная вакцина (живая, пероральная, трехвалентная), антирабическая вакцина (адсорбированная), антирабическая вакцина (диплоидных клеток человека), вакцина вируса коревой краснухи и свинки (живая), вакцина вируса коревой краснухи (живая, аттенуированная), вакцина столбнячного токсоида (жидкая), брюшнотифозная вакцина (пероральная), брюшнотифозная вакцина (парентеральная), полисахаридная брюшнотифозная вакцина (VI), вакцина вируса ветряной оспы, вакцина против желтой лихорадки и т.п.);
Антитоксины и антивенины (в том числе, например, антивенин паука «черной вдовы» и других пауков, антивенин Сго!айбае (поливалентный), дифтерийный антитоксин (лошадиный), антивенин М1сгигик ГиМик и т.п.);
Иммунные сыворотки (в том числе, например, иммуноглобулин цитомегаловируса (внутривенный), иммуноглобулин гепатита В (человек), иммуноглобулин внутримышечный, иммуноглобулин внутривенный, иммуноглобулин бешенства (человек), внутривенный иммуноглобулин респираторного синтициального вируса (человек), иммуноглобулины (человек), иммуноглобулин столбняка (человек) иммуноглобулин ветряной оспы и т.п.);
Другие иммуномодуляторы (в том числе, например, альдеслейкин, эпоэтин альфа, филграстим, глатирамера ацетат для инъекции, интерферон альфа соп-1, интерферон альфа-1а (рекомбинантный), интерферон альфа-2Ь (рекомбинантный), интерферон альфа-п3, интерферон бета-1а, интерферон бета-1Ь (рекомбинантный), интерферон гамма-1Ь, гидрохлорид левамизола, опрелвекин, сарграмостим и т. п.).
Другие агенты, которые могут комбинироваться с кНАЗЕОР данного изобретения (например, комбинироваться совместным приготовлением с одним или несколькими кНАЗЕОР или совместным введением с одним или несколькими кНАЗЕОР (которые могут вводиться до, во время или после введения этого агента), включают в себя, например, следующие агенты:
Стероидные противовоспалительные агенты (такие как алклометазоны, алгестоны, беклометазоны, бетаметазоны, будесониды, клобетазолы, клобетазоны, клокортолоны, клопреднолы, кортикостероны, кортизоны и гидрокортизоны (например, гидрокортизона ацетат), кортивазолы, дефлазакорты, десониды, дезоксиметазоны, дексаметазоны (например, дексаметазон-21-фосфат), дифлуорозоны, дифлукортолоны, дифлупреднаты, эноксолоны, флуазакорты, флуклорониды, флуметазоны, флунисолиды, флуоцинолоны, флуоцинониды, флуокортины, флуокортолоны, флуорометалоны, флуперолоны, флупреднидены, флупреднизолоны, флурандренолиды, флутикасоны, формокорталы, галцинониды, галобетазолы, галометазоны, галопредоны, гидрокортаматы, гидрокортизоны, лотепреднола этабонаты, мазипредоны, медризоны, мепреднизоны, метилпреднизолоны, мометазона фуроат, параметазоны, предникарбаты, преднизолоны (например, преднизолон-25-диэтиламиноацетат, преднизолон-натрия фосфат), преднизоны, пред
- 87 011654 нивалы, преднилидены, римексолоны, тиксокортолы, триамцинолоны (например, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексацетонид) и т.п.);
Нестероидные противовоспалительные агенты (такие как кромогликаты, диклофенаки, флурбипрофены, индометацины, ибупрофены, кеторолаки (например, кетеролак-трометамин), лодоксамиды, недокромилы, пироксикамы, салицилаты и т.п.);
Бета-блокаторы (такие как бетаксололы (например, бетаксолола гидрохлорид), картеололы, эсмололы, левобундололы, метипраналолы, тимололы (например, тимолола полугидрат и различные формы тимолола малеата) и т.п.);
Симпатомиметики (такие как адреналин, бримонидины, дипивефрины, эпинефрины и т.п.);
Дукасаноиды, простагландины и аналоги простагландинов (такие как биматопросты, латанопросты, травопросты, унопростоны и т.п.), а также антипростагландины и предшественники простагландинов;
Мостические средства, холинергические агенты и антихолинэстеразы (такие как ацетихолинхлориды, карбахолы, демекария бромиды, диизолропилфторфосфаты, эсерины, физостигмины, пилокарпины, фосфолин-иод, салицилаты и т.п.);
Антиаллергические агенты (такие как антазолин-натрий, цетиризины, хлорфенирамины, кромогликаты, кромолин-натрий (Кролом), эмедастина дифумарат, кетотифины (например, кетотифена фумарат), левокарбастины, метапирилины, недокромил-натрий, олопатадины, пириламины, профенпиридамины и т.п.);
Противоотечные средства (такие как фенилэфрины, нафазолины, тетрагидрозолины и т.п.);
Гормональные агенты (такие как эстрогены, эстрадиолы, прогестероноподобные вещества, благоприятствующие беременности, прогестероны, инсулины, кальцитонины, паратиреоидный гормон и пептид и высвобождающий вазопрессин фактор гипоталамуса и т.п.);
Факторы роста (такие как эпидермальный фактор роста, фибробластный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста бета, соматотропин и фибронектин и т.п.);
Аналгезирующие средства (такие как ацетаминофен; альфентанил; аминобензоат; анидоксим; анилеридин; анилопам; аниролак; антипирин; аспирин; беноксапрофен; бензидамин; бецифадина гидрохлорид; брифентанил; бромадолин; бромфенак; бупренорфин; бутацетин; бутиксират; буторфанол; карбамазепин; карбаспирин-кальций; карбифен; карфентанил; ципрефадола сукцинат; цирамадол; клониксерил, клониксин; кодеин; кодеина фосфат; кодеина сульфат; конорфон; циклазоцин; дексоксадрол; декспемедолак; дезоцин; дифлунизал; дигидрокодеин; димефадан; дипирон; докспикомин; дриниден; энадолин; эпиризол; эрготамина тартрат; этоксазен; этофенамат; эугенол; фенопрофен; фенопрофен-кальций; фентанилцитрат; флоктафенин; флуфенисал; флуниксин; флуниксин-меглумин; флупиртин; флупроквазон; флурадолин; флубипрофен; гидроморфон; ибуфенак; индопрофен; кетазоцин; кеторфанол; кеторолак; летимид; левометадилацетат; левометадила ацетата гидрохлорид; левонантрадол; леворфанол; лофемизол; лофетанила оксалат; лорцинадол; ломоксикарн; магния салицилат; мефенамовая кислота; менабитан; меперидин; мептазинол; метадон; метадила ацетат; метофолин; метотримепразин; меткефамида ацетат; мимбан; мирфентанил; молиназон; морфина сульфат; моксазоцин; набитан; налбуфин; налмексон; намоксират; нантрадол; напроксен; напроксол; нефопам; нексеридин; норациметадол; окфентанил; октазамид; олванил; оксеторон; оксикодон; оксикодона терефталат; оксиморфон; пемедолак; пентаморфон; пентазоцин; феназопиридин; фенирамидол; пиценадол; пинадолин; пирфенидон; пироксикам-оламин; правадолин; продилидин; профадол; пропирам; пропоксифен; пропоксифена напсилат; проксазол; проксорфан; пирролифен; ремифентанил; салколекс; салетамида малеат; салициламид; салицилат-меглумин; салсалат; салицилат; спирадолин; суфентанил; сукапсаицин; талметацин; талнифлумат; талосалат; тазадолен; тебуфелон; тетридамин; тифурак; тилидин; тиопинак; тоназоцин; трамадол; трефентанил; троламин; верадолин; верилопам; волазоцин; ксорфанол; ксилазин; мезилат зеназоцина; зомепирак; и т.п.);
Другие макромолекулярные фармакологические агенты, такие как белки, нуклеиновые кислоты и т.п.; а также комплексы макромолекул, таких как различные среды (наполнители) доставки лекарственных средств, доставки белков и/или доставки генов (в том числе синтетически полученные наполнители, такие как липосомы и т. п., а также биологически генерируемые носители, такие как вирусные векторы и т.п.); и
Другие агенты, используемые для различных состояний (и дополнительная информация, касающаяся применения, доз, противопоказаний и т. д. различных агентов, в том числе идентифицированных здесь), известные в данной области, в том числе, например, дополнительные агенты, идентифицированные в таких ссылках, как Рйуз1с1аиз' Эезк ПеРетеисе (РОК) (Ткотзом 2003, 2004, 2005); ТНе Атепсаи Со11еде ок РНуз1с1а1гз Сотр1е!е Ноте Меб1са1 Сшбе (ΌΚ РиЫ|з11тд 2003); и дополнительные агенты, идентифицированные в патентных ссылках, в том числе, например, Опубликованных заявках США 20040224023, 20040224012 и 20050002865 (списки агентов которых включены тем самым в качестве ссылки здесь).
Комбинации агентов (например, двух или нескольких агентов, выбранных из одного или нескольких предыдущих групп агентов и/или из других групп или классов агентов фармакологических и других агентов, указанных здесь или известных в этой области).
Применение зНА8ЕСР для уменьшения внутриглазного давления и других глазных показаний.
- 88 011654
Обычным побочным эффектом, встречающимся у послеоперационных пациентов с катарактой, является очень раннее и иногда продолжительное повышение внутриглазного давления. Такое состояние иногда является серьезным, особенно у пациентов с глаукоматозными изменениями диска зрительного нерва. Хотя это повышение давления имеет тенденцию быть более тяжелым при инъекции вязкоупругих агентов, таких как гиалуроновая кислота, в глаз во время хирургии, внутриглазное давление может становиться повышенным послеоперационно, даже в том случае, когда такие агенты не используются. Кроме того, такое увеличение давления может встречаться даже в том случае, когда во время хирургической процедуры не использовали никаких дополнительных лекарственных средств. В некоторых случаях, полезно оставлять вязкоупругий агент в глазу, что часто делает необходимым давать пациентам большие дозы ингибиторов карбонатдегидрогеназы. Эти ингибиторы понижают внутриглазное давление уменьшением образования внутриглазной жидкости, жидкости, которая в норме секретируется в глаз, ресничным (цилиарным) телом. Существующие способы уменьшения послеоперационных увеличений давления в глазу включают в себя различные типы глазных капель, таких как бета-адреноблокаторы, симпатомиметические агенты, миотики, альфа ΙΙ-селективные агенты, ингибиторы карбонатдегидрогеназы и простагландиновые агенты.
Предпочтительным способом удаления вязкоупругого вещества, такого как гиалуроновая кислота, является инъекция зНА8ЕСР во время или сразу же после хирургических процедур в переднем сегменте или заднем сегменте, хотя возможны также другие способы введения, известные в данной области. Предпочтительным является введение гиалуроновой кислоты и зНА8ЕСР инъекцией в переднюю камеру во время глазных хирургических процедур переднего сегмента, чтобы позволить гиалуроновой кислоте действовать в качестве «спейсера» (прокладки) во время начала хирургической процедуры. В некоторых случаях трансплантации роговицы комбинация гиалуроновой кислоты и зНА8ЕСР может быть помещена на поверхности внутриглазных структур перед пришиванием корнеального трансплантата на место. Эта комбинация может быть также использована в хирургии заднего сегмента, например, при операции сетчатки или стекловидного тела.
В некоторых случаях может быть рекомендовано оставление вязкоупругого агента, такого как Неа1оп™, У1зсоа!™ или других занимающих пространство веществ в передней камере глаза при завершении операции. Это особенно рекомендуется в повышении положительного давления, когда внутриглазное содержимое стремится выйти вперед и прижаться к задней поверхности роговицы. Если это происходит в глазу с синтетическим внутриглазным хрусталиком, находящимся на месте, давление на роговичном эндотелии может вызвать существенное повреждение этих клеток, и может иметь место последующее опухание и помутнение роговицы, которые ассоциированы с уменьшенным зрением. Обычно, если внутриглазное давление пациента значительно повышается при завершении хирургической процедуры, необходимо ввести такому пациенту большие дозы ингибиторов карбонатдегидрогеназы, а также топические глазные капли, такие как бета-блокаторы и агонисты альфа ΙΙ, для уменьшения образования внутриглазной жидкости и/или увеличения вытекания внутриглазной жидкости. Эти агенты, все, имеют существенные побочные действия и, в некоторых случаях, противопоказаны в пациентах с различными типами медицинских состояний, такими как проблемы дыхания, сердечное заболевание или высокое кровяное давление. Однако применение зНА8ЕСР в этих ситуациях будет устранять необходимость предоставления этим пациентам высоких доз таких лекарственных средств.
Кроме того, значительное количество гиалуроновой кислоты находится в трабекулярной сети. зНА8ЕСР будет разрушать гиалуроновую кислоту и, следовательно, улучшать вытекание этой жидкости через трабекулярную сеть. Следовательно, внутриглазное давление пациента будет уменьшаться. Комбинация зНА8ЕСР с другими агентами передней камеры, такими как метилцеллюлоза (Осисоа!™, например, коммерчески доступный из 8Югх [пз1гитеп1 Со.), используемых в качестве «спейсеров» (прокладок) и/или защитных агентов в хирургии катаракты, будут также эффективными в предотвращении существенных увеличений давления, так как она будет эффективно открывать трабекулярную сеть и делать возможным больший дренаж внутриглазной жидкости разрушением значительного количества гиалуроновой кислоты, присутствующей в трабекулярной сети.
Удаление гликозаминогликанов из трабекулярной сети полезно также для уменьшения внутриглазного давления у индивидуумов, страдающих от открытоугольной глаукомы. зНА8ЕСР человека может быть введен субконъюнктивальной инъекцией или инъекцией непосредственно в переднюю камеру. Поскольку зНА8ЕСР действует ферментативно, даже относительно ограниченные количества зНА8ЕСР могут эффективно действовать в качестве вязкоупругого антидота или в отношении других ситуаций, которые облегчаются или улучшаются применением гликозаминогликаназы. Как и в других применениях, количество единиц гиалуронидазной активности, обеспечиваемой зНА8ЕСР, для оптимального применения будут зависеть частично от конкретной ситуации, подлежащей лечению, в частности, от желаемого количества расщепления гликозаминогликанов, но может быть легко определено с использованием подходящих моделей и затем оптимизацией должным образом для конкретных применений. В качестве иллюстрации, на количество единиц зНА8ЕСР, применяемого в качестве антидота, будет влиять, т!ег а11а, конкретная используемая процедура и количество применяемого вязкоупругого агента, а также от
- 89 011654 того, должен ли этот вязкоупругий агент удаляться с использованием других процедур, таких как ирригация и аспирация. При использовании хНАБЕСР после ирригации и аспирации могут быть обычно использованы количества в диапазоне 10-12000 единиц, обычно 100-5000 единиц, более часто 5002000 единиц, хотя это опять будет зависеть от конкретного применения. При использовании хНАБЕСР для устранения необходимости ирригации и аспирации, будут использоваться более высокие количества для эффективного расщепления большего объема применяемого вязкоупругого агента, причем обычно могут использоваться количества в диапазоне 50-20000 единиц, обычно 400-10000, более часто 15005000 единиц, хотя это опять будет зависеть от конкретного применения.
В случае использования хНАБЕСР для уменьшения внутриглазного давления, ассоциированного с глаукомой, применение хНАБЕСР может быть также использовано в качестве первичного лечения для уменьшения 10Р (ВГ Д), ассоциированного с глаукомой, и посредством этого для потенциального устранения необходимости хирургических процедур, таких как глаукомная фильтрация, глаукомные дренажные имплантаты (трубчатые шунты), лазерная трабекулопластика (лазерная фотокоагуляция трабекулярной сети глаза), циклофотокоагуляция или иридотомия. Таким образом, хНАБЕСР этого изобретения может вводиться, например, инъекцией в переднюю камеру глаза для обеспечения минимально инвазивного способа для уменьшения внутриглазного давления, ассоциированного с глаукомой. Не желая быть связанными теорией, авторы считают, что введение хНАБЕСР в таких условиях может усиливать вытекание жидкости через трабекулярную сеть и, следовательно, понижать 10Р (ВГД) уменьшением гидростатического и/или онкотического давления в передней камере.
В случае использования хНАБЕСР для растворения агрегатов или «блуждающих скоплений», которые являются обычно макроскопическими непрозрачными агрегатами волокон стекловидного тела, введение хНАБЕСР в стекловидное тело может быть использовано для стимуляции дезагрегации.
Подобным образом, описанные здесь хНАБЕСР могут быть применены к стекловидному телу для стимуляции разрушения кровоизлияний стекловидного тела (т.е. экстравазации крови в стекловидное тело), которые могут иметь место в связи с такими состояниями, как диабетическая ретинопатия, ретинальное новообразование кровеносных сосудов, окклюзия ретинальной вены, отслойка задней части стекловидного тела, разрывы сетчатки, глазные травмы и т. п. Присутствие кровоизлияний стекловидного тела, которые обычно медленно рассасываются, может задержать, осложнить или предотвратить процедуры, которые требуют визуализации сетчатки через стекловидное тело для диагностики и/или процедур лечения, такие как лазерная фотокоагуляция и т.п., которые являются часто первичными обработками для таких состояний, как пролиферативная диабетическая ретинопатия. Применение хНАБЕСР для стимуляции рассасывания таких кровоизлияний стекловидного тела может быть, следовательно, использовано для облегчения диагностики состояний сетчатки и/или устранения необходимости более радикальных процедур, таких как витрэктомия.
В случае использования хНАБЕСР для стимуляции витреоретинального отделения в лечении таких состояний, как диабетическая ретинопатия, введение хНАБЕСР в стекловидное тело может быть использовано для стимуляции разделения или разобщения стекловидного тела и сетчатки. В этом отношении, хНАБЕСР может не только стимулировать это разделение, но и способствовать тому, что это происходит таким образом, что уменьшается потенциал деформации или разрывания сетчатки.
хНАБЕСР этого изобретения могут быть также использованы для лечения помутнений роговицы. В этом отношении, различные искажения или деформации могут влиять на нормально организованную структуру роговицы и приводить к прерываниям в прохождении света через роговицу и сопутствующим ухудшениям зрения. Таким образом, ряд состояний и причин приводят к деформациям роговицы, которые могут быть в виде рубцов, затемнения или помутнения. В применении хНАБЕСР для улучшения или лечения таких состояний роговицы, хНАБЕСР (в фармацевтически приемлемом растворе, который может содержать один или несколько дополнительных фармакологических агентов) может вводиться в роговицу любым из нескольких способов введения, в зависимости частично от степени и местоположения повреждения роговицы. В качестве иллюстрации, хНАБЕСР могут вводиться на наружной поверхности глаза (с использованием, например, капель или другого топического нанесения), потенциально в инкапсулированном в носителях виде, таком как липосомы и т.п., которые могут быть использованы для облегчения переноса через роговичный эпителий, инъекцией или микроинъекцией непосредственно на или в роговицу или другими доступами к роговичной ткани. Кроме биохимических или механических способов для стимуляции доставки, могут быть также использованы другие способы для усиления проникновения, такие как ионофорез.
хНАБЕСР данного изобретения могут быть также использованы, например, для увеличения проникаемости агентов, используемых в фотодинамической терапии (РОТ, ФДТ). РОТ является способом лечения хороидальных неоваскулярных мембран (СКУМ), которые обычно являются подтекающими сосудистыми структурами под сетчаткой в «мокрой форме» связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (АМО). В РОТ фоточувствительный краситель, такой как ν^υΩΥΝΗ™ (вертепорфин), обычно вводят внутривенно (IV) и дают ему перфузировать СКУМ, а также остальную часть тела. Затем офтальмолог обрабатывает СКУМ красным лазером конкретной длины волны (например, 689 нм) в течение приблизи- 90 011654 тельно 90 с. Этот нетепловой лазерный свет активирует краситель (такой как VIЗυ^ΥNЕ™), продуцируя активную форму кислорода, который как коагулирует, так и уменьшает рост отклоняющихся от нормы кровеносных сосудов, что, в свою очередь, ингибирует просачивание жидкости из СКУМ. кНАЗЕСР этого изобретения могут быть использованы, например, для стимуляции более локализованного введения красителя (такого как VIЗυ^ΥNЕ™) непосредственно в глаз; и/или для облегчения доставки других агентов, которые обычно вводят в глаз в связи с такими процедурами, как РОТ.
Ганглионарная киста.
Ганглионарная киста (также известная как киста запястья, киста В1Ь1е или киста дорсального сухожилия) является наиболее обычной массой мягкой ткани руки. Она представляет собой заполненный мешок, который может ощущаться под кожей. Она обычно прикреплена к влагалищу сухожилия (выстилке, которая смазывает сухожилие) в руке или кисти руки или соединена с лежащим ниже суставом; однако, некоторые из них не имеют видимой связи с какой-либо структурой. Они могут встречаться также в стопах. Эта киста часто встречается, когда имеется разрыв в связках, лежащих над выстилкой сухожилий или суставов, и эта выстилка выпячивается из дефекта связки, образуя шишку под кожей. Поскольку часто имеется асоциированное с этой кистой воспаление, воспаленная ткань образует желеподобную жидкость, которая заполняет этот выступающий мешок. Они могут быть твердыми, как камень, вследствие высокого давления слизеподобной жидкости, содержащейся в кисте, и часто их принимают за костный выступ.
кНАЗЕСР могут быть использованы для облегчения симптомов ганглионарных кист. Инъекция кНАЗЕСР внутрь повреждения в дозе 5-1000 Единиц с последующей аспирацией тонкой иглой будет удалять эту кисту без необходимости хирургического вмешательства. Вместе с кНАЗЕСР могут быть необязательно инъецированы кортикостероиды. Для некоторых пациентов может быть необходимой дополнительная инъекция.
Микседема.
Инфильтрация гликозаминогликанами (САС) кожи является признаком гипертиреоза, претибиальной микседемы (ограниченной микседемы кожи), склеромикседемы и склередемы (отечной склеродермии). Гиалуроновая кислота является основным САС во всех состояниях и в нормальной коже. Имеется минимальная гистологическая вариабельность дермального распределения САС. Приобретенный муциноз кожи обнаруживает сходное распределение САС кожи и сходный биохимический состав. Морфологические различия в фибробластной активности предполагают, что муцинозы склередемы и склеромикседемы представляют собой локальный процесс, в то время как инфильтрация САС заболеваний щитовидной железы может иметь системное происхождение. Эти нарушения могут быть ослаблены кНАЗЕСР как из локального, так и из системного пути введения. Для продолжительной терапии может предполагаться применение ПЭГилированного кНАЗЕСР.
Легочные применения кНАЗЕСР.
Уровни гиалуронана в бронхоальвеолярных лаважах (ВАЕ) из здоровых индивидуумов обычно равны 15 нг/мл. Однако уровни ВАЕ разительно увеличиваются в состояниях респираторного дистресссиндрома (В_)егтег Вг Меб 1 (С1т Кек Еб) 1987 0с! 3; 296(6602):803-6). В АКЭЗ, например, уровни гиалуронана могут увеличиваться до 500 нг/мл, тогда как в «легких фермера» (экзогенном аллергическом альвеолите) уровни ВАЬ могут превышать 1000 нг/мл (НаИдгеи с! а1., Ат Ксу Искри Э|к. 1989 Маг; 139(3):682-7), (Επη^οη с! а1., СНек!. 1992 1нп;101(1): 109-14). Увеличенный гиалуронан в легком может предотвращать диффузию кислорода и газообмен, а также активацию реакций нейтрофилов и макрофагов.
Бычьи препараты гиалуронидазы не являются предпочтительными для лечения таких состояний по ряду причин. Во-первых, известно, что препараты гиалуронидазы из полученных со скотобойни яичек загрязнены сериновыми протеазами, такими как акрозин. Во-вторых, чужеродная природа бычьих ферментов увеличивает вероятность анафилактической реакции, которая может привести к смерти пациента. Таким образом, высокоочищенный препарат рекомбинантного кНАЗЕСР человека может доставляться либо легочной, либо внутривенной доставкой. кНАЗЕСР человека может также вводиться пациентам, страдающим от других легочных осложнений, которые ассоциированы с повышенными гликозаминогликанами, или для увеличения доставки других совместно доставляемых молекул в легкое.
Это изобретение будет теперь описано более подробно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Пример 1.
Анализы гиалуронидазы на основе микротитрации.
Следующий пример обеспечивает быстрый анализ для измерения гиалуронидазной активности кНАЗЕСР. Этот анализ может быть связан с ТКИ, ТИ или №и с использованием стандартного препарата №.Н.О. (ВОЗ) гиалуронидазы.
Микротитрационный анализ биотинилированного гиалуронана.
Свободные карбоксильные группы на остатках глюкуроновой кислоты гиалуронана биотинилируют в одностадийной реакции с использованием биотингидразида (Р1егсе), сульфо-ЫНЗ (Р1егсе) и 1
- 91 011654 этилдиметиламинопропилкарбодиимида (81дта). Этот биотинилированный НА-субстрат (гиалуронан) ковалентно связывают с 96-луночным микротитрационным планшетом во второй реакции. При завершении этой ферментативной реакции остаточный субстрат детектируют с использованием авидинпероксидазной реакции, которая может быть считана в стандартном планшет-ридере ЕЬ18А. Поскольку субстрат ковалентно связан с микротитрационным планшетом, артефакты, такие как рН-зависимое смещение биотинилированного субстрата, не имеют места. Чувствительность делает возможным быстрое измерение гиалуронидазной активности из культивируемых клеток и биологических проб с вариацией между анализами, меньшей чем 10%.
а. Протокол.
Получение биотинилированного НА-субстрата.
100 мг гиалуронана (НА) (81дта СНет1са1) растворяли в 0,1 М МЕ8, рН 5,0, до конечной концентрации 1 мг/мл и давали растворяться в течение по меньшей мере 24 ч при 4°С перед связыванием биотина. Сульфо-НЫ8 (Р1егсе; ВоскГогб 1Ь) добавляли к раствору С804 МЕ8 до конечной концентрации 0,184 мг/мл. Биотингидразид (Р1егсе) растворяли в ДМСО в виде исходного раствора 100 мМ и добавляли к С804-раствору до конечной концентрации 1 мМ. Исходный раствор 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбидодиимида (ЕОАС) готовили в виде 100 мМ исходного раствора в дистиллированной воде и добавляли к раствору НА-биотина в конечной концентрации 30 мМ. Этот раствор оставляли перемешиваться в течение ночи при 4°С. Несвязанные биотин и ЕЭАС удаляли диализом против воды с 3 сменами 1000х объема воды. Диализованный биотинилированный НА (ЬНА) делили на аликвоты и хранили при -20°С в течение периода времени до нескольких месяцев.
Сульфо-ИН8 разбавляли до 0,184 мг/мл в воде с ЬНА в концентрации 0,2 мг/мл и пипетировали в 96-луночные планшеты СΟVЛ^INК-NН (ΝυΝδ; Р1асегуШе ΝΙ) при 50 мкл на лунку. ЕОАС разбавляли до 0,123 мг/мл в воде и пипетировали в планшеты СОУАиИК-ИН с раствором ЬНА с получением конечной концентрации 10 мкг/мл ЬНА и 6,15 мкг на лунку ЕОАС. Эти планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С или в течение 2 ч при 23 °С, что давало сравнимые результаты. После ковалентной иммобилизации ЬС804 на микротитрационных планшетах раствор связвания удаляли стряхиванием и планшеты промывали 3 раза в ЗФР, содержащем 2 М №С1 и 50 мМ Мд8О4 (буфер А). Планшеты можно было хранить при 4°С до одной недели.
Планшеты СОУАиХК-ХН с иммобилизованным ЬНА уравновешивали 100 мкл на лунку буфера для анализа - либо 0,1 М формиат, рН 3,7, 0,1 №С1, 1% детергент Тритон Х-100, 5 мМ сахаролактон для лизосомной гиалуронидазы; либо 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, с 1 мМ СаС12 и 1 мг/мл сывороточного альбумина человека (Ιί’Ν) для нейтрально-активных ферментов. Генерировали набор стандартов для калибрования активности фермента против «относительных уменьшающих помутнение единиц» (гТВи) разведением бычьей тестикулярной гиалуронидазы (81дта Туре У1-8) в буфере для нейтрально-активного фермента от 1,0 до 1х 10-6 гТВи на лунку и анализом 100 мкл на лунку в трех повторностях. Пробы кислотноактиной гиалуронидазы разводили буфером для лизосомной гиалуронидазы от 1:10 до 1:130000 и пипетировали в трех повторностях при 100 мкл на лунку. Для большинства анализов экстрактов тканей и плазмы человека достаточным было 30-минутное инкубирование при 37°С. Лунки положительного и отрицательного контроля (без фермента или без АВС (см. ниже), соответственно) включали также в трех повторностях.
Реакцию останавливали добавлением 200 мкл на лунку 6 М гуанидина-НС1 с последующими тремя промывками 300 мкл на лунку ЗФР, 2 М №С1, 50 мМ Мд8О4, 0,05% детергента Твина 20 (Буфер В). Готовили комплекс авидин-биотин (набор (АВС) (Уес!ог ЬаЬк; Вшйпдате СА) в 10 мл ЗФР, содержащего 0,1% детергент Твин 20, который предынкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре во время инкубирования. Добавляли раствор АВС (100 мкл на лунку) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Этот планшет промывали пять раз буфером В, затем добавляли субстрат офенилендиамин (ОРО) при 100 мкл на лунку растворением одной 10 мг-таблетки в 10 мл 0,1 М цитратРО4, рН 5,3 и добавлением 7,5 мкл 30% Н2О2. Планшет инкубировали в темноте в течение 10-15 мин, затем считывали показания с использованием фильтра 492 нм в планшет-ридере ЕЬ18А (Тйейек Ми1йккап РЬи8; Ι8Ν) с мониторингом при помощи компьютера с использованием программного обеспечения планшет-ридера Ое1!а 8ой II из Вюте!аШск (Рппсе!оп ΝΙ). Стандартную кривую с использованием бычьей тестикулярной гиалуронидазы генерировали при помощи четырехпараметрического построения кривой коммерческого препарата гиалуронидазы, и неизвестные пробы интерполировали с использованием их оптической плотности при 492 нм.
Для анализа рН-зависимости гиалуронидаз, используют очищенный кНА8ЕСР и бычью тестикулярную гиалуронидазу. рН-зависимость активности ферментов измеряют разбавлением очищенного &НА8ЕСР или частично очищенной бычьей тестикулярной гиалуронидазы для 0,1 гТВи в следующих буферах: 50 мМ формиат, рН 3-4,5; 50 мМ ацетат, рН 5-6; 50 мМ МЕ8, рН 6,7 или 50 мМ НЕРЕ8, рН 7-8. Пробы анализируют в течение 30 мин при 37°С и активность выражают в виде процента максимальной активности. В буферах не использовали №С1, так как он может изменять рН-оптимум тестикулярных препаратов гиалуронидазы (Со1б, Вюсйет. I 205:69-74, 1982; Сасека е! а1., Вюсйет. 8ос. Тгапк. 7:1287
- 92 011654
1289, 1979); физиологические концентрации соли (0,15 М) уменьшали видимый рН-оптимум, причем этот эффект был более выраженным в очищенных препаратах тестикулярного фермента, чем Е, исходной неочищенной пробе.
Ь. Результаты.
Гиалуронан биотинилировали в одностадийной реакции с использованием биотингидразида и ЕОАС. Посредством ограничения ЕОАС, который связывает свободные гидроксильные группы на гиалуронане (НА) с биотингидразидом, метили только небольшую долю всех остатков гиалуроновой кислоты на НА. Это количество ЕЭАС (3х10-5 М), добавленное к НА (2,8х10-3 М), приводит максимально к одной молекуле биотингидразида, связанной на 93 дисахаридные единицы НА.
Получали четырехпараметрическое построение кривой реакций стандартов бычьей тестикулярной гиалуронидазы, измеренных при рН 3,7 и разведенных от 1,0 до 1 х 10-6 ТКИ на лунку. Построения четырехпараметрических кривых устанавливали из уравнения у=((А-Э)/(1+(конц/С)ЛВ)+П), где 1од1! у=1п(у'/1-у'), у'=(у-О)/(А-Э), В=-Ь/1п 10 и С=ЕХР (а/В). Эти четыре параметра (А,В,С,О) рассчитывали с использованием компьютерной программы, которая использовала алгоритм 2+2 с линейной регрессией (КойЬагй е! а1., С1ш. С1ет. 22:350, 1976). Это построение кривой включает в себя сигмоидальные аспекты этой кривой стандартов. Оптимальная точность для измерения пробы обычно равна 0,001-0,01 ТКИ на лунку в течение 30-минутного инкубирования. Во время 60-минутного инкубирования 1/1000 ТКИ является детектируемой. Логарифмическая кривая стандартов может быть также использована на протяжении более короткого диапазона величин для установления построения кривой стандартов. Хотя это изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления должно быть понятно, что это изобретение в заявленном здесь виде не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления.
Пример 2. Клонирование кДНК кНА8ЕОР.
Нуклеиновая кислота, кодирующая &НА8ЕОР человека, может быть получена специалистом в данной области при помощи ряда процедур, в том числе, но не только, искусственным синтезом гена, ОТПЦР и гибридизацией с кДНК-библиотекой (например, см. Отас11 е! а1., ЕЕВ8 336(3) 1993, К1тте1 е! а1., Ргос. №11. Асай. 8сЕ И8А 90 1993 10071-10075). Альтернативно, клоны, кодирующие кНА8ЕОР человека, могут быть получены из 1МАОЕ или других поставщиков последовательностей генов человека (ΐηνίС1опс 1ОН10647).
Было рассчитано, что полноразмерная кДНК РН20 человека имеет длину 2009 нуклеотидов, а полученная открытая рамка считывания имеет длину 1530 нуклеотидов. 5'-ИТК является необычно большим, что указывает на сохранившийся интрон, и может ингибировать трансляцию, препятствуя связыванию рибосомы с точным инициирующим кодоном метионина вследствие 9 некодирующих стартовых кодонов в этом 5'-ИТК. Предсказано, что этот белок (номер доступа ОеηВаηк ИР_003108) содержит 509 аминокислот 8ЕО ΙΌ ΝΌ: с рассчитанной молекулярной массой 58 кДа.
Для секвенирования клонов ПЦР-амплифицированные полосы вырезали и элюировали с использованием набора для экстракции гелей (^адев) и клонировали в подходящие векторы с совместимыми концами после рестрикционного расщепления. Все реакции секвенирования выполняли на двухцепочечной ДНК с использованием набора для секвенирования Тад Эуе йеоху !егтта!ог сус1е (АррБей Вюкук!етк) в соответствии с инструкциями изготовителя, и разделяли на автоматическом секвенаторе АВ1 Рпкт™ (АррБей Вюкук!етк).
Открытую рамку считывания РН-20 человека получали амплификацией кДНК-библиотек яичка человека (С1оп!сс1, Ра1о А1!о СА) при помощи полимеразной цепной реакции с использованием праймеров 8ЕО ΙΌ ИО:14 и 8ЕО ΙΌ ИО:47. ПЦР-продукты расщепляли №е1 и ВатН1 и клонировали в сайты №е1 и ВатН1 вектора 1КЕ8Риго2 (С1оп!сс1).
Пример 4. Выделение кНА8ЕОР из кДНК РН20 человека.
Экспрессирующий вектор каталитически активного секретируемого рекомбинантного &НА8ЕОР человека, способного к эффективному гликозилированию в клетках млекопитающих, генерировали, как описано ниже. Рассматриваются и другие экспрессионные конструкции с промоторами и селектируемыми генами для различных видов, таких как клетки дрожжей и насекомых, которые также способны генерировать кНА8ЕОР. Могут быть также использованы гены положительного отбора, такие как ген глутаминсинтазы или дигидрофолатредуктазы (ОНЕК). Приведенные ниже примеры предназначены не для ограничения, а для обеспечения примера нескольких плазмидных систем экспрессии, которые могут быть использованы.
Для конструирования секретируемых форм &НА8ЕОР были сконструированы укороченные мутанты, которые были лишены гидрофобной С-концевой стороны. С использованием программы предсказания ОР1-расщепления сайт отщепления ОР1-якоря был обнаружен около положения аминокислоты N 483 в полноразмерном имеющем ОР1-якорь белке. Набор из семи 3'-праймеров «футлярного типа» (наборы праймеров для ПЦР, организованные таким образом, что должен использоваться второй набор праймеров, которые лежат в последовательности, амплифицированной первым набором праймеров, и т.д.) используют для конструирования набора из семи укороченных делеционных мутантов, лишенных предска- 93 011654 занного СР1-якоря, начинающихся в положении Υ 482, и делетированных прогрессирующим образом на одну аминокислоту. Эти праймеры были сконструированы таким образом, что они имеют совместимые сайты ΝΙκΙ (5') и ВатН1 (3') для клонирования укороченных мутантов в векторе 1КЕ8Риго2, либо немеченых со стоп-кодоном в 3'-праймере, либо в виде белка, Н1з-меченого на С-конце, для облегчения очистки и детектирования. Например, обратные праймеры 8Е0 ΙΌ N0:8, 8Е0 ΙΌ N0:9 и 8Е0 ΙΌ N0:10 использовали для генерирования мутантов, заканчивающихся в положении Υ 482, Ε 481 и Ι 480, без 6-Н1зметки. Другие мутантные праймеры генерировали с той же самой картиной оснований с подходящими модификациями для включения или исключения конкретных аминокислот. Для генерирования Н1змеченых вариантов использовали тот же самый набор праймеров, что и для немеченых вариантов, за исключением того, что праймеры лишены стоп-кодона в соответствующих обратных праймерах, причем прямой праймер остается тем же самым (в отношении Н1з-меченого конструирования делается ссылка на праймеры 8Е0 ΙΌ N0:19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, которые являются обратными праймерами без стопкодона, соответствующими немеченым обратным праймерам для их соответствующих конструкций). Перекрывающиеся праймеры использовали для конструирования состоящего из шести аминокислот спейсера, за которым следует метка из шести гистидинов в сайтах ВатШ и в векторе ГКЕ8Риго2, так что Шз-меченые мутанты генерировали лигированием ПЦР-амплифицированных и расщепленных рестриктазами продуктов в сайтах ΜιοΙ и ВатШ в содержащем Н1з-метку векторе ГКЕ8Риго2.
Для идентификации, мог бы быть зНА8ЕСР человека модифицирован на его карбоксиконце для генерирования секретируемого и нейтрально-активного фермента, получали ряд укорочений от сайта присоединения СРЕякоря до предсказанного «каталитического домена» на основе гомологии с ферментом змеиного яда.
ДНК, кодирующую полноразмерный имеющий СРЕякорь зНА8ЕСР человека в IКЕ8Ри^ο2, использовали в качестве матрицы для генерирования различных укороченных делетированных мутантов. Компьютерные программы моделирования давали несколько предсказанных сайтов расщепления для этого полноразмерного полипептида. Один из таких предсказанных сайтов находился в положении аминокислоты N 483 (8Е0 ΙΌ N0:1). Конструировали ПЦР-праймеры для успешного укорочения этого белка от N 483 для генерирования шести делеционных мутантов, начинающихся при Υ 482 (лишенных N и заканчивающихся при Е 477 (лишенных Р).
а. Протокол.
Генерирование укороченного мутанта, лишенного N 483.
Полноразмерный, имеющий СРЕякорь клон зНА8ЕСР между сайтами ΜκΙ и ВатШ в рIКЕ8Ри^ο2, использовали в качестве матрицы. Эту матрицу амплифицировали с 5'-праймерром, содержащим сайт №еф который начинается при начальном метионине нативного сигнального пептида при М 1 (8Е0 ΙΌ N0:14), и 3'-праймером, содержащим сайт ВатШ, который заканчивается при Υ 482 (8Е0 ΙΌ N0:8). ПЦР-продукт разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле для разделения и подтверждения амплифицированной полосы правильного размера, очищали из геля, расщепляли рестриктазами ΜιοΙ и ВатШ и клонировали в вектор рIКЕ8Ри^ο2 (СЧоШесН) между сайтами N114 и ВатШ с получением экспрессирующего вектора для экспрессии этого укороченного мутанта зНА8ЕСР, заканчивающегося в положении аминокислоты N482 и лишенного СРЕякоря, с аминокислотной последовательностью (8Е0 ΙΌ N0:5 для последовательности полученного полипептида зНА8ЕСР до Н 482) и нуклеотидной последовательностью (8Е0 ΙΌ N0:48 до кодирующих нуклеотидов для полипептида в 8Е0 ΙΌ N0:5), как показано.
Генерирование других укороченных мутантов, лишенных Υ 482, Ε 481, Ι 480, О 479 и Р 478, соответственно.
Ту же самую стратегию использовали с единственным различием, заключающимся в том, что использовали подходящий 3'-праймер для каждого мутанта. Соответствующими 3'-праймерами являются следующие:
3'-праймер для мутанта зНА8ЕСР, который лишен Υ 482 - 8Е0 ΙΌ N0:9;
3'-праймер для мутанта, который лишен Ε 481 - 8Е0 ΙΌ N0:10;
3'-праймер для мутанта, который лишен Ι 480 - 8Е0 ΙΌ N0:11; 3'-праймер для мутанта, который лишен О 479 - 8Е0 ΙΌ N0:12;
3'-праймер для мутанта, который лишен Р 478 - 8Е0 ΙΌ N0:13.
Генерирование дополнительных делеционных мутантов для определения минимально активного домена зНа8еСР.
Дополнительные делеции в блоках из десяти-двадцати аминокислот получали из 3'-конца самого глубоко лежащего активного при нейтральном рН укороченного мутанта зНА8ЕСР, который является зНА8ЕСР до Е 477. ШШ-прямой праймер 8Е0 ΙΌ N0:14 использовали с позиционированным подходящим образом 3'-праймером для ПЦР-амплификации делеционного мутанта зНА8ЕСР желаемой длины от карбоксиконцевой стороны. Например, ПЦР с праймерами, описанными 8Е0 ΙΌ N0:14 и 8Е0 ΙΌ N0:26 в качестве 5'- и 3'-праймеров, соответственно, использовали для рессионной конструкции в векторе IКЕ8Ри^ο2. Подобным образом, ПЦР с обратными 3'-праймерами, описанными в 8Е0 ΙΌ N0:27, 28, 29, 30, 31 и 32, использовали для генерирования делеционных мутантов, заканчивающихся в положениях аминокислот А 477, 8 430, С 413, 8 394, А 372 и 8 347, соответственно, зрелого зНА8ЕСР. ПЦР
- 94 011654 продукты в каждом случае расщепляли ферментами ШсЧ и ΒатΗI и расщепленный продукт клонировали в вектор ρIКΕδΡи^ο2 между сайтами ШсЧ и ΒатΗI. Несколько независимых клонов в конечной зкспрессионной конструкции из каждой группы испытывали на активность секретируемого нейтральноактивного δΗΑδΕСΡ транзиторной трансфекцией в клетки СИ0 в не содержащей сыворотки среде СЭСИ0 (1пу1!годеп, ΟΑ) и брали пробы в указанных временных точках для анализа. Минипреп-ДНК, полученную из ночных культур, трансфицировали с реагентом трансфекции Сепе)шсе (^уауеи, ΟΑ) в соответствии с рекомендуемыми изготовителем протоколами. Г иалуронидазную активность измеряли микротитрационным анализом, описанным выше.
Ь. Результаты.
Гиалуронидазную активность измеряли в укороченных мутантах δΗЛδΕСΡ для идентификации минимально активного домена для активности секретируемой нейтрально-активной гиалуронидазы.
От аминокислоты 1 до Е/мл/24 часа, рН 7,4
347 0,000
372 0,000
394 0,000
413 0,000
430 0,000
447 0,000
467 0,089
477 0,567
478 0,692
479 0,750
480 0,575
481 0,740
482 0,329
483 0,800
509 0,044
Эти результаты показали, что все шесть мутантов с делецией одной аминокислоты, заканчивающиеся указанными аминокислотами от Υ 482 до Ε 477, проявляли более высокую секретируемую активность, чем имеющий СΡI-якорь δΗЛδΕСΡ.
Эти результаты показали также, что делеции за пределами А 467 устраняли какую-либо секретируемую активность.
Секретируемая нейтральная активность из клонов А 467 уменьшалась до приблизительно 10% активности, обнаруживаемой клонами Р478 или N 483. Таким образом, был сделан вывод, что требовалось более, чем карбоксиконцевой домен δΗΑδΕСΡ человека для создания нейтрально-активного домена гиалуронидазы, чем предполагалось ранее на основе данных для фермента змеиного яда. Таким образом, цистеины в карбоксиконцевом домене являются необходимыми для нейтральной активности. Таким образом, очень узкий диапазон, охватывающий приблизительно 10 аминокислот перед сайтом отщепления СΡI при N 483, определял минимально активный домен.
Пример 5. Действия модификации сигнального пептида на секреторную активность δΗΑδΕСΡ.
δΗΑδΕСΡ человека имеет необычно длинный предсказанный нативный лидерный пептид. Кроме того, существование двух смежных остатков цистеина в этом лидерном пептиде может приводить к агрегации полипептидных мультимеров в эндоплазматическом ретикулуме (эндоплазматической сети) во время экспрессии высокого уровня и, следовательнро, предотвращать экспрессию высокого уровня δΗΑδΕСΡ. Таким образом, ряд более эффективных секреторных лидерных пептидов исследовали на их способность усиливать нацеливание δΗΑδΕСΡ на секрецию.
а. Протокол.
Каппа-лидерный пептид конструировали отжигом перекрывающихся праймеров и ПЦР-удлинением с праймерами, соответствующими последовательностям δΕΟ ГО N0:37, 38, 39 и 40. Полученную ПЦРамплифицированную последовательность цепи каппа амплифицировали с фланкирующими праймерами, содержащими сайт ШсЧ в 5'-конце (как описано в δΕ9 ГО N0:41) и сайт ИслМЫ в 3'-конце (как описано в δΕΟ ГО N0:42). Это позволило клонировать лидерный пептид каппа (полипептидную последовательность, описанную в δΕΟ ГО N0:43) в векторе Ь1!ти8 39 (N1:13) между сайтами МкЫ и ΕόοΚΙ. δΗЛδΕСΡ имеет внутренний сайт ИслМЫ; таким образом, эту каппа-конструкцию между сайтами ШсЧ и ИслМЫ дополнительно амплифицировали с 5'-δρеI-праймером (описанным в δΕΟ ГО N0:44) и б'-МИ-праймером (описанным в δΕΟ ГО N0:45). δΗΑδΕСΡ без СΡI-якорного конца при Ρ 478 вырезали из ρIКΕδΡи^ο2 при помощи ШсЧ и ΒатΗI и клонировали в вектор Ьйтик 39 (ΛΤΒ) в сайтах N11 сЧ и ΒатΗI этого вектора ЕЧтик 39. Полученный содержащий δΗЛδΕСΡ вектор ЕЧтик расщепляли рестриктазами δρеI и МЫ и конструкцию лидера каппа-цепи, амплифицированную с δρеI и МЫ, клонировали в него. Сайтнаправленный мутагенез выполняли на этом векторе Ьйтик 39, содержащем как последовательности каппа, так и δΗΑδΕСΡ-последовательности, для генерирования в рамке считывания слияния лидерной последовательности каппа-цепи со зрелым полипептидом δΗΛδΕСΡ. Пары праймеров, соответствующие δΕΟ ГО N0:34 и 35, использовали для генерирования лидера каппа-цепи с нативным Αδρ в качестве концевой аминокислоты, слитого с Е 38 δΗЛδΕСΡ (до Ρ 478) (как описано в δΕΟ ГО N0:46 для полипептид
- 95 011654 ной последовательности этого слитого белка). Комбинации других пар связывания, такие как описанные 8ЕС) ΙΌ ΝΌ:33 с 8ЕС) ΙΌ ΝΌ:35, использовали для генерирования окончания каппа-лидера при концевом Азр (Ό), слитого с Е 36 зНА8ЕСР; 8ЕС) ΙΌ NО:33 с 8ЕС) ΙΌ NО:36 использовали для генерирования окончания каппа-лидера при С1у(С) (перед концевым Азр (Ό)), слитого с Е 36 зНА8ЕСР и 8ЕС) ΙΌ NО:34 с 8ЕС) ΙΌ NО:36 использовали для генерирования окончания каппа при С1у(С) перед концевым Азр (Ό)), слитого с Р 38 зНА8ЕСР. Эти каппа-зНА8ЕСР-слияния, полученные сайт-направленным мутагенезом, очищали из геля, расщепляли ферментом ОргЕ для расщепления любой переносящей исходной ДНК и затем расщепляли ΝΚΊ и ВатЫ и клонировали в расщепленный ^еУВатН скелет Н1зЕВЕ8Риго2, который имеет Ыз-метку (спейсер из шести аминокислот, за которым следуют шесть гистидинов), клонированную между сайтами ВатН и ΝσίΙ в векторе р!ВЕ8Риго2. Таким образом, после лигирования авторы получают конструкцию, которая является NΡеI-каппа-зΗА8ΕСΡ-ВашΗI-Η^з в рIВΕ8Ρи^о2. Получали четыре набора такой конструкции, которые соответствуют комбинациям С или Ό на конце лидера каппацепи и Ь36 или Р 38 в начале зрелого зНА8ЕСР. Несколько независимых клонов из каждого типа конструкции трансфицировали в клетки СНО в среде СБ-СНО (Iην^!^одеη, СА) для тестирования, стимулирует ли присутствие лидера секреции каппа-цепи увеличенные уровни секретируемого белка в сравнении с природным лидером секреции. Минипреп-ДНК, полученный из ночных культур, трансфицировали с реагентом трансфекции Сепе]шсе (Nоνадеη, СА) в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом и брали пробы для тестирования при помощи микротитрационного анализа, описанного выше.
Слитые конструкции лидерный пептид каппа-цепи ΙβΟ мыши-зНА8ЕСР использовали для тестирования на более высокие уровни секретируемой нейтрально-активной активности зНА8ЕСР.
Ь. Результаты
Результаты этого анализа фермента показали, что лидер каппа-цепи НС был способен усиливать секрецию зНА8ЕСР, приблизительно в 7-8 раз более высокую, чем природный лидер секреции, при сравнении с клонами Р 478, Υ 482 или N 483, которые лишены такого лидера. Другие конструкции лидера каппа-цепи с вариациями сайта слияния лидера с Азр или С1у лидера на 1.36 или Р38 зНА8ЕСР также увеличивали уровни секретируемой нейтрально-активной гиалуронидазной активности. Эти примеры предназначены для рассмотрения, а не сужения объема изобретения, поскольку другие эффективные секреторные лидерные последовательности могут быть использованы в той же технологии.
Пример 6. Генерирование экспрессирующего вектора зНА8ЕСР человека.
зНА8ЕСР без эпитопной метки генерировали клонированием в бицистронную экспрессионную кассету, Н224 (8Ε^ ΙΌ NО:47). Плазмидный вектор Н224 для экспрессии зНА8ЕСР содержит скелет вектора рО (Рготеда), ДНК-последовательность, кодирующую аминокислоты 1-482 гиалуронидазы РН20 человека, внутренний сайт вхождения рибосом (ЕВЕ8) из вируса ЕСМУ (С1оп!есР) и ген дигидрофолатредуктазы (БНРВ) мыши. Скелет вектора рО включает в себя также ДНК, кодирующую ген устойчивости к бета-лактамазе (АтрВ), сайт инициации репликации £1, немедленно-ранний район энхансера/промотора цитомегаловируса (СМУ), химерный интрон и поздний сигнал полиаденилирования (8У40). ДНК, кодирующая конструкцию зНА8ЕСР, содержала консенсусную последовательность Козака при метионине нативного сигнального лидера и стоп-кодоне при тирозине 482. Полученная конструкция рСI-РН20-IВΕ8-^ΗРВ-8У40ра (Н2-24) приводит к единственной разновидности мРНК, запускаемой промотором СМУ, которая кодирует аминокислоты 1-482 РН20 и аминокислоты 1-187 дигидрофолатредуктазы, разделенные внутренним сайтом вхождения рибосом.
Открытую рамку считывания РН20 человека амплифицировали из ОВР-клона Iην^!^одеη (ЮН10647, Iην^!^одеη, Саг1зЬаб СА) с 5'-праймером, который вводил сайт Ше! и консенсусной последовательностью Козака перед метионином РН20, и обратным праймером, который вводил стоп-кодон после тирозина 482 и вводил сайт рестрикции ВашНР Полученный ПЦР-продукт лигировали в плазмиду р!ВЕ8Риго2 (С1оп!есР, Ра1о А1!о, СА) после расщерления ПЦР-фрагмента РН20 ΝΜ и ВатНР
Пример 7. Генерирование экспрессирующей зНА8ЕСР линии клеток.
Нетрансфицированные клетки 1)644 СНО, растущие в модифицированных СИВСО средах СО-СНО для ОНРВ(-) клеток, дополненных 4 мМ глутамином и 18 мл Плуроника Р68/Ь (С1Ьсо), высевали при 0,5 х106 клеток/мл во встряхиваемой колбе в приготовлении для трансфекции. Клетки выращивали при 37°С в 5% СО2-увлажненном термостате со встряхиванием при 120 об/мин. Экспоненциально растущие нетрансфицированные клетки ОС44 СНО тестировали на жизнеспособность перед трансфекцией.
60000000 жизнеспособных клеток нетрансфицированной культуры клеток ОС44 СНО осаждали и ресуспендировали до плотности 20000000 клеток в 0,7 мл 2х буфера для трансфекции (2Х НеВ8 = 40 мМ Нерез, рН 7,0, 274 мМ №С1, 10 мМ КС1, 1,4 мМ №11РО.|, 12 мМ декстроза). К каждой аликвоте ресуспендированных клеток добавляли 0,09 мл линейной плазмиды Н224 (250 мкг) и эти растворы клет
- 96 011654 ки/ДНК переносили в кюветы для электропорации со щелью 0,4 см ВТХ (Сеп1гошск) при комнатной температуре. Электропорацию отрицательного контроля выпоняли без плазмидной ДНК, смешанной с этими клетками. Смеси клетки/плазмида электропорировали с зарядом конденсатора 330 В и 960 мкФ или при 350 В и 960 мкФ.
Клетки извлекали из кювет после электропорации и переносили в 5 мл модифицированной среды СИ-СНО для ОНРК(-)-клеток, дополненной 4 мМ глутамином и 18 мл Плуроника Р68/Ь (С1Ьсо), и давали расти в лунке 6-луночной чашки для культуры ткани без отбора в течение 2 дней при 37°С в 5% СО2 увлажненном термостате.
Спустя два дня после электропорации 0,5 мл среды для культуры ткани извлекали из каждой лунки и тестировали на присутствие гиалуронидазной активности.
Исходная гиалуронидазная активность Н224-трансфицированных клеток ИС44 СНО при 40 ч после трансфекции
Клетки из трансфекции 2 (350 В) собирали из лунки для культуры ткани, считали и разводили до 10000-20000 жизнеспособных клеток на мл. Аликвоту 0,1 мл суспензии клеток переносили в каждую лунку пяти 96-луночных круглодонных планшетов для культуры ткани. В лунки, содержащие клетки, добавляли 0,1 мл среды СИ-СНО (С1ВСО), содержащей 4 мМ С1и1атах-1, без добавок гипоксантина и тимидина (конечный объем 0,2 мл).
Из 5 планшетов, росших без метотрексата, идентифицировали десять клонов.
1Е11 контроль контроль гиалуронидазная активность
Шесть клонов Н224 размножали в культуре и переносили во встряхиваемые колбы в виде суспензий отдельных клеток. Клоны 3Ό3, 3Е5, 2С8, 2Ό9, 1Е11 и 4Ό10 высевали в 96-луночные круглодонные планшеты для культуры ткани с использованием стратегии двумерного бесконечного разведения. Разведенные клоны росли в фоне 500 нетрансфицированных клеток ИС44 СНО на лунку для обеспечения необходимых факторов роста в течение начальных дней в культуре. Готовили десять планшетов на суб клон.
Клон 3Ό3 давал 24 визуальных субклона. Значимую гиалуронидазную активность измеряли в супернатантах из 8 из 24 клонов (>50 Единиц/мл) и эти 8 субклонов размножали в колбах для культуры ткани Т-25 в присутствии 50 нМ метотрексата. Клон 3Ό3 50 нМ дополнительно размножали в 500 нМ метотрексате с получением клонов, продуцирующих более 1000 Единиц/мл, во встряхиваемых колбах (клон 3Ό3 5М).
Пример 8. Получение кНАЗЕСР.
Флакон 3Ό3 5М оттаивали и размножали из Т-колб с использованием вращающихся колб на 1 л в среде СНО СИМ (Гпургодеп, Саг1кЬаб СА), дополненной 100 нМ метотрексатом и Глутамаксом (Гпургодеп). Клетки переносили из вращающихся колб в биореактор на 5 л (Вгаип) при плотности инокуляции 4,0х105 жизнеспособных клеток на мл. Параметры были следующими: заданная величина температуры 37°С, рН 7,2 (начальная заданная величина), заданная величина растворенного кислорода 25% и верхний слой воздуха 0-100 см3/мин. При 168 часах добавляли 250 мл среды Подпитки №1 (СИ СНО + 50 г/л глюкозы). На протяжении 216 ч добавляли 250 мл среды Подпитки №2 (СИ СНО + 50 г/л глюкозы + 10 мМ бутират натрия) и на протяжении 264 ч добавляли 250 мл среды Подпитки №2. Этот процесс приводил к конечной продуктивности 1600 Единиц на мл с максимальной плотностью клеток 6 млн клеток/мл. Было обнаружено, что добавление бутирата натрия разительно увеличивало продуцирование
- 97 011654 кНАЗЕОР в конечных стадиях продуцирования.
Выращивание и продуцирование кНАЗЕОР 3Ό3-5Μ, биореактор на 5 л
Часы опыта Жизнеспособные клетки х105 % жизнеспособных клеток Единиц/мл Объем (мл) [Глюкоза] Подпитка
0 4,4 100 0 4500 547
24 5,7 100 0 4500 536
48 10,1 100 37 4500 501
72 17,1 99 62 4500 421
96 28,6 99 118 4500 325
120 28,8 99 240 4500 274
144 60,2 100 423 4500 161
168 55 100 478 4500 92 250 мл Подпитки №1
192 66,6 98 512 4750 370
216 55,2 92 610 4750 573 250 мл Подпитки №2
240 53 88 710 5000 573
264 49,8 84 852 5000 474 250 мл Подпитки №2
288 40 70 985 5250 770
312 31 61 1467 5250 773
336 25,4 52 1676 5250 690
Пример 9. Очистка кНАЗЕОР.
Кондиционированную среду от клона 3Ό3 осветляли глубинным фильтрованием и диафильтрацией с тангенциальным потоком в 10 мМ Нерек, рН 7,0. Затем растворимый НАЗЕОР очищали последовательно ионообменной хроматографией на О-Сефарозе (РЬагтас1а), гидрофобной хроматографией на Фенил-Сефарозе (РЬагтас1а), хроматографией на фенилборонате (Рготейск) и хроматографией на гидроксиапатите (Вюгаб, КюЬтопб, СА).
кНАЗЕОР связывали с Р-Сефарозой и элюировали при 400 мМ ХаС1 в том же самом буфере. Этот элюат разбавляли 2 М сульфатом аммония до конечной концентрации 500 мМ АЗО4 и пропускали через колонку Фенил-Сефарозы (1о\х киЬ) с последующим связыванием при тех же условиях с фенилборонатной смолой. кНАЗЕОР элюировали из фенил-сефарозной смолы в Нерек, рН 6,9, после промывания при рН 9,0 в 50 мМ бицине без АЗО4. Этот элюат наносили на керамическую гидроксиапатитную смолу при рН 6,9 в 5 мМ РО4, 1 мМ СаС12 и элюировали 80 мМ РО4, рН 7,4, с 0,1 мМ СаС12.
Полученный очищенный кНАЗЕОР имел удельную активность более 65000 Единиц иЗР/мг белка согласно анализу микромутности с использованием ссылочного стандарта иЗР (Фармакопеи США). Очищенный кНАЗЕОР элюировался в виде единственного пика при 24-26 минутах из колонки РЬагтас1а 5КСР стирол-дивинилбензол с градиентом между 0,1% ТФУ/Н2О и 0,1% ТФУ/90% ацетонитрил/10% Н2О и разделялся в виде единственной широкой полосы 61 кДа электрофорезом с ДСН, которая уменьшалась до резкой полосы 51 кДа после обработки ПНГазой Р. Секвенирование Ν-концевых аминокислот выявило, что лидерный пептид был эффективно удален.
Последовательность Ν-концевых аминокислот биохимически очищенного кНАЗЕОР
Положение 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Теоретическое Ьеи Азп РЬе Агд А1а Рго Рго Уа1 Не Рго Азп
Наблюдаемое - Азп РЬе Агд А1а Рго Рго Уа1 11е Рго Азп
Пример 10. Анализ гликозилирования полученного из ΙΧ.Ϊ44 СНО кНАЗЕОР.
Существуют противоречивые данные в отношении того, требуют ли кНАЗЕОР из разных видов гликозилирования для их каталитической активности. Например, сообщалось, что ферментативно активная гиалуронидаза змеиного яда может быть синтезирована в клетках, которые лишены аппарата гликозилирования, т.е. таких как Е. со11. Кроме того, обработка очищенной гиалуронидазы бычьих яичек ПНГазой не инактивировала активность фермента (А’атащПа е! а1., 1997). Другие исследования сообщают о потере активности после дегликозилирования и о том, что требуются дополнительно дисульфидные связи.
Однако, поскольку все подобные тесты выполнялись либо с неочщенными, либо с частично очищенными препаратами, не было очевидным, являлась ли потеря активности результатом подвергания дегликозилированного фермента действию загрязняющих протеаз в неочищенных препаратах или прямой функциональной зависимостью между гликозилированием и каталитической активностью.
а. Протокол.
Для определения, могло ли Ν-связанное гликозилирование быть введено в кНАЗЕОР человека с использованием системы экспрессии на основе СНО в не содержащих белка условиях, кДНК, кодирующую кНАЗЕОР-Н1З6 человека, экспрессировали в клетках СНО с использованием бицистронной кассеты 1КЕЗРиго в среде с определенным химическим составом. Клетки выращивали в течение 72 ч в среде СНО СИМ (1пу|1годеп-С|Ьео) с последующими концентрированием и диафильтрацией с тангенциальным по
- 98 011654 током на установке РеШеоп ТРР (М1Шроге) с мембранами, имеющими отсечение молекулярной массы 30 кДа. Этот концентрат подвергали смене среды с использованием 10 мМ Нере8, рН 7,4, 50 мМ №С1. Затем диафильтрат наносили на смолу ЭЕАЕ 8йеат1те 8ерйаго8е и элюировали градиентом №С1 0-1 М №С1 на смоле Рйагтас1а РРЬС. 8НА8ЕСР человека элюировался между 10-3 0% №С1. Уровни 8НА8ЕСР во фракциях колонки показали, что большая часть фермента извлекалась в градиенте 10-30% №С1. Затем фермент из 10-30% градиента №1С1 дополнительно очищали аффинной хроматографией на смоле IΜАС, загруженной N1. 8НА8ЕСР человека элюировали из смолы £МАС после промывания 10 мМ имидазолом с использованием 50 мМ ацетата, рН 5,0. Этот белок концентрировали и диализовали против 10 мМ Нере8, рН 7,4. Было определено, что этот высокоочищенный фермент имел удельную активность 97000 Единиц/мг белка в присутствии 1 мМ кальция и 1 мг/мл Н8А в микротитрационном анализе на основе ЕЫ8А с биотинилированным субстратом.
Для детектирования изменений в относительной молекулярной массе белка очищенный 8НА8ЕСР человека обрабатывали ПНГазой или нейраминидазой в течение ночи с последующими гельэлектрофорезом, электропереносом и вестерн-блот-анализом с анти-Н186-моноклональным антителом, связанным с пероксидазой хрена (НВР) (01адеп) и ЕСЬ-детектированием.
Ь. Результаты.
Вестерн-блот-анализ показал, что 8НА8ЕСР человека, продуцируемый в клетках СНО, был чувствительным к обработке ПНГазой. Относительная молекулярная масса 8НА8ЕСР человека выявила, что этот белок был высокогликозилированным. После полного расщепления ПНГазой в течение ночи 8НА8ЕСР человека уменьшался до отдельных разновидностей, что подтверждало, что небольшая гетерогенность нерасщепленной полосы могла быть приписана Ν-связанным остаткам сахара. Частичное расщепление ПНГазой Р показало смещение ряда промежуточных продуктов от необработанного 8НА8ЕСР и прогрессирующее смещение при более продолжительной обработке. Хотя полосы были несколько диффузными на 7% геле, можно было визуализировать по меньшей мере 6 различных промежуточных изоформ.
Обработка 8НА8ЕСР нейраминидазой выявила, что клетки СНО были действительно способны синтезировать сиалированный 8НА8ЕСР человека. После обработки нейраминидазой и Вестерн-блотанализа 8НА8ЕСР на 7% гелях полученный из СНО рекомбинантный 8НА8ЕСР человека обнаруживал смещение приблизительно 1-3 кДа в подвижности в сравнении с необработанным 8НА8ЕСР. Таким образом, это сообщение является первым сообщением о генерировании существенно сиалированного 8НА8ЕСР человека. Сиалирование является очень важным как для стабильности, так и для увеличения полупериода существования в сыворотке 8НА8ЕСР человека, так как 8НА8ЕСР нативной спермы из многих видов лишен сиалирования и не взаимодействует со специфическими в отношении сиаловой кислоты лектинами.
РАСЕ-анализ 8НА8ЕСР.
Анализ олигосахаридов активного 8НА8ЕСР при помощи РАСЕ-анализа (анализа углеводов посредством электрофореза с использованием флуоресценции) делает возможным определение профилей каталитически активных 8НА8ЕСР.
Протокол.
Очищенную гиалуронидазу из клона 3Ό3 5М оценивали с использованием РАСЕ™ Ν-йпкей О1Цо8аее11апйе РгоГШпд (Ргохуте). Олигосахариды отщепляли от 128,7 мкг гликопротеинов ферментативным расщеплением Ν-гликаназой (также называемой ПНГазой), метили с использованием флуорофора АКГ8 и разделяли электрофорезом. Относительные положения полос олигосахаридов определяли пропусканием на геле пробы и разведений пробы вместе с лестницей (лэддером) олигосахаридных стандартов, которые обозначали расстояние миграции в единицах Степени Полимеризации (ЭР).
Результаты.
Ν-профиль для пробы гиалуронидазы состоит из десяти полос, из которых шесть полос (идущих рядом с полосами стандартов олигосахаридов С5-С12) имели интенсивности, большие чем 9%. Кроме того, полоса, идущая рядом со стандартом С9, была наиболее интенсивной с интенсивностями 35-46%.
- 99 011654
Анализ олигосахаридов кНАЗЕОР.
Олигосахарид зНАЗЕСР Степень полимеризации Процент от общего количества
1 15,64 1,2
2 13,68 3,4
3 11,61 10,0
4 10,04 10,4
5 8,37 35,4
6 7,32 9,7
7 6,14 9,0
8 5,57 12,4
9 3,84 2,3
10 3,26 0,5
Пример 11. Зависимость ферментативной активности от Ν-связанного гликозилирования кНАЗЕОР.
a. Протокол.
Пробы очищенного Н1З6-кНАЗЕОР смешивали с буфером, содержащим нейраминидазу и ПНГазу с 50 мМ октилглюкозидом или без 50 мМ октилглюкозида в течение ночи при 37°С. При помощи Вестернблот-анализа по смещению в геле было подтверждено, что олигосахариды были удалены.
b. Результаты.
Пример 12. Активность кНАЗЕОР в отношении сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов.
Кроме анализа на основе микротитрации с использованием НА, субстратная специфичность кНАЗЕОР в отношении других гликозаминогликанов или протеогликанов может быть испытана с использованием анализа смещения в геле с очищенными субстратами для определения активности кНАЗЕОР в отношении других гликозаминогликанов. Многие анализы гиалуронидазы были основаны на измерении генерирования новых редуцирующих Ν-ацетиламиногрупп (Воппег апб Сап1еу, С1т. СН1т. Ас1а 13:746752, 1966) или потери вязкости (1)е За1едш е! а1., АгсН. ВюсЫт. ВюрНук. 121:548-554, 1967) или мутности (ОогГтап апб Οΐΐ, I. Вю1. СНет. 172:367, 1948). С очищенными субстратами все эти способы пригодны для определения присутствия или отсутствия эндоглюкозамидной активности.
a. Протокол.
Анализ смещения в геле - Очищенные субстраты смешивают с рекомбинантным кНАЗЕОР для тестирования эндоглюкозидазной активности, которая приводит к увеличенной подвижности субстрата в геле. Хондроитинсульфат А, Аггрекан ихондроитинсульфат Ώ были из Са1ЬюсНет. Гиалуронан (Пупочного канатика человека), Хондроитинсульфат С, Дерматансульфат и Гепарансульфат получают из Са1ЬюсНет. Гиалуронан пупочного канатика человека получают из ΙΕΝ. Каждый тест-субстрат разбавляют до 0,1 мг/мл. Пробы 10 мкл очищенного кНАЗЕОР или также кондиционированной среды от кНАЗЕОРэкспрессирующих клеток смешивают с 90 мкл тест-субстрата в желаемом буфере и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. После инкубирования пробы нейтрализуют буфером для проб (Трис-ЭДТА, рН 8,0, краситель бромфеноловый синий и глицерин) с последующим электрофорезом на 15% полиакриламидных гелях.
Гликозаминогликаны детектируют окрашиванием гелей красителем.
Алциановым синим в 3% ледяной уксусной кислоте в течение ночи с последующим удалением красителя в 7% ледяной уксусной кислоте. Расщепление определяют сравнением подвижности субстрата в присутствии и в отсутствие фермента.
b. Результаты.
100 Единиц кНАЗЕОРН1З6 в 10 мкл инкубировали с 90 мкл 10 мМ Нерек-буфером с 50 мкг/мл сывороточного альбумина человека в течение 2 ч при 37°С, содержащим 10 мкг различных гликозаминогликанов и протеогликанов. Электрофоретический анализ с последующим окрашиванием красителем Алциановым синим выявил увеличенные смещения подвижности в отношении хондроитинсульфата А, С и I), аггрекана и гиалуронана, но не в отношении гепарансульфата и хондроитинсульфата В. В то время как нерасщепленные гликозаминогликаны перемещались в виде мазка в середине геля, расщепленные продукты обнаруживали большую часть красителя алцианового синего во фронте красителя с небольшим количеством материала, перемещающегося в виде лэддера с приращениями.
Пример 13. Действия ионов металлов на активацию кНАЗЕОР.
Было обнаружено, что кроме необходимости гликозилирования для оптимальной ферментативной активности, кНАЗЕОР человека активируется катионами для оптимальной ферментативной активности. В процессе очистки было обнаружено, что кНАЗЕОР имеет низкую удельную активность после последо
- 100 011654 вательных стадий хроматографии. Было обнаружено, что Ы186-меченый кЫА8ЕСР имеет очень низкую удельную активность при очистке до гомогенности из ДЭАЭ, за которой следуют последовательные Νί1МАС-очистки. Поскольку смолы 1МАС могут хелатировать ионы металлов, различные металлы вводили обратно к кЫА8ЕСР для определения относительной ферментативной активности.
a. Протокол.
Очищенный кЫА8ЕСР тестировали после инкубирования с 0,1 мМ никелем (Νί), кобальтом ^ο), цинком (Ζη), кальцием (Са) и магнием (Мд) в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим определением гиалуронидазной активности в анализе на основе микротитрации.
b. Результаты.
Значительное увеличение гиалуронидазной активности было обнаружено после инкубирования кЫА8ЕСР с 0,1 мМ кальцием или 0,1 мМ магнием. Такая активация не была обнаружена после инкубирования с другими металлами. Добавление кальция к кЫА8ЕСР увеличивало удельную активность этого фермента до приблизительно 97000 единиц на мг белка согласно измерению А280. Затем тестировали кривую доза-ответ металлов кальция и магния для определения оптимальной концентрации ионов ме-
Было обнаружено, что активация кЫА8ЕСР встречается в микромолярном диапазоне. Концентрации, большие чем 10 мМ, были ингибирующими как для кальция, так и для магния. Для исключения неспецифической активации субстрата, а не фермента, хлорид кальция в 10 мМ Ы^ек-буфере инкубировали с иммобилизованным биотинилированным субстратом на микротитрационном планшете с последующим промыванием. Активация не была обнаружена при добавлении фермента к предынкубированному с кальцием планшету, который был промыт. Эту активацию тестировали также на высвобожденном фосфолипазой С нативном кЧА8ЕСР, который обнаруживал сходную активацию с кальцием, что исключило артефакт эпитопной 4186-метки карбоксиконца.
Пример 14. Действия альбумина на активность кЧА8ЕСР.
Было обнаружено, что разведение рекомбинантного IШР1120 и других препаратов, полученных из яичек со скотобойни гиалуронидаз, требовало альбумина, кроме кальция, для оптимальной активности.
a. Протокол.
Сывороточный альбумин человека ПСИ) разбавляли в 10 мМ Е^ек-буфере с кальцием для определения действий белка альбумина на активность фермента. Анализы ферментов с яйА^ЕСР и коммерческими препаратами выполняли как с 1 мМ СаС12, так и с 1 мг/мл сывороточного альбумина человека.
b. Результаты.
Активация гиалуронидазной активности была обнаружена при высоких разведениях в присутствии альбумина. Неясно, является ли эта активация результатом предотвращения денатурации или альбумин влиял на доступность субстрата. Таким образом, предпочтительная готовая форма кПА8ЕСР человека могла бы включать в себя альбумин и соль металла, содержащую либо кальций, либо магний.
Пример 15. Распределение активности очищенного кПА8ЕСР ΐη νίνο.
а. Протокол.
Очищенный кПА8ЕСР в 10 мМ Ηеρеκ, ρΗ 7,4, 150 мМ ΝαΠ, 0,1% Плуронике разбавляли до 0,5 Е/мл в не содержащей пирогенов воде с 0,15 М №С1. Готовили серию разведений в конечном объеме 20 мкл с получением в целом 0,01, 0,05, 0,1 Единиц на инъекцию. Добавляли раствор Трипанового синего до конечного объема 40 мкл и инъецировали подкожно в латеральную кожу на каждой стороне мышей Ва1Ь Νυ/Νυ, которых предварительно анестезировали ΐ.ρ. введением кетамина/ксилазина. Площади красителя измеряли в 2 измерениях микрокронциркулем от времени (ΐ) 0 до времени (ΐ) 45 мин. Площади выражали в мм2. В качестве контроля был включен рекомбинантный ΗΥ^^ человека, который не имеет нейтральной активности, но секретируется.
- 101 011654
Ь. Результаты.
ТЕСТ-МАТЕРИАЛ ПЛОЩАДЬ КРАСИТЕЛЯ при 45 мин
А. Солевой раствор (контроль) 51,5 мм2
В. зНАЗЕСР 0,01 Е 76,8 мм2
С. зНАЗЕСР 0,05 Е 98,22 мм2
Ό. зНАЗЕСР 0,10 Е 180,4 мм2
Е. НУАЫ 100 Е 67,48 мм2
Пример 16. Кинетика диффузионной активности зНАЗЕСР.
a. Протокол.
Рекомбинантный очищенный зНАЗЕСРН1з6 делили на 2 аликвоты. Одну нагревали до 95°С в течение 15 мин в термоциклере с нагретой крышкой. Другая оставалась при комнатной температуре. Тепловую инактивацию активности фермента подтверждали в анализе на основе микротитрации. Для кинетического анализа тестировали инактивированный нагреванием материал в сравнении с нативным материалом. 4 Единицы очищенного зНАЗЕСР или эквивалентного, инактивированного нагреванием материала инъецировали подкожно с красителем Трипановым синим. Площади испытывали в разных временных точках до 15 мин.
b. Результаты._____________________________________________________________________
4 ЕДИНИЦЫ ^минуты после инъекции 4 ЕДИНИЦЫ ИНАКТИВИРОВАННОГО НАГРЕВАНИЕМ МАТЕРИАЛА ^минуты после инъекции
ύο = 52,38 ϋ0 = 50,58
ύ3 = 116,51 Из = 65,48
11б,5 = 181,93 £6,5 = 63,87
1110 = 216,96 Ию = 65,80
Ъ16 = 279,99 ^16 = 74,3
Пример 17. Восстановление кожного барьера, разрушенного зНАЗЕСР.
a. Протокол.
Для установления времени регенерации пор, открытых зНАЗЕСР после подкожного введения, 2 Единицы очищенного зНАЗЕСР или солевой раствор (контроль) инъецировали в два противолежащих латеральных участка подкожно животным при ί=0 с последующей инъекцией красителя трипанового синего в том же самом участке при 30 мин, 60 мин и 24 ч. Площадь диффузии красителя при ί=15 мин регистрировали для каждой временной точки в сравнении с контролем.
b. Результаты.______________________________________________________________________
2 ЕДИНИЦЫ £ц после инъекции зНАЗЕСР СОЛЕВОЙ РАСТВОР (КОНТРОЛЬ) £ч после инъекции зНАЗЕСР
^0,5 ч = 183 £о,5 ч = 54
И1 ч = 167 £1ч = 50
£•22 ч = 61 Ё.22 ч = 48
Эти результаты показывают, что кожный барьер восстанавливается в пределах 24 ч введения 2 Единиц фермента.
Пример 18. Определение размера каналов, открываемых зНАЗЕСР.
Было показано, что зНАЗЕСР человека открывал каналы в интерстициальном пространстве, достаточные для создания возможности диффузии малой молекулы, т.е. красителя трипанового синего. Однако, неизвестно, какими были верхние границы размера частиц, которые могли диффундировать в присутствии зНАЗЕСР.
а. Протокол.
Флуоресцентные молекулы варьирующихся размеров использовали для определения размера каналов, открываемых зНАЗЕСР человека, флуоресцеинированные декстраны со средней молекулярной массой 4400 и 2000000 Да (З1дта), а также меченые флуоресцеином гранулы определенных диаметров от 20 нм до 500 нм (Мо1еси1аг РгоЬез), вводили подкожно в объеме 40 мкл со следующей инъекцией зНАЗЕСР или солевого раствора в качестве контроля в одних и тех же местах. Затем измеряли площадь фронта красителя в двух измерениях при 15 мин после инъекции.
- 102 011654
Ь. Результаты.
Агент Размер частиц Площадь при Стандартное
диффузии диффузионного 15 минутах отклонение
теста
зНАЗЕСР 4400 Да 84,2 25,7
Контроль 4400 Да 38,0 5,8
зНАЗЕСР 2х10б Да 141,2 4,5
Контроль 2х106 Да 51,7 8,1
зНАЗЕСР диаметр 20 нм 92,3 20,6
Контроль диаметр 20 нм 51,6 3,0
зНАЗЕОР диаметр 100 нм 61,0 5,7
Контроль диаметр 100 нм 40,0 7,0
зНАЗЕСР диаметр 200 нм 35,5 1,6
Контроль диаметр 200 нм 27,9 8,2
зНАЗЕСР диаметр 500 нм 44,8 13,6
Контроль диаметр 500 нм 41,2 9,8
Эти результаты показали, что молекулы с диаметром от приблизительно 1 кДа (Трипановый Синий) до 50 нм (Латексные гранулы) обнаруживали усиленную диффузию после введения κΗΑδΕΟΡ. Хотя бычий сывороточный альбумин (66 кДа) обнаруживал кинетику, сходную с кинетикой трипанового синего, латексные гранулы 50 нм требовали значительно большего времени для диффузии. Гранулы 500 нм не обнаруживали диффузии до 480 мин.
Пример 19. Профили сывороточной фармакокинетики биотинилированных антител после подкожной совместной инъекции κΗΑδΕΟΡ человека.
a. Протокол.
Самок мышей Βа1Ь/с анестезировали смесью кетамин/ксилазин. Затем мышей инъецировали подкожно 20 мкл 0,5 мг/мл раствора биотинилированного ЕС мыши, смешанного либо с 20 мкл солевого раствора, либо 20 мкл κΗΑδΕΟΡ, содержащими 4 Единицы активности.
b. Результаты. _____________________________________________________
ВРЕМЯ ПОСЛЕ ИНЪЕКЦИИ КОНТРОЛЬ зНАЗЕОР (4 Е)
1д<3 сыворотки С=0 ч 0 нг/мл 0 нг/мл
1дО сыворотки Ъ=2 ч 0 нг/мл 360 нг/мл
1дС сыворотки ϋ=51 ч 4152 нг/мл 4176 нг/мл
Эти результаты демонстрируют, что κΗΑδΕΟΡ увеличивает кинетику сывороточного распределения больших молекул в кровотоке. Когда небиотинилированный Ι§Ο не мог быть обнаружен в контрольной группе при 2 ч, 360 нг/мл наблюдали при 2 ч в группе κΗΑδΕΟΡ.
Пример 20. Активность распределения подкожно инъецированных молекул после внутривенной инъекции κΗΑδΕΟΡ человека.
a. Протокол.
Четыре места для инъекции красителя использовали на дозу каждого тест-материала и контроляносителя. Инъекцию красителя выполняли через 45 мин после ΐ.ν. инъекции. Каждую дозу тестматериала или контрольного материала инъецировали ΐ.ν. двум животным. Измерение площади окрашивания через 45 мин после введения фермента рассчитывали через 2,5, 5, 10 и 15 мин для каждой дозы или контроля-носителя.
b. Результаты.
Результаты показали, что высококачественный κΗΑδΕΟΡ был системно допустим дистальным тканям при внутривенном введении.
Активность распределения системно введенного κΗΑδΕΟΡ была зависимой от дозы, причем инъекция 10 Единиц является неотличимой от контроля-носителя.
- 103 011654
Тип Доза ί.ν. Время (минуты) Средняя площадь (мм2) Стандартное отклонение
РН20 1000 2,5 86,417 2,834193
РН20 1000 5 102,17 2,221146
РН20 1000 10 124,53 6,304944
РН20 1000 15 129,81 1,434319
РН20 300 2,5 59,137 7,218615
РН20 300 5 73,638 7,51197
РН20 300 10 87,092 8,686008
РН20 300 15 92,337 10,66466
РН20 100 2,5 56,308 7,741934
РН20 100 5 63,156 11,42052
РН20 100 10 76,519 16,18449
РН20 100 15 77,432 17,32264
РН20 30 2,5 50,534 10,64287
РН20 30 5 59,493 5,163971
РН20 30 10 68,102 11,00071
РН20 30 15 71,118 9,934212
РН20 10 2,5 36,4 3,807072
РН20 10 5 39,859 6,680932
РН20 10 10 45,649 4,44936
РН20 10 15 48,41 6,546835
Контроль 0 2,5 34,652 5,935037
Контроль 0 5 36,279 3,614544
Контроль 0 10 44,687 5,821216
Контроль 0 15 53,002 2,812439
Пример 21. Иллюстративное применение пэгилирования для генерирования модифицированного вНАЗЕОР, проявляющего улучшенную фармакокинетику.
В качестве иллюстративного примера применения ПЭГилирования для генерирования модифицированных форм вНАЗЕОР, имеющих улучшенную фармакокинетику, например, увеличенный полупериод существования в сыворотке, авторы изобретения присоединяли либо линейный, либо разветвленный полиэтиленгликоль (ПЭГ) к приводимому в качестве примера вНАЗЕОР, рекомбинантному РН20 (гНиРН20), описанному выше.
Ряд различных функционально активированных групп может быть использован для присоединения ПЭГ-групп к вНАЗЕОР, такому как гНиРН20 (включают с целью иллюстрации альдегиды, сукцинимиды, малеимиды и другие). Ряд различных реагентов ПЭГилирования является коммерчески доступным из различных источников, в том числе №к!аг ТЕегареибсв (\ν\ν\\.ηекιаг.сοт.), а также ряд других поставщиков (\ν\\\\.р|^агта.(^ο\ν.сοт, \ν\ν\ν.ηο 1^().^, \ν\ν\ν.в^ιηЬ^ο.сοт, \ν\ν\\.се1агев.сοт). Для целей иллюстрации, гНиРН20 был эффективно ПЭГилирован, как описано здесь, с использованием ряда иллюстративных реагентов ПЭГ для генерирования ряда различных ПЭГилированных ферментов гНиРН20. Аналогичные методологии были применены также к другим ферментам гиалуронидазы, включающим в себя иллюстративную полученную от животного гиалуронидазу (с использованием препарата овечьей тестикулярной гиалуронидазы, доступного в виде Витразы™ из КТА РЕагтасеи!1са1в), иллюстративную полученную из бактерий гиалуронидазу (с использованием препарата бактериальной гиалуронидазы, доступного в виде гиалуронатлиазы из З1дта) и иллюстративную полученную из бактерий хондроитиназу, имеющую гиалуронидазную активность (с использованием препарата бактериальной хондроитиназы АВС, доступного в виде хондроитиназы АВС из Аввοс^а!ев οί Саре ^й, ^с./Зе/кадвки Сο^рο^а!юη).
Кроме варьирования функциональной группы, доступными являются ПЭГ с различными длинами и структурами, которые могут быть включены с использованием конкретной функциональной группы. Для целей иллюстрации, ПЭГ с длиной в диапазоне 5-60 кДа (например, 5, 10, 20, 30, 40 и 60 кДа) были конъюгированы с гНиРН20. Опять множество различных ПЭГ, имеющих разные длины и структуры, являются легко доступными из таких источников, как №к!аг, Γ)ο\ν СКет1са1 ^φοι^οη (^)ο\νрI^агта), N0? ^φοι^οη, ЗипЬю, Се1агев и другие. В данной области известно большое количество ссылок, относящихся к реагентам ПЭГ и способам ПЭГилирования белков, в том числе ряд обзоров и статей, цитируемых в них; см., например, ^ЬеЛв, М.1. е! а1., А^уа^ей Г)гид Песету КехчехА 2002, 54: 459-476; Нагпв 1М аЫ Ζа1^рвку, З (ейв) οί β1χέο1), СЕет1в!гу аЫ Β^ο1οд^са1 АррЕся^^ АСЗ Зутрοв^ит
Зепев 680 (1997); Μекνаг, К е! а1. I. РНагт. РЕагтасеи!. Зск, 3(1): 125-136 (2000); Натв, 1М, №!иге Ке\че\Ав 2:215 е! вец. (2003); ТвиЬегу, Н., I Вю1. СНет 279(37): 38118-24 (2004); и другие, описанные в ряде ссылок, описывающих ПЭГилирование и различные реагенты и методологии (см., например, Μοηίа^й^η^, С е! а1., Β^οсοη^ида!е СНет. 6: 62-69 (1995); Vе^οηеве ЕМ е! а1., I. Вюас!гуе ^траНЫе Рο1уте^в 12: 197207 (1997); и целый ряд патентов США и других опубликованных патентов и заявок, в том числе 5672662; 5932462; 6495659 и 6737505; а также патенты США с номерами 4002531; 4179337; 5122614; 5183550; 5324844; 5446090; 5612460; 5643575; 5766581; 5795569; 5808096; 5900461; 5919455; 5985263; 5990237; 6113906; 6214966; 6258351; 6340742; 6413507; 6420339; 6437025; 6448369; 6461802; 6828401;
- 104 011654
6858736; Публикации заявок США 20010021763; 20010044526; 20010046481; 20020052430; 20020072573; 20020156047; 20030114647; 20030143596; 20030158333; 20030220447; 20040013637; 2005000360; 20050114037; 20050171328 и 20050209416; и Европейские публикации ЕР 01064951 и ЕР 08221199; и Публикации РСТ \\'0 00176640; \\'0 0002017; \\'0 0249673; \\'0 9428024 и \\'0 0187925 (каждая из этих публикаций включена здесь в качестве ссылки).
Пример 21-А. Иллюстративные ПЭГилированные версии рекомбинантных гиалуронидаз человека.
В качестве примера иллюстрации ПЭГилирования иллюстративных хНАБЕСР, альдегиды, сукцинимиды и карбонаты ПЭГ использовали для конъюгирования ПЭГ с гНиРН20. Из этих трех химических способов, сукцинимидил-ПЭГ обычно был наиболее удобным для применения в случае гНиРН20. Например, гНиРН20 конъюгировали с примерными реагентами сукцинимидил-моноПЭГ (мПЭГ), включающими в себя мПЭГ-сукцинимидилпропионаты (тРЕС-БРА), мПЭГ-сукцинимидилбутаноаты (тРЕСБВА) и (для присоединения «разветвленных» ПЭГ) мПЭГ-К-гидроксисукцинимид. Эти ПЭГилированные сукцинимидиловые эфиры содержат углеродные скелеты разной длины между ПЭГ-группой и активированным перекрестным линкером, и либо единственную, либо разветвленную ПЭГ-группу. Эти различия могут быть использованы, например, для обеспечения различных кинетик реакции и для потенциального ограничения сайтов, доступных для присоединения ПЭГ к гНиРН20 во время процесса конъюгации.
Сукцинимидил-ПЭГ (описанные выше), содержащие линейные или разветвленные ПЭГ-группы, конъюгировали с гНиРН20. С использованием композиций и способов, описанных в данной области, сукцинимидил-ПЭГ использовали для генерирования гНиРН20, воспроизводимо содержащего комбинацию молекул, имеющих три-шесть молекул ПЭГ на хНАБЕСР. Такие композиции ПЭГилированного гНиРН20 легко очищали с получением композиций, имеющих удельные активности гиалуронидазы приблизительно 25000 Единиц/мг белка, и они являются по существу не содержащими не-ПЭГилированного гНиРН20 (менее чем 5% не-ПЭГилированного гНиРН20). Как известно в этой области и описано, например, в ссылках, относящихся к ПЭГилированию, в том числе в ссылках, цитируемых выше, целый ряд реагентов и способов являются также доступными для получения монодисперсных, а не полидисперсных ПЭГ-продуктов (см., например, обзоры и ссылки, цитируемые в подробном описании выше, относящиеся к сайт- специфическому моноПЭГилированию и сайт-направленному ПЭГилированию).
Улучшения как фармакокинетики, так и фармакодинамики наблюдали в моделях животных после введения ПЭГилированного хНАБЕСР в сравнении с немодифицированной версией хНАБЕСР. Например, после внутривенного введения мышам либо 1000 Единиц немодифицированного гНиРН20, либо 1000 Единиц гНиРН20, конъюгированного с ПЭГ, имеющим молекулярную массу приблизительно 40 кДа (гНиРН20-РЕС40), наблюдали, что полупериод существования в сыворотке нейтрально активной гиалуронидазной активности (РН20) в сыворотке мышей, обработанных гНиРН20-РЕС40, был значительно более продолжительным (в 16-20 раз), чем полупериод существования в сыворотке мышей, обработанных немодифицированным гНиРН20. Кроме того, эффективность гНиРН20-РЕС40 сравнивали с неПЭГилированным гНиРН20 в модели инсульта крысы. Начальные результаты из этих исследований демонстрируют более высокую эффективность гНиРН20-РЕС40 (более чем 75-85% выживание в сравнении с менее чем 50% в контролях) в выживании крыс спустя 7 дней после индукции инсульта.
С использованием различных реагентов ПЭГ, доступных из №к!аг, авторы этого изобретения получили примерные версии рекомбинантных гиалуронидаз человека (в частности, предпочтительные ферменты на основе гНиРН20) с использованием тРЕС-БВА (30 кД), тРЕС-БМВ (30 кД) и разветвленные версии на основе тРЕС2-КНБ (40 кД), тРЕС2-КНБ (60 кД). Эти реагенты и многие другие доступны с различными молекулярными массами (см., например, 2005-06 №к1аг Ргобис! Саίа1οд, который является оперативно (он-лайн) доступным в 1Шр://\ν\ν\ν.ηекιа^.сοт или кΐίр://ννν.ηекΐа^.сοт/рбГ/ηекΐа^ саίа1οд.рбГ, ссылках в нем, причем эти каталог и ссылки включены здесь в качестве ссылки). Целый ряд других ПЭГреагентов и методологий являются доступными из других поставщиков и/или описаны в этой области.
В качестве иллюстрации, ПЭГилированные версии гНиРН20 были генерированы с использованием химического способа с КНБ, а также карбонатов и альдегидов, с использованием каждого из следующих реагентов, доступных из №к!аг: тРЕС2-КНБ-40К разветвленный (№к!аг #2х3у0Ю1); тРЕС-КНБ-10К разветвленный (№к!аг #2ζ3χ0Εο1-10); тРЕС-КНБ-20К разветвленный (№к!аг #2ζ3χ0Εο1-20); тРЕСКНБ-40К разветвленный (№к!аг #2ζ3χ0Εο1-40); тРЕС2-КНБ-60К разветвленный (№к1аг #2ζ3у0ν01); тРЕС-БВА-5К (Кекки #2т450к01); тРЕС-БВА-20К (Кекки #2М450р01); тРЕС-БВА-30К (Кекки #2М450г01); тРЕС-БМВ-20К (Кекки #2т4к0р01); тРЕС-БМВ-30К (Кеккаг #2т4к0г01); тРЕСбутиральдегид-30К (№к!аг #072М0В01); тРЕС-БРА-20К (№к!аг #2т4т0р01); тРЕС-БРА-30К (№к!аг #2т4т0г01) и РЕС-К1НБ-5К-биотин (Кек1аг #0Н0Н4НМ0Н02).
Авторы изобретения генерировали также ПЭГилированные версии гиалуронидаз (например, гНиРН20) с использованием ПЭГ -реагентов, доступных из ^ονрка^та, отделения Ωο\ν Скетка1 ^τρογιΙίοπ; в том числе гиалуронидазы, ПЭГилированные п-нитрофеникарбонат-ПЭГ (30 кДа) (^ονрка^та) и пропиональдегид-ПЭГ (30 кДа). Реагенты №к!аг и ^ονрка^та и их полученные продукты использовали и тестировали, по существу как описано ниже, для генерирования большого разнообразия композиций ПЭГилированных гиалуронидаз. Другие реагенты и другие гиалуронидазы могут быть сходным образом
- 105 011654 использованы в реакции с использованием аналогичных способов.
Для генерирования ПЭГилированных версий гНиРН20, очищенный фермент (в концентрации приблизительно 1-14 мг/мл) смешивали с молярным избытком каждого ПЭГ-реагента (обычно приблизительно при молярном избытке 10:1 ПЭГ:фермент) при рН и других условиях, рекомендованных для каждого из ПЭГ-реагентов или способов (обычно реакции альдегидов выполняли при рН приблизительно 4,5, реакции с ННЗ при нейтральном рН и реакции с карбонатами при рН приблизительно 9,5). Компоненты реакций взаимодействовали при перемешивании в течение приблизительно 16 ч при 4°С.
Для начального испытания продуктов реакции использовали электрофорез в ДСН-ПААГ. Обычно наблюдали, что немодифицированный гНиРН20 мигрирует в виде единственной полосы с молекулярной массой приблизительно 63 кДа. Различные ПЭГ илированные версии гНиРН20 обычно содержали полосу в диапазоне приблизительно 150-200 кДа (обычно приблизительно 18 0 кДа), а также нескольких полос, больших чем 200 кДа.
Затем авторы выполняли гель-фильтрацию модифицированных продуктов-ферментов с последующим определением ферментативной активности фракционированных белков. Вкратце, в соответствии со способами, известными в данной области, отделения ПЭГ-модифицированных гиалуронидаз от их соответствующих нативных немодифицированных форм выполняли гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Зирегоке 6 (СЕ/РНагтааа). Для этих отделений в качестве подвижной фазы использовали забуференный фосфатом солевой раствор со скоростью тока 0,2 мл/мин. Эту колонку калибровали с использованием калибровочных стандартов для гель-фильтрации из СЕ/РНагтас1а. Фракции, содержащие отделенные расщепляющие гиалуронан ферменты, анализировали на относительную гиалуронидазную активность при помощи модифицированного анализа мутности ИЗР, выполняемого в формате микротитрации (микроразведения). Объем удерживания пика (время) для ферментативной активности гНиРН20, фракционированной посредством гель-фильтрационной колонки Зирегоке 6, смещался от приблизительно 16 мл (средняя молекулярная масса приблизительно 60-80 кД) для немодифицированной гиалуронидазы, до приблизительно 10 мл (средняя молекулярная масса более чем 100000 кД приблизительно 670000 кД) для ПЭГ-модифицированной гиалуронидазы. По-видимому, ПЭГ-модификация может смещать всю измеримую ферментативную активность в модифицированные формы с более высокой молекулярной массой при реакции молярного избытка ПЭГ с этим ферментом.
Затем авторы изобретения испытывали ферментативную активность различных нативных и модифицированных ферментов при помощи зимографии (анализов расщепляющей гликозаминогликаны активности субстратным гель-электрофорезом). Вкратце, заливали содержащие гиалуронан гели для зимограммы для электрофореза в ДСН-ПААГ и анализы выполняли по существу в соответствии с процедурой, описанной Мшга К0, е! а1. Апи1ук1к ο£ д1усοκат^ηοд1усаη-бед^аб^ηд еηζутеκ Ьу киЬк!га!е де1 е1ес!гор1югек1к (ζутοд^аρйу). Лпа1 ВюсНет. 1995 Маг 1;225(2):333-40.
Нативная гиалуронидаза гНиРН20 демонстрировала гиалуронан-расщепляющую активность в гелях-зимограммах в виде единственной полосы со средней молекулярной массой приблизительно 60 кДа. ПЭГ-модификации гиалуронидазы гНиРН20 приводили к смещению гиалуронан-расщепляющей активности в гелях-зимограммах с ферментативно активными сигналами при приблизительно 180 кДа и по меньшей мере с 2 дополнительными полосами, имеющими ферментативную активность, с молекулярными массами, большими чем 200 кДа.
Эти результаты и другие, описанные здесь результаты, демонстрируют, что гликозаминогликаназы могут быть модифицированы ПЭГилированием (что может быть использовано для изменения их фармакокинетических и/или других профилей) с использованием большого разнообразия ПЭГ-реагентов и что полученные ферменты могут сохранять существенную ферментативную активность, делая их применимыми в любом из целого ряда различных применений - в частности, ίη νίνο или других применениях, в которых может быть полезной модификация этого фермента для пролонгирования его полупериода существования в сыворотке.
Пример 21-В. Иллюстративные ПЭГилированные версии гиалуронидаз не человека.
Хотя рекомбинантные гиалуронидазы человека являются особенно предпочтительными для применений, в которых этот фермент используется в ассоциации с клетками человека, и даже более предпочтительно, когда он применяется к телу человека или в теле человека, проиллюстрированные здесь способы могут быть также использованы для генерирования фармакокинетически улучшенных версий других ферментов гиалуронидазы, которые могут иметь подходящее применение в определенных обстоятельствах или средах. Таким образом, с использованием методологий, проиллюстрированных здесь и описанных в данной области для ферментов гиалуронидазы, авторы генерировали ряд модифицированных ферментов, которые являются ПЭГилированными (которые могут быть использованы для улучшения их фармакокинетики, как проиллюстрировано выше) и все еще сохраняют существенную ферментативную активность. Для целей иллюстрации, методологии, описанные и проиллюстрированные здесь, были применены к ряду различных примерных ферментов гиалуронидазы «не человека», в том числе иллюстративной полученной от животных гиалуронидазе, иллюстративной полученной из бактерий гиалуронидазе и иллюстративной полученной из бактерий хондроитиназе, имеющей гиалуронидазную активность. ПЭГилированные версии таких гиалуронидаз не человека, описанные здесь, могут быть использованы
- 106 011654 для эффективного обеспечения пролонгированных полупериодов существования в сыворотке (например, после внутривенного или другого 1п у1уо введения).
В качестве иллюстративного примера гиалуронидазы «не человека», полученной от животного, авторы генерировали ПЭГилированные версии овечьей тестикулярной гиалуронидазы (доступной в виде Уйга8е™ из КТА Рйагтаееийеа18). Витраза (гиалуронидаза для инъекции, лиофилизированная, овечья ΝΩί.’ 67425-001-01, 6200 Единиц И8Р/флакон), купленная в КТА Рйагтаееийеак, была подарена офтальмологом. Растворы витразы готовили воссозданием лиофилизированной витразы 0,9% инъекционным раствором хлорида натрия И8Р (Вах!ег).
В качестве иллюстративного примера гиалуронидазы «не человека», полученной из бактерий, авторы генерировали ПЭГилированные версии бактериальной гиалуронидазы, доступной в виде гиалуронатлиазы из 81дта. Гиалуронатлиазу из 81гер!отуее8 йуа1иго1у!1еи8 или другого вида, СА8 номер 9001-54-1, ЕС номер 4.2.2.1) (674 единицы/флакон) покупали из 81дта. Гиалуронатлиазу воссоздавали с использованием стерильно отфильтрованного забуференного фосфатом солевого раствора. См., например, Ойуа, Т, апй Капеко, Υ. ВюеЫт. Вюрйу8. Ае!а 198, 607, (1970).
В качестве иллюстративного примера хондроитиназы не человека, имеющей гиалуронидазную активность, авторы генерировали бактериальную хондроитиназу АВС (доступную в виде хондроитиназы АВС из А88ое1а1е8 оГ Саре Сой, Ыс.^е/кадаки Согрогайоп). Хондроитиназу АВС из Рго!еи8 уи1дап8 (хондроитин АВС-лиазу, хондроитин АВС-элиминазу, ЕС номер: 4.2.2.4, СА8 номер: 9024-13-9, кат. номер 100330 или 10033) приобретали из А88ое1а!е8 оГ Саре Сой, Ше. Растворы хондроитиназы АВС готовили в 0,1% растворе БСА. Ссылки включают в себя: (1) Уашада1а. Т., е! а1., 1. Вю1. Сйет., 243, 1523 (1968); (2) 8айо, Н., е! а1., 1. Вю1. Сйет., 243, 1536 (1968); (3) 8и8ик1, 8., е! а1., 1. Вю1. Сйет., 243, 1543 (1968) и (4) О1ке, Υ., е! а1., 1. Вю1. Сйет., 257, 9751 (1982).
В качестве иллюстративного ПЭГ-реагента авторы использовали мПЭГ-сукцинимидилбутаноат (доступный в виде тРЕС-8ВА (30 кД) из №е!аг). Хотя для этого примера использовали тРЕС-8ВА-30К (Ν-гидроксисукцинимидиловый эфир метоксиполи(этиленгликоль)бутановой кислоты, средняя молекулярная масса (М.\У.) 30000, Кат. № 2М450В01), другой Ν-гидроксисукцинимидиловый эфир метоксиполи(этиленгликоля) любой молекулярной массы или Ν-гидроксисукцинимидиловые эфиры поли(этиленгликоля) любой молекулярной массы или ПЭГ-альдегиды любого размера или ПЭГ-карбонаты любого размера или другие ПЭП-реагенты №к!аг или другие реагенты ПЭГилирования могут быть также использрваны. См., например, 2айр8ку, 8. апй С. Ьее, Ро1у(е!йу1епе д1уео1) Сйет181гу: Вю!еейшеа1 апй Вютей1еа1 Арр11еа!юп8, БМ. Наггш8, ей., Р1епит, ΝΥ, 1992, см. часть 21.
Для генерирования примерных ПЭГилированных версий полученных от животных гиалуронидаз флакон овечьей тестикулярной гиалуронидазы (витразы) воссоздавали 0,62 мл 0,9% солевого раствора (10 единиц/мкл) и 0,3 мл воссозданного раствора фермента переносили в стерильную пробирку. В эту пробирку, содержащую раствор витразы, добавляли тРЕС-8ВА-30К (9,9 мг), эту пробирку перемешивали, пока весь мПЭГ не растворялся, и затем этой смеси давали реагировать в течение приблизительно 16 ч при 4°С при перемешивании.
Для генерирования примерных ПЭГилированных версий полученных из бактерий гиалуронидаз одну ампулу гиалуронатлиазы 81дта воссоздавали 0,7 мл стерильно отфильтрованного забуференного фосфатом солевого раствора (~1 единица/мкл) и 0,3 мл воссозданного раствора фермента переносили в стерильную пробирку. В эту пробирку, содержащую раствор гиалуронатлиазы, добавляли тРЕС-8ВА30К (9,8 мг), затем эту пробирку перемешивали, пока весь мПЭГ не растворялся, и этой смеси давали реагировать в течение приблизительно 16 ч при 4°С при перемешивании.
Для генерирования примерных ПЭГилированных версий полученной из бактерий хондроитиназы один флакон хондроитиназы АВС (10 Единиц) воссоздавали 0,2 мл 0,9% солевого раствора и примерный ПЭГ-реагент, тРЕС-8ВА-30К (12,4 мг), добавляли в этот флакон, содержащий раствор хондроитиназы АВС, и перемешивали, пока весь мПЭГ не растворялся, и этой смеси давали реагировать в течение приблизительно 11 ч при 4°С при перемешивании.
Первоначальные анализы включают в себя применение электрофореза в ДСН-ПААГ для испытания модифицированных ферментов в сравнении с немодифицированными контролями. Вкратце, общий белок визуализировали окрашиванием либо Кумасси синим, либо серебром после разделения с использованием 3-8% Трис/ацетатных гелей NиРаде (Iπν^ί^одеπ). Молекулярные массы окрашенных полос определяли сравнением с белками-стандартами с известной массой, разделяемыми на том же самом геле.
Результаты с витразой были следующими: (А) витраза (немодифицированная), 5 полос приблизительно со следующими молекулярными массами (кДа): 90, 80, 63, 50 и 40; (В) ПЭГ-витраза, 7 полос приблизительно со следующими молекулярными массами (кДа): 150, 180 и пять полос с молекулярными массами, большими чем 200.
Результаты с хондроитиназой АВС были следующими: (А) хондроитиназа АВС (немодифицированная), 6 полос приблизительно со следующими молекулярными массами (кДа): 100, 80, 50, 38, 33 и 30; (В) ПЭГ-хондроитиназа АВС, 8 полос приблизительно со следующими молекулярными массами (кДа): одна-две полосы между 150-200 и шесть или более полос, больших чем 200.
- 107 011654
Результаты с гиалуронатлиазой были следующими: (А) гиалуронатлиаза (немодифицированная), одна полоса приблизительно со следующей молекулярной массой (кДа): 35; (В) ПЭГ-гиалуронатлиаза, четыре или более полос приблизительно со следующими молекулярными массами (кДа): большими чем 200.
Как было показано, активированный полиэтиленгликоль (например, тРЕС-ЗВА-30К (Νгидроксисукцинимидиловый эфир метоксиполи(этиленгликоль)бутановой кислоты, средняя молекулярная масса (МЭД) 30000) мог быть применен к овечьей гиалуронидазе (например, витразе), бактериальной хондроитиназе АВС (например, из Рго!еик уи1дапк) или бактериальным гиалуронатлиазам (например, из З£тер!отусек Ьуа1иго1уйсик) для индукции химических изменений в препаратах ферментов, что производит новые молекулы с увеличенной средней молекулярной массой, которая может быть ассоциирована с генерированием ПЭГилированных версий этих фермепнтов. Дополнительная характеристика этих продуктов обеспечила дополнительное доказательство не только того, что эти ферменты могли быть эффективно ПЭГилированы, но и того, что полученные ферментные продукты могут проявлять существенную ферментативную активность в расщеплении гиалуронана - демонстрируя, что ПЭГилирование может быть применено к различным типам ферментов (что может быть использовано для изменения их фармакокинетических профилей с сохранением одновременно существенной ферментативной активности).
Затем авторы выполняли гель-фильтрацию модифицированных ферментных продуктов с последующим определением ферментативной активности фракционированных белков. Вкратце, в соответствии со способами, известными в данной области, отделения ПЭГ-модифицированных гиалуронидаз от их соответствующих нативных немодифицированных форм выполняли гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Зирегоке 6 (СЕ/РЬагтааа). Для этих отделений в качестве подвижной фазы использовали забуференный фосфатом солевой раствор со скоростью тока 0,2 мл/мин. Эту колонку калибровали с использованием калибровочных стандартов для гель-фильтрации из СЕ/РНагтааа. Фракции, содержащие отделенные расщепляющие гиалуронан ферменты, анализировали на относительную гиалуронидазную активность при помощи модифицированного анализа мутности ИЗР, выполняемого в формате микротитрации (микроразведения). рН и буфер, используемые для анализа активности каждого из испытанных гиалуронан-расщепляющих ферментов, были такими, какие описаны в литературе, для каждого конкретного фенмента.
Максимальный объем удерживания (время) для ферментативной активности овечьей гиалуронидазы, фракционированной посредством гель-фильтрационной колонки Зирегоке 6, смещался от приблизительно 15,5 мл (средняя молекулярная масса приблизительно 60-80 кД) для нативной овечьей гиалуронидазы, до 9,5 мл (средняя молекулярная масса более чем 100000 кД-приблизительно 670000 кД) для ПЭГмодифицированной гиалуронидазы. По-видимому, ПЭГ-модификация может смещать всю измеримую ферментативную активность в модифицированные формы с более высокой молекулярной массой при реакции молярного избытка ПЭГ с этим овечьим ферментом.
Максимальный объем удерживания (время) для ферментативной активности бактериальной гиалуронатлиазы был приблизительно 16 мл (средняя молекулярная масса приблизительно 50-70 кД) после инжекции. ПЭГ-модифицированная гиалуронатлиаза, фракционированная гель-фильтрацией, не обнаруживала ферментативной активности ни в одной фракции. Отсутстие измеримой ферментативной активности включало фракции, в которых активность нативной гиалуронатлиазы в норме является измеримой, что позволяет предположить, что ПЭГ-модификация отрицательно влияла на функцию фермента.
ПЭГ-модифицированная хондроитиназа АВС демонстрировала максимальную ферментативную активность (пик) при приблизительно 11 и 13 мл после инжекции (средняя молекулярная масса приблизительно 200-600 кД) и снова при приблизительно 16 мл после инжекции (средняя молекулярная масса приблизительно 50-70 кД). Нативная хондроитиназа АВС имела ферментативную активность только при приблизительно 16 мл после инжекции. Эти результаты предполагают, что хондроитиназа АВС была ПЭГилирована, с сохранением ферментативной активности молекул с более высокой молекулярной массой, чем молекулярная масса нативных молекул.
Гель-фильтрация может быть использована для приближенной оценки степени ПЭГ-модификации на гиалуронан-расщепляющих ферментах; и анализ ферментативной активности фракционированных препаратов может быть использован для оценки действия ПЭГ-модификации на ферментативную активность гиалуронан-расщепляющих ферментов в отношении общей активности и молекулярной массы компонентов, демонстрирующих ферментативную активность.
Затем авторы испытывали ферментативную активность различных нативных и модифицированных ферментов при помощи зимогорафии (анализов гликозаминогликан-расщепляющей активности при помощи субстратного гель-электрофореза). Вкратце, заливали содержащие гиалуронан гели для зимограммы для электрофореза в ДСН-ПААГ и анализы выполняли по существу в соответствии с процедурой, описанной Мшга КО, е! а1. Апа1ук1к о£ д1усокатшод1усап-бедгабшд епхутек Ьу киЬк!га!е де1 е1ес!горйогек1к (хутодгарНу). Апа1 ВюсНет. 1995 Маг 1; 225(2):333-40.
Нативная овечья гиалуронидаза демонстрировала гиалуронан-расщепляющую активность в геляхзимограммах, идентифицирующих первично 2 полосы активности при приблизительно 60 и 90 кД с некоторым размазыванием ферментативной активности между этими молекулярными массами. Не наблю
- 108 011654 дали ферментативной активности при больших молекулярных массах, чем 100 кД. ПЭГ-модификации овечьей гиалуронидазы приводили к смещению гиалуронан-расщепляющей активности в геляхзимограммах с ферментативно активными сигналами при приблизительно 150 кДа и по меньшей мере с 2 дополнительными полосами, имеющими ферментативную активность, с молекулярными массами, большими чем 200 кДа.
Нативная хондроитиназа АВС демонстрировала единственную полосу гиалуронан-расщепляющей активности в гелях-зимограммах, демонстрирующую молекулярную массу приблизительно 80-90 кД. ПЭГ-модификация хондроитиназы АВС демонстрирует смещение в гиалуронан-расщепляющей активности в гелях-зимограммах, с ферментативно активными сигналами при приблизительно 180 кДа и по меньшей мере с одной дополнительной полосой активности с молекулярной массой, большей чем 200 кДа.
Таким образом, зимографический анализ подтвердил, что примерная полученная от животного гиалуронидаза (витраза) и примерная полученная из бактерий хондроитиназа, имеющая гиалуронидазную активность (хондроитиназа АВС), могут быть модифицированы ПЭГилированием (что может быть использовано для изменения их фармакокинетического профиля, как проиллюстрировано выше в отношении рекомбинантной гиалуронидазы человека) и что полученные модифицированные ферменты могут все еще проявлять существенную ферментативную активность.
Как будет понятно специалистам в данной области в связи с предыдущими примерами, другие гиалуронидазы (как гиалуронидаза человека, так и другие рекомбинантные версии, описанные здесь, а также другие гиалуронидазы животного «не человека» или бактерий, прокариотические или другие гиалуронидазы, а также хондроитиназы) могут быть также модифицированы с использованием любого из ПЭГ-реагентов, которые известны в данной области или заново обнаружены, для генерирования модифицированных ферментов, имеющих измененные фармакокинетические и/или другие профили, что делает их полезными для конкретных применений.
Пример 22. Иллюстративное применение κΗА8ЕСΡ для стимуляции распределения фармакологического агента с малой молекулой ίη νίνο.
В качестве иллюстративного примера применения композиций κΗА8ЕСΡ этого изобретения для стимуляции распределения или диффузии фармакологических агентов в органы и ткани или в органах и тканях млекопитающего авторы изобретения оценивали применение гЧиРЖО для стимуляции проникновения дексаметазона (бех, противовоспалительного агента, используемого в качестве примера фармакологического агента с малой молекулой) в ткани глаза млекопитающего ίη νίνο.
Для инъекции агентов, таких как анестетики, в глаз млекопитающего, обычно используемые периорбитальные способы для достижения анестетических блоков, включают в себя перибульбарные, ретробульбарные инъекции и инъекции под тенонову капсулу. Для этого иллюстративного примера, авторы сравнивали инъекции дексаметазона (бех) под тенонову капсулу с одновременным или без одновременного введения κΗА8ЕСΡ, в эписклеральное пространство, и затем определяли концентрации бех в тканях задней части глаза, в частности, хороидального и ретинального слоев, которые являются важными мишенями, но часто труднодоступными для фармакологических агентов.
Самцов Ново-Зеландских рыжих кроликов (приблизительно 2,1-3,2 кг) использовали и помещали под общую анестезию с использованием внутримышечных инъекций гидрохлорида кетамина (21 мг/кг) и гидрохлорида ксилазина (5,25 мг/кг). Для анестезии поверхности глаза использовали топический 0,5% пропакаин. Зрачки расширяли 1% тропикамидом и 2,5% фенилэфрином. После открывания конъюнктивы правого глаза каждого кролика с использованием ножниц Ваннаса, кончик анестетической канюли Медеза с тремя отверстиями (Еад1е ^аЬο^аΐο^^еκ, ΕαικΕο Сиса^^а, СА) вставляли в эписклеральное пространство и 1,5 мл либо одного бех (АтеНсав РНагтасеиЕса1 РегЕ1егк, η=18), либо бех плюс кЦА8ЕСР (3000 единиц ШиРМО, η=18) инъецировали рядом с задним полюсом глаза. Аппликатор с ватным кончиком помещали в месте вхождения в конъюнктиву для предотвращения выхода жидкости.
При 1, 2, 3 или 6 часах после инъекции кроликов анестезировали, как описано выше, и умерщвляли внутрисердечной инъекцией пентобарбитал-натрия (120 мг/кг). После эвтаназии брали пробу крови 1 мл и оба глаза энуклеировали из каждого животного. Сразу же после энуклеации брали пробу 2 мл внутриглазной жидкости и помещали в помеченные пробирки Эрленмейера. Оставшуюся часть глаза иссекали и использовали трепан (трефин) 6 мм (Рте 8с1еасе Т^к, Ро^ег Сйу, СА) для перфорирования нижней части пробы ткани до зрительного нерва, где лекарственное средство инъецировали на внесклеральной стороне. Из этой перфорированной ткани выскребали сетчатку тупым лезвием и помещали в помеченную пробирку, как это делали с хороидом. Для оценки уровней бех в тканях с минимальными пределами количественного определения порядка 5 нг/мл использовали макс-спектрометрию. Для проб хороида и сетчатки буфер, содержащий 50 мМ Трис-основание, 1 мМ МдС12, ρΗ 9,0, добавляли к ткани таким образом, чтобы конечная концентрация была равна 20 мг/мл. Ткань разрушали при помощи ультразвукового гомогенизатора (Β^ο^οд^сκ. 1пс., тοбе1 150 В/Т) в течение 5-15 с. Пробы гомогената ткани, жидкости стекловидного тела, внутриглазной жидкости и плазмы анализировали с использованием следующей процедуры. Пробы, содержащие дексаметазон и преднизолон, в качестве внутреннего стандарта (1.8.) экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром с использованием вихревого перемешивания (вортекса) в
- 109 011654 течение 5 мин. Органический и водный слои разделяли центрифугированием при 1300 д в течение 5 мин, водный слой замораживали при -70°С в течение 15 мин, а органический слой выливали в новые пробирки и упаривали под током азота при 40°С. Остаток воссоздавали смесью вода:ацетонитрил (50:50 об./об.). Эти обработанные пробы анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием колонки РНепотепех Зупегу Ро1аг ВР, поддерживаемой при 45°С. Подвижную фазу распыляли с использованием нагретого азота ионизацией электрораспылением и с системой защиты от загрязнений Ζ-кргау и ионизированные соединения детектировали с использованием тандемного квадрупольного масс-спектрометра. Высоты пиков дексаметазона и преднизолона получали и интегировали с использованием программного обеспечения МаккЬупх™, Мюготакк, Веνе^1у, МА. Калибровочные кривые получали подставлением отношений высот пиков стандартов к внутреннему стандарту в уравнение мощности в МаккЬупх™. Затем это уравнение калибровочной кривой использовали для интерполяции концентрации дексаметазона в пробах с использованием их отношений высот пиков.
Результаты масс-спектрометрии выявили, что хороидальные, ретинальные уровни и уровень в стекловидном теле дексаметазона кроликов, обработанных только дексаметазоном, достигали максимальных концентраций в первой временной точке (т.е. спустя 1 ч после инъекции); в то время как хороидальные и ретинальные уровни концентраций дексаметазона кроликов, которые одновременно получали кНАЗЕОР, были более высокими и продолжали увеличиваться до второй временной точки (т.е. 2 ч после инъекции). Максимальные хороидальные, ретинальные уровни и уровни в стекловидном теле были приблизительно в 10 раз, 5 раз и 8 раз более высокими, соответственно, в тканях, которые были обработаны кНАЗЕОР, а площади под кривой (АИС) были также по меньшей мере на 50% более высокими.
Эти результаты указывают на то, что введение кНАЗЕОР может быть использовано для существенного увеличения доставки фармакологических агентов, таких как дексаметазон, даже в относительно труднодоступные ткани ш νίνΌ, такие как сегменты задней части глаза млекопитающих. Кроме того, поскольку относительно толстый склеральный слой образует тканевой барьер между суб-теноновым пространством инъекции и хороидальным и ретинальным слоями-мишенями, высокие уровни фармакологического агента, доставляемые к последним слоям, свидетельствуют о том, что кНАЗЕОР может быть использован для эффективного увеличения доставки фармакологических агентов через слои тканей в теле.
Таким образом, в случае стимуляции трансклеральной доставки, кНАЗЕОР может быть нанесен в минимально инвазивной процедуре для стимуляции доставки агентов, используемых для лечения состояний, поражающих заднюю сторону глаза, которые представляют особый интерес в целом ряде ситуаций глазных заболеваниий. Например, это может обеспечивать менее инвазивный способ доставки для лечения хороидального новообразования сосудов (т.е. посредством введения стероидов), дегенерации желтого пятна и других заболеваниий, поражающих эти ткани, которые обычно лечат посредством интравитреальной инъекции. Имеется большое разнообразие агентов, используемых в настоящее время для этих состояний, таких как, но не только, дексаметазон, триамцинолон, Макуген™ и антагонисты УЕОР.
Кроме ферментативных активностей кНАЗЕОР, которые способствуют распределению в контексте способов доставки, таких как введение через инъекцию под теноновой капсулой, авторы считают также, что введение кНАЗЕОР в объеме жидкости, которая эффективно заполняет или расширяет пространство ткани, в которое ее вводят, генерирует положительные гидростатические давления, которые дополнительно ускоряют доставку жидкостей и агентов, содержащихся в них, в окружающие ткани (например, стимуляцией конвективного транспорта).
Пример 23. Иллюстративное применение кНАЗЕОР для уменьшения давления интерсцитиальной жидкости опухоли посредством этого усиления чувствительности опухоли к противоопухолевым фармакологическим агентам.
Как описано и проиллюстрировано здесь, кНАЗЕОР могут быть использованы для генерирования интерстициальных каналов, которые могут увеличивать поток жидкости и облегчать доставку фармакологических и других агентов в желаемые участки ткани ш νί\Ό. Опухоли предоставляют особенно важную проблему нацеливания для ряда известных и постоянно развиваемых фармакологических агентов, в частности, противоопухолевых агентов, антиметаболитов, антиангиогенных агентов и различных цитотоксических и цитостатических агентов. Проблемы, ассоциированные с нацеливанием таких фармакологических агентов на участки опухолей ш νίνΌ, обостряются тем фактом, что многие опухоли обнаруживают увеличенные интерстициальные давления, которые имеют тенденцию затруднения инфузии вводимых фармакологических агентов, особенно к участкам, находящимся глубоко в массе опухоли. Авторы считают, что кНАЗЕОР могут уменьшать это сопротивление и, следовательно, облегчать доставку любого из целого ряда известных и заново разрабатываемых агентов в опухоли, делая их посредством этого более чувствительными к конкретной дозе и поддающимися лечению конкретной дозой фармакологического агента. В этом отношении, было показано, что кНАЗЕОР данного изобретения способны стимулировать образование интерстициальных каналов и увеличивать дипергирование (рассеяние) маркеров различных размеров, описанных здесь. Кроме того, авторы наблюдали, что кНАЗЕОР могут быть использованы для увеличения гидравлической проводимости интерстициальных тканей более чем в десять раз.
- 110 011654
В качестве подтверждения этих принципов в связи с опухолевыми клетками, применение примеров зНА8ЕСР (гНиРН20, 50 единиц) к опухолевым тканям ίη νί!ΐΌ привело к существенному удалению околоклеточных матриксов, которые, как считают, являются основным фактором увеличенного давления интерстициальной жидкости опухоли.
Кроме того, введение гНиРН20 ίη νίνΌ, в модели трансплантата опухоли человека, приводило к значительному уменьшению давления интерстициальной жидкости опухоли в пределах одного часа введения.
Как описано в подробном описании этого изобретения выше, зНА8ЕСР данного изобретения могут быть применены в комбинации с любым из ряда известных и вновь развиваемых противоопухолевых агентов для применения в лечении различных раковых заболеваний.
Пример 24. Иллюстративное применение зНА8ЕСР для увеличения фармакокинетики макромолекулы, доставляемой не-Ιν парентеральной инъекцией.
Как описано выше, зНА8ЕСР могут быть использованы для модуляции фармакокинетики известных или вновь развиваемых фармакологических и других агентов, например, облегчением их абсорбции и/или распределения организмом. Такие улучшенные параметры фармакокинетики могут быть, в свою очередь, использованы для улучшения фармакодинамики конкретного агента (например, уменьшения локальной токсичности посредством снижения количества агента, оставшегося вблизи участка инъекции, и/или увеличения эффективности посредством увеличения количества агента, доставляемого к желаемой мишени (и/или через желаемую мишень)). Альтернативно, поскольку зНА8ЕСР могут быть использованы для эффективного запуска диспергирования (рассеяния) локально введенного фармакологического агента (например, через участок инъекции и в кровоток), можно также использовать эти зНА8ЕСР для существенного улучшения фармакокинетики абсорбции и достижения сходной фармакодинамики с уменьшенным количеством применяемого агента.
В качестве иллюстративного примера применения зНА8ЕСР для увеличения фармакокинетики макромолекулярного лекарственного средства, которое обычно вводят невнутривенной парентеральной инъекцией, авторы комбинировали рекомбинантный РН20 человека (гНиРН20) с ПЭГилированной версией интерферона альфа-2Ь (РЕС-ЮТК0Шм, доступного из 8с11еппд-Р1оид11). РЕС-ЮТКШ является макромолекулой приблизительно 31 кД, которую обычно вводят подкожной инъекцией для лечения вируса Гепатита С (НОУ) (обычно в комбинации с лекарственным средством рибавирином). Подобно многим макромолекулам, вводимым подкожно, РЕС-INΤКОN относительно медленно абсорбируется, и существенная часть этого агента никогда не доходит в кровоток, с биодоступностью порядка 50-60%. Кроме того, существенная доля пациентов (обычно более половины) развивают различные реакции места инъекции, предположительно как результат сохраняющихся локальных концентраций или обострение сохраняющимися локальными концентрациями этого фармакологического агента. Как понятно специалистам в данной области, последствия такой фармакокинетики увеличиваются в несколько раз и включают в себя не только «вымывание» агента, заключенного вблизи места инъекции, но также реакции на локально метаболизируемое соединение.
Авторы этого изобретения вводили меченый иодом-125 РЕС-INΤКОN различными способами введения, с одновременным введением или без одновременного введения гНиРН20, для испытания действий гНиРН20 на фармакокинетические параметры РЕС-Г№ТК0К Для определения абсолютной биодоступности гНиРН20 авторы измеряли также фармакокинетические параметры РЕС-ШТК0Н вводимого внутривенным введением.
Вкратце, восемнадцать крыс 8ргадие-Оа^1еу (каждая с массой приблизительно 225-250 г) делили на три группы их шести животных каждая. Первой группе вводили тест-материал (т.е. меченый Ι-125 РЕСШТК0№) внутривенным введением (1,5 мкг/кг в объеме 100 мкл посредством инъекции через хвостовую вену). Удельная активность Ι-125-меченого интерферона была равна 55 мкКи/мкг. Пробы крови (100 мкл) собирали перед введением дозы и при 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 и 120 часах после введения дозы и обрабатывали для определения количества меченого лекарственного средства гамма-счетом (выраженным в виде импульсов в минуту (имп/мин) на грамм плазмы). Второй группе из шести животных вводили эквивалентные дозу и объем тест-материала интрадермальной инъекцией в обритое и подготовленное пятно на обратной стороне шеи и пробы крови обрабатывали, как описано для первой группы. Третьей группе из шести животных вводили эквивалентную дозу тест-материала с гНиРН20 (100 М.Е.) в объединенном объеме 100 микролитров интрадермальной инъекцией, как в предыдущей группе, и пробы крови обрабатывали затем, как описано для первой и второй групп. Результаты этого исследования показаны ниже в табл. 24-1.
- 111 011654
Таблица 24-1
Действия зНА8ЕСР на фармакокинетический профиль интерферона
Время (часы) ΡΕΟ-ΙΝΤΚΟΝ (1,5 мкг/кг) интрадермально Стандартное отклонение ΡΕ3-ΙΝΤΚ0Ν (1,5 мкг/кг) + зНАЗЕСР 100 Е интрадермально Стандартное отклонение РЕС-ΙΝΤΚΟΝ (1,5 мкг/кг) внутривенно
0,5 30289 9989 54808 12995 281781
1 43137 9434 76672 17570 185630
2 54655 11128 102159 17626 155591
3 55261 11055 115329 24910 128656
6 61214 15528 118364 23817 93065
8 59277 14704 110443 21735 79275
12 46696 12752 85710 28078 58457
24 16233 6595 26047 9006 16966
36 7954 1777 12498 1762 9277
4 8 3862 499 5517 1030 5847
дис 1222952 2212583 1910723
Максимальная концентрация (Смакс) 61214 118364
Максимальное время (Тмакс) 6 6
Абсолютная биодоступность 64% 116% 100%
Как видно в табл. 24-1, биодоступность примера фармакологического ΡΕС-INТВОN (оцениваемая по АИС) значительно улучшалась при объединении интрадермального введения дозы с дозой зНА8ЕСР. Действительно, абсолютная биодоступность, достигаемая интрадермальным введением дозы в комбинации с зНА8ЕСР, была статистически неотличимой от прямого внутривенного введения, где весь этот материал доставлялся непосредственно в кровоток. Таким образом, применение зНА8ЕСР в комбинации с фармакологическим агентом, который вводят не-ГУ парентеральным введением, может обеспечивать уровни доставки, сравнимые с введением непосредственно в кровоток. Хотя Тмакс является обязательно более продолжительным после ΙΌ-введения (так как некоторое время является необходимым для того, чтобы агент достиг кровотока), в пределах нескольких часов после ΙΌ-введения дозы с зНА8ЕСР концентрации агента в кровотоке по существу достигают концентраций, достигаемых Ιν-введением дозы, и после этого явно превышают их.
Пример 25. Иллюстративное применение зНА8ЕСР для облегчения интрадермальной доставки макромолекулы, обычно доставляемой внутривенной инъекцией.
Как обсуждалось выше, зНА8ЕСР могут быть использованы для облегчения доставки известных или вновь разрабатываемых фармакологических и других агентов различными способами введения, которые могут обеспечивать большие удобства, безопасность, уменьшенные расходы и/или другие преимущества. В качестве иллюстративного примера такого модулирования, авторы использовали зНА8ЕСР для облегчения интрадермальной доставки макромолекулярного лекарственного средства, которое обычно вводят внутивенной инъекцией. Для этого конкретного примера, авторы комбинировали рекомбинантный РН20 человека (гНиРН20) с химерным человек-мышь анти-ТNΕα-моноклональным антителом (Инфликсимабом, доступным в виде ВЕМЮАОЕ™ из Сеп!осог). ВЕМЮАОЕ является макромолекулой приблизительно 150 кД, которую обычно вводят внутривенной инъекцией для лечения артрита или болезни Крона. Таким образом, введение КЕМЮАОЕ обычно требует вовлечения внутривенного доступа и сопутствующей профессиональной помощи и рисков, а также требует периода времени порядка двух часов для каждого введения дозы.
КЕМЮАОЕ (20 мг/мл) метили 125Ι до удельной активности 10 мкКи/мг. Восемнадцать крыс делили на три группы из шести животных, каждая, и вводили им смесь радиоактивного и нерадиоактивного ВЕМЮАОЕ (в целом 10 мг/кг) в конечном объеме 100 мкл (ί) внутривенным введением, (ίί) интрадермальным введением или (ίίί) интрадермальным введением в комбинации с 100 Единицами зНА8ЕСР (из исходного раствора 100000 Е/мл); и затем кровь и ткани обрабатывали гамма-счетом в различных точках после введения дозы по существу, как описано для предыдущего примера. Эти результаты суммированы в таблице.
- 112 011654
Таблица 25-1
Действия кНАБЕСР на фармакокинетические параметры РЕМЮАОЕ
Время (часы) ИМП/МИН НЕМ1САЦЕ (10 мг/кг) интрадермально Стандартное отклонение ИМП/МИН НЕМ1САЦЕ (10 мг/кг) + зНАЗЕСР 100 Е интрадермально Стандартное отклонение ИМП/МИН КЕМ1САЦЕ (10 мг/кг) внутривенно
0,5 27451 2221 94888 31318 1657849
1 37213 10775 146793 42014 1645571
2 66001 6078 412047 61240 1576145
4 120704 21744 691626 89002 1260646
8 256987 32459 833826 133887 1157268
24 493004 75694 853423 65777 790357
48 515439 53431 728302 74848 684599
72 454717 54388 640303 81492 558307
96 375993 39744 598413 59533 496658
120 336067 66964 518861 53643 434008
дис 53350555 118424609 82718550
Максимальная 515439 853423 1657849
концентрация
(С„„с)
Максимальное 48 24 0
время (Тмакс)
Абсолютная 62% 121% 100%
биодоступность
Как можно видеть в табл. 25-1, биодоступность примера фармакологического ИЕМ^АОВ (оцениваемая по АиС) значительно улучшалась при объединении интрадермального введения дозы с дозой кНАБЕСР. Как наблюдали с увеличенной доставкой РЕС-ШТРОН общие уровни биодоступности ВЕМЮАОЕ с интрадермальным введением дозы в комбинации с кНАБЕСР, были статистически сходными с общими уровнями внутривенного введения при доставке всего материала непосредственно в кровоток. Хотя Тмакс является обязательно более продолжительным после ГО-введения в сравнении с Ш-введением, в пределах двадцати часов после Ш-введения дозы с кНАБЕСР концентрации агента в кровотоке превышали концентрации, наблюдаемые в случае Ш-введения дозы, и после этого приближались к концентрациям IV или превышали их. В сравнении с Ш-введением дозы без кНАБЕСР, наблюдаемое Тмакс достигалось приблизительно в 2 раза более быстро с кНАБЕСР (24 часа против 48 часов); и как Смакс, так и биодоступность (АиС) существенно увеличивались (приблизительно на 65% и 95%, соответственно).
Пример 26. Иллюстративное применение кНАБЕСР для облегчения интрадермальной доставки более крупного макромолекулярного комплекса, обычно доставляемого не-Ш парентеральной инъекцией.
В качестве другого иллюстративного примера применения кНАБЕСР для улучшения фармакокинетики макромолекулярного лекарственного средства, которое обычно вводят невнутривенной парентеральной инъекцией, авторы комбинировали рекомбинантный РН20 (гНиРН20) с рекомбинантным фактором VIII человека (ВЕСОМВГЫАХГЕ™, доступным из Вах!ег). Фактор VIII является большим гликопротеиновым комплексом, содержащим множественные полипептиды, и имеет объединенную молекулярную массу приблизительно 280 кД. Фактор VII вводят обычно только внутривенной инъекцией для лечения гемофилии. Подобно многим макромолекулам, вводимым подкожно, фактор VIII относительно медленно абсорбируется, и значительная часть этого агента никогда не достигает кровотока, с биодоступностью порядка 0,5-1%.
Восемнадцать крыс делили на три группы из шести животных, каждая, и вводили им смесь ι:'Ίмеченого фактора VIII (1) внутривенным введением, (ίί) интрадермальным введением или (ш) интрадермальным введением в комбинации с кНАБЕСР; и затем кровь и ткани обрабатывали в различных точках после введения дозы для измерения импульсов в минуту (имп/мин) на грамм плазмы по существу, как описано для предыдущего примера.
- 113 011654
Таблица 26-1
Действия гНиРН20 на фармакокинетику фактора VIII
Время (часы) ИМП/МИН фактор VIII (50 МЕ/кг) интрадермаль но Стандартное отклонение ИМП/МИН фактор VIII (50 МЕ/кг) + ВНАЗЕСР 100 Е интрадермально Стандартное отклонение ИМП/МИН фактор VIII (10 МЕ/кг) внутривенно
0,5 29748 12002 46376 5503 670743
1 43767 9415 70249 14614 379558
2 49507 14592 72736 14985 247397
3 56087 17621 76631 14454 200602
4 55494 12721 84066 8646 177846
5 55277 14181 79735 9363 165914
Ό 50195 ί ·> ап л / V пп ι пс ί х х / и С о л о 121198
8 52290 13707 66419 10495 114579
12 48336 10765 58817 11760 75912
24 23173 4700 24596 4426 29610
лис 1014521 1303078 2554607
Максимальная концентрация (Смаке) 56087 84066
Максимальное время (Тмакс) 4 4
Абсолютная биодоступность 39,7% 51% 100%
Как показано в табл. 26-1, совместное введение фактора VIII с гНиРН20 значимо увеличивало системную биодоступность в отношении одного фактора VIII (Р<0,01). Применение осаждения с использованием ТХУ было необходимым для устранения вклада полностью расщепленного '^-меченого белка фактора VIII, входящего в кровоток.
Пример 27. Иллюстративное применение кНАЗЕОР для улучшения выживания и/или поведенческих последствий после инсульта.
В первой серии исследований кНАЗЕОР оценивали в крысиной модели инсульта. Вкратце, инсульт хирургическим путем индуцировали в крысах Зргадие-ЭаЮеу окклюзией церебральной артерии с последующим внутривенным введением в разных точках времени либо контрольного раствора (солевого раствора), либо тест-раствора (солевого раствора, содержащего кНАЗЕОР). Животным давали восстановиться и затем их подвергали наблюдению на протяжении некоторого периода времени для оценки коэффициентов выживаемости в контрольной группе в сравнении с тест-группой. Кроме того, выживших животных оценивали на протяжении диапазона временных точек с использованием множественных анализов поведенческих состояний, обычно ассоциированных с инсультом. Только крыс, которые вели себя нормально в исходном тесте сгибания передней конечности, включали в это исследование, и затем их случайным образом относили к контрольной группе или тест-группе животных.
Асептические хирургические процедуры выполнялись ΖίνΚ ЕаЬога!опек по существу следующим образом. Крыс анестезировали в камере с подачей 2,5% галотана. Делали брюшной срединный разрез и мускуратуру отделяли для обнажения правой наружной сонной артерии, которую затем выделяли и дважды лигировали. Затем нестянутую, но сдавливающую полиамидную лигатуру 5/0 накладывали вокруг культи наружной сонной артерии. Прорезали небольшое отвестие в просвет этой культи и в этот просвет вставляли шовный материал 4/0 микронить длиной 18-20 мм и продвигали его во внутреннюю сонную артерию. При полном продвижении интернализованный кончик этой хирургической мононити должен блокировать кровоток в среднюю церебральную артерию. Затем сдавливающую полиамидную лигатуру затягивают для закрепления этой хирургической мононити. Ретракцию удаляют и кожный разрез закрывают раневым зажимом.
Внутривенные инъекционные процедуры выполняли по существу следующим образом. Крыс анестезировали в камере с подачей 2,5% галотана. Делали брюшной разрез для обнажения яремной вены. На стерильный одноразовый шприц на 1 мл надевали иглу 30-го калибра и набирали в шприц инъекционный материал. С использованием ключицы для опоры этот шприц вставляли в яремную вену (с применением небольшого отрицательного давления на шприц для оттягивания кровотока в шприц для подтверждения посредством этого правильного помещения шприца для ГУ-инъекции) и затем инъекционный материал медленно инъецировали в яремную вену. После инъекции иглу медленно вытаскивали (и любое кровотечение контролировали с использованием стерильного ватного аппликатора) и затем кожный разрез закрывали раневым зажимом.
Выживание животных в различных группах (приблизительно 40 животных в каждой группе) подвергали мониторингу после индукции инсульта, и затем количество выживших животных в каждый день строили в виде кривой в зависимости от дня после инсульта для построения кривой инсульта КапланаМайера. Значительные различия между группами были очевидными на 3-ий день после инсульта. Через одну неделю после индукции инсульта более половины контрольных животных умерли, тогда как почти три четверти обработанных кНАЗЕОР животных выжили, что было статистически значимым различием (р=0,03).
- 114 011654
Кроме измерения коэффициентов выживания после инсульта, выживших животных испытывали также (через 1, 2, 3 и 4 недели после инсульта) с использованием других анализов, предназначенных для оценки встречаемости определенных поведенческих проблем, ассоциированных с инсультом. Оцениваемые поведенческие состояния включали в себя сгибание передней конечности, изогнутое туловище, нарушения походки и ходьба по стенке, которые использовали для генерирования поведенческого балла РМЕСЗ (причем более высокие баллы отражают увеличение поведенческих проблем, ассоциированных с инсультом). На второй неделе после индукции инсульта зНАЗЕСР-обработанные животные обнаруживали значимо более высокие оценки (баллы) (р=0,02) и относительные различия между обработанной группой и контролем были еще более высокими на протяжении последующих недель (р=0,007 и р=0,003 для недель 3 и 4 соответственно).
Хотя это изобретение было описано со ссылкой на приведенные выше примеры, должно быть понятно, что модификации и вариации охватываются идеей и объемом этого изобретения. Таким образом, это изобретение ограничивается только следующей формулой изобретения.

Claims (72)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ доставки фармакологического или другого агента в ткань, включающий введение растворимой нейтрально-активной гиалуронидазы (зНАЗЕСР) в ткань-мишень; и введение фармакологического или другого агента в ткань, где фармакологический или другой агент выбран из следующих: Адалимумабы, Агалзидазы Бета, Алефацепты, Ампициллины, Анакинры, Антиполиомиелитные Вакцины, Антитимоциты, Азитромицины, Бекаплермины, Каспофунгины, Цефазолины, Цефепимы, Цефотетаны, Цефтазидимы, Цефтриаксоны, Цетуксимабы, Циластатины, Клавулановые кислоты, Клиндамицины, Дарбепоэтины Альфа, Деаклизумабы, Дифтерия, Дифтерийные антитоксины, Дифтерийные Токсоиды, Эфализумабы, Эпинефрины, Эритропоэтины Альфа, Этанерцепты, Филграстимы, Флуконазолы, Фолликулостимулирующие гормоны, Фоллитропины Альфа, Фоллитропины Бета, Фосфенилоины, Гадодиамиды, Гадопентетаты, Гатифлоксацины, Глатирамеры, СМ-СЗР, Гозерелины, ацетаты Гозерелина, Гранисетроны, НаеторЫ1из ίηΠικηζη В, Галоперидолы, Вакцины Гепатита, Вакцины Гепатита А, Вакцины Гепатита В, Ибритумомаб-Тиуксетаны, Ибритумомабы, Тиуксетаны, Иммуноглобулины, Вакцины НаеторЫ1из тЛиета, Вакцины вируса гриппа, Инфликсимабы, НИМА^С™, НИМАЬОС™ МГХ 75/25™, продукты НИМиЬШ™ (50/50, 70/30, Кедц1аг, ИРН, УНга и иИгМеШе), и МОУОЬШ™, Инсулин-Гларгины (например, ЬАЭТиЗ™1), Интерфероны, Интерфероны Альфа, Интерфероны Бета, Интерфероны Гамма, Интерфероны Альфа-2а, Интерфероны Альфа-2Ь, Интерфероны Альфакон-1, Интерфероны Альфаш3, Интерфероны Бета-1а, Интерфероны Альфа-консенсус, Иодиксанолы, Иогексолы, Иопамидолы, Иоверсолы, Кеторолаки, Ларонидазы, Левофлоксацины, Лидокаины, Линезолиды, Лоразепамы, Вакцины против кори, вирус кори, вирусы эпидемического паротита, Вакцины против вирусов кори-эпидемического паротита-коревой краснухи, Вакцины против коревой краснухи, Медроксипрогестероны, Меропенемы, Метилпреднизолоны, Мидазоламы, Морфины, Октреотиды, Омализумабы, Ондансетроны, Паливизумабы, Пантопразолы, Пегаспаргазы, Пегфилграстимы, Пег-Интерфероны Альфа2а, Пег-Интерфероны Альфа-2Ь, Пегвисоманты, Вакцины против коклюша, Пиперациллины, Пневмококковые вакцины и Пневмококковые конъюгатные вакцины, Прометазины, Ретеплазы, Соматропины, Сулбактамы, Суматриптаны, Тазобактамы, Тенектеплазы, Очищенные Токсоиды Столбняка, Тикарциллины, Тозитумомабы, Триамцинолоны, Триамцинолона Ацетониды, Триамцинолона гексацетониды, Ванкомицины, иммуноглобулины Уапсе11а Ζοзίе^, вакцины ветряной оспы, другие вакцины, Алемтузумабы, Алитретиноины, Аллопуринолы, Алтретамины, Амифостины, Анастрозолы, Мышьяки, Триоксиды мышьяка, Аспарагиназы, вакцины ВасШиз Са1тейе-Сиегт (ВСС), ВСС Ьгуе, Бексаротены, Блеомицины, Бусульфаны, Бусульфан внутривенный, Бусульфаны пероральные, Калустероны, Капецитабины, Карбоплатины, Кармустины, Кармустины с Полифепрозанами, Целекоксибы, Хлорамбуцилы, Цисплатины, Кладрибины, Циклофосфамиды, Цитарабины, Цитарабины липосомальные, Дакарбазины, Дактиномицины, Даунорубицины липосомальные, Даунорубицины, Дауномицины, Денилейкин-Дифтитоксы, Дексразоксаны, Доцетакселы, Доксорубицины, Доксорубицины липосомальные, пропионаты Дромостанолона, Растворы Эллиота В, Эпирубицины, Эпоэтины Альфа, Эстрамустины, Этопозиды, фосфаты Этопозида, Этопозиды УР-16, Эксеместаны, Флоксуридины, Флударабины, Фторурацилы, 5-Фторурацилы, Фулвестранты, Гемцитабины, Гемтузумабы, Озогамицины, озогамицины Гемтузумаба, Гидроксимочевины, Идарубицины, Ифосфамиды, мезилаты Иматиниба, Иринотеканы, Летрозолы, Лейковорины, Левамизолы, Ломустины, ΟΟΝυ, Меклоретамины, Азотные аналоги иприта, Мегестролы, ацетаты Мегестрола, Мелфаланы, Ь-РАМ, Меркаптопурины, 6-Меркаптопурины, Месны, Метотрексаты, Метоксалены, Митомицины, Митомицины С, Митотаны, Митоксатроны, Нандролоны, фенпропионаты Нандролона, Нофетумомабы, Опрелвекины, Оксалиплатины, Паклитакселы, Памидронаты, Пегадемазы, Пентостатины, Пипоброманы, Пликамицины, Митрамицины, Порфимеры, Порфимер-натрия, Прокарбазины, Хинакрины, Расбуриказы, Ритуксимабы, Сарграмостимы, Стрептозоцины, Тальки, Тамоксифены, Темозоломиды, Тенипозиды, Тестолактоны, Тиогуанины, 6-Тиогуанины, Триэтилентиофосфоамиды (Тиотепы), Топотеканы, Торемифены, Трастузумабы, Третиноины, Урацил-азотные аналоги иприта, Валрубицины,
    - 115 011654
    Винбластины, Винкристины, Винорелбины, Золедронаты, Ацивицины, Акларубицины, Акодазолы, Акронины, Адозелезины, Альдеслейкины, Ретиноевые кислоты, Алитрениноины, 9-цис-ретиноевые кислоты, Алвоцидибы, Амбазоны, Амбомицины, Аметантроны, Аминоглютетимиды, Амсакрины, Анаксироны, Анцитабины, Антрамицины, Апазиквоны, Аргимесны, Асперлины, Атримустины, Азацитидины, Азетепы, Азотомицины, Баноксантроны, Батабулины, Батимастаты, Бенаксибины, Бендамустины, Бензодепы, Бикалутамиды, Биэтазерпины, Бирикодары, Бисантрены, Биснафида Димезилаты, Бизелезины, Бортезомибы, Бреквинары, Бропиримины, Будотитаны, Кактиномицины, Канертинибы, Карацемиды, Карбетимеры, Карбоквоны, Кармофуры, Карубицины, Карзелезины, Цедефинголы, Цемадотины, Хлорамбуцилы, Циотеронелы, Циролемицины, Кланфенуры, Клофарабины, Криснатолы, Децитабины, Декснигулдипины, Дексормаплатины, Дезагуанины, Диазиквоны, Диброспидиумы, Диеногесты, Диналины, Дисермолиды, Дофеквидары, Доксифлуридины, Дролоксифены, Дуазомицины, Экомустины, Эдатрексаты, Эдотекарины, Эфломитины, Элакридары, Элинафиды, Элсамитруцины, Эмитефуры, Энлоплатины, Энпроматы, Энзастаурины, Эпипропидины, Эпталопросты, Эрбулозолы, Эзорубицины, Этанидазолы, Этоглюциды, Этоприны, Экзисулинды, Фадрозолы, Фазарабины, Фенретиниды, Флуоксиместероны, Фторцитабины, Фосквидоны, Фостриецины, Фотретамины, Галарубицины, Галоцитабины, Герохинолы, Гиматеканы, Гимерацилы, Глоксазоны, Глюфосфамиды, Илмофозины, Иломастаты, Имексоны, Импросульфаны, Индисуламы, Инпроквоны, Интерлейкины, Интерлейкины 2, рекомбинантные Интерлейкины, Интоплицины, Иобенгуаны, Ипроплатины, Ирзогладины, Иксабепилоны, Кетотрексаты, Ь-Аланозины, Ланреотиды, Лапатинибы, Ледоксандроны, Лейпролиды, Лейпрорелины, Лексакальцитолы, Лиарозолы, Лобаплатины, Лометрексолы, Лонафарнибы, Лозоксантроны, Луртотеканы, Мафосфамиды, Манносульфаны, Маримастаты, Мазопроколы, Майтансины, Мехлоретамины, Меленгестролы, Мелфаланы, Меногарилы, Мепитиостаны, Метезинды, Метомидаты, Метоприны, Метуредепы, Мибоплатины, Мипроксифены, Мизонидазолы, Митиндомиды, Митокарцины, Митокромины, Митофлаксоны, Митогиллины, Митогуазоны, Митомалцины, Митонафиды, Митоквидоны, Митосперы, Митозоломиды, Мивобулины, Мизорибины, Мофаротены, Мопидамолы, Мубритинибы, Микофеноловые кислоты, Недаплатины, Нелзарабины, Неморубицины, Нитракрины, Нокодазолы, Ногаламицины, Нолатрекседы, Нортопиксантроны, Ормаплатины, Ортатакселы, Отерацилы, Оксисураны, Оксофенарсины, Патубилоны, Пелдезины, Пелиомицины, Пелитрексолы, Пеметрекседы, Пентамустины, Пепломицины, Перфосфамиды, Перифозины, Пикоплатины, Пинафиды, Пипосульфаны, Пирфенидоны, Пироксантроны, Пиксантроны, Плевитрекседы, Пломестаны, Порфиромицины, Преднимустины, Пропамидины, Проспидиумы, Пумитепы, Пуромицины, Пиразофурины, Ранимустины, Рибоприны, Ритросульфаны, Роглетимиды, Роквинимексы, Руфокромомицины, Сабарубицины, Сафинголы, Сатраплатины, Себриплатины, Семустины, Симтразены, Сизофираны, Собузоксаны, Сорафенибы, Спарфосаты, Спарфосовые кислоты, Спарсомицины, Спирогермании, Спиромустины, Спироплатины, Скваламины, Стрептонигрины, Стрептоварицины, Суфосфамиды, Сулофенуры, Тацединалины, Талисомицины, Таллимустины, Тариквидары, Тауромустины, Текогаланы, Тегафуры, Телоксантроны, Темопорфины, Тероксироны, Тиамиприны, Тиазофурины, Тиломизолы, Тилороны, Тимкодары, Тимонацики, Тирапазамины, Топиксантроны, Трабектедины, Эктеинасцидин 743, Трестолоны, Трицирибины, Трилостаны, Триметрексаты, Триплатина Тетранитраты, Трипторелины, Трофосфамиды, Тубулозолы, Убенимексы, Уредепы, Валсподары, Вапреотиды, Вертепорфины, Винбластины, Виндезины, Винепидины, Винфлунины, Винформиды, Винглицинаты, Винлейцинолы, Винлейрозины, Винросидины, Винтриптолы, Винзолидины, Ворозолы, Ксантомицины А, Гуамециклины, Зениплатины, Зиласкорбы [2-Н], Зиностатины, Зорубицины, Зосуквидары, Ацетазоламиды, Ацикловиры, Адипиодоны, Алатрофлоксацины, Алфентанилы, Аллергенные экстракты, ингибиторы альфа-1-протеиназы, Алпростадилы, Амикацины, Аминокислоты, Аминокапроновые кислоты, Аминофиллины, Амитриптилины, Амобарбиталы, Амриноны, Анальгетические средства, Антиполиомиелитные вакцины, Сыворотки против бешенства, Противостолбнячные иммуноглобулины, вакцины против столбняка, Антитромбины ΙΙΙ, Противоядные сыворотки, Аргатробаны, Аргинины, Аскорбиновые кислоты, Атенололы, Атракурии, Атропины, Ауротиоглюкозы, Азатиоприны, Азтреонамы, Бацитрацины, Баклофены, Базиликсимабы, Бензойные кислоты, Бензтропины, Бетаметазоны, Биотины, Бивалирудины, Антитоксины ботулизма, Бретилии, Буметаниды, Бупивакаины, Бупренорфины, Буторфанолы, Кальцитонины, Кальцитриолы, Кальций, Капреомицины, Карбопросты, Карнитины, Цефамандолы, Цефоперазоны, Цефотаксимы, Цефокситины, Цефтизоксимы, Цефуроксимы, Хлорамфениколы, Хлорпрокаины, Хлорохины, Хлоротиазиды, Хлорпромазины, Хондроитинсерные кислоты, Хориогонадотропины Альфа, Хром, Цидофовиры, Цимецидины, Ципрофлоксацины, Цисатракурии, Клонидины, Кодеины, Колхицины, Колистины, Коллагены, Кортикорелина овечьего трифлутаты, Кортикотропины, Косинтропины, Цианокобаламины, Циклоспорины, Цистеины, Дакликсимабы, Далфопристины, Далтепарины, Данапароиды, Дантролены, Дефероксамины, Десмопрессины, Дексаметазоны, Дексмедетомидины, Декспантенолы, Декстраны, Декстраны железа, Диатризойные кислоты, Диазепамы, Диазоксиды, Дицикломины, Дигибинды, Дигоксины, Дигидроэрготамины, Дилтиаземы, Дифенгидрамины, Дипиридамолы, Добутамины, Допамины, Доксакурии, Доксапрамы, Доксеркальциферолы, Доксициклины, Дроперидолы, Дифиллины, Эдетовые (этилендиаминтетрауксусные) кислоты, Эдрофонии, Эналаприлаты, Эфедрины, Эпопростенолы, Эргокальциферолы, Эргоновины, Эртапенемы, Эритромицины, Эсмололы, Эстрадиолы, Эстрогенные средства, Этак- 116 011654 риновые кислоты, Этаноламины, Этанолы, Этиодизированные масла, Этидроновые кислоты, Этомидаты, Факторы VIII, Фамотидины, Фенолдопамы, Фентанилы, Флумазенилы, Флуоресцеины, Флуфеназины, Фолиевые кислоты, Фомепизолы, Фомиверсены, Фондапаринуксы, Фоскарнеты, Фосфенитоины, Фуросемиды, Гадотеридолы, Гадоверсетамиды, Ганцикловиры, Гентамицины, Глюкагоны, Глюкозы, Глицины, Гликопирролаты, Гонадорелины, Хорионические Гонадотропины, Полисахариды Η;·^ιηορ1ιν1ιΐ5 Β, Гемины, Лечебные средства из трав, Гистамины, Гидралазины, Гидрокортизоны, Гидроморфоны, Гидроксокобаламины, Гидроксизины, Гиосциамины, Ибутилиды, Имиглюцеразы, Индигокармины, Индометацины, Иодиды, Лопромиды, Иоталамовые кислоты, Локсагловые кислоты, Локсиланы, Изониазиды, Изопротеренолы, Вакцины Японского энцефалита, Канамицины, Кетамины, Лабеталолы, Лепирудины, Левобупивакаины, Левотироксины, Линкомицины, Лиотиронины, Лютеинизирующие гормоны, Вакцины против болезни Лайма, Мангафодипиры, Манниты, Менингококковые полисахаридные вакцины, Меперидины, Мепивакаины, Мезоридазины, Метараминолы, Метадоны, Метокарбамолы, Метогекситали, Метилдопаты, Метилэргоновины, Метоклопрамиды, Метопрололы, Метронидазолы, Миноциклины, Мивакурии, Морруевые кислоты (Μο^^Ни^с ас16к), Моксифлоксацины, Муромонабы-СО3, Микофенолатмофетилы, Нафциллины, Налбуфины, Налмефены, Налоксоны, Неостигмины, Ниацинамиды, Никардипины, Нитроглицерины, Нитропруссиды, Норепинефрины, Орфенадрины, Оксациллины, Оксиморфоны, Окситетрациклины, Окситоцины, Панкуронии, Пантенолы, Пантотеновые кислоты, Папаверины, Пегинтерфероны Альфа-2А, Пенициллины С, Пентамидины, Пентазоцины, Пентобарбиталы, Перфлутрены, Перфеназины, Фенобарбиталы, Фентоламины, Фенилэфрины, Фенитоины, Физостигмины, Фитонадионы, Полимиксины Ь, Пралидоксимы, Прилокаины, Прокаинамиды, Прокаины, Прохлорперазины, Прогестероны, Пропранололы, Пиридостигмин-гидроксиды, Пиридоксины, Хинидины, Хинупристины, Иммуноглобины бешенства, Вакцины против бешенства, Ранитидины, Ремифентанилы, Рибофлавины, Рифампины, Ропивакаины, Самарии, Скополамины, Селены, Серморелины, Синкалиды, Соматремы, Спектиномицины, Стрептокиназы, Стрептомицины, Сукцинилхолины, Суфентанилы, Сульфаметоксазолы, Такролимусс, Тербуталины, Терипаратиды, Тестостероны, Антитоксины столбняка, Тетракаины, Тетрадецилсульфаты, Теофиллины, Тиамины, Тиэтилперазины, Тиопентали, Тиреоидстимулирующие гормоны, Тинзапарины, Тирофибаны, Тобрамицины, Толазолины, Толбутамиды, Торсемиды, Транексамовые кислоты, Трепростинилы, Трифлуоперазины, Триметобензамиды, Триметопримы, Трометамины, Туберкулины, Тифоидные вакцины, Урофоллитропины, Урокиназы, Валпроевые кислоты, Вазопрессины, Векуронии, Верапамилы, Вориконазолы, Варфарины, Вакцины желтой лихорадки, Зидовудины, Цинки, гидрохлориды Зипрасидона, Аклациномицины, Актиномицины, Адриамицины, Азасерины, 6Азауридины, Карзинофилины, Хромомицины, Деноптерины, 6-Диазо-5-Оксо-Ь-Норлейцины, Эноцитабины, Локсуридины, Оливомицины, Пирарубицины, Пиритрексимы, Птероптерины, Тагафуры, Туберцидины, Альтеплазы, Арцитумомабы, Бевацизумабы, Токсины типа Α Βοϊυΐίηυα, Токсины типа В Βοϊυΐίηυα, Капромаб-пендетиды, Даклизумабы, Дорназы Альфа, Дротрекогины Альфа, ИмциромабПентетаты, иод-131, Адриамицины, Блеомицины, Кармустины, Цисплатины, Кладрибины, Цитарабины, Дактиномицины, Даунорубицины, Доксорубицины, Фепирубицины, Флударабины, Фторурацилы, Гемцитабины, Идарубицины, Локсуридины, 6-Меркаптопурины, Метотрексаты, Митрамицины, Митомицины, Микофеноловые кислоты, Ногаламицины, Пепломицины, Пликамицины, Порфиромицины, Пуромицины, Ретиноевые кислоты, Стрептозоцины, Тагафуры, Тамоксифены, Тиогуанины, Трамцинолоны, Туберцидины, Винкристины, Зорубицины, Аминогликозиды, Амфениколы, Ансамицины, Карбацефемы, Карбапенемы, Цефалоспорины или Цефемы, Цефамицины, Клавамы; Циклические липопептиды, Диаминопиримидины, Кетолиды, Линкосамиды, Макролиды, Монобактамы, Нитрофураны, Оксацефемы, Оксазолидиноны, Пенемы, Тиенамицины и разнообразные бета-лактамы, Пенициллины, Хинолоны, Сульфонамиды, Сульфоны, Тетрациклины, Клофоктолы, Фусидовые кислоты, Гекседины, Метенамины, Нитрофурантоины, Нитроксолины, Ритипенемы, Тауролидины, Ксибомолы, модификаторы крови, антибиотический агент, ингибитор ангиогенеза, вещества против катаракты и диабетической ретинопатии, ингибиторы карбоангидразы, мидриатики, агенты фотодинамической терапии, аналоги простагландина, факторы роста, противоопухолевые агенты, антиметаболиты, антивирусные агенты, амебоцидные и антипаразитарные агенты, противотуберкулезные и противолепрозные средства, антитоксины и антивенины, иммуномодуляторный агент, стероидные противовоспалительные агенты, Дукосаноиды, простагландины, аналоги простагландинов, антипростагландины и предшественники простагландинов, миотические агенты, холинергические агенты и антихолинэстеразы, противоаллергические агенты и комбинация агентов.
  2. 2. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармацевтически эффективный агент представляет собой иммуноглобулин.
  3. 3. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармацевтически эффективный агент выбран из Интерферона Бета, Интерферонов Альфа-2а, Интерферонов Альфакон-1, Интерферонов Альфа-п3, Интерферонов Бета-1, Интерферонов Бета-1а, Интерферонов Гамма-1Ь, Пег-Интерферонов Альфа-2, ПегИнтерферонов Альфа-2Ь.
  4. 4. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой Памидронат или Золедронат.
    - 117 011654
  5. 5. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой инсулин, который выбран из НИМАЕ0С™, НИМАЕ0С™ М1Х 75/25™, продуктов НИМЕЕ1Х™ (50/50, 70/30, Кеди1аг, №Н, И1!га и иИггНегНе), и N0V0^IN™, Инсулин-Гларгинов (например, ЕАХТиЗ™).
  6. 6. Способ по п.1, в котором фармакологический или фармакологически эффективный агент выбран из Доцетакселов, Доксорубицинов, Доксорубицинов липосомальных и бевацизумабов.
  7. 7. Способ по п.1, где кНАЗЕСР вводят в ткань инъекцией кНАЗЕСР в эту ткань или в соседнюю ткань.
  8. 8. Способ по п.1, где кНЛЗЕСР вводят в ткань предварительным введением кНЛЗЕСР в кровоток, снабжающий эту ткань.
  9. 9. Способ по п.8, где предварительное введение в кровоток опосредовано внутривенной инъекцией или инфузией кНАЗЕСР.
  10. 10. Способ по п.8, где предварительное введение в кровоток опосредовано невнутривенным парентеральным введением кНАЗЕСР.
  11. 11. Способ по п.1, где фармакологический или другой агент вводят в ткань инъекцией в эту ткань или в соседнюю ткань.
  12. 12. Способ по п.1, где фармакологический или другой агент вводят в ткань после предварительного введения кНАЗЕСР в кровоток, снабжающий эту ткань.
  13. 13. Способ по п.12, где фармакологический или другой агент вводят путем введения в кровоток, опосредованного внутривенной инъекцией или инфузией фармакологического или другого агента.
  14. 14. Способ по п.12, где фармакологический или другой агент вводят путем введения в кровоток, опосредованного невнутривенным парентеральным введением фармакологического или другого агента.
  15. 15. Способ по п.1, где стадию введения фармакологического или другого агента в ткань начинают в пределах трех часов после стадии введения кНАЗЕСР в эту ткань.
  16. 16. Способ по п.1, где стадию введения фармакологического или другого агента в ткань начинают в пределах двенадцати часов после стадии введения кНАЗЕСР в эту ткань.
  17. 17. Способ по п.1, где кНАЗЕСР содержит последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в ЗЕО ГО N0:1 или последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 91% идентичность аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в ЗЕО ГО N0:1.
  18. 18. Способ по п.17, где кНЛЗЕСР кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 ЗЕО ГО N0:1 или которая кодирует аминокислоты 1-482 ЗЕО ГО N0:1.
  19. 19. Способ по п.18, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в ЗЕО ГО N0:48.
  20. 20. Способ по п.17, где кНЛЗЕСР включает последовательность аминокислот, представленную в ЗЕО ГО N0:1, которая усечена по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
  21. 21. Способ по п.17, где кНЛЗЕСР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1-481, 36-481, 1-482, 36-482, 1-483 или 36-483 ЗЕО ГО N0:1.
  22. 22. Способ по п.21, где кНЛЗЕСР секретируется в клетки СН0.
  23. 23. Способ по п.1, где кНЛЗЕСР является ПЭГилированным или сверхсиалированным кНЛЗЕСР.
  24. 24. Способ по п.1, где кНЛЗЕСР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 ЗЕО ГО N0:1.
  25. 25. Способ по п.1, где кНЛЗЕСР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 ЗЕО ГО N0:1.
  26. 26. ПЭГилированная гиалуронидаза, содержащая по меньшей мере три ПЭГ-группы на полипептид.
  27. 27. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, представляющая собой не человеческую гиалуронидазу животного или бактериального происхождения.
  28. 28. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.27, представляющая собой не человеческую гиалуронидазу животного происхождения, выбранную из гиалуронидазы овечьих или бычьих яичек.
  29. 29. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза представляет собой нейтральноактивный растворимый полипептид гиалуронидазы, содержащий по меньшей мере одну ^связанную молекулу сахара; ^связанная молекула сахара ковалентно присоединена к остатку аспарагина полипептида; и гиалуронидаза является растворимой.
  30. 30. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.29, содержащая последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в ЗЕО ГО N0:1, или последовательность, которая обладает по меньшей мере примерно 91% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в ЗЕО ГО N0:1.
  31. 31. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.30, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 ЗЕО ГО N0:1 или которая кодирует аминокислоты 1-482 ЗЕО ГО N0:1.
    - 118 011654
  32. 32. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.31, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в 8ЕО ГО NО:48.
  33. 33. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.30, где гиалуронидаза включает последовательность аминокислот, представленную в 8ЕО ГО NО:1, которая является усеченной по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
  34. 34. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.33, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1481, 36-481, 1-482, 36-482, 1-483 или 36-483 8ЕО ГО ΝΘ:1.
  35. 35. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.34, где гиалуронидаза секретируется в клетки СЧО.
  36. 36. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 8ЕО ГО NО:1.
  37. 37. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 8ЕО ГО NО:1.
  38. 38. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза является гиалуронидазой бактериального происхождения, которая представляет собой хондроитиназу.
  39. 39. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.38, где хондроитиназа представляет собой хондроитиназу АВС.
  40. 40. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где гиалуронидаза является гиалуронидазой бактериального происхождения, которая представляет собой гиалуронатлиазу.
  41. 41. Способ увеличения диффузии терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса, предусматривающий введение субъекту ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 в количестве, достаточном для открывания или для образования каналов, меньших чем приблизительно 0,5 мкм в диаметре, посредством чего увеличивается диффузия терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса; и введение терапевтического вещества или другой молекулы или макромолекулярного комплекса.
  42. 42. Способ по п.41, где терапевтическое вещество или другая молекула или макромолекулярный комплекс выбран из химиотерапевтического агента, анальгетического агента, противовоспалительного агента, антимикробного агента, амебоцидного агента, трихомоноцидного агента, антипаркинсонического агента, противомалярийного агента, противосудорожного агента, антидепрессивного агента, антиартритного агента, противогрибкового агента, антигипертензивного агента, жаропонижающего агента, антипаразитарного агента, антигистаминного агента, альфа-адренергического агониста, альфа-блокатора, анестезирующего агента, бронхорасширяющего агента, биоцидного агента, бактерицидного агента, бактериостатического агента, бета-адреноблокатора, блокирующего кальциевые каналы агента, сердечнососудистого лекарственного агента, контрацептивного агента, противоотечного агента, диуретического (мочегонного) агента, депрессанта, диагностического агента, электролитного агента, гипнотического агента, гормонального агента, гипергликемического агента, миорелаксанта, агента мышечного сокращения, глазного агента, парасимпатомиметического агента, антидепрессанта, седативного агента, индуцирующего сон агента, симпатомиметического агента, транквилизирующего агента, мочевого агента, вагинального агента, противовирусного агента, витаминного агента, нестероидного противовоспалительного агента, ингибитора ангиотензинпревращающего фермента, полипептида, белка, нуклеиновой кислоты, лекарственного средства и органической молекулы.
  43. 43. Способ индукции разжижения жидкой части стекловидного тела для лечения нарушения глаза млекопитающего, предусматривающий контактирование жидкой части стекловидного тела с количеством ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26, эффективным для разжижения указанной жидкой части стекловидного тела, посредством чего лечится это нарушение.
  44. 44. Способ получения ПЭГилированной гиалуронидазы, предусматривающий реакцию гиалуронидазы с молярным избытком ПЭГ-реагента, выбранного из ПЭГ-сукцинимидилбутаноата, ПЭГсукцинимидилметилбутаноата, ПЭГ-сукцинимидилпропионата, ПЭГ -Ν-гидроксисукцинимида, ПЭГ альдегида, ПЭГ-карбоната, ПЭГ-пропиональдегида и ПЭГ-малеимида.
  45. 45. Способ по п.44, где ПЭГ-реагент выбран из тРЕС-8ВА (5 кДа), тРЕС-8ВА (20 кДа), тРЕС8ВА (30 кДа), тРЕС-8МВ (20 кДа), тРЕС-8МВ (30 кДа), тРЕС-бутиральдегида (30 кДа), тРЕС-8РА (20 кДа), тРЕС-8РА (30 кДа), тΡЕС2-NΗ8 (10 кДа разветвленного), тΡЕС2-NΗ8 (20 кДа разветвленного), тΡЕС-NΗ8 (40 кДа разветвленного), тΡЕС2-NΗ8 (60 кДа разветвленного), ΡЕС-NΗ8-биотина (5 кДа биотинилированного), ПЭГ-п-нитрофенилкарбоната (30 кДа) и ПЭГ-пропиональдегида (30 кДа).
  46. 46. ПЭГилированная гиалуронидаза, полученная согласно способу по п.44.
  47. 47. ПЭГилированная гиалуронидаза, полученная согласно способу по п.45.
  48. 48. Способ доставки молекулы в ткань, содержащую избыточные количества гликозаминогликана, предусматривающий введение ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 в ткань в количестве, достаточном для расщепления гликозаминогликанов в достаточной степени для открывания каналов, меньших чем 500 нм в диаметре; и введение молекулы в ткань, содержащую расщепленные гликозаминогликаны.
  49. 49. Фармацевтическая композиция, содержащая ПЭГилированную гиалуронидазу по п.26 и фарма
    - 119 011654 цевтический носитель.
  50. 50. Способ облегчения последствий инсульта или другого повреждения ЦНС у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26 после указанного инсульта или повреждения ЦНС.
  51. 51. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где указанные ПЭГ-группы являются разветвленными.
  52. 52. ПЭГилированная гиалуронидаза по п.26, где указанные ПЭГ-группы выбраны из группы, состоящей из тРЕС-8ВА (5 кДа), тРЕС-8ВА (20 кДа), тРЕС-8ВА (30 кДа), тРЕС-8МВ (20 кДа), тРЕС8МВ (30 кДа), тРЕС-бутиральдегида (30 кДа), тРЕС-8РА (20 кДа), тРЕС-8РА (30 кДа), тРЕС2^Н8 (10 кДа разветвленного), тРЕС2^Н8 (20 кДа разветвленного), тРЕС^Н8 (40 кДа разветвленного), тРЕС2^Н8 (60 кДа разветвленного), РЕС-ЯН8-биотин (5 кДа биотинилированного), ПЭГ-пнитрофенилкарбоната (30 кДа) и ПЭГ-пропиональдегида (30 кДа).
  53. 53. Комбинация, содержащая:
    (a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (зНА8ЕСР) и (b) фармакологический или фармацевтически эффективный агент, выбранный из следующих: Адалимумабы, Агалзидазы Бета, Алефацепты, Ампициллины, Анакинры, Антиполиомиелитные Вакцины, Антитимоциты, Азитромицины, Бекаплермины, Каспофунгины, Цефазолины, Цефепимы, Цефотетаны, Цефтазидимы, Цефтриаксоны, Цетуксимабы, Циластатины, Клавулановые кислоты, Клиндамицины, Дарбепоэтины Альфа, Деаклизумабы, Дифтерия, Дифтерийные антитоксины, Дифтерийные Токсоиды, Эфализумабы, Эпинефрины, Эритропоэтины Альфа, Этанерцепты, Филграстимы, Флуконазолы, Фолликулостимулирующие гормоны, Фоллитропины Альфа, Фоллитропины Бета, Фосфенилоины, Гадодиамиды, Гадопентетаты, Гатифлоксацины, Глатирамеры, СМ-С8Ε, Гозерелины, ацетаты Гозерелина, Гранисетроны, НаеторЫ1из ίηΠικηζη В, Галоперидолы, Вакцины Гепатита, Вакцины Гепатита А, Вакцины Гепатита В, Ибритумомаб-Тиуксетаны, Ибритумомабы, Тиуксетаны, Иммуноглобулины, Вакцины НаеторЫ1из тПиегтоа Вакцины вируса гриппа, Инфликсимабы, НИМАЬ0С™, НИМАЬ0С™ ΜΙΧ 75/25™, продукты НИМиЬШ™ (50/50, 70/30, Кеди1аг, №Н, ИНга и ИПхакШе), и NОVО^IN™, Инсулин-Гларгины (например, ЬА№Ти8™), Интерфероны, Интерфероны Альфа, Интерфероны Бета, Интерфероны Гамма, Интерфероны Альфа-2а, Интерфероны Альфа-2Ь, Интерфероны Альфакон-1, Интерфероны Альфаш3, Интерфероны Бета-1а, Интерфероны Альфа-консенсус, Иодиксанолы, Иогексолы, Иопамидолы, Иоверсолы, Кеторолаки, Ларонидазы, Левофлоксацины, Лидокаины, Линезолиды, Лоразепамы, Вакцины против кори, вирус кори, вирусы эпидемического паротита, Вакцины против вирусов кори-эпидемического паротита-коревой краснухи, Вакцины против коревой краснухи, Медроксипрогестероны, Меропенемы, Метилпреднизолоны, Мидазоламы, Морфины, Октреотиды, Омализумабы, Ондансетроны, Паливизумабы, Пантопразолы, Пегаспаргазы, Пегфилграстимы, Пег-Интерфероны Альфа-2а, Пег-Интерфероны Альфа-2Ь, Пегвисоманты, Вакцины против коклюша, Пиперациллины, Пневмококковые вакцины и Пневмококковые конъюгатные вакцины, Прометазины, Ретеплазы, Соматропины, Сулбактамы, Суматриптаны, Тазобактамы, Тенектеплазы, Очищенные Токсоиды Столбняка, Тикарциллины, Тозитумомабы, Триамцинолоны, Триамцинолона Ацетониды, Триамцинолона гексацетониды, Ванкомицины, иммуноглобулины Vа^^се11а 2оз1ег, вакцины ветряной оспы, другие вакцины, Алемтузумабы, Алитретиноины, Аллопуринолы, Алтретамины, Амифостины, Анастрозолы, Мышьяки, Триоксиды мышьяка, Аспарагиназы, вакцины ВасШиз Са1тейе-Сиегш (ВСС), ВСС Ыме, Бексаротены, Блеомицины, Бусульфаны, Бусульфан внутривенный, Бусульфаны пероральные, Калустероны, Капецитабины, Карбоплатины, Кармустины, Кармустины с Полифепрозанами, Целекоксибы, Хлорамбуцилы, Цисплатины, Кладрибины, Циклофосфамиды, Цитарабины, Цитарабины липосомальные, Дакарбазины, Дактиномицины, Даунорубицины липосомальные, Даунорубицины, Дауномицины, Денилейкин-Дифтитоксы, Дексразоксаны, Доцетакселы, Доксорубицины, Доксорубицины липосомальные, пропионаты Дромостанолона, Растворы Эллиота В, Эпирубицины, Эпоэтины Альфа, Эстрамустины, Этопозиды, фосфаты Этопозида, Этопозиды УР-16, Эксеместаны, Флоксуридины, Флударабины, Фторурацилы, 5-Фторурацилы, Фулвестранты, Гемцитабины, Гемтузумабы, Озогамицины, озогамицины Гемтузумаба, Гидроксимочевины, Идарубицины, Ифосфамиды, мезилаты Иматиниба, Иринотеканы, Летрозолы, Лейковорины, Левамизолы, Ломустины, СС^, Меклоретамины, Азотные аналоги иприта, Мегестролы, ацетаты Мегестрола, Мелфаланы, ЬРАМ, Меркаптопурины, 6-Меркаптопурины, Месны, Метотрексаты, Метоксалены, Митомицины, Митомицины С, Митотаны, Митоксатроны, Нандролоны, фенпропионаты Нандролона, Нофетумомабы, Опрелвекины, Оксалиплатины, Паклитакселы, Памидронаты, Пегадемазы, Пентостатины, Пипоброманы, Пликамицины, Митрамицины, Порфимеры, Порфимер-натрия, Прокарбазины, Хинакрины, Расбуриказы, Ритуксимабы, Сарграмостимы, Стрептозоцины, Тальки, Тамоксифены, Темозоломиды, Тенипозиды, Тестолактоны, Тиогуанины, 6-Тиогуанины, Триэтилентиофосфоамиды (Тиотепы), Топотеканы, Торемифены, Трастузумабы, Третиноины, Урацил-азотные аналоги иприта, Валрубицины, Винбластины, Зинкристины, Винорелбины, Золедронаты, Ацивицины, Акларубицины, Акодазолы, Акронины, Адозелезины, Альдеслейкины, Ретиноевые кислоты, Алитрениноины, 9-цис-ретиноевые кислоты, Алвоцидибы, Амбазоны, Амбомицины, Аметантроны, Аминоглютетимиды, Амсакрины, Анаксироны, Анцитабины, Антрамицины, Апазиквоны, Аргимесны, Асперлины, Атримустины, Азацитидины, Азетепы, Азотомицины,
    - 120 011654
    Баноксантроны, Батабулины, Батимастаты, Бенаксибины, Бендамустины, Бензодепы, Бикалутамиды, Биэтазерпины, Бирикодары, Бисантрены, Биснафида Димезилаты, Бизелезины, Бортезомибы, Бреквинары, Бропиримины, Будотитаны, Кактиномицины, Канертинибы, Карацемиды, Карбетимеры, Карбоквоны, Кармофуры, Карубицины, Карзелезины, Цедефинголы, Цемадотины, Хлорамбуцилы, Циотеронелы, Циролемицины, Кланфенуры, Клофарабины, Криснатолы, Децитабины, Декснигулдипины, Дексормаплатины, Дезагуанины, Диазиквоны, Диброспидиумы, Диеногесты, Диналины, Дисермолиды, Дофеквидары, Доксифлуридины, Дролоксифены, Дуазомицины, Экомустины, Эдатрексаты, Эдотекарины, Эфломитины, Элакридары, Элинафиды, Элсамитруцины, Эмитефуры, Энлоплатины, Энпроматы, Энзастаурины, Эпипропидины, Эпталопросты, Эрбулозолы, Эзорубицины, Этанидазолы, Этоглюциды, Этоприны, Экзисулинды, Фадрозолы, Фазарабины, Фенретиниды, Флуоксиестероны, Фторцитабины, Фосквидоны, Фостриецины, Фотретамины, Галарубицины, Галоцитабины, Герохинолы, Гиматеканы, Гимерацилы, Глоксазоны, Глюфосфамиды, Илмофозины, Иломастаты, Имексоны, Импросульфаны, Индисуламы, Инпроквоны, Интерлейкины, Интерлейкины 2, рекомбинантные Интерлейкины, Интоплицины, Иобенгуаны, Ипроплатины, Ирзогладины, Иксабепилоны, Кетотрексаты, Ь-Аланозины, Ланреотиды, Лапатинибы, Ледоксандроны, Лейпролиды, Лейпрорелины, Лексакальцитолы, Лиарозолы, Лобаплатины, Лометрексолы, Лонафарнибы, Лозоксантроны, Луртотеканы, Мафосфамиды, Манносульфаны, Маримастаты, Мазопроколы, Майтансины, Мехлоретамины, Меленгестролы, Мелфаланы, Меногарилы, Мепитиостаны, Метезинды, Метомидаты, Метоприны, Метуредепы, Мибоплатины, Мипроксифены, Мизонидазолы, Митиндомиды, Митокарцины, Митокромины, Митофлаксоны, Митогиллины, Митогуазоны, Митомалцины, Митонафиды, Митоквидоны, Митосперы, Митозоломиды, Мивобулины, Мизорибины, Мофаротены, Мопидамолы, Мубритинибы, Микофеноловые кислоты, Недаплатины, Нелзарабины, Неморубицины, Нитракрины, Нокодазолы, Ногаламицины, Нолатрекседы, Нортопиксантроны, Ормаплатины, Ортатакселы, Отерацилы, Оксисураны, Оксофенарсины, Патубилоны, Пелдезины, Пелиомицины, Пелитрексолы, Пеметрекседы, Пентамустины, Пепломицины, Перфосфамиды, Перифозины, Пикоплатины, Пинафиды, Пипосульфаны, Пирфенидоны, Пироксантроны, Пиксантроны, Плевитрекседы, Пломестаны, Порфиромицины, Преднимустины, Пропамидины, Проспидиумы, Пумитепы, Пуромицины, Пиразофурины, Ранимустины, Рибоприны, Ритросульфаны, Роглетимиды, Роквинимексы, Руфокромомицины, Сабарубицины, Сафинголы, Сатраплатины, Себриплатины, Семустины, Симтразены, Сизофираны, Собузоксаны, Сорафенибы, Спарфосаты, Спарфосовые кислоты, Спарсомицины, Спирогермании, Спиромустины, Спироплатины, Скваламины, Стрептонигрины, Стрептоварицины, Суфосфамиды, Сулофенуры, Тацединалины, Талисомицины, Таллимустины, Тариквидары, Тауромустины, Текогаланы, Тегафуры, Телоксантроны, Темопорфины, Тероксироны, Тиамиприны, Тиазофурины, Тиломизолы, Тилороны, Тимкодары, Тимонацики, Тирапазамины, Топиксантроны, Трабектедины, Эктеинасцидин 743, Трестолоны, Трицирибины, Трилостаны, Триметрексаты, Триплатина Тетранитраты, Трипторелины, Трофосфамиды, Тубулозолы, Убенимексы, Уредепы, Валсподары, Вапреотиды, Вертепорфины, Винбластины, Виндезины, Винепидины, Винфлунины, Винформиды, Винглицинаты, Винлейцинолы, Винлейрозины, Винросидины, Винтриптолы, Винзолидины, Ворозолы, Ксантомицины А, Гуамециклины, Зениплатины, Зиласкорбы [2Н], Зиностатины, Зорубицины, Зосуквидары, Ацетазоламиды, Ацикловиры, Адипиодоны, Алатрофлоксацины, Алфентанилы, Аллергенные экстракты, ингибиторы альфа-1-протеиназы, Алпростадилы, Амикацины, Аминокислоты, Аминокапроновые кислоты, Аминофиллины, Амитриптилины, Амобарбиталы, Амриноны, Анальгетические средства, Антиполиомиелитные вакцины, Сыворотки против бешенства, Противостолбнячные иммуноглобулины, вакцины против столбняка, Антитромбины III, Противоядные сыворотки, Аргатробаны, Аргинины, Аскорбиновые кислоты, Атенололы, Атракурии, Атропины, Ауротиоглюкозы, Азатиоприны, Азтреонамы, Бацитрацины, Баклофены, Базиликсимабы, Бензойные кислоты, Бензтропины, Бетаметазоны, Биотины, Бивалирудины, Антитоксины ботулизма, Бретилии, Буметаниды, Бупивакаины, Бупренорфины, Буторфанолы, Кальцитонины, Кальцитриолы, Кальций, Капреомицины, Карбопросты, Карнитины, Цефамандолы, Цефоперазоны, Цефотаксимы, Цефокситины, Цефтизоксимы, Цефуроксимы, Хлорамфениколы, Хлорпрокаины, Хлорохины, Хлоротиазиды, Хлорпромазины, Хондроитинсерные кислоты, Хориогонадотропины Альфа, Хром, Цидофовиры, Цимецидины, Ципрофлоксацины, Цисатракурии, Клонидины, Кодеины, Колхицины, Колистины, Коллагены, Кортикорелина овечьего трифлутаты, Кортикотропины, Косинтропины, Цианокобаламины, Циклоспорины, Цистеины, Дакликсимабы, Далфопристины, Далтепарины, Данапароиды, Дантролены, Дефероксамины, Десмопрессины, Дексаметазоны, Дексмедетомидины, Декспантенолы, Декстраны, Декстраны железа, Диатризойные кислоты, Диазепамы, Диазоксиды, Дицикломины, Дигибинды, Дигоксины, Дигидроэрготамины, Дилтиаземы, Дифенгидрамины, Дипиридамолы, Добутамины, Допамины, Доксакурии, Доксапрамы, Доксеркальциферолы, Доксициклины, Дроперидолы, Дифиллины, Эдетовые (этилендиаминтетрауксусные) кислоты, Эдрофонии, Эналаприлаты, Эфедрины, Эпопростенолы, Эргокальциферолы, Эргоновины, Эртапенемы, Эритромицины, Эсмололы, Эстрадиолы, Эстрогенные средства, Этакриновые кислоты, Этаноламины, Этанолы, Этиодизированные масла, Этидроновые кислоты, Этомидаты, Факторы VIII, Фамотидины, Фенолдопамы, Фентанилы, Флумазенилы, Флуоресцеины, Флуфеназины, Фолиевые кислоты, Фомепизолы, Фомиверсены, Фондапаринуксы, Фоскарнеты, Фосфенитоины, Фуросемиды, Гадотеридолы, Гадоверсетамиды, Ганцикловиры, Гентамицины, Глюкагоны, Глюкозы, Глицины, Гликопирролаты, Го
    - 121 011654 надорелины, Хорионические Гонадотропины, Полисахариды НаеторНу1ик В, Гемины, Лечебные средства из трав, Гистамины, Гидралазины, Гидрокортизоны, Гидроморфоны, Гидроксокобаламины, Гидроксизины, Гиосциамины, Ибутилиды, Имиглюцеразы, Индигокармины, Индометацины, Иодиды, Лопромиды, Иоталамовые кислоты, Локсагловые кислоты, Локсиланы, Изониазиды, Изопротеренолы, Вакцины Японского энцефалита, Канамицины, Кетамины, Лабеталолы, Лепирудины, Левобупивакаины, Левотироксины, Линкомицины, Лиотиронины, Лютеинизирующие гормоны, Вакцины против болезни Лайма, Мангафодипиры, Манниты, Менингококковые полисахаридные вакцины, Меперидины, Мепивакаины, Мезоридазины, Метараминолы, Метадоны, Метокарбамолы, Метогекситали, Метилдопаты, Метилэргоновины, Метоклопрамиды, Метопрололы, Метронидазолы, Миноциклины, Мивакурии, Морруевые кислоты (Моггйшс ас1бк), Моксифлоксацины, Муромонабы-СИ3, Микофенолат-мофетилы, Нафциллины, Налбуфины, Налмефены, Налоксоны, Неостигмины, Ниацинамиды, Никардипины, Нитроглицерины, Нитропруссиды, Норепинефрины, Орфенадрины, Оксациллины, Оксиморфоны, Окситетрациклины, Окситоцины, Панкуронии, Пантенолы, Пантотеновые кислоты, Папаверины, Пег-интерфероны Альфа-2А, Пенициллины С, Пентамидины, Пентазоцины, Пентобарбиталы, Перфлутрены, Перфеназины, Фенобарбиталы, Фентоламины, Фенилэфрины, Фенитоины, Физостигмины, Фитонадионы, Полимиксины Ь, Пралидоксимы, Прилокаины, Прокаинамиды, Прокаины, Прохлорперазины, Прогестероны, Пропранололы, Пиридостигмин-гидроксиды, Пиридоксины, Хинидины, Хинупристины, Иммуноглобины бешенства, Вакцины против бешенства, Ранитидины, Ремифентанилы, Рибофлавины, Рифампины, Ропивакаины, Самарии, Скополамины, Селены, Серморелины, Синкалиды, Соматремы, Спектиномицины, Стрептокиназы, Стрептомицины, Сукцинилхолины, Суфентанилы, Сульфаметоксазолы, Такролимусс, Тербуталины, Терипаратиды, Тестостероны, Антитоксины столбняка, Тетракаины, Тетрадецилсульфаты, Теофиллины, Тиамины, Тиэтилперазины, Тиопентали, Тиреоидстимулирующие гормоны, Тинзапарины, Тирофибаны, Тобрамицины, Толазолины, Толбутамиды, Торсемиды, Транексамовые кислоты, Трепростинилы, Трифлуоперазины, Триметобензамиды, Триметопримы, Трометамины, Туберкулины, Тифоидные вакцины, Урофоллитропины, Урокиназы, Валпроевые кислоты, Вазопрессины, Векуронии, Верапамилы, Вориконазолы, Варфарины, Вакцины желтой лихорадки, Зидовудины, Цинки, гидрохлориды Зипрасидона, Аклациномицины, Актиномицины, Адриамицины, Азасерины, 6-Азауридины, Карзинофилины, Хромомицины, Деноптерины, 6-Диазо-5-Оксо-Ь-Норлейцины, Эноцитабины, Локсуридины, Оливомицины, Пирарубицины, Пиритрексимы, Птероптерины, Тагафуры, Туберцидины, Альтеплазы, Арцитумомабы, бевацизумабы, Токсины типа А Во!и1шцт, Токсины типа В Во!и11пит, Капромаб-пендетиды, Даклизумабы, Дорназы Альфа, Дротрекогины Альфа, Имциромаб-Пентетаты и иод-131.
  54. 54. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармацевтически эффективный агент представляет собой иммуноглобулин.
  55. 55. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармацевтически эффективный агент выбран из Интерферона Бета, Интерферонов Альфа-2а, Интерферонов Альфакон-1, Интерферонов Альфа-п3, Интерферонов Бета-1, Интерферонов Бета-1а, Интерферонов Гамма-1Ь, Пег-Интерферонов Альфа-2, Пег-Интерферонов Альфа-2Ь.
  56. 56. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой Памидронат или Золедронат.
  57. 57. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент представляет собой инсулин, который выбран из НиМАТОС™, НиМАТОС™ М1Х 75/25™, продуктов НиМиЕ-ΙΝ™ (50/50, 70/30, Кеди1аг, №Н, И1!га и и1!га1еп!е), и NОVО^IN™, Инсулин-Гларгинов (например, ^АNТυЗ™).
  58. 58. Комбинация по п.53, в которой фармакологический или фармакологически эффективный агент выбран из Доцетакселов, Доксорубицинов, Доксорубицинов липосомальных и бевацизумабов.
  59. 59. Комбинация, содержащая:
    (a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (кНАЗЕСР); и (b) модификатор крови.
  60. 60. Комбинация по п.59, в которой модификатор крови выбран из следующих: антигемофильные факторы, антиингибитор-коагулент-комплексы, антитромбины ΐΐΐ, Факторы коагуляции νΐΐ, Факторы коагуляции VIII, Факторы коагуляции 1Х, фракции белков плазмы, факторы фон Виллебранда; антитромбоцитарные агенты (в том числе, например, абциксимабы, анагрелиды, цилостазолы, клопидогрела бисульфаты, дипиридамолы, эпопростенолы, эптифибатиды, тирофибаны; колониестимулирующие факторы (СЗР) (в том числе, например, гранулоцитарные СЗР и гранулоцитарно-макрафагальные СЗР); стимуляторы эритропоэза (в том числе, например, эритропоэтины), такие как дарбепоэтины альфа (и эпоэтины альфа); гемостатики и альбумины (в том числе, например, апротинины), комбинации антигемофильных факторов и плазмы, Десмопрессина ацетаты и альбумины; иммуноглобулины, а также иммуноглобулины гепатита В; ингибиторы тромбина (в том числе, например, прямые ингибиторы тромбина и лепирудин и дротекогины альфа; антикоагулянты (в том числе, например, далтепарины, эноксаперины и другие гепарины и варфарины).
    - 122 011654
  61. 61. Комбинация, содержащая:
    (a) растворимый нейтрально-активный полипептид гиалуронидазы (кНАЗЕОР); и (b) фармакологический или фармацевтически эффективный агент, выбранный из следующих: антибиотический агент, ингибитор ангиогенеза, вещества против катаракты и диабетической ретинопатии, ингибиторы карбоангидразы, мидриатики, агенты фотодинамической терапии, аналоги простагландина, фактор роста, противоопухолевые агенты, антиметаболиты, антивирусные агенты, амебоцидные и антипаразитарные агенты, противотуберкулезные и противолепрозные средства, антитоксины и антивенины, иммуномодуляторный агент, стероидные противовоспалительные агенты, Дукосаноиды, простагландины, аналоги простагландинов, антипростагландины и предшественники простагландинов, миотические агенты, холинергические агенты и антихолинэстеразы, противоаллергические агенты и комбинация агентов.
  62. 62. Комбинация по любому из пп.53-61, где кНАЗЕОР содержит последовательность аминокислотных остатков, имеющую последовательность, включенную в ЗЕР ΙΌ ΝΌ:1, или последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 91% идентичность аминокислотной последовательности с последовательностью аминокислот, включенной в ЗЕР ΙΌ Ν(.'):1.
  63. 63. Комбинация по п.62, где кНАЗЕОР кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 1-482 ЗЕР ΙΌ ΝΌ:1, или которая кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 36-482 ЗЕР ΙΌ ΝΌ:1.
  64. 64. Комбинация по п.63, где молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеотидов, представленную в ЗЕР ΙΌ NО:48.
  65. 65. Комбинация по п.62, где кНАЗЕОР включает последовательность аминокислот, представленную в ЗЕР ΙΌ ΝΌ:1, которая усечена по аминокислотному остатку, который является аминокислотным остатком 477 или 483 или находится между ними.
  66. 66. Комбинация по п.65, где кНАЗЕОР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-477, 36-477, 1-478, 36-478, 1-479, 36-479, 1-480, 36-480, 1-481, 36-481, 1-482, 36-482, 1483 или 36-483 ЗЕр ΙΌ ЬЮ:1.
  67. 67. Комбинация по п.66, где кНАЗЕОР секретируется в клетки СНО.
  68. 68. Комбинация по п.62, где кНАЗЕОР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 1-482 ЗЕР ΙΌ NО:1.
  69. 69. Комбинация по п.62, где кНАЗЕОР имеет последовательность аминокислот, представленную аминокислотами 36-482 ЗЕР ΙΌ NО:1.
  70. 70. Комбинация по любому из пп.53-69, где гликозаминогликаназа модифицирована полимером.
  71. 71. Комбинация по п.70, где полимер представляет собой ПЭГ или декстран.
  72. 72. Способ лечения опухоли, включающий введение субъекту ПЭГилированной гиалуронидазы по п.26.
EA200701791A 2005-02-23 2006-02-23 Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ EA011654B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/065,716 US7871607B2 (en) 2003-03-05 2005-02-23 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US11/238,171 US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2005-09-27 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
PCT/US2006/006700 WO2006091871A1 (en) 2005-02-23 2006-02-23 Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701791A1 EA200701791A1 (ru) 2008-02-28
EA011654B1 true EA011654B1 (ru) 2009-04-28

Family

ID=36927767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701791A EA011654B1 (ru) 2005-02-23 2006-02-23 Растворимые гликозаминогликаназы и способы получения и применения растворимых гликозаминогликаназ

Country Status (22)

Country Link
US (3) US20060104968A1 (ru)
EP (3) EP3943501A1 (ru)
JP (2) JP5366407B2 (ru)
KR (2) KR101363823B1 (ru)
CN (1) CN101163717B (ru)
AU (1) AU2006216545B2 (ru)
BR (1) BRPI0608314B1 (ru)
CA (1) CA2598823C (ru)
CY (1) CY1117104T1 (ru)
DK (1) DK1858926T3 (ru)
EA (1) EA011654B1 (ru)
ES (1) ES2557818T3 (ru)
HK (1) HK1109162A1 (ru)
HU (1) HUE028351T2 (ru)
IL (5) IL311178A (ru)
MX (2) MX2007010279A (ru)
NZ (1) NZ581233A (ru)
PL (1) PL1858926T4 (ru)
PT (1) PT1858926E (ru)
SG (2) SG164386A1 (ru)
SI (1) SI1858926T1 (ru)
WO (1) WO2006091871A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014141079A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Remedeye Inc Compositions for use in treating eye disorders using dipyridamole
US9550036B2 (en) 2011-03-03 2017-01-24 Impel Neuropharma Inc. Nasal drug delivery device
RU2710543C2 (ru) * 2015-05-28 2019-12-27 Орган Тиссю Реженерасьон Репарасьен Реплэйсман - Отр3 Композиции для лечения поражений головного мозга

Families Citing this family (620)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2390425T3 (es) 2000-12-22 2012-11-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Uso de moléculas de orientación repulsivas (RGM) y sus moduladores
CA2508948A1 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
MXPA05009429A (es) 2003-03-05 2005-12-12 Halozyme Inc Glicoproteina hialuronidasa soluble (shasegp), proceso para preparar la misma, usos y composiciones farmaceuticas que la comprenden.
JP4851185B2 (ja) * 2003-05-16 2012-01-11 ジェレックスインターナショナル株式会社 アレルギー症状抑制剤及び空気濾過フィルター
US20060004185A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-05 Leese Richard A Peptide antibiotics and peptide intermediates for their prepartion
CA2556537A1 (en) 2005-03-03 2006-09-03 Allergan, Inc. Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin
EP1907421A4 (en) * 2005-06-30 2012-03-28 Abbott Lab IL-12 / P40 BINDING PROTEINS
EP2500356A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2009510002A (ja) 2005-09-30 2009-03-12 アボット ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
PT1954718E (pt) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos
US20070259376A1 (en) * 2005-12-22 2007-11-08 Toru Yoshimura Homocysteine immunoassay
ES2902063T3 (es) 2006-09-08 2022-03-24 Abbvie Bahamas Ltd Proteínas de unión a interleucina-13
SG174804A1 (ru) * 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
US20080160003A1 (en) * 2006-10-31 2008-07-03 University Of Delaware Fertility Enhancement Using Lipid Carriers and Bioactive Molecules
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
ES2520765T3 (es) * 2007-02-15 2014-11-11 Allergan, Inc. Uso de toxina botulínica para el tratamiento de hiperhidrosis
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US20090175847A1 (en) * 2007-05-30 2009-07-09 Abbott Laboratories Humanized antibodies to ab (20-42) globulomer and uses thereof
US20090232801A1 (en) * 2007-05-30 2009-09-17 Abbot Laboratories Humanized Antibodies Which Bind To AB (1-42) Globulomer And Uses Thereof
KR20100018040A (ko) * 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
EP2033971A1 (de) * 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
IL186598A0 (en) * 2007-10-11 2008-11-03 Mohammad Abdulrazik Composition and method for the treatment or prevention of glaucoma and ocular hypertension
US20110002909A1 (en) * 2007-11-02 2011-01-06 Vikram Arora Method, composition, and article of manufacture for providing alpha-1 antitrypsin
EP2214639A2 (en) * 2007-11-06 2010-08-11 Stuart L. Weg Anesthetic composition, formulation and method of use
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
EP2268805B1 (en) * 2008-03-06 2015-05-06 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
TWI532498B (zh) * 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
US8754056B2 (en) 2008-03-20 2014-06-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Enhancing vessel lesion homing and repair potential of stem cells
EP2631302A3 (en) * 2008-03-31 2014-01-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
US20100003238A1 (en) * 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
AU2013201899B2 (en) * 2008-04-14 2015-08-27 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
CN101274921B (zh) * 2008-04-28 2010-06-02 长春迈灵生物工程有限公司 一种牛磺罗定的合成方法及药物制剂
TWI394580B (zh) * 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ588713A (en) 2008-05-09 2012-10-26 Abbott Gmbh & Co Kg Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof
UY31861A (es) * 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
WO2010005527A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-14 Angioblast Systems, Inc. Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using a combined therapy
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010006059A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 binding proteins and uses thereof
WO2010009129A2 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Methods of treating autoimmune diseases using cd4 antibodies
WO2010009335A1 (en) 2008-07-17 2010-01-21 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
CN102239149B (zh) * 2008-10-06 2015-05-13 约翰·霍普金斯大学 喹啉化合物作为血管新生、人类甲硫氨酰氨肽酶、以及sirt1的抑制剂,以及治疗病症的方法
US20100233079A1 (en) * 2008-12-04 2010-09-16 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
AU2013202000B2 (en) * 2008-12-09 2015-07-30 Halozyme, Inc. Extended soluble PH20 polypeptides and uses thereof
EP3037529B1 (en) 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
AR074874A1 (es) 2008-12-23 2011-02-16 Biosource Pharm Inc Composiciones antibioticas para el tratamiento de infecciones gram negativas. metodo. uso. compuesto.
BRPI1013688A8 (pt) 2009-03-05 2017-02-14 Abbott Lab Proteínas de ligação de il-17.
JP5649589B2 (ja) * 2009-03-06 2015-01-07 ハロザイム インコーポレイテッド マトリックスメタロプロテアーゼ１の温度感受性突然変異体およびその使用
US8283162B2 (en) * 2009-03-10 2012-10-09 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKAII and uses thereof
EP2411083A4 (en) 2009-03-23 2013-11-13 Micell Technologies Inc MEDICAL DEVICE FOR DELIVERY OF MEDICAMENT
MX2011010012A (es) 2009-03-25 2011-12-06 Genentech Inc NUEVOS ANTICUERPOS ANTI-A5ß1 Y SUS USOS.
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
RU2526911C2 (ru) * 2009-05-12 2014-08-27 Галеника Аб Эмульсия "масло-в-воде" мометазона и пропиленгликоля
US20100305500A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8513259B2 (en) 2009-07-03 2013-08-20 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US8263581B2 (en) 2009-07-03 2012-09-11 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9345661B2 (en) * 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
MX2012003282A (es) 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US8420083B2 (en) 2009-10-31 2013-04-16 Abbvie Inc. Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
JP5951498B2 (ja) * 2009-12-08 2016-07-13 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー 網膜神経線維層変性の治療に使用するためのｒｇｍａタンパク質に対するモノクローナル抗体
EP3616719A1 (en) 2009-12-21 2020-03-04 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulation
SI2536748T1 (sl) 2010-02-18 2014-12-31 Genentech, Inc. Nevrogulinski antagonisti in njihova uporaba pri zdravljenju raka
KR101899835B1 (ko) 2010-03-24 2018-09-19 제넨테크, 인크. 항-ｌｒｐ６ 항체
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
MY161302A (en) 2010-05-14 2017-04-14 Abbvie Inc IL-1 binding proteins
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
US8415307B1 (en) 2010-06-23 2013-04-09 Biosource Pharm, Inc. Antibiotic compositions for the treatment of gram negative infections
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
AR082163A1 (es) 2010-07-15 2012-11-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos especificamente ligantes del tslpr humano y metodos de utilizacion de los mismos
KR20130125753A (ko) 2010-07-20 2013-11-19 할로자임, 아이엔씨 항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
US8997136B2 (en) 2010-07-22 2015-03-31 Time Warner Cable Enterprises Llc Apparatus and methods for packetized content delivery over a bandwidth-efficient network
US9120862B2 (en) 2010-07-26 2015-09-01 Abbott Laboratories Antibodies relating to PIVKA-II and uses thereof
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
WO2012017003A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein
KR20130100125A (ko) 2010-08-13 2013-09-09 제넨테크, 인크. 질환의 치료를 위한, ＩＬ-1β 및 ＩＬ-18에 대한 항체
CN103168049B (zh) 2010-08-13 2015-10-07 罗切格利卡特公司 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法
PT2603530T (pt) 2010-08-13 2018-01-09 Roche Glycart Ag Anticorpos anti-fap e métodos de utilização
EP2603524A1 (en) 2010-08-14 2013-06-19 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
WO2012025536A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6194248B2 (ja) 2010-10-28 2017-09-06 パシラ ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド 非ステロイド性抗炎症薬の徐放性処方物
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
JP2013541594A (ja) 2010-11-08 2013-11-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 皮下投与される抗ｉｌ−６受容体抗体
ES2607086T3 (es) 2010-11-10 2017-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Métodos y composiciones para la inmunoterapia de enfermedades neuronales
CA2817380C (en) 2010-12-16 2019-06-04 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
TWI589589B (zh) 2010-12-20 2017-07-01 建南德克公司 抗間皮素（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）抗體及免疫接合物
PE20141060A1 (es) 2010-12-21 2014-09-26 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso
KR20130118925A (ko) 2010-12-22 2013-10-30 제넨테크, 인크. 항-pcsk9 항체 및 사용 방법
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
JP2014502607A (ja) 2011-01-03 2014-02-03 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｄｉｇ抗体およびペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体の薬学的組成物
EP2907504B1 (en) 2011-02-08 2017-06-28 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US9602414B2 (en) 2011-02-09 2017-03-21 Time Warner Cable Enterprises Llc Apparatus and methods for controlled bandwidth reclamation
CN103476433A (zh) 2011-02-10 2013-12-25 罗切格利卡特公司 改良的免疫疗法
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
CN103596983B (zh) 2011-04-07 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗fgfr4抗体及使用方法
BR112013026423A2 (pt) 2011-04-20 2016-11-29 Roche Glycart Ag método e construtos para a passagem de pendente do ph da barreira sangue-cérebro
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
PT2710035T (pt) 2011-05-16 2017-06-05 Hoffmann La Roche Agonistas do fgfr1 e métodos de utilização
US8623666B2 (en) 2011-06-15 2014-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for detecting erythropoietin (EPO) receptor using anti-human EPO receptor antibodies
KR101874401B1 (ko) 2011-06-17 2018-07-04 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 분해 효소의 안정한 제형
BR112013032265A2 (pt) 2011-06-17 2016-12-20 Halozyme Inc métodos de infusão de insulina subcutânea contínua com uma enzima de degradação do hialuronano
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
PE20141212A1 (es) 2011-06-22 2014-09-19 Hoffmann La Roche Eliminacion de celulas diana por parte de celulas t citotoxicas especificas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase 1
SG10201505454SA (en) 2011-07-13 2015-09-29 Abbvie Inc Methods and compositions for treating asthma using anti-il-13 antibodies
KR20140057326A (ko) 2011-08-17 2014-05-12 제넨테크, 인크. 뉴레귤린 항체 및 그의 용도
KR101886983B1 (ko) 2011-08-23 2018-08-08 로슈 글리카트 아게 2 개의 ｆａｂ 단편을 포함하는 fc-부재 항체 및 이용 방법
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
CA2846083A1 (en) 2011-09-15 2013-03-21 Genentech, Inc. Methods of promoting differentiation
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
CA2851371A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Genentech, Inc. Zymogen activators
TW201321414A (zh) 2011-10-14 2013-06-01 Genentech Inc 抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法
CA2850836A1 (en) 2011-10-15 2013-04-18 Genentech, Inc. Methods of using scd1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
EP2771028A2 (en) 2011-10-24 2014-09-03 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
CA2853114A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
WO2013063095A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against sclerostin
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
TW201326193A (zh) 2011-11-21 2013-07-01 Genentech Inc 抗－ｃ－ｍｅｔ抗體之純化
CN107459576A (zh) 2011-12-14 2017-12-12 艾伯维德国有限责任两合公司 用于诊断和治疗铁相关病症的组合物和方法
JP6336397B2 (ja) 2011-12-14 2018-06-06 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー 鉄関連障害を診断および治療するための組成物および方法
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
JP6067746B2 (ja) 2011-12-30 2017-01-25 ハロザイム インコーポレイテッド Ｐｈ２０ポリペプチド変異体、その製剤および使用
SG11201404198TA (en) 2012-01-18 2014-08-28 Genentech Inc Anti-lrp5 antibodies and methods of use
CN104168920A (zh) 2012-01-18 2014-11-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用fgf19调控剂的方法
NZ625403A (en) 2012-01-27 2016-03-31 Abbvie Inc Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
AU2013216753B2 (en) 2012-02-11 2017-09-21 Genentech, Inc. R-spondin translocations and methods using the same
ES2676031T3 (es) 2012-02-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc
US9139863B2 (en) 2012-03-16 2015-09-22 Genentech, Inc. Engineered conformationally-stabilized proteins
CN104254541A (zh) 2012-03-16 2014-12-31 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 改造的构象稳定蛋白质
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
JP6042527B2 (ja) 2012-04-04 2016-12-14 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
JP6007310B2 (ja) 2012-04-05 2016-10-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒトｔｗｅａｋ及びヒトｉｌ１７に対する二重特異性抗体並びにその使用
US20130281355A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
AU2013256596A1 (en) 2012-05-01 2014-10-09 Genentech, Inc. Anti-PMEL17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
MX2014014830A (es) 2012-06-15 2015-05-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso.
EP2863954A1 (en) 2012-06-21 2015-04-29 Indiana University Research and Technology Corporation Incretin receptor ligand polypeptide fc-region fusion polypeptides and conjugates with altered fc-effector function
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
CN104395340B9 (zh) 2012-06-27 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
WO2014006124A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
MX353951B (es) 2012-07-04 2018-02-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos de anti-teofilina y metodos de uso.
EP3339328A1 (en) 2012-07-04 2018-06-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
SG11201500087VA (en) 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
MX2015000315A (es) 2012-07-09 2015-07-06 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd22 e inmunoconjugados.
AU2013288932A1 (en) 2012-07-09 2014-12-11 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti - CD79b antibodies
JP2015523380A (ja) 2012-07-09 2015-08-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７９ｂ抗体を含む免疫複合体
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
KR20150038511A (ko) 2012-08-02 2015-04-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도
ES2848732T3 (es) 2012-08-07 2021-08-11 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
EP2895496B1 (en) 2012-09-14 2017-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production and selection of molecules comprising at least two different entities and uses thereof
CA2884220A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell penetrating peptides which bind irf5
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
NZ707641A (en) 2012-11-01 2016-09-30 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2884431A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
CN104968367B (zh) 2012-11-13 2018-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法
SG11201504414UA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Hoffmann La Roche Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
US20150196625A9 (en) 2013-01-07 2015-07-16 Rudolph D. Paladini Metal Sensitive Mutants of Matrix Metalloproteases and uses thereof
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
CA2900097A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cancer and preventing drug resistance
EP2961772A1 (en) 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Anti-mcsp antibodies
KR20150123250A (ko) 2013-03-06 2015-11-03 제넨테크, 인크. 암 약물 내성의 치료 및 예방 방법
AU2014243783B2 (en) 2013-03-13 2018-12-13 Genentech, Inc. Antibody formulations
JP6389236B2 (ja) 2013-03-13 2018-09-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 酸化還元製剤
US10653779B2 (en) 2013-03-13 2020-05-19 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
BR112015022475A8 (pt) 2013-03-13 2019-11-26 Genentech Inc formulação líquida e método para impedir a oxidação de uma proteína em uma formulação de proteína
US20140314778A1 (en) 2013-03-13 2014-10-23 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP6436965B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及びイムノコンジュゲート
RU2015139054A (ru) 2013-03-14 2017-04-19 Дженентек, Инк. Способы лечения рака и профилактики лекарственной резистентности рака
US9598485B2 (en) 2013-03-15 2017-03-21 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
EP2970471A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-crth2 antibodies and their use
CA2905123A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
DK2970422T3 (en) 2013-03-15 2018-07-16 Hoffmann La Roche IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 FC-FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
NZ712314A (en) 2013-03-15 2021-07-30 Genentech Inc Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US20160002306A1 (en) 2013-03-15 2016-01-07 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Fusion proteins and methods for identifying bromodomain inhibiting compounds
SG10201706210WA (en) 2013-03-15 2017-09-28 Genentech Inc Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
TW201512219A (zh) 2013-03-15 2015-04-01 Abbvie Inc 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白
WO2014161570A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Roche Glycart Ag Antibodies against human il17 and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
AU2014261631B2 (en) 2013-04-29 2019-02-14 F. Hoffmann-La Roche Ag FcRn-binding abolished anti-IGF-1R antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
SG10201800492PA (en) 2013-04-29 2018-03-28 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
JP6618893B2 (ja) 2013-04-29 2019-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体結合が変更された非対称抗体および使用方法
PE20151926A1 (es) 2013-05-20 2016-01-07 Genentech Inc Anticuerpos de receptores de antitransferrina y metodos de uso
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
GB2517896B (en) 2013-06-11 2015-07-08 Cilag Gmbh Int Injection device
GB2515039B (en) 2013-06-11 2015-05-27 Cilag Gmbh Int Injection Device
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
CN105407974A (zh) * 2013-07-03 2016-03-16 希望之城 抗癌组合
CN104342420B (zh) * 2013-07-30 2017-09-15 惠觅宙 一种重组长效人透明质酸酶、其编码基因、生产方法及应用
CN105518027A (zh) 2013-09-17 2016-04-20 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗lgr5抗体的方法
EA201991715A1 (ru) 2013-09-27 2020-03-31 Дженентек, Инк. Композиции, содержащие антитело к pdl1
CN105814078A (zh) 2013-10-11 2016-07-27 豪夫迈·罗氏有限公司 Nsp4抑制剂及其使用方法
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
CN105744954B (zh) 2013-10-18 2021-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
KR20160068802A (ko) 2013-10-23 2016-06-15 제넨테크, 인크. 호산구성 장애를 진단 및 치료하는 방법
EP3071597B1 (en) 2013-11-21 2020-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
US20150203592A1 (en) 2013-12-02 2015-07-23 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating osteoarthritis
PE20160712A1 (es) 2013-12-13 2016-07-26 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd33
CN106102774A (zh) 2013-12-17 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
KR20160089531A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-her2 항체를 사용하여 her2-양성 암을 치료하는 방법
RU2016128726A (ru) 2013-12-17 2018-01-23 Дженентек, Инк. Способы лечения злокачественных опухолей с использованием антагонистов связывания по оси pd-1 и антитела против cd20
BR112016013562A2 (pt) 2013-12-20 2017-10-03 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-tau(ps422) humanizados, seus usos, e formulações farmacêuticas
JP2017504598A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション 脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンｆｃ−領域融合ポリペプチド
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
CA2930154A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CA2933384A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
EP3851452A1 (en) 2014-01-06 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent blood brain barrier shuttle modules
CN105899534B (zh) 2014-01-15 2020-01-07 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
CA2935393A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Genentech, Inc. Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
TWI705824B (zh) 2014-02-08 2020-10-01 美商建南德克公司 治療阿茲海默症之方法
SG10201901076WA (en) 2014-02-08 2019-03-28 Genentech Inc Methods of treating alzheimer's disease
EP3825332A1 (en) 2014-02-12 2021-05-26 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-jagged1 antibodies and methods of use
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
US20150250610A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-10 DePuy Synthes Products, LLC Post-Operative Bone Grown Stimulant Introduction Method
RU2689119C2 (ru) * 2014-03-05 2019-05-24 Ультраджиникс Фармасьютикал Инк. Композиции на основе сиалированных гликопротеинов и их применение
US20150291689A1 (en) 2014-03-09 2015-10-15 Abbvie, Inc. Compositions and Methods for Treating Rheumatoid Arthritis
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
KR20160138177A (ko) 2014-03-21 2016-12-02 애브비 인코포레이티드 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체
PE20161571A1 (es) 2014-03-31 2017-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40 y metodos de uso
EP3126386A1 (en) 2014-03-31 2017-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
CN106414499A (zh) 2014-05-22 2017-02-15 基因泰克公司 抗gpc3抗体和免疫偶联物
WO2015179835A2 (en) 2014-05-23 2015-11-26 Genentech, Inc. Mit biomarkers and methods using the same
US20160002326A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
MX2016016233A (es) 2014-06-11 2017-03-31 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 y sus usos.
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
BR112016029935A2 (pt) 2014-06-26 2017-10-31 Hoffmann La Roche ?anticorpos anti-brdu, complexo, formulação farmacêutica e uso de anticorpo?
JP2017526641A (ja) 2014-07-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ経路阻害
ES2727137T3 (es) 2014-08-28 2019-10-14 Halozyme Inc Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario
CA2959141A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Bioatla, Llc Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
PT3191135T (pt) 2014-09-12 2020-11-12 Genentech Inc Anticorpos anti-her2 e imunoconjugados
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
AR101846A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
WO2016044334A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulations
JP6730261B2 (ja) 2014-09-17 2020-07-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体を含む免疫複合体
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
CA3203273A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
KR20170076697A (ko) 2014-11-06 2017-07-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 개질된 FCRN-결합 특성 및 단백질 A-결합 특성을 가진 Fc-영역 변이체
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
ES2749383T3 (es) 2014-11-06 2020-03-20 Hoffmann La Roche Variantes de la región Fc con unión al FcRn modificada y procedimientos de uso
EP3217787B1 (en) 2014-11-10 2019-04-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Animal model for nephropathy and agents for treating the same
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
SI3489256T1 (sl) 2014-11-14 2021-08-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Molekule, ki vežejo antigen in vsebujejo trimer ligandov iz družine TNF
BR112017010198A2 (pt) 2014-11-17 2017-12-26 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agonistas de ligação a ox40 e antagonistas de ligação ao eixo de pd-1
EP3221364B1 (en) 2014-11-19 2020-12-16 Genentech, Inc. Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy
EP3221362B1 (en) 2014-11-19 2019-07-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
EP3221361B1 (en) 2014-11-19 2021-04-21 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
DK3789402T3 (da) 2014-11-20 2022-09-19 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler og PD-1-aksebindende antagonister
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
AR102918A1 (es) 2014-12-05 2017-04-05 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b y métodos de uso
MX2017007491A (es) 2014-12-10 2018-05-04 Genentech Inc Anticuerpos del receptor de la barrera hematoencefálica y métodos para su uso.
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP2018503368A (ja) 2014-12-18 2018-02-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｃｄｃを誘発する抗体を決定するためのアッセイ法および方法
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
MY183415A (en) 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
WO2016117346A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
EP3913052A1 (en) 2015-04-24 2021-11-24 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
CN107771182A (zh) 2015-05-29 2018-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
BR112017025693A2 (pt) 2015-05-29 2018-08-14 Abbvie Inc. anticorpos anti-cd40 e seus usos
EP3302552A1 (en) 2015-06-02 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Compositions and methods for using anti-il-34 antibodies to treat neurological diseases
RU2732122C2 (ru) 2015-06-05 2020-09-11 Дженентек, Инк. Антитела против тау-белка и способы их применения
MX2017015937A (es) 2015-06-08 2018-12-11 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1.
MX2017014740A (es) 2015-06-08 2018-08-15 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40.
WO2016202713A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Method of freezing protein solutions
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10017577B2 (en) 2015-06-15 2018-07-10 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CA2986263A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
US9862763B2 (en) 2015-06-24 2018-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibodies and methods of use
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
JP6914919B2 (ja) 2015-08-28 2021-08-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ヒプシン抗体及びその使用
MX2018003040A (es) 2015-09-11 2018-04-11 Abbvie Inc Metodos para el tratamiento de formas recurrentes de esclerosis multiple.
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
MX2018003533A (es) 2015-09-24 2019-04-25 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpo de virus de inmunodeficiencia humana (vih) y metodos de uso.
MX2018003536A (es) 2015-09-24 2018-08-01 Genentech Inc Metodos para el tratamiento de la epilepsia.
TWI811892B (zh) 2015-09-25 2023-08-11 美商建南德克公司 抗tigit抗體及使用方法
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
UA124925C2 (en) 2015-10-02 2021-12-15 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
SI3356404T1 (sl) 2015-10-02 2021-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti PD1 in postopki uporabe
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
JP6657392B2 (ja) 2015-10-02 2020-03-04 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ヒトｃｄ２０／ヒトトランスフェリン受容体抗体及び使用方法
PE20181349A1 (es) 2015-10-07 2018-08-22 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos con tetravalencia para un receptor de fnt coestimulador
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
PL3368579T3 (pl) 2015-10-30 2022-03-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Fragmenty przeciwciał ze zmodyfikowanymi regionami zawiasowymi i sposoby ich wytwarzania
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
LT3370733T (lt) 2015-11-02 2021-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 aktyvinimo ir imuninės kontrolės taškų blokados būdai
WO2017078839A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Bioatla, Llc Conditionally active polypeptides
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
AU2016355320B2 (en) 2015-11-19 2023-12-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using B-RAF inhibitors and immune checkpoint inhibitors
WO2017096363A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Reporter system for detecting and targeting activated cells
CA3005592C (en) 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
JP7046814B2 (ja) 2015-12-30 2022-04-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体の使用
AR107303A1 (es) 2016-01-08 2018-04-18 Hoffmann La Roche Métodos de tratamiento de cánceres positivos para ace utilizando antagonistas de unión a eje pd-1 y anticuerpos biespecíficos anti-ace / anti-cd3, uso, composición, kit
CA3011739A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
EP3411067B1 (en) 2016-02-05 2021-10-20 Helixmith Co., Ltd Anti-c-met antibodies and uses thereof
JP2019517991A (ja) 2016-03-01 2019-06-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 低減したａｄｃｐを有するオビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体
CA3016552A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Genentech, Inc. Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
EP4029518A1 (en) * 2016-03-31 2022-07-20 Jiangsu Yahong Meditech Co., Ltd. Combinational uses of nitroxoline and its analogues with chemotherapies and immunotherapies in the treatment of cancers
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
KR20200087875A (ko) 2016-04-15 2020-07-21 바이오아트라, 엘엘씨 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
BR112018072286A2 (pt) 2016-04-29 2019-02-12 Yale University medida direcionada de atividade transcricional relacionada a receptores de hormônios
KR20240011868A (ko) * 2016-04-29 2024-01-26 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
SG11201809620UA (en) 2016-05-02 2018-11-29 Hoffmann La Roche The contorsbody - a single chain target binder
EP3455254B1 (en) 2016-05-11 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
US11254742B2 (en) 2016-05-13 2022-02-22 Bioatla, Inc. Anti-Ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
US20170349653A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Abbvie Inc. Methods for treating spinal cord injury and pain
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
IL262996B2 (en) 2016-06-06 2024-03-01 Hoffmann La Roche Fusion proteins for ophthalmology with increased grip in the eye
JP2019526529A (ja) 2016-06-08 2019-09-19 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
AU2017277914A1 (en) 2016-06-08 2019-01-03 Abbvie Inc. Anti-CD98 antibodies and antibody drug conjugates
CA3027045A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Abbvie Inc. Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
EP3478717B1 (en) 2016-07-04 2022-01-05 F. Hoffmann-La Roche AG Novel antibody format
WO2018017775A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Chesapeake Therapeutics, Llc Methods of attenuating drug excipient cross reactivity
CN117986372A (zh) 2016-07-29 2024-05-07 中外制药株式会社 显示增加的备选fviii辅因子功能活性的双特异性抗体
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
EP3497129A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
RS64550B1 (sr) 2016-09-23 2023-09-29 Hoffmann La Roche Upotreba il-13 antagonista za lečenje atopičnog dermatitisa
EP3516396A1 (en) 2016-09-26 2019-07-31 H. Hoffnabb-La Roche Ag Predicting response to pd-1 axis inhibitors
EP3532091A2 (en) 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
WO2018085555A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
CA3043356A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Musc Foundation For Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
MX2019005438A (es) 2016-11-15 2019-08-16 Genentech Inc Dosificacion para tratamiento con anticuerpos bispecificos anti-cd20 / anti-cd3.
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
CN109983013A (zh) 2016-11-18 2019-07-05 帕西拉制药有限公司 美洛昔康锌复合物微粒多囊脂质体制剂及其制备方法
CA3036983A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Cureab Gmbh Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
CN108367075B (zh) 2016-11-23 2022-08-09 免疫方舟医药技术股份有限公司 4-1bb结合蛋白及其用途
EP3548106B1 (en) * 2016-12-01 2023-01-04 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Combined treatment for nerve injuries
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
MX2019006334A (es) 2016-12-07 2019-08-01 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso.
BR112019011199A2 (pt) 2016-12-12 2019-10-08 Genentech Inc método para tratar um indivíduo que tem um câncer de próstata e kits
BR112019011689A2 (pt) 2016-12-14 2019-10-22 Progenity Inc tratamento de uma doença do trato gastrointestinal com um inibidor de tnf
AU2017378398B2 (en) 2016-12-14 2023-02-02 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a JAK inhibitor and devices
US20200315540A1 (en) 2016-12-14 2020-10-08 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-1 inhibitor
CN116712540A (zh) 2016-12-14 2023-09-08 比奥拉治疗股份有限公司 使用整联蛋白抑制剂治疗胃肠道疾病
US11426566B2 (en) 2016-12-14 2022-08-30 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a TLR modulator
EP3554346B1 (en) 2016-12-14 2024-01-31 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunosuppressant
WO2018112237A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor
CA3045475A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor released using an ingestible device
CA3045310A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
CA3045472A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a smad7 inhibitor
EP3554542A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 H. Hoffnabb-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1bb (cd137) agonists
PL3559034T3 (pl) 2016-12-20 2021-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona dwuswoistymi przeciwciałami anty-CD20/anty-CD3 i agonistami 4-1BB (CD137)
CA3043158A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Re-use of enzymes in in vitro glycoengineering of antibodies
KR102293106B1 (ko) 2016-12-21 2021-08-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체의 시험관 내 당조작 방법
CA3044920C (en) 2016-12-21 2022-06-28 Roberto Falkenstein In vitro glycoengineering of antibodies
MX2019007433A (es) 2016-12-22 2019-08-16 Genentech Inc Metodos y formulaciones para reducir el tiempo de reconstitucion de los polipeptidos liofilizados.
JP7122311B2 (ja) 2017-01-03 2022-08-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗４－１ｂｂクローン２０ｈ４．９を含む二重特異性抗原結合分子
SI3570884T1 (sl) 2017-01-17 2021-02-26 Genentech, Inc. Subkutane formulacije protiteles HER2
JP6995127B2 (ja) 2017-02-10 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体、その組成物、及びその使用
PE20191758A1 (es) 2017-03-22 2019-12-12 Genentech Inc Composiciones de anticuerpo optimizadas para el tratamiento de trastornos oculares
CN110494446A (zh) 2017-03-28 2019-11-22 基因泰克公司 治疗神经退行性疾病的方法
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
EP3601345A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
EP4108183A1 (en) 2017-03-30 2022-12-28 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
EP3601531B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
CA3054159A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chst15 inhibitor
US11596670B2 (en) 2017-03-30 2023-03-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with IL-10 or an IL-10 agonist
SG11201908787WA (en) 2017-04-04 2019-10-30 Hoffmann La Roche Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
CA3053360A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-lag3 antibodies
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
KR20190136076A (ko) 2017-04-13 2019-12-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 치료 방법에 사용하기 위한 인터루킨-2 면역접합체, cd40 작용제 및 임의적인 pd-1 축 결합 길항제
TW201839400A (zh) 2017-04-14 2018-11-01 美商建南德克公司 用於癌症之診斷及治療方法
KR102668891B1 (ko) 2017-04-18 2024-05-29 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 항원-특이적 면역 이펙터 세포
CR20190480A (es) 2017-04-21 2019-11-20 Genentech Inc Uso de antagonistas de klk5 para el tratamiento de una enfermedad
EP3615572A1 (en) 2017-04-27 2020-03-04 Tesaro Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
TWI797124B (zh) 2017-05-05 2023-04-01 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司 抗干擾素-γ之抗體及其應用
MX2019012381A (es) 2017-05-18 2020-01-23 Hoffmann La Roche Reduccion de reaccion secundaria relacionada con la aplicacion de un anticuerpo terapeutico.
WO2018220100A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Administration routes for immune agonists
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
MX2019015402A (es) 2017-06-22 2020-07-20 Catalyst Biosciences Inc Polipeptidos de serina proteasa 1 de tipo membrana modificada (mtsp-1) y metodos de uso.
CN111295394B (zh) 2017-08-11 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd8抗体及其用途
WO2019036363A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Progenity Inc. TREATMENT OF GASTROINTESTINAL TRACT DISEASE WITH GLATIRAMER OR A PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALT THEREOF
JP7382922B2 (ja) 2017-09-20 2023-11-17 中外製薬株式会社 Ｐｄ－１系結合アンタゴニストおよびｇｐｃ３標的化剤を使用する併用療法のための投与レジメン
US11491212B1 (en) 2017-09-27 2022-11-08 Catalyst Biosciences, Inc. Subcutaneous administration of modified factor IX polypeptides and treatment of hemophilia B
JP6496095B1 (ja) 2017-09-29 2019-04-03 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤
WO2019077500A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. ANTI-WATER ANTIBODIES AND USES THEREOF
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
MA50505A (fr) 2017-11-01 2020-09-09 Hoffmann La Roche Anticorps 2 + 1 bispécifiques (contorsbodies)
AU2018358904A1 (en) 2017-11-01 2020-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag TriFab-contorsbody
BR112020007630A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpo biespecífico ox40, produto farmacêutico, composição farmacêutica e anticorpos biespecíficos anti-fap/ anti-ox40
WO2019086499A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
WO2019086394A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The compbody - a multivalent target binder
JP7339944B2 (ja) 2017-11-07 2023-09-06 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム がんの処置におけるｃａｒ－ｔ細胞またはｃａｒ－ｎｋ細胞を用いるｌｉｌｒｂ４のターゲティング法
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
WO2019126472A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
EP3731865A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
CN107957403B (zh) * 2017-12-30 2021-03-23 广东药科大学 一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法
SG11202006348VA (en) 2018-01-05 2020-07-29 Ac Immune Sa Misfolded tdp-43 binding molecules
WO2019143636A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
TWI835772B (zh) 2018-01-26 2024-03-21 美商建南德克公司 Il-22fc融合蛋白及使用方法
US20210031012A1 (en) 2018-01-26 2021-02-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a pde4 inhibitor
KR20200125590A (ko) 2018-01-26 2020-11-04 제넨테크, 인크. 조성물 및 사용 방법
CA3091646A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Abba Therapeutics Ag Anti-human pd-l2 antibodies
SG11202007694UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Genentech Inc DOSING FOR TREATMENT WITH IL-22 Fc FUSION PROTEINS
WO2019165434A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
MX2020009468A (es) 2018-03-13 2020-10-22 Hoffmann La Roche Terapias de combinacion de agonistas de 4-1bb con anticuerpos anti-cd20.
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
WO2019191279A2 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds with anti-tumor activity against cancer cells bearing her2 exon 19 mutations
PE20210652A1 (es) 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
WO2019235426A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
CN108690119B (zh) * 2018-06-04 2022-04-19 莎穆(上海)生物科技有限公司 一种伊文思蓝修饰的多肽类前药及其制备和应用
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
WO2019246271A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20220257600A1 (en) 2018-06-20 2022-08-18 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a jak or other kinase inhibitor
WO2019246313A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
TWI819011B (zh) 2018-06-23 2023-10-21 美商建南德克公司 以pd-1 軸結合拮抗劑、鉑劑及拓撲異構酶ii 抑制劑治療肺癌之方法
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
KR20210034622A (ko) 2018-07-18 2021-03-30 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제, 항 대사제, 및 백금 제제를 이용한 폐암 치료 방법
KR20210032488A (ko) 2018-07-20 2021-03-24 서피스 온콜로지, 인크. 항-cd112r 조성물 및 방법
CA3106537A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives and l-methionine for protein formulation
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
AU2019342133A1 (en) 2018-09-21 2021-04-22 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
PE20211863A1 (es) 2018-10-01 2021-09-21 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap
WO2020070035A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules with trivalent binding to cd40
WO2020092546A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
WO2020102501A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Bristol-Myers Squibb Company Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
US20220033848A1 (en) 2018-11-19 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
EP3884043A1 (en) 2018-11-23 2021-09-29 Vira Therapeutics GmbH Vsv chimeric vectors
WO2020109352A1 (en) 2018-11-27 2020-06-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nanoparticles for preparing regulatory b cells
US20220031749A1 (en) 2018-11-28 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
KR20210096648A (ko) 2018-11-29 2021-08-05 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 자연 살해 세포의 생체외 확장을 위한 방법 및 이의 용도
CA3121265A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
WO2020115108A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Sørlandet Sykehus Hf Egfr inhibitors and their use in the treatment of neuroathic pain
AU2018451747A1 (en) 2018-12-06 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of diffuse large B-cell lymphoma comprising an anti-CD79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-CD20 antibody
JP2022514290A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
CN113286821A (zh) 2018-12-21 2021-08-20 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
WO2020127628A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted superagonistic cd28 antigen binding molecules
US11130804B2 (en) 2018-12-21 2021-09-28 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody that binds to VEGF and IL-1beta and methods of use
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CN113412123A (zh) 2018-12-28 2021-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-mhc-i-抗体融合蛋白
SG11202106244RA (en) 2018-12-28 2021-07-29 Catalyst Biosciences Inc Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
KR20210116525A (ko) 2019-01-14 2021-09-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 rna 백신으로 암을 치료하는 방법
EP3914291A2 (en) 2019-01-22 2021-12-01 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoglobulin a antibodies and methods of production and use
CN113329770A (zh) 2019-01-24 2021-08-31 中外制药株式会社 新型癌抗原及所述抗原的抗体
CA3130695A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
US20220135622A1 (en) 2019-02-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Antibacterial peptides and methods of use
WO2020178258A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Intracellular targeting of molecules
EP3938403A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
WO2020188061A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Paul Scherrer Institut Transglutaminase conjugation method with a glycine based linker
CN113677403A (zh) 2019-04-12 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子
KR20220002967A (ko) 2019-04-19 2022-01-07 제넨테크, 인크. 항 mertk 항체 및 이의 사용 방법
AU2020270376A1 (en) 2019-05-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with an anti-PD-L1 antibody
US20220220440A1 (en) 2019-05-09 2022-07-14 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
AU2020275415A1 (en) 2019-05-14 2021-11-25 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79B immunoconjugates to treat follicular lymphoma
WO2020234473A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
EP3990477A1 (en) 2019-06-26 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Fusion of an antibody binding cea and 4-1bbl
CN114531878A (zh) 2019-06-27 2022-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子
MX2022000111A (es) 2019-07-10 2022-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moleculas de union a claudina-6 y usos de las mismas.
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
WO2021023289A1 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 JelloX Biotech Inc. Composition and method for rendering biological material
MX2022002612A (es) 2019-09-03 2022-05-06 Amgen Inc Composiciones de il-22 orales, intrarrectales u otras relacionadas con el intestino y metodos de uso de las mismas.
MX2022002738A (es) 2019-09-04 2022-06-27 Genentech Inc Agentes de union a cd8 y uso de los mismos.
EP4028048A1 (en) 2019-09-09 2022-07-20 F. Hoffmann-La Roche AG Glucocerebrosidase mutants
AU2020349509A1 (en) 2019-09-18 2022-03-31 Genentech, Inc. Anti-KLK7 antibodies, anti-KLK5 antibodies, multispecific anti-KLK5/KLK7 antibodies, and methods of use
MX2022003610A (es) 2019-09-27 2022-04-20 Genentech Inc Administracion de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1.
MX2022004443A (es) 2019-10-18 2022-05-02 Genentech Inc Metodos para usar inmunoconjugados anti-cd79b para tratar linfoma difuso de linfocitos b grandes.
WO2021087458A2 (en) 2019-11-02 2021-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021092171A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for treatment of hematologic cancers
CA3159964A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
PE20221281A1 (es) 2019-12-09 2022-09-05 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpos anti-pd-l1
TW202128767A (zh) 2019-12-13 2021-08-01 美商建南德克公司 抗ly6g6d抗體及其使用方法
CA3164818A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
IL294226A (en) 2019-12-27 2022-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-ctla-4 antibodies and their use
BR112022012969A2 (pt) 2020-01-09 2022-09-06 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, usos da molécula de ligação, métodos para produzir a molécula de ligação, tratar um indivíduo com câncer e suprarregular ou prolongar a atividade de células t citotóxicas em um indivíduo com câncer
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021154414A2 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Catalyst Biosciences, Inc. Gene therapy for hemophilia b with a chimeric aav capsid vector encoding modified factor ix polypeptides
CA3164559A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Lars Mueller Methods of inducing neoepitope-specific t cells with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
US20230190881A1 (en) 2020-02-17 2023-06-22 Biotest Ag Subcutaneous administration of factor viii
WO2021177980A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy for cancer comprising pd-1 axis binding antagonist and il6 antagonist
KR20220156575A (ko) 2020-03-19 2022-11-25 제넨테크, 인크. 동종형 선택적 항-tgf-베타 항체 및 이용 방법
JP2023519213A (ja) 2020-03-24 2023-05-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｉｅ２結合剤および使用方法
WO2021198034A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf and pdgf-b and methods of use
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
CN111529685A (zh) * 2020-04-21 2020-08-14 厦门诺康得生物科技有限公司 抗呼吸道病毒感染的鼻腔喷雾制剂
CN115916822A (zh) 2020-04-24 2023-04-04 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物的方法
CN116323665A (zh) 2020-05-29 2023-06-23 23和我公司 抗cd200r1抗体及其使用方法
IL298599A (en) 2020-06-01 2023-01-01 Genentech Inc Methods for preparing extracellular vesicles and their uses
MX2022015206A (es) 2020-06-08 2023-01-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso.
CA3181820A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
TW202200616A (zh) 2020-06-18 2022-01-01 美商建南德克公司 使用抗tigit抗體及pd-1軸結合拮抗劑之治療
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
IL297880A (en) 2020-06-23 2023-01-01 Hoffmann La Roche Agonistic cd28 antigen-binding molecules targeting her2
CN115916834A (zh) 2020-06-29 2023-04-04 基因泰克公司 帕妥珠单抗加曲妥珠单抗的固定剂量组合
BR112023000204A2 (pt) 2020-07-10 2023-01-31 Hoffmann La Roche Conjunto de anticorpos, conjunto de ácidos nucleicos, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de pré-direcionamento de radioimunoterapia e direcionamento de um radioisótopo, ligante peptídico, proteína de múltiplos domínios e usos
EP4182688A1 (en) 2020-07-14 2023-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Assays for fixed dose combinations
CN111944059B (zh) * 2020-07-28 2022-03-01 中国农业大学 一种兼具抗菌、免疫调节、抗感染和抗炎活性的多功能杂合肽及其制备方法和应用
JP2023537761A (ja) 2020-08-14 2023-09-05 エイシー イミューン ソシエテ アノニム ヒト化抗ｔｄｐ－４３結合分子およびその使用
CN111903668A (zh) * 2020-09-10 2020-11-10 黑龙江八一农垦大学 一种多功能猪精液稀释粉及其应用
MX2023002901A (es) 2020-09-14 2023-06-01 Ichnos Sciences SA Anticuerpos que se unen a la proteína auxiliar del receptor de interleucina-1 (il1rap) y usos de estos.
EP4213886A1 (en) 2020-09-18 2023-07-26 Araris Biotech AG Transglutaminase conjugation method with amino acid-based linkers
US11795228B2 (en) 2020-09-30 2023-10-24 Dren Bio, Inc. Anti-CD94 antibodies and methods of use thereof
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
JP2023545566A (ja) 2020-10-20 2023-10-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストとｌｒｒｋ２阻害剤との併用療法
CA3192306A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Burkhard Ludewig Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
IL302017A (en) 2020-10-25 2023-06-01 Araris Biotech Ag Means and methods for creating antibody-linker conjugates
CA3197465A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 UCB Biopharma SRL Use of anti-trem1 neutralizing antibodies for the treatment of motor neuron neurodegenerative disorders
KR20230100732A (ko) 2020-11-04 2023-07-05 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 피하 투여
KR20230095113A (ko) 2020-11-04 2023-06-28 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체들과 항-cd79b 항체 약물 접합체들을 이용한 치료를 위한 투약
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2022146948A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
MX2023008083A (es) 2021-01-13 2023-07-13 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto.
UY39610A (es) 2021-01-20 2022-08-31 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
KR20230147099A (ko) 2021-01-28 2023-10-20 백신벤트 게엠베하 B 세포 매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 수단(method and means for modulating b-cell mediated immune responses)
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
EP4304732A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
WO2022221767A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Tiziana Life Sciences Plc Subcutaneous administration of antibodies for the treatment of disease
BR112023021993A2 (pt) 2021-05-03 2024-02-20 Astellas Inst For Regenerative Medicine Métodos de geração de células endoteliais da córnea madura
AU2022269643A1 (en) 2021-05-05 2023-11-02 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for ipsc-derived microglia
CN117716020A (zh) 2021-05-07 2024-03-15 安斯泰来再生医药协会 产生成熟肝细胞的方法
CN117480184A (zh) 2021-06-04 2024-01-30 中外制药株式会社 抗ddr2抗体及其用途
CA3220353A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
CA3221833A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody
EP4373859A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Heterodimeric fc domain antibodies
EP4380980A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use
JP2024531910A (ja) 2021-08-04 2024-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト Ｌａｔ活性化キメラ抗原受容体ｔ細胞及びその使用方法
EP4396223A1 (en) 2021-08-30 2024-07-10 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
JP2024533351A (ja) 2021-09-10 2024-09-12 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド 人工多能性幹細胞由来細胞の組成物及びその使用方法
AU2022347379A1 (en) 2021-09-14 2024-03-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Facilitated delivery of concentrated antibody formulations using hyaluronidase
JPWO2023053282A1 (ru) 2021-09-29 2023-04-06
AR127269A1 (es) 2021-10-08 2024-01-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulación de anticuerpo anti-hla-dq2.5
WO2023072934A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Araris Biotech Ag Methods for producing antibody-linker conjugates
AU2022376962A1 (en) 2021-10-29 2024-04-18 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof
WO2023081818A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
MX2024005876A (es) 2021-11-16 2024-05-29 Ac Immune Sa Moleculas novedosas para terapias y diagnostico.
EP4448578A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
TW202342519A (zh) 2022-02-16 2023-11-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
WO2023161291A1 (en) 2022-02-22 2023-08-31 Araris Biotech Ag Peptide linkers comprising two or more payloads
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
AR129062A1 (es) 2022-04-13 2024-07-10 Genentech Inc Composiciones farmacéuticas de proteínas terapéuticas y métodos de uso
AU2023258146A1 (en) 2022-04-20 2024-09-05 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2023245008A1 (en) 2022-06-13 2023-12-21 Genentech, Inc. Methods of delaying or preventing the onset of alzheimer's disease using crenezumab
US20240043553A1 (en) 2022-06-22 2024-02-08 Genentech, Inc. Methods for treatment of previously untreated follicular lymphoma with mosunetuzumab and lenalidomide
US20240003871A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof
TW202417042A (zh) 2022-07-13 2024-05-01 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024091417A1 (en) * 2022-10-24 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Human hyaluronidase 1 mutants
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024137677A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 FUJIFILM Holdings America Corporation Extracellular vesicle-enriched secretome composition derived from induced pluripotent stem cell derived-microglia and methods of use thereof
WO2024155901A2 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Genentech, Inc. E3 ligase family functions and interactions
WO2024183637A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Muc1 antibodies and methods of use
WO2024183635A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene, Ltd. Muc1 and cd16a antibodies and methods of use
WO2024184812A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 antibodies and methods of use
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof

Family Cites Families (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) * 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4044126A (en) * 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
USRE28819E (en) * 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) * 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
US4213765A (en) 1979-01-02 1980-07-22 Union Carbide Corporation Oxidative coal desulfurization using lime to regenerate alkali metal hydroxide from reaction product
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4328245A (en) * 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4769027A (en) * 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
GB8504025D0 (en) * 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4687610A (en) * 1986-04-30 1987-08-18 E. I. Du Pont De Neumours And Company Low crystallinity polyester yarn produced at ultra high spinning speeds
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
WO1988002261A1 (en) 1986-09-30 1988-04-07 Biochemie Gesellschaft M.B.H. Use of hyaluronidase
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
JP2547556B2 (ja) 1987-02-06 1996-10-23 株式会社 ミドリ十字 ｒ−グロブリンの液状製剤
US5723147A (en) * 1987-02-23 1998-03-03 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
US5041292A (en) * 1988-08-31 1991-08-20 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
US5116615A (en) * 1989-01-27 1992-05-26 Immunolytics, Inc. Method for treating benign prostatic hypertrophy
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) * 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5120548A (en) * 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
ZA912770B (en) * 1990-04-16 1992-01-29 Bethesda Eye Inst Enzymatic disinsertion of vitreous body
US5733566A (en) * 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5401629A (en) * 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5721348A (en) * 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
CA2106301C (en) 1991-03-18 1999-04-06 Chi-Huey Wong Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: method and compositions
DE69231736T2 (de) 1991-05-14 2001-10-25 The Immune Response Corp., Carlsbad Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
CA2103371C (en) 1991-06-05 2003-09-16 George Y. Wu Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
US5580578A (en) * 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
CH684164A5 (de) 1992-01-10 1994-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallab Intravenös anwendbare Immunglobulinlösung.
WO1993014188A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 The Regents Of The University Of Michigan Targeted virus
EP0633943A4 (en) 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
US5323907A (en) * 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
JP3980657B2 (ja) 1992-06-26 2007-09-26 生化学工業株式会社 コンドロイチナーゼａｂｃ、その製造法及び医薬組成物
US5496718A (en) * 1992-06-26 1996-03-05 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896
DK0671923T3 (da) 1992-10-09 2001-08-13 Advanced Tissue Sciences Inc Leverreserveceller
US5591767A (en) * 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5354566A (en) 1993-06-02 1994-10-11 Kraft General Foods, Inc. Preparation of yeast-leavened dough crusts
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5766627A (en) * 1993-11-16 1998-06-16 Depotech Multivescular liposomes with controlled release of encapsulated biologically active substances
DE4344824C1 (de) 1993-12-28 1995-08-31 Immuno Ag Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
ZA951877B (en) * 1994-03-07 1996-09-09 Dow Chemical Co Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
EP0755263A4 (en) * 1994-03-31 2005-02-09 Amgen Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR STIMULATING MEGAKARYOCYTE GROWTH AND THEIR DIFFERENTIATION
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE4445969C1 (de) 1994-12-22 1996-03-14 Schott Glaswerke Spritzenzylinder für eine Zweikammer-Fertigspritze, Zweikammer-Fertigspritze und Verfahren zum Herstellen und Füllen derselben
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5747027A (en) * 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DK0914102T3 (da) 1996-05-24 2006-01-09 Angiotech Pharm Inc Præparater og fremgangsmåder til behandling eller forebyggelse af syddomme i legemskanaler
US5958750A (en) * 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US5665069A (en) * 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US6214966B1 (en) * 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) * 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6103525A (en) * 1996-10-17 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase
US6123938A (en) * 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
US6258351B1 (en) * 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
JP4270590B2 (ja) 1997-03-19 2009-06-03 田辺三菱製薬株式会社 免疫グロブリン製剤
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DK1061954T3 (da) * 1998-03-12 2004-10-18 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivater med proximale reaktive grupper
US6528286B1 (en) 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
CN1314992A (zh) 1998-07-03 2001-09-26 奈勒斯菲尔德控制有限公司 流体测量的方法和装置
US6153394A (en) 1998-09-18 2000-11-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immunoassay for equine protozoal myeloencephalitis in horses
US6420339B1 (en) * 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
JP2002533473A (ja) * 1998-12-23 2002-10-08 イーデー ファーマ ゲーエムベーハー 微生物起源のヒアルロン酸分解酵素を含有する薬学的配合物
US6453170B1 (en) * 1998-12-31 2002-09-17 Nokia Corporation Mobile station user interface, and an associated method, facilitating usage by a physically-disabled user
CA2372053C (en) * 1999-04-28 2008-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
TWI248819B (en) 1999-09-27 2006-02-11 Arp Biomed Ltd Pharmaceutical composition containing IVIG for use in treating lymphoma
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
AU4511201A (en) * 1999-12-03 2001-06-12 Ista Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for the induction and treatment of retinal detachments
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) * 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
AU2001226650A1 (en) 2000-01-28 2001-08-07 Novo-Nordisk A/S A dose setting limiter
AU2001238595A1 (en) 2000-02-22 2001-09-03 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
WO2002049673A2 (en) 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US20040224012A1 (en) 2001-10-05 2004-11-11 Pichit Suvanprakorn Topical application and methods for administration of active agents using liposome macro-beads
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
MXPA04004336A (es) * 2001-11-07 2005-05-16 Nektar Therapeutics Al Corp Polimeros ramificados y sus conjugados.
JP2005510229A (ja) * 2001-11-28 2005-04-21 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド アミダーゼを用いる糖タンパク質のリモデリング
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
US7064110B2 (en) * 2002-05-13 2006-06-20 Enanta Pharmaceuticals, Inc. 6-11 bicycle ketolide derivatives
US6861236B2 (en) * 2002-05-24 2005-03-01 Applied Nanosystems B.V. Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
US6682904B1 (en) * 2002-08-15 2004-01-27 Deliatroph Pharmaceuticals, Inc. Specific inhibitors of hyaluronidase 2, and methods of identifying and using same
KR20040040782A (ko) * 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
PT1572744E (pt) 2002-12-16 2010-09-07 Genentech Inc Variantes de imunoglobulina e utilizações destas
CA2508948A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
JP2004238392A (ja) 2003-01-14 2004-08-26 Nipro Corp 安定化された蛋白質性製剤
SI2236154T1 (en) 2003-02-10 2018-08-31 Biogen Ma Inc. THE FORM OF IMUNOGLOBULIN AND THE METHOD OF ITS PREPARATION
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
MXPA05009429A (es) * 2003-03-05 2005-12-12 Halozyme Inc Glicoproteina hialuronidasa soluble (shasegp), proceso para preparar la misma, usos y composiciones farmaceuticas que la comprenden.
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
ATE449775T1 (de) * 2003-04-30 2009-12-15 Trine Pharmaceuticals Inc Carbacephem beta-lactam-antibiotika
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
EP1532983A1 (en) 2003-11-18 2005-05-25 ZLB Bioplasma AG Immunoglobulin preparations having increased stability
ES2902063T3 (es) 2006-09-08 2022-03-24 Abbvie Bahamas Ltd Proteínas de unión a interleucina-13
US8288142B2 (en) * 2007-06-19 2012-10-16 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
EP2268805B1 (en) * 2008-03-06 2015-05-06 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI532498B (zh) * 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
US20100003238A1 (en) 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
EP3037529B1 (en) * 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
KR20130125753A (ko) 2010-07-20 2013-11-19 할로자임, 아이엔씨 항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELDIN, P. et al.: Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation. Brazilian J. of Medical and Biological Res. 2003, vol. 36, pages 967-973 *
MENZEL, E.J. et al.: Hyaluronidase and its substrate hyaluronan: biochemistry, biological activities and therapeutic uses. Cancer Letters. 1998, Vol. 131, pages 3-11, STERN, R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? Glycobiology. 2003, vol. 13, No. 12, pages 105R-115R *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9550036B2 (en) 2011-03-03 2017-01-24 Impel Neuropharma Inc. Nasal drug delivery device
US10507295B2 (en) 2011-03-03 2019-12-17 Impel Neuropharma, Inc. Nasal drug delivery device
US11730903B2 (en) 2011-03-03 2023-08-22 Impel Pharmaceuticals Inc. Nasal drug delivery device
WO2014141079A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Remedeye Inc Compositions for use in treating eye disorders using dipyridamole
EA035966B1 (ru) * 2013-03-12 2020-09-07 О.Д. Окуляр Дискавери, Лтд. Применение фармацевтической композиции для местного применения для лечения расстройств лакримальной системы и переднего отрезка глаза
RU2710543C2 (ru) * 2015-05-28 2019-12-27 Орган Тиссю Реженерасьон Репарасьен Реплэйсман - Отр3 Композиции для лечения поражений головного мозга

Also Published As

Publication number Publication date
IL286802B2 (en) 2024-08-01
SG164386A1 (en) 2010-09-29
HUE028351T2 (en) 2017-02-28
EP1858926A1 (en) 2007-11-28
PT1858926E (pt) 2016-02-08
BRPI0608314B1 (pt) 2022-10-04
EA200701791A1 (ru) 2008-02-28
JP5654510B2 (ja) 2015-01-14
BRPI0608314A2 (pt) 2009-12-29
IL286802B1 (en) 2024-04-01
CY1117104T1 (el) 2017-04-05
EP3045472A1 (en) 2016-07-20
WO2006091871A1 (en) 2006-08-31
IL311178A (en) 2024-04-01
US20180185506A1 (en) 2018-07-05
EP1858926B1 (en) 2015-10-14
US20150165059A1 (en) 2015-06-18
NZ581233A (en) 2011-01-28
PL1858926T3 (pl) 2016-06-30
US20060104968A1 (en) 2006-05-18
KR20080004473A (ko) 2008-01-09
CN101163717B (zh) 2014-06-25
CN101163717A (zh) 2008-04-16
US10588983B2 (en) 2020-03-17
HK1109162A1 (en) 2008-05-30
EP3943501A1 (en) 2022-01-26
IL286802A (en) 2021-10-31
EP1858926A4 (en) 2011-05-11
MX354157B (es) 2018-02-15
SI1858926T1 (sl) 2016-02-29
DK1858926T3 (en) 2016-01-25
IL185497A (en) 2016-12-29
PL1858926T4 (pl) 2016-06-30
MX2007010279A (es) 2008-10-17
JP5366407B2 (ja) 2013-12-11
ES2557818T3 (es) 2016-01-28
JP2012143241A (ja) 2012-08-02
AU2006216545A1 (en) 2006-08-31
AU2006216545B2 (en) 2012-07-26
KR20120105018A (ko) 2012-09-24
IL220721A0 (en) 2012-08-30
KR101179029B1 (ko) 2012-09-07
IL242673B (en) 2021-10-31
IL185497A0 (en) 2008-01-06
CA2598823C (en) 2013-09-10
SG178799A1 (en) 2012-03-29
CA2598823A1 (en) 2006-08-31
JP2008531017A (ja) 2008-08-14
KR101363823B1 (ko) 2014-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10588983B2 (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US10016491B2 (en) Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
MXPA05009429A (es) Glicoproteina hialuronidasa soluble (shasegp), proceso para preparar la misma, usos y composiciones farmaceuticas que la comprenden.
BR122021011883B1 (pt) Glicosaminoglicanases solúveis métodos para a sua preparação, seu uso e respectiva composição farmacêutica

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment