KR101179029B1 - 가용성 글리코사미노글리카나제와 가용성글리코사미노글리카나제의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

가용성 글리코사미노글리카나제와 가용성글리코사미노글리카나제의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 가용성 중성 활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP)의 발견, 그 제조 방법 및 다른 분자들의 투여를 촉진하기 위해 또는 글리코사미노글리칸 관련 질병을 완화하기 위해 사용되는 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 기능성 중성 활성 히알루로니다제 도메인에 필요한 아스파라긴 결합 당 부분을 포함하는 가용성 중성 활성 sHASEGP 도메인의 최소 활성 폴리펩티드 도메인을 개시한다. sHASEGP의 분비를 향상시키는 변형된 아미노 말단 리더 펩티드도 포함한다. 본 발명은 또한 자연 발생 슬로터하우스 효소에 대한 안정성 및 혈청 약동학적 특성을 향상시키기 위한 재조합 sHASEGP의 시알화 및 페길화 형태를 포함한다. 본 발명은 또한 최적 활성에 필요한 적절한 글리코실화를 생성하는 진핵 세포로부터 유래된 실질적으로 정제된 재조합 sHASEGP 당단백질의 적절한 제형에 관해서도 기술한다.

Description

가용성 글리코사미노글리카나제와 가용성 글리코사미노글리카나제의 제조 및 사용 방법{SOLUBLE GLYCOSAMINOGLYCANASES AND METHODS OF PREPARING AND USING SOLUBLE GLYCOSAMINOGLYCANASES}
본 출원은 2005년 2월 23일자 미국 출원 11/065,716호의 일부 계속 출원인 2005년 9월 27일자 미국 출원 11/238,171호의 일부 계속 출원이며 이들 출원 각각은 그 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.
본 발명은 일반적으로 중성 활성, 가용성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 및 이의 부분, 특히 히알루로니다제 도메인을 비롯한 글리코사미노글리카나제 효소에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 질병의 치료에서 글리코스아미노글리칸의 치료적 변형을 위한 그리고 동물에서 주입된 분자와 같은 다른 분자의 확산을 증가시키기 위해 사용하기 위한, 글리코사미노글리카나제 (및 이의 도메인 및 코딩 핵산 분자)를 사용한 화학적 변형, 약학 조성물, 발현 플라스미드, 제조 방법 및 치료 방법에 관한 것이다.
글리코스아미노글리칸(GAG)은 세포외 매트릭스(ECM)의 복잡한 선형 다당류이다. GAG는 N-치환된 헥소스아민과 우론산의 이당류 구조 [히알루로난(HA), 콘드로이친 설페이트(CS), 콘드로이친(C), 더마탄 설페이트(DS), 헤파란 설페이트(HS), 헤파린(H)], 또는 갈락토스의 이당류 구조[케라탄 설페이트(KS)]를 반복하는 것을 특징으로 한다. HA를 제외하고는, 모두 코어 단백질에 공유 결합되어 존재한다. 그들의 코어 단백질을 가진 GAG는 구조적으로 프로테오글리칸(PG)로 불린다.
히알루로난(HA)은 포유류에서 주로 연결 조직, 피부, 연골, 및 활액에서 발견된다. 히알루로난은 또한 눈의 유리체의 주요 구성성분이다. 연결 조직에서, 히알루로난과 연합된 수화물은 조직 사이에 공간을 형성하여, 세포 이동 및 증식에 도움이 되는 환경을 형성한다. 히알루로난은 신속한 발생, 재생, 회복, 배발생, 발생학적 발생, 상처 치유, 혈관신생, 및 종양발생을 비롯한 세포 운동성과 관련된 생물학적 현상에서 주요 역할을 한다 (Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEBJ. 7: 1233-1241). 또한, 히알루로난 농도는 종양의 공격성과 상관된다 (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43: 1347-1354).
HA는 많은 세포, 특히 연성 연결 조직의 세포외 매트릭스에서 발견된다. HA는 물 및 혈장 단백질 항상성에서와 같은 다양한 생리학적 기능을 한다 (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404). HA 생산은 증식 세포에서 증가하며 유사분열에서 역할을 할 수도 있다. 또한 운동 및 세포 이동에도 관련된다. HA는 세포 조절, 발생, 및 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (상기의 Laurent 등).
HA는 임상 의약에서 사용되어 왔다. 그것의 조직 보호적 및 유동적 특성은 안과 수술에서 (예컨대, 백내장 수술동안 각막 내피를 보호하기 위해) 유용한 것으로 입증되었다. 혈청 HA는 간 질병, 및 류마티스 관절염과 같은 다양한 염증성 상태를 진단한다. HA의 축적에 의해 야기된 간질 부종은 다양한 기관에서 기능장애를 야기할 수도 있다 (상기의 Laurent 등).
히알루로난 단백질 상호작용은 또한 세포외 매트릭스 또는 "기저 물질"의 구조에 관련된다.
히알루로니다제는 동물에서 발견되는 중성- 및 산성 활성 효소의 군이다. 히알루로니다제는 기질 특이성 및 작용 기작에 관하여 다양하다.
세 가지 일반적인 부류의 히알루로니다제가 있다:
1. 주요 최종 생성물로서 사당류와 육당류를 갖는 엔도-베타-N-아세틸헥소스아미니다제인 포유류-타입 히알루로니다제 (EC 3.2.1.35). 이들은 가수분해 활성 및 트랜스글리코시다제 활성 둘다를 가지며, 히알루로난 및 콘드로이친 설페이트(CS), 특히 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다.
2. 박테리아 히알루로니다제 (EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및, 다양한 정도로 CS 및 DS를 분해한다. 이들은 주로 이당류 최종 생성물을 생성하는 베타 제거 반응에 의해 작용하는 엔도-베타-N-아세틸헥소스아미니다제이다.
3. 거머리, 다른 기생충, 및 갑각류로부터의 히알루로니다제 (EC 3.2.1.36)는 베타 1-3 결합의 가수분해를 통하여 사당류와 육당류를 생성하는 엔도-베타-글루쿠로니다제이다.
포유류 히알루로니다제는 추가로 두 그룹으로 나누어질 수 있다: 중성 활성 효소 및 산성 활성 효소. 인간 게놈에는 HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 및 PH20/SPAM1인 6개의 히알루로니다제-형 유전자가 있다. HYALP1은 슈도유전자이며, HYAL3은 어느 공지의 기질에 대해서도 효소 활성을 보유하지 않는 것으로 나타났다. HYAL4는 콘드로이티나제이며 히알루로난에 대한 활성이 없다. HYAL1은 기본형 산성 활성 효소이며 PH20은 기본형 중성 활성 효소이다. HYAL1 및 HYAL2와 같은 산성 활성 히알루로니다제는 중성 pH(pH 7)에서 촉매 활성이 없다. 예를 들어, HYAL1은 pH 4.5이상에서 생체외에서 촉매 활성이 없다 (Frost et al Anal Biochemistry, 1997). HYAL2는 생체외에서 매우 낮은 비활성을 갖는 산성 활성 효소이다.
히알루로니다제-형 효소는 또한 인간 HYAL2와 인간 PH20과 같이 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커를 통하여 혈장막에 고정되는 것들 (Danilkovitch-Miagkova, et al.Proc Natl Acad Sci U SA. 2003 Apr 15;100 (8): 4580-5, Phelps et al., Science 1988) 및 인간 HYAL1과 같이 가용성인 것들 (Frost et al,Biochem Biophys Res Commun. 1997 Jul 9; 236(1): 10-5)을 특징으로 할 수 있다. 하지만, 종에 따라 다르다: 소의 경우, 예를 들어 PH20은 혈장 막에 매우 느슨하게 부착되며, 포스포리파제 민감성 앵커를 통하여 고정되지 않는다 (Lalancette et al,Biol Reprod. 2001 Aug; 65 (2): 628-36). 소 히알루로니다제의 이 독특한 특징은 임상 사용을 위한 추출물로서 가용성 소 고환 히알루로니다제 효소의 사용을 허용하였다 (Wydase®, Hyalase®). 다른 PH20 종은 계면활성제 또는 리파제를 사용하지 않고서는 비가용성인 지질 고정된 효소이다. 예를 들어, 인간 PH20은 GPI 앵커를 통하여 혈장 막에 고정된다. 폴리펩티드내로 지질 앵커를 도입하지 않는 인간 PH20 DNA 구조체를 만들기 위해 시도한 결과 촉매적으로 비활성인 효소, 또는 불용성 효소가 얻어졌다 (Arming et al Eur J Biochem. 1997 Aug 1; 247 (3): 810-4). 자연 발생의 머카크 정자 히알루로니다제는 가용성 형태 및 막 결합 형태 둘다로 발견된다. 64 kDa의 막 결합 형태는 pH 7.0에서 효소 활성을 보유하는 한편, 54 kDa 형태는 단지 pH 4.0에서만 활성이다 (Cherr et al, Dev Biol. 1996 Apr 10; 175(1): 142-53.). 따라서, PH20의 가용성 형태는 종종 중성 조건하에서는 효소 활성이 없다.
콘드로이티나제는 동물 전체에서 발견되는 효소이다. 이들 효소는 엔도글리코시다제 반응을 통하여 글리코스아미노글리칸을 분해한다. 공지의 콘드로이티나제의 구체적인 예는 콘드로이티나제 ABC (프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 유래; 일본 특허 출원 공개 제6-153947호, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, and T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968)); 콘드로이티나제 AC (플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)에서 유래; T. Yamagata, H. Saito, 0. Habuchi, and S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)); 콘드로이티나제 AC II (아르트로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens)에서 유래; K. Hiyama, and S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824(1975), K. Hiyama and S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201(1976)), 히알루로니다제 ACIII (플라보박테리움 종 Hp102에서 유래; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, and Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023(1989)), 콘드로이티나제 B(플라보박테리움 헤파리 움에서 유래; Y. M. Michelacci and C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973(1974), Y. M. Michelacci and C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975), Kenichi Maeyama, Akira Tawada, Akiko Ueno, and Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189(1985)); 콘드로이티나제 C (플라보박테리움 종 Hp102에서 유래; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Kelichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa, and Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023(1939)) 등을 포함한다.
당단백질은 하나 이상의 탄수화물 부분에 공유 결합된 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 그들의 구성 단백질에 N-글리코시드 또는 O-글리코시드 결합을 통해 결합된 탄수화물을 보유하는 당단백질은 두 가지 카테고리가 있다. N- 및 O-결합된 글리칸은 각각 아스파라긴-N-아세틸-D-글루코스아민 및 세린 (트레오닌)-N-아세틸-D-갈락토스아민 결합을 통하여 폴리펩티드에 부착된다. 복잡한 N-결합된 올리고당은 말단 만노즈 잔기를 함유하지 않는다. 이들은 단지 말단 N-아세틸글루코스아민, 갈락토스, 및/또는 시알산 잔기를 함유한다. 하이브리드 올리고당은 말단 N-아세틸글루코스아민, 갈락토스, 및/또는 시알산 잔기뿐만 아니라 말단 만노즈 잔기를 함유한다.
N-결합된 당단백질의 경우, 올리고당 전구체는 소포체에서 펩티드 합성동안 아스파라긴의 아미노기에 부착된다. 올리고당 성분은 이어서 당 성분을 제거하고 추가하는 특정 효소 시리즈에 의해 순차적으로 가공된다. 프로세싱은 소포체에서 일어나며 시스-, 중간- 및 트랜스-골지체를 통과하면서 계속된다.
발명의 개요
본원에서는 특히 가용성 중성 활성 히알루로니다제 당단백질 패밀리(본원에 서는 sHASEGP로도 불림)의 멤버인 가용성 글리코사미노글리카나제 효소가 제공되며, 바람직한 멤버는 인간의 가용성 중성 활성 히알루로니다제 당단백질, 특히 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질(본원에서는 rHuPH20으로도 불림)이다. 본원에서 제공되는 가용성 중성 활성 히알루로니다제는 각각 본원에서 sHASEGP로 명명된 sHASEGP 패밀리 멤버이다. 가용성 히알루로니다제 도메인 및 이의 용도 또한 제공된다. (본원에서 때때로 GAG 효소로도 일컬어지는) 가용성 글리코사미노글리카나제의 다수의 용도 및 적용예는 본원에서는 (예컨대, 포유동물 신체 조직내에 약리학적 제제 및 기타 제제의 전달을 촉진하는 데) 예시적 글리코사미노글리카나제로서 rHuPH20을 사용하여 예시되지만, 본원에 개시된 것들 및 업계에 공지된 다른 것들과 같은 다른 글리코사미노글리카나제가 이러한 다수의 적용예에 적용될 수 있음은 당업자라면 인지할 것이다. sHASEGP와 같은 현재의 바람직한 가용성 글리코사미노글리카나제는 약간의 히알루로니다제 활성을 나타내며 다른 글리코사미노글리카나제 활성도 나타낼 수 있다. 인간 가용성 글리코사미노글리카나제는 현재 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 다수의 의학적 적용예를 비롯하여 효소가 인간 신체내에서 사용되는 적용예에 바람직하다.
본 발명의 한 양태는 인간 PH20 cDNA의 카르복시 말단에 아미노산을 인코딩하는 좁은 영역이 결여된 핵산을 도입함으로써 포유동물 발현 시스템에서 가용성 중성 활성 히알루로니다제 활성이 고수율로 생성될 수 있다는 발견에 기초한 것이다. 비천연 리더 펩티드를 사용하여 분비를 증대시키기 위한 sHASEGP의 추가 변형도 제공된다. 나아가, sHASEGP를 변형하여 자연적인 글리코실화에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및/또는 번역후 변형에 의하여 단백질을 마스킹함으로써 반감기를 연장하는 방법도 제공된다. 가용성 중성 활성 인간 히알루로니다제 당단백질을 생성시키려는 이전의 시도는 성공적이지 못하였다. 인간 히알루로니다제 폴리펩티드를 절단하면 중성 효소 활성이 손실되고 포유동물의 발현 시스템에서 세포가 재조합 단백질을 분비할 수 없게 된다는 결론에 이르렀다(Arming, et al Eur J Biochem 1997 Aug 1;247 (3):810-4). 히알루로니다제로서 치료적 유용성과 상업적 생산을 위한 중성 활성의 분비 sHASEGP를 생성시키는 것이 중요하다. 본원에 개시된 본 발명은 이러한 과제 및 다른 과제를 해결한다.
본 발명은 또한 sHASEGP가 하나 이상의 N-결합 당 부분을 가지는 촉매 활성 인간 sHASEGP 당단백질을 더 포함한다. 본원에 제시된 연구는 인간 PH20은 촉매 활성에 N-결합된 글리칸을 필요로 하는 반면, 소 및 벌 독 히알루로니다제는 그러한 N-결합된 글리칸 없이도 활성임을 보여준다. N-결합된 부분이 없는 인간 히알루로니다제 PH20 도메인은 촉매적으로 비활성이다. 따라서 고전적인 재조합 DNA 기법은 이. 콜라이에서 생산될 수 있는 벌 독 히알루로니다제와 달리, 촉매적으로 활성인 인간 sHASEGP의 생산을 허용하지 않는다.
본 발명은 상기 N-결합된 당 부분을 도입할 수 있는 세포를 이용하거나 또는 상기 N-결합된 부분을 sHASEGP 폴리펩티드상에 도입함으로써, N-결합된 sHASEGP 당단백질 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법과 세포를 포함한다. 적절히 글리코실화된 sHASEGP를 확인하는 방법 또한 개시된다.
촉매적으로 활성인 페길화(PEG화)된 및/또는 과시알화된 sHASEGP 당단백질 또한 제공된다. 페길화된 및/또는 과시알화된 sHASEGP는 자연 발생하는 비시알화된 소 및 양 고환 sHASEGP과 비교할 때 더 큰 혈청 반감기를 보유하며, 따라서 효소 안정성을 위해 그리고 연장된 반감기가 바람직한 환경(통상적으로 정맥내 전달의 경우)에서 약물 또는 보조제로서 사용하기에 바람직하다. 본 발명은 페길화된 및/또는 과시알화된 sHASEGP의 제조 방법, 그 조성물 및 용도를 제공한다. 특정 적용예 또는 작용 기전으로 제한하려는 것은 아니지만, 일반적으로 sHASEGP 및 다른 글리코사미노글리카나제에 대한 PEG 부분의 부착을 이용하여 분자를 효과적으로 보호하여 프로테아제에 대한 상대적인 감작성을 감소시키고 잠재적으로 신체로부터의 청소 및 제거 속도 및 범위를 감소시킬 수 있다고 고려된다. 이러한 원리 및 기술을 다른 글리코사미노글리카나제에 적용하여, 마찬가지로 이러한 다른 글리코사미노글리카나제의 페길화되고 과시알화된 및/또는 다르게 변형된 형태를 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 방법 및 기술(예컨대, 신체 조직에서 약물 및 기타 제제의 분산을 촉진하기 위한 기술)로 생성 및 사용할 수 있다.
자연적으로 GPI 앵커가 없는 sHASEGP의 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 단백질 또한 제공된다.
금속 이온을 갖는 가용성 sHASEGP 당단백질을 포함하는 sHASEGP의 조성물이 추가로 제공되며, 이때 금속 이온은 칼슘, 마그네슘 또는 나트륨이다. sHASEGP는 상기 금속의 존재하에서 최적 활성이다. 상기 금속 이온의 존재하에서 sHASEGP로 구성되는 제제 또한 제공된다.
반감기를 더 연장시키기 위한 sHASEGP의 변형이 제공된다. 폴리에틸렌 글리 콜 및 덱스트란과 같은 중합체를 이용한 sHASEGP 및 다른 글리코사미노글리카나제의 화학적 변형이 제공된다. 그러한 변형은 sHASEGP가 순환계 및 면역 시스템으로부터 제거되지 않도록 하며, 또한 만노즈와 어시알로당단백질을 위한 글리코실화 수용체를 차단한다. 글리코실화 부위, 양성 전하를 띤 아미노산 및 시스테인과 같은 특정 기능성 기에 연결시키는 방법이 추가로 제공된다.
작은 분자를 비롯한 화합물과 같은 효과인자, 및 pH, 온도 및 이온 강도와 같은, sHASEGP의 활성화, 발현 또는 활성을 조절하는 조건을 확인하는 분석 또한 여기서 제공된다. 예시적인 분석에서, sHASEGP의 히알루로니다제 도메인이 공지의 기질, 일반적으로 글리코스아미노글리칸 또는 프로테오글리칸을 절단하는 능력에 대한 시험 화합물의 효과를 평가한다. 히알루로니다제 도메인의 활성을 조절하는 제제, 일반적으로 화합물, 특히 작은 분자는 sHASEGP의 활성을 조절하기 위한 후보 화합물이다. 히알루로니다제 도메인은 또한 활성을 교란하는 기능을 갖는 히알루로니다제-특이적 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 여기서 제공된 히알루로니다제 도메인은 생체외에서 촉매 활성을 나타내는 C-말단 절단된 그 일부를 갖는 N-말단 글리코실-히드로라제 도메인을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
단백질 및 히알루로니다제 도메인을 코딩하는 핵산 분자 또한 제공된다. 가용성 히알루로니다제 도메인 또는 촉매적으로 활성인 그 일부를 코딩하는 핵산 분자 및 또한 전체 길이 sHASEGP를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 히알루로니다제 도메인과 그 하부의 핵산을 코딩하는 핵산은 서열 번호 6에 개시되며, 예시적 sHASEGP의 히알루로니다제 도메인은 서열 번호 1(아미노산 35-464)에 개시된다. 전 체 길이 sHASEGP의 단백질 서열 및 코딩 핵산 서열은 서열 번호 1 및 6에 개시된다.
그들의 전체 길이 또는 전체 길이의 적어도 약 70%, 80%, 또는 90%를 따른 그러한 sHASEGP-코딩 핵산에 하이브리드하며 히알루로니다제 도메인 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 하이브리드화는 일반적으로 적어도 낮은, 일반적으로 적어도 중간의, 그리고 종종 높은 엄격도 하에서 이루어진다.
분리된 핵산 단편은 게놈 또는 cDNA를 비롯한 DNA이거나, 또는 RNA이며, 또는 단백질 핵산 또는 다른 뉴클레오티드 유사체와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 분리된 핵산은 이종성 또는 천연 프로모터, 및 다른 전사 및 번역 조절 서열과 같은 추가 성분을 포함할 수 있으며, 이들 유전자는 리포터 유전자 또는 다른 지시자 유전자 또는 지시자를 코딩하는 유전자에 연결될 수 있다.
sHASEGP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부에 상보적인 분자의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자가 제공된다.
프로브 또는 프라이머로 이용될 수 있으며 서열 번호 6에 개시된 적어도 약 10 내지 16 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20 누클레오티드 이상 일반적으로 1000 미만, 일반적으로 100 미만 뉴클레오티드(또는 그 상보체)를 함유하거나, 또는 적어도 약 30 뉴클레오티드(또는 그 상보체)를 함유하거나 또는 임의의 그러한 단편 또는 올리고뉴클레오티드에 그들의 전체 길이(또는 적어도 약 70, 80 또는 90%)를 따라 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 상기 분리된 핵산 분자의 단편이 제공된다. 단편의 길이는 그들이 이용되는 목적의 함수 및/또는 대상 게놈의 복잡성의 함수이다. 일반적으로 프로브 및 프라이머는 약 50, 150 또는 500 뉴클레오티드 미만을 함유한다.
여기서 제공된 임의의 핵산 분자를 함유하는 플라스미드 또한 제공된다. 상기 플라스미드를 함유하는 세포 또한 제공된다. 그러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균류 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
sHASEGP를 효율적으로 분비할 수 있는 시그널 리더를 이용하는 개선된 포유류 발현 시스템 또한 제공된다. 그러한 효율적인 분비 리더 펩티드 아미노산 서열 및 sHASEGP와의 융합 단백질의 예는 서열 번호 43 및 46에서 발견된다.
전술한 세포를, sHASEGP가 세포에 의해 발현되는 조건하에서 성장시키고, 발현된 sHASEGP 폴리펩티드 또는 당단백질을 회수함으로써 sHASEGP를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 다른 sHASEGP를 코딩하는 핵산을 분리하기 위한 방법이 또한 제공된다.
sHASEGP 폴리펩티드가 세포의 표면에 발현되는 포유류 세포 및 효모 세포와 같은 세포, 일반적으로 진핵 세포가 또한 제공된다. 그러한 세포는 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 약물 스크리닝 분석에서 이용된다. 생체외 결합 분석 및 전사계 분석을 비롯한 이들 분석에서는, sHASEGP에 의해 직접, 또는 프로-성장 인자의 활성화를 통해서와 같이 간접적으로 매개되는 시그널 전달이 평가된다.
그러한 핵산 분자에 의해 코딩된 펩티드가 또한 제공된다. 특이성 및/또는 히알루로니다제 활성이 실질적으로 변하지 않고 남아 있는 아미노산 변화를 갖는 sHASEGP 히알루로니다제 도메인 또는 폴리펩티드가 이들 폴리펩티드에 포함된다. 특히, 분비된 중성 촉매 활성을 포함하는 실질적으로 정제된 포유류 sHASEGP 당단백질이 제공된다.
본 발명은 또한 히알루로니다제 촉매 도메인을 포함하며 다른 도메인을 추가적으로 포함할 수도 있다. sHASEGP는 동종이량체를 형성할 수도 있으며 또한 막결합 단백질과 같은 일부 다른 단백질과 이종이량체를 형성할 수 있다. 또한 sHASEGP에 대하여 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 당단백질이 제공되며, 이때 퍼센티지 동일성은 퍼센티지 동일성을 최대화하는 갭 패널티 및 표준 알고리즘을 이용하여 결정된다.
sHASEGP의 스플라이스 변이체, 특히 촉매적 활성 히알루로니다제 도메인을 갖는 것들이 여기서 고려된다.
다른 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인 또는 촉매적으로 활성인 그 일부를 포함하지만 서열 번호 1에 개시된 아미노산의 전체 서열을 포함하지는 않는 실질적으로 정제된 폴리펩티드가 제공된다. 이들 중에는 서열 번호 1 또는 3에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드가 있다.
특정 구체예에서는, 진핵성 sHASEGP로 표시되는, 진핵성 히알루로니다제 당단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다. 특히, 핵산은 서열 번호 6에 개시된 뉴클레오 티드의 서열, 특히 서열 번호 6의 뉴클레오티드 106-1446으로 개시된 서열, 또는 촉매적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 그 일부를 포함한다.
적어도 낮은 엄격도, 일반적으로 온건한 엄격도, 더욱 일반적으로 높은 엄격도의 조건하에서 서열 번호 6 또는 그 축퇴물에 하이브리드하는 핵산 분자가 또한 제공된다.
한 구체예에서, 분리된 핵산 단편은 높은 엄격도 조건하에서 서열 번호 6에 개시된 뉴클레오티드 서열(또는 그 축퇴물)을 함유하는 핵산 분자에 하이브리드한다. 전체 길이 sHASEGP는 서열 번호 1에 개시되며 서열 번호 6 또는 그 축퇴물에 의해 코딩된다.
sHASEGP의 히알루로니다제 도메인의 뮤테인, 특히 자유로운 (즉, 히알루로니다제 도메인의 임의의 다른 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하지 않는) 히알루로니다제 도메인의 Cys 잔기가 다른 아미노산 치환기, 반드시 그러하지는 않지만 일반적으로 보존적 아미노산 치환기 또는 활성을 제거하지 않는 치환기로 치환되는 뮤테인, 및 특정 글리코실화 부위(들)가 제거되는 뮤테인이 또한 제공된다.
그 스플라이스 변이체를 포함하며 이에 한정되지 않는 sHASEGP 폴리펩티드, 및 sHASEGP, 그 도메인, 유도체 및 유사체를 코딩하는 핵산이 여기서 제공된다. sHASEGP를 형성하기 위해 시그널 펩티다제의 활성화에 의해 생성되는 것과 기능적으로 등가인 N-말단을 갖는 단일쇄의 분비된 히알루로니다제 당단백질이 또한 제공된다. 서열 번호 1에 예시된 sHASEGP의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에서 7개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위가 있다. Cys 잔기 C60-C351 및 Cys 잔기 C224-C238 사이에서 이황화 결합이 형성되어 코어 히알루로니다제 도메인을 형성한다. 하지만, 중성 효소 촉매 활성을 위해서는 카르복시 말단에서 추가의 시스테인이 필요하여 서열 번호 1의 아미노산 36 내지 Cys464의 sHASEGP가 최소 활성 인간 sHASEGP 히알루로니다제 도메인을 포함한다. 따라서, N-결합된 글리코실화 부위 N-490은 적절한 sHASEGP 활성에 필요하지 않다. 당업자라면 인지하게 될 바와 같이, 그 유용 활성을 실질적으로 제거 또는 일부 경우 실질적으로 감소 (또는 잠재적으로 개선)시키지 않는 한 본원에 개시 및 예시된 조성물에 약간의 변화를 줄 수 있고, 이에 따라서 본원에 개시된 바와 같은 여러 적용예에서 유사하게 사용할 수 있다.
일부 sHASEGP(예컨대, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 sHASEGP)의 N-결합된 글리코실화는 그들의 촉매 활성 및 안정성에 매우 중요할 수 있다. 당단백질을 변형하는 글리칸 타입을 변화시키면 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 가용성, 및 안정성에 극적인 영향을 줄 수 있지만, 대부분의 효소는 적절한 효소 활성을 위해 글리코실화를 요구하지 않는 것으로 생각된다. 따라서 sHASEGP는 N-결합된 글리코실화의 제거가 히알루로니다제 활성의 거의 완전한 불활성화를 야기할 수 있다는 점에서 독특하다. 이러한 sHASEGP에서 N-결합된 글리칸의 존재는 활성 효소를 생성하는 데 중요하다. 중요한 N-결합된 글리코실화 잔기를 sHASEGP에 도입하는 데 적합한 단백질 발현 시스템이 포함된다. 추가로, N-결합된 글리칸을 도입할 수 있는 추출물의 존재하에서 탈글리코실화된 sHASEGP 폴리펩티드의 도입이 포함된다. 본 발명의 한 양태에서는, 시알화로 캡핑된 복잡한 글리코실화가 개시되며 자유 만 노즈 잔기로 캡핑된 다른 것들 또한 고려된다. 바람직하게는, 시알산 잔기는 sHASEGP에서 N-결합된 글리코실화의 말단 잔기에서 발견된다.
N-결합된 올리고당은 몇 가지 주요 타입으로 나뉘며(올리고만노스, 복합체, 하이브리드, 황화), 이들 모두다 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아님)내에 속하는, Asn 잔기의 아미드 질소를 통하여 부착된 (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys- 부위에서의 글리코실화는 응집 단백질 C에 대해 보고되어 왔다. N-결합된 부위는 종종 서열 결정동안 "블랭크" 사이클의 출현으로 간접적으로 지정된다. 글리코실화된 Asn을 Asp로 전환시키는 PNG아제 F에 의해 올리고당을 방출시킨 후 양성 확인이 이루어질 수 있다. PNG아제 F 방출 후, N-결합된 올리고당은 Bio-Gel P-6 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 올리고당 풀은 제조성 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)에 노출된다 (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). 일부 올리고당 아이소머는 HPAEC를 이용하여 분리될 수 있다. 푸코스 잔기는 HPAEC 크로마토그램에서 용출 위치를 더 앞으로 이동시킬 것이며, 한편 추가의 시알산 잔기는 보유 시간을 증가시킬 것이다. 올리고당 구조가 공지된 당단백질(예, 소 페투인, a-l 산 당단백질, 난백알부민, RNAse B, 트랜스페린)을 동시에 처리하면 올리고당 피크의 지정을 촉진할 수 있다. 수집된 올리고당은 조성 분석 및 메틸화 결합 분석의 조합에 의해 특징을 규명하며(Waeghe et al., (1983) Carbohydr Res. 123, 281-304), 이때 아노머 형태는 NMR 분광광도법에 의해 지정된다 (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
본원에 개시된 인간 sHASEGP rHuPH20으로 예시되는 일부 sHASEGP의 경우, sHASEGP는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합을 둘다 포함할 수 있다. 예컨대, rHuPH20(하기 실시예에 개시된 바와 같이 DG44 CHO주 3D3에서 제조)은 N-결합 올리고당 뿐만 아니라 0-결합 올리고당도 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 sHASEGP의 글리코시드 변형(예컨대, 이러한 N-결합 및/또는 0-결합된 올리고당의 하나 이상의 치환, 제거 또는 변경을 포함하는 변형)을 이용하여 특정 적용예에 바람직하도록 변경된 약력학적 및/또는 약동학적 프로필을 보이는 글리코시드 변이체 sHASEGP를 생성시킬 수 있다. 예시로서, 그러나 특정 작용 기전에 제한되지 않고, 세포 또는 기타 수용체에의 결합에 관여하는 하나 이상의 N-결합 및/또는 O-결합 올리고당의 제거 또는 변경 (예컨대, 캡핑 또는 비노출에 의함)하여 sHASEGP가 특정 조직에 결합하거나 또는 특정 조직에 의하여 흡수되는 속도 및/또는 범위를 변경할 수 있으며, 이를 이용하여 (예컨대, 그 혈청 반감기를 증가시키거나 또는 생체 흡수를 변경시킴으로써) 예컨대 약력학적 프로필을 변경할 수 있다.
sHASEGP의 제제가 또한 제공된다. sHASEGP는 동결건조 형태 및 안정화된 용액으로 조제될 수 있다. 칼슘, 마그네슘, 또는 나트륨과 같은 특정 금속 이온을 함유하는 제제는 중성 pH에서의 적절한 활성을 위해 유용하다. 안정화된 용액 제제에 더하여, 서방성 제제가 글리코스아미노글리칸의 연장된 제거를 위해 여기서 고려된다. 안내 외과 수술 및 다른 소부피 수술을 위해 소부피의 sHASEGP를 투여하기 위한 sHASEGP의 예비 포장된 시린지를 제공하는 키트가 또한 여기서 제공된다. 인공수태술에 생체외 사용하기 위한 균형화된 염 제제 또한 제공된다.
글리코스아미노글리칸의 제거에서 sHASEGP의 사용 방법 또한 제공된다. sHASEGP는 글리코스아미노글리칸의 분해를 통하여 간질 공간의 채널을 개방하여 500 nm 미만 크기의 분자의 확산을 허용한다. 이들 채널은 투여량 및 제제에 따라 24-48시간 동안 유지된다. 그러한 채널은 유체, 작은 분자, 단백질, 핵산 및 유전자 치료 벡터 및 500 nm 미만 크기의 다른 분자와 같은 외부에서 첨가된 분자의 확산을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 특정 이론 및 작용 기전에 제한됨 없이, 이러한 채널의 형성은 간질강내에서 대량의 유체 흐름을 촉진할 수 있고, 이에 따라 본원에서 "이류성 수송(convective transport)" 또는 단순히 이류로 언급되는 방법으로 유체에 의하여 효과적으로 운반되는 용질(예컨대, 검출 가능한 분자 또는 기타 진단 제제, 마취제 또는 기타 조직 변형제, 약리학적 또는 약제학적으로 효과적인 제제 또는 화장 또는 기타 미용 제제)의 분산 또는 이동을 촉진할 수 있다고 믿어진다. 이러한 이류성 수송은 실질적으로 분자 확산 속도 및 축적 효과를 초과할 수 있으며, 따라서 치료제 또는 기타 투여 분자가 더 신속하고 효과적으로 조직에 관류하게 할 수 있다. 또한, 치료제 또는 기타 제제(예컨대, 소분자 약물 또는 대분자 또는 복합물)를 sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)와 함께 동시에 제형화하거나 동시 투여하고 둘다 비침윤적 비경구 투여 부위와 같은 비교적 제한된 국소 부위(예컨대, 피내, 피하, 근내 또는 기타 내부 조직, 기관 또는 신체내 다른 상대적으로 제한된 공간내 또는 그 주위)로 주입할 경우, 투여량과 관련된 유체는 국소적인 구동력(즉, 정수압)을 제공하고 (간질 기질내에서 채널을 개방함으로써) 임피던스를 낮출 수 있는데, 이것은 둘 다 유체 흐름을 증가시키고 이로써 유체내 함유된 치료제 또는 기타 분자의 이류성 수송을 증가시킨다. 본원에서 더 상세히 개시 및 예시되고 당업자라면 인식하게 될 바와 같이, 이러한 sHASEGP 및 기타 글리코사미노글리카나제의 용도 양태는 생체 이용가능률을 개선시키고 동시 제형화되고 동시 투여되는 제제의 다른 약력학적 및/또는 약동학적 특징을 조절하는 데 실질적으로 유용할 수 있다.
sHASEGP는 또한 허혈 재관류, 염증, 동맥경화증, 부종, 암, 척수 손상 및 상처의 다른 형태에 따라 발생하는 것들과 같은 과량의 글리코스아미노글리칸을 제거하기 위해 이용될 수 있다. 일부 경우에, sHASEGP는 정맥내 주입에 의해 전신성으로 전달될 수 있다. 이것은 심장 또는 뇌 또는 질병이 신체 전체에 걸쳐 있는 파종 종양의 경우와 같이 국소적 접근이 용이하지 않을 때 도움이 된다. 과시알화된 sHASEGP는 말단 시알산이 없는 천연 히알루로니다제 효소에 비하여 혈청 반감기와 분포를 증가시키기에 바람직하다.
척수 손상 및 기타 신경계 질환, 녹내장 및 기타 특정 안질환, 그리고 각종 자기면역, 염증성 병태, 암 및 기타 만성적으로 진행하는 질환 및 병태, 및 미용 치료와 같은 일부 경우에서, 지속적인 전달이 바람직하다. 당업자라면 이해하게 될 바와 같이, 대상 분자의 서방 또는 지연 방출 제제 또는 데포를 제공하기 위하여 다수의 상이한 조성물 및 기술이 개발되어 왔다.
다른 경우에는, 한번의 짧게 작용하는 투여량이 바람직하다. 글리코스아미노글리칸의 일시적인 제거를 이용하여 용액 및 약물의 간질강내로의 전달을 증가시킬 수 있다. 이것은 마취제의 확산 및 치료 액, 분자 및 단백질의 투여에 유용할 수 있다. sHASEGP (및/또는 다른 글리코사미노글리카나제)의 존재하에서 분자의 피하 및 근육내 투여는 또한 그들의 전신성 분포를 더욱 신속하게 촉진한다. 그러한 방법은 정맥내 접근이 이용가능하지 않거나 또는 분자의 더욱 신속한 전신성 전달이 필요할 경우 매우 유용하다. 피하 투여시 생체이용률이 좋지 못한, 인자 VIII와 같은 다른 큰 분자의 전달은 그들의 이용가능성을 높이기 위해 sHASEGP와 함께 주사될 수 있다.
난모세포를 둘러싼 난구(cumulus matrix)를 효소적으로 제거하기 위하여 sHASEGP를 이용하는 것이 제공된다. 추출물에서 유래된 히알루로니다제의 독성 오염물이 없는 정제된 sHASEGP를 이용하여 난구를 제거하면 보다 높은 생존가능성으로 난모세포를 부드럽게 회수할 수 있다. 또한, sHASEGP는 전염성 스폰지형태 뇌병증과 같은 바이러스 및 다른 병원균을 보유한 소 추출물 또는 다른 유기체를 사용하지 않고 제조될 수 있다.
안내에서의 사용을 위해 작은 공간에 대하여 소부피의 sHASEGP를 주사하는 것이 이용될 수도 있다. sHASEGP는 수술동안 투여되는 과량의 점탄성 기질을 제거하기 위해 눈의 전실내로 주사될 수 있다. sHASEGP의 안내 주사는 또한 녹내장에서 안내 압력을 감소시키기 위해, 유리체 응집물 또는 "부유물"을 용해시키기 위해, 또는 반상 퇴화의 치료를 위하여, 유리체 출혈을 제거하기 위해, 당뇨성 망막병증에서 유리체 망막 탈착을 촉진하기 위해, 그리고 다른 효소와 혼합되어 교정 렌즈를 따라 각막의 재성형을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, sHASEGP 및/또는 기타 글리코사미노글리카나제는 또한 눈 또는 안와 주위의 공간으로 주입하여 "전착제"의 형태로서 표적 조직내 및/또는 표적 조직 주위로의 진 단, 마취 또는 약학 제제의 전달을 촉진할 수 있다. 예컨대, sHASEGP를 진단 제제, 마취제 또는 약리학적 제제의 주입과 동시에 또는 근접하게 서브테논강 또는 공막강으로 주입하여 약물의 눈 내부(예컨대, 맥락막, 망막 및 유리체)로의 공막 경우 전달을 촉진할 수 있다. 상공막강은 Fascia Bulbi(테논 캡슐)과 공막(맥락막 및 망막과 눈의 내부를 둘러싸는 비교적 강한 보호 조직) 사이의 림프를 함유하는 강이다. 종종 공막 근처 림프강으로도 언급되는 서브테논강 또는 상공막강은 일반적으로 경막하강 및 거미막하강과 연속되며 근막으로부터 공막까지 연장되는 연결 조직의 밴드가 횡단한다. 당업자라면 인식하게 될 바와 같이, 눈을 덮는 보호 공막층을 가로질러 조성물의 전달을 촉진하는 능력은 매우 다양한 약리학적 제제 및 기타 제제가 맥락막, 망막 또는 유리액과 같은 안내 조직으로 편리하고 효율적으로 전달될 수 있게 한다. 눈의 후부에서와 같이 조직에 도달하기가 비교적 곤란한 생체내 전달 경로로 본 발명 조성물을 적용함으로써 최소 침윤 수단에 의하여 치료할 수 있다. 일부 경우에, 페길화된 sHASEGP와 같은 오래 지속되는 sHASEGP의 사용이 바람직할 것임이 인식될 것이다.
동물에서 유래되는 히알루로니다제는 특정 안질환의 치료에 적용될 수 있거나 적용되어 왔지만, 마취제 및 기타 치료적 또는 약리학적 제제의 전달을 촉진하는 확산 인자로서, 몇몇 중요한 고려들은 동물에서 유래되는 효소의 용도에 적용되고, 인간 치료용으로 이들을 사용하는 경우에 잠재적으로 이의 사용을 제한하거나 안전상 생각 또는 추가적인 위험성을 고려하게 한다. 이러한 고려에는 제제 중에 존재하는 단백질 및 다른 불순물이 살아있는 인간 조직에 적용될 때 면역원성 문제 및/또는 기타 문제를 야기할 수 있다는 생각이 포함된다. 또한, 비인간 동물 효소를 사용하는 한, 정제된 효소라도 비인간 기원이므로 면역원성에 더 기여할 수 있다. 또, (본원에 개시된 바와 같이) 분산을 효과적으로 촉진시키는 히알루로니다제와 같은 분해 효소의 잠재성은 상기 동물에서 유래된 생성물의 면역원성 형태 또는 제제가 면역 시스템에 의해 접촉되는 확률을 증가시킬 수 있다.
동물에서 유래된 및/또는 불순 인자에 대한 고려는 또한 예를 들어, 표적 조직이 수술 또는 기타의 절차를 이미 거친 상황, 제제가 상당한 면역 특혜 공간(예컨대 눈, 심장, 신경계 및 외부 환경에 전형적으로 노출되지 않는 기타 많은 조직 및 기관)에 유입되는 상황, 및/또는 환자가 면역력이 약화되거나 감염될 위험성이 증가된 상황과 같은 다수의 상황에서 중요성이 증가된다. 따라서, 이러한 동물에서 유래된 제제는 감염 또는 다른 합병증의 위험성이 이의 잠재적인 용도를 감소시키는 많은 적용예에서 사용하지 않을 수 있다. 상기 상황 또는 기타의 상황에서, 본 발명의 재조합으로 제조된 sHASEGP의 사용은, 매우 효율적이면서 바람직한 안전 프로파일을 보유하는 적용예를 제공할 수 있기 때문에, 이들 효소가 이롭게 사용되는 병태 및 상황을 개선하거나 확장하게 된다.
정맥내가 아닌 비경구 주사(예컨대 피내, 피하, 근내 주사, 및 혈관계 이외의 공간으로의 기타 주사)의 경우, 한 부피의 액체(예컨대, 약학적 부형제 또는 다른 용액) 중에 sHASEGP (및/또는 또다른 글리코사미노글리카나제) 및 또다른 제제(예컨대, sHASEGP 및 진단제, 마취제, 약리학적 제제, 안정제와 같은 또다른 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 공제제 또는 혼합물)를 주사 또는 주입에 의해 체내 의 영역(들)에 유입시킬 수 있다. 이론으로 한정하려는 의도는 아니나, 일부 힘이 약리학적 또는 기타 제제의 전달을 강화하는 작용을 할 수 있다고 생각된다(이의 정도는 부분적으로, 예를 들어 특정 조성물, 부피 및 투여 부위에 따라 다름). 이들 구동력은 유체 부피가 함유공간(예컨대 상기 참조된 서브-테논(sub-Tenon)의 공간, 또는 피부 내, 피하 내, 근육 내 또는 다른 비-IV 비경구 주사의 영역)에 효과적으로 가압될 시의 정수압의 증가, 유체가 이의 압력 구배 이하로 증가될 시(용해된 분자 또는 거대분자 착물이 이와 함께 운반됨)의 용질(또는 이류)의 이류성 수송의 이후 증가뿐만 아니라, 하류 세포간 매트릭스 또는 간질강 내의 글루코스아미노글리칸의 분해 및 수반하는 채널 형성에 의해 매개되는 확산 및/또는 침투의 감소를 포함할 수 있다.
sHASEGP가 안구 전방에 주사되어 과량의 점탄성 물질, 예컨태 글리코스아미노글리칸 함유 제제(이는 다양한 전안부 절차에서의 안구 수술 보조제로서 통상적으로 사용됨)를 제거하는 경우, 본 출원의 교시의 관점에서, sHASEGP를 사용하여, 수술 완료 후 눈에 남아 있는 적용된 점탄성물의 양을 감소시키는 데 통상적으로 이용되는 수술후 절차에 대한 필요성을 부가하거나 없앨 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 것이다. 더욱 효율적인 조작을 허용하고 잠재적으로 각막 내피 및 기타 조직을 보호하는 깊은 전방을 유지하기 위하여 일반적으로 점탄성물을 전안구 수술 중에 사용한다. 히알루로네이트 및/또는 콘드로이틴 설페이트를 함유하는 다양한 점탄성물이 전안부 절차와 같은 수술에 사용된다[예를 들어, ProvisoTM, ViscoatTM 및 DuoviscTM(알콘 레이버러토리 인코포레이티드(Alcon Laboratories, Inc.)로부터 입수가능함, www.alconlabs.com); HealonTM, Healon 5TM 및 Healon GVTM(어드밴스트 메디칼 옵틱스(Advanced Medical Optics)로부터 입수가능함, www.healon.com): AmviscTM 및 AmviscTM Plus(바우치 앤 롭(Bausch & Lomb)으로부터 입수가능함, www.bausch.com); I-ViseTM, I-ViseTM Plus, I-ViscTM 18 및 I-ViseTM Phaco(아이-메드 파마(I-MED Pharma)로부터 입수가능함, www.imedpharma.com); LA LONTM(제너럴 이노베이션(General Innovations)으로부터 입수가능함, www.generaltrade.net) 참조]. 그러나, 당업계에 알려진 바와 같이, 백내장 수술과 같은 수술 절차 후의 전방에 잔존하는 점탄성물은 전방으로부터의 약화된 유출(잠재적으로 섬유주를 통한 유출의 감소에 의함)을 유도하여 안압 상승(IOP 스파이크)으로 녹내장을 유도할 수 있는 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 sHASEGP는, 예를 들어 히알루로난과 같은 글루코스아민글루칸을 함유하는 먼저 적용된 점탄성 제제에 대한 '점탄성 해독제'로서 눈의 전방에 주입에 의하여 도입시킬 수 있다. 이러한 점탄성 해독제를 사용하기 위해, sHASEGP은 전안부 절차, 예컨대 백내장 수술 및 인공수정체 삽입술(예를 들어, 수정체 유화술 또는 피막술), 녹내장 여과 수술(섬유주절제술), 각막 이식 수술(예를 들어, 전층각막이식술), 외상후 눈수술 등 후에, 전방으로 수술후 주입[앞서 적용된 점탄성물의 일부 부위를 제거하기 위한 선관주 또는 흡인에 의해서나 이에 의하 지 않음]에 의해 유입되게 되는 것이 일반적이다. 당업자에게 이해되게 되는 바와 같이, 이와 같이 적용되는 sHASEGP의 양은, 특히 이의 특정 활성뿐만 아니라 사용되는 점탄성물의 양 및 점탄성물이 우선 물리적으로 제거되었는 지(예를 들어 관주 및 흡인에 의함)의 여부에 따라 다르게 된다. 따라서, 각각의 적용은, 본 발명의 설명 및 예시의 관점에서 당업자에게 이해되는 바와 같이, 특히 환경에 대해 최적화되게 되는 것이 일반적이다.
일부 점탄성물, 예컨대 ViscoatTM 및 DuoviscTM(알콘 랩스(Alcon Labs)로부터 입수가능함)는 히알루로네이트 및 콘드로이틴 설페이트 둘 모두를 포함한다. 이롭게는, 본 발명의 많은 sHASEGP는 히알루로니다제 및 콘드로이티나제 양쪽으로서 효소적으로 활성이므로 이중 제제 점탄성물에 특히 적합하게 된다.
또한, sHASEGP를 포함하는 히알루로니다제는, 종래 기술에서와 같은 적용예에서는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제(예컨대, 콘드로이티나제)와 배합될 수 있거나, 본원에 개시 및 예시된 것과 같은 다른 적용예에서는 간질강내로 채널을 더 개방한다.
점탄성물이 기타 절차에 또한 사용하는 경우, 본 발명의 sHASEGP는 적용된 점탄성물, 즉 점탄성 해독제의 양을 감소시키거나 없애기 위한 기술과 병용하거나 대체하여 사용될 수 있다.
눈 조직과 같은 조직에서 전착제로서 sHASEGP를 사용하는 데 있어서, 본 원에서 기술한 바와 같이 하나 이상의 sHASEGP를 포함하는 제제는 마취제, 진단제, 약리학적 제제, 및 표적 조직으로 또는 그 주변으로 전달될 것으로 생각되는 기타의 제제를 적용하기 이전에 또는 동시에 표적 조직에 적용하는 것이 일반적이다. 일부 경우에서, sHASEGP는 제1 조직을 거쳐 이 제1 조직에서 먼 하나 이상의 조직을 목표로 하는 약리학적 제제 또는 기타 제제의 전달을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공막외공간에 약리학적 제제 또는 기타 제제를 유입하기 이전에 또는 동시에 눈 주위의 공막외공간에 sHASEGP를 유입시켜 보호 공막 조직을 거쳐 맥락막, 망막 및 유리체로 상기 제제를 전달시키는 것을 촉진시킬 수 있다. 이와 같이, 맥락막, 망막 및/또는 유리체의 병태를 치료하는 데 유용한 다수의 약리학적 제제 및/또는 기타 제제는 상기 표적 조직에 상대적으로 국부적으로 전달되는 동시에 상대적으로 비침윤적인 접근, 예컨대 서브 테논 주입을 사용하여 전달될 수 있다. 본 원에서 기술하고 예시하는 바와 같이, 체내 하나의 조직 또는 위치에 sHASEGP를 적용하여 상기 조직 또는 위치 내에 및/또는 원위 영역으로 약리학적 제제 또는 기타 제제의 전달을 촉진하는 다른 상황들에 있어서도 유사한 상황이 존재한다.
동시 제형화 또는 동시 투여된 제제의 분산 범위 및 속도는 부분적으로 관련 조직 및 제제에 따라 달라지지만, 이러한 분산은 일반적으로 특히 적용되는 sHASEGP의 양을 증가시키고, 특이 활성이 더 높은 sHASEGP를 사용하며, 분해 또는 다른 비활성화에 더 내성인 sHASEGP(예컨대, 페길화, 과시알화 또는 이러한 다른 변형된 sHASEGP)를 사용하고, sHASEGP의 서방 제제 또는 데포 제제를 제공함으로써 그리고 적용된 sHASEGP의 효과 활성 및/또는 지속성을 증가시키는 다른 방법에 의 하여 증가시킬 수 있다. 또한, sHASEGP를 예컨대 주사 부위에 대하여 원위 조직 또는 위치로 제제의 분산을 촉진하는 것이 바람직할 경우, sHASEGP 및/또는 제제를 유의적인 부피의 액체로 제공하여(예컨대, 주사 부위를 부분적으로 채우거나 또는 약간 팽창시킴) 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 이류성 수송 방법을 통한 분산을 더 촉진할 수 있다.
당업자라면 인식하게 될 바와 같이, 망막 박리, 망막 정맥 폐쇄, 증식성 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 염증성 질환 (예컨대, 포도막염, 맥락막염, 망막염 등), 및 퇴화성 질환, 혈관 질환 및 각종 종양과 같은 병태의 치료를 위해 sHASEGP를 사용하여 눈의 후부로 다수의 마취제, 진단제, 약리학적 제제 및/또는 기타 제제의 전달을 효과적으로 촉진할 수 있다. 역시 당업자라면 인식하게 될 바와 같이, 예컨대 이하에 개시 및 예시되는 바와 같은 마취제 및 약리학적 제제를 비롯하여 후 구역 병태 및 질환의 치료를 위한 각종 약리학적 또는 약제학적으로 효과적인 제제를 유용하게 적용할 수 있다.
sHASEGP와 다른 물질의 동시 제형화 또는 동시 투여는 또한 소량의 부피 또는 신속한 피하 투여를 위해 주입가능한 펜으로 생각해 볼 수도 있다. Epipen™, 인슐린 및 기타 유체와 같은 예를 제형화할 수 있다. 본 발명 방법은 다른 치료 분자의 투여 전, 동시 또는 후에 sHASEGP 펩티드 또는 sHASEGP를 함유하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. sHASEGP는 치료 분자의 투여 부위와 상이한 부위에서 투여되거나 또는 치료분자의 투여 부위와 동일한 부위에서 투여될 수 있다
이론에 의하여 한정하려는 의도는 아니나, sHASEGP 및 기타 글리코사미노글 리카나제가 세포간 간질강에서 일부 글리코스아미노글리칸의 분해를 야기하는 능력은 간질내에서 채널을 일시적으로 개방하며, 이로써 간질액 흐름이 증가되고 동시에 간질액내 용해된 성분(예컨대, 마취제, 약물 및 기타 약리학적 제제, 라벨 및 진단 제제 등)의 확산 및/또는 이류성 용질 운반(이류)이 촉진되는 것으로 믿어진다. 당업자라면 인식하게 될 바와 같이, 본 발명의 sHASEGP는 각종 질병 상태를 치료 또는 진단하거나 또는 생체내 하나 이상의 조직을 변형하는 데 유용한 다수의 약리학적 제제 및 기타 제제의 생체 이용가능률을 증대 (그리고 잠재적으로 다른 약력학적 및/또는 약동학적 특성을 개선)시키는 데 적용할 수 있다. 이러한 제제의 예시적 범주에는 업계 및 본원에 개시된 각종 범주의 제제 (및 이의 예시적 멤버)를 비롯하여 항암제, 항감염제, 마취제, 항염증제, 시토킨, 항체 및 기타 단백질, 핵산, 거대분자 복합체 및 세포 활성 또는 다른 생리학적 활성을 변형하는 다수의 다른 분자 및 약리학적 제제가 포함된다.
심지어 소분자의 확산 및 이류성 수송은 간질 채널을 개방하고 유체 흐름을 증가시켜 증대시킬 수 있으나, [항생물질 및 기타 단백질, 큰 핵산, 거대분자 복합체 (예컨대, 리포솜 및 기타 거대분자 운반체) 및 유전자 치료 벡터 등을 비롯한] 다수의 바이오 치료제와 같은 약리학적 제제 또는 기타 제제의 경우, 글리코스아미노글리칸과 같은 간질 성분의 존재 및 분자의 크기가 실질적으로 제제의 확산 및/또는 이류를 해친다. 제제의 유용성을 잠재적으로 제한하는 일부 결과가 나올 수도 있다. 예컨대, 제제의 약력학은 흡수 및 이에 따라 제제의 분포가 늦어짐으로써 실질적으로 손상될 수 있다. 또한, 투여 부위에서 또는 투여 부위 근처에서 제제의 일부가 포획되어 있는 것은 그 생체 이용가능률을 제한하며, 잠재적으로 국소 투여량이 지속적이고 높아서 결과적으로 독성의 원인이 될 수도 있다. 후자의 경우, 통증 또는 기타 부작용과 관련될 수 있는 국소적 독성이 예컨대 피하, 피내 또는 근내 주사에 의하여 정맥내 주사로 투여되는 다수의 큰 생분자에서 문제가 된다. 결과적으로, 다수의 약리학적 제제는 상기 제제 전에, 상기 제제와 동시에 그리고 상기 제제 후에 제공될 수 있는 sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)와 동시 제형화 및/또는 sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)와 동시 투여됨으로써 약력학적(PK) 및/또는 약동학적(PD) 프로필이 개선될 수 있으며, 이러한 매개변수는 표준 모델(제제의 약력학 및 약동학을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 동물 모델)에서 최적화 대상이 된다. 따라서, sHASEGP를 사용하여 비경구 투여로 투여되는 임의의 다양한 치료제 및 약리학적 제제 및 기타 제제(예컨대 화장 또는 미용 제제)를 개선시킬 수 있다.
특히 정맥내(IV) 주사에 의한 혈관내 투여는 일반적으로 신속한 생체 이용성을 제공할 수 있으나, IV 주사는 불편한 경우가 종종 있으며 위험하거나 적용 불가능하다(심지어 실제로 최적 전체 PK/PD 프로필에 못 미칠 수 있다). sHASEGP를 적용하여 IV가 아닌 비경구 경로(예컨대, 피하, 피내, 근내 및 기타 제제를 간질에 전달하는 기타 경로)에 의하여 투여되는 제제의 생체 이용가능률을 증대시킬 수 있으므로, IV 주사에 의하여 전달된 제제는 IV가 아닌 비경구 투여에 의한 전달을 위해 다시 제형화될 수 있다. 이러한 재 제형화는 IV 투여가 불편하거나, 적용 불가능하거나, 불안전하거나, 너무 고가이거나 또는 달리 제한되는 제제를 사용 가능하 게 하는 것과 같은 실질적인 이점을 제공할 수 있다. IV가 아닌 비경구 제제와 같은 IV 제제의 재 제형화는 또한 환자가 스스로 제제를 투여할 수 있게 할 수 있으며, 정맥내 주사에 의한 투여를 불필요하게 함으로써 투약의 최적화를 가능하게 한다(예컨대, 제제의 PK/RD 매개변수에 더 양호하게 맞춘다).
당업자라면 인식하게 될 바와 같이, sHASEGP (및/또는 기타 글리코사미노글리카나제)를 사용하여 개선될 수 있는 PK/PD 매개변수는 Cmax (예컨대 혈류중에 흡수 후 달성되는 제제의 최대 농도), Tmax (최대 농도를 얻는 데 요구되는 시간), T½ (농도 반감에 필요한 시간), Cmin (대사 및 배설 후 제제의 최소 농도), AUC (농도 대 시간 곡선 아래의 면적, 생체 이용가능률의 전체량의 측정), 여러 대상 조직에서의 농도 (예컨대, 소정 농도를 얻는 속도, 전체 레벨, 및 소정 레벨을 유지하는 지속 시간), 및 Emax (달성되는 최대 효과)와 같은 측정치를 포함한다. 예컨대, 약물 또는 기타 약리학적 제제를 sHASEGP와 다시 제형화하거나 또는 상기 제제를 sHASEGP(상기 제제 전, 동시 또는 후에 국소적으로 또는 전신적으로 도입될 수 있음)와 동시 투여하여 예컨대 제제의 Cmax를 증가시키고, Tmax를 감소시키며, T½을 감소시키고, AUC를 증가시키며 및/또는 Emax를 증가시킬 수 있다. 인식하게될 바와 같이, (예컨대, 더 많거나 더 적은 sHASEGP 단위를 적용하고 투여 시기 및/또는 위치를 변경함으로써) 이러한 주요 PK 및 PD 매개변수를 용이하고 균형적으로 조절하는 능력으로 다수의 약리학적 제제 및 기타 제제를 개선할 수 있다. 이들 매개변수의 수준 평가는 PK/PD 측정에 사용되는 동물 모델과 같은 모델에서 실시할 수 있으며 동시 제형화 및/또는 동시 투여는 그 상대 효율을 증대시켜 특정 적용예 를 위해 선택되는 프로파일을 안정화한다.
IV가 아닌 비경구 제제 중에, sHASEGP (및/또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 또한 사용하여 제제를 더 편리한 경로로 및/또는 더 큰 효율로 투여할 수 있다. (비제한적) 예시로서, 제제를 재제형화 및/또는 sHASEGP와 동시 투여함으로써 (제제의 투여 전, 동시 또는 후에 국소적 또는 전신적으로) 일반적으로 피하 주사에 의하여 투여되는 제제를 대신 피내 주사로, 그리고 일반적으로 근내 주사로 투여되는 제제를 대신 피내 주사로 투여할 수 있다. 이와는 다르게, 제제를 동일한 경로로, 그러나 sHASEGP를 사용하여 개선된 약력학 및/또는 약동학으로 투여할 수 있다.
IV 약물 및 IV가 아닌 비경구 약물로서의 기타 제제의 재제형화에 sHASEGP (및/또는 글리코사미노글리카나제)를 사용하면 자기 투여 촉진 및 용이하고 및/또는 신속한 전달을 위해 설계된 임의의 각종 신규 주입 장치를 사용하여 제제를 전달할 수 있다. 이러한 장치에는 예컨대 초예리 장치 및 미세바늘 장치 [예컨대, Becton Dickinson 등이 개발한 것) 및 무바늘 주입 장치 (예컨대, Biojector(TM) 및 Bioject사의 기타 장치; IntraJect(TM) 및 Aradigm사의 기타 장치; Medijector(TM) 장치 등]가 포함된다. 다수의 장치 (예컨대, the Biojector)가 (바늘 배치 동안 진피를 침투하고 피하층과 같은 하부 조직 부위에 제제를 전달하고 할 수 있으므로) 표준 바늘을 사용하는 경우 더 많은 경험을 요하는 피내 주사를 용이하게 하는 데 특히 유용하다. 예컨대, 백신(예, DNA계 또는 다른 백신)과 같은 일부 약리학적 제제의 경우, 진피내에 비교적 고농도의 항원 제시 세포(APC)가 편 재되기 쉬우므로 피하층에 대향하는 진피로 제제를 전달하는 것이 특히 유리할 수 있다.
(표준 바늘에 의하건 또는 기타 더 신규한 장치에 의하건) 일반적으로 피내 주사에 의하여 전달되는 제제 또는 현재는 아니나 피내 주사에 의하여 전달될 수 있을 다수의 다른 제제에서, sHASEGP (및/또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 국소적으로 동시 도입하여 전달되는 약리학적 제제 또는 기타 제제의 전달을 증대시키고 진피내에서 그 분산 또는 분포를 촉진할 수 있다. 백신의 경우, 진피가 1차 표적 조직일 수 있는 경우, APC가 국소적으로 풍부한 상황에서, sHASEGP (및/또는 다른 글리코사미노글리카나제)가 표적 조직 내의 백신 분산을 촉진함으로써 백신 및 APC 간의 상호작용 가능성 및 범위를 증가시킬 수 있다(이것은 면역조절 반응의 생성을 유의적으로 증가시킬 수 있다). 다른 제제의 경우, 진피는 1차적인 표적 조직일 수 있으나 제제 투약량이 도입되는 조직 또는 이것으로부터 또다른 조직, 일반적으로 혈류로 제제가 흡수되는 조직이다. 후자의 경우, 혈류는 그 자체로 대상 표적 조직일 수 있거나(예컨대, 업계 및 본원에 개시된 바와 같은 혈액 조절 인자의 경우), 또는 혈류는 그 자체로 원이 표적 조직에 제제를 운반하는 전달 조직일 수 있다(예컨대, 혈류에 의하여 공급되는 체내 조직). 이들 후자의 경우 중 어느 것에서 (전달은 피내이나 제제를 혈류로 전달하는 것이 바람직함), sHASEGP (및 잠재적으로 그것이 주입되는 액체의 부피)는 본원에 개시 및 예시된 바와 같이 먼저 진피내에서 이어서 진피에서 나가는 맥관구조로 그리고 실질적으로 더 큰 혈액 공급으로 제제의 분산을 촉진할 수 있다.
다른 치료적 또는 약리학적 제제의 약력학 및/또는 약동학을 증대시키기 위한 sHASEGP의 사용은 또한 IV가 아닌 비경구 투여 이외의 경로에 의하여 전달되는 제제에도 적용될 수 있다. 예컨대, 이론에 한정하려는 의도는 아니나, (sHASEGP의 국소 및/또는 전신 투여에 의하여 얻을 수 있는) 체내 간질강내 sHASEGP의 존재는 간질 채널 및 간질강에서의 유속 증가를 촉진하여 간질액(예컨대, 약리학적 제제 및 기타 제제)에 용해된 제제의 확산 및 이류성 수송을 용이하게 하는 경향이 있다고 믿어진다. 예시적으로, (예컨대, 정맥내 주입에 의하여) 혈류로 직접 투여되거나 또는 경구 투여되는 (따라서 예컨대 위장관으로부터의 흡수 후 혈류로 들어가는) 제제는 흡수후, 즉 약력학적 분포 상태에서 여전히 제약을 받을 수 있다. 이론에 의하여 한정하려는 의도는 아니나, sHASEGP는 간질 침투성 및 유속을 증가시키고, 따라서 간질강에서 제제의 확산 및/또는 이류를 증가시킴으로써 표적 세포로의 전달을 증대시킬 수 있다(모든 약동학적 전달 경로 및 표적 세포 간에 매개물을 효과적으로 형성함)고 믿어진다.
또한, sHASEGP의 투여에 의하여 유발되는 교질 삼투압 변화는 약리학적 제제의 전달을 증대시키는 데 기여할 수 있다고 믿어진다. 또한, 이론에 의하여 한정하려는 의도는 아니나, 맥관 형성된 조직의 간질면을 따른 sHASEGP의 존재 및 이에 수반되는 분해는 간질강내 교질 삼투압을 감소시켜 맥관 구조로부터 간질강내로의 유체 여과를 증대시키는 경향이 있다.
간질압을 감소시키는 가능성은 종양내의 간질압(TIF의 종양 간질압)이 증가되는 다수의 암에서 특히 중요하도록 고려된다. 높은 TIF는 종양의 중심으로 향하 는 맥관 구조로부터의 유체 흐름을 상대적으로 방해함으로써 종양, 특히 종양 덩어리 내부의 더 깊은 부위에 효과적으로 도달하는 항암제의 양을 제한할 수 있다. 따라서, 종양 간질에 sHASEGP의 도입은 간질 교질압이 감소되고 확산 및/또는 이류성 수송이 증가될 경우 종양을 더 용이하게 침투할 수 있는 국소 전달 및 전신적 사용 항암제의 전달을 증대시킨다. 종양내의 TIF 및 수리전도도(K)(예컨대, Evan 블루 염료로 알부민 표지된 것과 같은 태깅된 분자 사용)를 업계 및 본원에 예시된 바와 같이 생체내 종양의 유체 동력학에 미치는 여러 농도의 sHASEGP의 효과를 정량적으로 분석하는 데 사용될 수 있다.
다수의 종양내에서 감소된 유체 동력학을 더 악화시키고 종양에 sHASEGP를 도포하는 추가의 잠재적 이점을 강조하는 것은 다수의 종양이 글리코스아미노글리칸, 특히 히알루론의 축적을 보인다는 사실이다(이것은 히알루론 이화 작용에 대한 지배적인 경로인 임파선이 다수의 종양에서 부족하거나 결여된다는 사실에 기인할 수 있음). 이러한 과량의 히알루론은 수리전도성을 방해하는 데 기여할 수 있다. 따라서, sHASEGP의 도입은 다수의 종양에서 글리코스아미노글리칸의 축적을 방해하여 종양내에서의 수리 전도성을 개선시키고 (국소 전달 또는 전신 전달에 무관하게) 효과적으로 항종양제에 더 감작성이 되도록 할 수 있다.
당업자라면 인지하는 바와 같이, 본원에 개시된 원리는 예컨대 질병의 예방, 진단 및/또는 치료를 위해 신체 부위에 전달하거나 또는 생리 기능을 조절하기 위한 수많은 다른 약물 및 다른 제제에도 적용될 수 있다. 이러한 제제의 예시적 부류 (및 이의 예시적 멤버)는 본원에 제공되며 더 다수가 업계에 공지되어 있거나 개발중이다.
다양한 비경구 투여 약물 및/또는 제제의 개선 및/또는 재제형화에 사용하는 외에, sHASEGP는 또한 비경구 제제(예컨대, 필, 액체 또는 위장관을 통한 일반적인 흡수 및 섭취를 위한 다른 형태로서 조제된 제제)와 관련하여 유용하게 사용할 수도 있다. 예컨대, 대부분의 비경구 약물은 궁극적으로 간질내 세포에 도달하여 소정 효과를 발휘하여야 하므로, [전신적으로 또는 국소적으로(예컨대, sHASEGP의 국소 또는 표적 투여에 의하여)] 간질내 확산 및/또는 이류성 수송을 증대시키기 위하여 sHASEGP를 사용하여 (비경구형 약물 뿐만 아니라) 비경구형이 아닌 약물이 소정 표적 세포에 도달하는 속도 및/또는 범위를 개선시킬 수 있다.
또한, 일반적으로 비경구가 아닌 방법으로(예컨대, 경구로) 투여되는 다수의 제제를 다시 제형화하거나 또는 그 활성 성분을 다시 제형화하여 sHASEGP와 조합하여 더 효과적 및/또는 안전하게 되는 경구 투여에 사용할 수 있다. 이렇게 광범위하게 적용가능한 방법을 예시하기 위하여, 특정 조직에 대한 표적 전달을 촉진하는 sHASEGP의 능력(예컨대, 눈의 후부내 조직으로의 공막 경유 전달을 제공하는 sHASEGP의 능력)을 이용하여 임의의 다양한 제제(이전에 전신 투여한 제제 포함)를 신체내 국소 부위에 직접적으로 및 우선적으로 전달할 수 있다. 이것은 대상 부위에 더 바람직하고 및/또는 더 신속히 도달되는 농도를 제공할 뿐만 아니라, 의도하지 않는 부위에서의 농도가 소정 표적 부위에서의 농도와 동일하거나 또는 심지어 이를 초과할 수 있는 전신 투여와 관련된 잠재적 문제 및 한계를 실질적으로 감소시킬 수 있다. 일부 경우, 광범위하게 사용되지 않거나 예컨대 특정 환자에서 또는 특정 증상에 대하여 사용되지 않는 제제를 효과적으로 적용하여 본원에 개시 및 예시된 바와 같이 sHASEGP와 동시 제형화 또는 동시 투여에 의해 환자에 더 이익을 줄 수 있다.
당업자라면 이해하는 바와 같이, sHASEGP를 사용하여 동시 제형화 및/또는 동시 투여되는 제제의 생분포를 증대, 가속화 및/또는 표적화하고 (예컨대, 위험:이득 프로필을 개선시키거나 환자, 가족 또는 헬스 케어 전문인에 의한 사용을 용이하게 하기 위하여) 약동학적 또는 약리학적 양상을 조작하는 능력은 질병의 치료, 진단 또는 예방에 사용되는 약물 및 기타 제제를 개선하는 많은 기회를 제공한다.
특정한 군의 용도로 한정하려는 의도는 아니나, 본원에 개시된 바와 같은 sHASEGP를 포함하는 글리코사미노글리카나제 (및 다른 히알루로니다제 및 다른 글리코사미노글리카나제)를 비정맥 비경구 경로 및 다른 투여 경로에 의하여 [예컨대, (제제가 혈류에 직접적으로(예컨대, IV 투여에 의함) 또는 간접적으로(예컨대, 경구 또는 IV가 아닌 비경구 투여에 의함) 혈류로 도입되는지에 따라) 제제가 혈류에서 나간 후 표적 조직으로 및/또는 표적 조직을 통한 제제의 전달을 증대시키는 것에 의하여] 임의 수의 약물 및 기타 제제의 볼루스 또는 볼루스 유사 전달을 효과적으로 실시하는 데 사용할 수 있다.
특정 작용 기작 또는 이의 양태로 제한하려는 의도는 아니나, 이들 효소가 세포간 간질 기질의 성분을 일시적으로 분해하는 능력(약물 및 기타 제제가 대부분의 표적 세포에 도달하기 위하여 거쳐야 하는 신체내 유체 공간의 실질적인 부분 및 상응하는 큰 공간을 차지)은 일부 잠재적 상승 수단 중 하나 이상에 의한 제제의 표적 세포로의 전달을 유의적으로 촉진할 수 있다고 사료된다. 먼저, 큰 부피의 간질 유체가 어느 정도의 흐름을 보이는 동안, 그 흐름은 히알루로난과 같은 글리코스아미노글리칸 및 다른 간질 성분에 의해 종종 제한 또는 방해된다. 본원에 예시 및 개시된 바와 같이 간질 공간내로 채널을 개방하기 위하여 sHASEGP를 비롯한 글리코사미노글리카나제 (및 다른 히알루로니다제 및 다른 글리코사미노글리카나제)의 능력을 이용하여 임의의 소정 "업스트림" 압력으로부터 유래하는 "다운스트림" 흐름의 속도 및 범위를 증대시키고 임피던스를 감소시킬 수 있다. 두번째로, sHASEGP (또는 다른 글리코사미노글리카나제) 및 또다른 약물 또는 다른 제제를 IV가 아닌 비경구로 주입하는 경우, IV가 아닌 비경구 주입 부피를 사용하여 (예컨대, 제한된 공간내의 정수압을 증가시킴으로써) 업스트림 구동압 또는 압력 헤드를 증가시킬 수 있는데, 이것이 흐름을 더 촉진할 수 있다. 세번째로, 도입된 sHASEGP (또는 다른 글리코사미노글리카나제) 및 기타 제제를 포함하는 유체 부피는 증가 압력 구배에서 효과적으로 구동되므로(즉, 증가적 구배는 주입되는 "볼루스"내에서 관련 정수압을 증가시키면서 동시에 주위 조직에서 간질압을 감소시킴으로써 생성됨), 볼루스내의 용질은 (예컨대, 이류성 수송에 의하여) 인접 조직으로 효과적으로 운반될 수 있다. 따라서, 이렇게 주입된 유체 또는 볼루스는 인접 조적으로 효율적이고 비교적 신속하게 이동하여 (예컨대, sHASEGP 또는 다른 글리코사미노글리카나제와 조합된 제제의 공제형화 또는 공투여에 의하여) 동일한 주입 부분에 또는 그 근처에 도입되는 어떤 약물 또는 다른 제제를 전달할 수 있다.
예컨대, 본원에 개시 및 예시된 바와 같이 간질 공간내에 채널을 개방하는 sHASEGP와 같은 글리코사미노글리카나제를 사용하여, 흐름이 일반적으로 방해되고 간질 압력이 증가된 예컨대 종양 및 기타 조직 안으로 및 이를 통해 간질 흐름을 증가시킬 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 이들 원리의 예에는 sHASEGP를 사용하여 생체 종양에서 간질 압력을 감소시키는 것이 포함된다.
마찬가지로 흐름 증가를 정상 조직에 적용하여 예컨대 마취제, 진단제, 화장품 또는 다른 미용품 또는 약물 또는 기타 제제를 조직으로 전달할 수 있다(예컨대, 조직을 변화시키거나 또는 조직으로 데포 제제를 도입함). 마찬가지로 흐름 증가를 제1 조직 또는 근위 조직에 적용하여 원위 조직으로의 도입 조직을 통한 제제으 전달을 촉진할 수 있는데, 이 원위 조직은 그 자체로 소정 표적 조직이거나 또는 소정 표적 조직으로의 경로일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 이들 원리의 예에는 예컨대 (i) 망막 및 맥락막과 같은 안내 원위 표적 조직에 표적을 맞추기 위하여, 눈을 둘러싸는 공막 외강으로 sHASEGP를 도입하여 공막을 가로질러 제제의 전달을 촉진하는 것; 및 (ii) 피내에 sHASEGP를 도입하여 혈류그 자체로 표적 조직이거나(예컨대, 혈액 변형제) 또는 제제(들)가 신체내 다른 표적 조직으로 전달될 수 있는 경로일 수 있음)내 및 피하층을 통한 제제의 전달을 촉진하는 것이 포함된다.
신체내 소정 조직으로 약물 및 기타 제제의 전달을 촉진하기 위한 이러한 기술 및 조성물의 추가 예로서, 이하의 추가 실시예가 제공된다. 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 수단에 의하여, 약리학 제제의 약동학 및/또는 약력학 프로필 및 기타 제제의 흡수, 분포 및/또는 효과 프로필이 증대 또는 변화될 수 있다. 또한, 실질적으로 또는 실제적으로 전달이 한 경로(예컨대, IV 주입에 의함)로 제한된 제제를 다른 더 안정하고, 덜 침입적이고, 덜 비싸고 및/또는 더 편리한 경로로 전달할 수 있다.
특정 유형의 용도로 제한함 없이 추가의 예시로서, sHASEGP 또는 다른 글리코사미노글리카나제(GAG 효소)를 포함하는 한 부피(V)의 액(L)을 신체내 조직(투약 조직)으로 도입할 수 있다. 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하여, GAG 효소를 투약 조직으로 그리고 어느 정도 투약 조직을 통해서 전달할 수 있다. 특정 작용 기작에 제한하려는 의도는 아니나, GAG 효소는 액 부피(L)에 의한 이류성 수송에 의하여 투약 조직으로 효과적으로 운반될 수 있다. 이류성 수송은 부분적으로는 (구동압을 제공할 수 있는) L과 관련된 정수압에 의하여 그리고 부분적으로는 투약 조직의 간질강내에서 채널을 개방하는 GAG 효소의 능력(흐름의 다운스트림 임피던스를 감소시키고 이로써 저항압을 낮출 수 있음)에 의하여 촉진될 수 있다. 따라서, 유체 구동압 차가 발생하며 예컨대 (i) (예컨대, L을 제한된 공간으로 도입하고 필요에 따라 V를 증가시킴으로써) 구동 정수압을 도입하고 필요에 따라 증가시킴; 및 (ii) (예컨대, GAG 효소를 도입하고 필요에 따라 예컨대 그 농도 증가, (예컨대, 페길화, 과시알화 또는 기타 변형에 의한) 축퇴에 대한 내성 증가 및/또는 (예컨대 V의 증가에 의한) 이류성 수송에 의한 전달 증가에 의하여 그 효과를 증가시킴으로써) 흐름에 대한 다운스트림 임피던스를 감소시킴 중 하나 또는 둘다에 의하여 소정 정도로 증가될 수 있다.
(예컨대, 증가된 전달 속도 또는 범위가 바람직한) 특정 구체예에서, V는 GAG 효소가 도입되는 투약 조직내 부위를 임시로 넓히는 데 충분한 부피이다. 당업자라면 이해하는 바와 같이, 수용될 수 있는 부피(V) 및 이에 따른 팽창 범위(D)는 특정 조직에 따라 달라진다. 비제한적인 예시의 목적으로, 팽창 범위는 예컨대 (i) 투약 조직은 비교적 크고 및/또는 신속히 이동하는 유체로 채워진 강(예컨대, 정맥내 또는 동맥내 전달과 연관된 혈류)(이 경우, L은 크지만(예컨대, 필요에 따라 수 ml) D는 비교적 최소일 수 있음); (ii) 투약 조직은 비교적 작고 및/또는 덜 급속히 이동하는 유체로 충전된 강(예컨대, 경막내 전달과 연관된 뇌척수액)(이 경우, L은 비교적 크지만 D는 정확한 주입 부위 및 주입 부피에 따라 최소 이상일 수 있음); (iii) 투약 조직은 비교적 작지만 어느 정도 팽창 가능한 강(예컨대, 눈을 둘러싸는 공막외강)이거나; 또는 (iv) 투약 조직은 저항압이 더 큰 비교적 더 조밀하고 및/또는 더 제한된 강(에컨대, 피내 전달과 관계된 진피)인 상황에 따라 달라진다.
당업자라면 이해하는 바와 같이, V는 0.1 ml 미만의 부피 내지 100 ml 초과의 부피 범위일 수 있으며, 많은 용도에서 약 0.5 ml 내지 20 ml 범위이고, 많은 경우 1 ml 내지 10 ml 범위이며, 종종 2 내지 5 ml 범위이나, 본원에 예시된 바와 같이 특정한 상황에 대하여 달라질 수 있다. V는 또한 예컨대 테스트 부피 범위에 걸쳐 표준 약물동력학적 및/또는 약력학적 프로필을 비교함으로써 소정의 특정 용도를 위한 범위로 특별히 최적화할 수 있다.
당업자라면 이들 교시의 검토로 이해하게 될 바와 같이, 본원에 더 개시 및 예시되는 것처럼, GAG 효소의 채널 개방 활성의 신속 가동 및 재개시(둘다 그 자신의 전달을 촉진하고 그 자신의 전달에 의하여 촉진됨)와 촉매 활성을 촉진하고 촉매 활성에 의하여 촉진되는 전달 시스템을 조합함으로써, 다수배 상승적인 약물 전달 시스템을 제조할 수 있다.
제1 예시 양태에서, sHASEGP 또는 기타 글리코사미노글리카나제(GAG 효소) 및 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, (예컨대, 검출 가능한 분자 또는 다른 진단 제제, 마취제 또는 다른 조직 변형 제제, 약리학 또는 약학적으로 유효한 제제, 화장 또는 기타 미용 제제, 및 신체내 하나 이상의 조직에 도입되는 것이 바람직한 다른 제제)는 그 자체로 제제에 대한 소정 표적 조직(표적 조직)인 신체내 제1 조직 부위(투약 조직)으로 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 표적 조직내로 및 표적 조직을 통해 전달된다.
이 예시 양태 및 본원의 다른 예시 양태와 연관하여 당업자라면 이해하게 될 바와 같이, 투약 조직은 (예컨대, 본원에 개시 및 예시된 및/또는 업계에 공지된 바와 같은 여러 투여 경로를 사용하여) 신체 외면으로부터 또는 (예컨대, 수술과 연관하여 또는 신체내 조직에 도달하기 위한 장치 및 임의의 다양한 비외과적 또는 최소 침습법을 사용하여) 신체 내면으로부터 용이하게 도달될 수 있는 임의의 다양한 조직일 수 있다. 이러한 투약 조직은 본원에 개시 및 예시된 것들과 업계에 공지된 다른 것들을 포함한다.
이 예시 양태 및 본원의 다른 예시 양태와 연관하여 당업자라면 이해하게 될 바와 같이, 표적 조직은 GAG 효소 및 잠재적으로 다른 제제(들)을 전달하는 것이 바람직한 임의의 다양한 조직 [예컨대, (i) (내재적 또는 발생된 질병 상태와 같이 내인성이거나 또는 감염과 같이 외인성이거나 무관하게) 질병 상태의 진단, 예방 또는 치료하고자 하는 대상인 조직; (ii) (예컨대, 수술 및/또는 기타 절차에서) 마취 또는 조절되는 것이 바람직한 조직; (iii) (예컨대, 백신 작용과 관련하여) 면역 반응을 유발하는 것이 바람직한 조직; (iv) 다른 조직으로 제제(들)를 방출하기 위한 데포우 부위로서 작용하는 조직; (v) 미용 또는 화장 목적으로 변형된 조직; 및 (vi) 다른 목적으로 변형된 신체내 조직 또는 부위]일 수 있다. 이러한 표적 조직은 본원에 개시 및 예시된 것과 업계에 공지된 다른 것들을 포함한다.
마찬가지로 본원에서 전술한 예시 양태 및 다른 예시 양태와 관련하여 당업자라면 인지하게 될 바와 같이, 제제(들)는 [예컨대, (i) 표적 조직 및/또는 인접 조직에 영향을 주어 (내재적 또는 발생된 질병 상태와 같이 내인성이거나 또는 감염과 같이 외인성이거나 무관하게) 질병 상태의 진단, 예방 또는 치료 목적에서; (ii) 마취 또는 표적 조직의 생리 기능을 조절하는 목적에서; (iii) 백신 접종과 관련된 면역 반응을 유발하는 목적에서; (iv) 다른 조직으로 제제(들)를 방출하기 위한 데포우 부위로서 표적 조직을 사용하는 목적에서; (v) 미용 또는 화장 목적에서; 및/또는 (vi) 신체내 조직 또는 다른 부위로 GAG 효소 및 잠재적으로 기타 제제(들)를 전달함으로써 얻어지는 목적에서] 신체 상태를 변화 또는 조절하는 데 사용할 수 있는 임의의 다양한 분자, 거대분자 및 거대분자 복합체일 수 있다. 이러한 제제에는 본원에 개시 및 예시된 다양한 부류의 제제 및 이의 멤버, 및 업계에 공지된 이러한 부류의 제제의 다른 멤버, 및 기타 부류의 제제 (및 이의 멤버)가 포함된다.
제2 예시 양태에서, sHASEGP 또는 기타 글리코사미노글리카나제(GAG 효소) 및 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, 그 자체로 소정 표적 조직인 조직(조직 B)에 인접하거나 이에 근접한 신체 조직 부위(투약 조직)에 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 바와 같은 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 조직 A로부터 표적 조직 B로 전달된다.
제3 예시 양태에서, sHASEGP 또는 기타 글리코사미노글리카나제(GAG 효소) 및 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, 조직 A 및 그 자체로 소정 표적 조직이거나 또는 소정 표적 조직(표적 조직)을 포함하는 또다른 조직(들)(원위 조직) 사이에 위치된 하나 이상의 조직(중간 조직)에 근접한 신체 조직 부위(투약 조직)로 도입된다. 본원에 개시 및 예시되는 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 조직 A로부터 하나 이상의 중간 조직을 통하여 하나 이상의 표적 조직으로 전달된다.
제4 예시 양태에서는, sHASEGP 또는 기타 글리코사미노글리카나제(GAG 효소) 및 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, 소정 표적 조직이거나 또는 소정 표적 조직을 포함하는 하나 이상의 전달 조직, 예컨대 혈류, 림프 또는 뇌척수액(전달 조직)에 근접한 신체내 조직 부위(투약 조직)으로 도입된다. 본원에 개시 및 예시되는 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 조직 A로부터 하나 이상의 전달 조직으로 전달된다.
제5 예시 양태에서, sHASEGP 또는 기타 글리코사미노글리카나제(GAG 효소) 및 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, 신체내 하나 이상의 소정 표적 조직(표적 조직)으로 액을 전달하는 하나 이상의 전달 조직, 예컨대, 혈류, 림프 또는 뇌척수액(전달 조직)에 근접한 신체내 조직 부위(투약 조직)로 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 조직 A로부터 하나 이상의 전달 조직으로 그리고 거기로부터 하나 이상의 하류 표적 조직으로 전달된다.
제6 예시 양태에서, 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))와 함께 sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)(GAG 효소)를 포함하는 한 부피의 액체(V)는, 하나 이상의 소정 표적 조직으로 액을 공급하는 하나 이상의 전달 조직, 예컨대, 혈류, 림프 또는 뇌척수액(전달 조직)으로 도입된다(예컨대, 혈류를 통하여 표적 조직에 공급함). 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소(들)가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 표적 조직에 침투한다.
제7 예시 양태에서, sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)(GAG 효소)를 포함하는 한 부피의 액체(V)는 소정 표적 조직이거나 또는 소정 표적 조직(표적 조직) 근처에 있는 신체내 조직 부위(조직 A)로 도입되고, 하나 이상의 약물 또는 기타 제제(제제(들))는 제제(들)가 표적 부위로 도달할 수 있게 하는 또다른 투여 경로(예컨대, 경구 경로 또는 정맥내 주사)로 신체에 도입된다(예컨대, 혈액내로 주사 또는 흡수 후 혈류를 통하여 표적 조직에 공급함). 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 제제(들)는 GAG 효소(들)가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 표적 조직에 침투한다.
제8 예시 양태에서, sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)(GAG 효소)를 포함하는 한 부피의 액체(V)는 간질압이 증가된 신체내 표적 부위 또는 부위들(조직 부위(들))로 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 조직 부위(들)에서 간질압은 GAG 효소(들)의 분해 활성에 의하여 감소된다.
제9 예시 양태에서, sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)(GAG 효소)를 포함하는 한 부피의 액체(V)는 과량의 히알루로난 또는 기타 글리코스아미노글리칸을 갖는 신체내 조직 부위 또는 부위들(조직 부위(들))로 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 조직 부위(들)에서 과량의 히알루로난 또는 기타 글리코스아미노글리칸은 GAG 효소(들)의 분해 활성에 의하여 감소된다.
제10 예시 양태에서, sHASEGP (또는 기타 글리코사미노글리카나제)(GAG 효소)를 포함하는 한 부피의 액체(V)는 피하 세정(주액 부위)의 소정 접근점이거나 또는 이에 근접한 신체내 조직 부위 또는 부위들(조직 부위(들))로 도입된다. 본원에 개시 및 예시된 수단에 의하면, 이후 액은 GAG 효소(들)가 없을 때보다 더 큰 속도 및/또는 범위로 주액 부위(들) 내로 및 주액 부위(들)를 통해 도입될 수 있다.
본원에 제공된 상세한 설명 및 예시적 구체예를 통해 당업자라면 인지하게 될 바와 같이, 임의의 매우 다양한 제제를 동시 도입하고(예컨대, 공제형화 또는 GAG 효소와의 동시 투여에 의함), 임의의 다양한 GAG 효소를 본원에 제공된 것과 같은, 그러나 일반적으로 관련된 특정 조직 및 대상에 대하여 최적화된 범위의 농도로 사용할 수 있다. 상기 예시 양태에 적용되는 액체 부피(V)는 일반적으로 도입 부위의 성질에 따라 달라지며, 역시 일반적으로 관련된 특정 조직 및 대상에 대하여 최적화된다. 본원에 개시 및 예시된 바와 같이, IV형이 아닌 비경구 투여의 경우, (조직 부위의 특정 제한 범위내에서) V를 증가시켜 증대된 정수 구동압을 제공할 수 있으며, 이것은 히알루로난 또는 기타 글리코스아미노글리칸 분해 관련 임피던스 감소와 함께 효과적으로 상기 액체 부피를 볼루스로서 기능하게 하여 그것이 함유하는 임의의 용질을 하류 간질강 및 잠재적으로 그 이상 운반할 수 있다.
따라서, 본원에는 sHASEGP라 명명된 진핵 세포 분비 중성 활성 히알루로니다제 당단백질, 및 이의 기능적 도메인, 특히 이의 히알루로니다제 (또는 촉매) 도메인, 뮤테인 및 기타 유도체 및 이의 유사체 뿐만 아니라 신체내 부위로 약물 및 기타 제제의 전달을 촉진하기 위한 히알루로니다제 (및/또는 기타 글리코사미노글리카나제)를 사용하는 다양한 기술이 제공된다. 또한 본원에는 sHASEGP를 코딩하는 핵산이 제공된다. 추가로 상기 sHASEGP의 제제, 공제제 및 조직 변형 효소로서 사용하며 질병을 치료, 예방 또는 진단하기 위한 상기 sHASEGP(다른 제제와의 동시 투여 포함)의 치료 용도가 제공된다.
도 1은 sHASEGP 벡터 HZ24의 벡터 지도이다.
A. 정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 개시내용을 통하여 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개 출원 및 공개 문헌, 진뱅크 서열, 웹사이트 및 다른 공개 자료는 달리 표시되지 않으면 그 전체가 참고로 본원에 통합된다. 본원의 용어에 대한 정의가 다수 존재하는 경우에는 이 섹션의 용어 정의가 우선한다.
URL 또는 다른 그러한 식별자(identifier) 또는 어드레스를 참고하는 경우, 그러한 식별자는 변할 수 있으며 인터넷상의 특정 정보의 교류가 있을 수 있으나, 인터넷을 검색함으로써 등가의 정보를 발견할 수 있는 것으로 이해한다. 이들에 대한 참고는 그러한 정보의 이용가능성 및 공중에의 배포를 입증한다.
본원에서 사용된 바와 같은 임의의 보호기, 아미노산 및 다른 화합물의 약자는, 달리 표시되지 않으면, 그들의 일반적인 용법, 인정된 약자, 또는 생화학적 명칭에 대한 IUPAC-IUB 위원회를 따른다 ((1972) Biochem. 11: 942-944 참고).
본원에 사용된 바와 같은 진핵성 히알루로니다제는, 히알루로니다제의 글루타메이트 잔기가 산-염기 촉매 기전을 통하여 히알루로난과 콘드로이친 설페이트의 베타 1,4 결합을 가수분해하는, 글리코스아미노글리칸 엔도글루코사미니다제의 다양한 패밀리를 말한다.
특히 관심이 가는 것은 인간을 비롯한 포유류 기원의 가용성의 중성 활성 히알루로니다제, 즉 sHASEGP이다. 당업자라면 일반적으로 폴리펩티드의 비 필수 영역 내의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않음을 인식할 것이다 (예, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참고).
본원에 사용된 바와 같은 막 고정된 HASEGP는, 본원에 개시된 바와 같은 공통 구조적 특징을 공유하는 막 고정된 히알루로니다제의 패밀리를 말한다. 본원에 개시되고 예시된 바와 같이, 정상적으로 막 고정된 히알루로니다제(예, 히알루로난을 분해할 수 있는 글리코스아미노글리카나제, 바람직하게는 중성 pH 범위에서 적어도 일부 활성을 나타내는 것)는 히알루로니다제를 막에 고정하는 것과 관련된 영역 중 하나 이상의 영역을 제거하거나 또는 그렇지 않으면 변형시켜 가용성 HASEGP 또는 sHASEGP로 전환시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 히알루로니다제는 생리 조건하에서의 그 가용성을 특징으로 하는 폴리펩티드이다. 가용성 HASEGP는 예를 들어, 그것이 37℃로 가온된 트리톤 X-114의 수성상내로 분배되는 것에 의해 구별될 수 있다 (Bordier et al J Biol Chem. 1981 Feb 25; 256 (4): 1604-7). 한편 지질 고정된 HASEGP는 세제가 풍부한 상내로 분배될 것이지만, 포스포리파제-C로 처리한 후에는 세제가 적거나 수성인 상내로 분배될 것이다.
따라서, 예를 들어 "sHASEGP"라 함은 인간 sHASEGP, 마우스 sHASEGP, 또는 임의의 다른 공급원에서 얻어지거나, 또는 합성에 의해 제조되거나 동일한 활성을 나타내는 등가 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는, sHASEGP 유전자 패밀리에 의해 코딩되는 모든 당단백질을 포괄한다. 예시적인 sHASEGP 및/또는 그 도메인의 코딩 핵산 분자의 서열 및 코딩된 아미노산 서열은 예를 들어, 서열 번호 4에 개시된다. 상기 용어는 또한 각 구성원의 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환을 갖는 sHASEGP를 포함하며, 또한 그 스플라이스 변이체를 포함한다. 반드시는 아니지만, 아미노산의 보존적 치환을 비롯한 적합한 치환이 당업계에 공지되어 있으며, 생성된 분자의 촉매 활성 등의 생물학적 활성을 제거하지 않고 실시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 언급되는 경우의 sHASEGP는 서열 번호 6에 개시된 뉴클레오티드의 서열에 의해 또는 서열 번호 1의 아미노산 1-509를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 낮은, 중간 또는 높은 엄격도 조건하에서 서열 번호 6에 개시된 뉴클레오티드의 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드의 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 서열 번호 1의 아미노산 1-509로 개시된 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 1에 개시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 1-448에 개시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 적어도 하나 또는 전부 또는 임의의 조합을 포함한다.
특히, 서열 번호 4에 표시된 히알루로니다제 도메인을 갖는 sHASEGP 폴리펩티드가 제공된다. 상기 폴리펩티드는 단일쇄 또는 이중쇄 폴리펩티드이다. 히알루로니다제 활성을 보유하는 보다 작은 그 일부 또한 제공된다. sHASEGP로부터의 히알루로니다제 도메인은 표면 루프에서의 삽입 및 결실을 비롯하여, 크기 및 구성이 다양하다. 따라서, 본원에서의 목적을 위하여, 촉매 도메인은 본원에서 정의된 대로 sHASEGP의 일부이며, 이전에 확인된 HYAL1, HYAL2, HYAL3와 같은, 다른 히알루로니다제형 서열의 도메인에 상동성이지만; 인간 히알루로니다제 도메인의 분리된 단일쇄 형태가 시험관내 분석에서 기능할 수 있음은 인식되지 않았다. 활성에 필요한 아스파테이트 및 글루타메이트 잔기는 보존된 모티프에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은, "가용성 sHASEGP의 중성 히알루로니다제 도메인"은 중성 pH에서 히알루로니다제 활성을 나타내며, 개시된 바와 같은 조건하에서 가용성이며, 히알루로니다제 글리코실-하이드롤라제 패밀리 도메인과 상동성 및 구조적 특징을 공유하지만 중성 활성에 필요한 카르복시 말단에서의 추가 서열을 함유하는 sHASEGP의 베타 1,4 엔도글루코사미니다제 도메인을 말한다. 따라서 이것은 표준 시험관내 분석에 의해 평가할 때 히알루로니다제 활성을 나타내며 가용성으로 있는 상기 도메인의 적어도 최소 부분이다. 그러한 히알루로니다제 도메인 및 그것의 촉매적 활성 부분이 본원에서 고려된다. 단일쇄 형태로서 촉매적으로 작용하는 그것의 최소 단편을 포함하는 히알루로니다제 도메인의 절두된 형태 또한 제공된다. 본원에서 그리고 당업계에서 사용되는 바와 같이, 중성 또는 중성 활성이란 단백질이 중성 pH에서 활성을 나타내고(예를 들어, 약 pH7에서 활성을 나타내고), 따라서 여러 생리 조직에 특징적인 pH 범위에서 활성인 것을 의미한다. 또한 당업자들이 이해하는 바와 같이, 단백질은 일반적으로 최적 pH 부근에서 일정 범위의 활성을 나타낸다. 중성 활성 단백질의 최적 pH는 통상적으로 pH7보다 1 내지 수 pH 단위 높거나 낮은 pH 범위내에 있지만, 활성 범위는 수 pH 단위에 걸쳐 확대될 수 있다.
본원에서 언급되는 경우의 sHASEGP의 히알루로니다제 도메인은 서열 번호 1에 개시된 아미노산의 서열을 포함하는 N-결합된 당단백질 폴리펩티드; 낮은, 중간 또는 높은 엄격도 조건하에서 서열 번호 6에 개시된 뉴클레오티드의 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드의 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 서열 번호 1에 개시된 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 1에 개시된 아미노산의 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및/또는 sHASEGP의 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인 중 적어도 하나 또는 모두 또는 임의의 조합 또는 촉매적 활성 부분을 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 히알루로니다제 도메인은 본원에서 정의된 대로, sHASEGP의 일부이며, 다른 sHASEGP의 도메인에 상동성이다. 히알루로니다제 패밀리의 효소의 보다 큰 분류의 경우, sHASEGP 촉매 도메인은 고도의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 활성에 필요한 Asp와 Glu 잔기는 보존된 모티프에 존재한다.
활성 형태란 생체내 및/또는 시험관내에서 활성인 형태를 의미한다. 본원에서 개시된 대로, 히알루로니다제 도메인은 또한 가용성의 분비된 당단백질로서 존재할 수 있다. 적어도 시험관내에서, sHASEGP의 단일쇄 형태 및 그 촉매 도메인 또는 효소적 활성 부분(일반적으로 C-말단 절단물)은 히알루로니다제 활성을 나타내는 것으로 나타난다. 따라서 sHASEGP의 히알루로니다제 도메인의 분리 형태, 및 그 활성을 조절하는 제제의 확인을 위한 시험관내 약물 스크리닝 분석에서의 그들의 용도가 본원에서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, sHASEGP의 촉매적 활성도메인은 글리코스아미노글리칸 기질에 대한 시험관내 활성에 의해 정의되는 중성 활성 엔도글루코스아미니다제 도메인을 말한다.
대상 sHASEGP는 생체내 및 시험관내에서 콘드로이친 설페이트 및 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸(CSPG)에 대해 활성인 것들; 및 히알루로난에 대해 활성인 것들을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 인간 sHASEGP는 그들이 다른 포유류에서 발견되는 변이체가 아닌 한, 모든 대립유전자 변이체 및 보존적 변이체를 비롯하여 인간의 게놈에 존재하는 DNA와 같은 핵산에 의해 코딩되는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, sHASEGP의 히알루로니다제 도메인 또는 촉매적 활성 부분을 코딩하는 핵산은 언급된 단일쇄 히알루로니다제 도메인 또는 그 활성 부분만을 코딩하며 연속 서열로서 sHASEGP의 다른 인접 부분을 코딩하지 않는 핵산을 말하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, "질병" 또는 "장애"는 예를 들어 감염 또는 유전적 결함에서 기인하며 확인가능한 증상을 특징으로 하는 유기체의 병리학적 상태를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은, 스플라이스 변이체는 하나보다 많은 타입의 mRNA를 생성하는, DNA와 같은 게놈 핵산의 일차 전사물의 차등 프로세싱에 의해 생성된 변이체를 말한다. sHASEGP의 스플라이스 변이체가 본원에서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, sHASEGP 단백질의 히알루로니다제 도메인은 중성 엔도글루코스아미니다제 활성을 나타내는 sHASEGP의 히알루로니다제 도메인을 말한다. 따라서 그것은 표준 시험관내 분석에 의해 평가할 때 엔도글루코스아미니다제 활성을 나타내는 단백질의 적어도 최소 부분이다. 예시적인 인간 히알루로니다제 도메인은 엔도글루코스아미니다제 활성을 나타내는 서열 번호 4에 개시된 아미노산 서열의 적어도 충분한 일부를 포함한다.
또한 시험관내 히알루로니다제 분석에서 엔도글루코스아미니다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며, sHASEGP 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인의 전길이와 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 그들의 전길이를 따라 또는 전길이의 적어도 약 70%, 80% 또는 90%를 따라 특히 중간, 일반적으로는 높은 엄격도의 조건하에서 히알루로니다제 도메인을 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 분자가 고려된다.
PH20의 히알루로니다제 도메인의 경우, N-말단 영역의 잔기는 중요하지만 활성에 충분하지는 않다. 본원에 개시된 바와 같은 기술을 적용하면 촉매적으로 활성인 sHASEGP의 히알루로니다제 도메인을 생성할 수 있다. 예를 들어, 인간 PH20의 히알루로니다제 도메인은 일반적으로 활성을 위해 그들의 N-말단 아미노산을 필요로 하며; C-말단 부분은 마지막 시스테인 잔기가 최적의 활성이기 위해 추가의 아미노산을 필요로 할 때까지 절두될 수 있다. 제거될 수 있는 양은 촉매적 절단을 평가하는 시험관내 분석에서 히알루로니다제 활성에 대해 폴리펩티드를 시험함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
따라서 히알루로니다제 활성을 보유하는 히알루로니다제 도메인의 더 작은 부분, 특히 단일쇄 도메인이 고려된다. 그러한 보다 작은 형태는 일반적으로 히알루로니다제 도메인의 C-말단 절두된 형태이다. 히알루로니다제 도메인은 표면 루프에서의 삽입 및 결실을 비롯하여, 크기 및 구성에서 다양하다. 그러한 도메인은 양성자 공여체와 같은 하나 이상의 구조적 특징 및/또는 엔도글루코스아미니다제의 히알루로니다제 도메인의 다른 특징을 비롯하여 보존된 구조를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 히알루로니다제 도메인은 본원에서 정의된 대로, sHASEGP의 단일쇄 부분이지만, 그 구조적 특징 및 다른 히알루로니다제-유사 서열의 히알루로니다제 도메인에 대한 유사성 또는 상동성의 서열 보유면에서는 상동성이다. 당단백질은 단일쇄로서 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 상동성이란, 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%와 같은 약 25%를 초과하는 핵산 서열 동일성을 의미한다. 필요하면, 퍼센트 상동성이 특정될 것이다. 용어 "상동성" 및 "동일성"은 종종 상호교환적으로 이용된다. 일반적으로, 서열은 가장 높은 상태의 대응이 얻어지도록 배열된다 (예를 들어, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al.(1988) et al. Slam J Applied Math 48]: 1073 참고).
서열 동일성에 의해, 보존된 아미노산의 수는 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티와 함께 이용된다. 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 일반적으로 핵산의 길이를 따라 모두 또는 대상 핵산 분자의 전길이의 적어도 약 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 엄격도 또는 높은 엄격도에서 하이브리드할 것이다. 하이브리드화하는 핵산 분자에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 핵산 분자 또한 고려된다.
임의의 두 핵산 분자가 적어도 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson 등의 문헌[(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다 (다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST 함수를 이용하여 동일성을 결정할 수 있다. 다른 시판되거나 공개된 프로그램은 DNASTAR "MEGALIGN" PROGRAM (위스콘신주, 메디슨 소재) 및 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWG) "GAP" 프로그램(위스콘신주, 메디슨 소재)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 퍼센트 상동성 또는 동일성은 예를 들어, 문헌[Smith and Waterman Adv. Appl. Math (1981) 2:482]에 의해 개정된 대로, 예를 들어, 문헌[Needleman et al. (1970),J Mol Biol.48:443]과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 간단히 설명하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Gribskov 등[(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745]의 가중치 비교 매트릭스, 문헌[Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)]에 의해 개시된 바와 같음; (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동일성"은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 적어도 "90% 동일한"은 기준 폴리펩티드에 대하여 90 내지 99.99의 퍼센트 동일성을 말한다. 90% 이상의 동일성은 예시적인 목적을 위해 가정하여 100 아미노산 길이의 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드가 비교됨을 나타낸다. 시험 폴리펩티드의 10%(즉, 100개 중 10개) 이하의 아미노산이 기준 폴리펩티드와 상이하다. 유사한 비교를 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드 사이에서 할 수 있다. 그러한 차이는 아미노산 서열 전체 길이에 걸쳐 임의로 분포된 점 돌연변이로서 나타내지거나 또는 그들은 허용가능한 최대치, 예, 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 변하는 길이로 하나 이상의 위치에서 모여있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 또는 결실로서 정의된다. 약 85-90%를 넘는 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 정해진 파라미터와 무관하며; 그러한 높은 수준의 동일성은 쉽게, 종종 소프트웨어에 의존함 없이 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 프라이머는 2 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 일반적으로 3 이상을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 말하며, 이로부터 프라이머 연장 생성물의 합성이 시작될 수 있다. 합성에 유리한 실험 조건은 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 및 중합 및 연장을 위한 제제, 예, DNA 폴리머라제, 및 적합한 완충액, 온도 및 pH를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 동물은 염소, 소, 사슴, 양, 설치류, 돼지 및 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 동물을 포함한다. 인간 이외의 동물은 고려되는 동물에서 인간을 제외한다. 본원에서 제공되는 sHASEGP는 임의의 공급원, 동물, 식물, 원핵 및 진균류로부터 유래할 수 있다. 바람직한 sHASEGP는 포유류 기원을 비롯한 동물 기원이며, 인간에서 사용하는 경우에는 인간 기원이 더욱 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, 유전자 치료법은 DNA와 같은 이종성 핵산을, 그러한 치료를 필요로 하는 질환 또는 상태를 가진 포유류, 특히 인간의 일부 세포, 표적 세포내로 전달하는 것을 포함한다. DNA와 같은 핵산은 DNA와 같은 이종성 핵산이 발현되고 그에 의해 코딩된 치료 생성물이 생산되도록 하는 방식으로 선택된 표적 세포내로 도입된다.
다르게는, DNA와 같은 이종성 핵산은 일부 방식으로 치료 생성물을 코딩하는 DNA의 발현을 매개하거나, 또는 일부 방식으로는 직접 또는 간접적으로 치료 생성물의 발현을 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 생성물을 코딩할 수 있다. 유전자 치료법은 또한 결함 유전자를 대신하거나 그것이 도입되는 포유류 또는 세포에 의해 생산된 유전자 생성물을 보충하는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 도입된 핵산은 정상적으로 포유류 숙주에서 생산되지 않거나 또는 치료적으로 유효량으로 생산되지 않거나 치료적으로 유용한 시간에서 생산되지 않는, 성장 인자 억제자, 또는 종양 괴사 인자 또는 그 억제자, 예 그 수용체와 같은 치료 화합물을 코딩할 수 있다. 치료 생성물을 코딩하는 DNA와 같은 이종성 핵산은 생성물 또는 그 발현을 증가시키거나 또는 변화시키기 위해 숙주의 세포내로 도입하기 전에 변형될 수 있다. 유전자 치료법은 또한 유전자 발현의 억제자, 리프레서 또는 다른 조절자의 전달을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 이종성 핵산은 그것이 발현되는 세포에 의해 정상적으로 생체내에서 생산되지 않거나 또는 전사, 번역, 또는 다른 조절가능한 생화학적 과정에 영향을 줌으로써 DNA와 같은 내인성 핵산의 발현을 변화시키는 매개자를 코딩하거나 매개하는 단백질을 코딩하는 핵산(만일 DNA가 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 경우)이다. DNA와 같은 이종성 핵산은 또한 DNA와 같은 외래 핵산으로 불릴 수 있다. 당업자가 발현이 일어나는 세포에 대해 이종성 또는 외래인 것으로 인식하거나 간주하는 DNA와 같은 임의의 핵산은 본원에서 이종성 핵산에 포함되며; 이종성 핵산은 또한 내인성으로 발현되는 외부에서 첨가된 핵산을 포함한다. 이종성 핵산의 예는 약물 내성을 부여하는 단백질과 같은 미량의 마커 단백질을 코딩하는 핵산, 항암제, 효소 및 호르몬과 같은 치료적으로 효과적인 물질을 코딩하는 핵산, 및 항체와 같은 다른 타입의 단백질을 간접적 또는 직접적으로 코딩하는 핵산(예, DNA 및 RNA)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이종성 핵산에 의해 코딩되는 항체는 이종성 핵산이 도입된 세포의 표면에서 발현되거나 분비될 수 있다.
이종성 핵산은 일반적으로 그것이 도입되는 세포에 내인성이 아니며 다른 세포로부터 얻어지거나 합성으로 제조된다.
반드시 그렇지는 않지만, 일반적으로, 그러한 핵산은 그것이 발현되는 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 RNA 및/또는 단백질을 코딩한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료적으로 효과적인 생성물은, 핵산이 숙주 내로 도입될 때, 유전적 또는 후천적 질병의 증상, 징후를 완화하거나 제거하거나 그 질병을 치료하는 생성물이 발현되는, 이종성 핵산, 일반적으로 DNA에 의해 코딩되는 생성물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 당단백질이 주로 히알루로니다제 도메인으로 구성된다는 것은 폴리펩티드의 sHASEGP 부분만이 히알루로니다제 도메인 또는 그 촉매적 활성 부분임을 의미한다. 폴리펩티드는 선택적으로, 그리고 일반적으로 추가의 비-sHASEGP-유래의 아미노산 서열을 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 도메인은 구조적 및/또는 기능적으로 그 분자의 다른 부분과 구별되는 분자, 예를 들어 당단백질 또는 코딩 핵산의 일부를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제는 히알루로난을 비롯하여 글리코스아미노글리칸의 가수분해를 촉매하는 효소를 말한다.
명확히 하기 위하여, 히알루로니다제의 언급은 모든 형태를 말하는 것이며, 특정 형태는 구체적으로 표시될 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 히알루로니다제 도메인은 sHASEGP 단백질의 막 결합 및 가용성 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 단백질 핵산(PNA)을 비롯한 그 유사체 및 그 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 선택적으로 형광 염료 또는 방사성라벨과 같은 검출가능한 라벨로 표지된 프로브 또는 프라이머를 언급할 경우, 일반적으로 단일쇄 분자가 고려된다. 그러한 분자는 일반적으로 그들의 표적이 라이브러리를 탐침하거나 프라임하기 위해 통계적으로 독특하거나 낮은 카피수(일반적으로 5 미만, 대개 3 미만)를 갖는 길이이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 대상 유전자와 동일하거나 상보적인 적어도 14, 16 또는 30 잔기의 인접하는 또는 거의 인접하는 뉴클레오티드를 함유한다. 프로브와 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, sHASEGP의 단편 또는 일부를 코딩하는 핵산은 sHASEGP의 언급된 단편 또는 일부만을 코딩하며 sHASEGP의 다른 인접 부분은 코딩하지 않는 핵산을 말한다.
본원에서 이용할 때, 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위, 및 다른 시그널 서열과 같은 뉴클레오티드의 조절 및 효과인자 서열에의 이종성 핵산의 작동적 연결은 DNA와 같은 그러한 핵산과 그러한 뉴클레오티드 서열 간의 관계를 말한다. 예를 들어, 프로모터에의 이종성 DNA의 작동적 연결은, 그러한 DNA의 전사가 판독 프레임으로 DNA를 특이적으로 인식하고 결합하고 전사하는 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA와 프로모터 사이의 기능적(및 통상적으로 물리적) 관계를 말한다. 따라서, 작동적으로 연결된 또는 작동가능하게 연합된은 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 다른 시그널 서열과 같은 뉴클레오티드의 조절 및 효과인자 서열과, DNA와 같은 핵산의 기능적 관계를 말한다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위하여, 여분의 잠재적인 부적절한 다른 번역 개시, 즉 전사 또는 번역 수준에서 발현을 방해 또는 감소시킬 수 있는 개시 코돈 또는 다른 서열을 제거하기 위하여 클론의 5' 비번역 부분을 제거, 첨가 또는 변화시키는 것이 필요할 수 있다. 다르게는, 컨센서스 리보좀 결합 부위(예, Kozak J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991) 참고)가 개시 코돈의 5'에 삽입되어 발현을 개선할 수 있다. 그러한 변형이 바람직한지(또는 필요한지)는 실험적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 참고하여, RNA의 적어도 일부에 상보적인 서열은 충분한 상보성을 가져, 중간 또는 높은 엄격도 조건하에서 RNA와 하이브리드하여 안정한 이중쇄를 형성할 수 있는 서열을 말하며; 이중쇄 sHASEGP 안티센스 핵산의 경우에는, 이중쇄 DNA의 단일쇄(또는 dsRNA)가 시험되거나 또는 삼중쇄 형성을 분석할 수 있다. 하이브리드화하는 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이에 의존한다. 일반적으로, 하이브리드화하는 핵산의 길이가 길수록, 그것이 함유할 수 있으며 안정한 이중쇄(또는 가능한 경우에는, 삼중쇄)를 형성하는 sHASEGP 코딩 RNA와 더 많은 염기 부정합이 존재한다. 당업자는 하이브리드화한 복합체의 융점을 결정하기 위하여 표준 과정을 이용하여 허용할 수 있는 부정합 정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 아미노산 치환은 생성된 단백질이 히알루로니다제 활성을 나타내기만 하면 sHASEGP 및 그것의 히알루로니다제 도메인 중 임의의 것에서 만들어질 수 있다. 고려되는 아미노산 치환은 표 1에 개시된 것과 같은 보존적 치환과, 단백질 분해 활성을 제거하지 않는 다른 변형을 포함한다. 본원에서 개시된 바와 같이, 절단 부위 및 기타 그러한 부위의 제거와 같은, 단백질의 특성을 바꾸는 치환 또한 고려되며; 그러한 치환은 일반적으로 비-보존적이지만 당업자에 의해 쉽게 이루어질 수 있다.
아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며 일반적으로 생성 분자의 생물학적 활성, 예를 들어 효소 활성을 제거하지 않고 (바람직하게는 실질적으로 변화시키지 않고) 만들어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물 활성을 크게 바꾸지 않는다는 것을 인식한다 (예, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224 참고). sHASEGP의 촉매적 활성 단편, 특히 단일쇄 히알루로니다제 부분 또한 정의내에 포함된다. 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 하기와 같이 표 1에 개시된 것에 따라 만들어진다:
[표 1]
원래 잔기 보존적 치환 Ala (A) Gly; Ser, Abu Arg (R) Lys, Orn Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) ASP Gly (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln Ile(I) Leu; Val; Met; Nle; Nva Leu (L); Val; Met; Nle; Nva Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile; NLe Val Orn Lys; Arg Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) ILE; Leu; Met; Nle; Nva.
다른 치환 또한 허용가능하며 실험적으로 또는 공지의 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, Abu는 2-아미노부티르산이며; Nle는 노르류신이며; Nva는 노르발린이며; Orn은 오르니틴이다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 나타나는 다양한 아미노산 서열에서 발생하는 아미노산은 그들의 공지의, 3-문자 또는 1-문자 약자에 따라 확인된다. 다양한 DNA 단편에서 발생하는 뉴클레오티드는 당업계에서 일상적으로 이용되는 표준 단문자 표시에 따라 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 개시된 뉴클레오티드 서열에 기초한 프로브 또는 프라이머는 서열 번호 6의 적어도 10, 14, 일반적으로 적어도 16개의 인접한 뉴클레오티드 서열, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호 6의 적어도 20, 30, 50, 또는 100개의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 독특한 하이브리드화를 위한 프로브 또는 프라이머의 길이는 대상 게놈의 복잡성의 함수이다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 약학 조성물의 투여에 의한 특정 질환의 증상의 완화는, 영구적이건 일시적이건, 상기 조성물의 투여에 기인하거나 이에 연관될 수 있는 지속적이거나 일시적인, 임의의 감소를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 이중쇄 DNA의 센스 쇄 또는 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드 염기의 합성 서열을 말한다. 적절한 조건하에서 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼합물은 두 분자의 결합, 즉 하이브리드화를 야기한다. 이들 폴리뉴클레오티드가 mRNA와 결합(하이브리드)할 때, 단백질 합성(번역)의 억제가 일어난다. 이들 폴리뉴클레오티드가 이중쇄 DNA에 결합할 때, RNA 합성(전사)의 억제가 일어난다.
번역 및/또는 전사의 결과적인 억제는 센스 쇄에 의해 코딩되는 단백질의 합성의 억제를 야기한다. 안티센스 핵산 분자는 통상적으로 표적 핵산에 특이적으로 결합하기에 충분한 수의 뉴클레오티드, 일반적으로 대상 유전자를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 sHASEGP의 단일쇄 히알루로니다제 도메인을 코딩하는 핵산의 코딩 부분에 상보적인, 적어도 5 인접 뉴클레오티드, 종종 적어도 14 또는 16 또는 30 인접 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어레이는 셋 이상의 구성원을 함유하는, 항체와 같은 요소의 수집체를 말한다. 확인가능한 어레이는 어레이의 구성원이 일반적으로 고체상 지지체에서의 위치에 의해 확인가능한 것이다. 따라서, 일반적으로 어레이의 구성원들은 고체상의 표면상에 분별가능한 확인가능한 위치에 고정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체는 천연이건 또는 부분적 또는 전체적으로 합성되어 생산되었건 간에, 항체의 특이적 결합 능력을 보유한 그 임의의 유도체를 비롯한 면역글로불린을 말한다. 따라서, 항체는 면역글로불린-결합 도메인에 상동성이거나 실질적으로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 비롯한 임의의 면역글로불린 부류의 구성원을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 단편은 전길이 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 일부를 보유한, 전길이 미만인 항체의 임의 유도체를 말한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(AB)2, 단일쇄 Fvs(scFV), FV, dsFV 다이아바디 및 Fd 단편을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 단편은 이황화 결합에 의해서와 같이, 함께 연결된 다중쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편은 일반적으로 적어도 약 50 아미노산을 함유하며 일반적으로 적어도 200 아미노산을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, Fv 항체 단편은 비공유 상호작용에 의해 연결된 하나의 가변성 중쇄 도메인(VH)과 하나의 가변성 경쇄 도메인으로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, dsFV는 조작된 분자간 이황화 결합을 가진 Fv를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, F(AB)2 단편은 pH 4.0-4.5에서 펩신으로 면역글로불린을 분해하여 생기는 항체 단편이며; 등가 단편을 생산하기 위하여 재조합적으로 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, Fab 단편은 파파인으로 면역글로불린을 분해하여 생기는 항체 단편이며; 등가 단편을 생산하기 위하여 재조합적으로 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, scFv는 임의의 순서로 폴리펩티드 링커에 의해 공유 결합된 가변 경쇄 V, 및 가변 중쇄(VH)를 함유하는 항체 단편이다. 상기 링커는 두 가변 도메인이 실질적 간섭없이 결합되는 길이이다. 포함되는 링커는 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 용해성을 증가시키기 위해 전체에 퍼져 있는 (Gly-Ser)n 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간화 항체는 아미노산의 인간 서열을 포함하도록 변형되어 인간에의 투여가 면역 반응을 야기하지 않는 항체를 말한다. 그러한 항체의 제조 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 그러한 항체를 생산하기 위해, 모노클로날 항체를 발현하는, 이. 콜라이 또는 CHO 세포와 같은 하이브리도마 또는 다른 원핵 또는 진핵 세포는 재조합 DNA 기법에 의해 변화되어 비가변 영역의 아미노산 조성이 인간 항체에 기초한 항체를 발현한다. 컴퓨터 프로그램은 그러한 영역을 확인하도록 고안되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 다이아바디는 이량체 scFV이며; 다이아바디는 일반적으로 ScFV보다 짧은 펩티드 링커를 가지며, 이들은 일반적으로 이량체화된다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용하는 재조합 수단에 의한 생산은 클로닝된 DNA에 의해 코딩된 단백질을 발현하기 위한 공지된 분자 생물학 방법을 이용하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가는 샘플에 존재하는 sHASEGP 또는 그 도메인의 활성에 대해 절대값을 얻고 또한 활성의 수준을 나타내는 지수, 비율, 퍼센티지, 시각적 또는 다른 값을 얻는 의미에서 질적 및 양적 측정을 포함한다. 평가는 직접 또는 간접적일 수 있으며 실제로 검출되는 화학종은 물론 그 자체가 단백질 분해 생성물일 필요가 없으며 예를 들어 그 유도체 또는 일부 추가 물질일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물 활성은 화합물의 생체내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 다른 혼합물의 생체내 투여시 생기는 생리학적 반응을 말한다. 따라서, 생물 활성은 그러한 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물 활성은 그러한 활성을 시험하거나 이용하기 위해 고안된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여 루시퍼라제의 생물 활성은 기질의 산화시 빛이 생산되는 옥시게나제 활성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 기능적 활성은 전길이 단백질과 관련된 하나 이상의 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 그 일부를 말한다.
기능적 활성은 생물 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성(항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 결합에 대해 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력, 폴리펩티드를 위한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, sHASEGP를 비롯한, 하나 이상의 sHASEGP, 특히 단일쇄 히알루로니다제 도메인, 및 하나 이상의 표적화제를 포함하는 접합체는 본원에서 제공된 화합물을 말한다. 이들 접합체는 융합 단백질로서 재조합 수단에 의해 생산된 것들, 예를 들어 설프히드릴기에의 커플링을 통해서와 같은 화학적 커플링에 의한 것과 같은 화학적 수단에 의해 생산된 것들, 및 하나 이상의 sHASEGP 또는 그 도메인이 직접 또는 링커를 통하여 간접적으로 표적화제에 연결되는 임의의 다른 방법에 의해 생산된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적화제는 접합체 또는 그 sHASEGP 부분을 내부화할 수 있는 세포 표면 수용체에의 접합체의 특이적 결합을 제공하는 단백질 또는 그 유효 부분과 같은 임의의 부분이다. 표적화제는 또한 예를 들어, 접합체의 친화성 분리 또는 정제; 표면에의 접합체의 부착; 또는 접합체 또는 접합체를 함유하는 복합체의 검출을 증진 또는 촉진하는 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 접합체는 표적화제가 항체인 접합체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 분자의 유도체 또는 유사체는 분자에서 유래된 부분 또는 분자의 변형된 형태를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 질병을 치료하기 위한 화합물의 유효량은 그 질병과 관련된 증상을 완화시키거나 또는 일부 방식으로는 감소시키기에 충분한 양이다. 그러한 양은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 효과적인 요법에 따라 투여될 수 있다. 상기 양은 질병을 치료할 수 있으나, 일반적으로 질병의 증상을 완화시키기 위해 투여된다. 증상의 원하는 완화를 이루기 위해 반복 투여가 필요할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산의 두 서열을 말할 때, 등가물은 두 서열이 동일한 아미노산 서열 또는 등가의 단백질을 코딩함을 의미한다. 등가물을 두 단백질 또는 펩티드를 말할 때 이용하면, 그것은 두 단백질 또는 펩티드가 그 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환(예, 상기 표 1에 개시된 것과 같은 보존적 변화 등)만을 갖는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미한다. 등가물이 특성을 가리킬 경우, 그 특성은 동일한 정도로 존재할 필요는 없으나(예, 두 펩티드가 동일한 타입의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있음), 활성은 대개 실질적으로 동일하다. 두 뉴클레오티드 서열을 말할 때, 상보적이라는 것은 두 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 대치되는 뉴클레오티드간에 25%, 15%, 5% 또는 0% 미만의 부정합으로 하이브리드할 수 있음을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 퍼센티지가 특정될 것이다. 일반적으로 두 분자는 그들이 높은 엄격도 조건하에서 하이브리드하도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 활성 또는 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하는 제제는 단백질의 활성을 감소 또는 증가시키거나 또는 다르게는 변화시키며, 또는 일부 방식으로 세포에서 핵산의 발현을 상향 또는 하향 조절하거나 다르게는 변화시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, sHASEGP의 활성의 억제자는 시험관내 스크리닝 분석에서 특히 단일쇄 형태의, sHASEGP의 생산, 번역후 변형(들), 성숙, 또는 막 국재화를 금지 또는 감소시키는 임의 물질 또는 그 단백질분해 효능을 방해하거나 감소시키는 임의의 물질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 종양 질병을 치료하거나 예방하는 방법은 종양, 그 전이, 종양의 유관화 또는 질병이 특징지어질 수 있는 다른 파라미터와 같은 임의의 증상이 감소, 완화, 예방되거나, 경감 상태에 놓이거나, 또는 경감 상태로 유지되는 것을 말한다. 또한 종양 질병 및 전이의 특징이 치료에 의해 제거, 감소 또는 예방될 수 있음을 의미한다. 특징의 비제한적인 예는 기저막 및 기부 세포외 매트릭스의 비조절성 분해, 새로운 기능성 모세혈관으로 내피 세포의 이동, 분열 및 조직화, 및 그러한 기능성 모세혈관의 지속을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 접합체의 약학적 허용염, 에스테르 또는 다른 유도체는 그러한 유도체화를 위한 공지의 방법을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있으며 실질적인 독성 효과없이 동물 또는 인간에게 투여될 수 있는 화합물을 생산할 수 있으며 약학적 활성물이거나 프로드러그인 임의의 염, 에스테르 또는 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로드러그는 생체내 투여시 대사되거나 또는 다르게는 화합물의 생물학적, 약학적 또는 치료적 활성 형태로 전환되는 화합물이다. 프로드러그를 생산하기 위하여, 약학적 활성 화합물은 활성 화합물이 대사 과정에 의해 재생되도록 변형된다. 프로드러그는 약물의 대사적 안정성 또는 수송 특성을 변화시키기 위해, 부작용 또는 독성을 차단하기 위해, 약물의 향을 개선하기 위해 또는 약물의 다른 특징 또는 특성을 변화시키기 위해 디자인될 수 있다. 약력학적 과정 및 생체내 약물 대사에 대한 지식에 의해, 당업자는 일단 약학적 활성 화합물이 공지되면, 화합물의 프로드러그를 고안할 수 있다 (예, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, p388-392).
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공된 스크리닝 방법에 의해 확인된 약물은 치료제로서 또는 치료제의 고안을 위한 선도 화합물로서 사용하기 위한 후보자인 임의의 화합물을 말한다. 그러한 화합물은 작은 유기 분자, 펩티드, 펩티드 모방체, 안티센스 분자 또는 RNAi와 같은 dsRNA, 항체, 항체 단편, 재조합 항체 및 약물 후보 또는 선도 화합물로 작용할 수 있는 다른 그러한 화합물을 비롯한 작은 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드 모방체는 특정 펩티드의 생물학적 활성 형태의 배열 및 일부 입체화학적 특징을 모방하는 화합물이다. 일반적으로, 펩티드 모방체는 화합물의 일부 바람직한 특성은 모방하되, 생물학적으로 활성인 형태의 소실 및 결합 파괴를 야기하는 유연성과 같은 바람직하지 않은 특성을 모방하지 않도록 고안된다. 펩티드 모방체는 바람직하지 않은 특성에 기여하는 일부 기 또는 결합을 생물학적 동족체(bioisostere)로 대신함으로써 생물학적 활성 화합물로부터 제조될 수 있다. 생물학적 동족체는 공지되어 있다. 예를 들어 메틸렌 생물학적 동족체 CH2S는 엔케팔린 유사체에서 아미드 치환체로 사용되었다 (예, Spatola(1983) pp. 267-357 in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York 참고). 경구투여될 수 있는 모르핀은 펩티드 엔돌핀의 펩티드 모방체인 화합물이다. 본 발명의 목적을 위하여, 시클릭 펩티드는 펩티드 모방체에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로모터 영역 또는 프로모터 요소는 그것이 작동적으로 연결되는 DNA 또는 RNA의 전사를 조절하는 DNA 또는 RNA의 분절을 말한다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특이적 서열을 포함한다.
프로모터 영역의 이 부분은 프로모터로 불린다. 또한, 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제의 이러한 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 시스 작용하거나 또는 트랜스 작용 인자에 반응할 수 있다. 프로모터는 조절의 특성에 따라, 구성적이거나 조절될 수 있다. 원핵생물에서 사용하기 위해 고려되는 예시적인 프로모터는 박테리오파아지 T7 및 T3 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 수용체는 주어진 리간드에 대해 친화성을 갖는 분자를 말한다. 수용체는 자연 발생 또는 합성 분자일 수 있다. 수용체는 또한 당업계에서 항-리간드로 불린다. 본원에 사용된 바와 같이, 수용체 및 항-리간드는 상호교환적이다. 수용체는 그들의 비변화 상태로 또는 다른 종과의 응집체로서 사용될 수 있다. 수용체는 특이적 결합 물질 또는 링커를 통해 간접적으로 또는 직접적으로, 결합 구성원에 공유적 또는 비공유적으로 부착하거나 또는 물리적 접촉할 수 있다. 수용체의 예는 항체, 세포막 수용체 표면 수용체 및 내부화 수용체, 바이러스, 세포, 또는 다른 물질상의 특이적 항원성 결정인자와 반응성인 모노클로날 항체 및 항혈청, 약물, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 펩티드, 인자, 렉틴, 당, 다당류, 세포, 세포막, 및 기관을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
수용체 및 그러한 수용체를 이용한 용례의 예는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: a) 효소: 항생제 (리간드) 선별을 위한 표적으로 작용할 수 있는, 미생물의 생존에 필수적인 특이적 수송 단백질 또는 효소; b) 항체: 대상 항원의 에피토프와 결합하는 항체 분자상의 리간드-결합 부위의 확인이 조사될 수 있으며; 항원성 에피토프를 모방하는 서열의 결정은 면역원이 그러한 서열 하나 이상에 기초하는 백신의 개발로 이끌거나 또는 자가면역 질병을 위한 것과 같은 치료에 유용한 관련 진단제 또는 화합물의 개발로 이끌며; c) 핵산: 단백질 또는 RNA와 같은 리간드, 결합 부위의 확인; d) 촉매적 폴리펩티드: 하나 이상의 반응물을 하나 이상의 생성물로 전환시키는 것에 관련된 화학 반응을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 비롯한 중합체; 그러한 폴리펩티드는 대개 하나 이상의 반응물 또는 반응 중간체에 대해 특이적인 결합 부위 및 결합 부위에 인접한 활성 작용기를 포함하며 이때 작용기는 결합된 반응물을 화학적으로 변형시킬 수 있으며(예, 미국 특허 제5,215,899호 참고); e) 호르몬 수용체: 수용체에 고 친화성으로 결합하는 리간드의 결정은 호르몬 대체 요법의 개발에 유용하며; 예를 들어, 그러한 수용체에 결합하는 리간드의 확인은 혈압 조절 약물의 개발로 이끌 수 있으며; 그리고 f) 마취제 수용체: 뇌에서 마취제 수용체에 결합하는 리간드의 결정은 모르핀 및 관련 약물을 위한 덜 중독성인 대체물의 개발에 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 샘플은 애널라이트 분석이 필요한 애널라이트를 함유할 수 있는 임의의 것을 말한다. 샘플은 생물 유체 또는 생물 조직과 같은 생물 샘플일 수 있다. 생물 유체의 예는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 담, 척수액, 눈물, 점액, 정자, 양막액 등을 포함한다. 생물 조직은 대개 특정 종류의 세포와 연결, 상피, 근육 및 신경 조직을 비롯한, 인간, 동물, 식물, 박테리아, 진균 또는 바이러스 구조의 구조적 물질 중 하나를 형성하는 그들의 세포간 물질의 응집체이다. 생물 조직의 예는 또한 기관, 종양, 림프절, 동맥 및 개별 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 퍼센티지 부정합을 결정할 때 하이브리드화의 엄격도는 다음과 같다: 1) 높은 엄격도: 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃ 2) 중간 엄격도: 0.2 x SspE, 0.1% SDS, 50℃ 3) 낮은 엄격도: 1.0 x SspE, 0.1% SDS, 50℃. 당업자는 세척 단계가 안정한 하이브리드를 선택함을 알며 또한 SspE의 성분을 안다 (예, Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press 1989 Vol 3, p. B. 13을 참고하며, 또한 흔히 이용되는 실험 용액을 개시하는 많은 카타로그를 참고함). SspE는 pH 7.4 포스페이트 완충된 0.18 NaCl이다. 또한, 당업자는 하이브리드의 안정성이 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수인 TmT에 의해 결정되며(Tm = 81.5℃-16.6 + 0.41 (% G+C) -600/L)) 하이브리드 안정성에 중요한 세척 조건의 유일한 파라미터가 SspE(또는 SSC)에서 나트륨 이온 농도 및 온도임을 인식한다.
동등한 엄격도가 다른 완충액, 염 및 온도를 이용하여 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 비제한적인 예시로서, 낮은 엄격도의 조건을 이용하는 과정은 다음과 같다 (또한 Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad Sci USA 78: 6789-6792 (1981) 참고): DNA를 함유하는 필터를 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7. 5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA, 및 500 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA (lOx)를 함유하는 용액에서 40℃에서 6시간 동안 예비처리한다. SSC는 1.5 M 염화나트륨, 및 0.15 M 소듐 시트레이트이며 pH 7로 조절된다.
하이브리드화는 하기 변형을 갖는 동일한 용액에서 실시된다: 0.02% PVP, 0.02% Ficoll 0.2% BSA, 100VG/M 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트, 및 5-20 X 106 cpm 32P-표지된 프로브를 이용한다. 필터는 40℃에서 18-20시간 동안 하이브리드화 혼합물에서 항온처리되며 이어서 2X SSC, 25 mM Tris-HCI (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 55℃에서 1.5시간 동안 세척한다. 세척 용액을 새로운 용액으로 대체하고 60℃에서 추가의 1.5시간 동안 항온처리한다. 필터를 블롯 건조시키고 방사선 사진촬영술에 노출시킨다. 필요하면, 필터를 65-68℃에서 세번째 세척하고 필름에 재노출시킨다. 이용될 수 있는 낮은 엄격도의 다른 조건은 예를 들어, 교차종 하이브리드화에 이용되는 대로 공지되어 있다.
비제한적인 예로서, 중간 엄격도의 조건을 이용하는 과정은 예를 들어, 중간 엄격도의 조건이 하기와 같은 과정을 포함하며 이에 한정되지 않는다: DNA를 함유하는 필터를 6X SSC, 5X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 55℃에서 6시간 동안 예비처리한다. 하이브리드화는 동일한 용액에서 실시하고 5-20 X 106 32P 표지된 프로브를 이용한다. 필터를 55℃에서 18-20시간 동안 하이브리드화 혼합물에서 항온처리하며 이어서 1X SSC 및 0.1% SDS를 함유한 용액에서 60℃에서 30분동안 두번 세척한다. 필터를 블롯 건조시키고 방사선사진촬영술에 노출시킨다. 이용될 수 있는 중간 엄격도의 다른 조건은 공지되어 있다. 필터의 세척은 2X SSC 및 0.1% SDS를 함유한 용액에서 37℃에서 1시간 동안 이루어진다.
비제한적인 예로서, 높은 엄격도의 조건을 이용하는 과정은 하기와 같다: DNA를 함유하는 필터의 예비하이브리드화는 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 및 500 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 구성된 완충액에서 65℃에서 8시간 내지 밤새 실시한다. 필터는 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA 및 5-20 X 106 32P 표지된 프로브를 함유하는 예비하이브리드화 혼합물에서 65℃에서 48시간 동안 하이브리드화시킨다. 필터의 세척은 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll, 및 0.01% BSA를 함유하는 용액에서 1시간 동안 37℃에서 이루어진다. 이어서 방사선사진술에 앞서 45분동안 50℃에서 0.1X SSC에서의 세척이 이루어진다. 이용될 수 있는 높은 엄격도의 다른 조건은 공지되어 있다.
용어 실질적으로 동일한 또는 실질적으로 상동성이거나 유사한은 관련 분야의 당업자가 이해하는 것처럼 내용에 따라 다르며 적어도 60% 또는 70%를 의미하며, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생성물에 실질적으로 동일하다라는 것은 대상 특성이 충분히 불변하여 실질적으로 동일한 생성물이 그 생성물 대신 이용될 수 있을 정도로 충분히 유사함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 순수하다란 것은 그러한 순도를 평가하기 위해 당업자가 이용하는, 박층 크로마토그래피(TLC), 젤 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 표준 분석 방법에 의해 결정할 때 쉽게 검출가능한 불순물이 나타나지 않도록 충분히 균일하거나, 또는 추가 정제가 그 물질의 효소 및 생물 활성과 같은 물리적 및 화학적 특성을 검출가능하게 변화시키지 않을 정도로 충분히 순수함을 의미한다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 생산하기 위해 화합물을 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하지만, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체 또는 이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 예에서, 추가 정제는 화합물의 비활성을 증가시킬 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적 세포는 (본원에 개시된 바와 같은 sHASEGP 생성에서) sHASEGP를 발현하는 세포, 또는 sHASEGP 또는 (본원에 개시된 바와 같이 약제 및 기타 제제의 표적 세포로의 전달을 촉진하기 위해 sHASEGP를 사용하는데 있어서) 생체 내에서 동시제형화 또는 동시투여된 제제가 표적으로 하는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 시험 물질(또는 시험 화합물)은, 본원에서 제공된 분석과 같은, 시험관내 방법에 의해 결정할 때, sHASEGP, 특히 히알루로니다제 도메인 또는 활성에 충분한 그 일부를 포함하는 단일쇄 형태에 영향을 미치는, 화학적으로 정의된 화합물(예, 유기 분자, 무기 분자, 유기/무기 분자, 단백질, 펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 지질, 다당류, 당류 또는 당단백질과 같은 이들 분자간의 하이브리드 등) 또는 화합물의 혼합물(예, 시험 화합물, 천연 추출물 또는 배양 상등액의 라이브러리 등)을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 치료제, 치료 요법, 방사성보호 또는 화학치료제는 당업자에게 공지된, 백신을 비롯한, 종래 약물 및 약물 요법을 말한다. 방사성치료제는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 병태, 장애 또는 질병의 증상이 완화되거나 또는 다르게는 유익하게 바뀔 수 있는 임의의 방식을 의미한다.
치료는 또한 본 조성물의 임의의 약학적 용도를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종성 핵산을 그 발현 또는 복제를 위해 세포내로 도입하기 위해 이용되는 별도의 요소를 말한다. 벡터는 일반적으로 에피좀으로 남아 있으나, 유전자 또는 그 일부의 게놈의 염색체내로의 통합을 일으키도록 고안될 수 있다. 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체와 같은 인공 염색체인 벡터도 고려된다. 그러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 발현 벡터는 그러한 DNA 단편의 발현을 일으킬 수 있는, 프로모터 영역과 같은 조절 서열과 작동적으로 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 따라서, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포내로 도입시 클로닝된 DNA의 발현을 야기하는 플라스미드, 파아지, 재조합 바이러스 또는 다른 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구조체를 말한다. 적절한 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피좀으로 있는 것들 또는 숙주 세포 게놈내로 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 결합 서열은 다른 단백질 또는 펩티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드 서열, 단백질 또는 펩티드 서열의 세트 또는 특정 단백질 또는 펩티드 서열을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 에피토프 태그는 에피토프 태그가 붙은 단백질 또는 펩티드의 생화학적 및 면역학적 분석을 촉진하기 위한 에피토프에 해당하는 아미노산 잔기의 짧은 스트레치를 말한다. 에피토프 태킹은 적절한 발현 벡터에서 단백질 코딩 서열에 에피토프 태그의 서열을 포함시켜 이루어진다. 에피토프 태그가 붙은 단백질은 태그에 대해 생성된 매우 특이적인 항체를 이용하여 친화성 정제될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 금속 결합 서열은 금속 이온, 금속 이온의 세트 또는 특정 금속 이온에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드 서열을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합은 둘 또는 그 이상의 임의의 연합을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 말한다. 그것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 임의의 그 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 유체는 유동할 수 있는 임의의 조성물을 말한다. 유체는 따라서 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 젤, 로션, 크림 및 다른 그러한 조성물의 형태인 조성물을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물은 용혈되거나 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 제제가 단백질만의 또는 그 관련 기질, 결합 파트너 등과의 연합에 관련된 특이적 서열에 대한 고려없이 임의로 선택될 때 제제는 임의로 선택된다고 말한다. 임의 선택된 제제의 예는 화학적 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리 또는 유기체의 성장 배양액 또는 조절된 배지의 사용이다.
본원에 사용된 바와 같이, 제제가 표적 부위의 서열 및/또는 제제의 작용과 관련된 그 형태를 고려하는 비-임의 기초로 선택되면 제제는 이성적으로 선택되거나 고안되는 것으로 말한다. 실시예에 개시된 대로, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4를 갖는 당단백질에는 히알루로니다제를 위한 제안된 결합 부위 및 (촉매) 부위가 있다. 제제는 이들 부위를 구성하는 펩티드 서열을 이용함으로써 이성적으로 선택되거나 이성적으로 고안될 수 있다. 예를 들어, 이성적으로 선택된 펩티드 제제는 그 아미노산 서열이 ATP 또는 칼모듈린 결합 부위 또는 도메인과 동일한 펩티드일 수 있다.
올리고당류는 환원성 말단의 당이 실제 환원당이건 아니건 간에, 환원성 말단과 비환원성 말단을 갖는 것으로 생각된다. 허용된 명명법에 따라, 올리고당은 왼쪽의 비환원성 말단 및 오른쪽의 환원성 말단으로 묘사된다. 본원에서 개시된 모든 올리고당은 비환원당의 명칭 또는 약자(예, Gal), 이어서 글리코시드 결합의 형태(.알파 또는 .베타), 고리 결합, 그 결합에 관련된 환원성 당의 고리 위치, 및 이어서 환원성 당의 명칭 또는 약자(예, GlcNAc)로 표시된다. 두 당 사이의 연결은 예를 들어 2,3,2.fw darw.3, 또는 (2,3)으로 표현될 수 있다. 각 당은 피라노스이다.
본원에 사용된 바와 같이, N-결합된 당 부분은 Asn 잔기의 아미드 질소를 통하여 sHASEGP에 부착된 올리고당을 말한다. N-결합된 올리고당은 몇 가지 주요 타입으로 나뉘며(올리고만노스, 복합체, 하이브리드, 황화), 이들 모두는 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열(본원에서 Xaa는 Pro가 아님)내에 속하는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통하여 부착된 (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. N-결합된 부위는 종종 서열 결정동안 "블랭크" 사이클의 출현에 의해 간접적으로 지정된다. 글리코실화된 Asn을 Asp로 전환시키는 PNG아제 F에 의해 올리고당을 방출시킨 후 양성 확인이 이루어질 수 있다. PNG아제 F 방출 후, N-결합된 올리고당은 Bio-Gel P-6 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 올리고당 풀은 제조성 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)에 노출된다 (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem.182, 1-8). 일부 올리고당 이성질체는 HPAEC를 이용하여 분리될 수 있다. 푸코스 잔기는 HPAEC 크로마토그램에서 용출 위치를 더 앞으로 이동시킬 것이며, 한편 추가의 시알산 잔기는 체류 시간을 증가시킬 것이다. 올리고당 구조가 공지된 당단백질 (예, 소 페투인, a-l 산 당단백질, 난백알부민, RNAse B, 트랜스페린)을 동시에 처리하면, 올리고당 피크의 지정을 촉진할 수 있다. 수집된 올리고당은 조성 분석 및 메틸화 결합 분석의 조합에 의해 특징을 규명하며 (Waegheet al., (1983) Carbohydr Res. 123,281-304.), 이때 아노머 형태는 NMR 분광광도법에 의해 지정된다 (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
다르게는, 올리고당은 형광 보조 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 확인할 수 있다 (Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시알산"은 9-탄소 카르복실화 당의 패밀리의 임의의 구성원을 말한다. 시알산 패밀리의 가장 흔한 구성원은 N-아세틸뉴라민산(2-케토-5-아세트아민도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노누로피라노스-1-온산) (종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 약칭됨)이다. 이 패밀리의 두번째 구성원은 N-글리콜일-뉴라미닌산(Neu5Gc 또는 NeuGc)이며 본원에서 NeuAc의 N-아세틸기는 하이드록시화된다. 세번째 시알산 패밀리 구성원은 2-케토-3-데옥시-노누로손산(KDN)이다 (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:21811-21819). 또한 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac와 같이 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac와 같은 9-치환된 시알산 또한 포함된다. 시알산 패밀리의 리뷰를 위해서는 예를 들어, Varki (1992) Glycobiology 2:25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, N. Y. (1992))를 참고한다. 시알화 과정에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일에 공개된 국제 출원 WO92/16640호에 개시된다.
본원에 사용된 바와 같이, PNG아제는 플라보박테리움 마닌고셉툼 (Flavobacterium maningoseptum) 펩티드-N-글리코시다제 F와 같은 아스파라긴 펩티드 특이적 N-글리코시다제 F를 말한다. PNG아제 효소는 O-결합된 올리고당이 아닌 N-결합된 올리고당에 대한 그들의 특이성을 특징으로 한다. PNG아제 효능의 특성규명은 SDS PAGE 전기영동, 또는 형광 보조된 탄수화물 전기영동 둘다에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 말단화된 시알화는 말단 당으로서 시알산 잔기로 끝나는 N-결합된 올리고당을 말한다. 말단 시알산은 뉴라미니다제로 처리한 후 유리된 탄수화물의 FACE 분석에 의해 확인될 수 있다.
혈액중의 당단백질의 순환 수명은 N-결합된 탄수화물 기의 조성 및 구조에 크게 의존한다. 이 사실은 비경구로 투여될 치료적 당단백질과 직접 관련이 있다. 일반적으로, 당단백질의 최대 순환 반감기는 그것의 N-결합된 탄수화물기가 서열 NeuAc-Gal-GlcNAc로 끝날 것을 요한다. 말단 시알산(NeuAc)이 없으면, 당단백질은 하부의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 또는 갈락토스(Gal) 잔기의 인식에 관련되는 기전에 의해 혈액으로부터 신속하게 제거된다 (Goochee et al. (1991) Biol/Technology 9: 1347-1355). 이러한 이유로, 치료적 당단백질의 N-결합된 탄수화물기상의 말단 시알산의 존재를 확실히 하는 것은 그들의 상업적 개발을 위해 중요한 고려사항이다.
순환 당단백질은 말단 시알산 잔기를 제거할 수 있는 시알리다제(들) (또는 뉴라미니다제)에 노출된다. 일반적으로 시알산의 제거는 갈락토스 잔기를 노출시키며, 이들 잔기는 간세포의 갈락토스-특이적 수용체에 의해 인식되어 결합된다 (Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51 :531에 리뷰됨). 간은 또한 순환계로부터 당단백질의 제거를 매개하는 다른 당-특이적 수용체를 함유한다. 그러한 수용체의 특이성은 또한 N-아세틸글루코스아민, 만노스, 푸코스 및 포스포만노스를 포함한다. 간세포의 갈락토스 수용체에 의해 제거된 당단백질은 실질적인 분해를 일으키고 이어서 담즙으로 들어가며; 쿠퍼 세포의 만노스 수용체에 의해 제거된 당단백질은 소포체 시스템으로 들어간다 (Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem.에 리뷰됨).
본원에 사용된 바와 같이, 중성 활성은 150 mM 미만의 염 및 50 mM 미만의 완충 강도의 조건하에서 5 내지 8 사이의 pH에서 시험관내에서 글리코스아미노글리칸 기질에 대해 촉매 활성을 갖는 sHASEGP 당단백질을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 안정화된 용액은 실온에서 30일간 저장 후 그 초기 활성의 60% 이상을 보유하는 sHASEGP를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 특정되지 않으면, 단위는 탁도 감소 유닛 (TRU)로 표현된다. 1 TRU는 히알루론산의 산성화 용액의 탁도를 감소시키는 데 필요한 히알루로니다제 활성의 양으로 정의되며 U.S.P./내셔널 포물러리(NF XIII) 유닛(NFU)에 등가이다. 본원에서 개시된 ELISA-형 효소 분석은 U.S.P.를 통해 표준화된 히알루로니다제 샘플의 표준 곡선 (예, USP 또는 WHO 표준)을 통해 TRU, NFU 및 U.S.P. 유닛에 관련될 수 있다. 따라서, ELISA-형 효소 분석에 의해 결정된 효소 활성은 실제로 상대적인 TRU이며, 이는 효소 활성이 탁도계 분석을 이용하여 실제로 측정되지 않기 때문이다 (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172: 367).
본원에 사용된 바와 같이, 효능은 탁도 감소 유닛 또는 상대적 탁도 감소 유닛에 기초하여 시험관내에서 기질을 분해시키는데 필요한 sHASEGP 단백질의 양에 의해 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 비 활성은 단백질 mg 당 활성의 유닛을 말한다. sHASEGP 단백질의 양은 M-1cm-1의 단위로, 약 1.7의 몰 소광 계수를 가정할 때 280 nm에서 sHASEGP 용액의 흡수에 의해 정의된다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 생물물질, 생물공학 및 의약에서 주로 널리 이용되어 왔으며 이는 PEG가 생물융화성이고, 비독성이며, 비면역원성이고 수용성인 중합체이기 때문이다 (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997). 약물 전달 분야에서는, PEG 유도체는 면역원성, 단백질분해 및 신장에서의 소거를 감소시키고 용해도를 증가시키기 위하여 단백질에 공유 결합되어 (즉, "PEG화") 널리 사용되어 왔다 (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16: 157-82, 1995). 유사하게, PEG는 저분자량의, 상대적으로 소수성인 약물에 부착되어 용해성을 증가시키고, 독성을 감소시키고 생체분포를 변화시켰다. 일반적으로, PEG화된 약물은 용액으로 주사된다.
밀접하게 관련된 분야는, 분해성의 가용성 약물 담체의 고안에서 사용되는 동일한 화학의 다수가 또한 분해성 젤의 고안에서 이용될 수 있으므로, 약물 전달에 사용하기 위한 가교된 분해성 PEG 네트워크 또는 제제의 합성 분야이다 (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). 거대 분자간 복합체는 두 상보성 중합체의 용액을 혼합함으로써 형성될 수 있음이 또한 알려져 있다. 그러한 복합체는 일반적으로 관련된 중합체간의 정전기적 상호작용 (다가음이온-다가양이온) 및/또는 수소 결합 (다가산-다가염기)에 의해, 및/또는 수성 주변에서 중합체간의 소수성 상호작용에 의해 안정화된다 (Krupers et al., Eur. Polym J. 32: 785-790, 1996). 예를 들어, 적절한 조건하에서 폴리아크릴산(PAAc) 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)의 혼합 용액은 주로 수소 결합에 기초한 복합체의 형성을 야기한다. 생리학적 조건하에서 이들 복합체의 분해는 유리 약물(즉, 비-PEG화됨)의 전달을 위해 이용되었다. 또한, 상보성 중합체의 복합체는 단독중합체 및 공중합체 둘다로부터 형성되었다.
한 태양에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 3 kD 내지 약 50 kD 범위, 그리고 바람직하게는 약 5 kD 내지 약 30 kD 범위의 분자량을 갖는다. 약물에의 PEG의 공유 결합 ("PEG화"로 알려짐)은 공지의 화학 합성 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 태양에서, 단백질의 PEG화는 NHS-활성화된 PEG를 적절한 반응 조건하에서 단백질과 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.
많은 반응이 PEG화를 위해 개시되었지만, 가장 일반적으로 적용가능한 것들은 방향성을 부여하고, 중간 반응 조건을 이용하며, 독성 촉매 또는 부산물을 제거하기 위해 광범위한 후속 가공을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 모노메톡시PEG(mPEG)는 단지 하나의 반응성 말단 하이드록실을 가지며, 따라서 그 사용은 생성된 PEG-단백질 생성물 혼합물의 이질성의 일부를 제한한다. 말단 메톡시기의 반대편의 중합체 말단에서 하이드록실기의 활성화는, 대개 친핵체 공격에 보다 민감한 유도체화 PEG를 만드는 것을 목표로 할 때, 효과적인 단백질 PEG화를 이루는 데 필요하다. 공격 친핵체는 대개 라이실 잔기의 입실론-아미노기이지만, 다른 아민은 또한 만일 국소적 조건이 우호적이면 반응할 수 있다 (예, 히스티딘의 N-말단 알파-아민 또는 고리 아민). 보다 직접적인 부착은 단일 라이신 또는 시스테인을 함유한 단백질에서 가능하다. 후자는 티올-특이적 변형을 위해 PEG-말레이미드에 의해 표적화될 수 있다. 다르게는, PEG 히드라지드는 페리오데이트 산화된 sHASEGP와 반응하고 NaCNBH3의 존재하에서 환원될 수 있다. 보다 구체적으로는, PEG화된 CMP 당은 적절한 글리코실-트랜스퍼라제의 존재하에서 sHASEGP와 반응할 수 있다. 한 기법은 많은 중합성 분자가 해당 폴리펩티드에 연결되는 "PEG화" 기법이다. 이 기법을 이용할 경우, 면역계는 항체의 형성에 관여하는 폴리펩티드의 표면상의 에피토프를 인식하는데 어려움을 가지며, 따라서 면역 반응을 감소시킨다. 특정 생리학적 효과를 주기 위해 인간 신체의 순환계내로 직접 도입된 폴리펩티드(즉, 의약품)의 경우, 일반적인 잠재적인 면역 반응은 IgG 및/또는 IgM 반응이며, 호흡기를 통하여 흡입되는 폴리펩티드 (즉, 산업적 폴리펩티드)는 잠재적으로 IgE 반응 (즉, 알러지 반응)을 일으킬 수 있다. 감소된 면역 반응을 설명하는 이론중 하나는 중합체 분자(들)가 항체 형성을 야기하는 면역 반응에 관여하는 폴리펩티드의 표면상의 에피토프를 숨긴다는 것이다. 다른 이론 또는 적어도 부분적인 인자는 접합체가 무거울 수록 면역 반응이 더 감소된다는 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 바람직한 조합인 인간 sHASEGP가 인체에 사용되는 경우, 예를 들어 (즉, 실제로 실현하기에 불가능할 정도로 어렵지만 동물에서 유도된 효소를 다른 동물에서 유래한 단백질로부터 완전히 정제해낸다고 하더라도) 소 또는 양 히알루로니다제와 같이 인간 이외의 동물에서 유도된 효소와 비교하여 sSHASEGP가 면역 반응을 유도하는 경향을 유의적으로 감소시킬 수 있다. 따라서 인간 sHASEGP는 동물에서 유도된 산물에 비하여 실질적이고 매우 중요한 개선을 나타내지만, 이것을 여러 용도로 사용하기 위해서 PEG화와 같은 번역후 변형(PTM)으로 추가 개선시켜 분해 또는 제거에 대한 저항성을 향상시키고 및/또는 이들을 특정 용도에 더욱 유리하게 하는 다른 성질을 개선할 수 있다.
예를 들어, 인간에게 바람직한 조성물(예, 인간 sHASEGP)은 동물 유래 히알루로니다제 또는 인간 이외의 sHASEGP에 비해 면역원성이 감소되지만, 인간 sHASEGP의 PEG화는 혈류 및/또는 체내 다른 조직에서 반감기를 연장하는 데 사용할 수 있다. 특정 작용 기전으로 한정하지 않으면서, sHASEGP에 PEG 부분를 결합시켜 분자를 효과적으로 차폐하여, 프로테아제에 대한 상대적 감수성을 감소시키고 체외로의 청소 및 제거 범위 및 속도를 잠재적으로 감소시키는 것으로 일반적으로 생각된다.
폴리펩티드에 결합된 중합성 분자는 폴리올 (즉, 폴리-OH), 폴리아민 (즉, 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산 (즉, 폴리-COOH)와 같은 천연 및 합성 단독중합체, 및 추가로 이종중합체, 즉 예를 들어 하이드록실기 및 아민기와 같은 상이한 결합기 하나 이상을 포함하는 중합체를 비롯한, 본 발명에 따라 정의된 분자량을 갖는 임의의 적합한 중합성 분자일 수 있다.
적합한 중합성 분자의 예는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예컨대 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 비롯한 폴리알킬렌 글리콜(PAG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을 비롯한 덱스트란, 헤파린, 상동성 알부민, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸렐룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스 카르복시에틸셀룰로스 및 하이드록시프로필셀룰로스를 비롯한 셀룰로스, 키토산의 가수분해물, 하이드록시에틸-전분 및 하이드록시프로필-전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아 고무, 풀루란, 이눌린, 잔탄 고무, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물 및 생물중합체로 구성된 군에서 선택되는 중합성 분자를 포함한다.
바람직한 중합성 분자는 효소의 표면상의 부착기에 공유 결합하기 위해 상대적으로 간단한 화학물질을 추가로 요하는 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)과 같은 비독성 중합성 분자이다.
PEG 및 특히 mPEG와 같은 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 일반적으로 보여지는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)는, 이들 중합성 분자가 덱스트란, 풀루란 등과 같은 다당류에 비하여, 바람직하지 못한 가교가능한 반응성 기를 적게 가지므로 바람직한 중합성 분자이다.
PEG화 및 기타 유형의 번역후 변형(PTM) 개선은 광범위하며, 현재 다수의 PTM 기법과 시약이 당업계에 공지되어 있으며, 새로운 것들이 정기적으로 개발되고 있다. PEG화 기법 및 시약은 예를 들어, (i) 특수 링커 및 커플링 화학물질(예컨대, Harris, J.M.의 문헌[Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476 (2002)]에서 검토한 시약 및 기법과 상기 문헌에서 검토된 주요 참조 문헌] 참고); (ii) 추가의 PEG 기를 단일 접합 부위에 효과적으로 결합시키는 분지형 PEG(예컨대, Veronese, F.M. 등의 문헌[Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180 (2002)] 참조); (iii) 부위 특이적 모노PEG화를 비롯한 부위 특이적 PEG화(예컨대, Chapman, A.P. 등의 문헌[Nature Biotech. 17:780-783 (1999)] 참조; 및 (iv) 부위 지정 효소적 PEG화(예컨대 Sato, H.의 문헌[Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 487-504 (2002)]에 개시된 바와 같은 트랜스글루타미나제 반응 이용)를 포함한다. 그 수가 증가하고 있는 시판업자들로부터 입수가능한 추가의 기법과 시약이 또한 존재한다(예컨대, Nektar/Shearwater(www.nektar.com), Sunbio(www.sunbio.com 및 www.sunbio.com/peg-shop), Celares GmbH (www.celares.com) 등 참조).
B. 조직 발현 프로파일 sHASEGP.
인간 sHASEGP는 이전에는 고환 특이적으로 생각되었지만, RT-PCR과 같은 보다 민감한 기법을 이용할 경우 인간의 다수의 조직에서 발현된다. sHASEGP 전사물은 골수(뇌), 미세혈관 내피, 전립선, 유방, 망막, 수집된 인간 멜라닌 세포, 태아 심장, 및 임신 자궁에서 발견된다. sHASEGP는 또한 생식세포 종양에서 발현된다. sHASEGP 전사물의 RT-PCR 계 검출은 일반적으로 고환외의 조직에서의 농도를 검출하는 데 필요하다.
C. sHASEGP 효소 활성을 위한 분석
히알루로니다제 활성을 위한 탁도계 미세적정 분석
히알루로니다제 활성은 산성화된 혈청 용액에서 변형된 탁도계 분석에 의해 검출될 수 있다. 필요한 시약은 다음과 같다:
관주를 위한 UV-살균된 2X-탈이온수 또는 멸균수 브라운 R5000-01
히루메드 의약 - 소듐 히알루로네이트, 고분자량 HA 젠자임 어드밴스드
바이오머티리얼즈		 4876
히알루로니다제 참고 표준 USP 31200
아세트산칼륨, 입자형, USP, ACS JTBaker 2914-01
빙초산, 99+% 시그마 A-6283
인산나트륨 일염기 일수화물, USP 입자형 말린크로트 7774
인산나트륨 이염기 무수물, USP 말린크로트 7771
염화나트륨, 결정, GR, ACS EMScience SX0420-5
젤라틴 가수분해물 효소적 시그마 G-0262
말 혈청, 공여제 집단, 시험된 세포 배양물, 시험된 하이브리도마 배양물, USA 기원 시그마 H-1270
인간 혈청 알부민 20% 그리폴스
염산, ACS 시약 시그마 H-7020
염화칼슘, 이수화물, 입자, USP, -FCC JTBaker 1336-01
하기 시약을 준비한다: 아세테이트 완충 용액 - 물 중의 14.0 g의 아세트산칼륨 및 25.0 mL의 빙초산을 1000 mL로 만든다. 포스페이트 완충 용액 - 물 중의 2.5 g의 인산나트륨 일염기, 1.0 g의 무수 인산나트륨 이염기, 및 8.2 g의 염화나트륨을 1000 mL로 만든다. 효소 희석 저장 용액 - 500 mL의 물과 500 mL의 포스페이트 완충 용액. 효소 희석 작업 용액 - 효소 희석 저장 용액 50 mL중의 33 mg의 가수분해된 젤라틴 - 사용 2시간내에 제조함. 샘플 안정화 완충 용액("SSB" 용액) - 50 mL의 효소 희석 작업 용액중의 125 ㎕의 20% 인간 혈청 알부민 용액 및 50 ㎕의 1 M 염화칼슘 용액, 완전히 혼합한다. 혈청 저장 용액 - 말 혈청 1 부피를 9 부피의 아세테이트 완충 용액으로 희석한다. 4 N 염산으로 pH를 3.1로 조절하고 실온에서 18 내지 24시간 동안 용액을 정치시킨다. 용액을 4℃에서 저장하고, 30일이내에 사용한다. 혈청 작업 용액 - 30 mL의 아세테이트 완충 용액중의 10 mL의 혈청 저장 용액, 실온으로 조절한다. 히알루론산 저장 용액 - 물중의 5.0 mg/mL 농도의 소듐 히알루론산. 히알루론산 작업 용액 - 4.25 mL의 포스페이트 완충 용액중의 0.75 mL의 히알루론산 저장 용액. 표준 저장 용액 - 물 중의 1000 유닛/mL 농도의 USP 참고 표준 히알루로니다제의 용기, 50 ㎕ 분취액으로 분취하고, -20℃에서 저장함. 표준 작업 용액 - 960 ㎕의 차가운 효소 희석 작업 용액중의 40 ㎕의 표준 저장 용액으로 40 유닛/mL 농도를 갖는 용액을 얻으며, 분석에 사용하기 직전에 제조된다.
모든 효소 샘플은 하기의 안내에 따라 "저 단백질 결합" 96-웰 플레이트에서 희석된다:
a) 이 분석의 최대 민감도 범위는 10-30 유닛/mL 사이이다. 범위내의 결과를 얻기 위해 분석이 반복되는 횟수를 최소화하기 위하여, 먼저 샘플에 대한 전체 유닛/mL의 대략적인 수를 결정하고, 이어서 최종 농도가 약 20 유닛/mL이도록 (전체 수) 희석을 선택한다.
b) 분석을 실시하는 데 필요한 최소 샘플 부피는 다음과 같다: FPLC 분획 = 50 ㎕, 조직 배양 상등액 = 1mL, 정제/농축/최종 단계 재료 = 10 ㎕.
c) 연속 희석된 샘플의 경우, "SSB" 용액 360 ㎕ 및 샘플 40 ㎕를 각 웰에 피펫팅함으로써 "저 단백질 결합" 96-웰 플레이트에서의 1:10 희석을 3중으로 만든다.
USP 표준물의 제조를 위하여, "저 단백질 결합" 96-웰 플레이트에서의 USP 표준 곡선을 다음과 같이 준비한다:
USP 표준 곡선:

효소 희석 용액
(㎕):		 표준 작업 용액
(㎕):		 최종 농도
(Units/mL):
웰: 표준물:
A1-A3 St01 0 100 40
B1-B3 St02 20 80 32
C1-C3 St03 40 60 24
D1-D3 St04 60 40 16
E1-E3 St05 80 20 8
F1-F3 St06 90 10 4
G1-G3 St07 100 0 0
컬럼 1-3의 히알루론산 대조군의 제조를 위해, "평면 바닥" 96-웰 플레이트에서 H.A. 대조군을 다음과 같이 제조한다:
H.A. 대조군
웰 대조군 히알루론산 작업 용액
(㎕)		 효소 희석 작업 용액
(㎕)
H1-H3 Co01 0 60
반응 플레이트: 웰 당 30 ㎕의 히알루론산 작업 용액을 50 ㎕ 8-채널 전달 피펫을 이용하여 "평면 바닥" 96-웰 미세적정 플레이트내로 피펫팅하고 웰 H1-H3을 비워둔다. 60 ㎕/웰의 효소 희석 작업 용액을 HA 대조군으로서 동일 플레이트의 웰 H1-H3내로 피펫팅한다.
혈청 작업 용액: 40 mL의 혈청 작업 용액을 전달 용기 내로 분배하고 가열 블록으로 보낸다.
예비가온 단계: 일단 두 플레이트가 준비되면, 희석 샘플, 표준물, 대조군을 함유한 저 단백질 결합 96-웰 플레이트 및 히알루론산 작업 용액을 함유한 평면 바닥 96-웰 플레이트를 가열 블록에 놓고 37℃에서 5분동안 가온시킨다.
반응은 효소를 기질에 첨가하여 시작된다: 5-50 ㎕ 8-채널 피펫을 이용하여 96-웰 평면 바닥 플레이트(기질 함유)의 컬럼 #1의 모든 웰내로 효소 플레이트로부터의 30 ㎕를 첨가한다. 효소/기질 반응 혼합물을, 완전한 샘플 혼합을 보장하기 위하여 처음 15초동안 이동시키면서 위 아래로 용액을 당기면서 5회 흡인한다. 효소와 기질을 혼합한 후, 팁을 버리고 다음 컬럼을 위해서는 이동 피펫기에 새로운 팁 세트를 이용한다. 타이머를 다시시작하고, 시간 (t)=0:30에서, 이 과정을 컬럼 2를 위해 반복한다. 다음 30초 간격 (t)=1:00에서, 컬럼 3을 위해 이 과정을 반복한다. 이 과정은 모든 웰이 효소와 기질을 함유할 때까지 매 30초마다 플레이트를 왼쪽에서 오른쪽으로 가로질러 이동시키면서 반복한다.
반응의 정지: 타이머가 6분 (t) = 6:00에 도달할 때, 240 ㎕의 혈청 작업 용액을 50-300 ㎕ 8-채널 이동 피펫을 이용하여, 이웃한 50 mL 시약 저장기로부터 96-웰 평면 바닥 플레이트의 컬럼 1내로, 각 웰로 피펫팅한다. 완전한 혼합을 위해 처음 10초동안 (이동 피펫터를 이용하여 용액을 상하로 당기면서) 혼합물을 3회 흡인한다. 상기 과정을 컬럼 1 에서 12까지 진행하면서 매 30초마다 반복한다. 마지막 컬럼(컬럼 12)이 완결되면, 반응 플레이트를 가열 블록으로부터 제거하고 플레이트를 640 nM의 플레이트 판독기의 판독 트레이에 놓는다. 선형 곡선 대입이 시험 샘플의 외삽을 허용하는 표준 곡선으로부터 생성된다.
히알루로니다제를 위한 대안적 분석
비오틴화된 히알루로난 미세적정 분석
히알루로난의 글루쿠론산 잔기상의 유리 카르복실기는 비오틴-히드라지드(피어스), 설포 NHS(피어스) 및 1-에틸 디메틸아미노프로필-카보디이미드(시그마)를 이용하여 1 단계 반응으로 비오틴화된다. 이 비오틴화된 HA 기질은 두번째 반응에서 96웰 미세적정 플레이트에 공유 결합된다. 효소 반응이 완결되면, 잔여 기질을 표준 ELISA 플레이트 판독기로 판독할 수 있는 아비딘-퍼옥시다제 반응으로 검출한다. 기질이 미세적정 플레이트에 공유 결합되므로, 비오틴화된 기질의 pH-의존성 치환과 같은 인위적 일은 일어나지 않는다. 만감성은 10% 미만의 분석간 편차로 배양 세포 및 생물 샘플로부터 히알루로니다제 활성의 신속한 측정을 허용한다.
히알루로니다제의 비 활성은 탁도 감소 유닛(TRU)으로 표현된다. 1 TRU는 히알루론산의 산성화 용액의 탁도를 감소시키기 위해 필요한 히알루로니다제 활성의 양으로 정의되며 U.S.P/내셔널 포물라리(NF XIII) 유닛(NFU)에 해당한다. 정제를 위해 이용되는 ELISA-형 효소 분석은 U.S.P.를 통해 표준화된 히알루로니다제 샘플의 표준 곡선(예, USP)을 통해 TRU, NFU 및 U.S.P. 유닛에 관련될 수 있다. 따라서, ELISA-형 효소 분석에 의해 결정된 효소 활성은 실제로 상대적인 TRU이며, 이는 효소 활성이 탁도계 분석을 이용하여 실제로 측정되지 않기 때문이다 (Dorfman et al., 1948, J. Biol. Chem. 172:367).
많은 히알루로니다제 분석은 새로운 환원성 N-아세틸아미노기의 생성( (Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13: 746-752,1966), 또는 점도의 손실(De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys. 121: 548-554,1967) 또는 탁도(Dorfman and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948)의 측정에 기초하였다. 정제된 기질을 이용하면, 모든 이들 방법은 엔도글루코스아미드 활성의 존재 또는 부재의 결정에 충분하다.
실질적으로 정제된 글리코스아미노글리칸 기질은 또한 젤 이동 분석에 사용될 수 있다. 글리코스아미노글리칸은 젤 내에서 기질 이동성의 변화를 야기하는, 엔도글루코시다제 활성을 시험하기 위해 재조합 sHASEGP와 혼합된다. 콘드로이친-4 및 6 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파란-설페이트는 시그마 케미컬로부터 얻을 수 있다. 인간 탯줄 히알루로난은 ICN으로부터 얻을 수 있다. 각 시험 기질은 pH 3.5-7.5의 완충 범위에서 0.1 mg/ml로 희석된다. 정제된 sHASEGP 또는 sHASEGP 발현 세포로부터의 조절된 배지의 10 ㎕ 샘플을 원하는 완충액중의 시험 기질 90 ㎕와 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 항온처리 후, 샘플을 샘플 완충액(트리스 EDTA pH 8.0, 브로모페놀 블루 및 글리세롤)으로 중화시키고 이어서 전기영동시킨다. 글리코스아미노글리칸은 3% 빙초산중의 0.5% 알시안 블루에서 젤을 밤새 염색하고 이어서 7% 빙초산으로 탈염색시켜 검출한다. 분해는 효소의 존재 및 부재하에서 기질 이동성을 비교하여 결정된다.
히알루로니다제 활성은 또한 기질 젤 지모그래피에 의해 검출될 수 있다 (Guentenhoner et al., 1992, Matrix 388-396). 이 분석에서, 샘플은 히알루론산을 함유한 SDS-PAGE 젤에 가해지고 샘플내의 단백질은 전기영동에 의해 분리된다. 이어서 젤을 효소 분석 완충액에서 항온처리하고 이어서 염색하여 젤내의 히알루론산을 검출한다. 히알루로니다제 활성은 기질 젤에서 투명한 구역으로 가시화된다.
D. sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 확인 및 분리
sHASEGP 폴리펩티드 유전자 및/또는 그 도메인은 DNA 분리를 위한 당업계의 공지 방법에 의해 얻을 수 있다. 원하는 유전자를 코딩하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 당업계에서 이용가능한 임의 방법은 sHASEGP 폴리펩티드를 코딩하는 전체 길이(즉, 전체 코딩 영역을 포함) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 얻기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 게놈 또는 cDNA 라이브러리에서, 정상 조직에서 발현되는 서열, 예를 들어, sHASEGP 폴리펩티드(서열 번호 1 및 2)를 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위해 이용될 수 있다. 확인된 서열의 3' 및 5' 말단의 서열에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 프라이머로 이용하여 적절한 공급원(예, 고환, 전립선, 유방)으로부터의 핵산 샘플(RNA 또는 DNA, 일반적으로 cDNA 라이브러리)로부터 PCR에 의해 서열을 증폭시킬 수 있다.
PCR은 예를 들어, 퍼킨-엘머 세터스 열 사이클러 및 Taq 폴리머라제(진 앰프)를 사용하여 실시될 수 있다. 증폭될 DNA는 임의의 진핵 종으로부터의 mRNA 또는 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. PCR 반응에 사용하기 위해, 몇 가지 상이한 축퇴 프라이머를 합성하는 것을 선택할 수 있다.
공지의 뉴클레오티드 서열과 분리될 핵산 상동체간의 더 크거나 작은 뉴클레오티드 서열 유사성 정도를 허용함으로써 핵산 상동체를 증폭시키기 위해(예, 인간외의 종으로부터의 sHASEGP 폴리펩티드 서열을 얻기 위해 또는 sHASEGP 폴리펩티드에의 상동성을 갖는 인간 서열을 얻기 위해), PCR 반응을 프라임하는 데 이용되는 하이브리드화 조건의 엄격도를 다양하게 할 수 있다. 종간 하이브리드화의 경우, 낮은 엄격도 내지 중간 엄격도 조건을 이용한다. 동종 하이브리드화의 경우, 중간 엄격도 내지 높은 엄격도 조건을 이용한다. 상기 조건은 실험적으로 결정될 수 있다.
확인된 sHASEGP 폴리펩티드 서열의 일부 또는 전부를 코딩하는 핵산 또는 sHASEGP 폴리펩티드 상동체의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산의 성공적인 증폭 후, 그 분절은 분자적으로 클로닝되고 서열결정되고, 완전한 cDNA 또는 게놈 클론을 분리하기 위한 프로브로서 이용될 수 있다. 다시, 이것은 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열의 결정, 그 발현의 분석, 및 기능적 분석을 위한 그 단백질 생성물의 생산을 허용한다. 일단 뉴클레오티드 서열이 결정되면, sHASEGP 폴리펩티드 유전자 단백질 생성물을 코딩하는 개방 판독 프레임을, 개방 판독 프레임 결정을 위해 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 분석을 위한 공지의 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 결정할 수 있다. 일단 개방 판독 프레임이 정의되면, 개방 판독 프레임에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 결정하는 것은 일상적이다. 이러한 방식으로, 전체 sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 sHASEGP 폴리펩티드 단백질 및 유사체의 아미노산 서열을 확인할 수 있다.
임의의 진핵 세포는 sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산 공급원으로서 잠재적으로 작용할 수 있다. 핵산은 척추동물, 포유류, 인간, 돼지, 소, 고양이, 조류, 말, 개, 및 추가의 영장류 공급원, 곤충, 식물 및 다른 유기체로부터 분리될 수 있다. DNA는 클로닝된 DNA(예, DNA "라이브러리")로부터 당업계에 공지된 표준 과정에 의해, 화학 합성에 의해, cDNA 클로닝에 의해, 또는 원하는 세포로부터 정제된 게놈 DNA 또는 그 단편의 클로닝에 의해 얻어질 수 있다 (예, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. Ed., 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. 1,11 참고). 게놈 DNA에서 유래된 클론은 코딩 영역에 더하여 조절 및 인트론 DNA 영역을 함유할 수 있으며; cDNA에서 유래된 클론은 단지 엑손 서열만을 함유할 것이다. 임의의 공급원의 경우, 유전자는 그 증식에 적합한 벡터 내로 클로닝된다.
게놈 DNA로부터의 유전자의 분자 클로닝에서, DNA 단편이 생성되며, 그 일부는 원하는 유전자를 코딩할 것이다.
상기 DNA는 다양한 제한 효소를 사용하여 특정 부위에서 절단될 수 있다.
대안으로, DNA의 단편화를 위해 망간의 존재 하에서 DNAse를 이용하거나, 또는 DNA는 예를 들어, 초음파처리에 의해 물리적으로 전단될 수 있다. 이어서 선형 DNA 단편은 아가로즈 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하며 이에 한정되지 않는 표준 기법에 의해 크기에 따라 분리될 수 있다.
일단 DNA 단편이 생성되면, 원하는 유전자를 함유하는 특이적 DNA 단편의 확인은 많은 방식으로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 정제되고 표지될 (임의의 종의) sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 일부(예, 전술한 대로 얻어진 PCR 증폭 생성물 또는 공지의 뉴클레오티드 서열의 일부의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드) 또는 그 특이적 RNA, 또는 그 단편, 및 생성된 DNA 단편은 표지된 프로브에 대한 핵산 하이브리드화에 의해 스크리닝될 수 있다 (Benton 및 Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein 및 Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72: 3961 (1975)). 프로브에 실질적으로 상동성인 이들 DNA 단편은 하이브리드할 것이다. 제한 효소 분해 및, 만일 이용가능하다면 단편 크기를 공지의 제한 효소 지도에 따라 예상되는 단편 크기와 비교함으로써, 또는 DNA 서열 분석 및 sHASEGP 폴리펩티드의 공지 뉴클레오티드 서열과의 비교에 의해, 적절한 단편을 확인하는 것이 가능하다. 추가의 선별은 유전자의 특성을 기초로 실시될 수 있다. 대안으로, 유전자의 존재는 그 발현 생성물의 물리적, 화학적, 또는 면역학적 특성에 기초한 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 적절한 mRNA를 하이브리드-선별하는 cDNA 클론 또는 DNA 클론은 예를 들어, 유사하거나 동일한 전기영동 이동, 등전점 집중 거동, 단백질 분해 지도, 항원 특성, 히알루로니다제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 것을 선택할 수 있다. 항-sHASEGP 폴리펩티드 항체가 이용가능하다면, ELISA(효소-결합된 면역흡착 분석)-타입 과정에서, 추정되는 sHASEGP 폴리펩티드 합성 클론에 표지된 항체를 결합시켜 단백질을 확인할 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 게놈 DNA를 분리하기 위한 대안은 공지 서열로부터 유전자 서열을 화학적으로 합성하거나, 또는 sHASEGP 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA에 대한 cDNA를 만드는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 cDNA 클로닝을 위한 RNA는 단백질 발현 세포로부터 분리될 수 있다. 이어서 확인되고 분리된 핵산을 적절한 클로닝 벡터내로 삽입할 수 있다. 당업계에 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템을 이용할 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형 바이러스를 포함하며 이에 한정되지 않으나, 벡터 시스템은 이용되는 숙주 세포와 융화성이어야 한다. 그러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파아지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트 벡터(스트라타진, 캘리포니아주 라 졸라 소재)와 같은 플라스미드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 클로닝 벡터내로의 삽입은 예를 들어, DNA 단편을 상보적인 점착성(cohesive) 말단을 갖는 클로닝 벡터 내로 결찰시킴으로써 이루어질 수 있다.
DNA를 단편화시키기 위해 이용되는 상보성 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않으면, DNA 분자의 말단을 효소적으로 변형시킬 수 있다. 대안으로, 원하는 임의 부위는 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단 상에 결찰시킴으로써 생산될 수 있으며; 이들 결찰된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 코딩하는 특이적인 화학 합성 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 방법에서, 절단된 벡터 및 sHASEGP 폴리펩티드 유전자는 단독중합성 테일링에 의해 변형될 수 있다.
재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공, 칼슘 침전 및 다른 방법을 통해 숙주 세포내로 도입되어 유전자 서열의 많은 카피가 생성될 수 있다.
특정 구체예에서, 분리된 sHASEGP 폴리펩티드 유전자, cDNA, 또는 합성 DNA 서열을 통합하는 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키면 다수의 유전자 카피의 생성이 가능하다.
따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요하면 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 유전자를 다량으로 얻을 수 있다.
E. sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 히알루로니다제 도메인을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 플라스미드 및 세포, 및 sHASEGP 폴리펩티드 벡터의 발현 및 세포
sHASEGP 폴리펩티드 하나 이상의 재조합 발현의 경우, sHASEGP 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유한 벡터내로 삽입할 수 있다. 필요한 전사 및 번역 시그널은 또한 sHASEGP 유전자를 위한 천연 프로모터 및/또는 그들의 인접 영역에 의해 공급될 수 있다.
가용성의 중성 활성 sHASEGP 를 생산할 수 있는 발현 시스템내로 도입될 수 있는 sHASEGP 코딩 핵산을 함유하는 벡터 또한 제공된다.
상기 벡터를 함유한 세포 또한 제공된다. 세포는 진핵 및 원핵 세포를 포함하며, 그안에서 사용하기에 적합한 벡터를 포함한다.
벡터를 함유한, 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍 중국 햄스터 난소 세포(DG44)를 비롯한 진핵 세포가 제공된다. 적합한 세포는 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 세포는 (a) 코딩된 sHASEGP 폴리펩티드 또는 sHASEGP 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 전술한 세포를 성장시키고, 이어서 (b) 발현된 히알루로니다제 도메인 단백질을 회수함에 의해 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 히알루로니다제 도메인을 생산하기 위해 이용된다. 예시된 구체예에서는, 히알루로니다제 도메인이 배지내로 분비된다.
한 구체예에서, 벡터는 히알루로니다제 활성을 가지며 sHASEGP 단백질의 히알루로니다제 도메인 전부 또는 일부, 또는 그 카피 다수를 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 히알루로니다제 도메인 및 최대 전체 길이 sHASEGP 단백질까지, sHASEGP 단백질의 추가 부분 및 그 다수 카피를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 상기 벡터는 세포에서 sHASEGP 단백질 또는 그 히알루로니다제 도메인의 발현을 위해 선택되거나 또는 sHASEGP 단백질이 분비된 단백질로 발현되도록 선택될 수 있다. 대안으로, 벡터는 코딩된 단백질의 분비에 필요한 시그널을 포함할 수 있다. 히알루로니다제 도메인이 발현될 때 상기 핵산은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 접합 인자 시그널 서열 또는 그 일부와 같은 분비 시그널을 코딩하는 핵산 또는 천연 시그널 서열에 연결된다.
가용성의 중성 활성 sHASEGP 를 생성하기 위하여, N-결합된 글리코실화를 도입할 수 있는 세포가 필요하다. 바람직한 구체예에서, DG44와 같은 디하이드로폴레이트 리덕타제가 결핍된 포유류 중국 햄스터 난소 세포는 CMV와 같은 강한 포유류 프로모터, 내부 리보솜 진입 부위가 이어지는 sHASEGP 코딩 핵산, 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 플라스미드로 전기천공된다. 이어서 그러한 세포는 하이포잔틴 및 티미딘의 부재하에서 화학적으로 정해진 배지에서 배양되고 이어서 메토트렉세이트의 농도를 증가시키면서 추가의 유전자 증폭이 이루어진다.
다양한 숙주-벡터 시스템을 이용하여 단백질 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 이들은 바이러스(예, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유한 효모와 같은 미생물; 또는 박테리오파아지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함한다. 벡터의 발현 요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다양하다. 이용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 많은 적절한 전사 및 번역 요소중 임의의 하나를 이용할 수 있다. sHASEGP DNA의 박테리아 발현은 촉매적으로 활성인 sHASEGP 자체를 야기하지 않지만, 적절한 글리코실화 장치와 결합되면 그렇게 인공적으로 글리코실화될 수 있다.
벡터내로 핵산 단편을 삽입하기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 코딩 서열을 함유한 키메라 유전자를 함유한 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이들 방법은 생체외 재조합 DNA와 합성 기법 및 생체내 재조합체(유전적 재조합)를 포함할 수 있다. sHASEGP 폴리펩티드, 또는 그 도메인, 유도체, 단편 또는 상동체를 코딩하는 핵산 서열의 발현은 두번째 핵산 서열에 의해 조절될 수 있어, 유전자 또는 그 단편은 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현된다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구체예에서, 프로모터는 sHASEGP 폴리펩티드를 위한 유전자 고유의 프로모터가 아니다. 이용될 수 있는 프로모터는 하기를 포함하며 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(Bernoist 및 Chambon, Nature 290: 304-310(1981)), 라우스 사코마 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터(Yamamoto et al.,Cell 22 : 787-797 (1980)), 허피스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA78 : 1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature 296: 39-42(1982))(이에 한정되지 않음); B-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 1978)) 또는 TAC 프로모터(Deboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 21-25(1983))와 같은 원핵 발현 벡터; "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" : in Scientific American 242: 79-94(1980)) 참조; 오팔린 신세타제 프로모터(Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Garder et al., Nucleic Acids RES. 9: 2871 (1981)) 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 프로모터(Herrera- Estrella et al., Nature 310: 115-120(1984))를 함유하는 식물 발현 벡터; Gal4 프로모터와 같은 효모 및 다른 진균류 유래의 프로모터 요소, 알콜 디하이드로게나제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼린 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물(transgenic animal)에서 이용되어 온 하기의 동물 전사 조절 영역:췌장 선포 세포(acinar cell)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift Et Al., Cell 38: 639-646(1984); Ornitz Et Al., Cold Spring HarborSymp. Quant.Biol. 50: 399-409(1986); Macdonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan et AL., Nature 315 : 115 - 122(1985)), 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl et AL., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538(1985); Alexander et AL., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유선 종양 바이러스 조절 영역 (Leder et AL., CELL 45: 485-495(1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (PINCKERT et AL., Genes and Devel. 1: 268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-페토 단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf et AL., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer et AL., Science 235: 53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 안티트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey et al., Genes And Devel. 1: 161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Mogram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et AL., CELL 46: 89-94 (1986)), 뇌의 핍지교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead et al., Cell 48: 703-712 (1987)), 골격 근육에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Sani, Nature 314: 283-286 (1985)), 및 시상하부의 생식샘 자극 세포에서 활성인 생식샘자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason et al., Science 234: 1372-1378 (1986)).
특정 구체예에서, sHASEGP 폴리펩티드, 또는 그 도메인, 단편, 유도체 또는 상동체를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제 기원, 및 선택적으로 하나 이상의 선택성 마커(예, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 이용된다.
구체적인 개시 시그널은 또한 sHASEGP 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 이웃한 서열을 포함한다. sHASEGP, 그 개시 코돈 및 상부 서열이 적절한 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 추가의 번역 조절 시그널이 필요하지 않을 수도 있다. 하지만, 단지 코딩 서열 또는 그 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 전사 조절 시그널이 제공되어야 한다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 삽입체의 전사를 확실히 하기 위해 정확한 판독 프레임으로 존재해야 한다. 외인성 전사 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 사용되는 세포 시스템에 적합한 인핸서의 포함에 의해 증가될 수 있다 (Scharf D et al (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62; Bittner et al(1987) Methods in Enzymol 153: 516-544).
또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 방식으로 발현 단백질을 가공하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 폴리펩티드의 그러한 변형은 아세틸화, 카르복시화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 절단하는 번역후 가공은 또한 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. CHO (DG44, DXB 11 CHO- Kl), HeLa, MDCK, 293, WI38 등과 같은 상이한 숙주 세포는 그러한 번역후 활성을 위한 특이적인 세포 장치 및 특징적인 기작을 가지며, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다.
재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, sHASEGP를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택성 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포를 선택성 배지로 옮기기 전에 농축 배지에서 1-2일동안 성장시킬 수 있다. 선택성 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이며, 그 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 덩어리는 세포 타입에 적합한 조직 배양 기법을 이용하여 증식될 수 있다.
형질전환된 세포주를 회수하기 위하여 임의의 수의 선별 시스템을 이용할 수 있다. 이들은 각각 TK- 또는 APRT-세포에서 이용될 수 있는, 단순 허피스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler M et al (1977) Cell 11: 223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy I et al (1980) Cell 22: 817-23) 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 항대사산물, 항생제 또는 제초제 내성을 선별의 기초로 이용할 수 있다: 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 DHFR (Wigler M et al (1980) Proc Natl Acad Sci 77: 3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418 에 대한 내성을 부여하는 npt (Colbere-Garapin F et al (1981) J Mol Biol 150: 1-14) 및 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat (Murry, 상기). 추가의 선택성 유전자는 예를 들어 트립토판 대신 인돌을 세포가 이용하게 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용하도록 하는 hisD (Hartman S C 및 R C Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci85 :8047-51)가 개시되었다. 최근에는, 가시적 마커의 이용이 인기를 얻었으며, 그러한 마커로는 형질전환체의 확인뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 기인하는 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량하기 위해 널리 이용되는, 안토시아닌, 베타 글루쿠로니다제 및 그 기질, GUS, 및 루시퍼라제 및 그 기질, 루시페린과 같은 마커가 있다 (Rhodes C A et al (1995) Methods Mol Biol 55:121-131).
폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 형질전환체의 확인
마커 유전자 발현의 존재/부재가 대상 유전자 또한 존재함을 암시할지라도, 활성 sHASEGP의 존재 및 발현이 확인되어야 한다. 예를 들어, 만일 sHASEGP가 마커 유전자 서열내로 삽입되면, sHASEGP를 함유한 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에서 sHASEGP 서열과 탠덤하게 위치할 수 있다. 유도 또는 선별에 대한 반응으로 마커 유전자의 발현은 일반적으로 탠덤 sHASEGP의 발현을 나타낸다. 적절하게 글리코실화된 중성 활성 sHASEGP의 검출은 적절한 조건하에서 sHASEGP 효소 활성을 위한 조절된 배지를 시험하는 방식으로 결정될 수 있다.
sHASEGP의 정제
sHASEGP 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물로부터 코딩된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 분비되는 것이 바람직하지만, 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내에 함유될 수도 있다. 당업자가 이해하는 것처럼, sHASEGP를 함유하는 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 sHASEGP가 직접 분비되도록 촉진하는 시그널 서열을 갖도록 고안될 수 있다. 다른 재조합 구성체는 가용성 단백질의 정제를 촉진할 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 sHASEGP를 연결시킬 수도 있다 (Kroll D J et al (1993) DNA Cell Biol 12: 441-53; 융합 단백질을 함유하는 벡터 내용 참고).
sHASEGP는 또한 단백질 정제를 촉진하기 위해 첨가된 하나 이상의 추가의 폴리펩티드 도메인을 갖는 재조합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러한 정제 촉진 도메인은 고정화된 금속에서의 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 분자와 같은 금속 킬레이팅 펩티드, 고정화된 면역글로불린에서의 정제를 허용하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(이뮤넥스 코포레이션, 와싱턴주 시애틀 소재)에서 이용되는 도메인을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 정제 도메인과 sHASEGP 사이에서 인자 XA 또는 엔테로키나제(인비트로겐, 캘리포니아주 샌디애고 소재)와 같은 절단성 링커 서열의 포함은 정제를 촉진하는 데 유용하다. 한가지 그러한 발현 벡터는 sHASEGP를 손상시키는 융합 단백질의 발현을 제공하며 티오레독신과 엔테로키나제 절단 부위가 이어지는 6 히스티딘 잔기를 코딩하는 핵산을 함유한다. 히스티딘 잔기는 IMIAC(Porath et al (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281에 개시된 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)에서의 정제를 촉진하는 한편 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 케모카인을 정제하기 위한 수단을 제공한다.
재조합 생산에 더하여, sHASEGP의 단편은 고체상 기법을 이용하는 직접 펩티드 합성(Stewart et al (1969) Solid- Phase Peptide Synthesis, W H Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85 : 2149-2154 참고)에 의해 생산될 수 있다. 생체외 단백질 합성은 수동 기법 또는 자동화에 의해 실시될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 제조자에 의해 제공된 안내서에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 431A 펩티드 합성기(퍼킨 엘머, 캘리포니아주 포스터시 소재)를 이용하여 이루어질 수 있다. sHASEGP의 다양한 단편은 별도로 화학 합성되고 화학적 방법으로 결합되어 전체 길이 분자를 생산할 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드의 코딩 서열 또는 그 일부를 함유하는 발현 벡터는 예를 들어, 코딩 부분을 세 가지 PGEX 벡터(글루타치온 S-트랜스퍼라제 발현 벡터(Smith 및 Johnson, Gene 7: 31-40(1988)) 각각의 EcoRI 제한 부위내로 서브클로닝하여 만들어진다. 이에 의해 정확한 판독 프레임으로 생성물이 발현된다. sHASEGP 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인의 발현을 위한 예시적인 벡터 및 시스템은 당업계에 공지된 피치아 벡터(예를 들어, 인비트로겐에서 구할 수 있음), 특히 코딩된 단백질의 분비를 위해 고안된 것들을 포함한다. 단백질은 또한 인클루젼 바디에서처럼 세포질에서 발현될 수 있다. 한가지 예시적인 벡터는 실시예에 개시된다.
이. 콜라이 세포의 형질전환을 위한 플라스미드는 예를 들어, pET 발현 벡터를 포함한다 (미국 특허 제4,952,496호 참고; 위스콘신주 매디슨에 소재하는 노바겐에서 판매; 또한 상기 시스템을 설명하는 노바겐에 의해 공개된 문헌을 참고).
그러한 플라스미드는 T71ac 프로모터, T7 종결인자, 유도성 이. 콜라이 lac 작동인자, 및 lac 억제인자 유전자를 함유하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 종결인자, 및 이. 콜라이 OMPT 분비 시그널을 함유하는 pET 12A-C; 및 His 컬럼으로 정제하는 데 사용하기 위한 His-Tag 리더 서열 및 컬럼에서 정제 후 절단을 허용하는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 종결인자를 함유하는 pET 15B 및 PET19B(노바겐)를 포함한다.
벡터는 피치아 세포, 및 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포와 같은 숙주 세포내로 도입되고, 단백질은 그안에서 발현된다. 예시적인 피치아 균주는 예를 들어 GS115를 포함한다. 예시적인 박테리아 숙주는 LACUV 프로모터(미국 특허 제5,952,496호 참고)와 같은 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 DNA의 염색체 카피를 함유한다. 그러한 숙주는 용균성 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
sHASEGP 도메인, 유도체 및 유사체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 일단 sHASEGP 폴리펩티드, 또는 그 도메인, 단편 또는 유도체를 발현하는 재조합 세포가 확인되면, 개별 유전자 생성물이 분리되고 분석될 수 있다. 이것은 생성물의 방사성 표지 및 후속되는 겔 전기영동, 면역분석, 마커-표지된 생성물에의 가교, 및 단백질 분해 활성의 분석에 의한 분석을 포함하여 이에 한정되지 않는 단백질의 물리적 및/또는 기능적 특성에 기초한 분석에 의해 이루어진다.
sHASEGP 폴리펩티드는 컬럼 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 겔 배제, 역상 고압 및 빠른 단백질 액체), 차등 원심분리, 차등 용해성, 또는 단백질 정제를 위해 이용되는 임의의 다른 표준 기법을 포함하며 이에 한정되지 않는 공지 방법에 의해 (복합체 또는 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포 또는 천연 공급원으로부터) 분리 및 정제될 수 있다.
한 구체예에서, sHASEGP는 1) 접선 유동 정용여과, 2) 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 결합 및 용출, 3) 페닐 세파로즈 크로마토그래피를 통한 유동, 4) 페닐보로네이트 크로마토그래피에 의한 결합 및 용출, 및 4) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의한 결합 및 용출에 의해, HZ24 형질감염되고 메토트렉세이트 증폭된 DG44 세포의 화학적으로 정해진 조절 배지로부터 균질하게 정제될 수 있다.
기능적 특성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
대안으로, 일단 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 도메인 또는 유도체가 확인되면, 단백질의 아미노산 서열은 그것을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론될 수 있다. 그 결과, 단백질 또는 그 도메인 또는 유도체는 당업계에 공지된 표준 화학 방법에 의해 합성되고(예, Hunkapiller et al, Nature 310: 105-111 (1984)) 이어서 생체외에서 글리코실화될 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 서열의 조작은 단백질 수준에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, PEG화, 공지의 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 결합에 의해, 번역동안 또는 번역 후 차등적으로 변형되는 sHASEGP 폴리펩티드 단백질, 그 도메인, 그 유도체 또는 유사체 또는 단편 또한 여기서 고려된다.
임의의 많은 화학적 변형이 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8, NABH4에 의한 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원, 투니카마이신 및 기타 그러한 제제의 존재하에서의 대사성 합성을 포함하며 이에 한정되지 않는 공지 기법에 의해 실시될 수 있다.
또한, sHASEGP 폴리펩티드의 도메인, 유사체 및 유도체는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 도메인을 포함하거나 생체외에서 원하는 활성을 매개하는 sHASEGP 폴리펩티드의 일부에 해당하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
더욱이, 필요하다면, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 치환 또는 첨가로서 sHASEGP 폴리펩티드 서열내로 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산은 혼한 아미노산의 D-이성질체, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, E-ABU, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사코신, 시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, β-메틸 아미노산, ca-메틸 아미노산, na-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 아미노산은 d(우선성) 또는 l(좌선성)일 수 있다.
천연 생성물이 돌연변이로 의심되거나 새로운 종으로부터 분리되는 경우, 생체외에서 발현된 것 또는 생체내 또는 생체외에서 합성 발현 벡터로부터 분리된 것뿐만 아니라 천연 공급원으로부터 분리된 sHASEGP 폴리펩티드의 아미노산 서열은 DNA 서열의 분석으로 결정하거나 또는 다르게는 분리된 단백질을 직접 서열 결정하여 결정할 수 있다. 그러한 분석은 수동 서열 결정에 의해 또는 자동화된 아미노산 서열결정기를 사용하여 실시할 수 있다.
변형 - sHASEGP 폴리펩티드 및 도메인의 다양한 변형이 여기서 고려된다. sHASEGP-코딩 핵산 분자는 당업계에 공지된 많은 전략에 의해 변형될 수 있다 (Sambrook ET A/. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 상기 서열은 제한 엔도뉴클레아제로 적절한 부위에서 절단되고, 이어서 필요하면 추가로 효소적으로 변형되고, 분리되고 생체외에서 결찰될 수 있다. sHASEGP의 도메인, 유도체 또는 유사체를 코딩하는 유전자의 생산에서는, 변형된 유전자가 원하는 활성이 코딩되는 유전자 영역에서 번역 중지 시그널에 의해 방해되지 않고, 원래의 번역 판독 프레임을 보유하도록 주의해야 한다.
부가적으로, sHASEGP-코딩 핵산 분자는 생체외 또는 생체내에서 돌연변이되어 번역, 개시, 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 또는 코딩 영역에서 변화를 만들고/거나 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 또는 기존의 것을 파괴하거나, 추가의 생체외 변형을 촉진할 수 있다. 또한, 여기서 개시된 대로 Cys 잔기의 치환 및 글리코실화 부위의 제거 또는 첨가와 같은 일차 서열 변화를 갖는 뮤테인이 고려되며; 서열 번호 1의 sHASEGP는 7개의 잠재적인 글리코실화 부위를 갖는다. 그러한 돌연변이는 화학적 돌연변이유발 및 생체외 부위-지정된 돌연변이유발(Hutchinson et al., j. Biol. Chem. 253: 6551-6558(1978)), TABE 링커(파마시아)의 사용을 비제한적으로 포함하는 공지의 돌연변이유발 기법에 의해 이루어질 수 있다. 한 구체예에서는, 예를 들어, sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 도메인은 형광 라벨을 포함하도록 변형된다. 다른 특정 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드는 이종이기능성 시약을 갖도록 변형되며, 그러한 이종이기능성 시약은 복합체의 구성원을 가교시키기 위해 이용될 수 있다.
또한, sHASEGP의 도메인, 유사체 및 유도체는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 도메인을 포함하거나 원하는 활성을 생체외에서 매개하는, sHASEGP의 일부에 해당하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 필요하면, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체를 sHASEGP 서열내로 치환 또는 첨가로서 도입할 수 있다. 비고전적 아미노산은 흔한 아미노산의 D-이성질체, a-아미노 부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, S-ABU, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사코신, 시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 티-메틸 아미노산, ca-메틸 아미노산, na-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 아미노산은 d(우선성) 또는 l(좌선성)일수 있다.
F. N-결합된 당 부분을 갖는 기능적으로 활성인 글리코실화된 sHASEGP의 생성
적절하게 N-글리코실화된 인간 sHASEGP는 촉매적으로 안정한 단백질의 생성에 필요하다. sHASEGP의 N-결합된 글리코실화는 다양한 기법을 통해 이루어질 수 있다. sHASEGP의 글리코실화는 sHASEGP를 코딩하는 핵산을 적절한 N-결합된 글리코실화를 할 수 있는 진핵 기원의 세포내로 도입하거나, 또는 다르게는 sHASEGP 폴리펩티드를 원하는 N-결합된 당 부분을 도입할 수 있는 무세포 추출물 또는 정제된 효소와 접촉시켜 이루어질 수 있다.
발현 시스템의 선택
진핵 세포 발현 시스템은 그들이 전위적으로 발현된 폴리펩티드내로 도입하는 글리코실화의 정도 및 타입에서 다양하다. 예를 들어, CHO 세포는 활성 sHASEGP 폴리펩티드내로 N-결합된 글리코실화를 도입하는 데 있어서 매우 효율적이다.
기능적인 sHASEGP 생성물을 생성하기 위해 N-결합된 글리코실화를 도입하는 추가의 진핵성 발현 시스템은 인간 sHASEGP 발현 플라스미드를 상기 세포내로 도입하고 중성 활성에 대해 시험함으로써 시험될 수 있다. 적절한 N-결합된 글리코실화는 PNG아제 방출된 올리고당의 FACE 분석으로 결정할 수 있다. 촉매적으로 활성인 sHASEGP의 글리코실화 프로파일이 추가로 여기서 제공된다. 글리코실화의 확인은 또한 PNG아제-F로 상기 세포로부터의 sHASEGP를 처리하거나 또는 sHASEGP 코딩 핵산의 도입 후 투니카마이신에서 그러한 세포를 성장시켜 이루어질 수 있다.
생체외에서 sHASEGP 폴리펩티드의 N-글리코실화. sHASEGP 폴리펩티드는 개과 마이크로좀 막과 같은 sHASEGP 폴리펩티드에 N-결합된 당을 전달할 수 있는 활성을 함유한 무세포 추출물과 sHASEGP 폴리펩티드를 접촉시키거나, 또는 시판되는(프로메가, 위스콘신주의 매디슨에 소재) 결합된 전사 및 번역을 통해 N-글리코실화될 수 있다.
올리고당류는 환원성 말단의 당이 실제 환원당이건 아니건 간에, 환원성 말단과 비환원성 말단을 갖는 것으로 생각된다. 허용된 명명법에 따라, 올리고당은 왼쪽의 비환원성 말단 및 오른쪽의 환원성 말단으로 묘사된다. 여기서 개시된 모든 올리고당은 비환원당의 명칭 또는 약자(예, Gal), 이어서 글리코시드 결합의 형태(.알파. 또는 .베타.), 고리 결합, 결합에 관련된 환원성 당의 고리 위치, 및 이어서 환원성 당의 명칭 또는 약자(예, GlcNAc)로 표시된다. 두 당 사이의 연결은 예를 들어 2,3,2.fw darw.3, 또는 (2,3)으로 표현될 수 있다. 각 당은 피라노즈이다.
본원에서 사용된 것으로서, N-결합된 당 부분은 Asn 잔기의 아미드 질소를 통하여 sHASEGP에 부착된 올리고당을 말한다. N-결합된 올리고당은 몇 가지 주요 타입으로 나뉘며(올리고만노즈, 복합체, 하이브리드, 황산화), 이들 모두는 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아님)내에 속하는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통하여 부착된 (Man) 3- GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. N-결합된 부위는 종종 서열 결정동안 "블랭크" 사이클의 출현에 의해 간접적으로 지정된다. 글리코실화된 Asn을 Asp로 전환시키는 PNG아제 F에 의해 올리고당을 방출시킨 후 양성 확인이 이루어질 수 있다. PNG아제 F 방출 후, N-결합된 올리고당은 Bio-Gel P-6 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 올리고당 풀은 분취용 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)로 처리한다 (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem.182, 1-8). 일부 올리고당 이성질체는 HPAEC를 이용하여 분리될 수 있다. 푸코스 잔기는 HPAEC 크로마토그램에서 용출 위치를 더 앞으로 이동시킬 것이며, 한편 추가의 시알산 잔기는 보유 시간을 증가시킬 것이다. 올리고당 구조가 공지된 당단백질(예, 소 페투인, a-l 산 당단백질, 난백알부민, RNAse B, 트랜스페린)을 동시에 처리하면 올리고당 피크의 지정을 촉진할 수 있다. 수집된 올리고당은 조성 분석 및 메틸화 결합 분석의 조합에 의해 특징을 규명하며(Waegheet al., (1983) Carbohydr Res. 123,281-304.), 이때 아노머 형태는 NMR 분광광도법에 의해 지정된다 (Van Halbeek (1993) in Methods Enzymol 230).
대안으로, 올리고당은 형광 보조 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 확인할 수 있다 (Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281).
G. sHASEGP상의 N-결합된 당 부분의 검출 및 특징규명
단백질이 실제로 글리코실화되었는지를 결정하는 것은 당단백질 글리칸 분석의 초기 단계이다. 나트륨 도데실 설페이트의 존재하에서의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 단백질 서열결정 이전의 최종 단계로서 선택되는 방법이 되었다. 글리코실화된 단백질은 종종 SDS-PAGE에 의해 확산 밴드로서 이동한다. 펩티드-N4-(N-아세틸-D-글루코스아미닐)아스파라긴 아미다제(PNG아제 F)로 처리 후 밴드폭의 주목할만한 감소 및 이동 위치의 변화는 N-결합된 글리코실화의 진단으로 고려된다. 만일 다른 타입의 글리코실화가 주가 되면, 다른 접근법을 이용해야 한다. 렉틴 블롯팅 방법은 글리코실화의 부류(N 대 O)와 무관한 접근을 제공한다. 다양한 식물 조직으로부터의 탄수화물-결합 단백질인 렉틴은 당단백질 글리칸에서 발견되는 광범위한 한정된 당 에피토프에 대해 높은 친화성 및 좁은 특이성을 갖는다 (Cummings, R. D. (1994) Methods in Enzymol. 230,66-86.). 비오틴 또는 디곡시제닌과 접합될 때, 이들은 웨스턴 블롯팅에서 이용되는 이차 항체-알카라인 포스파타제 반응과 유사하게, 알카라인 포스파타제와 접합된 아비딘 또는 항-딕옥시제닌 항체를 이용하여 비색 반응을 통해 막 블롯에서 쉽게 확인될 수 있다 (Haselbeck, et al. (1993) Methods in Mol. Biol. 14,161-173.). 잘 한정된 특이성을 갖는 렉틴 패널을 이용한 스크리닝은 당단백질의 탄수화물 보체에 대해 상당한 정보를 제공할 수 있다. 중요하게도, 색상 발색 증폭은 10-50 ng의 당단백질이 SDS-PAGE의 막 블롯에서 쉽게 보여질 수 있을 정도로 충분히 높다. 렉틴이 그들의 짝 리간드에 대해 매우 높은 친화성을 나타냄에도 불구하고, 일부는 구조적으로 관련된 에피토프에 대해 상당한 친화성을 나타낸다. 따라서, 렉틴 패널을 선택할 때 교차반응성의 가능성을 주의깊게 주목하는 것이 중요하며, O-결합된 구조로부터 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 N-결합된 글리칸을 개별적으로 구별할 확률이 가장 높은 것을 적용하는 것이 중요하다.
단당류 분석 또한 sHASEGP가 글리코실화되는지를 결정하기 위해 이용될 수 있으며, 렉틴 분석의 경우처럼 구조적 특징에 대한 추가의 정보를 제공한다. 정량적 단당류 조성 분석은 i) 글리코실화된 단백질을 확인하고, ii) 개별 당 대 단백질의 몰 비를 제공하며, iii) 일부 경우에는, 올리고당 부류의 존재를 제안하며, iv) 구조적 확인 전략을 고안하는 데 있어 제 1 단계이며, 그리고 v) 재조합 당단백질 치료제를 위한 생산 일관성의 척도를 제공한다. 최근에는 펄스된 전류측정 검출을 갖는 고-pH 음이온-교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)가 단당류 조성을 결정하는 데 광범위하게 이용되었다 (Townsend, et al. (1995) in Carbohydrate Analysis: High-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis (Z. El Rassi ed.).pp. 181-209.). 보다 최근에는, 형광단 기초한 표지화 방법이 도입되었으며 다수가 키트 형태로 이용가능하다. 형광 방법의 뚜렷한 이점은 민감성의 증가(50배)이다. 한 가지 잠재적인 단점은 다른 단당류는 가수분해물에서 또는 외부 표준 혼합물에서, 커플링 반응동안 형광단에 대해 상이한 선택성을 나타낼 수 있다는 것이다. 하지만, 민감성의 증가 및 이용가능한 당단백질의 전체양의 작은 일부로부터 어느 단당류가 존재하는지를 확인하는 능력, 및 레이저 도입된 형광을 이용하는 더큰 민감성의 잠재력은 이 접근법을 더 매력적으로 만든다.
소량의 sHASEGP의 단당류 조성 분석은, 전기 블롯팅 (Weitzhandleret al, (1993) J. Biol. Chem. 268,5121-5130.) 또는 더 작은 양이 분석된다면 도트 블롯 후, PVDF(PSQ) 막에서 최상으로 실시된다. PVDF는 단당류 또는 올리고당류가 일단 산 또는 효소 가수분해에 의해 방출되면 막에 결합하지 않으므로, 탄수화물 분석에 이상적인 매트릭스이다.
FACE 분석은 sHASEGP의 글리코실화 프로파일의 검출에 효과적인 수단이다. 30% 올리고당 젤을 이용하는 FACE(상표명) N-결합된 올리고당 프로파일링(프로자임)이 한 가지 그러한 기작이다. N-글리카나제(a.k.a PNG아제)를 이용한 효소 분해에 의해 100 ㎍의 당단백질로부터 절단되고, 형광단 ANTS를 이용하여 표지되고, 전기영동에 의해 분리된 올리고당은 sHASEGP 글리코실화 프로파일의 검출에 이용될 수 있다. 올리고당 밴드의 상대적인 위치는 중합도(DP) 단위로 이동 거리를 표시하는 올리고당 표준 래더를 따라 샘플 및 샘플 희석액을 러닝시켜 결정된다.
H. sHASEGP 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 스크리닝 방법
몇 가지 타입의 분석이 여기서 예시되고 개시된다. 히알루로니다제 도메인이 다른 분석에서 이용될 수 있다. 하지만, 히알루로니다제 도메인은 촉매 활성을 나타내는 것으로 여기서 나타난다.
따라서 이들은 생체외 스크리닝 분석에 이상적이다.
이들은 또한 결합 분석에 이용될 수 있다.
sHASEGP 전체 길이 자이모겐, 활성 효소, 및 히알루로니다제 도메인이 여기서 제공된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 스크리닝 분석에 사용하도록 고려된다. 따라서, 히알루로니다제 분석에 적용된다면, 하기 설명은 sHASEGP를 비롯한 임의의 히알루로니다제의 단일쇄 히알루로니다제 도메인 또는 그 촉매 활성 부분의 사용에 적용하는 것을 의도한다. 그 스플라이스 변이체와 같은 임의의 변이체를 비롯한, sHASEGP와 사용하기 위한, 결합 분석과 같은 다른 분석이 여기서 제공된다.
1. sHASEGP 단백질의 히알루로니다제 활성을 조절하는 제제의 확인을 위한 촉매 분석.
sHASEGP, 특히 단일쇄 히알루로니다제 도메인 또는 그 촉매 활성 부분의 촉매 활성의 조절자를 확인하기 위한 방법이 여기서 제공된다. 상기 방법은 sHASEGP, 전체 길이 자이모겐 또는 활성 형태, 및 특히 그 단일쇄 도메인을 시험 물질 존재하에서 sHASEGP의 기질과 접촉시키고, 기질의 단백질분해를 검출함으로써 sHASEGP의 활성을 평가하고, 그 활성을 대조군과 비교함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, 대조군은 전체 길이 자이모겐 또는 활성 형태, 및 특히 그 단일쇄 도메인을 비롯한 sHASEGP를 sHASEGP의 기질과 접촉시키고, 기질의 단백질분해를 검출하고, sHASEGP의 활성을 평가함으로써 평가된 sHASEGP의 활성일 수 있다. 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서의 결과를 비교한다. 활성의 차이는 시험 물질이 sHASEGP의 활성을 조절함을 나타낸다. sHASEGP 활성화 절단의 활성인자 또한 고려되며, 그러한 분석이 하기에 개시된다.
한 구체예에서는, 상기 스크리닝 방법에서 다수의 시험 물질이 동시에 스크리닝된다. 다른 구체예에서는, sHASEGP가 표적 세포에 잠재적으로 특이적인 제제를 확인하기 위한 수단으로서 표적 세포로부터 분리된다.
다른 구체예에서는, 시험 물질은 치료 화합물이며, 시험 물질의 존재 및 부재에서 측정된 sHASEGP 활성의 차이는 표적 세포가 치료 화합물에 반응함을 나타낸다.
한 가지 방법은 (a) sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 히알루로니다제 도메인을 리간드와 화합물 사이의 상호작용을 유도하는 조건하에서 하나 또는 다수의 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 다수중에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
여기서 제공된 다른 방법은 (a) sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 히알루로니다제 도메인을 sHASEGP 폴리펩티드의 기질과 접촉시키고, 기질의 분해를 검출하여 이에 의해 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 평가하는 단계; (b) 시험 물질의 존재하에서 sHASEGP 폴리펩티드를 sHASEGP 폴리펩티드의 기질과 접촉시키고, 기질의 분해를 검출하고 이에 의해 sHASEGP 폴리펩티드의 활성이 평가되는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 b)에서 평가된 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 비교하여 이에 의해 단계 (a)에서 측정된 활성이 단계 (b)에서 측정된 활성과 상이함은 시험 물질이 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 조절함을 나타내는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서는, 다수의 시험 물질이 동시에 스크리닝된다. 시험 물질이 sHASEGP 폴리펩티드의 조절자인지를 평가하기 위해 시험 물질의 존재 및 부재 하에서 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 비교하는 데 있어서, 평행 측정이 일반적임에도 불구하고, 평행으로 활성을 분석하는 것이 불필요하다. 한 시점에서 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 측정하고 측정된 활성을 sHASEGP 폴리펩티드의 활성의 역사적 값에 비교하는 것이 가능하다.
예를 들어, 시험 물질의 존재하에서 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 측정하고 시험 물질의 부재하에서 이전에 측정된 sHASEGP 폴리펩티드의 활성의 과거의 값과 비교하거나 그 역일 수 있다. 이것은 예를 들어, 분석을 실시하기 위한 키트에 제공된 삽입물 또는 팜플렛상에 sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 제공함으로써 이루어질 수 있다.
특정 sHASEGP를 위한 기질을 선택하는 방법은 실시예에 개시되며, 구체적인 히알루로니다제 분석이 예시된다.
조합 및 선택적으로 분석을 실시하기 위한 안내서를 포함하는 조합을 함유하는 키트가 제공된다. 상기 조합은 sHASEGP 폴리펩티드 및 분석될 sHASEGP 폴리펩티드의 기질을 포함하며; 그리고, 선택적으로 기질의 단백질분해를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 특정 sHASEGP 폴리펩티드에 의한 단백질 분해에 노출되는, 글리코스아미노글리칸을 비롯한, 발색성 또는 형광성 분자일 수 있는 기질은 sHASEGP 폴리펩티드가 시험 기질을 절단하는 능력을 시험함으로써 실험적으로 확인될 수 있다. 최저 농도에서 및/또는 가장 빠른 속도로 또는 원하는 조건하에서 가장 효과적으로 절단되는 기질이 확인된다.
전술한 조합을 함유하는 키트가 추가로 제공된다. 상기 키트는 선택적으로 sHASEGP 폴리펩티드의 활성의 조절자를 확인하기 위한 안내서를 포함한다. 임의의 sHASEGP 폴리펩티드는 그 활성의 조절자의 확인을 위한 표적으로 고려된다.
2. 결합 분석
sHASEGP에 결합하는 제제, 특히 화합물의 확인 및 분리를 위한 방법이 또한 여기서 제공된다. 상기 분석은 분리된 히알루로니다제 도메인(또는 sHASEGP 폴리펩티드의 히알루로니다제 도메인을 함유하는, sHASEGP 폴리펩티드외의 단백질), 및 전체 길이 자이모겐 또는 확장된 히알루로니다제 도메인으로부터 유래된 활성 형태를 비롯한 활성 형태에 결합하는 제제를 확인하기 위해 고안된다. 확인된 화합물은 비정상 히알루로니다제 활성에 관련된 질환 및 질병의 치료를 위한 화합물의 확인을 위한 후보자 또는 선도 물질이다. 상기 방법에 이용된 sHASEGP 폴리펩티드는 sHASEGP 단일쇄 히알루로니다제 도메인 또는 그 단백질분해 활성 부분을 비롯한, 여기서 정의된 임의의 sHASEGP 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 방법이 여기서 제공된다. 이들 방법은 sHASEGP 폴리펩티드(들) 또는 그 히알루로니다제 도메인(들)이 직접 또는 링커를 통하여 간접적으로 고체 지지체에 결합되는 고체상 반응 또는 용액에서 실시될 수 있다. 스크리닝 분석은 실시예에서 개시되며, 이들 분석은 후보 화합물을 확인하기 위해 이용되어 왔다.
여기서의 목적을 위해, 전술한 모든 결합 분석이 sHASEGP에 대해 제공된다.
sHASEGP 단일쇄 히알루로니다제 도메인, 전체 길이 활성 sHASEGP 또는 그 2쇄 히알루로니다제 도메인에 특이적으로 결합하는 화합물과 같은 제제를 확인하기 위한 방법이 여기서 제공된다. 상기 방법은 (a) sHASEGP를 sHASEGP와 제제 사이의 결합을 유도하는 조건하에서 하나 또는 다수의 시험 제제와 접촉시키고; (b) sHASEGP에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제를 다수내에서 확인하는 것에 의해 실시될 수 있다.
예를 들어, 그러한 방법을 실시함에 있어서, sHASEGP 폴리펩티드는 잠재적인 결합 파트너와 폴리펩티드의 연합을 허용하는 조건하에서 잠재적인 결합 파트너 또는 세포의 추출물 또는 분획과 혼합된다. 혼합 후, sHASEGP와 연합된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 다른 분자를 혼합물로부터 분리한다. 이어서 sHASEGP에 결합된 결합 파트너를 제거하여 분석할 수 있다. 결합 파트너를 확인하고 분리하기 위하여, 전체 단백질, 예를 들어, 서열 번호 1의 전체 개시 단백질을 이용할 수 있다. 대안으로, 단백질의 단편을 이용할 수 있다.
다양한 방법을 이용하여 세포 추출물, 또는 혈액, 혈청, 소변, 땀, 활액, CSF 및 기타 그러한 액과 같은 체액을 얻을 수 있다.
예를 들어, 물리적 또는 화학적 파괴 방법을 이용하여 세포를 파괴할 수 있다. 물리적 파괴 방법의 예는 초음파처리 및 기계적 전단을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 화학적 용해 방법의 예는 계면활성제 용해 및 효소 용해를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 추출물을 얻기 위해 세포 추출물을 제조하기 위해 방법을 쉽게 적응시킬 수 있다.
일단 세포 추출물이 제조되면, 결합 파트너와 단백질의 연합이 발생할 수 있는 조건하에서 추출물을 sHASEGP와 혼합한다. 인간 세포의 세포질 또는 혈액과 같은 체액에서 발견되는 조건과 유사한 조건을 비롯한, 다양한 조건을 이용할 수 있다. 삼투압, pH, 온도, 및 이용되는 세포 추출물의 농도와 같은 특징들은 결합 파트너와 단백질의 연합을 최적화하기 위해 변화될 수 있다. 유사하게, 대상 분자를 체액에서 분리하는 방법이 공지되어 있다.
적절한 조건하에서 혼합한 후, 결합된 복합체를 혼합물로부터 분리한다. 다양한 기법을 이용하여 혼합물을 분리할 수 있다. 예를 들어, sHASEGP에 특이적인 항체를 이용하여 결합 파트너 복합체를 면역침전시킬 수 있다. 대안으로, 크로마토그래피 및 밀도/침강 원심분리와 같은 표준 화학 분리 기법을 이용할 수 있다.
추출물에서 비연합 세포 구성원을 제거한 후, 결합 파트너는 종래의 방법을 이용하여 복합체로부터 해리될 수 있다. 예를 들어, 혼합물의 염 농도 또는 pH를 변화시켜 해리시킬 수 있다.
연합된 결합 파트너 쌍을 혼합된 추출물로부터 분리하는 것을 돕기 위하여, sHASEGP는 고체 지지체에 고정될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 니트로셀룰로스 매트릭스 또는 아크릴 비드에 부착될 수 있다. 단백질 또는 그 단편의 고체 지지체에의 부착은 추출물에서 발견되는 다른 구성원으로부터 펩티드/결합 파트너 쌍을 분리시키는 것을 돕는다. 확인된 결합 파트너는 단일 단백질 또는 둘 이상의 단백질로 구성된 복합체일 수 있다.
대안으로, 단일쇄 히알루로니다제를 코딩하는 핵산 분자는 효모 투-하이브리드(two-hybrid) 시스템에서 이용될 수 있다. 효모 투-하이브리드 시스템은 다른 단백질 파트너 쌍을 확인하기 위해 이용되어 왔으며 여기서 개시된 핵산 분자를 이용하도록 쉽게 적응될 수 있다.
특히 sHASEGP를 위한 다른 생체외 결합 분석은 이들 단백질 중 하나의 적어도 촉매 도메인을 함유하는 폴리펩티드 및 하나 이상의 후보 결합 표적 또는 기질의 혼합물을 이용한다. 적절한 조건하에서 혼합물을 항온처리한 후, sHASEGP 또는 촉매 도메인을 함유하는 그 폴리펩티드 단편이 후보 기질과 결합하거나 상호작용하는 능력이 평가된다. 무세포 결합 분석의 경우, 성분중의 하나는 검출가능한 라벨을 포함하거나 여기에 결합된다. 라벨은 방사성활성, 발광, 광학적 또는 전자 밀도 등과 같은 직접 검출, 또는 에피토프 태그, 효소 등과 같은 간접 검출을 제공할 수 있다. 라벨 및 다른 분석 성분의 특성에 따라 다양한 방법을 이용하여 라벨을 검출할 수 있다. 예를 들어, 라벨은 고체 기질에 결합되어 검출되거나 또는 라벨을 함유한 결합 복합체의 일부가 고체 기질로부터 분리되고 이어서 라벨이 검출될 수 있다.
3. 막 고정 단백질인 시그널 전달 sHASEGP의 검출은 직접 또는 간접적으로 시그널 전달에 관련될 수 있는데, 세포 표면 수용체로서 직접 관련되거나, 또는 시그널 전달을 시작할 수 있는 성장 촉진 인자(pro-growth factor)와 같은 단백질을 활성화시킴에 의해 직접적으로 관련될 수 있다.
또한, 서열 번호 4에 개시된 sHASEGP의 가용성 도메인과 같은 분비된 sHASEGP는 세포 표면 수용체에 결합하거나 이와 상호작용함으로써 직접, 또는 시그널 전달을 개시할 수 있는 성장 촉진 인자와 같은 단백질을 활성화시킴으로써 간접적으로 시그널 전달에 관련될 수 있다. 시그널 전달을 평가하기 위한 분석은 공지되어 있으며, sHASEGP 폴리펩티드와 사용하기 위해 적응될 수 있다.
직접 또는 성장 촉진 인자의 활성화를 통해서와 같이 간접적으로, sHASEGP, 특히 전체 길이 또는 세포외 도메인 또는 sHASEGP의 기능성 부분을 세포의 표면에 고정시키기에 충분한 부분에 의해 매개되는 시그널 전달에 영향을 주거나 변화시키는 제제를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 그러한 분석은 예를 들어, 전달된 시그널의 조절이 리포터 유전자로부터의 발현에의 효과를 검출함으로써 평가되는 전사계 분석을 포함한다 (예, 미국 특허 제5,436,128호).
4. sHASEGP를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 제제를 확인하기 위한 방법.
다른 구체예는 sHASEGP를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 제제를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 분석은 sHASEGP를 코딩하는 핵산의 발현 수준의 변화를 모니터하는 임의의 이용가능한 수단을 이용한다.
분석 포맷을 이용하여 제제가 sHASEGP를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 능력을 조절할 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현은 핵산에의 하이브리드화에 의해 직접 모니터될 수 있다. 전술한 효소 분석 또한 sHASEGP의 발현을 조절하는 제제를 검출하기 위해 이용될 수 있다.
세포주는 적절한 조건 및 시간에서 시험될 제제에 노출되며, 전체 RNA 또는 mRNA는 표준 과정에 의해 분리된다 (예, Sambrook et al (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press). 시약에 노출된 세포와 대조군 세포 사이에서 RNA 발현 수준의 차이를 검출할 프로브는 핵산으로부터 제조될 수 있다. 높은 엄격도의 조건하에서 표적 핵산에만 하이브리드하는 프로브를 고안하는 것이 일반적이지만, 필수적이지는 않다. 단지 매우 상보적인 핵산 하이브리드만이 높은 엄격도 조건하에서 형성된다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 하이브리드를 형성하기 위하여 두 핵산 쇄 간에 존재해야 하는 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 프로브:표적 하이브리드와 잠재적 프로브:비-표적 하이브리드 사이에서 안정성의 차이를 최대화하도록 선택된다.
예를 들어, sHASEGP의 N- 및 C-말단 단편은 박테리아에서 발현되어, 이들 단편에 결합하는 단백질의 조사를 위해 이용될 수 있다. sHASEGP의 N- 또는 C-말단 영역에의 His-tag 또는 GST 융합과 같은 융합 단백질을 제조하여 기질로 사용할 수 있다. 이들 융합 단백질은 예를 들어, 글루타치온-세파로즈 비드에 결합되고 이어서 세포 용해물 또는 체액으로 탐침될 수 있다. 용해에 앞서, 세포 또는 체액을 sHASEGP 또는 그위의 도메인과 상호작용하는 단백질을 조절할 수 있는 후보 제제로 처리할 수 있다. 융합 단백질에의 용해물 단백질 결합은 당업계에 공지된 바와 같이 S-PAGE에 의해 구별되고, 분리되고 이어서 단백질 서열결정 또는 질량 분광법에 의해 확인될 수 있다.
항체 프로브는 충분한 길이라면(예, sHASEGP 폴리펩티드의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 그 이상의 연속적인 아미노산) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 면역원성 증가에 필요하다면, 적합한 담체에 접합된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하여 적절한 면역화 프로토콜에서 적합한 포유류 숙주를 면역화시켜 제조된다. 소 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 또는 다른 담체 단백질과 같은 담체와의 면역원성 접합체를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 일부 환경에서, 예를 들어 카르보디이미드 시약을 이용한 직접 접합이 효과적일 수 있으며; 다른 경우에는 피어스 케미컬 컴퍼니(일리노이주 락포드에 소재)에 의해 공급되는 것과 같은 연결 시약이 합텐에의 접근성을 제공하기에 바람직할 수 있다. 합텐 펩티드는 Cys 잔기로 아미노 또는 카르복시 말단에서 연장되거나 또는 예를 들어 담체에의 연결을 촉진하기 위하여 시스테인 잔기가 개재될 수 있다.
면역원의 투여는 일반적으로 적절한 기간동안 적절한 아쥬반트를 사용하여 주사하여 이루어진다. 면역화 스케쥴동안, 항체의 역가를 취하여 항체 형성의 적정성을 결정한다.
항-펩티드 항체는 예를 들어 sHASEGP의 카르복시 말단 아미노산에 해당하는 합성 펩티드를 이용하여 생성될 수 있다.
합성 펩티드는 1-3 아미노산 길이, 일반적으로 적어도 4 이상 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 펩티드는 표준 방법을 이용하여 KLH에 결합될 수 있으며, 토끼 또는 유제류와 같은 동물내로 면역화될 수 있다. 이어서 폴리클로날 항체를 예를 들어, 공유 결합된 펩티드를 함유한 액티겔 비드를 이용하여 정제할 수 있다.
이 방식으로 생산된 폴리클로날 항혈청이 일부 용례에는 만족스러울 수 있지만, 약학 조성물의 경우, 모노클로날 제제의 사용이 일반적으로 이용된다. 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화 세포주를 쾰러 등 (Nature 256: 495-7 (1975))의 표준 방법을 이용하거나 또는 림프구 또는 비장 세포의 불멸화를 일으키는 변형을 이용하여 제조될 수 있다. 원하는 항체를 분비하는 불멸화된 세포주는 항원이 펩티드 합텐, 폴리펩티드 또는 단백질인 면역분석에 의해 스크리닝된다.
원하는 항체를 분비하는 적절한 불멸화된 세포 배양물이 확인될 때, 세포는 생체외에서 또는 복수를 통하여 생체내에서 생산함으로써 배양될 수 있다. sHASEGP의 촉매 도메인 또는 활성화 절단 부위(영역)을 인식하는 모노클로날 항체가 특히 관심의 대상이다.
항체 또는 단편이 또한 생산될 수 있다. 수용체의 원하는 영역에 특이적으로 결합하는 영역이 또한 다수 종 기원을 갖는 키메라로 생산될 수 있다.
상기 방법으로 분석되는 제제는 임의로 선택되거나 또는 이성적으로 선택되거나 고안될 수 있다.
상기 제제는 예를 들어, 펩티드, 작은 분자, 및 탄수화물일 수 있다. 당업자는 제제의 구조적 특성에 제한이 없음을 인식할 수 있다.
펩티드 제제는 공지된 대로, 표준 고체상(또는 용액상) 펩티드 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 이들 펩티드를 코딩하는 DNA는 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성 기구를 이용하여 합성되고, 표준 재조합 생산 시스템을 이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 고체상 펩티드 합성을 이용하는 생산은 비-유전자 코딩된 아미노산이 포함되면 필요하다.
I. 치료 방법
본 방법에 의해 확인된 sHASEGP는 동물, 특히 인간을 비롯한 포유류에서 sHASEGP 기질의 비정상적인 축적을 치료하거나 방지하기 위해 이용된다. 한 구체예에서는, 상기 방법은 유효량의 sHASEGP 당단백질을 포유류에 투여하여 이에 의해 질병 또는 질환이 치료되거나 방지되는 것을 포함한다.
다른 구체예에서는, sHASEGP 억제자를 과다한 양의 중성 히알루로니다제 활성의 치료에 이용할 수 있다. 치료되는 포유류는 인간일 수 있다. 여기서 제공되는 억제자는 스크리닝 분석에 의해 확인된 것들이다. 또한, 항체 및 안티센스 핵산 또는 RNAi와 같은 이중쇄 RNA(dsRNA)가 고려된다.
1. 안티센스 치료: 전술한 대로, 특정 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드 기능은 과다한 콘드로이티나제 활성을 치료하거나 방지하기 위하여, sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산에 의해 감소되거나 억제된다. sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 일부를 코딩하는 유전자 또는 cDNA에 대해 안티센스인, 적어도 6 뉴클레오티드, 일반적으로 최대 약 150 뉴클레오티드의 핵산의 치료적 또는 예방적 사용이 제공된다. 여기서 이용되는 sHASEGP 폴리펩티드 "안티센스" 핵산은 일부 서열 상보성에 의해 그리고 일반적으로 높은 엄격도 조건하에서 sHASEGP 폴리펩티드 RNA(일반적으로 mRNA)의 일부에 하이브리드할 수 있는 핵산을 말한다. 안티센스 핵산은 sHASEGP 폴리펩티드 mRNA의 코딩 및/또는 비코딩 영역에 상보적일 수 있다. 그러한 안티센스 핵산은 sHASEGP 폴리펩티드 기능을 감소시키거나 억제하는 치료제로서 유용성을 가지며, 전술한 질환의 치료 또는 방지에 이용될 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산은 적어도 6 뉴클레오티드이며 일반적으로 올리고뉴클레오티드(6 내지 약 150 뉴클레오티드(6 내지 50 뉴클레오티드 포함) 범위)이다. 안티센스 분자는 히알루로니다제 도메인의 모두 또는 일부에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 100 뉴클레오티드, 또는 적어도 125 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 그 변형 버젼, 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 염기 부분, 당 부분, 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 펩티드와 같은 다른 부착기, 또는 세포막(예, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 : 6553-6556(1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 : 648-652 (1987); 1988년 12월 15일에 공개된 PCT 공개 WO 88/09810호) 또는 혈액-뇌 장벽(예, 1988년 4월 25일에 공개된 PCT 공개 WO89/10134호)을 가로지르는 수송을 촉진하는 제제, 하이브리드화-야기된 절단 제제(예, Krol et al., BioTechniques 6: 958-976(1988)) 또는 인터킬레이팅 제제(예, Zon. Pharm. Res. 5: 539-549(1988))를 포함할 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산은 일반적으로 올리고뉴클레오티드이며, 일반적으로 단일쇄 DNA 또는 RNA 또는 그 유사체 또는 그 혼합물이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 인간 sHASEGP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 일부에 안티센스인 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 당업계에 공지된 치환기를 이용하여 그 구조에서 임의의 위치에서 변형될 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5-아포스 -메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-n-2-카르복시프로필) 우라실, (ACP3)w, 및 2,6-디아미노푸린을 포함하며 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 변형된 염기 부분 적어도 하나를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일루로스, 및 헥소즈를 포함하며 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된 변형된 당 부분 적어도 하나를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 그 포름아세탈 또는 유사체로부터 선택된 변형된 포스페이트 백본 적어도 하나를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 a-아노머 올리고뉴클레오티드일 수 있다. a-아노머 올리고뉴클레오티드는 쇄들이 서로 평행하는, 상보성 RNA와의 특이적인 이중쇄 하이브리드를 형성한다 (Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641 (1987)).
올리고뉴클레오티드는 펩티드; 하이브리드화 야기된 가교제, 수송제제 또는 하이브리드화 야기된 절단 제제와 같은 다른 분자에 접합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동화 DNA 합성기(바이오서치, 어플라이드 바이오시스템즈 등에서 시판되는 것들)를 사용하여, 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 예로써, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 스테인 등의 방법(Nucl. Acids Res. 16: 3209(1988))에 의해 합성될 수 있으며, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 조절된 기공 유리 중합체 지지체의 사용에 의해 제조될 수 있다 (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 : 7448-7451 (1988)). 특정 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 올리고뉴클레오티드는 촉매 RNA 또는 리보자임을 포함한다 (예, 1990년 10월 4일에 공개된 PCT 국제 공개 WO90/11364호; Sarver et al., Science 247: 1222-225 (1990)). 다른 구체예에서는, 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148 (1987)), 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330(1987))이다.
대안으로, 올리고뉴클레오티드는 RNAi와 같은 이중쇄 RNA(dsRNA)일 수 있다.
다른 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생산된다.
예를 들어, 벡터는 그것이 세포에 의해 섭취되도록 생체내로 도입될 수 있으며, 그 세포내에서 벡터 또는 그 일부가 전사되어 안티센스 핵산(RNA)을 생산한다. 그러한 벡터는 sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산을 코딩하는 서열을 함유할 것이다. 그러한 벡터는 그것이 전사되어 원하는 안티센스 RNA를 생산할 수만 있다면, 에피좀으로 남아 있거나 염색체에 통합될 수 있다. 그러한 벡터는 당업계의 표준 재조합 DNA 기법에 의해 구성될 수 있다. 벡터는 포유류 세포에서 복제하고 발현하기 위해 이용되는 플라스미드, 바이러스, 또는 기타일 수 있다. sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 RNA를 코딩하는 서열의 발현은 인간을 비롯한 포유류 세포에서 작용하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 프로모터에 의해서일 수 있다. 그러한 프로모터는 유도성 또는 구성형일 수 있다. 그러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역(Bernoist 및 Chambon, Nature 290: 304-310(1981)), 라우스 사코마 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., Ce//22: 787-797(1980)), 헤르폐스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature 296: 39-42(1982)) 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
안티센스 핵산은 인간 sHASEGP 폴리펩티드 유전자를 비롯한, sHASEGP 폴리펩티드 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 절대적인 상보성이 필요하지는 않다. 종양성 질병의 치료 또는 방지에 효과적인 sHASEGP 폴리펩티드 안티센스 핵산의 양은 질병의 특성에 의존하며, 표준 임상 기법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
가능한 경우, 생체외에서 세포에서, 그리고 이어서 인간에서 시험하고 사용하기에 앞서 유용한 동물 모델 시스템에서 안티센스 세포독성을 결정하는 것이 바람직하다.
2. RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)(예, Chuang et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985) 참고)은 sHASEGP를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위하여 이용될 수 있다. 간섭 RNA(RNAi) 단편, 특히 이중쇄(ds) RNAi는 sHASEGP 기능의 손실을 생성시키기 위하여 이용될 수 있다. 포유류, 씨. 엘레간스(C. elegans), 초파리 및 식물 및 인간을 비롯한 유기체에서 유전자를 침묵시키기 위해 RNAi를 사용하는 것에 관련된 방법이 알려져 있다 (예, Fire et al. (1998) Nature 391: 806-811; Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490; Hammond et al.(2001) Nature Rev, Genet. 2: 110-119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:239-245; Hamilton et al. (1999) Science 286 : 950-952; Hammond et al. (2000) Nature 404: 293-296; Zamore et al. (2000) Cell 101: 25-33; Bernstein et al. (2001) Nature 409: 363-366; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15: 188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-498; 국제 PCT 출원 No. WO01/29058호; 국제 PCT 출원 제WO 99/32619호 참고).
이중쇄 RNA(dsRNA)-발현 구조체는 에피좀으로 남아 있거나 게놈내로 통합하는 복제가능한 벡터를 이용하여 동물 또는 식물과 같은 숙주내로 도입된다. 적절한 서열을 선택함으로써, dsRNA의 발현은 sHASEGP를 코딩하는 내인성 mRNA의 축적을 방해할 수 있다. RNAi는 또한 생체외에서 발현을 억제하기 위해 이용될 수 있다.
sHASEGP에 대해 선택적인(즉, 독특한) 적어도 약 21(또는 21) 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 이용하여 RNAi를 제조한다. 약 21 뉴클레오티드의 더 작은 단편은 직접(즉, 생체외 또는 생체내) 세포내로 형질전환될 수 있으며; 더 큰 RNAi dsRNA 분자는 일반적으로 그들을 코딩하는 벡터를 이용하여 도입된다. dsRNA 분자는 적어도 약 21 bp 길이 또는 그 이상이며, 50, 100, 150, 200 이상일 수 있다. 핵산 분자를 생체외 및 생체내에서 세포내로 도입하기 위한 방법, 시약 및 프로토콜은 공지되어 있다.
3. 유전자 치료
예시적인 구체예에서, sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 기능성 도메인 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 유전자 치료에 의해 sHASEGP 폴리펩티드 기능을 증진시키기 위해 투여된다. 유전자 치료는 대상에게 핵산을 투여하여 실시되는 치료를 말한다. 이 구체예에서는, 핵산은 sHASEGP 폴리펩티드 기능을 촉진시켜 치료 효과를 매개하는 그 코딩 단백질을 생산한다. 당업계에 이용가능한 유전자 치료의 임의의 방법을 이용할 수 있다 (Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu 및 Wu, Biotherapy 3 : 87-95 (1991); Tolstoshev,An. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); 및 Morgan 및 Anderson, An. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIBTECH11 5 :155- 215 (1993) 참고). 예를 들어, 유전자 치료를 위한 다른 치료 조성물은 적합한 숙주에서 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 도메인, 단편 또는 키메라 단백질을 발현하는 발현 벡터의 일부인 sHASEGP 폴리펩티드-코딩 핵산을 포함한다. 구체적으로, 그러한 핵산은 sHASEGP 폴리펩티드 코딩 영역에 작동적으로 연결된 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 유도성 또는 구성형이며, 선택적으로 조직-특이적이다. 다른 특정 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드 코딩 서열 및 임의의 다른 원하는 서열이 게놈내의 원하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진하는 영역과 인접하여 sHASEGP 단백질 핵산이 염색체내 발현되도록 하는 핵산 분자가 이용된다 (Koller 및 Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438(1989)).
환자내로 핵산의 전달은 직접적일 수 있으며, 이 경우 환자는 핵산 또는 핵산-보유 벡터에 직접 노출되며, 또는 간접적일 수 있으며, 이 경우에는 세포가 먼저 생체외에서 핵산으로 형질전환되고 이어서 환자에게 이식된다. 이들 두 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 치료로 알려져 있다.
특정 구체예에서는, 핵산은 생체내로 직접 투여되며, 이 경우 발현되어 코딩된 생성물을 생산한다. 이것은 예를 들어, 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 예를 들어, 결함이 있거나 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터(미국 특허 제4,980,286호)를 이용하여 감염시키거나, 그대로의 DNA를 직접 주사하거나, 또는 미세입자 충격(예, 유전자 총; 바이오리스틱, 듀폰) 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염 제제를 이용한 코팅, 리포좀에의 캡슐화, 미세입자, 또는 미세캡슐을 이용하거나, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려진 펩티드에 그것을 연결시켜 투여하거나, 수용체-매개 식균 작용에 노출되는 리간드에 결합시켜 투여함으로써 세포내로 들어가게 하는 것과 같이(수용체를 특이적으로 발현하는 세포 타입을 표적화하기 위해 이용될 수 있음), 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 이루어질 수 있다 (Wu 및 Wu, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432 (1987)). 다른 구체예에서는, 리간드가 엔도좀을 파괴하기 위한 용해성 바이러스 펩티드여서 핵산이 라이소좀 분해를 피하는 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 핵산은 특이적 수용체를 표적화시킴에 의해, 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내에서 표적화될 수 있다 (예, 1992년 4월 16일자의 PCT 공개 WO92/06180호(Wu et al.); 1992년 12월 23일자 WO92/22635호(Wilson et al.); 1992년 11월 26일자 WO92/20316호(Findeis et al.); 1993년 7월 22일자 WO93/14188호(Clarke et al.), 1993년 10월 14일자 WO93/20221호(Young) 참고). 대안으로, 핵산은 세포내로 도입되어, 발현을 위해 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 DNA내로 통합될 수 있다 (Koller 및 Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijistra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
특정 구체예에서, sHASEGP 폴리펩티드 핵산을 함유하는 바이러스 벡터가 이용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 이용될 수 있다 (Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993) 참고). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 숙주 세포 DNA내로의 통합에 필요하지 않는 레트로바이러스 서열이 결실되도록 변형되었다. 유전자 치료에 이용될 sHASEGP 폴리펩티드 핵산은 벡터내로 클론되어, 유전자가 환자내로 전달되는 것을 촉진한다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 사항은 Boesen et al., Biotherapy 6: 291-302 (1994)에 개시되며, 여기서는 줄기 세포를 화학요법에 보다 내성이 되도록 하기 위하여 조혈모 세포에 mdr1 유전자를 전달하기 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것을 개시한다.
유전자 치료에서 레트로바이러스 벡터를 이용하는 것을 예시하는 다른 문헌은 Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons 및 Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); 및 Grossman 및 Wilson, Curr. Opin. In Genetics And Devel. 3: 110-114 (1993)이다.
아데노바이러스는 유전자 치료에 이용될 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위해 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피에 감염되어 온건한 질병을 야기한다. 아데노바이러스-계 전달 시스템을 위한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 효과를 갖는다. Kozarsky 및 Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993)는 아데노바이러스계 유전자 치료의 개요를 제시한다. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)는 붉은털 원숭이의 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위해 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것을 입증하였다. 유전자 치료에서 아데노바이러스를 이용하는 다른 예는 Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); 및 Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993)에서 발견될 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 또한 유전자 치료에서의 사용이 제안되어 왔다 (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993)).
유전자 치료에의 다른 접근법은 전기천공, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염, 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 조직 배양에서 세포로 유전자를 전달하는 데 관련된다. 일반적으로, 전달 방법은 선택성 마커를 세포로 전달하는 것을 포함한다. 이어서 세포를 선별하여, 전달된 유전자를 흡수하여 발현하는 세포를 분리한다. 이어서 이들 세포를 환자에게 전달한다.
이 구체예에서, 핵산은 얻어진 재조합 세포를 생체내로 투여하기에 앞서 세포내로 도입된다. 그러한 도입은 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파아지 벡터를 이용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 미세세포-매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 공지 방법에 의해 실시될 수 있다. 외래 유전자를 세포내로 도입하기 위해 많은 기법이 공지되어 있으며(예, Loeffler 및 Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline,Pharmac. Ther. 29: 69-92 (1985)), 수용 세포의 필요한 발생학적 및 생리학적 기능이 파괴되지 않는다면 이용될 수 있다. 상기 기법은 세포에 핵산을 안정하게 전달할 수 있게 하여, 핵산은 세포에 의해 발현되고 일반적으로 유전가능하며 그 세포 후손에 의해 발현가능하게 한다.
생성된 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 한 구체예에서는, 상피 세포는 예를 들어, 피하로 주사된다. 다른 구체예에서는, 재조합 피부 세포는 환자에게 피부 이식편으로 적용할 수 있다. 재조합 혈액 세포(예, 조혈 모세포 또는 후손 세포)는 정맥내로 투여될 수 있다. 사용을 위한 세포의 양은 원하는 효과, 환자 상태 등에 의존하며, 당업자가 결정할 수 있다.
유전자 치료의 목적을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 원하는, 이용가능한 세포 타입을 포함하며, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기 또는 후손 세포, 특히 조혈모세포 또는 후손 세포, 예를 들어 골수, 탯줄 혈액, 말초혈액, 태아 간 및 기타 공급원에서 얻어진 줄기 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 유전자 치료에 이용되는 세포는 환자에게 자기유래성이다. 재조합 세포를 유전자 치료에 이용하는 한 구체예에서는, sHASEGP 폴리펩티드 핵산이 세포내로 도입되어 세포 또는 그 후손에 의해 발현가능하며, 이어서 재조합 세포는 치료 효과를 위해 생체내로 투여된다. 특정 구체에에서는, 줄기 또는 후손 세포를 이용한다. 생체외에서 분리되고 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 후손 세포는 이 구체예에 따라 잠재적으로 이용될 수 있다.
그러한 줄기 세포는 조혈모세포(HSC), 피부 및 창자의 내벽과 같은 상피 조직의 줄기 세포, 배아 심장 근육 세포, 간 줄기 세포(1994년 4월 28일자 PCT 공개 WO94/08598호), 및 신경 줄기 세포((Stemple 및 Anderson, Cell 71: 973-985 (1992))를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
상피 줄기 세포(ESC) 또는 각질세포는 공지 방법에 의해(Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A : 229 (1980)) 피부 및 창자의 내벽과 같은 조직으로부터 얻어질 수 있다. 피부와 같은 성층 상피 조직에서, 재생은 기저 라미나에 가장 가까운 층인 배층 내의 줄기 세포의 유사분열에 의해 일어난다. 창자의 내벽내의 줄기 세포는 이 조직의 신속한 재생 속도를 제공한다. 환자 또는 공여자의 피부 또는 창자의 내벽으로부터 얻은 ESC 또는 각질세포는 조직 배양으로 성장시킬 수 있다 (Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); Pittelkow 및 Scott, Cano. Clinic Proc. 61: 771 (1986)). 만일 ESC가 공여자에 의해 제공되면, 숙주 대 이식편 반응성의 억제 방법(예, 적당한 면역 억제를 증진하기 위한 조사, 약물 또는 항체 투여) 또한 이용될 수 있다.
조혈모세포(HSC)와 관련하여, HSC의 생체외 분리, 증식, 및 유지를 제공하는 임의의 기법을 이 구체예에서 이용할 수 있다. 이것이 이루어질 수 있는 기법은 (a) 미래의 숙주 또는 공여체로부터 분리된 골수 세포로부터 HSC 배양물의 분리 및 확립, 또는 (b) 알러지원 또는 이종원일 수 있는, 이전에 확립된 장기 HSC 배양물의 사용을 포함한다.
비-자가 HSC는 일반적으로 미래 숙주/환자의 이식 면역 반응을 억제하는 방법에서 이용된다. 특정 구체예에서, 인간 골수 세포는 주사바늘 흡입에 의해 후방 엉덩뼈능선으로부터 얻어질 수 있다 (예, Kodo et al., J. Clin. Invest. 73:1377-1384 (1984) 참고). 예를 들어, HSC는 매우 풍부하거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 만들어질 수 있다. 이러한 농축은 장기 배양전, 배양동안 또는 배양 후 이루어질 수 있으며, 공지의 임의의 기법에 의해 이루어질 수 있다. 골수 세포의 장기 배양은 예를 들어 변형된 덱스터(Dexter) 세포 배양 기법( Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335 (1977)) 또는 위트락-위트 배양 기법( Witlock 및 Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612 (1982))을 이용하여 확립되고 유지될 수 있다.
특정 구체예에서, 유전자 치료의 목적을 위하여 도입될 핵산은 코딩 영역에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하여, 핵산의 발현이 적절한 전사 유도자의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절가능하다.
3. 프로드러그
종양 치료 방법이 제공된다. 이 방법은 활성 약물 또는 생체내에서 활성 약물로 전환될 수 있는 전구체를 방출하기 위해 sHASEGP에 의해 특정 부위에서 절단되는 프로드러그를 투여함으로써 실시된다. sHASEGP 활성을 발현하는 세포와 접촉할 때, 프로드러그는 활성 약물로 전환된다. 프로드러그는 표적화된 sHASEGP를 위한 기질에 연결된, 세포독성 제제와 같은 항-종양 약물 또는 다른 치료제(TA)와 같은 활성 제제를 함유하는 접합체일 수 있으며, 상기 약물 또는 제제는 접합체에서는 비활성이거나 세포로 들어갈 수 없으나, 절단 시 활성화된다. 예를 들어, 프로드러그는 표적화된 sHASEGP에 의해 촉매적으로 절단되는, 상대적으로 짧은, 약 20 이당류 단위 미만인 콘드로이친 설페이트 분자를 함유할 수 있다. 세포독성 제제는 알킬화제, 항증식제 및 튜불린 결합제를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 다른 것들은 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신 및 탁산을 포함한다.
J. 약학 조성물 및 투여 방식
1. 조성물의 성분
활성 sHASEGP를 함유하는 약학 조성물이 여기서 제공된다. sHASEGP 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물의 조합 및 항체 화합물과 같은, 히알루로니다제 질환의 치료를 위한 화합물 또는 다른 치료가 제공된다.
sHASEGP 폴리펩티드 및 두번째 제제는 함께 또는 순차적으로 또는 간헐적으로 투여하기 위한 별도의 조성물로 포장될 수 있다. 대안으로, 이들은 투여를 위한 단일 조성물로 제공되거나 또는 단일 조성물로서 투여하기 위한 두 조성물로 제공될 수 있다. 상기 조합은 키트로 포장될 수 있다.
2. 제제 및 투여 경로
여기서 제공되는 sHASEGP 폴리펩티드 및 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 일반적으로 단일 투여 형태를 위해 약학 조성물로 조제될 수 있다. 제제에서 상기 폴리펩티드의 농도는 투여시, 목적하는 치료에 효과적인 양을 전달하는 데 효과적이다. 일반적으로, 조성물은 단일 투여량 투여를 위해 조제된다. 조성물을 조제하기 위하여, sHASEGP 폴리펩티드, 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인 또는 그 혼합물의 중량 분획을, 치료되는 상태가 경감되거나 완화되는 유효 농도로, 선택되는 비히클에 용해시키거나, 현탁시키거나, 분산시키거나 또는 다르게는 혼합시킨다.
본 발명에서 제공되는 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 그러한 담체를 포함한다.
또한, 폴리펩티드는 조성물 중의 단독 약학적 활성 성분으로서 조제되거나 또는 다른 활성 성분과 배합될 수 있다. 조직 표적화 리포좀을 비롯한 리포좀 현탁액 또한 약학적 허용 담체로서 적합할 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제제는 미국 특허 제4,522,811호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
활성 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 치료되는 환자에게 바람직하지 않은 부작용없이 치료적으로 유용한 효과를 나타내기에 충분한 양으로 약학적 허용 담체에 포함된다. 치료적 유효 농도는 본원에 제공된 분석을 이용하거나 하기 참고 문헌에서와 같은 공지의 시험관내 및 생체내 시스템에서 폴리펩티드를 시험함으로써 실험적으로 결정할 수 있으며, 그 후 그로부터 인간을 위한 투여량에 대해 외삽 추정할 수 있다: Taliani et al. (1996) Anal. Biochem. 240: 60-67, Filocamo et al. (1997) J Virology 71: 1417-1427, Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18, Buffard et al. (1995) Virology 209: 52-59, Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem.237: 239-244, Hamatake et al. (1996) Intervirology 39: 249-258, Steinkuehler et al. (1998) Biochem. 37: 8899-8905, D'Souza et al. (1995) J. Gen. Virol. 76: 1729-1736, Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247: 242-246; 또한 예를 들어, Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68: 8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70: 7219-7223, Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227: 822-826, Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 1412-1417, Hahm et al. (1996) Virology 226: 318-326, Ito et al. (1996) J. Gen. Virol. 77: 1043-1054, Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 212: 906-911, Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65: 201-207 참조.
일반적으로 치료 유효 투여량이 고려된다. 투여되는 양은 혈액량에 대하여 약 0.005 내지 0.05 mg/ml 및 약 0.01 mg/ml를 비롯한 0.001 내지 1 mg/ml 정도일 수 있다. 약학적 투여 단위 형태는 투여 단위 형태당 필수 활성 성분 또는 필수 성분의 조합 약 25 내지 75 mg을 비롯한, 약 10 내지 약 500 mg을 비롯하여 약 1 mg 내지 약 1000 mg을 제공하도록 제조된다. 정확한 투여량은 실험적으로 결정할 수 있다.
일부 경우에는, 고 유닛 투여량의 sHASEGP가 바람직하다. 예를 들어, 500 내지 100,000 유닛 sHASEGP/ml의 sHASEGP 농도를 정맥내 투여하는 것이 바람직하다. sHASEGP의 동결건조 제제가 또한 sHASEGP의 다량의 유닛 투여량의 저장에 이상적이다. 동결건조된 200,000 유닛의 sHASEGP 바이알이 정맥내 전달에 고려된다.
고농도 투여량은 또한 소용량의 sHASEGP의 전달에 고려된다. 5000 유닛/ml sHASEGP의 10 내지 100 ㎕의 투여는 백내장 및 수정체 안구내 렌즈 이식 수술 도중 먼저 투여된 점탄성 물질을 용해시키기 위해 전실에 주사하는 데 고려된다. 50 내지 200 U/ml의 소용량 주사는 또한 당뇨병성 망막병증에서 유리체 출혈 또는 유리체-망막 탈착의 치료와 같은 유리체내 수술에 고려된다.
체내에서 다소 더 큰 및/또는 더 쉽게 배수되는 공간에 대해서는 다소 다량의 주사(예를 들어, 약 1 내지 수 ml 이상)가 고려된다. 예를 들어, 본원에 예시된 바와 같이, 예를 들어 테넌 하부 공간 또는 공막극에 주사함으로써, 눈 주위의 하나 이상의 공간에 1 내지 수 ml 이상의 안와 주위 주사를 실시하여, 맥락총 및/또는 망막 등의 눈 후부의 조직을 향한 약제의 경공막 전달을 촉진할 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 체내의 일부 공간은 다량을 더 쉽게 수용할 수 있다. 예를 들어, 눈 주위의 공막극 또는 테넌 하부 공간은 1 내지 수 ml 이상의 용량을 더 쉽게 수용할 수 있다(예를 들어, 특정 조직의 특성 및 용량이 투여되는 속도에 따라, 최대 5 내지 10 ml 이상).
또한, 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, (가능하게는 1종 이상의 추가적인 약제 또는 기타 제제와 함께) 다량의 sHASEGP의 도입은 체내의 원하는 표적 부위로의 제제의 전달을 추가로 촉진하는 데 이용될 수 있다. 특정 작용 메카니즘에 국한되는 것은 아니지만, 그러한 다량의 주사는, 증가된 압력차에 의해 촉진되는 이류성 수송 과정에 의해, 처리 조직 내에 존재하는 sHASEGP 및 다른 제제(들) 양자의 침투 또는 확산을 추가로 촉진할 수 있는 것으로 생각된다. 역시, 특정 작용 메카니즘에 국한되기를 원하는 것은 아니지만, 이러한 증가된 압력차는, 본 발명에 있어서, 특히, (i) 증가된 구동압 또는 증가된 "압력 수두"(예를 들어, 대부분 충전하거나 다소 넘치게 충전하거나 주사 공간 또는 부위를 팽창시키는 주사와 관련된 증가된 정수압에 의해 유발됨) 및 (ii) 감소된 하류 압력 또는 감소된 "임피던스"(예를 들어, 국소화된 히알루로니다제 활성과 관련된 간질 매트릭스 내의 채널의 개방 및 이로 인한 비교적 수화된 히알루론의 분해에 의해 유발됨) 중 하나 또는 둘 다에 의해 유발될 수 있는 것으로 생각된다. 인체의 하나 이상의 조직으로 제제를 전달함에 있어서, 본 발명의 상기 및 기타 분야에 사용하기 위한(예를 들어 약제 및 기타 제제의 전달을 촉진하기 위한) 바람직한 히알루로니다제는 sHASEGP, 특히 인간 sHASEGP이다. 그러나, 히알루로니다제의 사용 및 적용에 대한 상기 및 기타 방법은 또한 비인간 sHASEGP, 예컨대 포유동물 sHASEGP뿐 아니라 다른 인간 또는 포유동물 히알루로니다제, 바람직하게는 그러한 히알루로니다제의 가용성 형태를 이용하여 적용할 수 있다.
활성 성분은 한번에 투여되거나, 또는 시간 간격을 두어 여러 번의 작은 투여량으로 나누어 투여될 수 있다. 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료하고자 할 질병에 의존하며, 공지의 테스트 프로토콜을 이용하거나 또는 생체내 또는 시험관내 테스트 데이터로부터 외삽하여 실험적으로 결정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 농도 및 투여량 값은 또한 완화하고자 하는 병태의 심각성에 따라 달라질 수 있음을 주목하여야 한다. 임의의 특정 피험체의 경우, 구체적인 투여량 요법은 개별적인 요구사항 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적 판단에 따라 시간에 따라 조정되어야 하며, 본원에 개시된 농도 범위는 단지 예시일뿐이며 청구된 조성물 및 이들을 함유하는 조합물의 범위나 용도를 제한하고자 함이 아님이 이해되어야 한다.
약학적 허용 유도체는 산, 염, 에스테르, 수화물, 용매화물 및 프로드러그 형태를 포함한다. 유도체는 일반적으로 그 약동학적 특성이 상응하는 중성 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인보다 우수하도록 선택된다.
따라서, 본 발명 폴리펩티드 또는 그 약학적 허용 유도체 하나 이상의 유효 농도 또는 양은 전신, 국소 또는 국부 투여를 위한 적합한 약학적 담체 또는 비히클과 혼합되어 약학 조성물을 형성한다. sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 치료가 고려되는 질환을 개선하거나 치료하기에 효과적인 양으로 포함된다. 조성물 중의 활성 폴리펩티드의 농도는 활성 폴리펩티드의 흡수, 불활성화, 분비 속도, 투여 스케쥴, 투여량, 특정 조제법 및 당업자에게 공지된 다른 인자들에 따라 달라진다.
상기 방법에 사용하기 위한 치료제는 국소, 관절내, 수조내, 안내, 안와 주위, 뇌실내, 경막내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피내, 피하, 기관내 및 이들 둘 이상의 조합을 비롯한 공지의 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 건조 분말 폐 제제 또한 이용될 수 있다.
가장 적합한 투여 경로는 예를 들어, 유체의 피하 전달을 촉진하기 위한 전달 제제로서의 용도, 점탄성 물질을 수용하는 녹내장 환자의 눈에서 안압을 감소시키는 용도, 또는 화학요법제의 활성을 증가시키기 위한 "확산 제제"로서의 용도와 같은 제안된 용도와, 특정 내부 장기, 종양 성장, 안내 동공 및 표피와 같은 소정 부위에 따라 달라질 것이다. 투여 방식은 국소, 국부, 관절내, 수조내, 안내, 안와 주위, 뇌실내, 경막내, 정맥내, 근육내, 기관내, 복강내, 피내, 피하 및 이들 둘 이상의 조합을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 편평세포 암종, 유방암, 방광암 및 위장관암과 같은 다양한 암의 치료의 경우, 종양 성장 부위에의 투여(예를 들어, 경막내, 뇌실내, 또는 수조내)를 비롯한 국소 투여는 치료제의 전신 투여에 수반될 수 있는 합병증의 위험없이 고농도로 치료제가 투여될 수 있는 잇점을 제공한다.
sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 병용될 수 있는[예를 들어, (제제의 투여 전에, 동시에 또는 후에) 1종 이상의 sHASEGP와 함께 투여하거나 또는 1종 이상의 sHASEGP와 공조제로 병용되는] 대표적인 부류의 약제로서, 각종 암의 치료에 유효성 또는 잠재적 유효성을 갖는 다수의 제제가 당해 기술 분야에 알려져 있고, 역시 1종 이상의 sHASEGP(예를 들어, 제제의 투여 전, 동시 및/또는 후에 동시 투여로 또는 공조제로 제공됨)와 함께 병용되어 그 제제의 약력학, 약동학 또는 기타 유용한 특성을 개선시킬 수 있는 신규 항암제가 정기적으로 개발되고 있다.
비제한적인 예로서, (항암제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에) 공조제 또는 동시 투여에 의해 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 병용될 수 있는 다수의 항암제 또는 화학요법제가 각종 암의 치료에 대해 최근 승인되었다. 그러한 제제의 예로는 알데스루킨(예를 들어, PROLEUKINTM); 알렘투주맙(예를 들어, CAMPATHTM); 알리트레티노인(예를 들어, PANRETINTM); 알로퓨리놀(예를 들어, ZYLOPRIMTM); 알트레타민(예를 들어, HEXALENTM); 아미포스틴(예를 들어, ETHYOLTM); 아나스트로졸(예를 들어, ARIMIDEXTM); 삼산화비소(예를 들어, TRISENOXTM); 아스파라기나제(예를 들어, ELSPARTM); 생 BCG(예를 들어, TICETM BCG); 벡사로텐(예를 들어, TARGRETINTM); 블레오마이신(예를 들어, BLENOXANETM); 정맥 부설판(예를 들어, BUSULFEXTM); 경구 부설판(예를 들어, MYLERANTM); 칼루스테론(예를 들어, METHOSARBTM); 카페시타빈(예를 들어, XELODATM); 카보플라틴(예를 들어, PARAPLATINTM); 카무스틴(예를 들어, BCNUTM, BiCNUTM); 폴리페프로산 함유 카무스틴(예를 들어, GLIADELTM 웨이퍼); 셀레콕시브(예를 들어, CELEBREXTM); 클로람부실(예를 들어, LEUKERANTM); 시스플라틴(예를 들어, PLATINOLTM); 클라드리빈(예를 들어, LEUSTATINTM, 2-CdATM); 사이클로포스파미드(예를 들어, CYTOXANTM, NEOSARTM); 시타라빈(예를 들어, CYTOSAR-UTM); 리포좀 시타라빈(예를 들어, DepoCytTM); 다카바진(예를 들어, DTIC-DomeTM); 닥티노마이신(예를 들어, COSMEGENTM); 다베포에틴 알파스(예를 들어, ARANESPTM); 리포좀 다우노루비신(예를 들어, DANUOXOMETM); 다우노루비신/다우노마이신(예를 들어, CERUBIDINETM); 데닐루킨 디프티톡스(예를 들어, ONTAKTM); 덱스라족산(예를 들어, ZINECARDTM); 도세탁셀(예를 들어, TAXOTERETM); 독소루비신(예를 들어, ADRLAMYCINTM, RUBEXTM); 리포좀 독소루비신(예를 들어, DOXILTM); 드로모스타놀론 프로피오네이트(예를 들어, DROMOSTANOLONETM 및 MASTERONETM 주사); 엘리엇 B 용액(예를 들어, Elliott's B SolutionTM); 에피루비신(예를 들어, ELLENCETM); 에포에틴 알파(예를 들어, EPOGENTM); 에스트라무스틴(예를 들어, EMCYTTM); 에토포사이드 포스페이트(예를 들어, ETOPOPHOSTM); 에토포사이드 VP-16(예를 들어, VEPESIDTM); 엑세메스탄(예를 들어, AROMASINTM); 필그라스팀(예를 들어, NEUPOGENTM); 플록스우리딘(예를 들어, FUDRTM); 플루다라빈(예를 들어, FLUDARATM); 5-FU를 비롯한 플루오로우라실(예를 들어, ADRUCILTM); 풀베스트란트(예를 들어, FASLODEXTM); 젬시타빈(예를 들어, GEMZARTM); 젬투주맙/ 오조가미신(예를 들어, MYLOTARGTM); 고세렐린 아세테이트(예를 들어, ZOLADEXTM); 히드록시우레아(예를 들어, HYDREATM); 이브리투모맙/티욱세탄(예를 들어, ZEVALINTM); 이드라루비신(예를 들어, IDAMYCINTM); 이포스파미드(예를 들어, IFEXTM); 이마티닙 메실레이트(예를 들어, GLEEVECTM); 인터페론 알파-2a(예를 들어, ROFERON-ATM); 인터페론 알파-2b(예를 들어, INTRON ATM); 이리노테칸(예를 들어, CAMPTOSARTM); 레트로졸(예를 들어, FEMARATM); 루코보린(예를 들어, WELLCOVORINTM, LEUCOVORINTM); 레바미솔(예를 들어, ERGAMISOLTM); 로머스틴/CCNU(예를 들어, CeeBUTM); 메클로레타민/질소 머스터드(예를 들어, MUSTARGENTM); 메게스트롤 아세테이트(예를 들어, MEGACETM); 멜팔란/L-PAM(예를 들어, ALKERANTM); 6-MP를 비롯한 머캅토퓨린(예를 들어, PURINETHOLTM); 메스나(예를 들어, MESNEXTM); 메토트렉세이트; 메톡스살렌(예를 들어, UVADEXTM); 미토마이신 C(예를 들어, MUTAMYCINTM, MITOZYTREXTM); 미토테인(예를 들어, LYSODRENTM); 미톡산트론(예를 들어, NOVANTRONETM); 난드롤론 펜프로피오네이트(예를 들어, DURABOLIN-50TM); 노페투모맙(예를 들어, VERLUMATM); 오프렐베킨(예를 들어, NEUMEGATM); 옥살리플라틴(예를 들어, ELOXATINTM); 파클리탁셀(예를 들어, PAXENETM, TAXOLTM); 파미드로네이트(예를 들어, AREDIATM); 페가데마스(예를 들어, ADAGENTM); 페가스파가스(예를 들어, ONCASPARTM); 페그필그라스팀(예를 들어, NEULASTATM); 펜토스타틴(예를 들어, NIPENTTM); 피포브로만(예를 들어, VERCYTETM); 플리카마이신/미트라마이신(예를 들어, MITHRACINTM); 포미머 소듐(예를 들어, PHOTOFRINTM); 프로카바진(예를 들어, MATULANETM); 퀴나크린(예를 들어, ATABRINETM); 라스부리카스(예를 들어, ELITEKTM); 리툭시맙(예를 들어, RITUXANTM); 사그라모스팀(예를 들어, PROKINETM); 스트렙토조신(예를 들어, ZANOSARTM); 탈크(예를 들어, SCLEROSOLTM); 타목시펜(예를 들어, NOLVADEXTM); 테모졸로마이드(예를 들어, TEMODARTM); 테니포사이드/VM-26(예를 들어, VUMONTM); 테스토락톤(예를 들어, TESLACTM); 6-TG를 비롯한 티오구아닌; 티오테파(예를 들어, THIOPLEXTM); 토포테칸(예를 들어, HYCAMTINTM); 토레미펜(예를 들어, FARESTONTM); 토시투모맙(예를 들어, BEXXARTM); 트라스투주맙(예를 들어, HERCEPTINTM); 트레티노인/ATRA(예를 들어, VESANOIDTM); 우리실 머스터드; 발루비신(예를 들어, VALSTARTM); 빈블라스틴(예를 들어, VELBANTM); 빈크리스틴(예를 들어, ONCOVINTM); 비노렐빈(예를 들어, NAVELBINETM); 졸레드로네이트(예를 들어, ZOMETATM); 및 본원에 기재되고 당업계에 알려진 기타 제제를 들 수 있다.
본원에 기재된 다른 부류의 약제와 함께, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 개개의 약제(예컨대, 예를 들어 항종양제로서, 또는 본원에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 다른 부류의 제제의 일원과 함께)와 함께 투여될 수 있다(또는 이것과 공조제될 수 있다). 대안으로, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 특정 부류의 1종 이상의 약제(예컨대, 예를 들어 다수의 항종양제로서, 또는 본원에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 다른 부류의 제제의 다수의 구성원과 함께)와 함께 투여될 수 있다(또는 이것과 공조제될 수 있다). 특정 부류의 2종 이상의 제제와 병용하는 경우, 2종 이상의 제제는 2 가지 이상의 상이한 작용 메카니즘으로 작용하는 것이 종종 바람직하다. sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 특정 제1 부류의 1종의 약제(예컨대, 예를 들어 항종양제, 또는 본원에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 다른 부류의 제제의 구성원)와, 다양한 임의의 병태의 치료에 유용한 1종 이상의 상이한 부류의 1종 이상의 추가적인 약제와 함께 투여될 수 있다(또는 이것과 공조제될 수 있다). 예시를 위해 항암제의 경우 특정 원리를 본원에 언급하였지만, 이러한 원리는, 예를 들어 본원에 기재 및 예시된 다른 부류의 제제의 다수의 구성원 및 항감염제와, 당업계에 이미 알려져 있거나 현재 개발중인 추가 제제에도 적용될 수 있다.
또한, (1종 이상의 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제) 및 1종 이상의 다른 제제(예컨대, 약제, 예를 들어 본원에 예시된 부류의 제제 중 1종)를 포함하는) 본원에 기재된 임의의 조합물 및/또는 공제제의 경우, 이러한 조합물 및/또는 공제제는, 그 자체로는 실질적인 약력학적 효과를 나타내지 않지만 조합물 및/또는 공제제의 유용성을 촉진하는(예를 들어, 성분 중 1종 이상 또는 전체 제제를 안정화시키거나, 1종 이상의 제제 또는 sHASEGP의 활성의 촉진 또는 표적화를 보조하고/하거나, 독성을 감소시키거나 다른 방식으로 조합물 또는 공제제의 안전성 프로필을 향상시킴으로써) 1종 이상의 제제(예컨대, 각종 안정화제, 부형제 등)를 추가로 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 역시 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 병용될 수 있는, 상기 및 기타 항암제(이 뿐만 아니라, 본원에 기재된 다른 부류의 제제의 구성원)의 새로운 버젼 및 제제가 정기적으로 개발되고 있다. 또한, 그러한 효소는 매우 다양한 제제의 약동학 및/또는 약력학적 프로필을 개선시키고, 제제가 상이한(잠재적으로는 더 표적화된) 경로에 의해 전달될 수 있도록 하는 데 이용될 수 있기 때문에, 예를 들어 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 종래에 최적 이하의 프로필을 갖는 것으로 간주된 다수의 제제의 PK 및/또는 PD 프로필을 향상시키는 데 이용될 수 있다. 부수적인 sHASEGP 유무 하에 적절한 동물 모델에서의 제제의 테스트는 특정 제제의 상대 유효성 및 독성을 평가하는 데 이용될 수 있다.
본원에 기술되고 예시된 바와 같이, 다수의 분자 제제(예컨대 항체 및 기타 단백질, 특히 비-IV 비경구 주사에 의해 투여되는 것)는 상대적으로 불량한 약동학적 프로필을 나타내며, 특히 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와의 공조제 또는 동시 투여에 의해 향상될 수 있다. 특정 작용 메카니즘에 국한되는 것은 아니지만, 비교적 작은 소수성을 나타내는 소 분자 제제는, 예를 들어 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)에 의해 촉진될 수 있는 바와 같이 간질액 내에서의 이류성 수송에 의해, 더욱 효과적으로 분산될 수 있다. 이러한 특성을 예측하는 데 일반적으로 이용되는 방법은 다수의 화합물에 대해 보고된 옥탄올 : 물 분배 계수(Kow)의 계산치 및/또는 추정치를 측정하는 것이다. 이러한 점에서, 제제는 3 미만, 더 바람직하게는 2 미만 또는 1 미만, 더 바람직하게는 0 미만, 더욱 더 바람직하게는 (-1) 미만의 log Kow를 나타낸다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 그 친수성을 증가시키기 위해 및/또는 그 투과 및/또는 전달을 촉진하기 위해 소낭 또는 거대 분자 복합체 내에 그 제제를 포함시키기 위해 공유 및/또는 비공유적으로 다수의 제제를 변형시킬 수도 있다.
비제한적인 추가 예시를 위해, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 함께 이용될 수 있는 대표적인 항암제 또는 화학요법 약제는 아래에 열거하는 것들에 포함된다(나머지는 당업계에 공지되어 있다): 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스루킨; 알리트레니노인(9-시스-레티노산); 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지쿠온; 아기메스나; 아스파라기나제; 아스퍼린; 아트리머스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; 베낙시빈; 벤다머스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 비칼루타마이드; 비에타세르핀; 비리코다; 비산트렌; 비산트렌; 비스나피드; 디메실레이트; 비제레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나; 브로피리민; 부도티탄; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카너티닙; 카펙시타빈; 카라세마이드; 카베티머; 카보플라틴; 카보쿠온; 카르모퍼; 카머스틴; 카루비신; 카젤레신; 세데핑골; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시로렐마이신; 시스플라틴; 클래드리빈; 클란페너; 클로파라빈; 크리스나톨; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 덱스니굴디핀; 덱소마플라틴; 데자구아닌; 디아지쿠온; 디브로스피듐; 디에노제스트; 디날린; 디서몰라이드; 도세탁셀; 도페퀴다; 독시플루리딘; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론; 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코머스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로니틴; 엘라크리다; 엘리나피드; 엘사미트루신; 에미테퍼; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 엡탈로프로스트; 에불로졸; 에소루비신; 에스트라머스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포사이드; 에토프린; 엑시설린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스우리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루오로시트라빈; 포스퀴돈; 포스트리신; 포스트리신; 포트레타민; 갈라루비신; 갈로시타빈; 젬시타빈; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 히드록시우레아; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이멕손; 임프로설판; 인디설람; 인프로쿠온; 인터페론; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터루킨-2 및 기타 인터루킨(재조합 인터루킨 포함); 인토플리신; 요오벤구안[131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 루프롤리드; 루프로렐린(루프로렐리드); 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로머스틴; 로나파닙; 로속산트론; 루토테칸; 마포스파미드; 만노스설판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜파란; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 메테신드; 메토트렉세이트; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도마이드; 미토카신; 미토크로민; 미토플락손; 미토글린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신; 미토나파이드; 미노퀴돈; 미토스퍼; 미토테인; 미톡산트론; 미토졸라마이드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 멉리티닙; 마이코페놀산; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노토픽산트론; 옥트레오타이드; 오마플라틴; 오타탁셀; 오터라실; 옥시서란; 옥소페나신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가스파가스; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타머스틴; 페플로마이신; 퍼포스파마이드; 페리포신; 피코플라틴; 피나파이드; 피포브로만; 피포설판; 퍼페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신; 플로메스탄; 플로메스탄; 포피머; 포피로마이신; 프레드니머스틴; 프로카바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퍼미테파; 퓨로마이신; 피라조퓨린; 라니머스틴; 리보프린; 리트로설판; 로글레티마이드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세머스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파포세이트; 스파포스산; 스파소마이신; 스피로게르마늄; 스피로머스틴; 스피로플라틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 서포스파마이드; 설로페너; 타세디날린; 탈리소마이신; 탈리머스틴; 타리퀴다; 타우로머스틴; 테코갈란; 테가퍼; 텔록산트론; 테모포핀; 테니포사이드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다; 티모나식; 티라파자민; 토픽산트론; 토레미펜; 트라벡테딘(엑테인아시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트리시리빈; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파마이드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스터드; 우레다파; 발스포다; 바프레오타이드; 버테포핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포마이드; 빈글리시네이트; 빈루시놀; 빈루로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 산토마이신 A(구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스콥 [2-H]; 지노스타틴; 조루비신; 조수퀴다 등.
본원에 제공되는 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 투여에 적합한 약학적 및 미용적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 그러한 담체를 포함한다. 또한, 상기 폴리펩티드는 조성물 내의 단독 약학 활성 성분으로 조제되거나 또는 원하는 작용을 손상하지 않는 다른 활성 성분 또는 당업자에게 공지된 원하는 작용을 보충하는 물질과 배합될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 sHASEGP 폴리펩티드는 제2 활성 성분의 전달 촉진 또는 활성 증가를 위하여 약물 또는 프로드러그를 포함하며 이에 한정되지 않는 치료 유효 제제와 같은, 제2의 활성 화합물과 조합되어 전달 또는 "확산" 제제로 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 리그노케인, 부피비케인 또는 이 둘의 혼합물과 같은 마취제와, 경우에 따라 안과 수술 도중의 혈액 흡수를 감소 또는 중단시키기 위해 에피네프린과 같은 호르몬 제제와 공조제 또는 동시 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 제제가 특정 병태를 치료하는 데 바람직한 생체내 포유동물 조직(예를 들어, 눈 부분)으로의 약제의 전달을 증대시키기 위해 항염증제와 같은 약제와 공조제 또는 동시 투여될 수 있다. 동시 투여란, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 약제와 함께, 또는 시간적으로 약제를 투여하는 시점과 가까운 시점에 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 약제를 투여하기 직전에(예를 들어 5 내지 60분 전에) 또는 가장 편리하게는 약제와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 동시 투여의 바람직한 근접성은 특정 조직 환경에서 제제의 유효 반감기 및 치료되는 특정 질병에 따라 크게 좌우되며, 적절한 동물 모델에서와 같이 적절한 모델에서 다양한 시점에 제제를 투여하는 효과를 테스트함으로써 쉽게 최적화할 수 있다. 어떤 경우에는, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)의 투여의 최적 시점은 60분을 초과할 것이다. 이론에 구속되기를 원하는 것은 아니지만 예시를 위해, 몇몇 종양의 경우, 예를 들어 종양으로의 화학요법제의 최대 진입은 종양 내의 히알루론의 분해가 실질적으로 완료되어 종양 간극 부피를 감소시킨 후에 일어날 수 있으며, 그 후 히알루론 재생 단계가 이어지며, 그 동안 유체가 종양으로 재도입되어 혈장으로부터 화학요법제의 흡수 증가로 이어진다. 후자의 경우, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)의 최적 투여는 약제를 투여하기 약 1 내지 20 시간 전에 이루어질 수 있다. 질병 상태와 약제의 특정 조합에 있어서 약제에 대한 사전 투여 시점을 최적화하기 위해서, 당업자는 통상적인 시간 절차의 사전 투여를 수행할 수 있으며, 일반적으로 1 시간 이하의 하나 또는 여러 시점을 1 시간 초과의 하나 또는 여러 시점을 비교하여(단, 일반적으로 1일을 초과하지 않음) 투여 시점을 최적화할 수 있다. sHASEGP 폴리펩티드 또는 이의 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 독소 및 종양 괴사 인자와 같은 다양한 화학요법제와 공조제 또는 동시 투여하여, 화학요법제의 활성을 증가시키고/시키거나 화학요법제에 대한 표적 종양의 접근성을 증가시킬 수 있다. 활성 화합물은 치료된 개체에 대한 심각한 독성 효과의 부재에 있어서 치료적으로 유용한 효과를 나타내도록 충분한 양으로 담체 중에 포함된다. 유효 농도는 본원에 기술하는 동물 모델을 비롯하여 시험관내 및 생체내 시스템을 이용하여 화합물을 테스트함으로써 실험적으로 결정할 수 있다.
비경구 투여(즉, 소화관을 통하는 경로 이외의 경로, 예를 들어 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 경로)에 의해 전달되는 약제의 경우, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 체내의 원하는 부위로의 그 전달을 증가시키기 위해 임의의 다양한 약제와 함께 용이하게 공조제 또는 동시 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제와 투여 경로의 특정 조합에 따라, (예를 들어 주사 후에) 제제가 전달 부위 또는 그 부근의 조직으로 확산되는 정도(및/또는 속도) 및/또는 (예를 들어 혈류, 림프, 뇌척수액 또는 다른 체액계로부터 방출된 후) 제제가 이류성 수송에 의해 표적 조직으로 확산 및/또는 수송되는 정도(및/또는 속도)를 증가시킴으로써 전달성을 향상시킬 수 있다. 전달성의 향상 정도는, 예를 들어 sHASEGP의 첨가가 체내의 관심있는 조직에서의 그 제제의 생체이용률의 측정 가능한 증가를 유도하는 동물 모델 시스템에서 쉽게 평가할 수 있다.
이론에 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 비정맥 비경구 투여 물질(예컨대 피하, 피내 및 근육내 주사 물질)의 경우, 주사 부위와 원위 혈관층 사이의 부위와 같은 "하류" 부위와 주사 부위 근처에서의 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)의 존재는 혈관 구조와 같은 전달 시스템으로의 제제의 확산 및/또는 이류성 수송을 향상시킬 수 있는 것으로 생각된다. 그러한 상황에서의 전달성 향상은 (잠재적으로는 벌크 유체 흐름의 부피 및 속도를 증가시키는 것에 의해) 최초 전달 부위를 효과적으로 통과하여 나가는 제제량의 증가와 관련이 있다.
조직에서 분해, 제거 또는 다른 형태로 불활성화되는 다수의 약제의 경우, 조직을 관통하는 속도를 증가시키는 것이 조직을 통해 전달되는 유효 제제의 양을 크게 증가시켜, 생체이용률을 추가로 증가시킨다. 이후에 혈류 또는 다른 도관으로 진입하는 비정맥 투여된 비경구 투여 물질과 (예컨대 정맥내 투여 IV에 의해) 도관으로 직접 전달되는 제제의 경우, 그 제제가 도관에 의해 공급되는 조직을 통해 확산되는 능력은 또한 그 조직에서의 sHASEGP의 존재에 의해 향상될 수 있다. 따라서 sHASEGP가 전자의 경우에서와 같이 "전달 조직"에 존재하든지, 및/또는 후자의 경우에서와 같이 "표적 조직"에 존재하든지 간에, sHASEGP의 존재는 체내의 표적 조직으로의 약제의 유효 전달 정도 및/또는 속도를 향상시킬 수 있다. 어느 경우에나, sHASEGP는 공조제 또는 동시 투여되는 약제의 유효 생체이용률을 증가시키는 데 이용될 수 있다. 그 결과, sHASEGP는, 예를 들어 특정 용량에 대해 더 강력하고/하거나 더 신속한 반응을 제공하도록, 제제 농도를 증가시키고/시키거나 제제 농도를 더 신속하게 달성하는 데 이용될 수 있다. 대안으로, sHASEGP를 이용하여, 예를 들어 특정 반응이 소량의 투여 제제로도 일어날 수 있도록 할 수 있다. sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)가 주사 부위 또는 주사 부위 근처에서의 벌크 유체 흐름을 증가시키는 능력은 관련된 약제 전달의 다른 측면을 향상시킬 수도 있다. 예를 들어, 벌크 유체 흐름의 증가는 주사액의 용량이 주사 부위로부터 쉽게 분산될 수 있도록 촉진할 수 있다(이로써, 주사 통증 또는 주사로 인한 다른 부작용을 감소시킬 수 있다). 실제로, 오랫동안, 비-IV 비경구 주사와 관련된 거부감이 환자가 비-IV 비경구 투여에 저항하거나 회피하려고 하는 주된 원인인 것으로 인식되어 왔다(이는, 제품이 비-IV 경로를 통해 더 편리하고/하거나 안전하게 투여될 수 없다면, 사실상 제품이 정맥 투여될 것을 요할 수 있다).
1종 이상의 약제 또는 다른 제제의 체내로의 전달성을 향상시키기 위해 본 발명의 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)를 사용함에 있어서(종종 "확산"이라 부르는 사용), sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 그 자체가 약제(이 경우, 이것은 약제와 공조제 또는 달리 동시 투여될 수 있거나 개별적으로, 바람직하게는 전술한 바와 같은 약제보다 먼저 투여될 수 있다)와 동일한 경로로 투여될 수 있다. 대안으로 또는 이에 부가하여, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 비-IV 비경구 주사로 국소 투여될 수 있으며, sHASEGP는 정맥 투여될 수 있다. 비제한적인 다른 예로서, sHASEGP는 비-IV 비경구 주사로 (약제에 의해 표적화되기를 원하는 조직으로) 국소 투여될 수 있으며, 약제 그 자체는 다른 경로, 예컨대 정맥내, 비-비경구(예, 경구) 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명의 sHASEGP는 일반적으로 비경구 경로뿐 아니라 비-비경구 경로에 의해 전달되는 제제를 비롯하여 다양한 약제 및 기타 제제의 전달성 및 생체이용률을 향상시키는 데 이용될 수 있다.
예를 들어, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)는 질병을 치료함에 있어서, 예를 들어 유효성을 증가시키기 위해, 및/또는 위험/이익 프로필을 향상시키기 위해, 일반적으로 비경구 전달에 의해 투여되는 다양한 약제와 공조제 또는 동시 투여될 수 있다.
비경구 투여될 수 있고 본 발명의 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와의 공조제 및/또는 동시 투여를 통해 그 전달성 및/또는 생체이용률이 향상될 수 있는 다양한 약제의 예를 하기에 열거하였으나 이것이 총망라된 것은 아니며(즉, 제한적인 예가 아님), 단순히 대표적인 제제를 제시한 것이다: 아달리무맙(예를 들어, HUMIRATM), 아갈시다스 베타(예를 들어, FABRAZYMETM), 알데스루킨(PROLEUKINTM IL-2), 알레파셉트(예를 들어, AMEVIVETM), 암피실린(예를 들어, UNASYNTM 주사), 아나킨라(예를 들어, KINERETTM), 회색질 척수염 예방 백신(예를 들어, PEDIARIXTM), 항흉선세포(예를 들어, THYMOGLOBULINTM), 아지스로마이신(예를 들어, ZITHROMAXTM IV), 베카플러민(예를 들어, REGRANEXTM), 카스포펑긴(예를 들어, CANCIDASTM), 세파졸린(예를 들어, ANCEFTM 및 CEFAZOLINTM), 세페핌(예를 들어, MAXIPIMETM), 세포테탄(예를 들어, CEFOTANTM), 세프타지딤(예를 들어, FORTAZTM), 세프트리악손(예를 들어, ROCEFINTM), 세툭시맙(예를 들어, ERBITUXTM), 실라스타틴(예를 들어, PRIMAXINTM IV), 클라불란산(예를 들어, AUGMENTINTM에서와 같이 아목시실린과 병용), 클린다마이신(예를 들어, CLEOCINTM), 다베포에틴 알파(예를 들어, ARANESPTM), 데아클리주맙(예를 들어, ZENAPAXTM), 디프테리아 변성 독소(일반적으로 예를 들어, DAPTACELTM, INFANRIXTM 및 PEDIARIXTM의 조합물로), 에팔리주맙(예를 들어, RAPTIVATM), 에피네프린(예를 들어, EPIPENTM), 에리스로포이에틴 알파(예를 들어, EPOGENTM 및 PROCRITTM), 에타너셉트(예를 들어, ENBRELTM), 필그라스팀(예를 들어, NEUPOGENTM), 플루코나졸(예를 들어, DIFLUCANTM 주사), 여포 자극 호르몬, 예컨대 폴리트로핀 알파(예를 들어, GONAL-FTM) 및 폴리트로핀 베타(예를 들어, FOLLISTIMTM), 포스페니토인(예를 들어, CEREBYXTM), 플루코나졸(예를 들어, DIFLUCANTM), 가도디아미드(예를 들어, OMNISCANTM), 가도펜테테이트(예를 들어, MAGNEVISTTM), 가티플록사신(예를 들어, TEQUINTM), 글라티라머(예를 들어, COPAXONETM), GM-CSF(예를 들어, LEUKINETM), 고세렐린(예를 들어, ZOLADEXTM), 그라니세트론(예를 들어, KYTRILTM), 헤모필러스 인플루엔자 B(예를 들어, COMVAXTM 및 HibTITERTM), 할로페리돌(예를 들어, HALDOLTM), A형 간염 백신(예를 들어, HAVRIXTM, TWINRIXTM 및 VAQTATM), B형 간염 백신(예를 들어, 재조합 COMVAXTM, ENGERIXTM-B, RECOMBIVAXTM-HB, TWINRIXTM, 및 비재조합 BAYHEPTM-B 및 NABFTM-HB), 이브리투모맙 티욱세탄(예를 들어, ZEVALINTM), 면역글로불린(GAMMAGARDTM 등과 같은 면역글로불린과 다양한 정제된 면역글로불린의 혼합물을 포함함), 인플루엔자 바이러스 백신(예를 들어, FLUMISTTM), 인플릭시맙(예를 들어, REMICADETM), 인슐린(예를 들어, HUMALOGTM, HUMALOGTM MIX 75/25TM, HUMULINTM 제품(50/50, 70/30, 레귤러, NPH, 울트라 및 울트라렌테를 포함함), 및 NOVOLINTM), 인슐린 글라긴(예를 들어, LANTUSTM), 인터페론 알파-2a(ROFERANTM-A), 인터페론 알파-2b(예를 들어, INTRON-ATM), 인터페론 알파콘-1(예를 들어, INFERGENTM), 인터페론 알파-n3(예를 들어, ALFERON NTM), 인터페론 베타(예를 들어, BETASERONTM 및 BETAFERONTM), 인터페론 베타-1a(예를 들어, AVONEXTM 및 REBIFTM), 인터페론 감마(예를 들어, ACTIMMUNETM), 요오딕사놀(예를 들어, VISIPAQUETM), 요오헥솔(OMNIPAQUETM), 요오파미돌, 요오버솔(예를 들어, OPTIRAYTM), 케토로락(예를 들어, TORADOLTM), 라로니다스(예를 들어, ALDURAZYMETM), 레보플록사신(예를 들어, LEVAQUINTM), 리도케인, 리네졸리드(예를 들어, ZYVOXTM), 로라제팜(예를 들어, ATIVANTM), 홍역 백신(예를 들어, ATTENUVAXTM), 홍역-볼거리-풍진 바이러스 백신(예를 들어, M-M-RTM II), 메드록시프로게스테론(예를 들어, DEPO-PRO VERATM), 메로페넴(예를 들어, MERREMTM IV), 메틸프레드니솔론(예를 들어, SOLU-MEDROLTM), 미다졸람(예를 들어, VERSEDTM), 몰핀(예를 들어, ASTRAMORPH/PFTM), 옥트레오타이드(예를 들어, SANDOSTATINTM), 오말리주맙(예를 들어, XOLAIRTM), 온단세트론(예를 들어, ZOFRANTM), 팔리비주맙(예를 들어, SYNAGISTM), 판토프라졸(예를 들어, PROTONIXTM), 페가스파가스(예를 들어, ONCASPARTM), 페그필그라스팀(예를 들어, NEULASTATM), 페그-인터페론 알파-2a(예를 들어, PEGASYSTM), 페그-인터페론 알파-2b(예를 들어, PEG-INTRONTM), 페그비소만트(예를 들어, SOMAVERTTM), 백일해 백신, 피페라실린(예를 들어, ZOSYNTM), 폐렴구균 백신(예를 들어, PNEUMOVAXTM 23) 및 폐렴구균 접합 백신(예를 들어, PREVNARTM), 프로메타진(예를 들어, PHENERGANTM), 레테플라스(예를 들어, RETAVASETM), 소마트로핀(예를 들어, GENOTROPINTM, HUMATROPETM, NORDITROPINTM, NUTROPINTM, SAIZENTM, SEROSTIMTM, ZORBTIVETM), 술박탐, 수마트립탄(예를 들어, IMITREXTM), 타조박탐, 테넥테플라스(예를 들어, TNKASETM), 파상풍 정제 변성 독소, 티카실린(예를 들어, TIMENTINTM), 토시투모맙(예를 들어, BEXXARTM), 트리암시놀론 아세토나이드, 바노마이신(예를 들어, VANCOCINTM), 수두 백신(예를 들어, VARIVAXTM) 및 기타 백신 등.
본 명세서에서 기술하고 설명한 바와 같이, 여러 상이한 분류의 약리학 제제와 투여 경로는 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 동시 투여 및/또는 동시 제제화하여 이들의 1 이상의 사용 양태를 개선함으로써 유익화될 수 있다. 이러한 개선점에는, 예를 들어, 이하 것들 중 하나 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다: (i) 제제의 흡수 정도 및/또는 속도를 개선시켜, 제제의 생체이용성을 개선하며(예를 들어, 비-IV 비경구 투여 이후 혈류에 더 많은 제제가 도달하도록 하거나, 및/또는 더욱 빠른 침투에 의한 국부 투여 이후 더 적은 제제가 분해되도록 함으로써), 이는 예를 들어, 비-IV 비경구 투여에 따른 세포간 흐름을 촉진시켜 잠재적으로 이류성 수송을 촉진시킴으로써 초래할 수 있음(예, 히알루로난의 분해와 연관된 흐름에 대한 임피던스를 감소시키면서, 주사 부피와 연관된 유체정역학적 압력을 제공함으로써); (ii) 보다 안전하거나 더욱 편리한 투여 경로를 제공함(예를 들어 IV 대신 비-IV 비경구 투여를, 또는 근육내 투여 대신 피내 또는 피하 투여와 같이 개선되거나 더욱 편리한 비-IV 비경구 투여를 가능케 함); (iii) 보다 바람직한 투여 섭생법(예를 들어, 투여 빈도의 감소, 또는 덜 빈번하지만 투여량이 많은 IV와 달리, 다소 빈번하지만 투여량이 작은 비-IV 경로); (iv) 부작용을 감소시키거나 독성을 감소시킴(예를 들어, IV 투여에 의해 발생되는 높은 초기 농도(높은 Cmax)와 연관된 효과, 또는 비-IV 비경구투여에 따른 느리거나 및/또는 불완전한 흡수에 의해 초래되는 높은 국부 투여량과 연관된 효과); (v) 달리 약물동력학 및/또는 약력학을 개선시킴(예를 들어, 보다 많은 제제가 표적 위치에 도달하도록 함으로써(예, 주사 부위와 같은 전달 위치에 또는 그 근처에서의 sHASEGP 존재로 인한 세포간 흐름을 및 이류성 수송을 증가시킴으로써), 및/또는 표적 위치 이내에서의 투과를 개선시킴으로써(예, 표적 위치 이내에서의 sHASEGP 존재로 인한 세포간 흐름을 및 이류성 수송을 증가시킴으로써), 또는 제제가 표적 위치로 우선적으로 전달되도록 함으로써(예, sHASEGP의 국부 또는 전신 투여와 함께 표적 위치로 국부 투여하여 표적의 침투를 촉진함으로써, 또는 sHASEGP의 국부 또는 전신 투여와 함께 제제를 특정 위치로 우선적으로 표적화해주는 비히클 또는 거대분자 복합체를 사용하여 표적의 침투를 촉진함으로써)). 경구 전달되는 제제는 또한 예를 들어, 제제가 위장관에서 소실되거나 이후 분해되거나 독성을 가지는 것을 피하기 위해, 바람직한 작용 위치에 보다 효율적으로 표적화되어, 잠재적으로 더 효능이 있거나 및/또는 독성이 적도록 하기 위해서, 또는 달리 더욱 바람직한 약물동력학 및/또는 약력학 프로파일을 제공하기 위해서, 비경구 전달용으로 다시 제제화되는 것도 바람직할 수 있다. 또한, sHASEGP는 경구 투여되는 제제의 약물동력학을 개선시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 바람직한 표적 위치 이내에 경구 투여된 제제의 침투를 개선시킴으로써(예, sHASEGP의 전신 투여 및/또는 sHASEGP의 표적 위치로의 국부 투여에 따른 표적 위치 이내에서의 sHASEGP 존재로 인한 세포간 흐름을 및 이류성 수송을 증가시킴으로써)).
약리학 제제와 같은 제제를 위한 소정의 표적 위치가 혈류 그 자체인 상황에서조차도, 이러한 제제는 sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)의 동시 투여 및/또는 동시 제제화에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 경구 복용 및 비경구 투여(예, IV 주사)를 비롯한 여러 경로 중 하나에 의해 투여될 수 있는 혈류 조절제로 작용하는 여러 제제가 존재한다. 경구 투여되거나 투여될 수 있는 여러 제제는 그럼에도 불구하고 상대적으로 제한되거나 느린 섭취율을 보이거나, 및/또는 바람직하지 않은 분해를 초래한다(그리고, 혈류로 도입시 일반적으로 안전하고 효과적이나, 이러한 이유로 경구적으로 투여되지는 않는 기타 제제가 존재한다). 따라서, 이러한 제제의 비경구 투여(예, sHASEGP의 투여와 함께 근육내, 피하, 피내 또는 경피 경로, 바람직하게는 비경구 투여 위치에서 또는 그 근처에서)는 혈류로의 도입을 제공하는데 사용될 수 있다. 또한, 제제의 혈류로의 신속한 전달이 필수적이나, 경구 투여는 너무 느리고 정맥 투여는 불편하거나, 불안전하거나 사용이 곤란한 여러 긴급한 의약 상황이 존재한다. 이러한 긴급한 상황에는 혈액이 표적인 상황 및 혈류가 단순히 다른 표적 조직으로의 전달 경로인 경우가 포함된다. 이러한 상황에서, 투여를 sHASEGP와 조합하는 능력(또는 sHASEGP와 미리 준비된 동시 제제에 적용하는 것)은 비-IV 비경구 투여를 통해 제제를 빠르게 전달시킬 수 있다. 본 기술분야의 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 예를 들어, 제제의 지연되거나 기타 발사되는 방출, 및 다양하게 조절되는 투여 등을 제공할 수 있는 비-IV 비경구 투여용으로 고안된 여러 제제 및 장치가 존재한다. 이러한 여러 약리학 제제( sHASEGP와 동시 제제화되거나, 이와 함께 사용될 수 있음)는 규칙적으로 의약 실무에 적용되며, 이들의 사용 양태에 대해서는 잘 기술되어 있으며(예, the Physicians' Desk Reference, Thomson 2003, 2004, 2005 참고), 이러한 기타 여러 제제에 대해서는 본 기술분야에 공지되어 있다. 후자와 관련하여, 본 기술분야의 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, sHASEGP는 통상 사용되는 제제와 함께 사용될 수 있으며(예를 들어, 본 명세서에 서술된 바와 같은 이들의 응용성을 개선하기 위해), 통상 사용되지 않는 제제와 함께 사용될 수도 있으며(예를 들어, 이들의 약물동력학 및/또는 약력학을 개선하여 유용하게 하기 위해), 또는 새로 개발된 제제와 사용될 수도 있다.
따라서, 전형적으로 비경구(예, IV 주사에 의함) 도입되는 약리학적 제제(예를 들어, 항암제, 혈액 조절제 또는 본 명세서에서 서술한 바와 같이 기타 분류의 제제의 구성원들)의 경우, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)가 사용되어 예를 들어, 비-IV 비경구 투여와 같은 기타 잠재적으로 보다 편리하고 및/또는 안전한 경로에 의해 이러한 제제가 투여될 수 있도록 해준다(예, 근육내, 피하, 피내 또는 경피 경로에 의해). 비-IV 비경구 경로에 의해 이미 전달가능한 제제의 경우, sHASEGP가 사용되어 섭취 및 전달 정도 및/또는 속도를 개선시킬 수 있다(예, 본 명세서에 서술한 바와 같이 이류성 수송에 의해 도움을 받을 수 있는, 분산 및 이에 따르는 혈류로의 도입을 개선시킴으로써). 이러한 효과의 이점에는, 혈류로 도달하는 제제의 비율의 증가, 제제에 대해 감소된 국부 노출(농도 및/또는 시간 측면에서)(예, 종종 국부 독성 문제를 초래하거나 투여를 제한하는 주사 부위에서 또는 이 근처에서), 제제가 혈류로 전달될 수 있는 속도의 증가, 기타 개선된 약물동력학 및/또는 약력학 성질, 및 투여 편이성이 포함된다. 마지막으로, 비-IV 비경구 투여는 많은 제제들이 입원을 요구하거나 정맥내 투여에 전형적으로 요구되는 기타 의학상 주의를 요구할 수 있는 여러 제제를 병원 밖에서 투여될 수 있도록 해준다.
혈류 조절제의 예시적인 일례에는, 항혈우병제 및 혈액 인자 결핍제(예를 들어, 항혈우병 인자(예, ADVATE™, HEMOFIL™, KOATE™-DVI, KOGENATE™-FS, RECOMBINATE™ 및 REFACTO™), 항-저해제 응고제 복합체(예, FEIBA™ VH), 안티트롬빈 III(예, THROMBATE™ III), 응고 인자 VII(예, NOVOSEVEN™), 응고 인자 VIII(예, ADVATE™, KOGENATE™-FS 및 RECOMBINATE™), 응고 인자 IX(예, BEBULIN™, BENEFIX™ 및 PROPLEX™ T), 혈장 단백질 분획(예, PLASMANATE™), 본 빌러브란트 인자)); 항혈소판제(예를 들어, 앱시시맵(예, REOPRO™), 아나그렐리드(예, AGRYLIN™), 실로스타졸(예, PLETAL™), 클로피도그렐 비설페이트(예, PLAVIX™), 디피리다몰(예, AGGRENOX™ 및 PERSANTINE™), 에포프로스테놀(예, FLOLAN™), 엡티피바티드(예, INTEGRILIN™), 티로피반(예, AGGRASTAT™)); 콜로니 자극 인자(CSF)(예를 들어, 과립구 CSF(예, NEULASTA™ 및 NEUPOGEN™) 및 과립구 마크로파지 CSF(예, LEUKINE™)); 적혈구생성 자극제(예를 들어, 에리트로포이에틴, 예를 들어, 다르베포에틴 알파(예, ARANESP™) 및 에포에틴 알파(예, EPOGEN™ 및 PROCRIT™); 지혈제 및 알부민(예를 들어, 아프로티닌(예, TRASYLOL™), 항혈우병 인자와 혈장의 조합(예, ADVATE™), 데스모프레신 아세테이트(예, DDAVP™), 및 알부민(예, BUMINATE™ 및 PLASBUMIN™)); 면역글로불린(예, BAYGAM™, CARIMUNE™NF IV, FLEBOGAMMA™, GAMIMUNE™, GAMMAGARD S/D™, GAMUNEX™, IVEEGAM™, IVEEGAM™ EN IGIV, MICRHOGAM™, RHOGAM™, PANGLOBULIN™ 및 THYMOGLOBULIN™, 및 B형 간염 면역글로불린(예, BAYHEP™ B, NABI-HB™, 및 NOVAPLUS™ NABI-HB); 트롬빈 저해제(예를 들어, 직접 트롬빈 저해제(예, ARGATROBAN™) 및 레피루딘(예, REFLUD AN™), 및 드로테코긴 알파(예, XIGRIS™); 항응고제(예를 들어, 달테파린, 에녹사페린 및 기타 헤파린(예, FRAGMIN™ 및 LOVENOX™), 와파린(예, COUMADIN™ 및 JANTOVEN™)); 등과 같은 제제가 포함된다.
추가적으로, 비경구 투여되고, sHASEGP(또는 다른 글리코사미노글리카나제)와 함께 동시 투여 및/또는 동시 제제화될 수 있는 다양한 유형의 제제의 예에는 이하 목록이 포함된다: 아세타졸아미드; 아시클로비르; 아디피오돈; 알라트로피옥사신; 알데스루킨; 알렘투주맵; 알펜타닐; 알레르기성 추출물; 알로푸리놀; 알파 1-프로테나제 저해제; 알프로스타딜; 아미포스틴; 아미카신; 아미노산; 아미노카프로산; 아미노필린; 아미트립틸린; 아모바르비탈; 암리논; 아나킨라; 진통제; 항소아마비 백신; 광견병예방 혈청; 파상풍예방 면역글로불린; 항트롬빈 III; 해독 혈청; 아르가트로반; 아르기닌; 비소; 아스코르브산; 아스파라기나제; 아테놀롤; 아트라쿠륨; 아트롭핀; 오로티오글루코즈; 아자티오프린; 아지트로마이신; 아즈트레오남; 바실러스 칼멧-구에린(BCG) 백신; 박시트라신; 박클로펜; 바실리시맵; 벤조산; 벤즈트로핀; 베타메타손; 비오틴; 비발리루딘; 블레오마이신; 보툴리즘 항독소; 브레틸륨; 부메타니드; 부피바카인; 부프레노르핀; 부술판; 부토르파놀; 칼시토닌; 칼시트리올; 칼슘; 카프레오마이신; 카보프로스트; 카르무스틴; 카르니틴; 카스포푼긴; 세파만돌; 세파졸린; 세포페라존; 세포탁심; 세포테탄; 세폭시틴; 세프타지딤; 세프티족심; 세푸록심; 클로람페니콜; 클로로프로카인; 클로로퀸; 클로로티아지드; 클로프로마진; 콘드로이틴황산; 코리오고나도트로핀 알파; 크로뮴; 시도포비르; 시메티딘; 시프로플록사신; 시사트라쿠륨; 시스플라틴; 클라드리빈; 클라불란산; 클린다마이신; 클로니딘; 코데인; 콜키신; 콜리스틴; 콜라겐; 코르티코렐린 양 트리플루테이트; 코르티코트로핀; 코신트로핀; 시아노코발라민; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 시스테인; 시타라빈; 다카르바진; 다클리시맵; 닥티노마이신; 달포프리스틴; 달테파린; 다나파로이드; 단트롤렌; 다우노루비신; 데페록사민; 데닐루킨 디프티톡스; 데스모프레신; 덱사메타손; 덱세데토미딘; 덱산테놀; 덱스라족산; 덱스트란; 디아트리조산; 디아제팜; 디아족시드; 디시클로민; 디기빈드; 디곡신; 디히드로에르고타민; 딜티아젬; 디펜히드라민; 디프테리아, 파상풍 및 백일해 백신; 디프테리아 항독소; 디피리다몰; 도부타민; 도파민; 독사쿠륨; 독사프람; 독세르칼시페롤; 독시시클린; 드로페리돌; 드로트레코긴 알파; 디필린; 에데트산; 에드로포늄; 에날라프릴랏; 에페드린; 에포프로스테놀; 에르고칼시페롤; 에르고노빈; 에르타페넴; 에리트로마이신; 에스몰롤; 에스트라디올; 에스트로제닉; 에타크린산; 에탄올아민; 에탄올; 에티오다이즈 오일; 에티드론산; 에토미데이트; 에톱포시드; 인자 VIII; 파모디틴; 페놀도팜; 펜타닐; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루마제닐; 플루오레스세인; 플루오로우라실; 플루페나진; 폴산; 여포 자극 호르몬; 포메피졸; 포미비르센; 폰다파리눅스; 포스카르넷; 포스페니토인; 풀베스트란; 푸로세미드; 가도테리돌; 가도베르세타미드; 간시클로비르; 가티플록사신; 젬투주맵 오조가미신; 젠타미신; 글루카곤; 글루코즈; 글리신; 글리코피롤레이트; 고나도렐린; 고나도트로핀 코리오닉; 헤모필러스 B 다당류; 할로페리돌; 헤민; 헤모필러스 인플루엔자 백신; 간염 백신; 허브; 히스타민; 히드랄라진; 히드로코르티손; 히드로모르폰; 히드록소코발라민; 히드록시진; 히오스시아민; 이부틸리드; 이다루비신; 이포스파미드; 이미글루세라제; 면역글로불린; 인디고 카르민; 인도메타신; 인터페론 알파-con1; 인터페론 알파-2A; 인터페론 알파-N3; 인터페론 베타-IA; 요오디드; 이오프로미드; 이오탈람산; 이옥사글리산; 이옥실란; 철 덱스트란 주사제; 이소니아지드; 이소프로테레놀; 일본 뇌염 백신; 카나마이신; 케타민; 케토롤락; 라베탈롤; 레피루딘; 루코보린; 루프롤리드; 레보부피바카인; 레보티록신; 리도카인; 린코마이신; 리네졸리드; 리오티로닌; 로라제팜; 황체형성 호르몬; 라임병 백신; 만가포디피르; 만니톨; 홍역 바이러스; 메클로레타민; 멜파란; 메닌고코칼 다당류 백신; 메페리딘; 메피바카인; 메로페넴; 메스나; 메소리다진; 메타람미놀; 메타돈; 메토카르바몰; 메토헥시탈; 메토트레세이트; 메틸도페이트; 메틸에르고노빈; 메토클로프라미드; 메토프롤롤; 메트로니다졸; 미다졸람; 미노시클린; 미트라마이신; 미토마이신; 미토잔트론; 미바쿠륨; 모루산; 목시플록사신; 이하선염 바이러스; 무로모납-CD3; 미코페놀레이트 모페틸; 나프실린; 날부핀; 날메펜; 날록손; 난드롤론; 네오스티그민; 니아신아미드; 니카르디핀; 니트로글리세린; 니트로프루시드; 노레피네프린; 오프렐베킨; 오르페나드린; 옥사실린; 옥살리플라틴; 옥시니오르폰; 옥시테트라사이클린; 옥시토신; 판쿠로늄; 판테놀; 판토텐산; 파파베린; 페가스파르가제; 페긴터페론 알파 2A; 페니실린 G; 펜타미딘; 펜타조신; 펜토바르비탈; 펜토스타틴; 퍼플루트렌; 퍼펜아진; 백일해 백신; 페노바르비탈; 펜톨아민; 페닐에프린; 페니토인; 피소스티그민; 피토나디온; 폐렴균 백신; 폴리믹신 bs; 포르피머; 프랄리독심; 프릴로카인; 프로카인아미드; 프로카인; 프로클로르페라진; 프로게스테론; 프로메타진; 프로프라놀롤; 피리도스티그민수산화물; 피리독신; 퀴니딘; 퀴누프리스틴; 광견병 면역글로불린; 광견병 백신; 라니티딘; 라스부리카제; 레미펜타닐; 리보플라빈; 리팜핀; 로피백신; 풍진 백신; 사마륨; 스코폴라민; 셀레늄; 세르모렐린; 신칼리드; 소마트렘; 스펙티노마이신; 스트렙토키나제; 스트렙토마이신; 스트렙토조신; 숙시닐콜린; 수펜타닐; 술박탐; 술파메톡사졸; 수마트립탄; 타클로리머스; 테니포시드; 테르부탈린; 테리파라티드; 테스토스테론; 파상풍 항독소; 테트라카인; 테트라데실 설페이트; 테오필린; 티아민; 티에틸페라진; 티오펜탈; 갑상선 자극 호르몬; 티카르실린; 틴자파린; 티로피반; 토브라마이신; 톨라졸린; 톨부타미드; 토포테칸; 토르세미드; 트라넥삼산; 트레프로스티닐; 트리암시놀론 아세토니드; 트리암시놀론 헥사세토니드; 트리암시놀론; 트리에틸렌티오포스포라미드(티오테파); 트리플루오페라진; 트리메톡벤자미드; 트리메토프림; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로메타민; 튜버쿨린; 장티푸스 백신; 유로폴리트롭핀; 유로키나제; 발프로산; 발루비신; 수두대상포진 면역글로불린; 바소프레신; 베큐로늄; 베라파밀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 보리코나졸; 와파린; 황열병 백신; 지도부딘; 아연; 지프라시돈 염산염; 및 전술한 것들과 연관되거나 전술한 것들과 동일 또는 유사한 분류의 제제들.
비경구 투여(근육내, 진피, 피하, 국소 도포 및 기타 비경구 경로)에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 주사용 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 및 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 및 소듐 비설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 및 포스페이트와 같은 완충액; 및 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 덱스트로스, 글리세롤 또는 붕산을 비롯한 긴장성의 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 앰퓰, 일회용 시린지 또는 유리, 플라스틱 또는 다른 적합한 재료로 만들어진 단일 또는 다중 투여량 바이알에 포함될 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 미세화되거나 다른 적합한 형태로 현탁되거나 또는 유도체화되어 보다 가용성인 활성 생성물 또는 프로드러그를 생산할 수 있다. 생성된 혼합물의 형태는 목적하는 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클에서 폴리펩티드의 가용성을 비롯한 많은 인자에 의존한다. 유효 농도는 표적 상태를 완화시키기에 충분하며 공지의 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 조성물을 조제하기 위하여, 폴리펩티드의 중량 분획은 표적 상태가 경감되거나 완화되는 유효 농도로, 선택 비히클에 용해, 현탁, 분산, 또는 다르게는 혼합된다.
sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인이 불충분한 가용성을 나타내는 경우, 폴리펩티드를 가용화시키는 방법을 이용할 수 있다. 그러한 방법은 공지되어 있으며, 디메틸설폭시드(DMSO)와 같은 공용매를 이용하거나, TWEEN® 및 Pluronic® F68과 같은 계면활성제를 이용하거나, 또는 수성 소듐 비카보네이트에 용해시키는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 상기 폴리펩티드의 프로드러그와 같은 유도체는 또한 효과적인 약학 조성물을 조제하는 데 이용될 수 있다. 안과적 사용의 경우, 상기 조성물은 안과적으로 허용가능한 담체에 조제된다. 여기서 안과적 사용의 경우, 국소 투여 또는 주사에 의한 국지적 투여가 고려된다. 서방성 제제 또한 바람직하다. 일반적으로, 조성물은 단일 투여량 투여를 위해 조제되어 단일 투여량이 유효량을 투여하도록 한다.
폴리펩티드를 비히클과 혼합 또는 첨가할 때, 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 다른 조성물일 수 있으며, 수성 혼합물, 크림, 젤, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 포옴, 에어로졸, 관주, 스프레이, 좌약, 밴드, 또는 전신, 국소 또는 국지 투여를 위해 적합한 임의의 다른 제제로 조제될 수 있다.
생성된 혼합물의 형태는 의도한 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클에서 화합물의 용해도를 비롯한 많은 인자들에 의존한다. 필요하면, 화합물의 약학적 허용 염 또는 다른 유도체가 제조된다. 근육내, 비경구 또는 동맥내 투여와 같은 국소적 내부 투여의 경우, 화합물은 바람직하게는 등장 완충된 염수와 같은 수성계 매질중의 용액 현탁액으로 조제되거나 또는 내부 투여를 위한 생체융화성 지지체 또는 생체접착제와 배합된다.
sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 치료되는 환자에서 바람직하지 않은 부작용 없이 치료적으로 유용한 효과를 나타내기에 충분한 양으로 약학적 허용 담체에 포함된다. 부작용의 수 및 정도는 화합물이 투여되는 상태에 의존한다. 예를 들어, 보다 덜한 결과의 질환을 치료할 때는 허용되지 않을 일부 독성 및 바람직하지 못한 부작용은 생명을 위협하는 질병을 치료할 때는 허용된다. 치료 용도에 효과적인 양은 물론 질병의 심각성 및 대상의 중량 및 일반적 상태 및 투여 경로에 의존할 것이다. 치료제의 국지적 투여는 일반적으로, 일부 경우에는 치료제의 국소적 농도가, 전신 투여시 안전하게 얻어질 수 있는 것보다 국소 투여 후 더 높을 수 있음에도 불구하고, 전신 투여의 임의 모드보다 더 작은 투여량을 필요로 한다.
개별 대상이 증상의 심각성에서 큰 차이를 나타내며 각 치료제가 그 독특한 치료 특성을 가질 수 있으므로, 치료에 대한 대상의 반응을 결정하고 이에 따라 투여량을 변화시키는 것은 의사에게 달려 있다. 생체외에서 사용되는 투여량은 약학 조성물의 인시추 투여에 유용한 양의 유용한 안내를 제공할 수 있으며, 동물 모델은 일부 경우에는 특정 질환의 치료를 위한 유효 투여량을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 하지만, 일반적으로, 국지적 투여의 경우, 치료제의 유효량은 체중 kg 당 약 0.1 피코그램(pg) 내지 약 1 ng 범위내의 양일 것이다. 유효량을 얻는 데 있어서 다양한 고려 사항이 공지되어 있으며 개시된다(예, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; 및 Mantyh et al., Science, 278: 275-79, 1997(신경 특이적 리간드-독소의 경막내 주사에 관련되며 모두 참고로 전체가 본원에 통합됨)).
여기서 사용하기 위한 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 제제는 경구, 직장, 국소, 흡입, 볼내(예, 혀밑), 비경구(예, 피하, 근육내, 진피내, 또는 정맥내), 경피 투여 또는 임의의 경로에 적합한 것들을 포함한다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료될 상태의 특성 및 심각도 및 사용될 특정 활성 화합물의 특성에 의존한다. 상기 제제는 적합한 양의 폴리펩티드 및/또는 다른 제제 또는 그 약학적 허용 유도체를 함유하는 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구 용액 또는 현탁액, 및 오일-물 에멀젼과 같은 단위 제형으로 인간 및 동물에게 투여하도록 제공된다. 약학적 치료적 활성 폴리펩티드 및/또는 다른 제제 및 그 유도체는 일반적으로 단위 제형 또는 다중 제형으로 조제되고 투여된다. 본원에서 사용된 것으로서 단위 투여량 형태는 인간 및 동물에 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며 공지된 대로 개별적으로 포장된다.
약학 조성물은 적합한 양의 sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인, 및 선택적으로 다른 제제 또는 그 약학적 허용 유도체를 함유하는 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구 용액 또는 현탁액, 및 오일-물 에멀젼과 같은 단위 제형으로 인간 및 동물에게 투여하도록 제공된다. 약학적 치료적 활성 화합물 및 그 유도체는 일반적으로 단위 제형 또는 다중 제형으로 조제되고 투여된다. 본원에서 사용된 것으로서 단위-투여량 형태는 인간 및 동물에 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며 공지된 대로 개별적으로 포장된다. 각 단위-투여량은 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 생산하기에 충분한 미리 정해진 양의 치료 활성 화합물을 함유한다. 단위-투여량 형태의 예는 앰퓰, 시린지 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 5 내지 50 ㎕와 같은 작은 부피내에 1 내지 5000 유닛의 sHASEGP를 갖는 안정화된 용액을 함유하는 작은 부피 제제는 점탄성 주사 후와 같은 용도를 위해 시린지에 포장될 수 있다. 단위-투여량 형태는 분획으로 또는 여러번 투여할 수 있다. 다중-투여량 형태는 분리된 단위-투여량 형태로 투여되기 위해 단일 용기에 포장된 다수의 동일한 단위-투여량 형태이다. 다중-투여량 형태의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐 병 또는 파인트 또는 갤론 병을 포함한다. 따라서, 다중 투여량 형태는 포장에서 분리되지 않은 다수의 단위 투여량이다.
상기 조성물은 sHASEGP 폴리펩티드와 같은 활성 성분과 함께, 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카르복시메틸셀룰로스와 같은 희석제; 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 활석과 같은 활택제; 및 전분, 고무 아카시아젤라틴과 같은 천연 고무, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 그 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 공지된 기타 그러한 결합제와 같은 결합제를 함유할 수 있다. 액체 약학적 투여형 조성물은 예를 들어, 전술한 활성 화합물 및 선택적인 약학적 아쥬반트를 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올, 등과 같은 담체에 용해, 분산, 또는 다르게는 혼합시킴으로써 용액 또는 현탁액을 형성하여 제조될 수 있다. 필요하면, 투여될 약학 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 또는 가용화제, pH 완충제 등, 예를 들어, 아세테이트, 소듐 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 기타 그러한 제제와 같은 비독성 보조 물질 소량을 함유할 수 있다. 그러한 제형을 제조하는 방법은 공지되어 있거나 당업자에게 명백할 것이다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975). 투여될 조성물 또는 제제는 치료되는 대상의 증상을 완화시키기에 충분한 양으로 활성 화합물을 함유한다. 예를 들어, 여기서 제공된 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 표준 안정화 제제는 EDTA, NaCl 및 CaCl2에 조제된 150 U/ml의 가용성 당단백질을 포함한다. 부가적으로, 티오메르살을 비제한적으로 포함하는 항균 또는 항진균제가 제제에 존재할 수 있다. 여기서 제공되는 다른 제제는 150 Unit/ml과 같은 유효량의 가용성 당단백질을 13 mg/ml과 같은 락토스와 함께 함유하는, EDTA, NaCl 및 CaCl2 중의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 안정화 용액 또는 동결 건조 형태이다. 150 Unit/ml과 같은 유효량의 가용성 당단백질을 13 mg/ml과 같은 락토스, 및 알부민, Pluronic® F68, TWEEN® 및/또는 기타 세제와 함께 함유하는, EDTA, NaCl 및 CaCl2 중의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 안정화 용액 또는 동결 건조 형태를 함유하는 제제 또한 여기서 제공된다. 동결건조 또는 안정화 용액으로서 여기서 제공되는 다른 제제는 EDTA, NaCl 및 CaCl2 중의, 1 내지 300 Unit/ml과 같은, sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 유효량을 함유한다.
비독성 담체로 구성되는 나머지와 함께 0.005% 내지 100%의 범위로 활성 성분을 함유하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다. 경구 투여를 위하여, 약학 조성물은 예를 들어, 결합제(예, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 칼슘 수소 포스페이트); 활택제(예, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제(예, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예, 소듐 라우릴 설페이트)와 같은 약학적 허용 부형제를 이용하여 종래의 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐 형태를 취할 수 있다. 정제는 공지의 방법에 의해 코팅될 수 있다.
sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인 또는 약학적 허용 유도체는 서방성 제제 또는 코팅과 같은, 가용성 당단백질이 신체로부터 신속하게 제거되지 않도록 하는 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 상기 조성물은 원하는 특성의 조합을 얻기 위하여, 화학요법제, 진통제, 항염증제, 항균제, 아메바살균제, 트리코모나스 제거제, 항-파킨슨제, 항-말라리아제, 항경련제, 항우울제, 및 항관절염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린 아고니스트제, 알파 차단제, 마취제, 기관지 확장제, 생물살균제, 살균제, 세균발육저지제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심혈관 약물제, 피임제, 충혈제거제, 이뇨제, 억제제, 진단제, 전해질제, 수면제, 호르몬제, 고혈당제, 근육 이완제, 근육 수축제, 안과 제제, 부교감신경 흥분 작용제, 정신 활력제, 안과용제제, 진정제, 교감신경 흥분 작용제, 신경안정제, 비뇨제, 질 제, 바이러스실멸제, 비타민제, 비스테로이드 항염증제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 약물, 프로드러그, 유기 분자 및 수면 유도제를 포함하며 이에 한정되지 않는, 질병 또는 의학 상태 하나 이상을 치료하는 데 가치있는 공지된 다른 약학적 유효제제를 포함할 수 있다. 그러한 조합 치료는 여기서 제공되는 조성물 및 치료 방법의 추가의 태양을 구성함이 이해되어야 한다.
1. 경구 투여용 조성물
경구 약학 제형은 고체, 젤 또는 액체이다. 고체 제형은 정제, 캡슐, 과립, 및 덩어리 분말이다. 경구 정제의 타입은 압착, 씹을 수 있는 로젠지 및 정제를 포함하며, 이들은 장용코팅되거나, 당 코팅되거나 또는 필름 코팅될 수 있다. 캡슐은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐일 수 있으며, 과립 및 분말은 공지된 다른 성분과 조합되어 비-비등성 또는 비등성 형태로 제공될 수 있다.
sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 약학 조성물은 액체 형태, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액이거나, 또는 사용전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 약물 생성물로 제공될 수 있다. 그러한 액체 제제는 현탁제(예, 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아); 비수용성 비히클(예, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 또는 분획화 식물성 오일); 및 방부제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 솔브산)과 같은 약학적 허용 첨가제를 이용하여 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다.
일부 구체예에서는, 제제는 고형 제형이며, 바람직하게는 캡슐 또는 정제이다. 정제, 알약, 캡슐, 트로치 등은 결합제, 희석제, 붕해제, 활택제, 글리단트, 감미제 및 향미제중 임의의 것 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다.
결합제의 예는 미세결정질 셀룰로스, 고무 트라가칸트, 글루코스 용액, 아카시아 고무풀, 젤라틴 용액, 수크로스 및 전분 페이스트를 포함한다. 활택제는 활석, 전분, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 리코포듐 및 스테아르산을 포함한다. 희석제는 예를 들어, 락토스, 수크로스, 전분, 카올린, 염, 만니톨 및 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 글리단트는 콜리이드 실리콘 디옥사이드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 붕해제는 크로스카르멜로스 소듐, 소듐 전분 글리콜레이트, 알긴산, 옥수수 전분, 감자 전분, 벤토나이트, 메틸셀룰로스, 한천 및 카르복시메틸셀룰로스를 포함한다. 착색제는 예를 들어, 승인되고 확인된 수용성 FD 및 C 염료, 그 혼합물; 및 알루미나 수화물에 현탁된 수불용성 FD 및 C 염료를 포함한다. 감미제는 수크로스, 락토스, 만니톨 및 사카린과 같은 인공 감미제 및 임의의 수의 분무 건조된 향료를 포함한다. 향미제는 과일과 같은 식물에서 추출한 천연 향 및 페퍼민트 및 메틸 살리실레이트와 같은 상쾌한 감각을 생산하는 합성 화합물 혼합물을 포함한다. 습윤제는 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 솔비탄 모노올레이트, 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌 라우르 에테르를 포함한다. 구토를 일으키는 코팅은 지방산, 지방, 왁스, 쉘락, 암모니아화된 쉘락 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함한다. 필름 코팅은 하이드록시에틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 4000 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함한다.
만일 경구 투여가 필요하면, sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 그것을 위의 산성 환경으로부터 보호하는 조성물로 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 위에서 그 통합성을 유지하고 장에서 활성 화합물을 방출하는 장용 코팅내에 조제될 수 있다. 상기 조성물은 또한 개미산 또는 다른 그러한 성분과 함께 조제될 수 있다.
투여량 단위 형태가 캡슐인 경우, 이것은 상기 타입의 물질에 더하여, 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 투여량 단위 형태는 투여량 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 다른 물질, 예를 들어, 당 및 다른 장용 제제의 코팅을 함유할 수 있다. 상기 화합물은 또한 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 스프링클, 츄잉검 등의 성분으로 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물에 더하여, 감미제로서 수크로스 및 일부 방부제, 염료 및 착색제 및 향료를 함유할 수 있다.
sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 또한 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 개미산, H2 차단제, 및 이뇨제와 같은 원하는 작용을 보충하는 물질과 혼합될 수 있다. 활성 성분은 여기서 개시된 대로 화합물 또는 그 약학적 허용 유도체이다. 최대 약 98 중량%의 고 농도의 활성 성분이 포함될 수 있다.
정제에 포함되는 약학적 허용 담체는 결합제, 활택제, 희석제, 붕해제, 착색제, 향미제, 및 습윤제이다. 장용 코팅때문에, 장용코팅된 정제는 위산의 작용에 저항하며 중성 또는 알카리성 장에서 용해 또는 붕해된다. 당코팅된 정제는 약학적 허용 물질의 다른 층들이 적용되는 압착 정제이다. 필름-코팅된 정제는 중합체 또는 다른 적합한 코팅으로 코팅된 압착 정제이다. 다중 압착 정제는 이전에 언급된 약학적 허용 물질을 이용하는 2회 이상의 압착 사이클에 의해 만들어진 압착 정제이다. 착색제는 또한 상기 투여량 형태에 이용될 수 있다. 향미제 및 감미제는 압착 정제, 당 코팅되고, 다중 압착되고 씹을 수 있는 정제로 이용된다. 향미제 및 감미제는 씹을 수 있는 정제 및 로젠지의 형성에 특히 유용하다.
액체 경구 제형은 수용액, 에멀젼, 현탁액, 비비등성 과립으로부터 재구성된 용액 및/또는 현탁액 및 비등성 과립으로부터 재구성된 비등성 제제를 포함한다. 수용액은 예를 들어, 엘릭시르 및 시럽을 포함한다. 에멀젼은 수중유 또는 유중수이다.
엘릭시르는 투명하고, 감미된, 하이드로알콜성 제제이다. 엘릭시르에 사용되는 약학적 허용 담체는 용매를 포함한다. 시럽은 당, 예를 들어, 수크로스의 농축된 수용액이며, 방부제를 함유할 수 있다. 에멀젼은 한 액체가 다른 액체에 작은 방울 형태로 분산된 2-상 시스템이다. 에멀젼에 이용되는 약학적 허용 담체는 비수성 액체, 유화제 및 방부제이다. 현탁액은 약학적 허용 현탁제 및 방부제를 이용한다. 액체 경구 제형으로 재구성될, 비등방성 과립에 이용되는 약학적 허용 물질은 희석제, 감미제 및 습윤제를 포함한다. 액체 경구 제형으로 재구성될, 등방성 과립에 사용되는 약학적 허용 물질은 유기산 및 이산화탄소 공급원을 포함한다. 착색제 및 향미제가 상기 모든 제형에서 이용된다.
용매는 글리세린, 솔비톨, 에틸 알콜 및 시럽을 포함한다. 방부제의 예는 글리세린, 메틸 및 프로필파라벤, 벤조산, 소듐 벤조에이트 및 알콜을 포함한다. 에멀젼에 이용되는 비수성 액체의 예는 미네럴 오일 및 목화씨 오일을 포함한다. 유화제의 예는 젤라틴, 아카시아, 트라가칸트, 벤토나이트, 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트와 같은 계면활성제를 포함한다. 현탁제는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 펙틴, 트라가칸트, 비굼(veegum) 및 아카시아를 포함한다. 희석제는 락토스와 수크로스를 포함한다. 감미제는 수크로스, 시럽, 글리세린 및 사카린과 같은 인공 감미제를 포함한다. 습윤제는 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 솔비탄 모노올레이트, 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르를 포함한다. 유기 첨가제는 시트르산 및 타르타르산을 포함한다. 이산화탄소의 공급원은 소듐 비카보네이트 및 소듐 카보네이트를 포함한다. 착색제는 승인된 확인 수용성 FD 및 C 염료, 및 그 혼합물 중 임의의 것을 포함한다. 향미제는 과일과 같은 식물로부터 추출된 천연 향료, 및 상쾌한 미각을 생산하는 화합물의 합성 혼합물을 포함한다.
고형 제형의 경우, 예를 들어 프로필렌 카보네이트, 식물성 오일 또는 트리글리세라이드 중의 용액 또는 현탁액은 젤라틴 캡슐에 캡슐화된다. 그러한 용액, 및 그 제제 및 캡슐화는 미국 특허 제4,328,245호, 4,409,239호, 및 4,410,545호에 개시된다. 액체 제형의 경우, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액은 충분한 양의 약학적 허용 액체 담체, 예, 물로 희석되어 투여를 위해 쉽게 측정될 수 있다.
다르게는, 액체 또는 반고체 경구 제제는 식물성 오일, 글리콜, 트리글리세라이드, 프로필렌 글리콜 에스테르(예, 프로필렌 카보네이트) 및 기타 그러한 담체에 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 용해 또는 분산시키고, 이들 용액 또는 현탁액을 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐 쉘에 캡슐화시켜 제조될 수 있다. 다른 유용한 제제는 미국 특허 Re 28,829호 및 4,358,603호에 개시된 것들을 포함한다.
볼내(혀밑) 투여에 적합한 제제는 예를 들어, 대개 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트인 향미 기제중에 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 로젠지; 및 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 기제중에 상기 화합물을 함유하는 파스틸을 포함한다.
모든 구체예에서, 정제 및 캡슐 제제는 활성 성분의 용해를 변화시키거나 지속하기 위해 공지된 대로 코팅될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이들은 페닐살리실레이트, 왁스 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트와 같은 종래의 장내 소화형 코팅으로 코팅될 수 있다.
2. 주사제, 용액 및 에멀젼
피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는, sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 비경구 투여 또한 여기서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액; 주사 전에 액체에 용해시키거나 현탁시키기에 적합한 고체 형태 또는 에멀젼으로서, 종래의 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한, 필요하면, 투여될 약학 조성물은 또한 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증가제, 및 예를 들어, 소듐 아세테이트, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로덱스트린과 같은 기타 그러한 제제와 같은 비독성 보조 물질 소량을 함유할 수 있다. 서방성 또는 지속성 방출 시스템의 이식에 의해 일정한 수준의 투여량이 유지되도록 하는 것(예, 미국 특허 제3,710,795호 참고) 또한 여기서 고려된다. 그러한 비경구 조성물에 함유된 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 퍼센티지는 그 구체적인 특성, 및 화합물의 활성 및 대상의 필요에 의존한다.
조성물의 비경구 투여는 정맥내, 피하 및 근육내 투여를 포함한다. 비경구 투여용 제제는 멸균 주사용 용액, 피하 주사용 정제를 비롯한, 사용 전에 용매 또는 멸균용액과 배합될, 동결 건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 생성물, 및 주사용 멸균 현탁액, 사용 전에 비히클과 배합될 멸균 건조 불용성 생성물 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 상기 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥내로 투여된다면, 적합한 담체는 생리학적 염수 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS), 및 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 및 그 혼합물과 같은 농후제 및 가용화제를 함유하는 용액을 포함한다.
비경구 제제에 이용되는 약학적 허용 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충액, 항산화제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 격리 또는 킬레이팅 제 및 다른 약학적 허용 물질을 포함한다.
수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장 덱스트로즈 주사제, 멸균수 주사제, 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사제를 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물성 기원의 고정 오일, 목화씨 오일, 옥수수 오일, 참깨 오일 및 땅콩 오일을 포함한다. 페놀 또는 크레졸, 수은제, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티오메르살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는 세균성장저해 또는 진균성장저해 농도의 항균제가 다중 투여량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가되어야 한다. 등장제제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 소듐 비설페이트를 포함한다. 국소 마취제는 프로케인 하이드로클로라이드를 포함한다. 현탁제 및 분산제는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리솔베이트 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이팅제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한 물 혼화성 비히클을 위해 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을, 그리고 pH 조절을 위해 소듐 하이드록사이드, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
약학적 활성 화합물의 농도는 주사가 원하는 약리 효과를 생산하기에 충분한 양을 제공하도록 조절된다. 정확한 투여량은 환자 또는 동물의 연령, 중량 및 상태에 의존한다.
단위-투여량 비경구 제제는 앰퓰, 바이알 또는 주사바늘을 갖춘 시린지에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 공지된 대로, 멸균되어야 한다.
예시적으로, 활성 화합물을 함유하는 멸균 수용액의 정맥내 또는 동맥내 주입이 효과적인 투여 방식이다. 다른 구체예는 원하는 약리 효과를 생산하기 위해 필요에 따라 주사되는 활성 물질을 함유하는 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다.
주사제는 국소 및 전신 투여를 위해 고안된다. 일반적으로 치료적 유효 투여량은 치료되는 조직에 대해 적어도 약 0.1% w/w 내지 약 90% w/w 또는 그 이상, 바람직하게는 1% w/w 초과의 활성 화합물의 농도를 함유하도록 조제된다. sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인과 같은 활성 성분은 한번에 투여되거나, 또는 일정 간격으로 투여될 여러 개의 작은 투여량으로 나누어질 수 있다. 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료될 조직에 따라 결정되며, 공지의 시험 프로토콜을 이용하거나 또는 생체내 또는 생체외 시험 데이터로부터의 외삽에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 농도 및 투여량 값은 또한 치료될 개체의 연령에 따라 변할 수 있음이 주목된다. 임의의 특정 대상의 경우, 특정 투여량 요법은 개별 필요 및 제제를 투여하고 제제의 투여를 감독하는 전문가의 판단에 따라 시간에 따라 조절되며, 여기서 개시된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 제제의 범위 또는 실시를 제한하지 않는다.
여기서 제공된 화합물은 주사에 의해, 예를 들어, 환괴 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여되기 위해 조제될 수 있다. 주사용 제제는 첨가된 방부제와 함께 단위 제형, 예를 들어, 앰퓰 또는 다중-투여량 용기에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁, 안정화 및/또는 분산제와 같은 조제 제제를 함유할 수 있다. 다르게는, 활성 성분은 적절한 비히클, 예를 들어 멸균 무-피로젠 물 또는 다른 용매를 이용하여 사용 전에 재구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 예를 들어, 안정화된 용액 또는 동결건조 형태내에 500 내지 500,000 유닛과 같은 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 비경구 제제가 여기서 제공된다.
상기 화합물은 미세화된 형태 또는 다른 적합한 형태로 현탁되거나, 또는 유도체화되어 보다 가용성인 활성 생성물을 생산하거나 프로드러그를 생산할 수 있다. 생성된 혼합물의 형태는 투여 방식 및 선택 담체 또는 비히클에서 상기 화합물의 용해도를 비롯한 많은 인자에 의존한다. 유효 농도는 상태의 증상을 완화시키기에 충분하며 실험적으로 결정될 수 있다.
3. 동결건조된 분말
용액, 에멀젼 및 기타 혼합물로 투여하기 위해 재구성될 수 있는 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 동결건조된 분말이 여기서 제공된다. 이들 제제는 또한 고체 또는 젤로서 재구성되고 조제될 수 있다.
멸균, 동결건조 분말은 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 용액의 고체 부분을 적합한 용매에 용해시키거나 상기 용액의 분액을 적합한 용매에 혼합함으로써 제조된다. 상기 용매는 분말 또는 상기 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 이용될 수 있는 부형제는 덱스트로즈, 솔비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 락토스 또는 기타 적합한 제제를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 상기 용매는 또한 시트레이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트 또는 약 중성 pH의 기타 그러한 공지의 완충액과 같은 완충액을 함유할 수 있다. 이어서 상기 용액의 멸균 여과 및 공지된 표준 조건하에서의 동결건조는 동결건조된 제제를 제공한다. 일반적으로, 멸균 여과로부터 생기는 용액은 동결건조를 위해 바이알로 나눠진다. 각 바이알은 10-1000 mg 또는 100-500 mg과 같은 단일 투여량, 또는 다중 투여량의 화합물을 함유할 수 있다.
요약하면, 동결건조 분말은 덱스트로스, 솔비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 락토스 또는 기타 적합한 제제 약 1-20%를 시트레이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트 또는 약 중성 pH의 공지된 기타 그러한 완충액과 같은 적합한 완충액에 용해시켜 제조된다. 이어서, 예를 들어 sHASEGP의 소듐 염(완충 용액 10-100 그램 당 약 1 그램의 염, 대개 약 1 gm/30 gm)과 같은 선택된 염이 약 30-35 ℃와 같은 실온 이상에서 생성된 혼합물에 첨가되며, 용해될 때까지 교반된다. 생성된 혼합물은 약 10-50%, 일반적으로 약 15-25% 정도만큼 염의 생성 농도를 감소시키기 위해, 더 많은 완충액을 첨가함으로써 희석된다. 생성된 혼합물은 입자를 제거하고 멸균성을 보장하기 위하여 멸균 여과 또는 처리되며, 동결건조를 위해 바이알에 나눠진다. 동결건조 분말은 약 4 ℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건하에서 저장될 수 있다.
주사용 물을 이용하여 상기 동결건조 분말을 재구성하면 비경구 투여에 사용하기 위한 제제가 얻어진다. 재구성의 경우, sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 동결건조 분말의 치료적 유효량을 멸균수 또는 다른 적합한 담체 밀리리터당 첨가한다. 정확한 양은 선택된 화합물에 의존하며 공지 방법으로 실험적으로 결정할 수 있다.
4. 국소 투여
국소 혼합물은 국소 및 전신 투여를 위해 개시된 대로 제조된다. 국소 투여 (때때로 본 기술분야에서 경피 투여로도 언급됨)는 전형적으로 피부, 점막 또는 기타 신체의 표면을 통한 흡수를 위해 고안된 도포를 포함한다(예, 직접적으로 피부상, 혀 밑(설하), 볼에(볼), 눈, 코 또는 귀, 또는 폐(흡입)에 투여). 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있으며 크림, 젤, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 포옴, 에어로졸, 관주, 분무, 좌약, 밴드, 피부 패치 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제제로서 조제된다.
sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인 또는 그 약학적 허용 유도체의 조성물은 흡입에 의해서와 같이, 국소 적용하기 위한 에어로졸로서 조제될 수 있다(예, 미국 특허 제 4,044,126호, 4,414,209호, 및 4,364,923호 참고하며, 이들은 염증성 질병, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을 개시함). 호흡기에 투여하기 위한 이들 제제는 락토스와 같은 불활성 담체와 조합된, 에어로졸 또는 분무기를 위한 용액 형태이거나, 또는 팽대를 위한 미세분말일 수 있다. 그러한 경우에, 제제의 입자는 대개 50 미크론 미만, 예를 들어, 10 미크론 미만의 직경을 가질 것이다.
흡입에 의한 투여의 경우, 여기서 사용하기 위한 조성물은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 및 기타 적합한 가스를 포함하며 이에 한정되지 않는 적합한 추진제를 사용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말기제의 분말 혼합물을 함유하도록 조제될 수 있다.
상기 조성물은 젤, 크림 및 로션의 형태로, 눈과 같은 점막 및 피부에 국소 적용, 그리고 눈에의 적용 또는 수조내 또는 척추관안 적용과 같은 국지 또는 국소 적용을 위해 조제될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달 및 눈 또는 점막에의 투여, 또는 흡입 치료를 위해 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약학적 허용 부형제와의 조합의 비강 용액 또한 투여될 수 있다.
예를 들어, 피부 또는 눈에의 국소 적용에 적합한 제제는 연고, 크림, 로션, 페이스트, 젤, 스프레이, 에어로졸 및 오일로 조제된다. 이용될 수 있는 담체는 바세린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 및 이들 둘 이상의 조합을 포함한다. 국소 제제는 추가로 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리/하이드록시알킬,(메트)아크릴레이트 또는 폴리(메트)아크릴아미드를 포함하며 이에 한정되지 않는, 0.05 내지 15 중량%의 농후제를 함유할 수 있다. 국소 제제는 종종 적하에 의해 또는 연고로서 결막주머니내로 적용된다. 이것은 또한 눈, 얼굴 공동, 및 외이도의 관주 또는 윤활을 위해 이용될 수 있다. 액체 상태의 국소 제제는 또한 스트립, 콘택트 렌즈 등의 형태의 친수성 삼차원 중합체 매트릭스에 존재할 수 있으며 이로부터 활성 성분이 방출된다. 이것은 또한 앞쪽 안실 및 다른 장소내로 주사될 수 있다. 예를 들어, 30 내지 150,000 Units/mg의 비활성을 갖는 가용성 당단백질 1 내지 5000 유닛과 같은, 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 안정화 용액을 5 내지 50 ㎕와 같은 작은 부피에 함유하는 제제가 점탄성 주사 후 안내 사용을 위해 제공된다. 다른 예로, 30 내지 150,000 Units/mg의 비활성을 갖는 가용성 당단백질 50 내지 5000 유닛과 같은, 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인의 안정화 용액을 0.05 내지 10 ㎕와 같은 부피에 함유하는 제제가 공막을 둘러싸는 공막외 공간으로 주사되는 서브-테논(Sub-Tenon's) 주사 경로에 의한 안내 조직으로의 1 이상의 약리학적 제제의 전달을 강화시키기 위해 제공된다.
이들 용액, 특히 안과적 사용을 목적으로 하는 것들은 적절한 염과 함께, 약 5-7 pH의 0.01% - 10% 등장 용액으로 조제될 수 있다.
전리요법과 동시 적용
전리요법에 견딜 수 있는 국부 투여 및 기타 조직 투여의 경우, 1 이상의 sHASEGP(다른 약리학 제제 또는 기타 제제와 잠재적으로 동시 제제화되거나 동시 투여됨)를 조직으로의 침투를 더 촉진하기 위해 전리요법과 조합하여 사용할 수 있다. 이 경우, 전리요법과 sHASEGP는, 전리요법이 조직이나 신체 내 기타 위치로 sHASEGP의 전달을 촉진시킬 수 있고, 이렇게 전달된 sHASEGP가 효소는 물론 조직 내에 존재하는 동시 제제화되거나 동시 투여된 분자 또는 다른 분자의 침투를 촉진하도록(즉, 확산을 용이하게 하는 채널을 효소적으로 개방시키고, 벌크 유체 흐름을 촉진하여 약리학과 같은 용질의 이류성 수송을 촉진함으로써) 서로 작용할 수 있다.
5. 다른 투여 경로를 위한 조성물
국소 적용, 경피 패치, 및 직장 투여와 같은 다른 투여 경로 또한 여기서 고려된다.
예를 들어, 직장 투여를 위한 약학적 제형은 전신 효과를 위한 직장 좌약, 캡슐 및 정제이다. 본원에서 사용된 것으로서 직장 좌약은 직장 내로 삽입하기 위한 고체 덩어리로서 체온에서 용융하거나 연화되어 하나 이상의 약학적 또는 치료학적 활성 성분을 방출한다. 직장 좌약에 이용되는 약학적 허용 물질은 기제 또는 비히클 및 융점을 상승시키기 위한 제제이다. 기제의 예는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, 카보왁스(폴리옥시에틸렌 글리콜) 및 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세리드의 적절한 혼합물을 포함한다. 다양한 기제의 조합을 이용할 수 있다. 좌약의 융점을 상승시키기 위한 제제는 경랍 및 밀랍을 포함한다. 직장 좌약은 압착법 또는 주형법에 의해 제조될 수 있다. 직장 좌약의 전형적인 중량은 약 2 내지 3 gm이다.
직장 투여를 위한 정제 및 캡슐은 경구 투여용 제제와 동일한 약학적 허용 물질 및 동일한 방법을 이용하여 제조된다.
경피 투여에 적합한 제제는 지속적인 기간동안 수용체의 표피와 밀접하게 접촉하도록 적응된 별도의 패치로 제공될 수 있다. 그러한 패치는 예를 들어, 활성 화합물에 대하여 0.1 내지 0.2M 농도의 선택적으로 완충된 수용액으로서 활성 화합물을 함유한다. 경피 투여에 적합한 제제는 또한 전리요법(예, Pharmaceutical Research 3(6): 318(1986))에 의해 전달될 수 있으며, 일반적으로 활성 화합물의 선택적으로 완충된 수용액 형태를 갖는다.
약학 조성물은 또한 조절된 방출 수단 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다(예, 미국 특허 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제3,630,200호; 제3,845,770호; 제3,847,770호; 제3,916,899호; 제4,008,719호; 제4,687,610호; 제4,769,027호; 제5,059,595호; 제5,073,543호; 제5,120,548호; 제5,354,566호; 제5,591, 767호; 제5,639,476호; 제5,674,533호 및 제5,733,566호 참고). 활성 화합물 또는 약학적 허용 유도체는 서방성 제제 또는 코팅과 같이, 화합물이 신체로부터 신속하게 제거되지 않도록 하는 담체와 함께 제조될 수 있다.
여기서 제공되는 조성물 및 방법의 한 구체예에서, 치료제는 서방성 전달 비히클로 국소적으로 투여되어, 예를 들어, 콜로이드 분산 시스템 또는 중합체 안정화 결정에 캡슐화되어 투여된다. 유용한 콜로이드 분산 시스템은 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 지질계 시스템을 포함하며, 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함한다. 예를 들어, 콜로이드 분산 시스템은 리포좀 또는 미소구체일 수 있다. 리포좀은 주사되거나 이식될 때 서방성 전달 비히클로 유용한 인공 막 소낭이다. 지질-중합체 접합체 및 리포좀의 일부 예는 참고로 전체가 본원에 통합되는 미국 특허 제5,631,018호에 개시된다. 서방성 전달 비히클의 다른 예는 생분해성 하이드로젤 매트릭스(미국 특허, 제5,041,292호), 수지상 중합체 접합체(미국 특허 제5,714,166호), 및 다소낭 리포좀(캘리포니아주 샌디애고에 소재하는 디포텍, Depofoam™)(미국 특허 제 5,723,147호 및 제 5,766,627호)이다. 국소 주사(예, 피하 조직내로)를 위해 치료제를 캡슐화하는 데 적합한 미소구체의 한 타입은 D. Fletcher, Anesth. Anal. 84: 90-94,(1997)에 개시된 폴리(D,L)락티드 미소구체이다. 예를 들어, 1 내지 5000 Units/ml과 같은 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 서방성 제제는 미용제 및 척수 손상 치료를 비롯한 다양한 용도를 위해 또는 다양한 상태의 치료에 이용될 수 있다.
바람직한 혈액 농도는 혈장 농도에 의해 확인하면서 활성 제제를 연속 주입하여 유지할 수 있다. 치료 의사는 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 손상으로 인해 언제 어떻게 치료를 종료, 중지 또는 더 낮은 투여량으로 조절할 것인지 알 것이다. 역으로, 치료 의사는 또한 임상 반응이 적절하지 않다면(독성 부작용 배제) 언제 그리고 어떻게 치료를 더 높은 수준으로 조절할 것인지 알 것이다.
sHASEGP 폴리펩티드 및/또는 그 억제자 단독 또는 치료 유효 제제와 같은 다른 제제와의 조합의 효능 및/또는 독성은 또한 공지 방법에 의해 평가될 수 있다(예, O & Apos; Reilly, Investigational New Drugs 15 : 5-13(1997)).
6. 제조 물품
sHASEGP 폴리펩티드 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인 또는 전술한 제제 중 어느 것을 함유하는 조성물은 포장 재료, 포장 재료내의 여기서 고려되는 질병 또는 질환의 치료에 효과적인 여기서 제공된 화합물 또는 그 적합한 유도체, 및 상기 화합물 또는 그 적합한 유도체가 여기서 고려되는 질병 또는 질환을 치료하기 위한 것임을 나타내는 라벨을 함유하는 제조 물품으로 포장될 수 있다. 라벨은 선택적으로 치료가 보장되는 질환을 포함할 수 있다.
여기서 제공되는 제조 물품은 포장 재료를 함유한다. 약학 제품을 포장하는 데 사용하기 위한 포장 재료는 공지되어 있다(예, 미국 특허 제 5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,352호). 약학 포장 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 시린지, 병, 및 선택된 제제 및 의도하는 투여 방식 및 치료에 적합한 포장 재료를 비제한적으로 포함한다. 여기서 제공된 화합물 및 조성물의 광범위한 제제는, HCV 감염이 증상 또는 원인의 매개자 또는 기여자로 작용하는 임의의 질환을 위한 다양한 치료에서처럼 고려된다.
투여 안내서와 함께 조성물 및/또는 조합을 함유하는 키트가 또한 여기서 제공된다. 상기 키트는 추가로 복합체를 주사하기 위한, 대개 멸균 형태로 포장된 주사바늘 또는 시린지, 및/또는 포장된 알콜 패드를 포함할 수 있다. 안내서는 임상의 또는 환자에 의한 활성 제제의 투여를 위해 선택적으로 포함된다. 예를 들어, 1 내지 5000 유닛의 가용성 당단백질과 같은 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 5 내지 50 ㎕ 부피에 갖는 작은 부피 시린지를 함유하며, 선택적으로 점탄물을 함유하는 두번째 시린지를 함유하는 키트가 여기서 제공된다. 1 내지 500 유닛의 가용성 당단백질과 같은, 유효량의 sHASEGP 또는 그 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을 함유하는 작은 부피 시린지, 및 약물, 소분자, 단백질 또는 핵산과 같은 두번째 활성 성분의 치료량을 함유하는 작은 부피 시린지를 함유하는 키트가 또한 여기서 제공된다.
K. 동물 모델
마우스와 쥐를 비롯한 설치류, 소, 닭, 돼지, 염소, 양, 고릴라를 비롯한 원숭이, 및 기타 영장류와 같은 형질전환 동물 모델 및 동물이 여기서 제공된다. 특히, sHASEGP 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산을 함유하는 형질전환 비인간 동물, 또는 내인성 유전자의 프로모터 영역 또는 다른 조절 영역을 대체하거나 변화시켜 상기 폴리펩티드의 발현이 변경된 형질전환 동물이 제공된다. 그러한 동물은, 상동성 또는 다른 재조합 사건을 통하여, 강한 프로모터하에서의 발현에 의해서와 같이, 과다-발현되거나 잘못-발현될 수 있는 외인성 sHASEGP 유전자와 내인성 핵산 사이의 재조합을 촉진함으로써 생산될 수 있다.
형질전환 동물은 미세주사, 리포펙션 및 기타 유전자 전달 모드를 비롯한 임의의 공지의 방법을 이용하여 핵산을 배아줄기 세포와 같은, 생식세포 또는 체세포내로 도입함으로써 생산될 수 있다. 일반적으로 핵산은 배아 줄기 세포(ES)와 같은 세포내로 도입되고, 이어서 ES 세포를 배반포내로 주입하고 상기 배반포를 수양모내로 이식하며, 이어서 형질전환 동물이 탄생한다. 일반적으로, 동물의 염색체내로 이종성 핵산 분자를 도입하는 것은 이종성 sHASEGP-코딩 핵산과 내인성 핵산 사이의 재조합에 의해 발생한다. 이종성 핵산은 특이적 염색체로 표적화될 수 있다. 일부 경우에는, 넉아웃 동물이 생산될 수 있다. 그러한 동물은 그 염색체내의 sHASEGP 폴리펩티드 유전자와 생물학적으로 비활성이 된(대개 이종성 서열, 예, 항생제 내성 유전자의 삽입에 의해) 외인성 sHASEGP 폴리펩티드 유전자 사이의 상동성 재조합을 촉진함으로써 처음에 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 이 상동성 재조합은 배아-유래 줄기(ES) 세포를 삽입 불활성화된 sHASEGP 폴리펩티드 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 상동성 재조합이 일어나고, 이어서 ES 세포를 배반포에 주입하고 배반포를 수양모내로 이식하여 키메라 동물("넉아웃 동물")을 탄생시킴으로써 실시되며, 상기 키메라 동물에서는 sHASEGP 폴리펩티드 유전자는 불활성화된다(Capecchi, Science 244:1288-1292(1989) 참고). 키메라 동물은 추가의 넉아웃 동물을 생산하기 위해 이용될 수 있는 동종접합성 넉아웃 동물을 생산하기 위해 교배될 수 있다. 넉아웃 동물은 마우스, 햄스터, 양, 돼지, 소, 및 기타 비인간 포유류를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 넉아웃 마우스가 생산된다. 생성된 동물은 sHASEGP 폴리펩티드를 부족하게 발현하는, 암과 같은 특정 질병의 모델로서 작용할 수 있다. 그러한 넉아웃 동물은 예를 들어, 그러한 질병 또는 질환을 치료 또는 방지하는 능력에 대해 분자를 스크린하거나 시험하기 위해 그러한 질병의 동물 모델로서 이용될 수 있다.
sHASEGP 폴리펩티드를 과다 발현하는 것을 비롯한, 다른 타입의 형질전환 동물 또한 생산될 수 있다. 그러한 동물은 정상 유전자가 돌연변이, 과다발현 형태, 또는 기타 형태와 같은 변이체에 의해 대체된 동물인 "넉인" 동물을 포함한다. 예를 들어, 설치류의 내인성 유전자와 같은 한 종의 유전자는 인간과 같은 다른 종의 유전자에 의해 대체될 수 있다. 동물은 또한 다수의 통합 사건을 갖는 동물을 비롯하여, 염색체내의 다른 부위내로의 비-상동성 재조합에 의해 생산될 수 있다.
1세대 형질전환 동물의 생산 후, 키메라 동물은 과다 발현 또는 잘못 발현된 sHASEGP 폴리펩티드를 갖는 추가의 동물을 생산하기 위해 교배될 수 있다. 그러한 동물은 마우스, 햄스터, 양, 돼지, 소, 및 기타 비인간 포유류를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 생성된 동물은 sHASEGP 폴리펩티드의 과다 발현 또는 잘못된 발현을 나타내는, 암과 같은 특정 질병의 모델로서 작용할 수 있다. 그러한 동물은 예를 들어, 그러한 질병 또는 질환을 치료 또는 방지하는 능력에 대해 분자를 스크린하거나 시험하기 위해 그러한 질병의 동물 모델로서 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 과다 발현 또는 잘못 발현된 sHASEGP 폴리펩티드를 갖는 마우스가 생산된다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 포함되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
L. sHASEGP의 치료적 용도
도살장으로부터 얻은 천연 히알루로니다제 효소가 40년 넘게 임상 효소 제제의 주된 공급원이었다. 소 및 양의 고환이 이 재료의 주요 공급원이다. 하지만 이들 임상적 효소 제제는 매우 조악하며, 30-100,000 Units/mg 사이의 공지의 비활성에 기초하여 0.5-5% 순도 범위의 제제로 판매된다. 따라서, 그들의 도살장 기원과 함께 그들의 순도 부족은 이들이 인간에게 면역원성이게 하고 야콥 크루츠펠트 병 및 기타 소 및 양 병원균의 잠재적 공급원이 되게 한다. 소 및 양 히알루로니다제 제제에 대한 아나필락시스 반응이 발생하는 것으로 알려져 있다.
소 또는 박테리아 유래 히알루로니다제는 과다한 히알루론산과 관련된 질병의 치료 및 생리학적 유체 및/또는 치료제의 순환 개선에 사용되어 왔다. 예를 들어, 소 히알루로니다제는 안과 수술을 위해 눈앞쪽, 눈뒤쪽 및 테논(TENON) 아래 블록에서 마취제와 동시 주사될 수 있다. 더욱이, 그 부재하에서는 외과적 합병증이 증가한다(Brown SM et al., J Cataract Refract Surg. 1999 Sep; 25(9): 1245-9). 소 히알루로니다제는 또한 빈카 알카로이드와 같은 괴사 물질의 정맥옆 주사로부터의 국소적 괴사에 해독제로 이용된다(Few, B. J.(1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12,23-26). 소 고환 히알루로니다제는 또한 신경절 낭의 치료에 유용하다(Paul et al. J Hand Surg 1997 Apr; 22(2): 219-21). 히알루로니다제는 또한 수액피하주사에서 유체의 피하 전달을 촉진하기 위해 이용될 수 있다(Berger EY, Am Geriatr Soc 1984 Mar; 32(3): 199-203). 히알루로니다제는 또한 점탄물을 수용하는 백내장 환자 및 녹내장 환자의 눈에서 안내 압력을 감소시키기 위하여 이용되어 왔다(1989년 4월 11일에 발행된 미국 특허 제4,820,516호).
소 또는 박테리아 유래 히알루로니다제는 또한 화학요법제의 활성 및/또는 종양의 화학요법에의 접근성을 개선하기 위한 "확산제"로 이용되었다(Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32: 173, abstract no. 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45: H. 9). 히알루로니다제를 이용한 조합 화학요법은 방광암(Horn et al., 1985, J. Surg. Oncol. 28: 304-307), 편평세포 암종(Kohno et al., 94, J. Cancer Res. Oncol. 120: 293-297), 유방암(Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118: 591-596), 및 위장암(Scheithauer et al., 1988, Anticancer Res. 8: 391-396)을 비롯한 다양한 암의 치료에 효과적이다. 히알루로니다제는 뇌암(신경교종)의 치료에서 단독 치료제로서 효과적이다(1988년 4월 7일에 공개된 PCT 공개 출원 W088/02261호). 히알루로니다제의 투여는 또한 췌장, 위, 결장, 난소, 및 유방의 화학요법-내성 종양의 반응성을 유도한다(Baumgartner et al., 1988, Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al., 1986, Proc.Amer. Assoc. Cancer Res. 27: 390). 불행히도, 그러한 히알루로니다제의 오염물 및 비 인간 특성은 아나필락시스 반응을 야기한다.
간접적인 항암 효과에 더하여, 소 유래 히알루로니다제는 직접적인 항발암 효과를 갖는다. 히알루로니다제는 마우스에 이식된 종양의 성장을 방지하며(De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51: 657-660) 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다(Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23: 105-109; Haberman et al.,1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D. C., 22: 105, abstract no. 415).
특히 화학요법에서 종래의 화학요법제와 함께 또는 단독 화학요법제로서, 치료제로서 소-유래 히알루로니다제의 가치를 고려할 때, 인간 기원의 히알루로니다제의 실질적으로 순수한 제제가 당업계에 필요하다. 또한, 상업적으로 중요한 양의 효소를 제공하기 위해 히알루로니다제를 만드는 효율적이고, 비용 절감적인 방법이 필요하다. 본 발명은 이들 문제를 해결한다.
히알루론산은 세포외 매트릭스의 필수 성분이다. 히알루론산은 포유류의 연결 조직에서 발견되며 눈의 유리체의 주요 구성원이다. 연결 조직에서, 히알루론산과 관련된 수화의 물은 조직간에 공간을 형성하여 세포 이동 및 증식을 위한 환경을 형성한다. 히알루론산은 신속한 발생, 재생, 회복, 배발생, 배아 발생, 상처 치유, 혈관신생, 및 종양 생성을 비롯한 세포 이동성과 관련된 생물학적 현상에서 중요 역할을 한다(Toole, 1991, Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay(ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al., 1992, Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al., 1993, FASEB J. 7: 1233-1241). 또한, 히알루론산 농도는 종양 공격성과 상관있다(Ozello et al., 1960, Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al., 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al., 1983, Cancer Res. 43: 1347-1354).
척수 손상 후, 별아교세포에 의해 신경교성 반흔이 생성되며 이는 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸(CSPG)을 함유한다. CSPG는 축삭 성장의 억제에서 중요 역할을 한다(Levine, 1994; Powell et al., 1997). 예를 들어, 태아 발생동안, CSPG는 축삭을 격퇴시키며 신경 세포 부착을 억제한다. CSPG는 또한 경계 형성에 중요한 역할을 한다(Snow et al., 1990,1992; Powell 및 Geller, 1999). 또한 CSPG의 발현은 CNS의 손상 후에 증가한다(Mckeon et al., 1991; Davies et al.,1997).
연구결과 CSPG의 억제 효과가 주로 콘드로이친 설페이트(CS) 글리코스아미노글리칸(GAG) 당쇄에 기인함이 밝혀졌다(Snow et al., 1990; Cole 및 McCable, 1991; Geisert 및 Bidanset, 1993). 이것은 경막내 투여될 때 박테리아 콘드로이티나제의 투여가 축삭 재생을 촉진한다는 발견에 의해 지지된다. 더욱이, 전기생리학적 실험은 재생된 CST 축삭이 기능적 관련성을 확립하는 것으로 결정하였다 (Bradbury, et al 2002). 그들의 직접적인 억제 효과에 더하여, CSPG는 또한 세포 부착 분자 또는 향신경 인자와 상호작용하여 신경돌기 과성장에 영향을 줄 수도 있다(Roberts et al., 1988; Ruoslahti 및 Yamaguchi, 1991; Milev et al., 1994). 재조합 포유류 히알루로니다제는 따라서 아교 상처에서 CSPG의 억제를 역전시키고 손상 후 축삭 재생을 촉진시키는 데 유용하다.
신경교성 반흔에서 CSPG를 충분히 분해시키는 데 필요한 sHASEGP의 양은 변할 것이다. 일부 경우에는, 반흔에서 CSPG를 제거하기 위하여, 경막내 전달에 의해 10-5000 유닛의 sHASEGP를 반복 투여하는 것이 필요할 것이다. 다른 경우에는, 서방성 제제의 사용을 통한 sHASEGP의 지연된 방출이 바람직할 수도 있다. 다르게는, sHASEGP를 코딩하는 유전자 치료 벡터의 투여가 CSPG의 소거를 개선하는데 효과적일 수도 있다.
sHASEGP는 또한 화학핵소체용해술로 알려진 과정에서 원반탈출증의 치료에 유용할 수 있다. 콘드로이티나제 ABC, 및 sHASEGP와 유사한 기질을 절단하는 효소는 허리 척수에서 원반내 압력의 감소를 유도할 수 있다(Sasaki et al., 2001, Ishikawa et al., 1999). 세 가지 타입의 디스크 손상이 있다. 돌출 디스크는 그대로이지만 튀어나온 것이다. 압출된 디스크에서는, 섬유성 래퍼가 찢어지며 NP가 흘러나오지만, 여전히 디스크에 연결되어 있다. 격리된 디스크에서는, NP 단편이 디스크로부터 느슨하게 부숴지며 척추 관에서 자유상태이다. 화학핵소체용해술은 돌출 다스크 및 압출 디스크에 효과적이지만, 격리 디스크 손상에는 효과적이지 않다. 미국에서는, 화학핵소체용해술은 허리(하부)척수에서의 사용에만 승인된다. 다른 국가에서는, 경부(상부 척추) 헤르니아 치료에 성공적으로 이용되었다. 따라서 화학핵소체용해술은 디스크 압력 감소가 바람직할 경우 디스크 수술에 대한 보수적 대안이다.
당단백질상의 탄수화물쇄의 정확한 조성 및 구조는, 간 및 소포체 시스템의 세포가 특정 탄수화물을 갖는 순환 당단백질을 결합하여 내부화시킬 수 있으므로, 그 혈청 수명에 직접 영향을 줄 수 있다. 간세포는 말단(즉, 폴리펩티드에 대하여 글리칸의 가장 마지막) Gal 잔기를 갖는 올리고당 쇄를 인식하는 수용체를 그 표면에 가지며, 대식세포는 말단 Man 또는 GlcNAc 잔기를 위한 수용체를 함유하며, 간세포와 림프구는 노출된 푸코스 잔기를 위한 수용체를 갖는다. 하지만, 시알산-특이적 수용체는 발견되지 않았다. 일반적으로, 올리고당의 공간적 배열에 다소 의존함에도 불구하고, 간 및 소포체 시스템에서 세포 표면 수용체에 의해 인식되는 노출된 당 잔기의 수가 많을수록, 당단백질은 더 신속하게 혈청으로부터 제거될 것이다. 하지만, 시알산-특이적 수용체의 부재때문에, 시알산으로 종결되거나 "캡핑"된 모든 가지를 갖는 올리고당은 그들이 부착되는 단백질의 제거를 촉진하지 않을 것이다.
당단백질상의 올리고당 쇄의 존재 및 특성은 또한 간 및 소포체 세포상의 당-특이적 수용체에 의한 그 인식에 더하여 중요한 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 당단백질로부터 탄수화물의 제거는 대개 그 용해도를 감소시킬 것이며, 또한 정확한 폴리펩티드 접힘 패턴을 불안정화시키고/거나 프로테아제-민감성 부위를 탈보호시켜 단백질 분해에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다. 유사한 이유로, 단백질의 글리코실화 상태는 면역 시스템에 의한 그 인식에 영향을 줄 수 있다.
sHASEGP는 동결보존, 및 세포질내 정자 주사(ICSI)와 같은 기타 생체외 수정 기법에 앞서 난자를 둘러싼 난구 세포를 제거하기 위해 이용될 수 있다. 히알루로니다제는 완충된 염 용액중의 10-200 U/ml 사이로 수집된 난모세포에 첨가될 수 있다. 난모세포는 흡입에 의해, 방출된 난구 세포로부터 분리되고 히알루로니다제가 없는 배지로 여러번 세척된다. 이어서 난자를 동결보존 또는 IVF 기법을 위해 처리할 수 있다.
sHASEGP는 또한 화학요법제가 고형 종량내로 더욱 효과적으로 침투하도록 하는 데 유용하다. sHASEGP는 항암제와 함께 종양내로 주사되거나, 또는 파종 암 또는 종양 도달이 어려운 경우에는 정맥내로 주사될 수 있다. 항암제는 화학요법제, 항체, 펩티드, 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA일 수 있다. 부가적으로, sHASEGP는 다문화성 약물 내성을 획득한, 이전에는 화학불응성인 종양에서 감작화를 위한 사이클링 풀내로 종양 세포를 보내기 위해 이용될 수 있다(St Croix et al Cancer Lett 1998 Sep 11; 131(1) : 35-44). sHASEGP는 또한 모노클로날 항체, 사이토카인 및 기타 약물과 같은 생물물질을 글리코스아미노글리칸을 축적하는 종양으로 전달하는 것을 개선하기 위해 유용하다. 많은 종양은 글리코스아미노글리칸의 대사에 관련된 유전자가 결실되어, 국소화된 축적이 항종양 제제 및 면역 시스템이 종양 덩어리에 도달하는 것을 막을 수 있다.
sHASEGP는 또한 종래의 화학요법에 내성인 종양의 민감성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 한 구체예에서, sHASEGP는 종양 부위 주위에서의 확산을 증가시키고(예, 화학요법 인자의 순환 증가, 종양 부위 및 그 주변에서 화학요법제의 순환 및/또는 집중의 촉진), 종양 세포 이동성을 억제하기 위해(예, HA 분해에 의해) 및/또는 어팝토시스의 종양 세포 역치를 낮추기 위해(즉, 종양 세포를 아노이키스(anoikis)상태, 세포 사멸을 촉진할 수 있는, 바람직하게는 아노이키스의 세포의 프로그램된 세포 사멸을 우선적으로 촉진할 수 있는 화학요법제 또는 다른 제제의 작용에 종양 세포가 더 민감하도록 하는 상태로 가져감) 효과적인 양으로 LuCa-1 결함과 관련된 종양을 갖는 환자에 투여된다. 본원에서 사용된 것으로서 화학요법제는 종양 세포 성장의 억제를 촉진하는, 그리고 바람직하게는 종양 세포 사멸을 우선적으로 촉진하는, 합성(예, 시스플라틴) 및 천연(예, 종양 괴사 인자 IF)의 모든 분자를 포함하는 것을 의미한다.
특히 관심의 대상은 비-암성(정상) 세포에 대하여 히알루로니다제 활성이 검출불가능하게 감소된 전이성 및 비전이성 암, 특히 전이성 암의 치료를 위한 sHASEGP의 용도이다. sHASEGP는 다양한 암, 특히 침입성 종양 중 어느 것의 치료에서 화학요법제(단독 또는 다른 화학요법제와 함께)로 이용될 수 있다. 예를 들어, sHASEGP는 작은 폐세포 암종, 편평 폐세포 암종 및 유방, 난소, 머리 및 목의 암, 또는 히알루로니다제의 농도 감소 또는 결함이 있는 LuCa-1(hpHAse) 유전자(예, 적절한 hpHAse 수준의 발현을 제공하지 않거나 적절한 수준의 히알루로니다제 활성을 제공하지 않는 결함있는 hpHAse를 코딩하는 LuCa-1 유전자)와 관련된 임의의 다른 암, 또는 히알루로난 대사 감소와 관련된 다른 결함의 치료에 이용될 수 있다. sHASEGP는 분해가 일어나는데 세포 참여를 필요로 하지 않으므로, 결함이 있는 HA 대사와 관련된 암의 치료에 바람직하다.
투여에 적합한 구체적인 투여량은 전술한 인자에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다(예, Harrison's Principles of Internal Medicine,1 lth Ed.,1987 참고). 또한, 인간에서 적절한 투여량을 위한 추정은 생체외에서 sHASEGP의 효소 활성의 정도의 결정 및/또는 동물 연구에서 효과적인 투여량으로부터 외삽될 수도 있다. 예를 들어, 70-300 TRU 히알루로니다제는 중복 면역 부전증 마우스에서 종양 부하를 감소시키는 데 효과적이다. 이 정보를 이용하여, 평균 70 kg 인간에서 해당 투여량은 약 250,000-1,200,000 TRU 히알루로니다제 범위일 것이다. 인간 환자에게 투여된 sHASEGP의 양은 대개 1 TRU 내지 5,000,000 TRU의 효소 활성의 범위이며, 바람직하게는 약 1,000 TRU 내지 2,500,000 TRU 사이이며, 더욱 바람직하게는 약 100,000 TRU 내지 1,500,000 TRU 사이이며, 정상적으로는 약 250,000 TRU 내지 1,200,000 TRU 사이이며, 약 725,000 TRU가 평균 처방 투여량을 나타낸다.
한 구체예에서, sHASEGP는 약 150,000 TRU/cc의 농도로 sHASEGP를 함유하는 0.15M 염수 용액으로 조제된다. 제제는 이어서 15,000 TRU/환자 체중 kg으로 정맥내 주사된다. 다르게는, 효소 제제는 또한 피하로 주사되어 히알루로니다제가 종양 부위에서 관류하도록 한다. 바람직한 구체예에서는, sHASEGP는 종양 주변에 또는 종양 덩어리내로 주사된다. 다른 바람직한 구체예에서는, sHASEGP는 리포좀으로 조제되고 정맥내로 또는 LuCa-1(hpHAse) 유전자의 결함과 관련된 암종 세포의 부위 또는 그 근처에서 주사되어 전달된다. sHASEGP의 정맥내 주사는 종양 부위에서 sHASEGP를 야기한다. 더욱이, 과시알화된 sHASEGP는 sHASEGP상의 말단 시알산이 소포체 시스템에 의해 순환계로부터 효소가 제거되는 것을 방지하므로 비경구 투여에 바람직하다. 비시알화된 소 및 양 히알루로니다제와 과 시알화된 sHASEGP를 비교한 결과 실질적으로 더 바람직한 약력학이 얻어짐이 밝혀진다.
유전자 치료의 촉진
대부분의 유전자 전달 비히클의 생체내 효능은 생체외에서 발견된 효능에 일치하지 않는다. 글리코스아미노글리칸은 많은 세포 타입내로의 DNA 및 바이러스 벡터의 전달 및 확산을 방해할 수 있다. 그러한 세포외 매트릭스 물질의 농도는 상기 과정을 상당히 방해할 수 있다. Dubensky et al., (Proc Natl Acad Sci U S A 1984 Dec; 81 (23): 7529-33)는 콜라게나제와 배합될 때 히알루로니다제가 생체내에서 DNA의 형질도입을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 아데노 관련 바이러스는 또한 히알루로니다제 매개 유전자 치료에 민감함이 입증되었다 (Favre et al, (Gene Ther 2000 Aug; 7 (16): 1417-20)).
본 발명자들은 세포외 매트릭스에서 한정된 크기의 채널이 sHASEGP로 개방된다고 본원에서 단정하였다. 이들 기공은 직경이 약 200-500 nm보다 큰 물질의 확산을 증가시키지 않는다. 하지만, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 DNA 복합체와 같은 작은 분자는 sHASEGP 매개 확산에 민감하다. sHASEGP가 통상적으로는, 관심대상이 되는 대부분의 치료제 및 기타 약리학적 제제 (단백질 및 핵산과 같은 거대분자 뿐만 아니라 유전자 치료 벡터와 같은 거대분자 복합체를 포함함)의 이동을 허용하기에 실질적으로 충분히 큰 채널을 개방시키는 작용을 하지만, 통상적으로는 세포의 전위 및 이동을 촉진할 만큼 크지는 않다는 사실은, 예를 들어 다양한 질병을 치료, 예방 및/또는 진단하는 것에 있어서 특히 유익한 적용을 제공한다.
다르게는, 바이러스는 예를 들어 표적 조직내에서 그들의 복제 및 확산을 촉진하기 위해 sHASEGP 유전자로 무장될 수 있다. 표적 조직은 바이러스가 종양내에서 선택적 복제를 할 수 있는 암성 조직일 수 있다. 바이러스는 또한 바이러스가 조직 특이적 프로모터하에서 선택적으로 복제하는 비용해성 바이러스일 수 있다. 바이러스가 복제할 때, 바이러스 유전자와 sHASEGP의 동시발현은 생체내에서 바이러스의 확산을 촉진할 것이다.
다르게는 대상 핵산 및 sHASEGP는 동시에 또는 연속적으로 사용되거나 또는 시간에 걸쳐 시차를 두고 사용될 수 있다. 동시란 공동투여를 말한다. 이 경우에, 이들 두 필수 성분은 투여되기 전에 혼합되어 조성물을 형성하거나, 또는 세포 또는 숙주 유기체에 동시에 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조합 생성물의 어느 성분이 먼저 투여되는지에 상관없이, 이들을 연속적으로 투여하는 것이 가능하며, 즉, 하나에 이어 다른 하나를 투여하는 것이 가능하다. 마지막으로, 시간에 따라 엇갈리거나 간헐적이며, 규칙적이거나 규칙적이지 않은 간격으로 중단하고 다시 시작하는 투여 방식을 사용하는 것이 가능하다. 두 성분의 투여 경로 및 부위는 상이할 수 있음을 주목한다. 한 가지 특히 바람직한 구체예에 따라, sHASEGP는 핵산 앞에 투여되며, 두 성분의 투여 경로는 바람직하게는 유사하다. 주사 사이의 시간 간격은 중요하지 않으며 당업자에 의해 정의될 수 있다. 10분 내지 72시간의 간격, 유익하게는 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 24시간, 매우 바람직하게는 1 내지 6시간의 간격을 권장할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조합 생성물은 또한 핵산 투여를 개선하기 위한 분자 하나 이상과 배합될 수 있다. 상기 분자는 핵산에 보호 효과(세포에서의 분해와 관련한 보호)를 갖거나, 숙주 세포에서 그 침투 또는 발현을 개선하거나(용해성 펩티드, 핵 국소화 시그널 등), 한 가지 특정 세포 타입이 표적화되도록 하거나(세포 표면 단백질을 인식하는 리간드 또는 항체 등), 또는 치료 효과를 지속시키는 분자(면역억제제 등)일 수 있다. 조합 생성물은 또한 형질감염을 촉진하는 제제(단백질 등)와 배합될 수 있다.
본 발명에 따른 조합 생성물은 국소 또는 비경구 투여 또는 분해 경로에 의한 투여에 대한 관점으로 제조될 수 있다. 특히 언급될 수 있는 경로는 위장관내, 피하, 심장내, 정맥내, 복강내, 윤활막내, 종양내, 허파내, 비강내 및 기관내 경로이며, 매우 특히 근육내 경로이다. 투여는 특정 시간 간격 후에 한번 또는 여러번 반복되는 투여량 또는 단일 투여량으로서, 공지된 임의의 수단(주사, 경구 경로, 에어로졸, 점안, 등)에 의해 이루어질 수 있다. 투여 경로는 대상 유전자가 전달되고 질병이 치료되도록 조절될 수 있다. 제제는 약학적 허용 비히클(부형제, 아쥬반트 등)을 포함할 수 있다. 세포외 매트릭스 및 대상 핵산의 무조직화로 이끄는 물질은 바람직하게는 약학적 용도에 적합하며 고장성, 저장성 또는 등장성일 수 있는 완충액에 용해된다. 다양한 완충액이 가능하다. 예시적으로 언급될 수 있는 것들은 생리학적 염수용액(0.9% NaCl), 비생리학적 염수 용액(1.8% NaCl), 헤르페스-링거 용액, 락테이트-링거 용액, Tris-HCl에 기초한 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5 내지 8, 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 내지 8, 1 mM MgCl2), 포스페이트 완충액(크렙스 포스페이트 H2O 완충액), 당(글루코스, 수크로스, 트레할로즈 등) 용액, 또는 간단히 물이다.
수액 피하 주사(hypodermoclysis)
유체를 피하로 주입하는 수액 피하 주사는 다소 내지 온건하게 탈수된 성인 환자, 특히 노인들에게 적합한 유용하고 용이한 수화 기법이다. 이 방법은 안전한 것으로 간주되며 어떤 심각한 합병증도 일으키지 않는다. 가장 빈번한 역효과는 국소 마사지 또는 전신성 이뇨에 의해 치료될 수 있는 온화한 피하 부종이다. 대략 3 L가 두 개의 별도 부위에서 24시간내에 제공될 수 있다. 일반적인 주입 부위는 가슴, 복부, 허벅지 및 상부 팔이다. 바람직한 용액은 정상 염수이지만, 절반-정상 염수, 염수를 가진 글루코스 또는 5% 글루코스와 같은 다른 용액 또한 이용될 수 있다. 포타슘 클로라이드는 필요하면 용액 백에 첨가될 수 있다. 추가적으로, 다른 약물이 유사한 경로로 전달될 수 있다. 인간 sHASEGP는 유체 흡수를 증가시키고 전체적인 투여 속도를 증가시키기 위하여 첨가될 수 있다. 인간 sHASEGP는 소 효소와 달리 면역원성일 가능성이 낮다는 점에서, 도살장에서 얻은 효소에 비하여 반복적인 피하 수액 주사에 바람직하다. 이것은 가족 구성원 또는 간호원에 의해 가정에서 투여될 수도 있으며, 기법은 모든 가정 의학 의사에게 익숙하다.
외래 환자의 경우, 피하 수액 주사 부위는 복부, 상부 가슴, 유방 위, 갈비사이 공간위 및 어깨 영역을 포함한다. 누워만 있는 환자의 경우, 바람직한 부위는 허벅지, 복부 및 상부 팔의 바깥 부분이다. 1 ~ 4일 후, 주사바늘 및 튜브를 바꿔줘야 하며, 주입 세트는 합병증없이 더 오랜 기간동안 그 자리에 유지될 수 있다. 첫번째 아침 주입 전에 피하 부위에서 150 U의 sHASEGP를 주고, 하루 세 번 한 시간 또는 두 시간에 걸쳐 500 mL 환괴의 투여가 이루어질 수 있다.
치료 주사의 용이화
경피로 주사된 많은 분자 (예를 들어, 피부를 꽂아서 분자를 피하 층으로 투입하는데 사용하는 니들 또는 다른 장치를 사용함으로써)는 천천히 그리고 매우 낮은 효율로 순환계에 도달한다. 몇 가지 인자가 피하로(SC) 또는 근육내로(IM) 주사되는 분자의 약동학 및 약역학을 조절한다. 일반적으로, 더 큰 분자는 순환계로의 능동 수송없이 더 느리게 그리고 덜 효율적으로 순환계에 도달한다. 피하 생체이용성은 SC 대 정맥내 투여를 위한 곡선 아래 영역의 비(AUCSC/AUC정맥내)를 계산함으로써 결정된다. 두번째 인자는 피하에서 분자의 격리에서 역할을 할 수도 있는 매트릭스 분자에 대한 친화성 및 전하이다. 만일 이들 물질이 국소적으로 분해되면 이들은 그들의 원하는 표적에 절대 도달하지 못하며 따라서 표적 기관에 대해 감소된 전체적인 전신적 생체이용성을 나타낸다.
큰 단백질은 정상적으로 정맥내로 주어져 의약이 혈류에서 직접 이용가능하도록 한다. 하지만, 의약이 피하로, 근육내로, 또는 표피내로 제공될 수 있으면, 이들 투여 형태가 환자에게 있어 다루기가 더 용이하므로 유익할 것이다. 특히, 의약이 전체 수명동안 규칙적으로 섭취되어야 하고 치료가 일찍, 환자가 아동일 때 시작된다면 그러하다. 하지만, 170 내지 300 kDa의 응집 인자 VII와 같은, 매우 크고 불안정한 분자를 갖는 의약은 흡수가 충분하지 않고 분해가 심하므로, 피하로, 근육내로 또는 표피내로 주어지면 매우 낮은 생체이용성을 갖는다.
피하로 투여된 많은 생물질의 생체이용성을 증가시킬 필요에 더하여, 보다 신속한 약동학 또한 비상 의약의 경우에 매우 중요하다. 많은 환자에서 정맥내 접근에 도달하는 데 필요한 시간은, 전신성으로 투여될 때 신속하게 작용할 약물이 이용되는 것을 막을 수 있다. 일부 경우에, 정맥내 접근에 도달하지 못하면 피하 주사가 이루어지고 이로 인해 표적 기관에 도달하는 데 있어서 추가의 지연이 일어난다. 따라서, 정맥내 접근을 이루기 위해 필요한 시간을 감수하는 것보다는, 첫번째 피하 약물의 보다 신속한 이용가능성이 치료로서 유용할 것이다. 정맥내 뿐만 아니라 피하로 전달될 수 있는 분자의 예는 에피네프린, 아트로핀, 나르칸, 리그노케인, 및 덱스트로스를 포함한다.
본 발명의 추가 효과는 주사 부위에서 용액의 압력 및 부피와 관련된 고통 및 이환없이 등가의 또는 더 큰 부피의 용액을 ID, SC 또는 IM으로 전달하는 능력이다.
예를 들어 (한정함이 없이), 하나 이상의 sHASEGP와 조합함으로써(예를 들어, 생물제제의 투여 전, 투여와 동시에, 투여 후에 sHASEGP를 함께 제형화하거나 함께 투여함으로써) 증강될 수 있는 다수의 생물제제가 있으며, 이것으로는 예를 들어 하기가 포함된다: 아브식스맙 (Abciximab (예를 들어, REOPROTM), 아달리무맙(Adalimumab) (예를 들어, HUMIRATM), 아갈시다제 베타(Agalsidase beta) (예를 들어, FABRAZYMETM), 알데스류킨(Aldesleukin) (예를 들어, PROLEUKINTM), 알레파셉트(Alefacept) (예를 들어, AMEVIVETM), 알렘투주맙(Alemtuzumab) (예를 들어, CAMPATHTM), 알테플라제(Alteplase) (예를 들어, ACTIVASETM), 알테플라제(Alteplase) (예를 들어, CATHFLO ACTIVASETM), 아나킨라(Anakinra) (예를 들어, KINERETTM), 아르시투모맙(Arcitumomab) (예를 들어, CEA-ScanTM), 아스파라기나제(Asparaginase) (예를 들어, ELSPARTM), 바실릭시맙(Basiliximab) (예를 들어, SIMULECTTM), 베카프레르민(Becaplermin) (예를 들어, REGRANEXTM), 베바시주맙 (bevacizumab) (예를 들어, AVASTINTM), 보툴리눔 톡신 A형(Botulinum Toxin Type A) (예를 들어, BOTOXTM), 보툴리눔 톡신 B형 (예를 들어, MYOBLOCTM), 카프로맙 펜데티드(Capromab Pendetide) (예를 들어, PROSTASCINTTM), 세툭시맙(Cetuximab) (예를 들어, ERBITUXTM), 다슬리주맙(Daclizumab) (예를 들어, ZENAPAXTM), 다르베포에틴 알파스(Darbepoetin alfas) (예를 들어, ARANESPTM), 데니류킨 디프티톡스(Denileukin diftitox) (예를 들어, ONTAKTM), 도르나제 알파스(Dornase alfas) (예를 들어, PULMOZYMETM), 드로트레코긴 알파스(Drotrecogin alfas) (예를 들어, XIGRISTM), 에팔리주맙(Efalizumab) (예를 들어, RAPTIVATM), 에포에틴 알파스(Epoetin alfas) (예를 들어, EPOGENTM), 에타네르셉트(Etanercept) (예를 들어, ENBRELTM), 필그라스팀(Filgrastim) (예를 들어, NEUPOGENTM), 이브리투모맙(Ibritumomab)/티욱세탄(Tiuxetan) (예를 들어, ZEVALINTM), 임시로맙 펜테타트(Imciromab Pentetate) (예를 들어, MYOSCINTTM), 인플릭시맙(Infliximab) (예를 들어, REMICADETM), 인터페론 알파-2에이에스(인터페론 알파-2as) (예를 들어, ROFERON-ATM), 인터페론 알파콘-1에스 (예를 들어, INFERGENTM), 인터페론 알파-엔3에스 (예를 들어, ALFERON NTM), 인터페론 베타-1에이에스 (예를 들어, AVONEXTM, BETASERONTM), 인터페론 베타-1에이에스 (예를 들어, REBIFTM), 인터페론 감마-1비에스 (예를 들어, ACTIMMUNETM), 라로니다제(Laronidase) (예를 들어, ALDURAZYMETM), 노페투모맙(Nofetumomab) (예를 들어, VERLUMATM), 오말리주맙(Omalizumab) (예를 들어, XOLAIRTM), 오프렐베킨(Oprelvekin) (예를 들어, NEUMEGATM), 팔리비주맙(Palivizumab) (예를 들어, SYNAGISTM), 페그필그라스팀(Pegfilgrastim) (예를 들어, NEULASTATM), 페그-인터페론 알파-2에이에스 (예를 들어, PEGASYSTM), 페그인터페론 알파-2비에스 (예를 들어, PEG-INTRONTM), 라스부리카제(Rasburicase) (예를 들어, ELITEKTM), 레테플라제(Reteplase) (예를 들어, RETAVASETM), 리툭시맙(Rituximab) (예를 들어, RITUXANTM), 테네크테플라제(Tenecteplase) (예를 들어, TNKaseTM), 토시투모맙(Tositumomab) 및 요오딘 1-131에스(Iodine 1-131s) (예를 들어, BEXXARTM), 트라스투주맙(Trastuzumab) (예를 들어, HERCEPTINTM), 우로키나제(Urokinase) (예를 들어, ABBOKINASETM).
유리체 출혈
유리체 절제술의 실시동안 망막의 추가 탈착 또는 찢어짐을 야기할 가능성을 최소화하는 노력으로, 미국 특허 제5,292,509호(Hageman)는 유리체의 제거에 앞서, 일부 무-프로테아제 글리코스아미노글리칸 효소를 유리체내로 주입하여, 유리체가 망막으로부터 탈결합되거나 "변연부망막해리"되도록 할 것을 제안하였다. 그러한 유리체의 변연부망막해리 또는 탈결합은 유리체가 제거될 때 추가의 망막 찢어짐 또는 탈착이 일어날 가능성을 최소화하기 위한 것으로 알려져 있다. 이러한 유리체 변연부망막해리를 야기하기 위해 이용될 수 있는 특정 프로테아제가 없는 글리코스아미노글리카나제 효소의 예는 콘드로이티나제 ABC, 콘드로이티나제 AC, 콘드로이티나제 B, 콘드로이친-4-설파타제, 콘드로이친 6-설파타제, 히알루로니다제 및 베타-글루쿠로니다제를 포함한다.
히알루로니다제 효소가 미국 특허 제5,292,509호(Hageman)에 개시된 유리체절제술 보조 용례를 비롯하여, 다양한 안과적 용례에 사용가능한 것으로 알려져 있지만, 공개된 연구들은 히알루로니다제 효소 자체가 망막 및/또는 눈의 다른 해부학적 구조에 독성일 수 있음을 나타낸다. The Safety of Intravitreal Hyaluronidase; Gottleib, J. L.;Antoszyk, A. N.,Hatchell, D. L. and Soloupis, P., Invest Ophthalmol Vis Sci 31: 11,2345-52 (1990)를 참고한다. 더욱이, 히알루로니다제의 불순한 도살장 제제의 사용은 포도막염 또는 눈의 염증을 야기할 수 있다. 따라서 인간 sHASEGP의 사용이 그 증가된 효능, 순도, 및 반복 투여 후 면역원성 반응 및 항체 매개 중화를 야기할 수 있는 동물 기원의 부족면에서 바람직하다. 다른 구체예에서는, sHASEGP의 PEG화 형태가 눈에 주사될 수 있다. 그러한 PEG화 sHASEGP는 그렇게 빨리 유리체로부터 제거되지 않으며 보다 오랜 기간동안 유리체에서 그 활성을 유지한다.
일부 히알루로니다제 제제의 안과적 독성이 다른 연구자들에 의해 확인되었으며, 이들은 그러한 히알루로니다제 제제를 동물 독성 모델에서, 눈의 실험적으로 유도된 혈관신생을 야기하기 위한 독성 자극제로 사용할 것을 제안하였다 (An Experimental Model of Preretinal 신혈관 형성 in the Rabbit; Antoszyk, A. N., Gottleib, J. L., Casey, R. C., Hatchell, D. L. and Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32: 1,46-51 (1991) 참고). 수은계 오염물 및 소 또는 박테리아 유래된 오염물이 없는 매우 정제된 sHASEGP의 사용은 안내 수술에 바람직하다. 더욱이, 재조합 인간 sHASEGP는 소 병원균이 없는 순도 및 면역원성 위험의 감소면에서 도살장 유래 제제에 비하여 바람직하다. 가장 바람직한 것은 PEG화된 sHASEGP이다.
따라서 인간 sHASEGP를 이용하는 효소적 방법이 포유류 눈의 안과 질환 치료를 위해 제공된다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 sHASEGP는 유리체내에서 그 거주를 지연시키고 국소적 섭취를 방지하기 위해 PEG화된다. 혈관신생의 방지, 및 망막에 독성인 물질을 유리체로부터 제거하는 속도의 증가는, 눈에 독성 손상을 야기함없이, 치료된 눈의 유리체액을 액화시키는 데 효과적인 양의 히알루로니다제를 투여하여 이루어진다. 유리체액의 액화는 유리체 실로부터 액체 교환의 속도를 증가시킨다. 이러한 교환 증가는 그 존재가 안과적 및 망막 손상을 야기하는 물질 및 상태를 제거한다.
sHASEGP의 미용적 용도
히알루로니다제가 결합수의 보유를 일으키는 기본 물질의 긴 점성다당류 쇄를 탈중합화시키고, 모세관 압착에 의해, 대사 폐기물을 제거하는 유기 액체의 확산을 늦추는 효과를 가짐이 알려져 있다. 지방 세포의 지방 과부하와 관련된 폐기물 및 물의 그러한 보유는 전통적인 "돼지가죽" 부종 또는 "오렌지껍질" 부종을 구성한다. 따라서 이러한 탈중합화는 점성다당류의 긴 쇄를 보다 짧은 쇄로 자르고, 따라서 결합수 및 폐기물의 제거, 정맥 및 림프 순환의 회복 및 국소 부종의 제거를 일으킨다.
따라서 피하 투여에 의한 sHASEGP의 사용이 소위 셀룰라이트의 축적에 관련된 글리코스아미노글리칸의 제거에 바람직하며 림프 유동을 촉진시키는 데 바람직하다. 인간 sHASEGP는 도살장 유래 단백질의 염증성 성분 없이 상기 글리코스아미노글리칸을 제거할 수 있으며 순도가 높고 면역원성일 가능성이 낮다는 점에서 셀룰라이트의 치료에 바람직하다. sHASEGP는 반복적 피하 주사를 통해, 연고 또는 크림 형태로 경피 전달을 통해, 또는 주사가능한 서방성 제제의 사용을 통해 투여되어 글리코스아미노글리칸의 연속적인 분해를 촉진하고 그들의 회복을 방지할 수 있다.
기관 이식
히알루로난은 부분적으로 그 분자 크기에 관련되는 몇가지 생물학적 효과를 갖는다 (West, D. C., Kumar, S. Exp. Cell. Res. 183, 179-196,1989). 기관에서 히알루로난의 함량은 그 기관의 다른 염증 상태에서 증가한다. 따라서, 히알루로난의 농도 증가는 허파꽈리염(Nettelbladt 0 et al, Am Rev Resp Dis 1989; 139: 759-762) 및 심근경색(Waldenstrom et al, J Clin Invest 1991; 88 (5):1622-1628)과 같은 염증-면역학적 손상을 특징으로 하는 다른 기관으로부터의 조직에서 나타났다. 다른 예는 신장 (Ha'llgren et al, J Exp Med 1990a; 171: 2063-2076; Wells et al, Transplantation 1990; 50: 240-243), 소장 (Wallander et al, Transplant Int 1993; 6: 133-137) 또는 심장(Hallgren et al, J Clin Invest 1990b; 85 : 668-673) 이식 후 이종이식 거부; 또는 바이러스 기원의 심근 염증(Waldenstrdm et al, Eur J Clin Invest 1993; 23:277-282)이다.
기관의 이식과 관련된 사이질 부종의 발생은 이식 수술 분야에서 심각한 문제를 구성한다. 이식편의 25%가 기능이 일시적으로 상실될 정도로 팽윤할 것이다. 더욱이, 2-3% 경우에서는, 팽윤이 신장의 파괴를 야기하여 다량 출혈을 일으킨다.
sHASEGP는 기관 이식체에서 축적된 글리코스아미노글리칸을 분해시키기 위해 이용될 수 있다. 그러한 글리코스아미노글리칸의 제거는 이식편으로부터 물의 제거 및 따라서 기관 기능을 촉진한다. 500-10,000 Units/kg 범위의 투여량이 그러한 사이질 압력을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
뇌에서 글리코스아미노글리칸의 병리학적 축적
히알루로난 농도는 많은 뇌척수 병리적 상태에서 증가된다. 뇌척수 히알루로난의 농도는 보통 성인에서 200 ㎍/L 미만이다 (Laurent et al,ActaNeurol Scand 1996 Sep; 94 (3): 194-206). 이들 농도는 뇌막염, 척추관 협착증, 두부 외상 및 뇌경색과 같은 질병에서 8,000 ㎍/L 이상으로 증가할 수 있다. 따라서 sHASEGP의 투여 (예를 들어, sHASEGP. PEG화된 sHASEGP, 또는 초(super)시알화된 sHASEGP의 경막내 전달 또는 전신성 주사에 의한 것)는 위태롭게 상승된 농도의 기질을 분해하기 위해 이용될 수 있다.
뇌에서 효과적인 림프관의 결핍은 또한 두부 외상에 따른 생명을 위협하는 부종을 야기할 수 있다. 히알루로난 축적은 HA 신타제에 의한 합성 증가, 및 분해 감소의 결과이다. 히알루로난의 축적은 초기에는, 손상된 조직에서 물 함량을 증가시키는 유익한 목적을 제공하여 백혈구의 혈관외 유출을 촉진할 수 있지만, 계속하여 축적되면 치명적일 수 있다. 따라서 두부 외상으로 고통받는 환자에게 인간 sHASEGP를 투여하면 조직 히알루로난 축적 및 이와 연관된 물을 제거할 수 있다. 인간 sHASEGP를, 단락을 통해 경막내로 투여하거나, 또는 대안적으로는 sHASEGP. PEG화된 sHASEGP, 또는 초(super)시알화된 sHASEGP (바람직하게는, 이의 인간형)를 정맥내로 투여하여 뇌 조직에 도달할 수 있다.
졸중에서 일어나는 것과 같은 뇌의 재관류 및 허혈에 이어, 히알루로난 함량은 통상적으로는, HA 신타제의 발현 증가 및 대사 감소로 인해 극적으로 증가한다. 이온 펌프의 불능 및 사이질(interstitium)로의 혈장의 누수는 유체의 체류를 야기하며, 이것은 림프관에 의해 적절히 제거되지 않으면 조직 괴사를 야기한다. 일부 그룹은 혈관 투과성을 차단함으로써 허혈 재관류에 이은 사이질 유체 축적을 방지하기 위한 시도를 하였다. 하지만, 일단 유체가 혈관외 유출되면, 혈관 투과성 방지는 부종의 용해를 막고 상태를 악화시킬 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 인간 sHASEGP를 (단락을 통해) 경막내로 투여하거나, 또는 sHASEGP. PEG화된 sHASEGP, 또는 초(super)시알화된 sHASEGP (바람직하게는, 이의 인간형)를 정맥내로 투여하여 뇌 조직에 도달할 수 있다.
인간 sHASEGP는 또한 뇌 종양과 관련된, 특히 다형성 아교모세포종과 관련된 부종의 치료에 이용될 수 있다. 뇌 종양과 관련된 부종은 종양에 이웃한 뇌의 비암종 부분에서 히알루로난의 축적으로 생긴다. 히알루로난 축적 부위에 과량의 히알루로니다제의 투여(예, 정맥내 주사 또는 단락을 통해)는 이들 부위에서 과다한 히알루로난을 분해시켜 그러한 종양과 관련된 부종을 경감시킬 수 있다. 따라서, 히알루로니다제는 종양 덩어리의 감소 및 종양 성장 및/또는 전이의 억제에서 뇌 종양의 치료에서 성공적일 뿐만아니라, 악성 종양과 관련된 부종을 완화시키는 데도 유용하다. 인간 sHASEGP는 부종을 치료하기 위해 소 고환 히알루로니다제를 투여하기 위한 것과 유사한 방식으로 부종의 치료를 위해 투여될 수 있다 (예, Sa Earp Arq. Braz. Med. 44: 217- 20).
특정한 적용 또는 작용 메커니즘에 구속됨이 없이, sHASEGP는 잠재적으로는, 하기의 것 중 하나 이상에 의해 허혈성 또는 출혈성 졸중 및/또는 기타 CNS 손상 상태를 완화할 수 있다: (i) 두개내 압력의 감소에 의한 손상 조직의 산소공급을 증가시킴; (ii) 독성 대사산물의 재흡수 및 응혈의 용해를 용이하게 함; (iii) 경색 또는 출혈 구역으로 백혈구 혈관외 유출을 억제함 (예를 들어, CD44에 대한 수용체인 히알루로난의 제거에 의해); (iv) 손상된 조직의 신경 재생의 촉진; 또는 (v) 대뇌 혈관형성을 증가시킴.
심장혈관 질병에서 글리코스아미노글리칸 축적의 치료
실험적 심근경색 후 동물 모델에서 히알루로니다제의 투여는 경색 크기를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 (Maclean, et. al Science 1976 Oct 8; 194 (4261): 199-200). 소 히알루로니다제가 동물에서 경색 크기를 감소시키는 제안된 기작은 허혈성 재관류 후 발생하는 히알루로난 축적을 감소시키는 것이다. 경색 크기의 감소는 림프 배출 증가 및 조직 산소섭취 증가 및 심장근육 물 함량의 감소로부터 발생하는 것으로 생각된다. 경색 크기 감소가 동물 모델에서는 얻어질 수 있었지만, 그 효과는 인간에서 보다 큰 임상 연구에서는 실현되지 않았다. 소 고환 히알루로니다제는 동물 및 인간에서 약 3분의 주목할만한 짧은 혈청 반감기를 보유한다 (Wolf, et. al., J Pharmacol Exp Ther 1982 Aug; 222 (2): 331-7.).
이러한 짧은 반감기는 세망내피계의 스캐빈저 수용체에 의해 쉽게 인식되는 말단 만노스 잔기로 인한 것이다. 작은 동물은 더 작은 혈관 베드로 인해 히알루로니다제로부터 효과를 얻을 수 있지만, 반감기가 증가된 효소가 필요하다. 초 시알화된 sHASEGP는 스캐빈저 수용체가 없는 시알화로 인한 보다 우호적인 약동학을 보유한다. 100-200,000 유닛/kg 범위의 투여량의 초 시알화된 sHASEGP를 이용하여 허혈 재관류 후의 과다한 히알루로난의 용해를 촉진하고 경색 크기를 감소시킬 수 있다.
과시알화된 sHASEGP는 또한 동맥경화증으로부터의 관상동맥 플라크를 제한하기 위해 이용될 수 있다. 그러한 플라크는 글리코스아미노글리칸을 축적하며 대식세포 및 포말 세포 부착을 매개한다 (Kolodgie et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002 Oct 1; 22 (10): 1642-8). 초 시알화된 sHASEGP의 투여는 플라크 형성을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 히알루로니다제의 반복 투여가 100-100,000 유닛/kg 투여량에서 고려될 때, 면역원성 위험이 낮고 반감기가 증가된 인간 재조합 단백질을 이용하면 우수한 플라크 감소를 야기할 것이다.
말초 조직 괴사의 치료
조직 괴사는 정맥 기능부전으로 인한 많은 질병에서 발생한다. 충분한 산소섭취의 부족은 조직의 재성장에 대한 주요 장애 중 하나이다. 동맥내 히알루로니다제 치료는 말초 동맥 폐색 질병을 가진 환자에서 임상 상태를 크게 개선시키는 것으로 입증되었다 (Elder et. al, Lancet (1980) 648-649). sHASEGP는 10-200,000 유닛의 투여량으로 일주일에 3-5회 동맥내 주사될 수 있다.
포유동물 조직으로의, 마취제 및 기타 약리학적 제제의 송달 증강
도살장-유래 히알루로니다제는 안과 수술에 앞서 국소 마취에서 눈둘레 차단마취를 위해 흔히 이용된다. 상기 효소의 존재는 추가 차단 마취의 필요를 막으며 아키네시아 (akinesia)(눈 운동의 상실)의 개시를 가속시킨다. 눈둘레 및 테논 하부 차단 마취는 안과 수술을 위한 히알루로니다제의 가장 일반적인 용례이다. WydaseTM의 중단 이후, 복시 및 눈꺼풀처짐 증가의 보고가 눈둘레 차단 마취를 이용하여 보고되었다 (Brown et al J 백내장 RefractSurg 1999; 25: 1245-9).
와이어스(Wyeth)의 WydaseTM의 중단으로, 소 고환-유래 히알루로니다제 재료는 이제 혼합제조 약국에 의해 공급된다. 하지만, 즉시 혼합제조된 멸균 생성물을 이용하는 것과 관련하여 몇가지 염려가 있다. http://www.ashp.org/shortage/ hyaluronidase.cfm?cfid=11944667&CFToken=9426953-ref#ref. 혼합제조 제제는 FDA-허가 제품이 아니다. 따라서, FDA는 제조 과정의 일관성 또는 품질에 대해 컨트롤할 수 없다.
10-500 유닛의 sHASEGP는 직접 5 ml의 2% 리도케인(자일로케인), 5 ml의 0.5% 부피바케인(마르케인) 및 선택적으로 에피네프린 1:200,000과 혼합될 수 있다. sHASEGP는 아키네시아의 개시를 증가시키고 추가 차단 마취의 필요를 제거하기 위해 이용될 수 있다. sHASEGP는 또한 눈꺼풀성형술 및 얼굴 주름제거에서 성형 수술을 위한 아키네시아에 이상적이다. sHASEGP는 또한 항 염증제를 확산시키고 조직 팽윤을 감소시키기 위해 그러한 수술과정 후 이용될 수 있다.
sHASEGP는 또한 주사 과정동안 불편함을 방지하기 위하여 비카보네이트와 같은 완충 용액과 혼합될 수 있다. sHASEGP는 또한 주사에 필요한 물질의 총 부피를 감소시키고 조직의 팽윤으로 인한 고통을 감소시키기 위해 열상(laceration)용 마취제와 혼합될 수 있다.
약리학적 제제 및 기타 제제의 분산을 촉진하기 위한 sHASEGP의 용도
본원에 기재한 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은, 마취제 및 기타 약리학적 제제 (예컨대, 본원에 언급한 다양한 부류의 약학적 유효 제제의 구성원)를 다양한 임의의 생체내 포유동물 조직으로 송달하는 것을 촉진 또는 증강하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, sHASEGP 또는 이의 가용성 인간 히알루로니다제 도메인은 확산을 용이하게 하는데 사용될 수 있고, 이에 따라, 마취제, 항감염제 및 소염제와 같은 소형 분자 약리학적 제제 뿐만 아니라, 단백질 (예를 들어, 효소, 모노클로날 항체 등이 포함됨), 핵산 (데옥시리보핵산 (예를 들어, 유전자 및 안티센스 분자), 및 리보핵산 (RNA 간섭(RNAi)의 분자 등)이 포함됨), 및 상기와 같은 성분의 조합물 (핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 지지계 분자 등의 조합물이 포함됨)을 함유할 수 있는 거대분자 조성물과 같은 더 큰 분자 약리학적 제제를 송달하는 것을 촉진한다. 예를 들어, 직경이 약 10 nm 미만 내지 약 500 nm, 특히 약 20 내지 200 nm인 분자 및 거대분자 복합체는, 세포사이 공간이 본원에 기재하고 묘사한 바와 같이 sHASEGP에 이미 노출되었거나 동시적으로 노출될 경우, 세포사이 공간을 통한 송달에 있어서 현저한 개선을 나타낼 것이다.
특정한 작용 메커니즘 이론에 한정됨이 없이, 본 발명의 sHASEGP는, 포유동물 세포를 둘러싼 세포외 매트릭스 내의 글리코스아미노글리칸을 가수분해함으로써, 노출된 세포외 매트릭스 내로의 분자 확산 또는 다른 이동을 용이하게 하는 기공형 통로 또는 채널을 발생시키는 것에 의해 주로 작용하고; 또한, 세포외 매트릭스 중 그러한 일부의 투과는, 콜라겐의 아치형 네트워크와 같은 세포외 매트릭스의 다른 거대분자 성분에 의해 또한 방해되지 않을 정도로 큰 것인 분자의 확산 또는 "확산(spreading)"에 가장 큰 영향을 갖는다고 여겨진다. 소정의 sHASEGP 또는 이의 가용성 인간 히알루로니다제 도메인, 특히 조직 환경으로 얻어질 수 있는 퍼짐 효과의 정도는, 시간과 농도의 범위에서 sHASEGP 또는 이의 도메인으로 예비처리 또는 부수적 처리를 하거나 하지 않은 시험 조직 내에서 다양한 크기의 검출가능한 시험 분자 (예컨대, 플루오레세인 표지된 또는 다른 것으로 표지된 비드)의 확산에 대해 sHASEGP 또는 이의 도메인의 효과를 평가함으로써, 본원에 묘사한 바와 같이 손쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 마우스의 측부 피부 내로 피하 주사된 재조합 rHuPH20의 경우, 플루오레세인 표지된 비드 확산 시험 (본원에서 예시한 바와 같은)은, 확산 효과가 직경이 약 500 nm 미만인 입자에서 가장 컸다는 것을 나타냈다.
또한, 더욱 큰 거대분자 (예를 들어, 500 nm 이상의 비드)는 그의 큰 크기에 의해서 뿐만 아니라, 세포사이 콜라겐의 스트랜드로 형성된 네트워크와 같은 세포외 매트릭스 내의 상대적으로 더욱 많은 개방 다른 네트워크와의 잠재적인 상호작용에 의해서, 확산에 방해를 받을 수 있다고 여겨진다. 또한, 기재한 동물 유래의 히알루로니다제와 달리, 현재로서 바람직한 본 발명의 sHASEGP은, 혈관외 유출을 촉진하는 제제 또는 오염화 제제, 예컨대 콜라게나제 (이는 더욱 큰 채널을 개방시킬 수 있음) 또는 면역 반응을 자극시킬 수 있는 다른 오염물질을 함유하지 않는다. 더욱 큰 기공 또는 채널이 바람직한 특정 적용에 있어서는, sHASEGP 또는 이의 가용성 인간 히알루로니다제 도메인을, 콜라게나제와 같은 다른 매트릭스-변성 효소의 바람직하게는 상대적으로 순수한 형태와 조합하여, 더욱 큰 크기의 거대분자 복합체 또는 세포의 추가적 퍼짐을 용이하게 할 수 있다. 대부분의 적용의 경우, 크기가 약 500 nm 미만, 더욱 바람직하게는 약 200 nm 미만인 거대분자의 투과성을 촉진하는 제제의 사용은, 그 제제가 처리 조직 내에서 세포의 이동을 실질적으로는 촉진하지 않지만, 더욱 작은 복합체 및 제제의 통과를 촉진한다는 점에서 매우 유익하다.
본원에 기재하고 묘사한 바와 같이, sHASEGP는 인간 몸체 내의 조직 (통상적으로 도달이 비교적 어려운 눈의 후방부에 있는 조직과 같은 조직이 포함됨)으로 다양한 다른 약리학적 및/또는 기타의 제제가 송달되는 것을 증강시키는데 사용될 수 있다. 이론으로 구속하고자 하는 것은 아니나, sHASEGP는, 조직 내에서 그의 확산 또는 투과를 잠재적으로 증강시킴으로써, 및/또는 조직의 세포사이 공간 내의 벌크 유체 유동을 증강시켜 이류성 수송을 증강시킴으로써, 다수의 이러한 제제의 약동학적 및/또는 약력학적 프로파일을 증강시킬 수 있다고 여겨진다. 예를 들어 (제한이 아님), 눈에 영향을 미치는 다양한 상태의 치료를 위한, 본 발명의 sHASEGP와 조합할 수 있는(예를 들어, 하나 이상의 sHASEGP과의 공동 제형화에 의해 또는 하나 이상의 sHASEGP(제제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있음)와의 공동투여에 의해 조합됨) 약리학적 제제의 예로는 예를 들어 하기가 포함된다:
혈관신생 저해제 (예컨대, 안지오스타틴, 아네코르타브 아세테이트 (예를 들어, RETAANETM), 엔도스타틴, 트롬보스폰딘 (예를 들어, 트롬보스포딘-1 및 트롬보스포딘-2), 항-혈관신생 항체 및 기타 항-혈관신생제 또는 혈관 표적화제 (VTA) (예를 들어, 항-VEGF 항체, 예컨대 베바시투맙(예를 들어, AVASTINTM), 카르복시아미도 트리아졸 (CAI), 인터류킨-12 (IL-12), OLTIPRAZTM (5-[2-피라지닐]-4-메틸-1,2,3-티온), SU-5416, TNP-470, 탈리도미드), 등); 항-백내장성 및 항-당뇨병성 망막증 물질 (예컨대, 알도스 리덕타아제 저해제 (ARI), 예를 들어, 톨레스타트 (예를 들어, ALRED ASETM) 및 조폴레스타트 (예를 들어, ALONDTM), 리시노프릴, 에날라프릴, 스타투스, 및 티올 가교결합 물질 등); 소염제 (당업계 및 본원에 기재한 바와 같은 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염제가 포함됨); 항감염제 (하기 기재한 바와 같은 화합물 뿐만 아니라, 이의 다수의 안 제제, 예컨대 BLEPHAMIDETM, CILOXANTM, POLYTRIMTM, QUIXINTM, TOBRADEXTM, VIGAMOXTM, ZYMARTM가 포함됨); 베타-아드레날린 작용성 차단제 (예컨대, 베탁솔롤 (예를 들어, BETOPTIC STM), 티몰롤 (예를 들어, BETIMOLTM 및 TIMOPTICTM) 및 이의 조합물 (예를 들어, 티몰롤 및 탄산 안히드라제 저해제, 예컨대 도르졸아미드(예를 들어, COSOPTTM); 탄산 안히드라제저해제 (예컨대, 아세타졸아미드, 브린졸아미드 (예를 들어, AZOPTTM), 디클로로펜아미드, 도르졸아미드 (예를 들어, TRUSOPTTM, 및 예를 들어 COSOPTTM와 같은 다른 제제와의 조합물), 메타졸아미드 등); 산동약 (예컨대 아트로핀 술페이트, 시클로펜톨레이트, 호마트로핀, 스코폴아민, 트로피카미드, 유카트로핀, 및 히드록시암페타민 등); 광역학 요법제 (예컨대, 베르테포르핀 (예를 들어, LUMIGANTM), 라타노프로스트 (예를 들어, XALATANTM), 및 트라보프로스트 (예를 들어, TRAVATANTM); 교감신경 작용약 (예컨대, 브리모니딘 (예를 들어, ALPHAGANTM P); 및 이의 조합물 (예컨대, COSOPTTM 와 같은 탄산 안히드라제 저해제와 베타-아드레날린 작용성 차단제의 조합물); 및 본원 또는 그 밖의 다른 문헌에 기재되어 있고/있거나 당업계에 공지되어 있거나 새롭게 개발된 수많은 다른 부류의 제제, 예컨대 항감염제 및 다양한 다른 생리활성 조절제.
본 발명의 sHASEGP와 조합될 수 있는 수많은 다른 약리학적 제제 (예를 들어, 하나 이상의 sHASEGP와 공동제형화함으로써 또는 하나 이상의 sHASEGP와 공동투여함으로써 (상기 제제의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여될 수 있음) 조합됨)이 눈에 영향을 미치는 또는 신체의 다양한 다른 조직에 영향을 미치는 다양한 상태의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어보자면 (제한하는 것은 아님), 상기와 같은 제제로는 예를 들어 다음이 포함된다: 마취제; 항대사물질, 항신생물제 및 다른 항암제; 항바이러스제; 항감염제 (항박테리아제 및 기타 항생제를 포함함), 항진균제 및 기타 항감염제; 면역조절제; 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염제; 베타 차단제; 교감신경작용약; 두코사노이드, 프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 유사체; 동공 축소제, 콜린작용약 및 항-콜린작용약; 항-알러지약 및 충혈완화제; 호르몬제; 성장 인자; 기타의 합성 및 생물학적 유래된 제제; 및 이들의 조합물. 신규한 약리제의 제형물 및/또는 기존 약리물의 재제형물에서 sHASEGP와 조합될 수 있는 상기 성질을 갖는 제제의 일부 예시적 예로는, 상기 및 하기에 기재한 다양한 카테고리의 제제가 포함된다 (또한, 다양한 질병의 진단, 예방 또는 치료용으로 정지적으로 동정되고 있는 기타의 공지된 제제 및 신규한 제제도 포함된다):
마취제, 특히, 비흡입성 국소 마취제 (예컨대, 암부카인; 아목세카인; 아밀로카인; 아프토카인; 아르티카인; 베녹시네이트; 벤질 알콜; 벤조카인; 베톡시카인; 비페나민; 부크리카인; 부메카인; 부피바카인; 부타마인; 부트암벤; 부타닐리카인; 카르비조카인; 클로로프로카인; 클리부카인; 클로다카인; 코카인; 덱시바카인; 디아모카인; 디부카인; 디클로닌; 엘루카인; 에티도카인; 유프로신; 헥시카인; 포모카인; 펩타카인; 헥실카인; 히드록시프로카인; 히드록시테트라카인; 이소부탐벤; 케토카인; 류시노카인; 리도카인; 메피바카인; 메프릴카인; 옥토카인; 오르토카인; 옥세타카인; 옥시부프로카인; 페나카인; 피놀카인; 피페로카인; 피리도카인; 폴리도카놀; 프로모카인; 프릴로카인; 프로카인; 프로파노카인; 프로피포카인; 프로폭시카인; 프록시메타카인; 피로카인; 쿠아타카인; 퀴니소카인; 리소카인; 로도카인; 로피바카인; 살리실 알콜; 수이카인; 테트라카인; 트라펜카인; 트리메카인) 등; 및 다양한 다른 비흡입성 마취제 (예컨대, 알팍살론; 아몰라논; 에톡사드롤; 펜타닐스; 케타민; 레복사드롤; 메티투랄; 메토헥시탈; 미다졸람; 미낙솔론; 프로파니디드; 프로폭세이트; 프라목신; 프로포폴; 레미펜타닐스; 수펜타닐스; 틸레타민; 졸라민 등);
항-대사물질 (예컨대, 엽산 유사체 (예를 들어, 데노프테린, 에다트렉세이트, 메토트렉세이트, 피리트렉심, 프테로프테린, 토무덱스, 트리메트렉세이트), 푸린 유사체 (예를 들어, 클라드리빈, 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티아구아닌), 및 피리미딘 유사체 (예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 독시플루리딘, 에미테푸르, 에노시타빈, 플록수리딘, 플루오로우라실, 겜시타빈, 테가푸르) 등;
항신생물제 (예컨대, 아클라시노마이신, 아크티노마이신, 아드리아미신, 안시타빈, 안트라마이신, 아자시티딘, 아자세린, 6-아자우리딘, 비산트렌, 블레오마이신, 카크티노마이신, 카르모푸르, 카르무스틴, 카루비신, 카르지노필린, 크로모마이신, 시스플라틴, 클라드리빈, 시타라빈, 다크티노마이신, 다우노루비신, 데노프테린, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독시플루리딘, 독소루비신, 에다트렉세이트, 에미테푸르, 에노시타빈, 페피루비신, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 이다루비신, 록수리딘, 메노가릴, 6-메르카프토푸린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 피라루비신, 피리트렉심, 플리카마이신, 포르피로마이신, 프테로프테린, 푸로마이신, 레티노산, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 테가푸르, 테목시펜, 티아미프린, 티오구아닌, 트리암시놀론, 트리메트렉세이트, 투베르시딘, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 지노스타틴, 조루비신 등) (또한, 본원에 기재한 예시적인 항암제도 참고하라);
항바이러스제 (예컨대, 아바카비르 (예를 들어, ZIAGENTM), 아사이클로비르(예를 들어, ZOVIRAXTM), 아만타딘 및 리만타딘 (예를 들어, SYMMETRELTM), 암프레나비르 (예를 들어, AGENERASETM), 시도포비르 (예를 들어, VISTIDETM), 델라비르딘 (예를 들어, RESCRIPTORTM), 디다노신 (예를 들어, VIDEXTM), 에파비렌즈 (예를 들어, SUSTIV ATM), 팜시클로비르 (예를 들어, FAMVIRTM), 포미비르센 (예를 들어, VITRAVENETM), 포스카르네트 (예를 들어, FOSCAVIRTM), 간시클로비르 (예를 들어, CYTO VENETM) 및 발간시클로비르 (예를 들어, VALCYTETM), 이독수리딘 (예를 들어, HERPLEXTM), 인디나비르 (예를 들어, CRIXIVANTM), 인터페론 (예를 들어, ALFERON NTM, INTRONTM A, PEGASYSTM, PEG-INTRONTM, ROFERON-ATM, 및 인터페론과 기타 항바이러스제의 조합물, 예컨대 ROBETRONTM 및 PEGASYS/COPEGUSTM), 라미부딘 (예를 들어, 3TCTM 및 EPIVIRTM) 및 라미부딘 및 지도부딘의 조합물 (예를 들어, COMBIVIRTM), 모노클로날 항체, 예컨대 팔리비주맙 (예를 들어, SYNAGISTM), 넬프마비르 (예를 들어, VIRACEPTTM), 네비라핀 (예를 들어, VIRAMUNETM), 오셀타미비르 (TAMIFLUTM), 펜시클로비르 (예를 들어, DENA VIRTM), 플레코나릴, 리바비린 (예를 들어, COPEGUSTM 및 REBETOLTM), 리만타딘 (예를 들어, FLUMADINETM), 리토나비르 (NORVIRTM), 사퀴나비르 (예를 들어, INVERASETM), 스타부딘 (d4T, 예를 들어, ZERITTM), 발라사이클로비르 (예를 들어, VALTREXTM), 비다라빈 (예를 들어, VIRA-ATM), 잘시타빈 (예를 들어, HWIDTM), 자나미비르 (RELENZATM), 지도부딘 (예를 들어, AZT, RETROVIRTM) 등);
항박테리아제 및 기타 항생제 [예를 들어, 다음이 포함됨: 아미노글라이코시드; 암페니콜; 안사마이신; 카르바세펨; 카르바페넴; 세팔로스포린 또는 세펨; 세팔마이신; 클라밤; 시클릭 리포펩티드; 디아미노피리미딘; 케톨리드; 린코사미드; 마크롤리드; 모노박탐; 니트로푸란; 옥사세펨; 옥사졸리디논; 페넴, 티에나마이신 및 기타의 베타-락탐; 페니실린; 폴리펩티드 항생제; 퀴놀론; 술폰아미드; 술폰; 테트라사이클린; 및 기타 항생제, 이의 예는 하기에 제공되어 있음 (및 당업계에 공지된 또는 새로 개발된 다른 것들)];
아미노글리코시드 (예를 들어, 아미카신, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 디히드로스트렙토마이신, 포르티미신, 겐타미신, 이세파미신, 카나마이신, 미크로노미신, 네오마이신, 네오마이신 운데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 토브라마아신, 트로스펙토마이신 등);
암페니콜 (예를 들어, 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 티암페니콜 등);
안사마이신 (예를 들어, 리파미드, 리팜핀 또는 리팜피신 (예를 들어, RIFADINTM, RIFADIN IVTM, 및 리팜핀을 함유하는 조합물, 예컨대 리팜핀/이소니아지드 (예를 들어, RIFAMATETM) 및 리팜핀/이소니아지드/피라진아미드 (예를 들어, RIFATERTM), 피라마이신, 리파펜틴, 리팍시민 (예를 들어, XIFAXAMTM) 등);
카르바에펨 (예를 들어, 로라카르베프, 3-클로로-1-카르바세펨, 3-티오 치환된 카르바세펨, 미국 공개 특허 출원 20050004095에 기재된 카르바에펨 등);
카르바페넴 (예를 들어, 비아페넴, 이미페넴, 메로페넴, 파니페넴 등);
세파로스포린 또는 세펨 (예를 들어, 세파클로르 (예를 들어, CECLORTM), 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세파졸린 (예를 들어, ANCEFTM), 세페아펜 피복실, 세펠리딘, 세프디니르, 데프디토렌, 세페핌 (예를 들어, MAXIPIMETM), 세페타메트, 세픽심, 세피네녹심, 세프메타졸, 세포디짐, 세포니시드, 세포페라존, 세포라니드, 세포탁심, 세포티암, 세포테탄, 세폭시틴, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라미드, 세프피롬, 세프포독심, 프록세틸, 세프프로질, 세프ㅗㄱ사딘, 세프술로딘, 세프타지딤(예를 들어, FORTAZTM), 세프테람, 세프테졸, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손 (예를 들어, ROCEPHINTM), 세푸록심 (예를 들어, ZINACEFTM), 세푸조남, 세파세트릴, 세팔렉신, 세팔로글라이신, 세팔로리딘, 세팔로스포린, 세팔로틴, 세파피린, 세프라딘, 피브세팔렉신 등);
세파마이신 (예를 들어, 세프부페라존, 세피네타졸, 세피니녹스, 세포티탄, 세폭시틴 (예를 들어, MEFOXINTM), 등);
클라밤(Clavam) (예를 들어, 클라부린산 또는 클라부라네이트, 2- 및 3-페닐 클라밤, 및 상기 제제를 함유하는 조합물, 아목시실린/클라부라네이트 (예를 들어, AUGMENTINTM) 및 티카르실린/클라불라네이트 (예를 들어, TIMENTINTM) 등);
시클릭 리포펩티드 (예를 들어, 다프토마이신 (예를 들어, CUBICINTM);
디아미노피리미딘, 예컨대, 2,4-디아미노피리미딘 (예를 들어, 브로디모프림, 테트로옥소프림)), 테트로옥소프림,
브로디모프린 (예를 들어,, 테트로고프림, 트리메토프림 등);
케토리드 (예를 들어, 텔리트로마이신 (예를 들어, KETEKTM), 및 가교된 비시클릭 케토리드 (예를 들어, 미국 특허 공보에 기재된 것으로서 에난타 EP-013420 및 6-11 바이시클릭 케토리드), 등);
린코사미드 (예를 들어, 클린다마이신, 린코마이신 등);
마크롤리드 (예를 들어, 아지트로마이신 (예를 들어, ZITHROMAXTM), 카르보마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 에리트로마이신 아시스트레이트, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에리트로마이신 글루코헵토네이트, 에리트로마이신 락토비오네이트, 에리트로마이신 프로피오네이트, 에리트로마이신 스테아레이트, 조사마이신, 류코마이신, 미데카마이신, 미오카마이신, 올레안도마이신, 프리마이신, 로키타마이신, 로사라미신, 록시트로마이신, 스피라마이신, 트롤레안도마이신 등);
모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남 (예를 들어, AZACTAMTM), 카루모남, 티게모남 등);
니트로푸란 (예를 들어, 푸랄타돈, 푸라졸륨 클로라이드, 니푸라덴, 니푸라텔, 니푸르폴린, 니푸르피리놀, 니푸르프라진, 니푸르토이놀, 니트로푸라노인 등);
옥사세펨 (예를 들어, 플로목세프, 라타목세프 또는 목살락탐 (예를 들어, MOXAMTM) 등);
옥사졸리디논 (예를 들어, 리네졸리드 (예를 들어, ZYVOXTM), 에페레졸리드 등);
페넴, 티에나마이신 및 기타의 베타-락탐 (예를 들어, 에르타페넴 (예를 들어, INVANZTM), 이미페넴 (예를 들어, PRIMAXINTM 중에서 클라스타틴과 함께), 메로페넴 (예를 들어, MERREMTM), 등);
페니실린 (예를 들어, 암디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 암피실린 (이의 조합물 포함 (예를 들어, UNASYNTM) 중에서 서브락탐과 함께), 아팔실린, 아스폭시실린, 아지도실린, 아즐로실린, 베캄피실린, 벤질페니실린 산, 벤질페니실린 소듐, 카르베니실린, 카린다실린, 클로메토실린, 클록사실린, 코아목시클라브, 사이클라실린, 디클록사실린, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 헤타실린, 레남피실린, 메탐피실린, 메티실린 소듐, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페나메실린, 페네타메이트 히드리오다이드, 페니실린 G 베네타민, 페니실린 G 벤자틴 (예를 들어, BICILLINTM L-A), 페니실린 G 벤즈히드릴아민, 페니실린 G 칼슘, 페니실린 G 히드라바민, 페니실린 G 포타슘, 페니실린 G 프로카인, 페니실린 N, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피사이클린, 페네티실린 포타슘, 피페라실린 (이의 조합물 포함 (예를 들어, ZOSYNTM 중의 것으로서, 타조박탐과 같은 베타-락타마제 저해제와 함께)), 피밤피실린, 프로피실린, 퀴나실린, 술베니실린, 술타미실린, 탈람피실린, 타조실린, 테모실린, 티카르실린 (예를 들어, TIMENTINTM 중에서 클라불라네이트와 함께) 등);
폴리펩티드 항생제 (예를 들어, 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 클리스티메테이트 (예를 들어, COLI-MYCINTM M), 콜리스틴, 엔두라시딘, 엔비오마이신, 푸사푼긴, 그라미시딘, 미카마이신, 폴리마익신, 프리스티나마이신 (및 프리스티나마이신 유도체, 예컨대 퀴누프리스틴 및 달포프리스틴 (예를 들어, SYNERCIDTM)), 리스토세틴, 테이코플라닌, 티오스트레프톤, 투베라크티노마이신, 타이로시딘, 타이로트리신, 반코마이신, 비오마이신, 비르기니아마이신, 아연 바시트라신 등);
퀴놀론 (플루오로퀴놀론 및 유사체 포함) (예를 들어, 알라트로플록사신 메실레이트, 시녹사신, 시프로플록사신 (예를 들어, CIPROTM), 클리나플록사신, 디플록사신, 에낙사신, 플레록사신, 플루메퀸, 가티플록사신 (예를 들어, TEQUINTM), 그레파플록사신, 레보플록사신 (예를 들어, LEVAQUINTM), 로메플록사신, 밀록사신, 목시플록사신 (예를 들어, AVELOXTM), 나디플록사신, 날리딕스 산, 노르플록사신, 오플록사신, 옥솔린 산, 파주플록사신, 페플록사신, 피페미드 산, 프로미드 산, 로속사신, 루플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 트로바플록사신 메실레이트 등);
술폰아미드 (예를 들어, 아세틸 술파메톡시피라진, 벤질술파미드, 클로르아민-B, 클로르아민-T, 디클로르아민 T, 포르밀술피소미딘, 베타-글루코실술파닐아미드, 마페니드, 4'-(메틸술파모일)술파닐아닐리드, 노프릴술파미드, 프탈릴술파세타미드, 프탈릴술파티아졸, 살라조술파디미딘, 숙시닐술파티아졸, 술파벤즈아미드, 술파세타미드, 술파클로르피리다진, 술파크리소이딘, 술파시틴, 술파디아진, 술파디크라미드, 술파디메톡신, 술파독신, 술파에티돌, 술파구아니딘, 술파구아놀, 술팔렌, 술팔록스 산, 술파메라진, 술파메테르, 술파메타진, 술파메티졸, 술파메토미딘, 술파메톡사졸, 술파메톡시피리다진, 술파메트롤, 술파미도클리라이소이딘, 술파목솔, 술파닐아미드, 4-술파닐아미도살리실 산, 술파닐릴술파닐아미드, 술파닐릴우레아, n-술파닐릴-3,4-크실아미드, 술파니트란, 술파페린, 술파페나졸, 술파프록실린, 술파피라진, 술파피리딘, 술파소미졸, 술파사이마진, 술파티아졸, 술파티오우레아, 술파톨아미드, 술프이소미딘, 술프이속사졸 등);
술폰 (예를 들어, 아세다프손, 아세디아술폰, 아세토술폰 소듐, 다프손, 디아티모술폰, 글루코술폰 소듐, 솔라술폰, 서브락탐, 숙시술폰, 술파닐 산, p-술파닐릴벤질아민, 술폭손 소듐, 티아졸술폰 등);
테트라사이클린 (예를 들어, 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 구아메사이클린, 라이메사이클린, 메클로사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 페니메피사이클린, 피파사이클린, 롤리테트라사이클린, 산사이클린, 테트라사이클린), 및 기타의 것들 (예를 들어, 사이클로세린, 무피로신, 투베린 등);
및 기타의 항생제 (예컨대, 클로토크톨, 푸시드 산, 헥세딘, 메텐아민 (예를 들어, 메텐아민, 메텐아민 안히드로메틸렌-시트레이트, 메텐아민 히프푸레이트, 메텐아민 만델레이트, 메텐아민 서브살리사일레이트가 포함됨), 니트로푸란토인 (예를 들어, FURAD ANTINTM), 니트록솔린, 리티페넴, 타우롤리딘, 크시보몰 등);
항진균제, [폴리엔, 예컨대 암포테르신 Bs (예를 들어, ABELCETTM 및 AMBISOMETM), 칸디시딘, 데르모스타틴, 필리핀, 푼기크로민, 하키마이신, 하마이신, 루센소마이신, 메파르트리신, 나타마이신 (예를 들어, Natacyn), 나이스타틴, 페실로신, 페리마이신, 및 기타의 것들 (예를 들어, 아자세린, 그리세오폴빈, 올리고마이신, 네오마이신 운데실레네이트, 피롤니트린, 시스카닌, 투베르시딘, 비리딘)이 포함됨]; 및 합성 항진균제, 예컨대 알릴아민 (예를 들어, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀); 이미다졸 (예를 들어, 비포나졸, 부토코나졸, 클로르단토인, 클로르미다졸, 클로코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 에닐코나졸, 펜티코나졸, 플루트리마졸, 이소코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸, 라노코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸 니트레이트, 세르타코나졸, 술코나졸, 티오코나졸, 보리코나졸 (예를 들어, VFENDTM)); 티오카르바메이트 (예를 들어, 톨시클레이트, 톨린데이트, 톨나프테이트); 트리아졸 (예를 들어, 플루코나졸 (예를 들어, DIFLUCANTM), 이트라코나졸 (예를 들어, SPORANOXTM), 사페르코나졸, 테르코나졸); 및 기타의 합성물 (예를 들어, 아크리소르신, 아모롤핀, 비페나민, 브로모살리사일클로라닐리드, 부클로사미드, 칼슘 프로피오네이트, 클로르페네신, 시클로피록스, 시클록시퀸, 코파라피네이트, 디암타졸, 디히드로클로라이드, 엑살아미드, 플루사이토신, 할레타졸, 헥세티딘, 리포펩티드, 예컨대 에키노칸딘 (카스포푼긴 CANCIDASTM 중에서의 것), 로플루카르반, 니푸라텔, 포타슘 요오다이드, 프로피온 산, 파이리티온, 살리실아닐리드, 소듐 프로피오네이트, 술벤틴, 테노니트로졸, 트리아세틴, 우조티온, 운데실렌 산, 아연 프로피오네이트) 등;
아메바 구제제 및 항-원충제 (예를 들어, 아토바쿠온(atovaquone), 클로로퀸 히드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 메트로니다졸, 메트로니다졸 히드로클로라이드, 펜타미딘 이세티오네이트 등); 구충제(Anti-helmenthic) 및 항-기생충제 (예를 들어,메벤다졸, 파이란텔 파모에이트, 티아벤다졸 등이 포함됨); 항말라리아제 (예를 들어, 클로로퀸 히드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 독시사이클린, 히드록시클로로퀸 술페이트, 메플로퀸 히드로클로라이드, 프리마퀸 포스페이트, 프리메타민, 술파독신과의 피리메타민이 포함됨); 항-결핵제 및 항-나병제 (예를 들어, 클로파지민, 사이클로세린, 다프손, 에탐부톨 히드로클로라이드, 이소니아지드, 파이라진아미드, 리파부틴, 리팜핀, 리파펜틴, 스트렙토마이신 술페이트 등, 및 이의 조합물, 예컨대 리팜핀/이소니아지드 (예를 들어, RIFAMATETM) 및 리팜핀/이소니아지드/파이라진아미드 (예를 들어, RIFATERTM)가 포함됨).
(제한이 아닌) 추가의 예시를 목적으로, 본 발명의 sHASEGP와 조합될 수 있는 면역조절제의 예로는 (예를 들어, 하나 이상의 sHASEGP와 공동제형화함으로써 또는 하나 이상의 sHASEGP(이는 제제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여될 수 있음)와 공동투여함으로써 조합됨), 예를 들어, 하기의 제제 부류 중의 구성원이 포함된다:
면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다실리주맙, 림프구 면역 글로불린, 무로모나브-CD3, 마이코페놀레이트 모페틸, 마이코페놀레이트 모페틸 히드로클로라이드, 시로리무스, 타크롤리무스 등이 포함됨);
백신 및 변성 독소 (예를 들어, BCG 백신, 콜레라 백신, 디프테리아 및 테타누스 변성 독소 (흡착형), 디프테리아 및 파상풍 변성 독소 및 정제 백일해 백신 (흡착형), 디프테리아 및 파상풍 변성 독소 및 전세포 백일해 백신, 해모필루스 b 콘쥬게이트 백신, A형 간염 백신 (불활성화), B형 간염 백신 (재조합), 인플루엔자 바이러스 백신 (정제된 표면 항원을 기재로 함), 인플루엔자 바이러스 백신 (서브비리온 또는 정제한 서브비리온을 기재로 함), 인플루엔자 바이러스 백신 (전 비리온을 기재로 함), 일본 뇌염 바이러스 백신 (불활성화), 라임 병 백신 (재조합 OspA), 홍역 및 이하선염 및 풍진 바이러스 백신 (생), 홍역 및 이하선염 및 풍진 바이러스 백신 (생, 약독화), 홍역 바이러스 백신 (생, 약독화), 수막구균 폴리사카라이드 백신, 이하선염 바이러스 백신 (생), 페스트 백신, 폐렴구균 백신 (다가), 폴리오바이러스 백신 (불활성화), 폴리오바이러스 백신 (생, 경구, 3가), 광견병 백신 (흡착형), 광견병 백신 (인간 배수체 세포), 풍진 및 이하선염 바이러스 백신 (생), 풍진 바이러스 백신 (생, 약독화), 파상풍 변성 독소 (흡착형), 파상풍 변성 독소 (유체), 장티푸스 백신 (경구), 장티푸스 백신 (비경구), 장티푸스 VI 폴리사카라이드 백신, 수두 바이러스 백신, 황열 백신 등이 포함됨);
항독소제(antitoxin) 및 해독제(antivenin) (예를 들어, 흑거미 및 기타 거미 해독제, 살모사 항사독소제(antivenom) (다가), 디프테리아 항독소제 (말(equine)), 산호뱀(Micrurus fulvius) 해독제 등이 포함됨);
면역 혈청 (including, 예를 들어, 거대세포바이러스 면역 글로불린 (정맥내), B형 간염 면역 글로불린 (인간), 면역 글로불린 근육내, 면역 글로불린 정맥내, 광견병 면역 글로불린 (인간), 호흡기 합포체(respiratory syncytial) 바이러스 면역 글로불린 정맥내 (인간), 면역 글로불린 (인간), 파상풍 면역 글로불린 (인간), 수두-대상 포진 면역 글로불린 등);
기타의 면역조절제 (예를 들어, 알데스류킨, 에포에틴 알파, 필그라스팀, 주사용 글라티라머 아세테이트, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-2a (재조합), 인터페론 알파-2b (재조합), 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-Ia, 인터페론 베타-Ib (재조합), 인터페론 감마-Ib, 레바미솔 히드로클로라이드, 오프렐베킨, 사르그라모스팀 등이 포함됨).
본 발명의 sHASEGP와 조합될 수 있는 기타 제제 (예를 들어, 하나 이상의 sHASEGP과의 공동 제형화에 의해 또는 하나 이상의 sHASEGP(제제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있음)와의 공동투여에 의해 조합됨)의 예로는 예를 들어 하기가 포함된다:
스테로이드성 소염제 (예컨대, 알클로메타손, 알게스톤, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손 및 히드로코르티손 (예를 들어, 히드로코르티손 아세테이트), 코르티바졸, 데플라자코르트, 데소니드, 데속시메타손, 덱사메타손 (예를 들어, 덱사메타손 21-포스페이트), 디플루오로손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오메톨론, 플루페롤론, 플루프레드니덴, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀리드, 플루티카손, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로베타솔, 할로메타손, 할로프레돈, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 로테프레드놀 에타보네이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론 (예를 들어, 프레드니솔론 25-디에틸아미노-아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트), 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 리멕솔론, 틱소코르톨, 트리암시놀론 (예를 들어, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 베네토니드, 및 트리암시놀론 헥사세토니드) 등);
비스테로이드성 소염제 (예컨대, 크로모글리세이트, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 인도메타신, 이부프로펜, 케토롤락 (예를 들어, 케토롤락 트로메타민), 로독사미드, 네도크로밀, 피록시캄, 살리실레이트 등);
베타 차단제 (예컨대, 베탁솔롤 (예를 들어, 베탁솔롤 히드로클로라이드), 카르테올롤, 에스몰롤, 레보부놀롤, 메티프라놀롤, 티몰롤 (예를 들어, 티몰롤 헤미히드레이트 및 다양한 형태의 티몰롤 말레에이트) 등);
교감신경작용약 (예컨대, 아드레날린, 브리모니딘, 디피베프린, 에피네프린 등);
두코사노이드(Ducosanoid), 프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 유사체 (예컨대, 비마토프로스트, 라타노프로스트, 트라보프라스트, 우로프로스톤 등), 및 항프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 전구체;
동공 축소제, 콜린작용약 및 항-콜린에스테라아제 (예컨대, 아세틸콜린 클로라이드, 카르바콜, 데메카륨 브로마이드, 디이소프로필 플루오로포스페이트, 에세린, 피소스티그민, 필로카르핀, 포스폴린 요오딘, 살리실레이트 등);
항-알레르기제 (예컨대, 소듐 안타졸린, 세티리진, 클로르페르아민, 크로모글라이세이트, 클로몰린 소듐 (크롤롬(Crolom)), 에메다스틴 디푸마레이트, 케토티픔 (예를 들어, 케토티펜 푸마레이트), 레보카바스틴, 메타피릴린, 네도크로밀 소듐, 올로파타딘, 피릴아민, 프로펜피리드아민 등);
충혈완화제 (예컨대, 페닐레프린, 나파졸린, 테트라히드로졸린 등);
호르몬제 (예컨대, 에스트로겐, 에스트라디올, 프로게스타티오날, 프로게스테론, 인슐린, 칼시토닌, 파라티로이드 호르몬 및 펩티드 및 바소프레신 시상하부 방출 인자 등);
성장 인자 (예컨대, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 변형 성장 인자 베타, 소마토트로핀 및 피브로넥틴 등);
진통제 (예컨대, 아세트아미노펜; 알펜타닐; 아미노벤조에이트; 아미노벤조에이트; 아니독심; 아닐레리딘; 아닐레리딘; 아닐로팜; 아니롤락; 안티파이린; 아스피린; 베녹사프로펜; 벤지다민; 비시파딘 히드로클로라이드; 브리펜타닐; 브로마돌린; 브롬페낙; 부프레노르핀; 부타세틴; 부트익시레이트; 부토르파놀; 부토르파놀; 카르바마제핀; 카르바스피린 칼슘; 카르비펜; 카르펜타닐; 시프레파돌 숙시네이트; 시라마돌; 시라마돌; 클로닉세릴; 클로닉신; 코데인; 코데인 포스페이트; 코데인 술페이트; 코노르폰; 사이클라조신; 덱속사드롤; 덱스페메돌락; 데조신; 디플루니살; 디히드로코데인; 디메파단; 디파이론; 독스피코민; 드리니덴; 에나돌린; 에피리졸; 에르고 타민 타르트레이트; 에톡사젠; 에토페나메이트; 유게놀; 페노프로펜; 페노프로펜 칼슘; 펜타닐 시트레이트; 플록타페닌; 플루페니살; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루피르틴; 플루프로쿠아존; 플루라돌린; 플루르비프로펜; 히드로모르폰; 이부페낙; 인도프로펜; 케타조신; 케토르파놀; 케토롤락; 레티미드; 레보베타딜 아세테이트; 레보메타딜 아세테이트 히드로클로라이드; 레보난트라돌; 레보르파놀; 로페미졸; 로펜타닐 옥살레이트; 로르시나돌; 로목시카른; 마그네슘 살리실레이트; 메페남 산; 메나비탄; 메페리딘; 메프타지놀; 메타돈; 메타딜 아세테이트; 메토폴린; 메토트리메프라진; 메트케파미드 아세테이트; ala반; 미르펜타닐; 몰리나존; 모르핀 술페이트; 목사조신; 나비탄; 날부핀; 날멕손; 나목시레이트; 난트라돌; 나프록센; 나프록센; 나프록솔; 네포팜; 넥세리딘; 노라시메타돌; 옥펜타닐; 옥타자미드; 올베닐; 옥세토론; 옥시코돈; 옥시코돈; 옥시코돈 테레프탈레이트; 옥시모르폰; 페메돌락; 펜타모르폰; 펜타조신; 펜타조신; 페나조피리딘; 페니라미돌; 피세나돌; 피나돌린; 피르페니돈; 피록시캄 올라민; 프라바돌린; 프로딜리딘; 프로파돌; 프로피람; 프로폭시펜; 프로폭시펜 나프실레이트; 프록사졸; 프록소르판; 피롤리펜; 레미펜타닐; 살콜렉스; 살레타미드 말레에이트; 살리실아미드; 살리실레이트 메글루민; 살살레이트; 살리실레이트; 스피라돌린; 술펜타닐; 수펜타닐; 수카프사이신; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 타자돌렌; 테부펠론; 테트리다민; 티푸락; 틸리딘; 티오피낙; 토나조신; 트라마돌; 트레펜타닐; 트롤아민; 베라돌린; 베릴로팜; 볼라조신; 크소르파놀; 크실라진; 제나조신 메실레이트; 조메피락 등);
기타 거대분자 약리학적 제제, 예컨대 기타의 단백질, 핵산 등; 및 거대분자의 복합체, 예컨대 다양한 약물 송달, 단백질 송달 및/또는 유전자 전달 비히클 (합성적으로 제조한 비히클, 예컨대 리포솜 등, 및 생물학적으로 발생된 비히클, 예컨대 바이러스 벡터 등이 포함됨); 및
예를 들어 [Physicians' Desk Reference (PDR) (Thomson 2003, 2004, 2005)]; [American College of Physicians Complete Home Medical Guide (DK Publishing 2003)]과 같은 참조문헌에서 동정된 추가의 제제; 및 예를 들어 U.S. 공개 출원 20040224023, 20040224012 및 20050002865를 포함한 특허 참조문헌에서 동정된 추가의 제제 (제제의 목록이 본원에 참조로 포함됨)를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 상태 (및 본원에 동정된 것들을 포함하는 다양한 제제의 사용, 투여, 금기 등에 대한 추가의 정보)에 사용되는 기타 제제.
제제의 조합물 (예를 들어, 제제의 전술한 군 중의 하나 이상 및/또는 본원에서 특정한 또는 당업계에 공지된 약리학적 제제 및 기타 제제의 다른 군 또는 부류에서 선택한 둘 이상의 제제).
안내 압력 및 기타 안 징후의 감소를 위한 sHASEGP의 용도
백내장 수술후 환자에서 흔히 발생하는 부작용은 초기에 현저하고, 때때로 오랫 동안, 안내 압력이 상승하는 것이다. 그러한 상태는 때때로 심각하며, 특히 녹내장성 시각신경유두 변화를 가진 환자에서 그러하다. 압력 증가는 히알루론산과 같은 점탄성 제제가 수술동안 안내로 주사되는 경우에 더 심각한 경향이 있지만, 안내 압력은 그러한 제제가 사용되지 않는 경우에도 수술 후 증가될 수 있다. 더욱이, 그러한 압력 증가는 수술동안 추가 의약이 사용되지 않을 때에도 발생할 수 있다. 일부 경우에는, 눈에 점탄성 제제를 남겨두는 것이 유익하며, 이것은 종종 더 많은 투여량의 탄산 안히드라제 억제제를 환자에게 제공하는 것이 필요하게 한다. 이들 억제제는 눈에서 정상적으로 분비되는 유체인 눈방수가 섬모체에 의해 형성되는 것을 감소시켜 안내 압력을 낮춘다. 수술후 눈의 압력 증가를 완화시키는 현재의 방법은 베타-아드레날린 차단제, 교감신경흥분제, 축동제, 알파 II 선택제, 탄산 안히드라제 억제제 및 프로스타글란딘제와 같은 다양한 타입의 점안제를 포함한다.
히알루론산과 같은 점탄성물을 제거하는 바람직한 방법은 전방 절편 또는 후방 절편 수술동안 또는 그 직후 sHASEGP를 주사하는 것이며, 공지의 다른 투여 방법 또한 가능하다. 히알루론산 및 sHASEGP가 전방 절편 눈 수술동안 전실내로 주사되어 히알루론산이 수술 개시동안 스페이서로 작용하게 한다면 그것이 바람직하다. 각막 이식의 일부 경우에는, 각막 이식편을 제자리에 봉합하기 전에 히알루론산 및 sHASEGP 조합을 안내 구조의 표면에 놓을 수 있다. 이 조합은 또한 망막 또는 유리체 수술과 같은 후방 절편 수술에 사용될 수 있다.
일부 경우에는, 수술 마지막에 히론(Healon)TM, 비스코트(Viscoat)TM 와 같은 점탄성제제, 또는 다른 공간-차지 물질을 눈의 전실에 남겨두는 것이 좋을 수도 있다. 이것은 안내 내용물이 앞으로 와서 각막의 후방 표면에 대하여 압박하는 경우에 양성 압력 상승에서 특히 그러하다. 만일 이것이 합성 안내 렌즈를 가진 눈에서 발생하면, 각막 내피에의 압력은 세포에의 상당한 손상을 야기할 수 있으며 이어서 각막 팽윤 및 혼탁화가 발생할 수 있으며, 이는 시력 감소와 관련된다. 일반적으로, 환자의 안내 압력이 수술 마지막에 크게 상승되면, 그러한 환자에게는 큰 투여량의 탄산 안히드라제 억제제 및 베타-차단제 및 알파 II 아고니스트와 같은 국소 안약을 제공하여 눈방수 형성을 감소시키고/거나 눈방수 유출을 증가시키는 것이 필요하다. 이들 제제는 모두 상당한 부작용을 가지며, 일부 경우에는, 호흡 곤란, 심장 질환 또는 고혈압과 같은 다양한 유형의 의학적 상태를 가진 환자에서는 금지된다. 하지만, 이들 상황에서 sHASEGP의 사용은 이들 환자에게 그러한 약을 다량 제공할 필요를 제거할 것이다.
더욱이, 기둥 섬유주에는 상당량의 히알루론산이 있다. sHASEGP는 이것을 분해시키고, 따라서 기둥 섬유주를 통한 눈방수의 유출을 개선시킬 것이다. 따라서, 환자의 안내 압력은 감소할 것이다. 메틸셀룰로스(예를 들어, Storz Instrument Co.에서 시판하는 오쿠코트(Ocucoat)TM)와 같은, 백내장 수술에서 스페이서 및/또는 보호제로 사용되는 다른 전실 제제와 sHASEGP의 조합은 또한 기둥 섬유주를 개방시키며, 기둥 섬유주에 존재하는 상당량의 히알루론산을 분해시켜 보다 많은 눈방수 배출을 허용할 것이므로, 상당한 압력 상승을 방지하는 데 효과적일 것이다.
기둥 섬유주로부터 글리코스아미노글리칸의 제거는 또한 개방 각 녹내장을 앓고 있는 개인에서 안내 압력 감소에 유용하다. 인간 sHASEGP는 결막하 주사 또는 전실내로의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. sHASEGP는 효소적으로 작용하기 때문에, 심지어 비교적 제한된 양의 sHASEGP도, 글리코스아미노글리카나제의 적용에 의해 보조되거나 개선되는 기타 상태를 위해, 또는 점탄성 해독제로서 효과적으로 기능할 수 있다. 기타의 용도로서, 최적 적용을 위해 sHASEGP에 의해 제공되는 히알루로니다제 활성의 유닛은 부분적으로는 치료되는 특정 상태 - 특히, 목적하는 글리코스아미노글리칸 분해의 양에 의존할 것이나, 적당한 모델을 사용하여 손쉽게 평가한 다음, 특정 용도에 적당하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 해독제로서 적용될 sHASEGP의 유닛은, 특히, 이용되는 특정 절차 및 적용되는 점탄성물의 양에 의해, 그리고, 임의의 적용된 점탄성물이 관주 및 흡인과 같은 다른 절차를 사용함으로써 제거될 것인지 여부에 따라, 영향을 받을 것이다. sHASEGP을 관주 및 흡인에 이어서 사용할 경우, 비록 특정 적용에 다시 의존할 것이지만, 통상적으로 10 내지 12,000 유닛 범위, 통상적으로 100 내지 5,000 유닛 범위, 더욱 통상적으로는 500 내지 2,000 유닛 범위의 양으로 적용될 수 있다. sHASEGP를 사용하여 관주와 흡인에 대한 필요성을 회피할 경우, 적용된 다량의 점탄성물을 효과적으로 분해시키기 위해서 다량을 적용할 것이고, 그 양은 비록 특정 적용에 다시 의존할 것이지만, 통상적으로 50 내지 20,000 유닛, 통상적으로 400 내지 10,000 유닛, 더욱 통상적으로 1,500 내지 5,000 유닛의 범위로 제공된다.
sHASEGP를 녹내장과 관련된 안내 압력을 감소시키는데 사용할 경우, sHASEGP의 적용은 또한, 녹내장과 관련된 IOP를 감소시킴으로써 녹내장 여과수술, 녹내장 방수유출 임플란트 (튜브 분로(tube shunt)), 레이저 섬유주성형술, 모양체 광응고술 또는 홍채절개술과 같은 수술적 절차에 대한 필요성을 잠재적으로 회피하기 위한 1차적 치료로 사용될 수 있다. 이에, 본 발명의 sHASEGP은, 예를 들어, 눈의 전실로의 주사에 의해 도입되어 녹내장과 관련된 안내 압력을 감소시키기 위한 최소한의 침입식 수단을 제공할 수 있다. 이론으로 구속시키고자 함이 없이, 이러한 환경에서 sHASEGP의 투여는, 기둥 섬유주를 경유하여 유체가 유출되는 것을 증강시킬 수 있고, 이에 따라, 전실 내에서 유체 정역학적 압력 및/또는 교질 삼투압을 감소시킴으로써 IOP를 낮춘다고 여겨진다.
sHASEGP를, 통상적으로는 유리체 섬유의 거시적인 불투명한 응집인 유리체 "플로터(floater)" 또는 응집을 용해시키는데 사용할 경우, 유리체 보디로의 sHASEGP 투여가 탈응집화를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
이와 유사하게, 본원에 기재된 sHASEGP를 유리체로 적용하여, 당뇨병성 망막증, 망막 신혈관 형성, 망막 혈관 폐색, 후방 유리체 이탈, 망막 찢어짐, 안 외상 등과 같은 상태와 연관되어 발생할 수 있는 유리체 출혈 (즉, 유리체 내로 혈액의 혈관외 유출)의 해소를 촉진시킬 수 있다. 통상적으로 해소가 느린 유리체 출혈의 존재는, 종종 증식성 당뇨병성 망막증과 같은 상태에 대한 일차적인 치료가 되는 레이저 광응고술 등과 같은 치료 절차를 위해 및/또는 진단을 위해 망막을 유리체를 통해 노출시키는데 필요한 절차를 지연시키거나, 복잡하게 하거나, 막을 수 있다. 이에, 이러한 유리체 출혈의 해소를 촉진하기 위한 sHASEGP의 용도는, 망막 상태의 진단을 용이하게 하기 위해 및/또는 유리체 절제술과 같은 더욱 근본적인 절차에 대한 필요성을 회피하기 위해 사용될 수 있다.
당뇨병성 망막증과 같은 상태를 치료하는데 있어서 유리체-망막 이탈을 촉진시키기 위해 sHASEGP를 사용할 경우, 유리체로의 sHASEGP 투여가, 망막으로부터 유리체 보디의 이탈 또는 탈결합(uncoupling)을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 이러한 상황에 있어서, sHASEGP는, 이탈을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 망막 왜곡 또는 찢어짐에 대한 잠재성을 감소시키는 방식으로 발생하는 것을 조력할 수 있다.
또한, 본 발명의 sHASEGP는, 각막 혼탁을 치료하는데 사용될 수도 있다. 이와 관련하여, 다양한 왜곡 또는 기형이, 정상적으로 조직화되어 있는 각막 구조에 영향을 미칠 수 있고, 각막을 통한 빛의 통과를 방해하여, 부수적으로 시력이 손상된다. 이에, 다수의 상태 및 원인이 반흔, 헤이징 또는 혼탁으로 나타날 수 있는 각막 왜곡을 야기한다. 그러한 각막 상태의 개선 또는 치료에 sHASEGP를 적용함에 있어서, sHASEGP (하나 이상의 부가적인 약리학적 제제를 함유할 수 있는 약학적으로 허용가능한 용액 중)를, 각막 손상의 정도 및 위치에 부분적으로 의존하여, 임의 몇가지 투여 경로에 의해 각막으로 도입할 수 있다. 예를 들어, sHASEGP를, 눈의 외부 표면에 도입하여 (예를 들어, 점안 또는 기타 국부적 적용수단을 사용하여), 각막 상피를 가로지르는 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 리포솜 등과 같은 담체 내에 잠재적으로 캡슐화하여, 각막 그 자체 상에 또는 그 자체 중으로 주사 또는 마이크로주사함으로써, 또는 각막 조직에 대한 다른 접근법에 의해 도입할 수 있다. 송달을 촉진하기 위한 생화학적 또는 기계적 보조수단에 부가적으로, 이온영동법과 같은, 침투를 촉진하기 위한 다른 수단이 마찬가지로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 sHASEGP는, 예를 들어, 광역학 요법 (PDT)에서 이용되는 제제의 투과력을 증강시키는데 사용될 수 있다. PDT는, 노인성 황반 변성 (AMD)의 "웨트(wet)" 형태에서 망막 하의 누출성 혈관 구조인 맥락막 혈관 신생 (CNVM)에 대한 치료이다. PDT에 있어서, VISUDYNETM (베르테포르핀(verteporfin))과 같은 광감성 염료가 통상적으로 정맥내 (IV) 투여되고, CNVM 뿐만 아니라 보디의 나머지도 관류시킨다. 그 후, 안과의사는 통상적으로, 약 90 초 동안 특정 파장 (예를 들어, 689 nm)의 적색 레이저를 사용하여 CNVM를 치료한다. 비열성(non-thermal) 레이저 광이 염료 (예컨대 VISUDYNETM)를 활성화시켜, 비정상적인 혈관의 성장을 감소시키고 응고시키는 활성 형태의 산소를 발생시키고, 이것이 다시, CNVM로부터 유체의 누출을 억제한다. 본 발명의 sHASEGP는 예를 들어, 염료 (예컨대 VISUDYNETM)를 눈에 직접적으로 보다 국소적으로 투여하는 것을 촉진시키기 위해; 및/또는 PDT와 같은 절차와 연관하여 눈에 유용하게 투여되는 다른 제제의 송달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
신경절 낭
신경절 낭(손목 낭, 바이블 낭, 또는 등 힘줄 낭으로도 알려짐)은 손의 가장 일반적인 연성 조직 덩어리이다. 이것은 피부 아래에서 느껴질 수 있는 유체로 채워진 주머니이다. 이것은 대개 손 또는 손목에서 힘줄 집(힘줄을 윤활시키는 내층)에 부착되거나 또는 하부 관절과 연결되지만, 일부는 어떤 구조에도 연결되지 않는다. 이들은 또한 발에서 발생할 수도 있다. 이것은 힘줄 또는 관절의 내층을 덮고 있는 인대가 찢어지거나 내층이 인대 결함으로 탈출하여 피부아래의 융기를 야기하는 경우에 발생한다. 종종 염증이 관련되므로, 염증이 생긴 조직은 돌출 주머니를 채우는 젤리같은 유체를 생산한다. 이들은 낭내에 함유된 점성 유체의 높은 압력으로 인해 바위처럼 단단할 수도 있으며, 종종 뼈 융기로 오해된다.
sHASEGP는 신경절 낭을 완화시키기 위해 이용될 수 있다. 5-1000 유닛의 sHASEGP를 병변내 주사하고 이어서 미세 주사 흡입하면 수술없이 낭을 제거할 것이다. 코르티코스테로이드는 선택적으로 sHASEGP와 함께 주사될 수도 있다. 일부 환자는 추가 주사가 필요할 수도 있다.
점액부종
피부의 글리코스아미노글리칸(GAG) 침윤은 갑상샘과다증, 갑상샘저하증, 정강뼈앞점액부종, 공막점액부종, 및 경화부종의 특징이다. 히알루론산은 상기 모든 상태 및 정상 피부에서 주요 GAG이다. GAG 피부 분포의 조직학적 변이성은 최소이다. 후천성 피부 점액증은 유사한 피부 GAG 분포 및 생화학적 조성을 나타낸다. 섬유아세포 활성의 형태학적 차이는 경화부종 및 공막점액부종의 점액증이 국소 과정을 나타냄을 제안하는 반면, 갑상선 질병의 GAG 침윤은 전신성 기원을 가질 수도 있다. 이들 질환은 국소 및 전신 투여 경로 둘다로부터의 sHASEGP로 완화될 수 있다. 만성 치료의 경우, PEG화된 sHASEGP를 이용할 수 있다.
sHASEGP의 폐 사용
정상 개체로부터의 기관지폐포 세척(BAL)에서 히알루로난의 농도는 대개 15 ng/ml 미만이다. 하지만, BAL 농도는 호흡곤란 상태에서 극적으로 증가한다 (Bjermer Br Med J (Clin Res Ed) 1987 Oct 3; 295 (6602): 803-6). 예를 들어, ARDS에서는, 히알루로난 수준은 500 ng/ml까지 증가할 수 있는 반면, 농부 폐에서는 BAL 농도는 1000 ng/ml을 초과할 수 있다 (Hallgren et al Am Rev Respir Dis. 1989 Mar; 139 (3): 682-7), (Larrson et al Chest. 1992 Jan; 101 (1) : 109-14). 폐에서 증가된 히알루로난은 산소 확산 및 가스 교환 및 활성 호중구 및 대식세포 반응을 방지할 수 있다.
히알루로니다제의 소 제제는 많은 이유로 그러한 상태의 치료에 바람직하지 않다. 먼저, 히알루로니다제의 도살장 고환-유래 제제는 아크로신과 같은 세린 프로테아제로 오염되는 것으로 알려져 있다. 두번째, 소 효소의 외인성 특성은 환자를 사망하게 할 수도 있는 아나필락시스 반응의 확률을 증가시킨다. 따라서, 재조합 인간 sHASEGP의 매우 정제된 제제를 폐 또는 정맥내 전달에 의해 전달시킬 수 있다. 인간 sHASEGP는 또한 증가된 글리코스아미노글리칸과 관련된 다른 폐 합병증으로 고통받는 환자에게 투여될 수 있으며, 또는 다른 동시 전달되는 분자의 폐에의 전달을 개선하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예를 참고로 보다 상세히 설명될 것이다.
실시예 1
미세적정 계 히알루로니다제 분석
하기 실시예는 sHASEGP의 히알루로니다제 활성의 측정을 위한 신속한 분석을 제공한다. 이 분석은 W.H.O 표준 히알루로니다제 제제를 사용하여 TRU, IU 또는 NFU에 상관될 수 있다.
비오틴화된 히알루로난 미세적정 분석
히알루로난의 글루쿠론산 잔기의 자유 카르복실기는 비오틴-히드라지드(피어스(Pierce)), 설포 NHS(피어스) 및 1-에틸 디메틸아미노프로필-카르보디이미드(시그마)를 이용한 1 단계 반응으로 비오틴화된다. 이 비오틴화 HA 기질은 두번째 반응에서 96웰 미세적정 플레이트에 공유 결합된다. 효소 반응 완결시, 잔여 기질은 표준 ELISA 플레이트 판독기로 판독할 수 있는 아비딘-퍼옥시다제 반응으로 검출된다. 기질이 미세적정 플레이트에 공유 결합되므로, 비오틴화된 기질의 pH-의존성 치환과 같은 작위적 사항은 발생하지 않는다. 민감성은 배양된 세포 및 생물 샘플로부터 히알루로니다제 활성을 10% 미만의 분석간 편차로 신속하게 측정하도록 한다.
a. 프로토콜
비오틴화된 HA 기질의 제조
100 mg의 HA(시그마 케미컬)를 1 mg/ml의 최종 농도로 0.1 M MES, pH 5.0에 용해시키고 비오틴에 결합시키기 전에 4℃에서 적어도 24시간 동안 용해시켰다. 설포-NHS(피어스, 일리노이주 락포드 소재)를 0.184 mg/ml의 최종 농도로 CS04 MES 용액에 첨가하였다. 비오틴 히드라지드(피어스)를 100 mM 저장 용액으로서 DMSO에 용해시키고 1 mM의 최종 농도로 CS04 용액에 첨가하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미 노프로필) 카르비도디이미드(EDAC)의 저장 용액을 증류수중의 100 mM 저장 용액으로 제조하고 30 mM의 최종 농도로 HA 비오틴 용액에 첨가하였다. 이 용액을 4℃에서 밤새 교반시켰다. 미결합 비오틴과 EDAC를 1000배의 물을 세번 교환하면서 물에 투석시켜 제거하였다. 투석된, 비오틴화 HA(bHA)를 분취하여 몇달간 -20℃에서 저장하였다.
설포-NHS를 0.2 mg/ml의 농도의 bHA를 갖는 물에 0.184 mg/ml로 희석시키고 50 ㎕/웰로 96웰 COVALINK-NH 플레이트(NUNC; 뉴저지 플라세르빌 소재)에 피펫팅하였다. EDAC를 물에 0.123 mg/ml로 희석시키고 bHA 용액을 갖는 COVALINK-NH 플레이트에 피펫팅하여 10 ㎍/웰 bHA 및 6.15 ㎍/웰 EDAC의 최종 농도가 되도록 하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 또는 23℃에서 2시간 동안 항온처리하여 비교가능한 결과를 얻었다. 미세적정 플레이트에 bCS04를 공유적으로 고정시킨 후, 흔들어서 결합 용액을 제거하고 플레이트를 2M NaCl 및 50 mM MgS04 (완충액 A)를 함유하는 PBS로 세번 세척하였다. 플레이트를 최대 1주일동안 4℃에서 저장할 수 있다.
고정된 bHA를 가진 COVALINK-NH 플레이트를 100 ㎕/웰 분석 완충액 - 0.1 M 포르메이트, pH 3.7, 0.1 M NaCl, 1% TRITON X-100 계면활성제, 라이소좀 히알루로니다제를 위한 5 mM 사카로락톤; 또는 1mM CaCl2 및 중성 활성 효소를 위한 1 mg/ml 인간 혈청 알부민(ICN)을 갖는 lOmM Hepes PH 7.4-로 평형화시켰다. 소 고환 히알루로니다제(시그마 타입 VI-S)를 1.0 내지 10-6 rTRU/웰로 중성 효소 완충액에 희석하고 세벌로 100㎕/웰을 분석하여, "상대적 탁도 감소 유닛"(rTRU)에 대한 효소 활 성의 보정을 위한 표준 세트를 생성시켰다. 산활성 히알루로니다제의 샘플을 1:10 내지 1:130,000으로 라이소좀 분석 완충액에 희석시키고 100 ㎕/웰로 세벌로 피펫팅하였다. 조직 추출물 및 인간 혈장의 대부분의 분석의 경우, 37℃에서 30분 항온처리가 충분하였다. 양성 및 음성 대조군 웰(각각 효소 또는 ABC(하기 참고)가 없음)를 세벌로 포함시켰다.
200 ㎕/웰로 6M 구아니딘 HCl을 첨가하고 PBS, 2 M NaCl, 50 mM MgS04, 0.05% TWEEN 20 계면활성제(완충액 B)를 이용하여 300 ㎕/웰로 3회 세척하여 반응을 종결하였다. 아비딘 비오틴 복합체(ABC) 키트(벡터 랩, 캘리포니아주 벌림엄 소재)를 0.1% TWEEN20 계면활성제를 함유하는 PBS 10 ml에서 제조하였으며, 이를 항온처리동안의 실온에서 30분동안 예비항온처리하였다. ABC 용액을 첨가하고(100 ㎕/웰) 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 플레이트를 완충액 B로 5회 세척하고, 이어서 0.1 M 시트레이트-P04 완충액, pH 5.3의 10ml에 OPD 10 mg 정제를 용해하고 7.5 ㎕의 30% H2O2를 첨가하여 o-페닐렌디아민(OPD) 기질을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 10-15분동안 어두운 곳에서 항온처리하고, 이어서 바이오메탈릭스(Biometallics) (뉴저지 프린스턴 소재)로부터의 델타 소프트 II 플레이트 판독기를 이용하여 컴퓨터에 의해 모니터되는 ELISA 플레이트 판독기(Titertek Multiskan PLUS; ICN)에서 492 nm 필터를 이용하여 판독하였다. 시판 히알루로니다제 제제의 4 파라미터 곡선 핏트에 의해 소 고환 히알루로니다제를 이용한 표준 곡선을 생성하고, 미지 샘플은 그들의 492 nm에서의 흡광도를 통해 삽입하였다.
히알루로니다제의 pH 의존성을 분석하기 위하여, 정제된 재조합 sHASEGP와 소 고환 히알루로니다제를 이용한다. 효소 활성의 pH 의존성은 정제된 sHASEGP 또는 부분적으로 정제된 소 고환 히알루로니다제를 하기 완충액에서 0.1 rTRU로 희석하여 측정한다: 50 mM 포르메이트, pH 3-4.5; 50 mM 아세테이트, pH 5-6; 50 mM MES, pH 6-7; 또는 50 mM HEPES, pH 7-8. 샘플은 37℃에서 30분간 분석하고 활성은 최대 활성의 퍼센트로 표현하였다. NaCl은 고환 히알루로니다제 제제의 최적 pH를 변화시킬 수 있으므로, 완충액에 이용되지 않았으며(Gold, Biochem. J. 205: 69-74,1982; Gacesa et al. Biochem. Soc. Trans. 7: 1287-1289, 1979); 생리학적 염 농도(0.15 M)는 겉보기 pH 최적값을 감소시키며, 이 효과는 원래의 조 샘플에서보다 고환 효소의 정제 제제에서 더욱 심하였다.
b. 결과
히알루로난은 비오틴-히드라지드와 EDAC를 이용하는 1 단계 반응으로 비오틴화되었다. HA상의 유리 카르복실기를 비오틴 히드라지드와 결합시키는 EDAC를 제한함으로써, HA상의 전체 글루쿠론산 잔기의 작은 분획만이 표지되었다. HA(2.8 X 10-3 M)에 첨가된 EDAC의 이 양(3 X 10-5 M)은 HA의 93 이당류 단위 당 최대 한 분자의 비오틴 히드라지드가 결합하도록 한다.
pH 3.7에서 측정되고 1.0 내지 1 X 10-6 TRU/웰로 희석된 소 고환 히알루로니다제 표준 반응의 4-파라미터 곡선 피트를 준비하였다. 4 파라미터 곡선 피트는 식 y= ((A-D)/(1+(conc/C)^B)) + D)으로부터 확립되었으며, 이때 logit y= ln (y'/1-y'), y'= (y-D)/(A-D), B=-b/ln 10 및 C=EXP(a/B)이다. 4 파라미터(A,B,C,D)는 선형 회귀를 이용한 2+2 알고리즘을 이용하는 소프트웨어 프로그램으로 계산되었다 (Rodbard et al., Clin. Chem. 22: 350,1976).이 곡선 피트는 표준 곡선에 S자 모양을 포함시킨다. 샘플 측정을 위한 적절한 정확성은 일반적으로 30분 항온처리동안 0.001 내지 0.01 TRU/웰로 발생한다.60분 항온처리동안, TRU의 1/1000이 검출가능하다. 표준 로그 곡선 또한 보다 짧은 범위의 값에 걸쳐 이용되어 표준 곡선 피트를 확립할 수 있다. 본 발명은 특정 바람직한 구체예에 관하여 개시되었지만, 본 발명은 그러한 특정 구체예로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
실시예 2
sHASEGP cDNA의 클로닝
인간 sHASEGP를 코딩하는 핵산은 인공 유전자 합성, RT-PCR, 및 cDNA 라이브러리 하이브리드화를 비롯한 많은 과정을 통해 당업자가 쉽게 얻을 수 있다 (예를 들어, Gmachl et al FEBS 336 (3) 1993, Kimmel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 10071-10075 참고). 다르게는, 인간 sHASEGP를 코딩하는 클론은 IMAGE 또는 다른 인간 유전자 서열의 공급체(인비트로겐(Invitrogen) 클론 ID IOH10647)로부터 얻을 수 있다.
전장 인간 PH20 cDNA는 2009 뉴클레오티드 길이이며 1530 뉴클레오티드의 개방 판독 프레임을 함유하였다. 5' UTR은 특이하게 크며, 이것은 보유된 인트론을 나타낼 수 있으며, 5' UTR의 9개의 비코딩 개시 코돈으로 인해 리보좀이 정확한 개시 메티오닌 코돈에 결합하는 것을 방해하여 번역을 억제할 수 있다. 단백질(젠뱅크(Genbank) 기탁 번호 NP_003108)은 서열 번호 1의 509 아미노산을 포함하며 58 kDa의 계산 분자량을 갖는다.
클론의 서열 결정의 경우, PCR 증폭된 밴드를 잘라내고, 젤 추출 키트(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 용출시키고, 제한 분해 후 양립성 말단을 갖는 적절한 벡터내로 클론시킨다. 모든 서열 결정 반응은 Taq 염료 데옥시 종결자 사이클 서열결정 키트(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 제조자의 지시에 따라 이용하여 이중쇄 DNA에서 실시되며, ABI PrismTM 자동화 서열결정기(어플라이드 바이오시스템즈)에서 실시된다.
인간 PH-20 개방 판독 프레임은 서열 번호 14 및 47의 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 인간 고환 cDNA 라이브러리(클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 증폭시켜 얻어졌다. PCR 생성물을 NheI 및 BamHI으로 분해하고 벡터 IRESpuro2(클론테크)의 NheI 및 BamHI 부위내로 클론시켰다.
실시예 4
인간 PH20 cDNA로부터 sHASEGP의 분리
포유류 세포 내에서 유효하게 글리코실화할 수 있는 촉매적 활성 분비형 재조합 인간 sHASEGP 발현 벡터를 다음과 같이 생성시켰다. sHASEGP를 또한 생성할 수 있는 다른 종 예컨대 효모 및 곤충용의 프로모터 및 선별용 유전자를 갖는 기타 발현 구성체의 사용을 고려할 수 있다. 글루타민 합성 효소 또는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 등과 같은 양성 선별 유전자를 또한 사용하여도 된다. 이하에 제시되는 실시예들은 이에 한정하고자 하는 의도가 아니라 사용해도 되는 몇몇 플라스미드 발현 시스템의 일례들로 제공하고자 하는 것이다.
sHASEGP의 분비형을 구축하기 위하여, 소수성 C 말단이 결핍된 절두형 돌연변이체를 구축하였다. GPI 절단 예측 프로그램을 사용하여, 전장 GPI-앵커된 단백질의 아미노산 위치 N 483 주변에 GPI 앵커 절단 부위를 확인하였다. 7개의 네스티드(nested) 3'프라이머 세트를 사용하여 위치 Y482로부터 출발하여 하나의 아미노산씩 단계적으로 결손시켜서 예측한 GPI 앵커가 결핍된 7개의 절두형 결손 돌연변이체 세트를 구축하였다. 이들 프라이머는 3' 프라이머에서 중지 코돈으로 태깅하지 않았거나, 또는 정제 및 검출의 용이성을 위해 C 말단 His 태깅된 단백질로서, 절단 돌연변이를 벡터 Irespuro2에 클로닝시키기 위해 상용성 Nhe1(5') 및 BamH1(3') 부위를 갖도록 설계하였다. 예를 들어, 역방향 프라이머 서열 번호 8, 9 및 10을 사용하여 6 His 태그없이, 위치 Y 482, F481, 및 I 480 위치에서 종결되는 결실 돌연변이를 생성시켰다. 다른 돌연변이체 프라이머는 특정 아미노산을 포함시키고 배제시키는 적절한 변형을 갖도록 동일한 염기 디자인으로 생성하였다. His-태깅된 변이체를 생성시키기 위하여, 전방향 프라이머는 동일하며, 각 역방향 프라이머에 중지 코돈이 없는 것을 제외하고는, 태깅되지 않은 변이체에 대한 것과 동일한 프라이머 세트를 이용하였다 (His 태깅된 구성체에 대한 프라이머는 서열 번호 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25를 가지며, 이들은 각 구성체에 대하여 태깅되지 않은 역방향 프라이머에 상응하는 프라이머에서, 중지 코돈이 없는 역방향 프라이머를 말함). 중첩 프라이머를 이용하여 Irespuro2 벡터의 BamH1 및 Not1 부위 내에 헥사히스티딘이 후속되는 6 아미노산 스페이서를 구축하여서, PCR 증폭되고 제한 효소로 분해한 생성물을 his 태그 함유 Irespuro2 벡터의 Nhe1(5') 및 BamH1 부위내에 결찰시켜 His-태깅된 돌연변이를 생성시켰다.
인간 sHASEGP의 카르복시 말단을 변형시켜, 분비형 중성 활성형 효소를 생성할 수 있는지 확인하기 위하여, 벌 독소 효소와의 상동성에 기초해서, GPI 앵커 부착 부위로부터 예측 "촉매 도메인"까지의 일련의 절두형을 제조하였다.
IRESPuro2내의 인간 sHASEGP 전장 GPI 앵커된 클론을 코딩하는 DNA를 주형으로하여 다양한 절두형 결실 돌연변이체를 생성하였다. 소프트웨어 모델링 프로그램을 통해 전장 폴리펩티드에 대하여 몇 가지 예측되는 절단 부위를 얻었다. 이러한 예측 부위 중 하나는 아미노산 위치 N483(서열 번호 1)이다. PCR 프라이머는 N483으로부터 단백질을 연속적으로 절단시켜, Y482(N 결핍)에서 시작하여 E477(P 결핍)에서 끝나는 6 결실 돌연변이를 생성하도록 설계하였다.
a. 프로토콜
N483이 결핍된 절두형 돌연변이체의 생성:
pIRESPuro2의 Nhe1 및 BamH1 부위 사이의 전장 GPI 앵커된 sHASEGP 클론을 주형으로 사용하였다. M1의 천연 시그널 펩티드의 개시 메티오닌에서 시작하는 NheI 부위를 함유하는 5' 프라이머(서열 번호 14), 및 Y482에서 종결되는 BamHI 부위를 함유하는 3' 프라이머(서열 번호 8)를 사용하여 상기 주형을 증폭시켰다. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 분리시켜서 정확한 크기의 증폭 밴드를 확인하고, 이 겔을 정제하여서, NheI 및 BamHI의 제한 효소로 분해하여서 벡터 pIRESPuro2(클론테크)내의 NheI 및 BamHI 부위 사이로 클로닝시켜 아미노산 위치 N482에서 종결되고 GPI 앵커가 결핍된 아미노산 서열(Y482까지의 sHASEGP의 생성 폴리펩티드 서열에 대한 서열 번호 5) 및 뉴클레오티드 서열(서열 번호 48- 서열 번호 5의 폴리펩티드를 위한 코딩 뉴클레오티드)를 갖는 sHASEGP의 절두형 돌연변이체를 발현시키기 위한 발현 벡터를 생성하였다.
각각 Y482, F481, I480, Q479, 및 P478이 결핍된 다른 절두형 돌연변이체의 생성:
각 돌연변이체에 대하여 적절한 3' 프라이머를 사용한 것만이 다르며, 상기와 동일한 전략을 사용하였다. 각 3' 프라이머는 하기와 같다:
Y 482가 결핍된 sHASEGP 돌연변이체를 위한 3' 프라이머 - 서열 번호 9
F 481이 결핍된 돌연변이체를 위한 3' 프라이머 - 서열 번호 10
I 480이 결핍된 돌연변이를 위한 3' 프라이머 - 서열 번호 11
Q 479가 결핍된 돌연변이를 위한 3' 프라이머 - 서열 번호 12
P 478이 결핍된 돌연변이를 위한 3' 프라이머 - 서열 번호 13
sHASEGP의 최소 활성 도메인을 결정하기 위한 추가적인 결실 돌연변이체의 생성:
10 내지 20 아미노산 블록의 추가 결실을, E477까지의 sHASEGP인 sHASEGP의 최내쪽 중성 pH 활성 절두형 돌연변이체의 3' 말단으로부터 제조하였다. 카르복시 말단으로부터 목적하는 길이의 sHASEGP 결실 돌연변이체를 PCR 증폭하기 위하여, 상기 NheI 전방향 프라이머(서열 번호 14)와 적절히 위치된 3' 프라이머를 사용하였다. IRESPuro2 벡터의 발현 구성체로부터 발현 시, 서열 번호 49의 폴리펩티드를 생성하도록, 예를 들어, PCR 용 각 5' 및 3' 프라이머로서 서열 번호 14 및 26에 개시된 프라이머를 사용하였다. 유사하게, 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31 및 32에 개시된 역방향 3' 프라이머를 이용한 PCR을 이용하여, 각각 성숙 sHASEGP의 아미노산 위치 A 447, S 430, G 413, S 394, A 372, 및 S 347에서 끝나는 결실 돌연변이체를 생성하였다. 각 경우에 PCR 생성물은 NheI 및 BamHI 효소로 절단하였으며 절단한 생성물은 NheI 및 BamHI 부위 사이에서 pIRESPuro2 벡터내로 클로닝시켰다. 각 그룹 내 최종 발현 구성체 중 몇몇 독립적인 클론을, CD-CHO 무혈청 배지(인비트로겐, 캘리포니아주)중의 CHO 세포에 일시적 형질감염시키고, 표시한 시점에서 분석용 샘플을 채취하여 상기 클론에 대한 분비성 중성 활성형 sHASEGP 활성을 시험하였다. 밤샘 배양물로부터 준비한 미니프렙 DNA를, 제조자의 추천 프로토콜에 따라 Genejuice(Novagen, 캘리포니아주 소재) 형질감염 시약으로 형질감염시켰다. 히알루노니다제 활성을 상기에서 기술한바와 같이 마이크로타이터 분석을 통해 측정하였다.
b. 결과
sHASEGP 절단 돌연변이에서 히알루노니다제 활성을 측정하여 분비형 중성 활성형 히알루노니다제 활성을 위한 최소 활성 도메인을 확인하였다.
Figure 112007068929656-pct00001
상기 결과에 따르면, Y482에서 E477까지의 아미노산에서 종결되는 모든 여섯 개의 1 아미노산 결실 돌연변이체가 GPI 앵커된 sHASEGP에 비하여 보다 높은 분비 활성을 제공하고 있음을 알 수 있다.
상기 결과는 또한 A467를 넘어서 그 이상으로 결실된 경우에는 모든 분비 활성이 제거됨을 보여주고 있다. A467 클론의 분비형 중성 활성은 P478 또는 N483 클론에서 확인되는 활성의 약 10% 만큼 감소하였다. 따라서 결론내리면, 중성 활성형 히알루로니다제 도메인을 생성시키기 위해서는, 벌 독소 효소에 의하여 앞서 추정한 것보다, 인간 sHASEGP의 카르복시 말단 도메인이 보다 많이 필요하다는 것을 알 수 있다. 따라서, 카르복시 말단 도메인의 시스테인이 중성 활성에 필요하다. N483에서 GPI 절단 부위 앞의 약 10 아미노산에 걸친 매우 협소한 범위가 최소 활성 도메인인 것으로 정의 내렸다.
실시예 5 - sHASEGP 분비성 활성에 대한 시그널 펩티드 변형의 효과
인간 sHASEGP는 현저하게 길이가 긴 예측 천연 리더 펩티드를 보유한다. 부가적으로, 리더 펩티드에 존재하는 두 인접한 시스테인 잔기는 고수준의 발현 동안 소포체내에서 폴리펩티드 다량체의 응집을 야기하여 sHASEGP의 고수준 발현을 방지할 수 있다. 따라서 보다 효율적인 일련의 분비성 리더 펩티드들에 대하여, sHASEGP의 분비를 위한 표적화를 강화시키는 능력을 조사하기 위하여 시험하였다.
a. 프로토콜
카파 리더 펩티드는 서열 번호 37,38,39 및 40의 서열에 해당하는 프라이머를 이용한 중복 프라이머 어닐링 및, 연장 PCR에 의해 구성하였다. 생성된 PCR 증폭 카파 서열을 5' 말단에 NheI 부위(서열 번호 41에 개시) 및 3' 말단에 EcoRI 부위(서열 번호 42 에 개시)를 함유하는 측접 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이를 통해 카파 리더 펩티드(폴리펩티드 서열은 서열 번호 43에 개시됨)를 리트머스(Litmus) 39(NEB) 벡터의 NheI 및 EcoRI 부위 사이에 클로닝하였다. sHASEGP는 내부 EcoRI 부위를 가지며; 따라서 NheI 및 EcoRI 부위 사이의 이 카파 구성체를 5' SpeI 프라이머(서열 번호 44에 개시됨) 및 3' MluI 프라이머(서열 번호 45에 개시됨)를 사용하여 추가 증폭하였다. P478에서 끝나는 GPI 앵커없는 sHASEGP를 NheI 및 BamHI으로 pIresPuro2로부터 절단하고, 리트머스39 벡터의 NheI 및 BamHI 부위내에서 리트머스39(NEB) 벡터로 클로닝시켰다. 이렇게 얻어진 sHASEGP-함유 리트머스 벡터를 SpeI 및 MluI 제한 효소로 분해하고 SpeI 및 MluI로 증폭된 카파 리더 구성체를 그안에 클로닝시켰다. 카파 및 sHASEGP 서열 모두를 함유하는 이 리트머 스 39 벡터에서 위치 지정 돌연변이유발을 실시하여 카파 리더 서열을 sHASEGP의 성숙 폴리펩티드에 인프레임으로 융합시켰다. 서열 번호 34 및 35에 해당하는 프라이머 쌍을 이용하여, sHASEGP(최대 P478까지)의 F38에 융합된, 말단 아미노산으로 천연 Asp를 갖는 카파 리더를 생성하였다 (융합 단백질의 폴리펩티드 서열은 서열 번호 46에 개시됨). 서열 번호 35와 서열 번호 33에 의해 구현된 것과 같은 다른 프라이머쌍 조합을 이용하여, sHASEGP의 L36에 융합된, 말단 Asp(D)에서 끝나는 카파 리더를 생성시키고, 서열 번호 36과 서열 번호 33을 이용하여 sHASEGP의 L36에 융합된 Gly(G)(말단 Asp(D) 앞)에서 끝나는 카파 리더를 생성시켰으며, 서열 번호 36과 서열 번호 34를 이용하여 sHASEGPDML F38에 융합된, Gly(G)(말단 Asp(D) 앞)에서 끝나는 카파 리더를 생성시켰다. 위치 지정 돌연변이유발에 의해 얻어진 카파-sHASEGP 융합체를 겔 정제하고, 효소 DpnI로 분해하여 임의의 캐리오버 모 DNA를 분해시키고, 이어서 NheI 및 BamHI으로 분해시킨 후, pIRESPuro2 벡터내의 BamHI과 NotI 부위 사이에 클로닝된 his 태그(6 히스티딘이 후속되는 6 아미노산 스페이서)를 갖는 NheI/BamHI 분해된 HisIresPuro2 골격에 클로닝하였다. 따라서 결찰시, pIresPuro2내에 NheI-카파-sHASEGP-BamHI-His인 구성체를 얻게 되었다. 카파 리더 말단에서 G 또는 D 및 성숙 sHASEGP의 시작에서 L36 또는 F38의 조합에 해당하는 구성체 4 세트를 얻었다. 각 타입의 구성체 중 몇 가지 독립적인 클론을 CD-CHO 배지(Invitrogen, 캘리포니아주)에서 CHO 세포내로 형질감염시키고 카파 분비 리더의 존재가 천연 분비 리더에 비하여, 분비형 단백질의 수준 증가를 촉진하는지 시험하였다. 밤샘 배양물로부터 제조된 미니프렙 DNA를 제조자의 추천 프로토콜에 따라 Genejuice(Novagen, 캘리포니아주) 형질감염 시약으로 형질감염시키고, 지정한 시점에서 마이크로타이터 분석을 통한 시험을 위한 샘플을 취하였다. 히알루노니다제 활성을 상기에서 기술한 바와 같이 마이크로타이터 분석으로 측정하였다.
보다 높은 수준으로 분비형 중성 활성형 sHASEGP 활성에 대해 시험하기 위하여 마우스 IgG 카파쇄 리더 펩티드 sHASEGP 융합 구성체를 시험하였다.
b. 결과
인간 sHASEGP 유전자 구성체 U/ML/24시간 pH 7.4
IgG 카파 리더 sHASEGP AA 38-478 HIS6 3.0257
천연 리더 sHASEGP AA 1-478 HIS6 0.4857
효소 분석 결과에 의하면 IgG 카파 리더는 이같은 리더가 결핍된 클론 P478, Y482 또는 N483과 비교시 천연 분비 리더에 비해 약 7 내지 8배 높게 sHASEGP의 분비를 증가시킬 수 있는 것으로 나타냈다. 카파 리더의 Asp 또는 Gly에서부터 sHASEGP의 L36 또는 F38까지의 리더 융합 부위에 변이를 갖는 다른 카파 리더 구성체도 역시 분비형 중성 활성형 히알루노니다제의 활성 수준을 증가시켰다. 다른 효과적인 분비 리더 서열이 동일한 기법으로 사용될 수 있으므로, 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이라기보다는 확장하고자 하는 의도이다.
실시예 6
인간 sHASEGP 발현 벡터의 생성
에피토프 태그가 없는 sHASEGP를 바이시스트론 발현 카세트, HZ224(서열 번호 47)에 클로닝시켜 생성하였다. sHASEGP의 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 골격(Promega), 인간 PH20 히알루노니다제의 아미노산 1-482를 코딩하는 DNA 서열, ECMV 바이러스(Clontech) 유래의 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 포함한다. pCI 벡터 골격은 또한 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제 기원, 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 영역(CMV), 키메라 인트론, 및 SV40 후기 폴리아데닐화 시그날(SV40)을 포함한다. sHASEGP 구성체를 코딩하는 DNA는 천연 시그날 리더의 메티오닌에 코작(Kozak) 일치 서열 및 티로신 482에서 중지 코돈을 함유하였다. 생성된 구성체 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ-24)는 내부 리보솜 진입 위치에 의해 분리되어 PH20의 아미노산 1-482 및 디하이드로폴레이트 리덕타제의 아미노산 1-187을 코딩하는, CMV 프로모터에 의해 구동되는 단일 mRNA 종을 생성한다.
인간 PH20 오플 리딩 플레임을 PH20의 메티오닌앞에 NheI 부위와 코작 일치 서열을 도입한 5' 프라이머와 티로신 482 뒤에 중지 코돈을 도입하고 BamHI 제한 부위를 도입한 역방향 프라이머를 이용하여 Invitrogen ORF 클론(IOH10647, Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터 증폭시켰다. NheI 및 BamHI으로 PH20 PCR 단편을 분해한 후, 생성된 PCR 생성물을 플라스미드 pIRESpuro2(Clontech, 캘리포니아주 팔로 알토 소재)내로 결찰시켰다.
실시예 7
sHASEGP 발현 세포주의 생성
4 mM 글루타민 및 18 mL 플루리오닉(Plurionic) F68/L(Gibco)로 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장시킨 비형질감염 DG44 CHO 세포를 형질감염을 위하여, 진탕 플라스크에 0.5 X 106 세포/mL로 접종하였다. 120 rpm으로 진탕하면서 5% CO2 가습 배양기에서 37℃에서 세포를 성장시켰다. 기하급수적으로 성장한 비형질감염 DG44 CHO 세포에 대하여 생존성을 시험하고 형질감염시켰다.
비형질감염 DG44 CHO 세포 배양물의 60,000,000 생존 세포를 침전시키고 2X 형질감염 완충액(2X HeBS = 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KC1, 1.4 mM Na2HP04, 12 mM 덱스트로스) 0.7 mL에서 20,000,000 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁 세포의 각 분취액에, 선형 HZ24 플라스미드(250 ㎍) 0.09 mL을 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm 갭 BTX(젠트로닉스) 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 음성 대조군 전기천공을 플라스미드 DNA가 혼합되지 않은 세포로 실시하였다. 세포/플라스미드 혼합물을 330 V와 960 uF 또는 350 V와 960 uF의 축전지 방전으로 전기천공시켰다.
전기천공 후 큐벳에서 세포를 제거하고 4 mM 글루타민 및 18 mL 플루리오닉 F68/L(Gibco)로 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지 5 mL에 옮기고, 5% CO2 가습 배양기에서 37℃에서 2일 동안 선별없이 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에서 성장시켰다.
전기천공 후 2일째에, 조직 배양 배지 중 0.5 mL을 각 웰에서 취하여 히알루노니다제 활성의 존재에 대해 시험하였다.
형질감염 후 40시간에 HZ24 형질감염된 DG44 CHO 세포의 초기 히알루노니다 제 활성
희석도 활성 (유니트/mL)
형질감염 1
330V		 1 내지 10 0.25
형질감염 2
350V		 1 내지 10 0.52
천연 대조군 1 내지 10 0.015
형질감염 2(350 V)의 세포를 조직 배양 웰에서 채취하고, 계수하여 mL 당 10,000 내지 20,000 생존 세포로 희석하였다. 세포 현탁액의 0.1 mL 분취액을 5개의 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 4 mM 글루타막스-1을 함유하고 하이포잔틴 및 티미딘 보충물이 없는 CD-CHO(Gibco) 0.1 mL을 세포 함유하는 웰에 첨가하였다 (최종 부피 0.2 mL).
10개의 클론을 메토트렉세이트없이 성장시킨 5 개의 플레이트로부터 확인하였다.
플레이트/웰 ID 상대 히알루로니다제 활성
IC3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
1E11 242
A1(+) 대조군 333
H12(-) 대조군 0
6개의 HZ24 클론을 배양하고 단일 세포 현탁액으로 진탕 플라스크로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, 및 4D10을 2차원 무한 희석법을 사용하여 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰 당 500 비형질감염 DG44 CHO 세포의 백그라운드로 성장시켜, 배양 초기동안 필요한 성장 인자를 제공하도록 하였다. 서브클론 당 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론을 생산하였다. 24개의 서브클론중 8개의 상등액에서 유의한 히알루로니다제 활성이 측정되었으며(> 50 Units/mL), 이들 8개의 서브클론을 50 nM 메토트렉세이트의 존재하에서 T-25 조직 배양 플라스크내에서 증식시켰다. 클론 3D3 50 nM을 500 nM 메토트렉세이트에서 추가 증식시켜 진탕 플라스크에서 1,000 Units/mL가 초과하여 생산하는 클론을 얻었다 (클론 3D3 5M).
실시예 8
sHASEGP의 생산
3D3 5M의 바이알을 해동시키고 100 nM 메토트렉세이트와 글루타맥스(인비트로겐)로 보충된 CHO CDM(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 T 플라스크에서 1L 스피너 플라스크로 확장시켰다. 세포를 ml 당 4.0 x 10E5 생존 세포의 접종 밀도로 스피너 플라스크에서 5 L 생물반응기(브라운)로 옮겼다. 파라미터는 온도 고정점, 37℃, pH 7.2(시작 고정점)이었으며, 용존 산소 고정점 25% 및 0-100 cc/분의 공기 오버레이였다. 168 시간에, 250 ml의 공급 #1 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스)를 첨가하였다. 216 시간에, 250 mL의 공급 #2 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 10 mM 소듐 부티레이트)를 첨가하고, 264시간에 250 mL의 공급 #2 배지를 첨가하였다. 이 과정에 의해 6백만 세포/mL의 최대 세포 밀도에서 1600 Units/ml의 최종 생산성이 얻어졌다. 생산의 최종 단계에서 소듐 부티레이트의 첨가를 통해 sHASEGP의 생산을 극적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
3D3-5M 성장 및 sHASEGP 생산, 5L 생물반응기
Figure 112007068929656-pct00002
실시예 9
sHASEGP의 정제
3D3 클론 유래의 조건 배지를 다층 여과를 통해 정화하고 10 mM Hepes pH 7.0 으로 접선 유동 정용여과하였다. 이어서 가용성 sHASEGP를 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온 교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록스아파타이트 크로마토그래피(Biorad, 캘리포니아주 리치몬도 소재)에서 순차적으로 크로마토그래피시켜 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 sHASEGP를 동일한 완충액에서 400 mM NaCl에서 용리시켰다. 용리물을 500 mM ASO4의 최종 농도로 2M 암모늄 설페이트로 희석시키고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시키고, 이어서 동일한 조건하에서 페닐 보로네 이트 수지에 결합시켰다. sHASEGP를 AS04없는 50 mM 비신에서 pH 9.0에서 세척한 후 Hepes pH 6.9에서 페닐 세파로즈 수지로부터 용리시켰다. 용리물을 5 mM PO4 1 mM CaCl2에서 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파티트상에 충전하고 0.1 mM CaCl2를 함유하는 80 mM PO4 pH 7.4로 용리시켰다.
최종적으로 정제된 sHASEGP는 USP 참고 표준을 사용한 미세탁도 분석을 통해 비활성(specific activity)가 65,000 USP Units/mg 단백질을 초과하였다. 정제된 sHASEGP는 0.1 % TFA/H20 및 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 이용하는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24 내지 26분에서 단일 피크로 용리되었으며, PNGase-F로 처리시 뚜렷한 51 kDa 밴드로 감소되는, SDS 전기영동에 의해 61 kDa의 단일한 광범위 밴드로 분리되었다. N-말단 아미노산 서열분석 결과, 리더 펩티드가 효과적으로 제거된것으로 확인되었다.
생화학적으로 정제된 sHASEGP의 N-말단 아미노산 서열
Figure 112007068929656-pct00003
실시예 10
DG44 CHO-유래 sHASEGP 글리코실화의 분석
상이한 종에서 유래한 sHASEGP는 촉매 활성을 위해 글리코실화가 필요한가에 대하여 상반되는 데이타가 존재하였다. 예를 들어, 효소 활성형 벌 독소 히알루로 니다제는 이.콜라이와 같이 글리코실화 기전이 없는 세포에서 합성할 수 있다. 게다가, 정제한 소의 고환 히알루로니다제를 PNGase로 처리하여 효소 활성이 불활성화되지 않는다 (Yamagata et al 1997). 다른 연구 보고에 의하면 탈글리코실화 이후 활성이 손실되었으며 이황화 결합이 더욱 필요하였다.
이러한 모든 종래 연구는 조악하거나 부분 정제된 조제물을 이용하여 이루어졌기 때문에, 활성의 손실이 탈글리코실화 효소가 미정제 조제물중에 오염된 프로테아제에 노출되어 야기된 결과인지 또는 글리코실화와 촉매 활성 간의 직접적인 기능적 관계의 결과인지는 분명하지 않았다.
a. 프로토콜
단백질 무함유 조건하에서 CHO 계 발현 시스템을 이용하여 기능적 N-결합 글리코실화가 인간 sHASEGP내로 도입될 수 있는지를 확인하기 위하여, 화학적으로 정의된 배지에서 IRESpuro 비시스트론 카세트를 이용하여 인간 sHASEGP-HIS6을 코딩하는 cDNA를 CHO 세포에서 발현시켰다. 세포를 CHO CDM(Invitrogen/Gibco)에서 72시간 동안 성장시키고, 이어서 농축시키고, 30 kDa 컷오프 멤브레인이 구비된 펠리콘 TFF 유닛(Millipore)에서 접선 유동 정용여과시켰다. 농축물을 10 mM Hepes PH 7.4 50mM NaCl로 교환시켰다. 이어서 정용여과물을 DEAE 스트림라인 세파로즈 수지에 충전시키고 Pharmacia FPLC 수지에서 0-1M NaCl의 NaCl 구배로 용리시켰다. 인간 sHASEGP는 10-30% NaCl 사이에서 용리되었다. 컬럼 분획에서 sHASEGP의 농도는 효소의 대다수가 10-30% NaCl 구배에서 회수됨을 결정하였다. 이어서, 10-30% NaCl 구배의 효소를 Ni로 하전된 IMAC 수지에서 친화성 크로마토그래피하여 추가 정제하 였다. 50 mM 아세테이트 pH 5.0와 10 mM 이미디졸로 세척한 후 IMAC 수지로부터 인간 sHASEGP를 용리하였다. 단백질을 농축시키고 10 mM Hepes pH 7.4에 대하여 투석시켰다. 매우 정제된 효소는, 1 mM 칼슘 및 1 mg/ml HSA의 존재하에서 ELISA-계 비오틴화 기질 마이크로타이터 분석에서 97,000 Units/mg 단백질의 비활성을 보유하는 것으로 나타났다.
분자량과 관련한 단백질의 변화를 검출하기 위하여, 정제된 인간 sHASEGP를 PNGase 또는 뉴라미니다제로 밤새 처리하고 겔 전기영동하여 전기이동시키고 HRP 결합된 항 His6 모노클로날 항체(퀴아젠)을 이용한 웨스턴 블롯 분석 및 ECL 검출을 하였다.
b. 결과
웨스턴 블롯 분석 결과는 CHO 세포에서 생산된 인간 sHASEGP가 PNGase 처리에 감응성인 것으로 확인되었다. 인간 sHASEGP의 상대 분자량에 의하면 단백질이 상당히 글리코실화되어 있었다. PNGase로 완전하게 분해시킨 경우, 인간 sHASEGP는 단일 종으로 감소되었는데, 이는 미분해 밴드의 마일드한 비균질성이 N-결합 당 잔기에 기여할 수 있음을 확증시켜주는 것이다. PNGase F 부분 분해는 미처리로 중간 변위 그리고 보다 긴 처리로 점진적인 변위가 연속되는 것으로 나타났다. 밴드가 7% 겔에서 다소 확산되었으나, 적어도 6개의 상이한 중간체 이소폼이 가시화되었다.
뉴라미니다제로 sHASEGP를 처리한 결과, CHO 세포가 사실상 시알화된 인간 sHASEGP를 합성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 뉴라미니다제 처리 및 7% 겔에서의 sHASEGP의 웨스턴 블롯 분석시, CHO 유래 인간 재조합 sHASEGP는 미처리 sHASEGP와 비교할 때 이동성에서 약 1-3 kDa 변위된 것으로 나타났다. 따라서 이는 실질적으로 시알화된 인간 sHASEGP가 생성된다는 첫번째 보고서이다. 이것은, 많은 종에서 유래한 천연 정자 sHASEGP는 시알화가 결핍되어 시알산 특이적 렉틴과 반응하지 않기때문에, 인간 sHASEGP의 안정성 그리고 이의 혈청 반감기를 개선하는데 매우 중요하다.
sHASEGP의 FACE 분석
FACE 분석에 의한 활성 sHASEGP 올리고당의 분석으로 촉매적으로 활성인 sHASEGP의 프로파일을 신속하게 결정가능하다.
프로토콜
3D3 5M 클론에서 정제된 히알루로니다제를 FACE® N-결합된 올리고당 프로파일링(프로자임)을 이용하여 평가하였다. N-글리카나제(a.k.a PNGase)로 효소 분해시켜 당단백질 128.7㎍로부터 올리고당을 절단하고, 형광단 ANTS를 이용하여 표지하고, 전기영동으로 분리하였다. 올리고당 밴드의 상대적 위치는 중합도(DP) 단위로 이동 거리를 표시하는 올리고당 표준 래더와 함께 샘플과 샘플 희석물을 런닝시켜서 결정하였다.
결과
히알루로니다제 샘플에 대한 N-프로파일은 10개 밴드로 구성되며, 이중 6개(올리고당 표준 밴드 G5-G12와 동시 러닝)는 9%를 넘는 강도를 가졌다. 또한, G9 표준 래더와 함께 런닝하는 밴드의 강도가 35%-46%로 가장 강했다.
sHASEGP 올리고당 분석
Figure 112007068929656-pct00004
실시예 11
효소 활성에 대한 sHASEGP N-결합 글리코실화의 의존성
a. 프로토콜
정제된 HIS6 sHASEGP 샘플을 50 mm 옥틸글루코시드없이 또는 이것과 함께, 뉴라미니다제와 PNGase를 함유한 완충액 37℃에서 밤새 혼합하였다. 올리고당은 웨스턴 블롯 분석에서 겔 시프트를 통해서, 이의 제거를 확인하였다.
b. 결과
샘플 U/ML
Rx 없음 22.01
뉴라미니다제 O/N 50 mM OG 23.57
PNGase F w/ 50 mM OG 0.0
PNGase F w/o 50 mM OG o/n 10.74
실시예 12
황화 및 비황화 글리코스아미노글리칸에 대한 sHASEGP의 활성
HA를 이용하는 마이크로타이터 분석이외에, 다른 글리코스아미노글리칸에 대한 sHASEGP의 활성을 측정하기 위하여, 정제한 기질을 사용하는 겔 이동 분석을 이용하여, 다른 글리코스아미노글리칸 또는 프로테오글리칸에 대한 sHASEGP의 기질 특이성을 시험하였다. 많은 히알루로니다제 분석법은 새로운 환원성 N-아세틸아미노기의 생성(Bonner and Cantey, Clin.Chim. Acta 13: 746-752,1966), 또는 점도의 손실(De Salegui et al.,Arch. Biochem. Bioplays. 121: 548-554,1967) 또는 탁도(Dorfman and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948)의 측정에 기초하는 것들이었다. 이러한 모든 방법들에 정제 기질을 사용하는 것은 엔도글루코스아미드 활성의 존재 또는 부재를 확인하는데 충분하다.
a. 프로토콜
겔 시프트 분석법 - 정제 기질을 재조합 sHASEGP와 혼합하여 겔내에서 기질의 이동성 증가를 야기하게 되는 엔도글루코시다제 활성에 대한 시험을 수행하였다. 콘드로이틴 설페이트 A, 아그레칸 및 D는 Calbiochem에서 구입하였다. 히알루로난(인간 탯줄) 콘드로이틴 설페이트 C, 더마탄 설페이트, 및 헤파란-설페이트를 Calbiochem에서 구입하였다. 인간 탯줄 히알루로난을 ICN에서 구매하였다. 각 시험 기질을 0.1 mg/ml로 희석하였다. 정제 sHASEGP 또는 sHASEGP 발현 세포의 조건 배지 샘플 10 ㎕를 바람직한 완충액 중에서 시험 기질 90 ㎕와 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리한 샘플을 샘플 완충액(Tris EDTA PH 8.0, 브 로모페놀 블루 및 글리세롤)으로 중화시키고 15% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 겔을 3% 빙초산중의 0.5% 알시안 블루로 밤새 염색하고 7% 빙초산으로 탈색시켜 글리코스아미노글리칸을 검출하였다. 효소의 존재 및 부재 시의 기질 이동을 비교하여 분해를 확인하였다.
b. 결과
10 ㎕중의 100 units의 sHASEGPHIS6를 다양한 글리코스아미노글리칸과 프로테오글리칸 10㎍을 함유하고, 50 ㎍/mL 인간 혈청 알부민을 포함하는 10 mM Hepes 완충액 90㎕와 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 전기영동 분석을 수행하고 이어서 알시안 블루를 염색한 바에 따르면, 콘드로이틴 설페이트 A, C 및 D, 아그레칸 및 히알루로난에서는 단일 종으로 이동성 시프트가 증가하는 것으로 나타났으나, 헤파란 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트 B에서는 그렇지 않았다. 비분해 글리코스아미노글리칸은 겔의 중간에서 번져서 이동하는 반면, 분해된 생성물은 점증식 래더로 이동하는 소량의 물질로, 염료 전면에서 이동하는 다수의 알시안 블루 염색이 나타났다.
실시예 13
sHASEGP 활성화에 대한 금속 이온의 효과
적절한 효소 활성을 위해 글리코실화가 요구될뿐만 아니라, 인간 sHASEGP는 적절한 효소 활성을 위해 양이온으로 활성화되는 것이 밝혀졌다. 정제 과정에서, sHASEGP는 연속적인 크로마토그래피 단계 이후에 낮은 비활성(specific activity) 을 갖는 것으로 나타났다. HIS6태그된 sHASEGP는 DEAE에서 균질하게 정제하고 이어서 연속 Ni-IMAC 정제했을 때 매우 낮은 비활성을 나타내는 것으로 확인되었다. IMAC 수지는 금속 이온을 킬레이팅할 수 있기 때문에, 다양한 금속을 사전에 sHASEGP에 첨가하여 상대적인 효소 활성을 측정하였다.
a. 프로토콜
정제된 sHASEGP를 실온에서 2시간 동안 0.1 mM 니켈(Ni), 코발트(Co), 아연(Zn), 칼슘(Ca) 및 마그네슘(Mg)과 항온처리 한 후 마이크로타이터 분석으로 히알루로니다제 활성을 측정하여서 시험하였다.
b. 결과
금속 염 부가물 중성 활성 U/mL
부가물 없음 11.909
100 uM Ni 6.0306
100 uM Co 8.972
100 uM Zn 3.7476
100 uM Ca 101.9892
0.1 mM 칼슘 또는 0.1 mM 마그네슘과 sHASEGP를 항온처리한 후, 히알루로니다제 활성이 상당히 증가한 것으로 확인되었다. 다른 금속과의 항온처리 후에는 이러한 활성화가 발견되지 않았다. sHASEGP에 칼슘을 첨가하는 것은, A280 측정을 기준으로, 단백질 mg 당 약 97,000 만큼 효소의 비활성 증가시켰다. 칼슘 및 마그네슘 금속의 투여량 반응 곡선을 이어서 시험하여 효소에 대한 금속 이온의 적정 농도를 결정하였다.
이가 금속 mM [Ca++] [Mg++]
100 1 1.3
10 108 104
1 169 164
0.1 123 78
0.01 59 18
0.001 47 13
0.0001 39 13
0.00001 55 15
sHASEGP의 활성화는 마이크로몰 범위에서 발생하는 것으로 확인되었다. 10 mM 이상의 농도는 칼슘 및 마그네슘 모두에 대해 억제적이었다. 효소보다는 기질의 비특이적 활성화를 배제하기 위하여, 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 비오틴화 기질과 10 mM Hepes 완충액 중의 염화칼슘을 항온처리하고 이어서 세척하였다. 상기 세척한, 칼슘 사전항온반응 플레이트에 효소를 첨가하였을 때 어떠한 활성화도 발견되지 않았다. 포스포리파제 C 방출 천연 sHASEGP에 대한 활성화도 시험하였는데 여기서 카르복시 말단 HIS6 에피토프 태그의 인공물을 배제시킨, 칼슘과 유사한 활성화가 확인되었다.
실시예 14
sHASEGP의 활성에 대한 알부민의 효과
재조합 rHUPH20 및 도살장 고환-유래 히알루로니다제의 기타 조제물의 희석물은 최적 활성을 위하여 칼슘뿐만 아니라 알부민도 요구된다는 것이 밝혀졌다.
a. 프로토콜
인간 혈청 알부민(ICN)을 칼슘 함유 10 mM Hepes 완충액으로 희석시켜서 효소 활성에 대한 알부민 단백질의 효과를 측정하였다. sHASEGP 및 시판 조제물을 사 용한 효소 분석법으로 1 mM CaCl2 및 1 mg/ml 인간 혈청 알부민을 조사하였다.
b. 결과
히알루로니다제 활성의 활성화는, 알부민의 존재하에서 높은 희박도로 확인되었다. 이 활성화가 변성 방지의 결과인지 또는 알부민이 기질의 이용성에 영향을 주었는지에 대해서는 분명하지 않았다. 따라서, 인간 sHASEGP의 바람직한 제제에는알부민과, 칼슘 또는 마그네슘으로 이루어진 금속 염을 포함할 수 있다.
실시예 15
정제된 sHASEGP의 생체 내 확산(spreading) 활성
a. 프로토콜
10 mM Hepes PH 7.4, 150 mM NaCl 0.1% 플루로닉 중의 정제된 sHASEGP를 0.15M NaCl을 함유하지 않는 피로젠 무함유 물로 0.5U/㎕로 희석시켰다. 최종 20 ㎕ 염수로 일련의 희석을 통하여 주사 당 0.01, 0.05, 0.1 units을 제공하였다. 20 ㎕의 트리판 블루 용액을 40 ㎕의 최종 부피로 첨가하고, 케타민/자일라진 복강 내 투여로 마취시킨 발브 Nu/Nu 마우스의 각 측면에서 측쪽 피부내로 피하 주사하였다. 염료 면적을 마이크로칼리퍼를 사용하여 2차원으로 t=0 내지 t=45 분에서 측정하였다. 면적은 mm2로서 나타냈다. 대조군 재조합 인간 HYAL1은 중성 활성은 결핍되었으나, 방출은 포함되었다.
b. 결과
시험 물품 염료 면적 @ 54분
A. 염수 대조군 51.5 ㎟
B. sHASEGP 0.01 U 76.8 ㎟
C. sHASEGP 0.05 U 98.22 ㎟
D. sHASEGP 0.10 U 180.4 ㎟
E. HYAL1 100 U 67.48 ㎟
실시예 16
sHASEGP 확산 활성의 역학
a. 프로토콜
재조합 정제 sHASEGPHis6을 2 분취액으로 분리하였다. 하나는 가열 덮개가 구비된 가열사이클러에서 15분 동안 95℃로 가열하였다. 다른 하나는 실온에 유지시켰다. 효소 활성의 가열 불활성화는 마이크로타이터 기반 효소 분석으로 입증하였다. 역학 분석을 위해, 가열 불활성화 대 천연 물질을 시험하였다. 정제된 sHASEGP 4 units 또는 등가 열 불활성화 물질을 트리판 블루 염료와 함께 피하 주사하였다. 최대 15분까지 다양한 시점에서 면적을 시험하였다.
b. 결과
4 UNITS
t주사후 분 		4 UNITES 가열 불활성화
t주사후 분
t0 = 52.38 t0 = 50.58
t3 = 116.51 t3 = 65.48
t6.5 = 181.93 t6.5 = 63.87
t10 = 216.96 t10 = 65.80
t16 = 279.99 t16 = 74.3
실시예 17
sHASEGP에 의해 분해된 표피 장벽의 회복
a. 프로토콜
피하 투여 후 sHASEGP에 의하여 열린 기공의 재생 시간을 정하기 위하여, t=0에서 동물의 두 대항 외측부로 정제된 sHASEGP 2 units 또는 염수 대조군을 피하 주사하였고 이어서 30분, 60분 및 24시에 동일 부위에 트리판 블루를 주사하였다. 주사 후 t=15분에 염료 확산 면적을 대조군과 비교하여 각 시점에서 기록하였다.
b. 결과
2 UNITS
tsHASEGP 주사후 시간 		염수 대조군
tsHASEGP 주사후 시간
t0.5시간 = 183 t0 = 54
t1시간 = 167 t3 = 50
t22시간 = 61 t6.5 = 48
상기 결과에 따르면, 2units의 효소를 투여한 후 24 시간 이내에 표피 장벽이 재구성됨을 보여주는 것이다.
실시예 18
sHASEGP에 의해 개방된 채널 크기의 측정
소분자, 즉, 트리팜 블루 염료 등의 확산되기에 충분하도록, 인간 sHASEGP가 세포간 공간 내 채널을 개방시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, sHASEGP의 존재 시 확산될 수 있는 입자의 크기에 대한 상한선은 알려져 있지 않다.
a. 프로토콜
다양한 크기의 형광 분자를 사용하여 인간 sHASEGP에 의해 개방된 채널의 크 기를 측정하였다. 평균 분자량이 4,400 및 2백만 Da인 형광 덱스트란(Sigma)과 직경을 20 나노미터 내지 500 나노미터로 한정한 형광 표지된 비드(분자 프로브)를 40 ㎕의 부피로 피하 투여하였고, 이후 sHASEGP 또는 염수 대조군을 동일 위치에 주사하였다. 주사 후 15분에 염료 전방의 면적을 2차원으로 측정하였다.
b. 결과
Figure 112007068929656-pct00005
상기 결과는, 직경이 대략 1 kDa (트리판 블루) 내지 50 nm (라텍스 비드)인 분자는, sHASEGP 투여 후 이의 확산이 증가된다는 것을 증명하고 있다. 소 혈청 알부민(66 kDa)은 트리판 블루의 확산 역학과 유사한 것으로 나타난 반면, 50 nm 라텍스 비드는 확산에 보다 많은 시간이 요구되었다. 500 nm 비드는 480분까지는 어떠한 확산도 나타내지 않았다.
실시예 19
인간 sHASEGP와 피하 공동주사 후 비오틴화 항체의 혈청 약동학 프로파일
a. 프로토콜
암컷 Balb/c 마우스를 케타민/자일라진의 혼합물로 마취시켰다. 이어서 염수 또는 4 units의 활성을 갖는 sHASEGP 20 ㎕와 혼합된 비오틴화 마우스 IgG의 0.5 mg/ml 용액 20 ㎕를 상기 마우스에 피하 주사하였다.
b. 결과
주사후 시간 대조구 sHASEGP (4U)
혈청 IgG t=0시간 0 ng/mL 0 ng/mL
혈청 IgG t=2시간 0 ng/mL 360 ng/mL
혈청 IgG t=51시간 4152 ng/mL 4176 ng/mL
상기 결과에 의하면 sHASEGP는 순환계 내에서 큰 분자들의 혈청 분포의 역학을 증가시키는 것을 알 수 있다. 2시간에서 비오틴화 Ig는 대조군에서 검출되지 않는 반면, sHASEGP 그룹은 2시간에 360 ng/mL이 검출되었다.
실시예 20
인간 sHASEGP의 정맥 내 주사 후 피하 주사한 분자의 확산 활성
a. 프로토콜
각 시험 물품 및 담체 대조군의 투여 당 염료 주사용으로 4 위치를 이용하였다. 염료 주입은 정맥내 주사 후 46분이었다. 시험 또는 대조군 제품의 각 투여량을 2 동물에게 정맥 내 주사하였다. 45분 효소 투여 후 염료 전방 면적 측정은 각 투여량 또는 담체 대조군에 대하여 2.5, 5, 10 및 15분에 산출하였다.
b. 결과
결과에 따르면 고정제된 sHASEGP를 정맥 내 투여시 말단 조직까지 전신으로 이용가능하다는 것으로 확인하였다. 전신 투여된 sHASEGP의 확산 활성은 투여량 의존적이며, 10 units 주사와 담체 대조군은 차이가 없었다.
Figure 112007068929656-pct00006
실시예 21 - 개선된 약동학을 보이는 변형 sHASEGP를 생성하기 위한 PEG화 사용의 일례
개선된 약동학, 예컨대 혈청 반감기 증가 등을 나타내는 sHASEGP의 변형된 형태를 생성시키기 위한 PEG화의 사용 일례로서, 본 발명자들은 예시용 sHASEGP, 즉, 상기에서 기술한 바와 같은 재조합 인간 PH20(rHuPH20)에 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 부착시켰다.
다수의 상이한 작용성 활성화기(예를 들어, 알데히드, 숙신이미드, 말레이미드 등 포함)를 사용하여 sHASEGP 예컨대 rHuPH20에 PEG 부분을 부착시킬 수 있다. 다수의 상이한 PEG화 시약은 다수의 공급자(www.pharma.dow.com, www.nof.co.jp, www.sunbio.com, www.celares.com)를 비롯하여 Nektar Therapeutics(www.nektar.com)을 포함하는 여러 공급처에서 상업적으로 구매가능하다. 예컨대, rHuPH20을 본 발명에서 기술한 바와 같이, 다양한 예시적인 PEG 시약을 사용하여 효과적으로 PEG화시켜서 다수의 다양하게 PEG화된 rHUPH20 효소를 생성할 수 있었다. 또한, 예컨대 동물 유래 히알루로니다제(ISTA Pharmaceuticlas사의 Vitrase™로 구매가능한 양 고환 히알루로니다제의 조제물 이용), 예컨대 박테리아 유래 히알루로니다제(Sigma의 히알루로네이트 리아제로 구매가능한 박테리아 히알루로니다제 조제물 이용), 예컨대 히알루로니다제 활성을 보유한 박테리아 유래 콘드로이티나제(Associates of Cape Cod, Inc./Seikagaku Corporation의 콘드로이티나제 ABC로 구매가능한 박테리아 콘드로이티나제 ABC 조제물을 사용)를 비롯한, 기타 히알루로니다제 효소에 유사한 방법을 적용할 수 있다.
작용기를 다양화하는 것 이외에도, 특정 작용기를 이용하여 길이와 구조가 상이하고 다양한 PEG를 도입시킬 수 있도록 이용가능하다. 예를 들어, 길이가 5 내지 60 KDa(e.g. 5, 10, 20, 30, 40, 및 60 KDa)인 PEG를 rHuPH20에 접합시켰다. 또한, 다양한 구조와 길이를 갖는 다양하고 상이한 PEG는 Nektar, Dow Chemical Corporation(DowPharma), NOF Corportion, Sunbio, Celares 등을 포함하는 공급처에서 용이하게 입수가능하다. PEG 시약 및 단백질 PEG화 방법과 관련된 방대한 참조 문헌들이 당 분야에서 공지이며, 예를 들어, 다수의 리뷰 및 본 명세서에서 인용한 논문들이 있다; [Monfardini, C et al, Bioconjugate Chem. 6: 62-69 (1995); Veronese FM et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207 (1997)]; 기타 다양한 미국 공개 특허 및 출원서 등, 예컨대 US 5,672,662; US 5,932,462; US 6,495,659; and US 6,737,505; as well as U.S. Pat. Nos. 4,002,531; 4,179,337; 5,122,614; 5,183,550; 5,324,844; 5,446,090; 5,612,460; 5,643,575; 5,766,581; 5,795,569; 5,808,096; 5,900,461; 5,919,455; 5,985,263; 5,990,237; 6,113,906; 6,214,966; 6,258,351; 6,340,742; 6,413,507; 6,420,339; 6,437,025; 6,448,369; 6,461,802; 6,828,401; 6,858,736; US Appl Publ 20010021763; 20010044526; 20010046481; 20020052430; 20020072573; 20020156047; 20030114647; 20030143596; 20030158333; 20030220447; 20040013637; 2005000360; 20050114037; 20050171328 및 20050209416; 유럽 공개 특허 EP 01064951; 및 EP0822199; 및 PCT 공개특허 WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; 및 WO 0187925]등을 참조한다 (이들 각 공개물들을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다).
실시예 21-A : 인간 재조합 히알루로니다제의 PEG화 이형의 일례
sHASEGP의 PEG화를 예로 들면, PEG 알데히드, 숙신이미드 카르보네이트 각각을 rHuPH20과 PEG 부분의 접합에 적용하였다. 이들 세 종의 화합물들 중에서, 숙신이미딜 PEG가 대체로, rHuPH20의 경우에 사용하기 가장 편리하다. 예컨대, mPEG- 숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA), 및 ("분지형" PEG를 결합시키기 위한) mPEG2-N-히드록실숙신이미드를 포함하는 숙신이미딜 모노PEG (mPEG) 시약을 rHuPH20에 접합시킬 수 있다. 이들 PEG화 숙신이미딜 에스테르는 PEG 기와 활성 가교제사이에 상이한 길이의 탄소 골격을 함유하며, 단일 또는 분지형 PEG 기를 함유한다. 이러한 차이들을 이용하여, 예컨대 접합 과정 동안 상이한 반응 동력학을 제공할 수 있고, rHuPH20에서 PEG가 부착할 수 있는 부위를 강력하게 제한할 수 있다.
선형 또는 분지형 PEG를 포함하는 숙신이미딜 PEG (상기와 같은)를 rHuPH20에 접합시켰다. 당 분야에서 기술된 조성물과 기술을 사용하여서, 숙신이미딜 PEG 사용하여 sHASEGP 당 약 3 내지 6 PEG 분자를 보유하는 분자 조합을 포함하는 rHuPH20를 재생가능하게 생성시킬 수 있다. 이러한 PEG화 rHuPH20 조성물을, 대략 25,000 Unit/mg 단백질의 히알루로니다제 활성을 갖고, 실질적으로 비PEG화 rHuPH20가 없는 (비PEG화가 5% 미만) 조성물이 되도록 용이하게 정제할 수 있다. 당분야에서 공지인 바와 같이, 그리고 상기 인용한 문헌들을 포함하는 PEG화에 대한 참조 문헌에 기술된 바에 따르면, 다양한 시약 및 기술들을 또한 이용하여 다분산 PEG생성물에 대항하여 단분산 PEG 생성물을 얻을 수 있다(e.g., 상기 부위 특이적 단일 PEG화 및 부위 지정 PEG화와 관련되어 구체적으로 설명한 리뷰 및 참조 문헌 등을 참조한다).
비변형 sHASEGP와 비교하여 PEG화 sHASEGP를 투여한 동물 모델에서 약동학과 약력학이 모두 개선되는 것이 관찰되었다. 예컨대, 비변형 rHuPH20 1,000 Unit 또는 1,000 Unit의 분자량이 대략 40 kDa인 PEG 접합된 HuPH20(rHuPH20-PEG40)를 마우스에게 정맥 투여한 후, 비변형 rHuPH20를 처리한 경우에 비하여, rHuPH20-PEG40를 처리한 마우스의 혈청내 중성 활성형 히알루로니다제 활성(PH20)의 혈청 반감기가 보다 길어진 것(16 내지 20배)으로 관찰되었다. 또한, 래트 졸중 모델에서, 비PEG화 rHuPH20과 rHuPH20-PEG40의 효능을 비교하였다. 이러한 시험의 초기 결과에 다르면 졸중 유도 후 7일에 생존한 래트에서, rHuPH20-PEG40의 효능이 보다 높음이 입증되었다 (대조군에서는 생존율이 50% 미만인데 반해, 생존율이 75-85% 이상임).
Nektar에서 구매가능한 다양한 PEG 시약을 사용하여서, 본 발명자들은 예컨대 mPEG-SBA (3OkD), mPEG-SMB (3OkD), 및 mPEG2-NHS (4OkD), mPEG2-NHS (6OkD) 계 분지형을 사용하여 인간 재조합 히알루로니다제(특히 바람직하게는 rHuPH20계 효소)의 예시적인 이형을 제조하였다. 상기 시약 및 기타 다양한 시약들은 다양한 분자량으로 구매가능하다 (예컨대, http://www.nektar.com 또는 http://www.nektar.com/pdf/nektar_catalog.pdf의 온라인에서 이용가능한 Neckaaar 제품 카달로그를 참조할 수 있으며, 상기 사이트의 참조 문헌, 이들 카탈로그 등을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다). 기타 다수의 PEG 시약 및 방법들은 당 분야에서 기술된 것들 및/또는 기타 공급자들로부터 구매가능하다. 예를 들어서, NHS, 화학법을 비롯하여, 카르보네이트, 및 알데히드를 이용할 수 있으며, 또한 Nektar에서 구매가능한 다음의 각 시약을 이용하여 rHuPH20의 PEG화 이형을 생성시켰다:mPEG2-NHS-40K 분지형 (Nektar #2z3y0t01); mPEG-NHS-1OK 분지형 (Nektar #2z3xOLol-10); mPEG-NHS-20K 분지형 (Nektar #2z3xOLol- 20); mPEG-NHS-40K 분지형 (Nektar #2z3xOLo 1-40); mPEG2-NHS-60K 분지형 (Nektar #2z3y0v01); mPEG-SBA-5K (Nektar #2m450h01); mPEG-SBA-20K (Nektar #2M450p01); mPEG-SBA-30K (Nektar #2M450r01); mPEG-SMB-20K (Nektar #2m4k0p01); mPEG-SMB-30K (Nektar #2m4k0r01); mPEG-부티르알데히드-30K (Nektar #072M0R01); mPEG-SPA-20K (Nektar #2m4m0p01); mPEG-SPA-30K (Nektar #2m4m0r01); 및 PEG-NHS-5K-비오틴 (Nektar #0H4M0H02).
본 발명자들은 또한 Dow Chemical Corporation의 계열사인 Dowpharma에서 구매가능한 PEG 시약을 사용하여 히알루로니다제(예컨대, rHuPH20)의 PEG화 이형을 생성시켰는데, 예컨대 Dowpharma의 p-니트로페닐-카르보네이트 (30 kDa) 및 프로피온알데히드 PEG (30 kDa) 등으로 히알루로니다제를 PEG화하는 것을 포함할 수 있다. 다수의 다양한 PEG화 히알루로니다제 조성물을 생성하기 위하여, Nektar 및 Dowpharma 시약 및 이들의 최종 생성물을 사용하고 필수적으로 하기에서 기술한 바와 같은 방법으로 시험하였다. 기타 시약, 및 기타 히알루로니다제를 유사한 기술을 사용하여 유사하게 반응시킬 수 있다.
rHuPH20의 PEG화 이형을 생성시키기 위하여, 각 PEG 시약 또는 화학법에서 추천하는 pH 및 조건(일반적으로 알데히드 반응은 약 pH 4.5에서 수행하고, NHS 반응은 중성 pH에서 수행하며, 카르보네이트 반응은 약 pH 9.5에서 수행한다)에서, 정제 효소 (약 1 내지 14 mg/ml의 농도)를 과량의 몰농도의 각 PEG(대체로 PEG:효소가 약 10:1 몰비)와 혼합시킨다. 상기 반응 성분들은 4℃에서 대략 16시간 동안 혼합하면서 반응시킨다.
우선 SDS-PAGE를 이용하여 반응 생성물을 확인하였다. 대체로 비변형 rHuPH20은 분자량이 대략 63 kDa인 단일 밴드로 이동하는 것이 관찰된다. 일반적으로, rHuPH20의 PEG화 이형은 약 150-200 kDa (통상 약 180 kDa) 범위의 밴드를 비롯하여 200 kDa보다 큰 몇몇 밴드들을 포함한다.
이후 본 발명자들은 변형 효소 생성물을 겔 여과하고 이어서 분획화한 단백질의 효소 활성을 측정하였다. 요약하면, 당 분야에 공지인 다음의 방법을 수행하였는데, 각각 천연의 비변형 형태로부터 PEG-변형된 히알루로니다제를 분리하는 것은 세파로스 6 컬럼(Ge/Pharmacia)을 사용하는, 겔 여과 크로마토그래피로 수행하였다. 인산 완충 염수를 분리용 이동상으로 사용하고 유속은 0.2 mL/분으로 하였다. 상기 컬럼은 GE/Pharmacia의 겔 여과법 보정화 표준물로 보정하였다. 마이크로타이터 포맷으로 수행하는, 변형 USP 탁도 분석법을 통하여 분리된 히알루로난 분해 효소를 함유하는 분획의 상대 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 세파로스 6 겔 여과 컬럼을 통과하는, rHuPH20 히알루로니다제 효소 활성 분획에 대한 피크 체류 용적(시간)은 비변형 히알루로니다제에 대해서는 약 16 mL(대략 60 내지 80 KD로 식별되는 분자량)에서 PEG-변형 히알루로니다제에 대해서 약 10 mL(100,000 KD 보다 크고 대략 670,000 KD 까지로 식별되는 분자량)로 이동하였다. 과몰의 PEG를 효소와 반응시킬 경우, PEG 변형은 분명하고, 완벽하게 모든 측정한 효소 활성을 보다 고분자량의 변형 형태로 이동시킬 수 있다.
본 발명자들은 이어서 자이모그래피(zymography)(기질 겔 전기영동을 통한 글리코사미노글리칸 분해 활성 분석법)를 사용하여 다양한 천연 및 변형 효소의 활 성을 측정하였다. 요약하면, 히알루로난 함유 SDS-PAGE 자이모그램 겔을 만들고 문헌 [MiuraRO, et al. Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis (zymography). Anal Biochem. 1995 Mar l;225(2):333-40.]에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 필수적으로 분석을 수행하였다.
천연 rHuPH20 히알루로니다제는 대략 60 kDa의 분자량을 갖는 단일 밴드로서, 자이모그램 겔에서 히알루로난 분해 활성이 있는 것으로 확인되었다. PEG 변형rHuPH20 히알루로니다제는 자이모그램 겔에서 히알루로난 분해 활성이 대략 180 kDa으로 그 효소 활성 신호가 이동하였는데, 200 kDa 이상의 분자량을 갖고 효소의 활성을 갖는 적어도 2개의 추가적 밴드가 존재하였다.
여기서 기술한 이러한 결과들을 통해서 임의의 광범위한 PEG 시약을 사용하여 글루코사미노글리카나제를 유효하게 PEG화로 변형시킬 수 있으며(이것은 이들의 약동학 및/또는 기타 프로파일을 변화시키는데 이용할 수 있음), 최종 효소는 이들의 실질적인 효소 활성을 유지하여서 다양한 임의 응용분야, 구체적으로 효소 변형으로 반감기를 증가시키는 것이 유용한 분야 등에서 유용하게 이용할 수 있다.
실시예 21-B: 인간 이외의 히알루로니다제의 PEG화의 예
인간 세포와 함께 효소를 사용하게 되는 분야, 구체적으로 인체에 적용하고자 하는 경우에는 인간 재조합 히알루로니다제가 특히 바람직하지만, 본 발명에서 예시하는 방법은 또한 일정한 환경에서 적절하게 응용할 수 있는 기타 히알루로니다제 효소의 약동학적으로 개선된 이형을 생성시키는데 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 예시한 방법을 이용하여서, 그리고 기타 히알루로니다제 효소에 대하여 당 분야에서 기술되어 있는 바에 따라서, 본 발명자들은 실질적으로 효소 활성은 유지하는 PEG화(상기 설명한 바와 같이 이들의 약동학을 개선시키기 위하여 이용할 수 있음)시킨 다수의 변형 효소를 생성하였다. 예를 들어서, 본 발명에서 기술하고 설명하는 방법을, 예시적인 동물 유래 히알루로니다제, 예시적인 박테리아 유래 히알루로니다제, 히알루로니다제 활성을 보유하는 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제를 비롯한, 일련의 다양한 예시적인 "인간 이외의" 히알루로니다제 효소에 적용하였다. 본 발명에서 기술한 바와 같이, 이러한 인간 이외의 히알루로니다제의 PEG화 이형은 반감기 증가(예컨대 정맥 또는 기타 생체내 투여 후)를 제공하는데 유효하게 이용가능하다
인간 이외의 동물 유래 히알루로니다제의 예를 위하여, 본 발명자들은 양 고환 히알루로니다제(Vitrase™:ISTA Pharmaceuticals에서 구매)의 PEG화 이형을 생성시켰다. 비트라제 (주사용, 동결건조형, 양 유래 히알루로니다제, 양 NDC 67425-001-01, 6200 USP Units/vial)는 ISTA pharmaceuticals에서 구입하였는데, 안과의사에게 기증받았다. 동결건조된 비트라제를 0.9% 염화 나트륨 주사액 USP (Baxter)으로 재구성시켜서 비트라제 용액을 제조하였다.
Sigma에서 히알루로네이트 리아제로 구매가능한 박테리아의 히알루로니다제의 PEG화 이형을 생성시켰다. 스트렙토마이세트 히아루로라이티커스 또는 기타 종 유래의 히아루로니네이트 리아제를 Sigma에서 구매가능하다(CAS Number 9001-54-1, EC Number 4.2.2.1) (674 units /vial). 히알루로네이트 리아제는 멸균 여과한 인 산 완충 염수로 재구성시켰다(예컨대, 문헌 [Ohya, T., and Kaneko, Y. Biochim. Biophys. Acta 198, 607, (1970)] 참조).
히알루로니다제 활성을 보유한 인간 이외의 콘드로이티나제 ABC(콘드로이티나제 ABC : Associates of Cape Cod, Inc. Seikagaku Corporation에서 구매가능)의 PEG화 이형을 생성시켰다. 프로테우스 불가리스 유래의 콘드로이티나제 ABC(콘드로이틴 ABC 리아제, 콘드로이틴 ABC 엘리미나제, EC Number: 4.2.2.4, CAS Number: 9024-13-9, cat. # 100330 또는 10033)를 Associates of Cape Cod Inc에서 구매하였다. 0.1% BAS 용액으로 콘드로이티나제 ABC 용액을 제조하였다. 참조 문헌으로 다음의 것들을 포함한다: [(1) Yamagata, T., et al., J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968); (2) Saito, H., et al., J. Biol. Chem., 243, 1536 (1968); (3) Suzuki, S., et al., J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968); and (4) Oike, Y., et al., J. Biol. Chem., 257, 9751 (1982)].
PEG 시약의 예로, 본 발명자들은 mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA (3OkD), Nektar에서 구매)를 사용하였다. mPeg-SBA-3 OK (메톡시폴리(에틸렌글리콜)부탄산의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 평균 M.W. 30,000, Cat # 2M450R01)를 이러한 예로 사용하였고, 기타 임의 분자량의 메톡시폴리(에틸렌글리콜)부탄산의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 또는 기타 임의 분자량의 폴리(에틸렌글리콜)부탄산의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 임의 크기의 PEG 알데히드, 임의 크기의 PEG 카르보네이트, 기타 Nektar PEG 시약, 기타 PEG화 시약을 또한 사용할 수 있다. 예컨대 문헌 [Zalipsky, S and C Lee, "Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications," J.M. Harris, ed., Plenum, NY, 1992, cf. chapter 21] 참조.
예시적인 동물 유래의 히알루로니다제의 PEG화 이형의 생성을 위하여, 양 고환 히알루로니다제(비트라제) 바이알을 0.9% 염수 (10 units/마이크로리터) 0.62 mL로 재구성하고, 이 재구성 효소 중 0.3 mL을 멸균 튜브에 옮겨 담았다. 상기 예시적인 PEG 시약, mPeg-SBA-30K (9.9 mg)를 비트라제 용액을 함유하는 튜브에 첨가하였고, 모든 mPeg가 용액으로 들어가는 것으로 나타날 때까지 튜브를 혼합하였으며, 이어서 상기 혼합물을 혼합하면서, 대략 16 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
예시적인 박테리아 유래의 히알루로니다제의 PEG화 이형의 생성을 위하여, Sigma의 히알루로네이트 리아제 1 앰플에 0.7 mL의 멸균 여과 인산 완충 염수 0.7 mL을 넣고 재구성시켰고, 이 재구성 효소 중 0.3 mL을 멸균 튜브에 옮겨 담았다. 상기 예시적인 PEG 시약, mPeg-SBA-30K (9.8 mg)를 히알루로네이트 리아제 용액을 함유하는 튜브에 첨가하였고, 모든 mPeg가 용액으로 들어가는 것으로 나타날 때까지 튜브를 혼합하였으며, 이어서 상기 혼합물을 혼합하면서, 대략 16 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
히알루로니다제 활성을 보유한 예시적인 동물 유래의 콘드로이티나제의 PEG화 이형의 생성을 위하여, 콘드로이티나제 ABC(10 Units) 1 바이알에 0.9% 염수 0.2 mL로 재구성하고, 상기 예시적인 PEG 시약, mPeg-SBA-30K (12.4 mg)를 콘드로이티나제 ABC 용액을 함유하는 튜브에 첨가하였으며, 모든 mPeg가 용액으로 들어가는 것으로 나타날 때까지 튜브를 혼합하였으며, 이어서 상기 혼합물을 혼합하면서, 대략 16 시간 동안 4℃에서 반응시켰다.
초기 분석에는 비변형 대조군과 비교한 변형 효소를 측정하기 위하여 SDS-PAGE가 포함된다. 요약하면, 총 단백질을 3% 내지 8% NuPage 트리스/아세테이트 겔(Invitrogen)에서 분리시키고 난 후, 쿠마시 블루나 은 염색으로 가시화하였다. 염색된 밴드의 분자량은 동일한 겔상의 기지 분자량의 표준 단백질과의 비교를 통해 측정하였다.
비트라제에 대한 결과는 다음과 같다 :(A) 비변형(unmodified), 대략 다음의 분자량(kDa)을 갖는 5 밴드: 90, 80. 63, 50 및 40; (B) PEG- 비트라제, 대략 다음의 분자량(kDa)을 갖는 7밴드: 150, 180 그리고 200 보다 큰 5 밴드.
콘드로이티나제 ABC에 대한 결과는 다음과 같다: (A) 콘드로이티나제 ABC (비변형), 대략 다음의 분자량(kDa)을 갖는 6 밴드: 100, 80, 50, 38, 33 및 30; (B) PEG-콘드로이티나제e ABC, 대략 다음의 분자량 (kDa)을 갖는 8 이상의 밴드: 150-200 사이인 1, 2 밴드와 200보다 큰 6 이상의 밴드.
히알루로네이트 리아제에 대한 결과는 다음과 같다: (A) 히알루로네이트 리아제 (비변형), 대략 다음의 분자량 (kDa)을 갖는 1 밴드: 35; (B) PEG-히알루로네이트 리아제, 대략 다음의 분자량 (kDa)을 갖는 4 이상의 밴드: 200 이상.
증명한 바와 같이, 상기의 효소의 PEG활성화 이형을 생성하는 것과 관련된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜(e.g.: mPeg-SBA-30K (메톡시폴리(에틸렌 글리콜)부탄산의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 평균 M.W. 30,000)을 양 히알루로니다제 (예컨대, 비트라제), 박테리아 콘드로이티나제 ABCs (e.g. 프로테우스 불가리스 유 래), 또는 박테리아 히알루로네이트 리아제 (예컨대, 스트렙토마이세스 히아루로리티커스)에 적용하여서, 평균 분자량이 증가한 신규 분자를 생산하는 효소 제조물 내에 화학 변형을 유도시킬 수 있다. 이러한 생성물의 추가 특징화를 통하여 상기 효소들을 단지 유효한 PEG화뿐만 아니라 최종 효소 생성물이 히알루로난 분해에서 실질적으로 효소 활성을 나타낼 수 있다는 추가 증거를 제공하여서, PEG화를 이들 다양한 유형의 효소에 적용할 수 있다는 것을 증명할 수 있다(이는 실질적인 효소 활성을 유지하는 동시에 효소의 약동학적 프로파일을 변경시키는데 사용할 수 있다).
이어서 본 발명자들은 변형 효소 생성물의 겔 여과법을 수행하고 이어서 분획 단백질의 효소 활성을 측정하였다. 요약하면, 이하 당분야에서 공지인 방법을 수행하였는데, 각각의 천연 비변형 형태에서 PEG-변형 히아루로디나제의 분리는 세파로스 6 컬럼(GE/Pharmacia)을 이용하는 겔 여과법으로 수행하였다. 인산 완충 염수를 분리용 이동상으로 이용하고, 유속은 0.2 mL/분이었다. 상기 컬럼은 GE/Pharmacia의 겔 여과법 보정 표준물을 사용하여 보정하였다. 마이크로타이터 포맷으로 수행하는, 변형 USP 탁도 분석법을 통하여 분리된 히알루로난 분해 효소를 함유하는 분획에 대하여 상대 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 시험하고자 하는 각 히알루로난 분해 효소의 활성을 분석하는데 사용하는 pH 및 완충제는 각 특정 효소에 대한 문헌에 기술된 바와 같다.
세파로스 6 겔 여과 컬럼을 통과하는, 양 히알루로니다제 효소(예를 들어, 비트라제) 활성 분획에 대한 피크 체류 용적(시간)은 천연 양 히알루로니다제에 대 해서는 약 15.5 mL(대략 60 내지 80 KD로 식별되는 분자량)에서, PEG-변형 양 히알루로니다제에 대해서 약 9.5 mL(100,000 KD 보다 크고 대략 670,000 KD 까지로 식별되는 분자량)로 이동하였다. 과몰의 PEG를 효소와 반응시킬 경우, PEG 변형은 분명하고, 완벽하게 모든 측정한 효소 활성을 보다 고분자량의 변형 형태로 이동시킬 수 있다.
천연 박테리아 히알루로네이트 리아제 효소에 대한 피크 체류 용적(시간)은 주입 후 대략 16 mL(대략 50 내지 70 kDa으로 식별되는 분자량)이었다. 겔 여과법으로 분획시킨 PEG-변형 히알루로네이트 리아제는 어떠한 분획에서도 효소 활성을 나타내지 않았다. 천연 히알루로네이트 리아제 활성은 정상적으로 측정되나 상기 분획들에서는 효소 활성의 측정되지 않았다는 것은 상기 효소 기능에 PEG 변형이 역효과를 준다는 것을 시사한다.
PEG-변형 콘드로이티나제 ABC는 주입후 대략 11 mL 및 13 mL(대략 200 내지 600 KDa 사이로 식별되는 분자량)에서 피크 효소 활성이 나타났고, 주입 후 다시 대략 16 mL(대략 50 내지 70 KDa으로 식별되는 분자량)에서 확인되었다. 천연 콘드로티나제 ABC는 주입후 단지 대략 16 mL에서만 효소 활성을 나타내었다. 이러한 데이타는 콘드로이티나제 ABC의 PEG 변형은 천연 분자량 분자보다 효소 활성을 높게 유지시키는 것을 시사한다.
히알루로난 분해 효소에 대한 PEG 정도는 겔 여과법을 사용하여 측정하였고, 분획 조제물의 효소 활성 분석을 사용하여, 효소 활성을 확인하는 구성물의 분자량 및 총 활성에 대하여, 히알루로난 분해 효소의 활성에 대한 PEG 변형의 효과를 측 정하였다.
본 발명자들은 이어서 자이모그래피(기질 겔 전기영동을 통한 글리코사미노글리칸 분해 활성 분석법)를 사용하여 다양한 천연 및 변형 효소의 활성을 측정하였다. 요약하면, 히알루로난 함유 SDS-PAGE 자이모그램 겔을 만들고 문헌 [MiuraRO, et al. Analysis of glycosaminoglycan-degrading enzymes by substrate gel electrophoresis (zymography). Anal Biochem. 1995 Mar l;225(2):333-40]에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 필수적으로 분석을 수행하였다.
천연 양 히알루로니다제는 대략 60 kDa과 90 kDa에서 활성이 있는 주요 2 밴드를 확인하여 자이모그램 겔에서의 히알루로난 분해 활성을 증명하였는데, 상기 분자량 사이에 일부 효소 활성이 번져서 나타났다. 100 KDa 이상에서는 어떠한 효소 활성도 없었다. 양 히알루로니다제의 PEG 변형은 효소 활성 신호가 대략 150 KDa에서, 그리고 200 KDa 이상의 분자량에서 효소 활성을 갖는 적어도 2개의 추가 밴드가 생성되어서, 자이모그램 겔에서 히알루로난 분해 활성이 이동되었음을 확인하였다.
천연 콘드로이티나제 ABC는 자이모그램 겔에서 히알루로난 분해 활성의 단일 밴드가 확인되었는데, 이는 분자량이 대략 80 내지 90 KDa이다. 콘드로이티나제 ABC의 PEG 변형으로 자이모그램 겔에서 히알루로난 분해 활성이 이동하였는데, 효소 활성 신호가 대략 180 KDa에서, 그리고 분자량이 200 KDa 이하의 하나 이상의 추가 활성 밴드가 나타났다.
자이모그램 분석을 통해서 동물 유래 히알루로니다제(비트라제) 및 히알루로 니다제 활성을 갖는 박테리아 유래 콘드로이티나제(콘드로티나제 ABC)를 PEG화로 변형시킬 수 있고(재조합 인간 히알루로니다제에 대하여 상기 기술한 바와 같이 약동학 프로파일을 변경하기 위하여 이용할 수 있음), 최종 변형 효소는 여전히 실질적인 효소 활성을 유지하였다.
상기 실시예의 관점에서 당 분야의 당업자에게, 기타 히알루로니다제(여기서 기술하는 인간 및 기타 재조합 이형과, 기타 인간 이외의 동물 또는 박테리아 원핵 세포 등의 효소, 기타 히알루로니다제와 콘드로이티나제 등)를 당분야에서 공지인 방법에 따라서 다양한 임의 PEG 시약으로 변형시켜서 특정 분야에서 이들 효소를 유용하게 만들도록 약동학 프로파일 및/또는 기타 프로파일이 변경된 변형 효소를 생성시킬 수 있다.
실시예 22 - 생체 내에서 소분자 약학제의 분산을 촉진시키기 위한 sHASEGP 용도의 일례
포유류의 장기 및 조직에 약학 제제의 분산 또는 확산을 촉진시키기 위한 본 발명의 sHASEGP 조성물의 용도에 대한 일례를 위하여, 본 발명자들은 생체 내에서, 포유류 안구 조직으로의 덱사메타손(소분자 의예로 사용한 항염증제 "덱스(dex)")의 침투를 촉진시키기 위한 rHUPH20의 용도를 평가하였다.
포유류에 마취제 등을 주사하기 위해서, 마취블록을 취하기 위하여 공통으로 사용되는 안와 주변 경로로는, 인경주변부, 후방인경부 및 서브-테논 주입 등을 포함한다. 이러한 예를 위하여, 본 발명에서는 sHASEGP 투여를 수반하거나 수반하지 않고, 상공막부에 덱스를 서브-테논 주입하여서 이를 비교하고, 이어서 안구 후부 조직 내, 구체적으로 중요한 약물 표적이지만 약학 제제가 효과적으로 도달하기 어려운, 맥락막 및 망막층에서의 덱스 농도를 측정하였다.
뉴질랜드 적색 숫컷 토끼(대략 2.1 내지 3.2 kg)를 사용하여서, 이를 케타민 염산(21 mg/kg) 및 자일라진 염산 (5.25 mg/kg)의 근육내 주사를 이용한 일반적인 마취 상태하에 두었다. 국소 0.5% 프로파라카인을 안구 표면 마취를 위하여 사용하였다. 1% 트로피카미드 및 2.5% 페닐에프린을 사용하여, 동공을 팽창시켰다. 바나스 가위를 사용하여 각 토끼의 우안구의 결막을 열고, Medez tri-port 마취용 캐뉼라(Eagle Laboratories, Rancho Cucamonga, CA)의 끝을 상공막부에 삽입시키고 덱스 단독(American Pharmaceutical Partners, n=18) 또는 덱스와 sHASEGP (3000 units of rHUPH20, n=l 8)의 1.5 mL을 안구의 후부극에 인접하여 주입하였다. 유체 배출을 방지하기 위하여 결막 입구 위치에 면봉을 두었다.
주입후, 1, 2, 3 또는 6시에 상기에서 기술한 바와 같이 토끼를 마취시키고 펜토바르비탈 나트륨 (120 mg/kg)을 심장내 주입하여 희생시켰다. 안락사 이후에, 1 ml 혈액 샘플을 취하고 각 동물 유래의 양쪽 안구를 적출하였다. 적출 후 곧바로, 투베르쿨린 시린지를 사용하여 전방 챔버 천자술을 통해 각 안구에서 수성 체액 2-ml 샘플을 수집하였다. 적출한 안구에서 전방 부분을 제거한 후, 유리체 샘플1 ml을 취하여 에펜도르프 튜브에 넣었다. 상기 안구의 나머지를 절개하고 6-mm 트레핀 (Fine Science Tools, Foster City, CA)을 사용하여, 공막외면상에 약물이 주입된 시신경 안쪽으로 샘플을 천공시켰다. 천공된 조직에서 망막을 블런트 브레이트를 사용하여 모아서 맥락막이라고 표지한 튜브에 넣었다.
질량 분광계를 사용하여서 최소 측정 한계를 5 ng/ml로 하여 조직에서의 덱스 농도를 측정하였다. 맥락막 및 망막 샘플에 대하여 50 mM 트리스 베이스, 1 mM MgCl2를 함유하는 pH 9.0의 완충액을 상기 조직에 첨가하여서 최종 농도가 20 mg/mL이었다. 상기 조직을 초음파 균질파쇄기(homogenizer) (BioLogics, Inc., model 150 V/T)르 5-15 초간 파쇄하였다. 조직 균질물 샘플, 유리체액, 수성액, 플라스마에 대하여 이 모두를 다음의 과정을 통해 분석하였다. 덱사메타손 함유 샘플 및 내부 표준(I.S.)으로 프레드니솔론을 함유하는 샘플을 5분간 볼텍스 혼합하여 메틸 t-부틸 에테르로 추출하였다. 유기층 및 수성층을 5분간 1,300 g에서 원심분리하여 분리하고, 수성상을 15분간 -70℃에서 동결시키고, 유기상은 새로운 튜브에 부어서 40℃의 질소 스트림하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 물:아세토니트릴(50:50 v/v)로 재구성하였다. 이렇게 가공한 샘플을 45℃로 유지시킨 Phenomenex Synery Polar RP 컬럼을 사용하는 고성능 액상 크로마토그래프를 통해 분석하였다. Z-스프레이공급원/경계면에서 가열 질소를 사용하여 이동상을 분무하였고 이온화 화합물은 직렬식 4극자 질량 분광계를 통하여 검출하였다. MassLynx(TM) 소프트웨어( Micromass, Beverly, MA)를 이용하여 덱사메타손 및 프레드니솔론의 피크 높이를 얻어서 적분하였다. MassLynx(TM)의 전력 방정식으로 표준 대 내부 표준의 높이 비를 맞추어서 그래프를 얻었다. 상기 피크 높이 비를 이용하여 샘플내 덱사메타손의 농도를 외삽하기 위하여 상기 그래프의 방정식을 이용하였다.
질량 분광계의 결과에 다르면, 덱스 단독 처리한 토기의 맥락막, 망막, 유리 체의 덱사메타손의 농도는 처음 시간점(즉, 주입후 1시간)에 피크 농도에 도달한 반면, sHASEGP를 함께 수반한 토끼의 맥라막 및 망막 덱스 농도는 보다 높아졌고 2차 시간점(즉, 주입후 2시간)까지 계속 증가하였다. 맥락막, 망막 및 유리체의 피크 농도는, sHASEGP로 처리한 조직에서, 각각 대략 10-배, 5-배 및 8-배로 보다 높았고, 그래프 하의 면적(AUC)도 50% 이상 높았다.
이 결과에 의하면, 포유류 안구의 후방 분절 등과 같은, 생체 내에서 비교적 약제가 도달하기 어려운 조직에 대해서도, sHASEGP를 투여하여 실질적으로 덱스 등과 같은 약학 제제의 전달을 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다. 뿐만 아니라, 비교적 두꺼운 공막층이 서브테논 주입부와 표적화한 맥락막 및 망막층 사이에 조직 장벽을 형성하기 때문에, 후자의 층에 고농도의 약학 제제가 전달된 것은, 상기 신체 내에서 조직층을 가로질러서 약제의 전달을 효과적으로 촉진하기 위하여 sHASEGP를 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
공막을 가로지르는 전달을 촉진하는 경우를 통해서, 다수의 안과 질환 상태에서 특히 주목받고 있는, 안구의 후면에 영향을 주는 병태를 치료하는데 사용되는 약제의 전달을 촉진하기 위한 최소 침투 프로세스에 sHASEGP를 이용할 수 있다. 예를 들어, 이는 맥락막 신생혈관생성(예를 들어, 스테로이드 투여에 의함), 황반 변성증 및 기타 유리체내 투여로 통상 치료하는 이들 조직에 영향을 주는 기타 질환 등의 치료를 위한 침투 전달 경로를 줄일 수 있도록 제공할 수 있다. 이러한 병태들에 사용하는 광범위한 제제들이 존재하는데, 예컨대 덱사메타손, 트리암시놀론, Macugen™, and VEGF 길항제 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
서브테논 주입 등을 통한 전달 경로에서의 확산에 기여하는 sHASEGP의 효소 활성뿐만 아니라, 이는 또한 이것이 주입되는 조직부를 유효하게 채우거나 팽창시키는 유체에 sHASEGP를 도입하여 유체 전달을 더욱 구동화하는 양성 유체 정역학적 압력을 생성하며, 여기에 포함되는 제제를 주변 조직으로 보내게된다(예를 들어, 이류성 수송을 촉진하여).
실시예 23- 종양 세포간 유압을 저하시켜서 항종양 약학 제제에 대한 종양의 민감성을 촉진하는 sHASEGP의 용도의 일례
본 발명에서 기술하는 바와 같이, sHASEGP는 세포간 채널을 생성시켜서 유체 흐름을 증가시키고, 생체 내 목적 조직 부위에 약약 제제 및 기타 제제의 전달을 촉진시킨다. 알려진 바에 의하면 종양은 특히 중요하게 표적화되는 문제이며 일반적으로 개발하는 약학 제제, 특히 항종양형성제, 항대사제, 항신생혈관제 및 다양한 세포 독성 및 증식 정지제들이 있다. 생체 내에서 종양 부위를 표적화하는 이러한 약제들에 대한 문제점은 많은 종양들이 세포내 압이 증가하여 특히 종양 덩어리내 깊숙한 부위로, 투여 약물의 주입을 방해하는 경향이 있다는 사실로 인해 그 문제점들이 더욱 악화되었다. 알려진 바에 의하면, sHASEGP가 이러한 방해를 다양한 공지의 신규 개발된 약제를 종양으로 전달하는 것을 촉진시켜서, 종양이 소정의 약제 용량으로도 이들 약제에 대하여 보다 감응성 있게 만들고 치료가능하게 만든다. 이러한 관점에서, 본 발명의 HASEGP는 세포간 채널 형성을 촉진할 수 있고 상기 기술한 바와 같은 다양한 마커의 분산을 향상시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 10배 이상으로 세포간 조직의 유압 전도성을 증가시킬 수 있는 것으 로 관찰되었다.
종양 세포에 대한 이러한 원리를 확인한 바에 따르면, 시험관내 종양 세포에 대해 sHASEGP (rHuPH20, 50 Units)를 적용한 결과, 종양의 세포간 유압을 증가시키는 주요 기여 인자인 것으로 알려진 세포주변부 메트릭스가 실질적으로 제거되었다.
뿐만 아니라, 이종이식 인간 종양 모델에서, 생체내 rHuPH20의 투여 결과 투여 1시간 이내에 종양 세포내 유압이 유의하게 감소되었다.
본 발명에서 상기에 구체적으로 설명한 바에 따르면, 본 발명의 sHASEGP는 다양한 암 치료에서 사용하기 위한 다수의 임의 공지인 제제 또는 현재 개발중인 항종양제와 병용하여 사용할 수 있다.
실시예 24- 비IV 비경구 주입을 통해 전달되는 거대분자의 약동학을 증가시키기 위한 sHASEGP의 용도 일례
상기에서 기술한 바와 같이, sHASEGP는 공지의 약동학(pharmacokinetics)을 조절하거나 신규 개발 약제 및 기타 제제를, 예컨대 신체내 분산 및/또는 흡수를 촉진하여 조절하는데 사용할 수 있다. 이러한 개선된 약동력학 파라미터는 다음으로, 특정 제제의 약력학(pharmacodynamics)을 개선시키는데 사용할 수 있다(예컨대, 주입 부위 근처에 남는 제제의 양을 줄여서 국소 독성을 줄이고/줄이거나 목적 표적을 통해서 또는 이에 전달되는 제제의 양을 증가시켜서 효능을 증가시키는 등). 다르게는, sHASEGP를 사용하여 국소 투여된 약학 제제의 분산(예를 들어, 주입 부위를 통하여서 혈류로 가는 분산 등)을 효과적으로 촉진시킬 수 있기 때문에, 또 한, 적용하려는 제제의 양을 줄여서 유사한 약력학을 얻고 흡수 약동학을 본질적으로 개선하기 위하여 sHASEGP를 이용하는 것이 가능하다. 비정맥 비경구 투여에 의하여 정상적으로 투여되는 거대분자 약물의 약동학을 증가시키기 위하여 sHASEGP를 사용하는 예를 위하여, 본 발명자들은 재조합 인간 PH20 (rHuPH20)를 PEG화된 인터페론 알파2b (PEG-INTRON(TM), Schering- Plough에서 구매)와 배합하였다. PEG-INTRON은 대략 31 kD의 거대분자이며 통상 C형 간염 바이러스(HCV) 치료를 위하여 피하 주입된다(일반적으로 소분자 약물 리바비린과 병용함). 피하 투여되는 이와 유사한 많은 거대 분자와 같이, PEG-INTRON은 비교적 천천히 흡수되고 상기 제제의 실질적인 부분이 혈류로 전달되기 어려우며, 생체이용률이 50-60% 정도이다. 또한, 환자의 상당 비율(통상 절반 이상)에서, 즉, 국부에 유지되는 국소 농도의 약제에 의해 악화되는 결과에 의한 것으로 예측되는 다양한 주입 부위 반응이 진행한다. 당 분야의 당업자에 다르면, 이러한 약동학의 결과는 7배이며, 주입 부위 근처에 포집되는 제제의 "낭비"가 없으며 국소적으로 대사되는 화합물에 대한 반응도 없다.
본 발명자들은 PEG-INTRON의 약동학 파라미터에 대한 rHuPH20의 효과를 측정하기 위하여, rHuPH20과 함께 또는 없이, 다양한 투여 경로를 통하여 요오드-125 표지화 PEG-INTRON를 투여하였다. rHuPH20의 절대적인 생체 이용률을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 정맥 투여를 통하여 투여된 PEG-INTRON의 약동학 파라미터를 측정하였다.
요약하면, 18 스프라그-다우리 래트(각각 체중이 대략 225-250 그램)를 각 6 마리씩 3그룹으로 분류하였다. 1그룹에는 시험 제품(즉, 1-125 표지화 PEG-INTRON)을 정맥 투여(꼬리 정맥 투여를 통하여 100 마이크로 부피 중 1.5 마이크로그램/kg)하였다. 1-125 표지화 이터페론의 비활성은 55 uCi/마이크로그램이었다. 혈액 샘플(100 마이크로리터)을 투약전에 채취하고 투약 후 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 120 시간에 채취하여서 감마 카운팅(Counts Per Minute (CPM) per gram plasma라고 함)으로 표지화 약물을 정량하였다. 6 동물의 2 그룹은 목 뒤를 이발하고 준비한 부위에 피부내 주입으로 시험 제품을 동량 부피로 투여하였으며, 제1 그룹과 같이 혈액 샘플을 채취하고 처리하였다. 6 동물의 3 그룹은 앞의 그룹처럼 피부내 주입으로 100 마이크로리터의 배합 부피로 rHuPH20 (100 I.U.)를 혼합한 시험 제품을 동량 투여하였고, 앞의 1 및 2 그룹처럼 혈액 샘플을 취하였다. 이 실험 결과는 하기 표 24-1에 나타내었다.
[표 24-1]
시간(시) PEG-INTRON
(1.5ug/kg)
피부내		 SD PEG-INTRON
(1.5ug/kg)+
sHASEGP 100 U
피부내		 SD PEG-INTRON
(1.5ug/kg)
정맥내
0.5 30,289 9,989 54,808 12,995 281,781
1 43,137 9,434 76,672 17,570 185,630
2 54,655 11,128 102,159 17,626 155,591
3 55,261 11,055 115,329 24,910 128,656
6 61,214 15,528 118,364 23,817 93,065
8 59,277 14,704 110,443 21,735 79,275
12 46,696 12,752 85,710 28,078 58,457
24 16,233 6,595 26,047 9,006 16,966
36 7,954 1,777 12,498 1,762 9,277
48 3,862 499 5,517 1,030 5,847
AUC 1,222,952 2,212,583 1,910,723
Cmax 61,214 11,364 -
Tmax 6 6 -
절대
생체이용률		 64% 116% 100%
표 24-1에 나타낸 바와 같이, 약제의 생체 이용률(AUC로 측정)은 sHASEGP와 병용하여 피부 내에 투여한 경우에 상당히 개선되었다. 사실, sHASEGP와 병용하여 피부내 투약하여 얻은 절대 생체 이용률은, 모든 물질이 직접 혈류로 전달되는 직접 정맥 투여에서 얻은 결과와 통계적으로 구별되지 않았다. 따라서, 비IV 비경구 투여로 도입되는 약물과 sHASEGP를 병용하는 것은 혈류로 직접 투여하는 것에 필적할 정도의 전달 수준을 제공할 수 있다. ID 투여 후 비록 Tmax가 필수적으로 길어지지만(상기 제제가 혈류에 도달하는데는 일부 시간 필요하기 때문), sHASEGP를 ID 투약한 후 수 시간 이내에, 혈류내 상기 제제의 농도는 본질적으로 IV 투약에서 얻는 수준에 도달하였고, 이후에는 분명하게 이를 초과하였다.
실시예 25- 정맥 주사로 정상적으로 전달되는 거대분자의 피부내 전달을 촉진하기 위한 sHASEGP의 용도 일례
상기 기술한 바와 같이, sHASEGP를 사용하여, 보다 용이하고, 안정하며, 비용절감적이고/거나 기타 혜택을 제공할 수 있는 다른 투여 경로를 통하여 공지의 약물이나 새로 개발된 약물 및 기타 약물의 전달을 촉진할 수 있다. 이러한 재공식화의 예로서, 본 발명자들은 정맥 주사를 통해 정상적으로 투여되는 거대 분자 약물의 피내 전달을 촉진시키기 위하여 sHASEGP를 사용하였다. 이러한 특정 예에서, 본 발명자들은 재조합 인간 PH20 (rHuPH20)과 키메라 인간-쥐 항-TNF알파 모노클로날 항체(Infliximab, REMICADE™로 Centocor에서 구매)를 배합하였다. REMICADE는 대략 150 kD의 거대분자이며 관절염 또는 크론 질병의 치료를 위하여 정맥 주사로 통상 투여된다. 따라서, 일반적으로 REMICADE의 투여는 정맥 접근과 부수되는 전문 적인 관리와 위험이 요구되고, 또한 각 투약에 2시간 간격이 요구된다.
REMICADE (20mg/ml)를 125I로 표지하였고 비활성은 10 [mu]Ci/mg이었다. 18마리의 래트를 각각 6 동물의 3 그룹으로 분류하였고 최종 농도 100ul의 방사성 콜드 REMICADE (10mg/kg으로 배합) 혼합물을 (i) 정맥내 투여, (ii) 피내 투여, 또는 (iii) 100 Unit sHASEGP (100,000 U/ml 스톡에서)를 병용하여 피내 투여하였고, 투약후 다양한 시간점에서 감마 카운팅을 통하여, 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 필수적으로, 혈액 및 조직을 처리하였다. 결과는 다음의 표 25-1에 요약하였다.
[표 25-1]
REMICADE의 약동학 파라미터에 대한 sHASEGP의 영향
시간(시) CPM
REMICADE
(10mg/kg)
피부내		 SD CPM
REMICADE
(10mg/kg)+
sHASEGP 100U
피부내		 SD CPM
REMICADE
(10mg/kg)
정맥내
0.5 27,451 2,221 94,888 31,318 1,657,849
1 37,213 10,775 146,793 42,014 1,645,571
2 66,001 6,078 412,047 61,240 1,576,145
4 120,704 21,744 691,626 89,002 1,260,646
8 256,987 32,459 833,826 133,887 1,157,268
24 493,004 75,694 853,423 65,777 790,357
48 515,439 53,431 728,302 74,848 684,599
72 454,717 54,388 640,303 81,492 558,307
96 375,993 39,744 598,413 59,533 496,658
120 336,067 66,964 518,861 53,643 434,008
AUC 53,350,555 118,424,609 82,718,550
Cmax 515,439 853,423 1,657,849
Tmax 48 24 0
절대
생체이용률		 62% 121% 100%
상기 표 25-1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 약제 REMICADE의 생체이용률 (AUC로 측정)은 sHASEGP 용량과 병용하여 피내 투여시 상당히 개선되었다. PEG-INTRON의 전달을 증가시킨 결과에서 처럼, sHASEGP와 병용하여 피내 투여하여 얻은 REMICADE 생체이용률의 전체 수준은 모든 물질을 혈류에 직접 전달하는 정맥 투여에서와 통계적으로 동일하였다. 비록 ID 대 IV 투여 후 REMICADE Tmax가 필수적으로 길어졌지만, sHASEGP와 ID 투약 이후 24시간 이내에, 혈류내 제제의 농도는 IV 투약에서 관찰된 것을 초과하였고, 이후에는 IV 농도에 도달하거나 이를 초과하였다. sHASEGP없는 ID 투약과 비교하여, 관찰된 Tmax는 sHASEGP와 함께인 경우에 약 2배 빨랐고(24 시간 대 48 시간), Cmax와 생체이용률(AUC) 모두 실질적으로 증가하였다(각각 약 65% 및 95% 만큼).
실시예 26 - 비 IV 비경구 주입을 통해 정상적으로 전달되는 보다 큰 거대 분자 복합체의 피내 전달을 촉진하기 위한 sHASEGP의 용도 일례
비정맥 비경구 주입으로 정상적으로 투여되는 거대분자 약물의 약동학을 증가시키기 위한 sHASEGP의 용도에 대란 다른 예로서, 본 발명자들은 재조합 인간 PH20 (rHuPH20)를 재조합 인간 인자(Factor) VIII (RECOMBINATE(TM), Baxter에서 구매)과 배합하였다. 인자 VIII는 다수의 폴리펩티드를 포함하며, 대략 280 kDa의 복합 분자를 갖는 거대 당단백질이다. 인자 VIII는 통상 혈우병 치료를 위하여 정맥 주사로만 투여된다. 피하 투여되는 다른 많은 거대분자처럼, 인자 VIII는 서서히 흡수되며 제제의 실질적인 부분이 혈류에 도달되지 않아서, 생체 이용률이 0.5-1%이다.
18 래트를 각 6마리씩 3 그룹으로 분류하였으며, 125-1 표지된 인자 VIII을 (i) 정맥 투여, (ii) 피내 투여 또는 (iii) sHASEGP와 병용하여 피내 투여하였고, 이어서 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 필수적으로, 혈장 그램 당 분당 카운트(CPM)를 측정하기 위하여, 투약 후 각 시간점에서 혈액 및 조직을 처리하였다.
[표 26-1]
인자 VIII의 약력학에 대한 rHuPH20의 영향
시간(시) CPM
인자 VIII
(50 IU/kg)
피부		 SD CPM
인자 VIII
(50 IU/kg)+
sHASEGP 100
피부		 SD CPM
인자 VIII
(50 IU/kg)
정맥내
0.5 29,748 12,002 46,376 5,503 670,743
1 43,767 9,415 70,249 14,614 379,558
2 49,507 14,592 72,736 14,985 247,397
3 56,087 17,621 76,631 14,454 200,602
4 55,494 12,721 84,066 8,646 177,846
5 55,277 14,181 79,735 9,363 165,914
6 50,195 13,970 72,176 6,848 121,198
8 52,290 13,707 66,419 10,495 114,579
12 48,336 10,765 58,817 11,760 75,912
24 23,173 4,700 24,596 4,426 29,610
AUC 1,014,521 1,303,078 2,554,607
Cmax 56,087 84,066 -
Tmax 4 4 -
절대
생체이용률		 39.7% 51% 100%
상기 표 26-1에서 알 수 있는 바와 같이, 인자 VIII과 rHuPH20의 공동투여는 인자 III 단독 투여에 비하여 유의하게 전신 생체이용률을 증가시켰다(P< O.01). 혈류로 들어가는 완전하게 분해된 1-125 표지화 인자 VIII 단백질의 관여를 제거하기 위하여 TCA 침전법을 이용하는 것이 필요하다.
실시예 27- 졸중후 생존율 및/또는 행동 결과를 개선시키기 위한 sHASEGP의 용도 일례
시험의 처음 세트로, 졸중 래트 모델에서 sHASEGP를 평가하였다. 요약하면, 중간 대뇌 동맥 경색을 통하여 스프라그-다우리 래트에 외과적으로 졸중을 유발시키고, 이어서 다양한 시간점에 대조구 용액(염수) 또는 시험 용액(sHASEGP 함유 염수)을 정맥 투여하였다. 동물들을 회복시키고 시간 기간에 걸쳐 추적하여 대조군 대 시험군의 생존율을 평가하였다. 또한, 생존체에 대하여 시간점 범위에 걸쳐서 졸중과 통상 연관되는 행동 상태를 다수 분석으로 평가하였다. 앞다리 굴곡 시험을 수행하여 초기에 적격을 판단한 래트만을 본 실험에 포함시켰으며, 이후 무작위적으로 동물 대조군 또는 시험군으로 할당하였다.
무균 수술과정을 다음과 같이 필수적으로 지빅 실험실(Zivic Laboratories)을 통해 수행하였다. 2.5% 할로탄이 공급된 챔버에서 래트를 마취시켰다. 복부 중간 절개를 하고, 근육 조직을 분리하여 오른쪽 외부 경동맥을 노출시켜서, 이후 분리하고 이중 결찰시켰다. 풀어서 조인 5/0 폴리아미드 봉합사를 이어서 외부 경동맥 절주 둘레에 위치시켰다. 상기 절주의 루멘에 작은 구멍을 잘라서 18-20 mm 길이의 4/0 미세필라멘트 봉합재를 상기 루멘에 삽입하고 내부 경동맥으로 전진시켰다. 이를 완료하면, 내부로 들어간 모노필라멘트의 끝으로 중간 대뇌 동맥으로 들어가는 흐름을 차단하였다. 이어서 조여진 폴리아미드 봉합사를 메어서 상기 모노필라멘트를 단단하게 한 죄었다. 수축력을 제거하고 피부 절개부를 상처 클립으로 봉합하였다.
정맥 투여 절차는 본질적으로 다음과 같이 수행하였다. 2.5% 할로탄이 공급 된 챔버에서 래트를 마취시켰다. 복부 피부 절개부를 경정맥이 노출되도록 만들었다. 멸균한 1 ml 1회용 시린지에 30-gauge 바늘이 끼우고 주입물을 채웠다. 지지용 쇄골을 사용하여, 시린지를 경정맥에 삽입시키고(혈류를 시린지로 뽑아내기 위하여 시린지에 음압을 사용하여서 IV 주사에 적절한 위치를 확인하였다), 이어서 주입물을 천천히 경정맥으로 주입시킨다. 주입 후, 상기 바늘을 천천히 빼고(그리고 멸균 면봉으로 출혈을 조절한다), 이후 피부 절개부를 상처 클립으로 닫는다.
졸중 유발 후 다양한 그룹 내(각 그룹 내 대략 40 동물) 동물 생존율을 모니터링하였으며, 졸중 이후의 일수에 대하여 날마다 생존체의 수를 측정하여 카플란-마이어 졸종 그래프(Kaplan-Meier stroke curve)를 만들었다. 그룹간에 실질적인 차이는 졸중 후 3번째 날부터 나타났다. 졸중 유발 후 1주일에는 대조군 동물의 절반 이상이 죽은 반면, sHASEGP-처리한 동물의 3/4가 생존하였고, 이는 통계적으로 유의한 차이이다 (p=0.03).
졸중 후 생존율을 측정한 것외에도, 졸중과 관련된 일정 행동 문제의 발생을 측정하기 위하여 설계한 다른 분석법을 사용하여 생존체를 시험하였다(졸종 후 1, 2, 3, 및 4주). 평가한 행동 상태는 굴곡, 몸통 휨, 뒷다리, 걸음 장애 및 벽 걸음(wall walk) 등을 평가하여서, PNEGS 행동점수를 부여하였다(높은 점수는 졸중과 관련된 행동 문제가 크다는 것을 반응함). 졸중 유발후 2주에, sHASEGP-처리 동물은 유의하게 높은 행동 점수를 나타내었고(p=0.02), 처리군과 대조군사이의 차이점은 그 이후 주에 보다 커졌다(각각 3주 및 4주에 대하여 p=0.007 및 p=0.003).
본 발명을 상기 실시예를 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 범주 및 관점 내에서 다양한 변형이 가능함은 자명하다. 따라서, 본 발명은 하기의 청구항에 의해서만 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> HALOZYME THERAPEUTICS, Inc. Bookbinder, Louis H. Kundu, Anirban Frost, Gregory I. HALLER, Michael F. KELLER, Gilbert A. 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120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr 35 <210> 3 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 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Hyaluronidase Glycoprotein <400> 6 atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa 48 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt 96 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct 144 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt 192 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga 240 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 ata aac gcc acc ggg caa ggt gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt 288 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga 336 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val 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Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 tac aac cat cac tat aag aaa ccc ggt tac aat gga agt tgc ttc aat 720 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 gta gaa ata aaa aga aat gat gat ctc agc tgg ttg tgg aat gaa agc 768 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta 816 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt 864 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc 912 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa 960 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att 1008 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg 1056 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac 1104 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa 1152 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc 1200 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca 1248 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa 1296 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat 1344 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt 1392 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct caa att 1440 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 ttc tac aat gct tca ccc tcc aca cta tct gcc aca atg ttc att gtt 1488 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 agt att ttg ttt ctt atc att tct tct gta gcg agt ttg taa 1530 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu * 500 505 <210> 7 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARBOHYD <222> 82, 166, 235, 254, 368, 393, 490 <400> 7 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala 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end <400> 11 aattggatcc tcattgaggt tcttctgtct cc 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to generate GPI anchor lacking Q479 and terminating at P478 with BamHI site in the 5' end <400> 12 aattggatcc tcaaggttct tctgtctcca tg 32 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer to generate GPI anchor lacking P478 and terminating at E477 with BamHI site in the 5' end <400> 13 aattggatcc tcattcttct gtctccatgg g 31 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer with NheI restriction site at 5' end <400> 14 aattgctagc atgggagtgc taaaattcaa gc 32 <210> 15 <211> 1473 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(1473) <223> sHASEGPup to P478 and His Tagged <400> 15 atg gga gtg cta aaa ttc aag cac atc ttt ttc aga agc ttt gtt aaa 48 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 tca agt gga gta tcc cag ata gtt ttc acc ttc ctt ctg att cca tgt 96 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 tgc ttg act ctg aat ttc aga gca cct cct gtt att cca aat gtg cct 144 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 ttc ctc tgg gcc tgg aat gcc cca agt gaa ttt tgt ctt gga aaa ttt 192 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 gat gag cca cta gat atg agc ctc ttc tct ttc ata gga agc ccc cga 240 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 ata aac gcc acc ggg caa ggt gtt aca ata ttt tat gtt gat aga ctt 288 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 ggc tac tat cct tac ata gat tca atc aca gga gta act gtg aat gga 336 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 gga atc ccc cag aag att tcc tta caa gac cat ctg gac aaa gct aag 384 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 aaa gac att aca ttt tat atg cca gta gac aat ttg gga atg gct gtt 432 Lys Asp 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agc 768 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 act gct ctt tac cca tcc att tat ttg aac act cag cag tct cct gta 816 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 gct gct aca ctc tat gtg cgc aat cga gtt cgg gaa gcc atc aga gtt 864 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 tcc aaa ata cct gat gca aaa agt cca ctt ccg gtt ttt gca tat acc 912 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 cgc ata gtt ttt act gat caa gtt ttg aaa ttc ctt tct caa gat gaa 960 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 ctt gtg tat aca ttt ggc gaa act gtt gct ctg ggt gct tct gga att 1008 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 gta ata tgg gga acc ctc agt ata atg cga agt atg aaa tct tgc ttg 1056 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 ctc cta gac aat tac atg gag act ata ctg aat cct tac ata atc aac 1104 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 gtc aca cta gca gcc aaa atg tgt agc caa gtg ctt tgc cag gag caa 1152 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 gga gtg tgt ata agg aaa aac tgg aat tca agt gac tat ctt cac ctc 1200 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 aac cca gat aat ttt gct att caa ctt gag aaa ggt gga aag ttc aca 1248 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 gta cgt gga aaa ccg aca ctt gaa gac ctg gag caa ttt tct gaa aaa 1296 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 ttt tat tgc agc tgt tat agc acc ttg agt tgt aag gag aaa gct gat 1344 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 gta aaa gac act gat gct gtt gat gtg tgt att gct gat ggt gtc tgt 1392 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 ata gat gct ttt cta aaa cct ccc atg gag aca gaa gaa cct gga tcc 1440 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser 465 470 475 480 ggt tct ggt gct cac cat cac cat cac cat taa 1473 Gly Ser Gly Ala His His His His His His * 485 490 <210> 16 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gly Ser 465 470 475 480 Gly Ser Gly Ala His His His His His His 485 490 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpacerHisFor Primer <400> 17 ataattggat ccggttctgg tgctcaccat caccatcac 39 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpacerHisRev Primer <400> 18 tataattgcg gccgcctaat ggtgatggtg atggtgag 38 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at N 483 <400> 19 aatggatcca ttgtagaaaa tttgaggttc 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at Y 482 <400> 20 aatggatccg tagaaaattt gaggttcttc 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at F 481 <400> 21 aattggatcc gaaaatttga ggttcttctg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at I 480 <400> 22 attggatcca atttgaggtt cttctgtctc 30 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at Q 479 <400> 23 aattggatcc ttgaggttct tctgtctcc 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at P 478 <400> 24 aattggatcc aggttcttct gtctccatg 29 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' REVERSE PRIMER WITHOUT STOP CODON FOR GENERATING truncation product HIS-sHASEGP lacking GPI anchor and ending at E 477 <400> 25 aattggatcc ttcttctgtc tccatggg 28 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at A 467 <400> 26 aattggatcc ctaagcatct atacagacac catcag 36 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at A 447 <400> 27 aattggatcc ctaagctttc tccttacaac tcaag 35 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at S 430 <400> 28 aattggatcc ctaagaaaat tgctccaggt cttc 34 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at G 413 <400> 29 aattggatcc ctatccacct ttctcaagtt gaatag 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at S 394 <400> 30 aattggatcc ctatgaattc cagtttttcc ttatac 36 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at A 372 <400> 31 aattggatcc ctatgctagt gtgacgttga ttatg 35 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer to amplify sHASEGP deletion mutant ending at S 347 <400> 32 aattggatcc ctaacttcgc attatactga ggg 33 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN forward primer for site directed mutagenesis to generate sHASEGP fusion with kappa leader with L 36 as the first sHASEGP amino acid after the kappa leader <400> 33 ctgaatttca gagcacctcc tgttattcc 29 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FR forward primer for site directed mutagenesis to generate sHASEGP fusion with kappa leader with F 38 as the first sHASEGP amino acid after the kappa leader <400> 34 ttcagagcac ctcctgttat tccaaatg 28 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp reverse primer for site directed mutagenesis to generate sHASEGP fusion with kappa leader with Asp as the last Kappa leader amino acid before L 36 or F 38 of PH-20 <400> 35 gtcaccagtg gaacctggaa ccc 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly reverse primer for site directed mutagenesis to generate sHASEGP fusion with kappa leader with Gly as the last Kappa leader amino acid before L 36 or F 38 of PH-20 <400> 36 accagtggaa cctggaaccc agag 24 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for first fragment of kappa leader <400> 37 gagacagaca cactcctgct atgggtactg 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for first fragment of kappa leader <400> 38 cccagagcag cagtacccat agcaggagtg 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for second fragment of kappa leader <400> 39 ggtactgctg ctctgggttc caggttccac 30 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for second fragment of kappa leader <400> 40 gcgtcaccag tggaacctgg aacccag 27 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nhe Forward primer for kappa leader <400> 41 attgctagca tggagacaga cacactcctg 30 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR1 reverse primer for kappa leader <400> 42 aattgaattc gtcaccagtg gaacctgg 28 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgK-chain leader sequence <400> 43 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp 20 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K-leader SPE 1 FORWARD Primer <400> 44 actcactagt gctagcatgg agacagacac 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K-leader MLU1 REV primer <400> 45 aattacgcgt gaattcgtca ccagtggaac 30 <210> 46 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa leader fusion protein with sHASEGP with F 38 as the first amino acid of the putative mature secreted sHASEGP (up to P478) <400> 46 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 20 25 30 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 35 40 45 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 50 55 60 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 85 90 95 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 100 105 110 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 115 120 125 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 145 150 155 160 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 165 170 175 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 180 185 190 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 195 200 205 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 210 215 220 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 225 230 235 240 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 245 250 255 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 260 265 270 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 275 280 285 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 290 295 300 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 305 310 315 320 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 325 330 335 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 340 345 350 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 355 360 365 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 370 375 380 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 385 390 395 400 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 405 410 415 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 420 425 430 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 435 440 445 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 450 455 460 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer BAM REV sHASEGP with GPI anchor up to L 509 including STOP <400> 47 aattggatcc ctacagaaga aatgataaga aacaaaatac 40 <210> 48 <211> 1449 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactaa 1449 <210> 49 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 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Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala 465 <210> 50 <211> 1536 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctacaatg cttcaccctc cacactatct gccacaatgt tcatttggag gctggaagtc 1500 tgggatcaag gtattagcag aattggtttc ttctga 1536 <210> 51 <211> 6630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZ24 plasmid vector <400> 51 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210> 52 <211> 2009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 atgtggctca cataaattca gaaagtatga tagcagtgta ggtggttagc agcacctcat 60 aaggtccttc ctagcaaggc aaagggatgc taatgactag ccaatgctct aggaagacat 120 tgagaccagc caacttcttg ccttgataac tactgaagag acattgggtg gctggatttt 180 gaaagcagac ttctggttat aggtgatgca acttgaaaaa caatcctgaa acatgaaaca 240 agaataataa tatttaaatg taacttaatc attatacctc tttatccatc aaagtgaatt 300 cattccattc cctttcatct gtgctcatac tttgcatcag atattgggta aaccaaagtg 360 tgtaggaaga aataaatgtt ttcatagtca ttactcttta caatgggagt gctaaaattc 420 aagcacatct ttttcagaag ctttgttaaa tcaagtggag tatcccagat agttttcacc 480 ttccttctga ttccatgttg cttgactctg aatttcagag cacctcctgt tattccaaat 540 gtgcctttcc tctgggcctg gaatgcccca agtgaatttt gtcttggaaa atttgatgag 600 ccactagata tgagcctctt ctctttcata ggaagccccc gaataaacgc caccgggcaa 660 ggtgttacaa tattttatgt tgatagactt ggctactatc cttacataga ttcaatcaca 720 ggagtaactg tgaatggagg aatcccccag aagatttcct tacaagacca tctggacaaa 780 gctaagaaag acattacatt ttatatgcca gtagacaatt tgggaatggc tgttattgac 840 tgggaagaat ggagacccac ttgggcaaga aactggaaac ctaaagatgt ttacaagaat 900 aggtctattg aattggttca gcaacaaaat gtacaactta gtctcacaga ggccactgag 960 aaagcaaaac aagaatttga aaaggcaggg aaggatttcc tggtagagac tataaaattg 1020 ggaaaattac ttcggccaaa tcacttgtgg ggttattatc tttttccgga ttgttacaac 1080 catcactata agaaacccgg ttacaatgga agttgcttca atgtagaaat aaaaagaaat 1140 gatgatctca gctggttgtg gaatgaaagc actgctcttt acccatccat ttatttgaac 1200 actcagcagt ctcctgtagc tgctacactc tatgtgcgca atcgagttcg ggaagccatc 1260 agagtttcca aaatacctga tgcaaaaagt ccacttccgg tttttgcata tacccgcata 1320 gtttttactg atcaagtttt gaaattcctt tctcaagatg aacttgtgta tacatttggc 1380 gaaactgttg ctctgggtgc ttctggaatt gtaatatggg gaaccctcag tataatgcga 1440 agtatgaaat cttgcttgct cctagacaat tacatggaga ctatactgaa tccttacata 1500 atcaacgtca cactagcagc caaaatgtgt agccaagtgc tttgccagga gcaaggagtg 1560 tgtataagga aaaactggaa ttcaagtgac tatcttcacc tcaacccaga taattttgct 1620 attcaacttg agaaaggtgg aaagttcaca gtacgtggaa aaccgacact tgaagacctg 1680 gagcaatttt ctgaaaaatt ttattgcagc tgttatagca ccttgagttg taaggagaaa 1740 gctgatgtaa aagacactga tgctgttgat gtgtgtattg ctgatggtgt ctgtatagat 1800 gcttttctaa aacctcccat ggagacagaa gaacctcaaa ttttctacaa tgcttcaccc 1860 tccacactat ctgccacaat gttcattgtt agtattttgt ttcttatcat ttcttctgta 1920 gcgagtttgt aattgcgcag gttagctgaa atgaacaata tgtccatctt aaagtgtgct 1980 ttttcgacta attaaatctt tgaaaagaa 2009 <210> 53 <211> 2395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 atgtggctca cataaattca gaaagtatga tagcagtgta ggtggttagc agcacctcat 60 aaggtccttc ctagcaaggg atgctaatga ctagccaatg ctctaggaag acattgagac 120 cagccaactt cttgccttga taactactga agagacattg ggtggctgga ttttgaaagc 180 agacttctgg ttataggtga tgcaacttga aaaacaatcc tgaaacatga aacaagaata 240 ataatattta aatgtaactt aatcattata cctctttatc catcaaagtg aattcattcc 300 attccctttc atctgtgctc atactttgca tcagatattg ggtaaaccaa agtgtgtagg 360 aagaaataaa tgttttcata gtcattactc tttacaatgg gagtgctaaa attcaagcac 420 atctttttca gaagctttgt taaatcaagt ggagtatccc agatagtttt caccttcctt 480 ctgattccat gttgcttgac tctgaatttc agagcacctc ctgttattcc aaatgtgcct 540 ttcctctggg cctggaatgc cccaagtgaa ttttgtcttg gaaaatttga tgagccacta 600 gatatgagcc tcttctcttt cataggaagc ccccgaataa acgccaccgg gcaaggtgtt 660 acaatatttt atgttgatag acttggctac tatccttaca tagattcaat cacaggagta 720 actgtgaatg gaggaatccc ccagaagatt tccttacaag accatctgga caaagctaag 780 aaagacatta cattttatat gccagtagac aatttgggaa tggctgttat tgactgggaa 840 gaatggagac ccacttgggc aagaaactgg aaacctaaag atgtttacaa gaataggtct 900 attgaattgg ttcagcaaca aaatgtacaa cttagtctca cagaggccac tgagaaagca 960 aaacaagaat ttgaaaaggc agggaaggat ttcctggtag agactataaa attgggaaaa 1020 ttacttcggc caaatcactt gtggggttat tatctttttc cggattgtta caaccatcac 1080 tataagaaac ccggttacaa tggaagttgc ttcaatgtag aaataaaaag aaatgatgat 1140 ctcagctggt tgtggaatga aagcactgct ctttacccat ccatttattt gaacactcag 1200 cagtctcctg tagctgctac actctatgtg cgcaatcgag ttcgggaagc catcagagtt 1260 tccaaaatac ctgatgcaaa aagtccactt ccggtttttg catatacccg catagttttt 1320 actgatcaag ttttgaaatt cctttctcaa gatgaacttg tgtatacatt tggcgaaact 1380 gttgctctgg gtgcttctgg aattgtaata tggggaaccc tcagtataat gcgaagtatg 1440 aaatcttgct tgctcctaga caattacatg gagactatac tgaatcctta cataatcaac 1500 gtcacactag cagccaaaat gtgtagccaa gtgctttgcc aggagcaagg agtgtgtata 1560 aggaaaaact ggaattcaag tgactatctt cacctcaacc cagataattt tgctattcaa 1620 cttgagaaag gtggaaagtt cacagtacgt ggaaaaccga cacttgaaga cctggagcaa 1680 ttttctgaaa aattttattg cagctgttat agcaccttga gttgtaagga gaaagctgat 1740 gtaaaagaca ctgatgctgt tgatgtgtgt attgctgatg gtgtctgtat agatgctttt 1800 ctaaaacctc ccatggagac agaagaacct caaattttct acaatgcttc accctccaca 1860 ctatctgcca caatgttcat ttggaggctg gaagtctggg atcaaggtat tagcagaatt 1920 ggtttcttct gagagtcatg agggaaaaat gtgtttcagg cctcttccct tggcttacag 1980 gaaatgaaaa aaccatgact atcatcacca acatccttgg gtattaagtg cagtcactct 2040 cctagatgct gtggggagaa ggcaagttac aaagatagac cttccctcaa gataatcaga 2100 ttttcatggt attatcctta acctttttga catcatggag gctttgggaa tctgatgaag 2160 cctatcaatt ttcttccaga agatatttat ataagattat aagaaaaatt atgtacacag 2220 cttattttat tgcattggat caaaatgcca tttataaaga attatgcctt ttccatcaat 2280 tttagcatgg aaaaataatt tcaggcaata tgcttaaaaa ttgggggaag acaaaagaaa 2340 tccatatcgt gtaaataaaa ataaattttg gttttgctca aaaaaaaaaa aaaaa 2395

Claims (153)

  1. 가용성 중성 활성 인간 히알루로니다제(sHASEGP), 및 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제를 포함하는, 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제의 포유동물 표적 조직으로의 전달을 위한 조직 투과성 증가용 약학 조성물로서,
    상기 sHASEGP가 서열 번호 1의 아미노산 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 개시된 아미노산 서열을 가지고;
    상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 아달리무맙, 아갈시다제 베타, 알레파셉트, 암피실린, 아나킨라, 소아마비 예방 백신, 항흉선세포, 아지스로마이신, 베카플러민, 카스포펑긴, 세파졸린, 세페핌, 세포테탄, 세프타지딤, 세프트리악손, 세툭시맙, 실라스타틴, 클라불란산, 클린다마이신, 다베포에틴 알파, 데아클리주맙, 디프테리아, 디프테리아 항독소, 디프테리아 변성 독소, 에팔리주맙, 에리스로포이에틴 알파, 에타너셉트, 필그라스팀, 플루코나졸, 여포 자극 호르몬, 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 포스페닐로인, 가도디아미드, 가도펜테테이트, 가티플록사신, 글라티라머, GM-CSF, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 그라니세트론, 헤모필러스 인플루엔자 B, 할로페리돌, 간염 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, 이브리투모맙 티욱세탄, 이브리투모맙, 티욱세탄, 헤모필러스 인플루엔자 백신, 인플루엔자 바이러스 백신, 인플릭시맙, 인슐린 리스프로, 75% 중성 프로타민 리스프로(NPL)/25% 인슐린 리스프로, 50% 중성 프로타민 하게돈(NPH)/50% 레귤러 인슐린; 70% NPH/30% 레귤러 인슐린; 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 울트라 인슐린 및 울트라렌테 인슐린, 및 인슐린 글라긴, 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 콘센서스, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1a, 요오딕사놀, 요오헥솔, 요오파미돌, 요오버솔, 케토로락, 라로니다제, 레보플록사신, 리네졸리드, 로라제팜, 홍역 백신, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역-볼거리-풍진 바이러스 백신, 풍진 백신, 메드록시프로게스테론, 메로페넴, 메틸프레드니솔론, 미다졸람, 옥트레오타이드, 오말리주맙, 온단세트론, 팔리비주맙, 판토프라졸, 페가스파가제, 페그필그라스팀, Peg-인터페론 알파-2a, Peg-인터페론 알파-2b, 페그비소만트, 백일해 백신, 피페라실린, 폐렴구균 백신 및 폐렴구균 접합 백신, 프로메타진, 레테플라제, 소마트로핀, 술박탐, 수마트립탄, 타조박탐, 테넥테플라제, 파상풍 정제 변성 독소, 티카실린, 토시투모맙, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 반코마이신, 수두 포진 면역글로불린, 수두 백신, 기타 백신, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 비소, 삼산화비소, 아스파라기나제, 칼메트 게랑 간균(BCG) 백신, 생 BCG, 벡사로텐, 부설판, 정맥 부설판, 경구 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 폴리페프로산과 병용되는 카무스틴, 셀레콕시브, 클로람부실, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시타라빈 리포솜, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신 리포솜, 다우노루비신, 다우노마이신, 데닐루킨 디프티톡스, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 엘리엇 B 용액, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 에토포사이드 VP-16, 엑세메스탄, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-플루오로우라실, 풀베스트란트, 젬시타빈, 젬투주맙, 오조가미신, 젬투주맙 오조가미신, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 이리노테칸, 레트로졸, 루코보린, 레바미솔, 로머스틴, CCNU, 메클로레타민, 질소 머스터드, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, L-PAM, 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토테인, 미톡산트론, 난드롤론, 난드롤론 펜프로피오네이트, 노페투모맙, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 미트라마이신, 포피머, 포피머 소듐, 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 리툭시맙, 사그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 6-티오구아닌, 트리에틸렌티오포스포라미드(티오테파), 토포테칸, 토레미펜, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스터드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 졸레드로네이트, 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로닌, 아도젤레신, 알데스루킨, 레티노산, 알리트레티노인, 9-시스-레티노산, 알보시딥, 암바존, 암보마이신, 아메탄트론, 아미노글루테티마이드, 암사크린, 아낙시론, 안시타빈, 안트라마이신, 아파지쿠온, 아기메스나, 아스퍼린, 아트리머스틴, 아자시티딘, 아제테파, 아조토마이신, 바녹산트론, 바타불린, 바티마스타트, 베낙시빈, 벤다머스틴, 벤조데파, 비칼루타마이드, 비에타세르핀, 비리코다, 비산트렌, 비스나피드 디메실레이트, 비제레신, 보르테조밉, 브레퀴나, 브로피리민, 부도티탄, 칵티노마이신, 카너티닙, 카라세마이드, 카베티머, 카보쿠온, 카모퍼, 카루비신, 카젤레신, 세데핑골, 세마도틴, 클로람부실, 시오테로넬, 시로레마이신, 클란페너, 클로파라빈, 크리스나톨, 데시타빈, 덱스니굴디핀, 덱소마플라틴, 데자구아닌, 디아지쿠온, 디브로스피듐, 디에노제스트, 디날린, 디서몰라이드, 도페퀴다, 독시플루리딘, 드롤록시펜, 두아조마이신, 에코머스틴, 에다트렉세이트, 에도테카린, 에플로미틴, 엘라크리다, 엘리나피드, 엘사미트루신, 에미테퍼, 엔로플라틴, 엔프로메이트, 엔자스타우린, 에피프로피딘, 엡탈로프로스트, 에불로졸, 에소루비신, 에타니다졸, 에토글루시드, 에토프린, 엑시설린드, 파드로졸, 파자라빈, 펜레티니드, 플루옥시메스테론, 플루오로시타빈, 포스퀴돈, 포스트리신, 포트레타민, 갈라루비신, 갈로시타빈, 게로퀴놀, 기마테칸, 기메라실, 글록사존, 글루포스파미드, 일모포신, 일로마스타트, 이멕손, 임프로설판, 인디설람, 인프로쿠온, 인터루킨, 인터루킨-2, 재조합 인터루킨, 인토플리신, 요오벤구안, 이프로플라틴, 이소글라딘, 익사베필론, 케토트렉세이트, L-알라노신, 란레오티드, 라파티닙, 레독산트론, 루프롤리드, 루프로렐린, 렉사칼시톨, 리아로졸, 로바플라틴, 로메트렉솔, 로나파닙, 로속산트론, 루토테칸, 마포스파미드, 만노설판, 마리마스타트, 마소프로콜, 마이탄신, 메클로레타민, 멜렌게스트롤, 멜팔란, 메노가릴, 메피티오스탄, 메테신드, 메토미데이트, 메토프린, 메투레데파, 미보플라틴, 미프록시펜, 미소니다졸, 미틴도마이드, 미토카신, 미토크로민, 미토플락손, 미토길린, 미토구아존, 미토말신, 미토나파이드, 미노퀴돈, 미토스퍼, 미토졸로마이드, 미보불린, 미조리빈, 모파로텐, 모피다몰, 무브리티닙, 마이코페놀산, 네다플라틴, 넬자라빈, 네모루비신, 니트라크린, 노코다졸, 노갈라마이신, 놀라트렉세드, 노토픽산트론, 오마플라틴, 오타탁셀, 오터라실, 옥시서란, 옥소페나신, 파투빌론, 펠데신, 펠리오마이신, 펠리트렉솔, 페메트렉세드, 펜타머스틴, 페플로마이신, 퍼포스파마이드, 페리포신, 피코플라틴, 피나파이드, 피포설판, 퍼페니돈, 피록산트론, 픽산트론, 플레비트렉세드, 플로메스탄, 포피로마이신, 프레드니머스틴, 프로파미딘, 프로스피듐, 푸미테파, 퓨로마이신, 피라조퓨린, 라니머스틴, 리보프린, 리트로설판, 로글레티마이드, 로퀴니멕스, 루포크로모마이신, 사바루비신, 사핑골, 사트라플라틴, 세브리플라틴, 세머스틴, 심트라젠, 시조피란, 소부족산, 소라페닙, 스파포세이트, 스파포스산, 스파소마이신, 스피로게르마늄, 스피로머스틴, 스피로플라틴, 스쿠알라민, 스트렙토니그린, 스트렙토바리신, 서포스파마이드, 설로페너, 타세디날린, 탈리소마이신, 탈리머스틴, 타리퀴다, 타우로머스틴, 테코갈란, 테가퍼, 텔록산트론, 테모포핀, 테록시론, 티아미프린(Thiamiprine), 티아미프린(Tiamiprine), 티아조푸린, 틸로미솔, 틸로론, 팀코다, 티모나식, 티라파자민, 토픽산트론, 트라벡테딘, 엑테인아시딘 743, 트레스톨론, 트리시리빈, 트릴로스탄, 트리메트렉세이트, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트립토렐린, 트로포스파마이드, 투불로졸, 우베니멕스, 우레데파, 발스포다, 바프레오타이드, 버테포핀, 빈블라스틴, 빈데신, 비네피딘, 빈플루닌, 빈포마이드, 빈글리시네이트, 빈루시놀, 빈루로신, 빈로시딘, 빈트립톨, 빈졸리딘, 보로졸, 크산토마이신 A, 구아메사이클린, 제니플라틴, 질라스콥 [2-H], 지노스타틴, 조루비신, 조수퀴다, 아세타졸아미드, 아시클로버, 아디피오돈, 알라트로플록사신, 알펜타닐, 알레르기성 추출물, 알파 1-프로테이나제 억제제, 알프로스타딜, 아미카신, 아미노산, 아미노카프로산, 아미노필린, 아미트립틸린, 아모바비탈, 암리논, 소아마비 예방 백신, 항광견병 혈청, 항파상풍 면역글로불린, 파상풍 백신, 항트롬빈 III, 해독 혈청, 아르가트로반, 아르기닌, 아테놀롤, 아트라쿠륨, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 아즈트레오남, 바시트라신, 바클로펜, 바실릭시맙, 벤즈트로핀, 베타메타손, 비오틴, 비발리루딘, 보툴리누스 중독증 항독소, 브레틸륨, 부메타나이드, 부프레노르핀, 부토르파놀, 칼시토닌, 칼시트리올, 카프레오마이신, 카보프로스트, 카르니틴, 세파만돌, 세포페라존, 세포탁심, 세폭시틴, 세프티족심, 세푸록심, 클로람페니콜, 클로로프로카인, 클로로퀸, 클로로티아지드, 클로프로마진, 콘드로이틴황산, 코리오고나도트로핀 알파, 크로뮴, 시도포버, 시메티딘, 시프로플록사신, 시사트라쿠륨, 클로니딘, 코데인, 콜키신, 콜리스틴, 콜라겐, 코르티코렐린 양 트리플루테이트, 코르티코트로핀, 코신트로핀, 시아노코발라민, 사이클로스포린, 시스테인, 다클릭시맙, 달포프리스틴, 달테파린, 다나파로이드, 단트롤렌, 데페록사민, 데스모프레신, 덱사메타손, 덱스메데토미딘, 덱스판테놀, 덱스트란, 철 덱스트란, 디아트리조산, 디아제팜, 디아족시드, 디시클로민, 디기빈드, 디곡신, 디히드로에르고타민, 딜티아젬, 디펜히드라민, 디피리다몰, 도부타민, 도파민, 독사쿠륨, 독사프람, 독서칼시페롤, 독시사이클린, 드로페리돌, 디필린, 에데트산, 에드로포늄, 에날라프릴랏, 에페드린, 에포프로스테놀, 에르고칼시페롤, 에르고노빈, 에르타페넴, 에리스로마이신, 에스몰롤, 에스트라디올, 에스트로제닉, 에타크린산, 에티오디제드 오일, 에티드론산, 에토미데이트, 파모티딘, 페놀도팜, 펜타닐, 플루마제닐, 플루오레세인, 플루페나진, 폴산, 포메피졸, 포미비르센, 폰다파리눅스, 포스카르넷, 포스페니토인, 푸로세마이드, 가도테리돌, 가도베르세타마이드, 간시클로버, 젠타미신, 글루카곤, 글리코피롤레이트, 고나도렐린, 고나도트로핀 코리오닉, 헤모필러스 B 다당류, 헤민, 허브(Herbal), 히스타민, 히드랄라진, 히드로코르티손, 히드로모르폰, 히드록소코발라민, 히드록시진, 히오스시아민, 이부틸리드, 이미글루세라제, 인디고 카르민, 인도메타신, 요오다이드, 이오탈람산, 이옥사글리산, 이옥실란, 이소니아지드, 이소프로테레놀, 일본 뇌염 백신, 카나마이신, 케타민, 라베탈롤, 레피루딘, 레보부피바카인, 레보티록신, 린코마이신, 리오티로닌, 황체 형성 호르몬, 라임병 백신, 만가포디퍼, 만니톨, 수막염균 다당류 백신, 메페리딘, 메피바카인, 메소리다진, 메타라미놀, 메타돈, 메토카르바몰, 메토헥시탈, 메틸도페이트, 메틸에르고노빈, 메토클로프라미드, 메토프롤롤, 메트로니다졸, 미노사이클린, 미바쿠륨, 모루산(Morrhuic acid), 목시플록사신, 무로모납-CD3, 미코페놀레이트 모페틸, 나프실린, 날부핀, 날메펜, 날록손, 네오스티그민, 니아신아미드, 니카르디핀, 니트로글리세린, 니트로프루시드, 노르에피네프린, 오르페나드린, 옥사실린, 옥시모르폰, 옥시테트라사이클린, 옥시토신, 판쿠로늄, 판테놀, 판토텐산, 파파베린, Peg-인터페론 알파 2A, 페니실린 G, 펜타미딘, 펜타조신, 펜토바비탈, 퍼플루트렌, 퍼페나진, 페노바비탈, 펜톨아민, 페닐에프린, 페니토인, 피소스티그민, 피토나디온, 폴리믹신 b, 프랄리독심, 프릴로카인, 프로카인아미드, 프로클로르페라진, 프로게스테론, 프로프라놀롤, 피리도스티그민 수산화물, 피리독신, 퀴니딘, 퀴누프리스틴, 광견병 면역글로불린, 광견병 백신, 라니티딘, 레미펜타닐, 리보플라빈, 리팜핀, 로피바카인, 사마륨, 스코폴라민, 셀레늄, 세르모렐린, 신칼리드, 소마트렘, 스펙티노마이신, 스트렙토키나제, 스트렙토마이신, 숙시닐콜린, 수펜타닐, 술파메톡사졸, 타크롤리머스, 테르부탈린, 테리파라티드, 테스토스테론, 파상풍 항독소, 테트라카인, 테트라데실 설페이트, 테오필린, 티아민, 티에틸페라진, 티오펜탈, 갑상선 자극 호르몬, 틴자파린, 티로피반, 토브라마이신, 톨라졸린, 톨부타마이드, 토르세마이드, 트라넥삼산, 트레프로스티닐, 트리플루오페라진, 트리메토벤자미드, 트리메토프림, 트로메타민, 튜버쿨린, 장티푸스 백신, 유로폴리트로핀, 유로키나제, 발프로산, 바소프레신, 베큐로늄, 베라파밀, 보리코나졸, 와파린, 황열병 백신, 지도부딘, 지프라시돈 염산염, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아드리아마이신, 아자세린, 6-아자우리딘, 카지노필린, 크로모마이신, 데노프테린, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 에노시타빈, 록수리딘, 올리보마이신, 피라루비신, 피리트렉심, 프테로프테린, 타가퍼, 튜버시딘, 알테플라제, 아시투모맙, 베바시주맙, 보툴리늄 독소 A형, 보툴리늄 독소 B형, 카프로맙 펜데타이드, 다클리주맙, 도나세 알파, 드로트레코긴 알파, 임시로맙 펜테테이트, 요오드-131, 페피루비신, 아미노글리코시드, 암페니콜, 안사마이신, 카바세펨, 카바페넴, 세팔로스포린 또는 세펨, 세파마이신, 클라밤, 환형 리포펩티드, 디아미노피리미딘, 케톨라이드, 린코사마이드, 매크롤라이드, 모노박탐, 니트로푸란, 옥사세펨, 옥사졸리디논, 페넴, 티에나마이신 및 기타 베타락탐, 페니실린, 퀴놀론, 술폰아미드, 술폰, 테트라사이클린, 클로폭톨, 후시드산, 헥세딘, 메테나민, 니트로푸란토인, 니트록솔린, 리티페넴, 타우롤리딘, 심보몰, 항생제, 혈관신생 억제제, 백내장 및 당뇨병성 망막증 예방 물질, 산동제, 광역학 치료제, 프로스타글란딘 유사체, 항신생물제, 대사길항제, 항바이러스제, 살아메바제 및 항원충제, 항결핵제 및 항나병제, 항독소 및 항사독소; 알클로메타손, 알게스톤, 베클로메타손, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자코르트, 데소니드, 데속시메타손, 디플루오로손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오메톨론, 플루페롤론, 플루프레드니덴, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀리드, 플루티카손, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로베타솔, 할로메타손, 할로프레돈, 히드로코르타메이트, 로테프레드놀 에타보네이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 리멕솔론 및 틱소코르톨 중에서 선택되는 스테로이드성 항염증 약물; 듀코사노이드, 프로스타글란딘 유사체, 항프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 전구체, 콜린성 제제 및 항콜린에스테라제, 항알레르기제, 및 제제들의 조합 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 인터페론 베타, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 컨센서스, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마-1b, Peg-인터페론 알파-2 및 Peg-인터페론 알파-2b 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 파미드로네이트 또는 졸레드로네이트인 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 인슐린 리스프로, 75% 중성 프로타민 리스프로(NPL)/25% 인슐린 리스프로, 50% 중성 프로타민 하게돈(NPH)/50% 레귤러 인슐린; 70% NPH/30% 레귤러 인슐린; 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 울트라 인슐린 및 울트라렌테 인슐린, 및 인슐린 글라긴 중에서 선택되는 인슐린인 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 트라스투주맙 및 베바시주맙 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 조직 또는 근처 조직으로의 주사용으로 제제화되는 것인 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 정맥내 주사 또는 혈류로의 주입용으로 제제화되는 것인 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 비정맥내 비경구 투여용으로 제제화되는 것인 약학 조성물.
  10. 포유동물의 뇌졸중 또는 다른 CNS 손상의 결과를 개선하기 위한, 가용성 인간 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP)을 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 sHASEGP가 서열 번호 1의 아미노산 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 개시된 아미노산 서열을 갖는 약학 조성물.
  11. 제1항 또는 제10항에 있어서,
    상기 sHASEGP는 히알루로니다제 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 공유 결합된 하나 이상의 당 잔기를 포함하는 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 sHASEGP가 CHO 세포로부터 발현되어 분비되는 것인 약학 조성물.
  17. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 sHASEGP가 PEG화 또는 과시알화된 sHASEGP인 약학 조성물.
  18. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 sHASEGP가 서열 번호 1의 아미노산 36-482로서 개시된 아미노산 서열을 가지는 것인 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 폴리펩티드당 3개 내지 6개의 PEG 부분을 포함하고,
    서열 번호 1의 아미노산 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 개시된 아미노산 서열을 가지는, PEG화된 인간 히알루로니다제.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제20항에 있어서,
    상기 히알루로니다제는 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 공유 결합된 하나 이상의 N 결합 당 잔기를 포함하는 중성 활성 가용성 인간 히알루로니다제 폴리펩티드이고;
    상기 히알루로니다제는 가용성인 PEG화된 히알루로니다제.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제20항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 CHO 세포로부터 발현되어 분비되는 것인 PEG화된 히알루로니다제.
  30. 제20항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 서열 번호 1의 아미노산 36-482로서 개시된 아미노산 서열을 가지는 것인 PEG화된 히알루로니다제.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 제20항에 있어서, 상기 PEG 부분이 분지형인 PEG화된 히알루로니다제.
  36. 제20항에 있어서, 상기 PEG 부분이 mPEG-SBA(5 kDa), mPEG-SBA(2O kDa), mPEG-SBA(3O kDa), mPEG-SMB(2O kDa), mPEG-SMB(3O kDa), mPEG-부티르알데히드(3O kDa), mPEG-SPA(2O kDa), mPEG-SPA(3O kDa), mPEG2-NHS(1O kDa 분지형), mPEG2-NHS(2O kDa 분지형), mPEG-NHS(4O kDa 분지형), mPEG2-NHS(6O kDa 분지형), PEG-NHS-비오틴(5 kDa 비오틴화), PEG-p-니트로페닐-카보네이트(3O kDa) 및 PEG-프로피온알데히드(3O kDa)로 구성된 군에서 선택되는 PEG 시약과의 반응으로부터 생성되는 것인 PEG화된 히알루로니다제.
  37. 직경 0.5 마이크론 미만의 치료 물질 또는 다른 분자 또는 거대 분자 복합체의 피험체에서의 확산을 증가시키는 데 사용하기 위한 제20항의 PEG화된 히알루로니다제를 포함하는 약학 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 치료 물질 또는 다른 분자 또는 거대 분자 복합체가 화학요법제, 진통제, 항염증제, 항균제, 살아메바제, 살트리코모나스제, 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관절염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린 작용제, 알파 차단제, 마취제, 기관지 확장제, 살생물제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심혈관 약제, 피임제, 충혈 완화제, 이뇨제, 진정제, 진단제, 전해질제, 최면제, 호르몬제, 고혈당제, 근육 이완제, 근육 수축제, 안과 제제, 부교감신경 흥분제, 정신 자극제, 진정제, 수면 유도제, 교감신경 흥분제, 신경안정제, 비뇨기 제제, 질 제제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드성 항염증제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 약물 및 유기 분자 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  39. 포유동물의 안 질환을 치료하기 위해 유리액의 액화를 유도하는 데 사용하기 위한, 제20항의 PEG화된 히알루로니다제를 포함하는 약학 조성물.
  40. 종양을 치료하기 위한, 제20항의 PEG화된 히알루로니다제를 포함하는 약학 조성물.
  41. 인간 히알루로니다제를, PEG-숙신이미딜 부타노에이트, PEG-숙신이미딜 메틸부타노에이트, PEG-숙신이미딜 프로프리오네이트, PEG-N-히드록시숙신이미드, PEG-알데히드, PEG-카보네이트, PEG-프로피온알데히드 및 PEG-말레이미드 중에서 선택되는 몰 과량의 PEG 시약과 반응시켜 3개 내지 6개의 PEG 부분을 포함하는 히알루로니다제를 생산하는 단계를 포함하는, 제20항의 PEG화된 히알루로니다제의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 PEG 제제가 mPEG-SBA(5 kDa), mPEG-SBA(2O kDa), mPEG-SBA(3O kDa), mPEG-SMB(2O kDa), mPEG-SMB(3O kDa), mPEG-부티르알데히드(3O kDa), mPEG-SPA(2O kDa), mPEG-SPA(3O kDa), mPEG2-NHS(1O kDa 분지형), mPEG2-NHS(2O kDa 분지형), mPEG-NHS(4O kDa 분지형), mPEG2-NHS(6O kDa 분지형), PEG-NHS-비오틴(5 kDa 비오틴화), PEG-p-니트로페닐-카보네이트(3O kDa) 및 PEG-프로피온알데히드(3O kDa) 중에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항의 방법에 따라 제조된 PEG화된 히알루로니다제.
  44. a) 서열 번호 1의 아미노산 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 개시된 아미노산 서열로 이루어진 가용성 중성 활성 인간 히알루로니다제(sHASEGP) 폴리펩티드; 및
    b) 아달리무맙, 아갈시다제 베타, 알레파셉트, 암피실린, 아나킨라, 소아마비 예방 백신, 항흉선세포, 아지스로마이신, 베카플러민, 카스포펑긴, 세파졸린, 세페핌, 세포테탄, 세프타지딤, 세프트리악손, 세툭시맙, 실라스타틴, 클라불란산, 클린다마이신, 다베포에틴 알파, 데아클리주맙, 디프테리아, 디프테리아 항독소, 디프테리아 변성 독소, 에팔리주맙, 에리스로포이에틴 알파, 에타너셉트, 필그라스팀, 플루코나졸, 여포 자극 호르몬, 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 포스페닐로인, 가도디아미드, 가도펜테테이트, 가티플록사신, 글라티라머, GM-CSF, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 그라니세트론, 헤모필러스 인플루엔자 B, 할로페리돌, 간염 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, 이브리투모맙 티욱세탄, 이브리투모맙, 티욱세탄, 헤모필러스 인플루엔자 백신, 인플루엔자 바이러스 백신, 인플릭시맙, 인슐린 리스프로, 75% 중성 프로타민 리스프로(NPL)/25% 인슐린 리스프로, 50% 중성 프로타민 하게돈(NPH)/50% 레귤러 인슐린; 70% NPH/30% 레귤러 인슐린; 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 울트라 인슐린 및 울트라렌테 인슐린, 및 인슐린 글라긴, 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 콘센서스, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1a, 요오딕사놀, 요오헥솔, 요오파미돌, 요오버솔, 케토로락, 라로니다제, 레보플록사신, 리네졸리드, 로라제팜, 홍역 백신, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역-볼거리-풍진 바이러스 백신, 풍진 백신, 메드록시프로게스테론, 메로페넴, 메틸프레드니솔론, 미다졸람, 옥트레오타이드, 오말리주맙, 온단세트론, 팔리비주맙, 판토프라졸, 페가스파가제, 페그필그라스팀, Peg-인터페론 알파-2a, Peg-인터페론 알파-2b, 페그비소만트, 백일해 백신, 피페라실린, 폐렴구균 백신 및 폐렴구균 접합 백신, 프로메타진, 레테플라제, 소마트로핀, 술박탐, 수마트립탄, 타조박탐, 테넥테플라제, 파상풍 정제 변성 독소, 티카실린, 토시투모맙, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 반코마이신, 수두 포진 면역글로불린, 수두 백신, 기타 백신, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 비소, 삼산화비소, 아스파라기나제, 칼메트 게랑 간균(BCG) 백신, 생 BCG, 벡사로텐, 부설판, 정맥 부설판, 경구 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 폴리페프로산과 병용되는 카무스틴, 셀레콕시브, 클로람부실, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시타라빈 리포솜, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신 리포솜, 다우노루비신, 다우노마이신, 데닐루킨 디프티톡스, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 엘리엇 B 용액, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 에토포사이드 VP-16, 엑세메스탄, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-플루오로우라실, 풀베스트란트, 젬시타빈, 젬투주맙, 오조가미신, 젬투주맙 오조가미신, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 이리노테칸, 레트로졸, 루코보린, 레바미솔, 로머스틴, CCNU, 메클로레타민, 질소 머스터드, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, L-PAM, 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토테인, 미톡산트론, 난드롤론, 난드롤론 펜프로피오네이트, 노페투모맙, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 미트라마이신, 포피머, 포피머 소듐, 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 리툭시맙, 사그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 6-티오구아닌, 트리에틸렌티오포스포라미드(티오테파), 토포테칸, 토레미펜, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스터드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 졸레드로네이트, 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로닌, 아도젤레신, 알데스루킨, 레티노산, 알리트레티노인, 9-시스-레티노산, 알보시딥, 암바존, 암보마이신, 아메탄트론, 아미노글루테티마이드, 암사크린, 아낙시론, 안시타빈, 안트라마이신, 아파지쿠온, 아기메스나, 아스퍼린, 아트리머스틴, 아자시티딘, 아제테파, 아조토마이신, 바녹산트론, 바타불린, 바티마스타트, 베낙시빈, 벤다머스틴, 벤조데파, 비칼루타마이드, 비에타세르핀, 비리코다, 비산트렌, 비스나피드 디메실레이트, 비제레신, 보르테조밉, 브레퀴나, 브로피리민, 부도티탄, 칵티노마이신, 카너티닙, 카라세마이드, 카베티머, 카보쿠온, 카모퍼, 카루비신, 카젤레신, 세데핑골, 세마도틴, 클로람부실, 시오테로넬, 시로레마이신, 클란페너, 클로파라빈, 크리스나톨, 데시타빈, 덱스니굴디핀, 덱소마플라틴, 데자구아닌, 디아지쿠온, 디브로스피듐, 디에노제스트, 디날린, 디서몰라이드, 도페퀴다, 독시플루리딘, 드롤록시펜, 두아조마이신, 에코머스틴, 에다트렉세이트, 에도테카린, 에플로미틴, 엘라크리다, 엘리나피드, 엘사미트루신, 에미테퍼, 엔로플라틴, 엔프로메이트, 엔자스타우린, 에피프로피딘, 엡탈로프로스트, 에불로졸, 에소루비신, 에타니다졸, 에토글루시드, 에토프린, 엑시설린드, 파드로졸, 파자라빈, 펜레티니드, 플루옥시메스테론, 플루오로시타빈, 포스퀴돈, 포스트리신, 포트레타민, 갈라루비신, 갈로시타빈, 게로퀴놀, 기마테칸, 기메라실, 글록사존, 글루포스파미드, 일모포신, 일로마스타트, 이멕손, 임프로설판, 인디설람, 인프로쿠온, 인터루킨, 인터루킨-2, 재조합 인터루킨, 인토플리신, 요오벤구안, 이프로플라틴, 이소글라딘, 익사베필론, 케토트렉세이트, L-알라노신, 란레오티드, 라파티닙, 레독산트론, 루프롤리드, 루프로렐린, 렉사칼시톨, 리아로졸, 로바플라틴, 로메트렉솔, 로나파닙, 로속산트론, 루토테칸, 마포스파미드, 만노설판, 마리마스타트, 마소프로콜, 마이탄신, 메클로레타민, 멜렌게스트롤, 멜팔란, 메노가릴, 메피티오스탄, 메테신드, 메토미데이트, 메토프린, 메투레데파, 미보플라틴, 미프록시펜, 미소니다졸, 미틴도마이드, 미토카신, 미토크로민, 미토플락손, 미토길린, 미토구아존, 미토말신, 미토나파이드, 미노퀴돈, 미토스퍼, 미토졸로마이드, 미보불린, 미조리빈, 모파로텐, 모피다몰, 무브리티닙, 마이코페놀산, 네다플라틴, 넬자라빈, 네모루비신, 니트라크린, 노코다졸, 노갈라마이신, 놀라트렉세드, 노토픽산트론, 오마플라틴, 오타탁셀, 오터라실, 옥시서란, 옥소페나신, 파투빌론, 펠데신, 펠리오마이신, 펠리트렉솔, 페메트렉세드, 펜타머스틴, 페플로마이신, 퍼포스파마이드, 페리포신, 피코플라틴, 피나파이드, 피포설판, 퍼페니돈, 피록산트론, 픽산트론, 플레비트렉세드, 플로메스탄, 포피로마이신, 프레드니머스틴, 프로파미딘, 프로스피듐, 푸미테파, 퓨로마이신, 피라조퓨린, 라니머스틴, 리보프린, 리트로설판, 로글레티마이드, 로퀴니멕스, 루포크로모마이신, 사바루비신, 사핑골, 사트라플라틴, 세브리플라틴, 세머스틴, 심트라젠, 시조피란, 소부족산, 소라페닙, 스파포세이트, 스파포스산, 스파소마이신, 스피로게르마늄, 스피로머스틴, 스피로플라틴, 스쿠알라민, 스트렙토니그린, 스트렙토바리신, 서포스파마이드, 설로페너, 타세디날린, 탈리소마이신, 탈리머스틴, 타리퀴다, 타우로머스틴, 테코갈란, 테가퍼, 텔록산트론, 테모포핀, 테록시론, 티아미프린(Thiamiprine), 티아미프린(Tiamiprine), 티아조푸린, 틸로미솔, 틸로론, 팀코다, 티모나식, 티라파자민, 토픽산트론, 트라벡테딘, 엑테인아시딘 743, 트레스톨론, 트리시리빈, 트릴로스탄, 트리메트렉세이트, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트립토렐린, 트로포스파마이드, 투불로졸, 우베니멕스, 우레데파, 발스포다, 바프레오타이드, 버테포핀, 빈블라스틴, 빈데신, 비네피딘, 빈플루닌, 빈포마이드, 빈글리시네이트, 빈루시놀, 빈루로신, 빈로시딘, 빈트립톨, 빈졸리딘, 보로졸, 크산토마이신 A, 구아메사이클린, 제니플라틴, 질라스콥 [2-H], 지노스타틴, 조루비신, 조수퀴다, 아세타졸아미드, 아시클로버, 아디피오돈, 알라트로플록사신, 알펜타닐, 알레르기성 추출물, 알파 1-프로테이나제 억제제, 알프로스타딜, 아미카신, 아미노산, 아미노카프로산, 아미노필린, 아미트립틸린, 아모바비탈, 암리논, 소아마비 예방 백신, 항광견병 혈청, 항파상풍 면역글로불린, 파상풍 백신, 항트롬빈 III, 해독 혈청, 아르가트로반, 아르기닌, 아테놀롤, 아트라쿠륨, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 아즈트레오남, 바시트라신, 바클로펜, 바실릭시맙, 벤즈트로핀, 베타메타손, 비오틴, 비발리루딘, 보툴리누스 중독증 항독소, 브레틸륨, 부메타나이드, 부프레노르핀, 부토르파놀, 칼시토닌, 칼시트리올, 카프레오마이신, 카보프로스트, 카르니틴, 세파만돌, 세포페라존, 세포탁심, 세폭시틴, 세프티족심, 세푸록심, 클로람페니콜, 클로로프로카인, 클로로퀸, 클로로티아지드, 클로프로마진, 콘드로이틴황산, 코리오고나도트로핀 알파, 크로뮴, 시도포버, 시메티딘, 시프로플록사신, 시사트라쿠륨, 클로니딘, 코데인, 콜키신, 콜리스틴, 콜라겐, 코르티코렐린 양 트리플루테이트, 코르티코트로핀, 코신트로핀, 시아노코발라민, 사이클로스포린, 시스테인, 다클릭시맙, 달포프리스틴, 달테파린, 다나파로이드, 단트롤렌, 데페록사민, 데스모프레신, 덱사메타손, 덱스메데토미딘, 덱스판테놀, 덱스트란, 철 덱스트란, 디아트리조산, 디아제팜, 디아족시드, 디시클로민, 디기빈드, 디곡신, 디히드로에르고타민, 딜티아젬, 디펜히드라민, 디피리다몰, 도부타민, 도파민, 독사쿠륨, 독사프람, 독서칼시페롤, 독시사이클린, 드로페리돌, 디필린, 에데트산, 에드로포늄, 에날라프릴랏, 에페드린, 에포프로스테놀, 에르고칼시페롤, 에르고노빈, 에르타페넴, 에리스로마이신, 에스몰롤, 에스트라디올, 에스트로제닉, 에타크린산, 에티오디제드 오일, 에티드론산, 에토미데이트, 파모티딘, 페놀도팜, 펜타닐, 플루마제닐, 플루오레세인, 플루페나진, 폴산, 포메피졸, 포미비르센, 폰다파리눅스, 포스카르넷, 포스페니토인, 푸로세마이드, 가도테리돌, 가도베르세타마이드, 간시클로버, 젠타미신, 글루카곤, 글리코피롤레이트, 고나도렐린, 고나도트로핀 코리오닉, 헤모필러스 B 다당류, 헤민, 허브(Herbal), 히스타민, 히드랄라진, 히드로코르티손, 히드로모르폰, 히드록소코발라민, 히드록시진, 히오스시아민, 이부틸리드, 이미글루세라제, 인디고 카르민, 인도메타신, 요오다이드, 이오프로마이드, 이오탈람산, 이옥사글리산, 이옥실란, 이소니아지드, 이소프로테레놀, 일본 뇌염 백신, 카나마이신, 케타민, 라베탈롤, 레피루딘, 레보부피바카인, 레보티록신, 린코마이신, 리오티로닌, 황체 형성 호르몬, 라임병 백신, 만가포디퍼, 만니톨, 수막염균 다당류 백신, 메페리딘, 메피바카인, 메소리다진, 메타라미놀, 메타돈, 메토카르바몰, 메토헥시탈, 메틸도페이트, 메틸에르고노빈, 메토클로프라미드, 메토프롤롤, 메트로니다졸, 미노사이클린, 미바쿠륨, 모루산(Morrhuic acid), 목시플록사신, 무로모납-CD3, 미코페놀레이트 모페틸, 나프실린, 날부핀, 날메펜, 날록손, 네오스티그민, 니아신아미드, 니카르디핀, 니트로글리세린, 니트로프루시드, 노르에피네프린, 오르페나드린, 옥사실린, 옥시모르폰, 옥시테트라사이클린, 옥시토신, 판쿠로늄, 판테놀, 판토텐산, 파파베린, Peg-인터페론 알파 2A, 페니실린 G, 펜타미딘, 펜타조신, 펜토바비탈, 퍼플루트렌, 퍼페나진, 페노바비탈, 펜톨아민, 페닐에프린, 페니토인, 피소스티그민, 피토나디온, 폴리믹신 b, 프랄리독심, 프릴로카인, 프로카인아미드, 프로클로르페라진, 프로게스테론, 프로프라놀롤, 피리도스티그민 수산화물, 피리독신, 퀴니딘, 퀴누프리스틴, 광견병 면역글로불린, 광견병 백신, 라니티딘, 레미펜타닐, 리보플라빈, 리팜핀, 로피바카인, 사마륨, 스코폴라민, 셀레늄, 세르모렐린, 신칼리드, 소마트렘, 스펙티노마이신, 스트렙토키나제, 스트렙토마이신, 숙시닐콜린, 수펜타닐, 술파메톡사졸, 타크롤리머스, 테르부탈린, 테리파라티드, 테스토스테론, 파상풍 항독소, 테트라카인, 테트라데실 설페이트, 테오필린, 티아민, 티에틸페라진, 티오펜탈, 갑상선 자극 호르몬, 틴자파린, 티로피반, 토브라마이신, 톨라졸린, 톨부타마이드, 토르세마이드, 트라넥삼산, 트레프로스티닐, 트리플루오페라진, 트리메토벤자미드, 트리메토프림, 트로메타민, 튜버쿨린, 장티푸스 백신, 유로폴리트로핀, 유로키나제, 발프로산, 바소프레신, 베큐로늄, 베라파밀, 보리코나졸, 와파린, 황열병 백신, 지도부딘, 지프라시돈 염산염, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아드리아마이신, 아자세린, 6-아자우리딘, 카지노필린, 크로모마이신, 데노프테린, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 에노시타빈, 록수리딘, 올리보마이신, 피라루비신, 피리트렉심, 프테로프테린, 타가퍼, 튜버시딘, 알테플라제, 아시투모맙, 베바시주맙, 보툴리늄 독소 A형, 보툴리늄 독소 B형, 카프로맙 펜데타이드, 다클리주맙, 도나세 알파, 드로트레코긴 알파, 임시로맙 펜테테이트 및 요오드-131, 페피루비신, 아미노글리코시드, 암페니콜, 안사마이신, 카바세펨, 카바페넴, 세팔로스포린 또는 세펨, 세파마이신, 클라밤, 환형 리포펩티드, 디아미노피리미딘, 케톨라이드, 린코사마이드, 매크롤라이드, 모노박탐, 니트로푸란, 옥사세펨, 옥사졸리디논, 페넴, 티에나마이신 및 기타 베타락탐, 페니실린, 퀴놀론, 술폰아미드, 술폰, 테트라사이클린, 클로폭톨, 후시드산, 헥세딘, 메테나민, 니트로푸란토인, 니트록솔린, 리티페넴, 타우롤리딘, 심보몰, 항생제, 혈관신생 억제제, 백내장 및 당뇨병성 망막증 예방 물질, 산동제, 광역학 치료제, 프로스타글란딘 유사체, 항신생물제, 대사길항제, 항바이러스제, 살아메바제 및 항원충제, 항결핵제 및 항나병제, 항독소 및 항사독소; 알클로메타손, 알게스톤, 베클로메타손, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자코르트, 데소니드, 데속시메타손, 디플루오로손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오메톨론, 플루페롤론, 플루프레드니덴, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀리드, 플루티카손, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로베타솔, 할로메타손, 할로프레돈, 히드로코르타메이트, 로테프레드놀 에타보네이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 리멕솔론 및 틱소코르톨 중에서 선택되는 스테로이드성 항염증 약물; 듀코사노이드, 프로스타글란딘 유사체, 항프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 전구체, 콜린성 제제 및 항콜린에스테라제, 항알레르기제, 및 제제들의 조합 중에서 선택되는 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제
    를 포함하는,
    약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제의 전달 증가용 조합물.
  45. 삭제
  46. 제44항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 인터페론 베타, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 컨센서스, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마-1b, Peg-인터페론 알파-2 및 Peg-인터페론 알파-2b 중에서 선택되는 것인 조합물.
  47. 제44항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 파미드로네이트 또는 졸레드로네이트인 조합물.
  48. 제44항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 인슐린 리스프로, 75% 중성 프로타민 리스프로(NPL)/25% 인슐린 리스프로, 50% 중성 프로타민 하게돈(NPH)/50% 레귤러 인슐린; 70% NPH/30% 레귤러 인슐린; 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 울트라 인슐린 및 울트라렌테 인슐린, 및 인슐린 글라긴 중에서 선택되는 인슐린인 조합물.
  49. 제44항에 있어서, 상기 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제가 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 트라스투주맙 및 베바시주맙 중에서 선택되는 것인 조합물.
  50. a) 서열 번호 1의 아미노산 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 개시된 아미노산 서열로 이루어진 가용성 중성 활성 인간 히알루로니다제(sHASEGP) 폴리펩티드; 및
    b) 항혈우병 인자, 항억제제 응고 복합체, 안티트롬빈 III, 응고 인자 V, 응고 인자 IX, 혈장 단백질 분획, 폰 빌레브란트 인자; 항혈소판제; 콜로니 자극 인자(CSF); 적혈구 생성 자극제; 지혈제 및 알부민; 및 트롬빈 억제제 중에서 선택되는 혈액 조절제
    를 포함하는,
    혈액 조절제의 전달 증가용 조합물.
  51. 삭제
  52. a) 제20항의 PEG화된 히알루로니다제 폴리펩티드; 및
    b) 치료 제제 또는 화장 제제인 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제
    를 포함하는,
    약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제의 전달 증가용 조합물.
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  58. 제52항에 있어서, 상기 히알루로니다제 폴리펩티드가 CHO 세포로부터 발현되어 분비되는 것인 조합물.
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  60. 제44항, 제50항, 또는 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루로니다제 폴리펩티드가 서열 번호 1의 아미노산 36-482에 개시된 아미노산 서열을 가지는 것인 조합물.
  61. 제44항 또는 제50항에 있어서, 상기 히알루로니다제 폴리펩티드가 중합체에 의해 변형된 것인 조합물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 중합체가 PEG 또는 덱스트란인 조합물.
  63. 제44항, 제50항 또는 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 조성물 또는 별개의 조성물로서 제공되는 것인 조합물.
  64. 제52항에 있어서, 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제는 화학요법제, 진통제, 항염증제, 항균제, 살아메바제, 살트리코모나스제, 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관절염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린 작용제, 알파 차단제, 마취제, 기관지 확장제, 살생물제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심혈관 약제, 피임제, 충혈 완화제, 이뇨제, 진정제, 진단제, 전해질제, 최면제, 호르몬제, 고혈당제, 근육 이완제, 근육 수축제, 안과 제제, 부교감신경 흥분제, 정신 자극제, 진정제, 수면 유도제, 교감신경 흥분제, 신경안정제, 비뇨기 제제, 질 제제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드성 항염증제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 항체, 인슐린, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 약물 및 유기 분자 중에서 선택되는 것인 조합물.
  65. 제52항에 있어서, 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제는 아달리무맙, 아갈시다제 베타, 알레파셉트, 암피실린, 아나킨라, 소아마비 예방 백신, 항흉선세포, 아지스로마이신, 베카플러민, 카스포펑긴, 세파졸린, 세페핌, 세포테탄, 세프타지딤, 세프트리악손, 세툭시맙, 실라스타틴, 클라불란산, 클린다마이신, 다베포에틴 알파, 데아클리주맙, 디프테리아, 디프테리아 항독소, 디프테리아 변성 독소, 에팔리주맙, 에피네프린, 에리스로포이에틴 알파, 에타너셉트, 필그라스팀, 플루코나졸, 여포 자극 호르몬, 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 포스페닐로인, 가도디아미드, 가도펜테테이트, 가티플록사신, 글라티라머, GM-CSF, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 그라니세트론, 헤모필러스 인플루엔자 B, 할로페리돌, 간염 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, 이브리투모맙 티욱세탄, 이브리투모맙, 티욱세탄, 면역글로불린, 헤모필러스 인플루엔자 백신, 인플루엔자 바이러스 백신, 인플릭시맙, 인슐린 리스프로, 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 울트라 인슐린, 울트라렌테 인슐린, 및 인슐린 글라긴, 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파 콘센서스, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마, 요오딕사놀, 요오헥솔, 요오파미돌, 요오버솔, 케토로락, 라로니다제, 레보플록사신, 리도케인, 리네졸리드, 로라제팜, 홍역 백신, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역-볼거리-풍진 바이러스 백신, 풍진 백신, 메드록시프로게스테론, 메로페넴, 메틸프레드니솔론, 미다졸람, 모르핀, 옥트레오타이드, 오말리주맙, 온단세트론, 팔리비주맙, 판토프라졸, 페가스파가제, 페그필그라스팀, Peg-인터페론 알파-2a, Peg-인터페론 알파-2b, 페그비소만트, 백일해 백신, 피페라실린, 폐렴구균 백신 및 폐렴구균 접합 백신, 프로메타진, 레테플라제, 소마트로핀, 술박탐, 수마트립탄, 타조박탐, 테넥테플라제, 파상풍 정제 변성 독소, 티카실린, 토시투모맙, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 반코마이신, 수두 포진 면역글로불린, 수두 백신, 기타 백신, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 비소, 삼산화비소, 아스파라기나제, 칼메트 게랑 간균(BCG) 백신, 생 BCG, 벡사로텐, 블레오마이신, 부설판, 정맥 부설판, 경구 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 폴리페프로산과 병용되는 카무스틴, 셀레콕시브, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시타라빈 리포솜, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신 리포솜, 다우노루비신, 다우노마이신, 데닐루킨 디프티톡스, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 엘리엇 B 용액, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 에토포사이드 VP-16, 엑세메스탄, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-플루오로우라실, 풀베스트란트, 젬시타빈, 젬투주맙, 오조가미신, 젬투주맙 오조가미신, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 이리노테칸, 레트로졸, 루코보린, 레바미솔, 로머스틴, CCNU, 메클로레타민, 질소 머스터드, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, L-PAM, 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신, 미토마이신 C, 미토테인, 미톡산트론, 난드롤론, 난드롤론 펜프로피오네이트, 노페투모맙, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 미트라마이신, 포피머, 포피머 소듐, 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 리툭시맙, 사그라모스팀, 스트렙토조신, 탈크, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 6-티오구아닌, 트리에틸렌티오포스포라미드(티오테파), 토포테칸, 토레미펜, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스터드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 졸레드로네이트, 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로닌, 아도젤레신, 알데스루킨, 레티노산, 알리트레티노인, 9-시스-레티노산, 알보시딥, 암바존, 암보마이신, 아메탄트론, 아미노글루테티마이드, 암사크린, 아낙시론, 안시타빈, 안트라마이신, 아파지쿠온, 아기메스나, 아스퍼린, 아트리머스틴, 아자시티딘, 아제테파, 아조토마이신, 바녹산트론, 바타불린, 바티마스타트, 베낙시빈, 벤다머스틴, 벤조데파, 비칼루타마이드, 비에타세르핀, 비리코다, 비산트렌, 비스나피드 디메실레이트, 비제레신, 보르테조밉, 브레퀴나, 브로피리민, 부도티탄, 칵티노마이신, 카너티닙, 카라세마이드, 카베티머, 카보쿠온, 카모퍼, 카루비신, 카젤레신, 세데핑골, 세마도틴, 클로람부실, 시오테로넬, 시로레마이신, 클란페너, 클로파라빈, 크리스나톨, 데시타빈, 덱스니굴디핀, 덱소마플라틴, 데자구아닌, 디아지쿠온, 디브로스피듐, 디에노제스트, 디날린, 디서몰라이드, 도페퀴다, 독시플루리딘, 드롤록시펜, 두아조마이신, 에코머스틴, 에다트렉세이트, 에도테카린, 에플로미틴, 엘라크리다, 엘리나피드, 엘사미트루신, 에미테퍼, 엔로플라틴, 엔프로메이트, 엔자스타우린, 에피프로피딘, 엡탈로프로스트, 에불로졸, 에소루비신, 에타니다졸, 에토글루시드, 에토프린, 엑시설린드, 파드로졸, 파자라빈, 펜레티니드, 플루옥시메스테론, 플루오로시타빈, 포스퀴돈, 포스트리신, 포트레타민, 갈라루비신, 갈로시타빈, 게로퀴놀, 기마테칸, 기메라실, 글록사존, 글루포스파미드, 일모포신, 일로마스타트, 이멕손, 임프로설판, 인디설람, 인프로쿠온, 인터루킨, 인터루킨-2, 재조합 인터루킨, 인토플리신, 요오벤구안, 이프로플라틴, 이소글라딘, 익사베필론, 케토트렉세이트, L-알라노신, 란레오티드, 라파티닙, 레독산트론, 루프롤리드, 루프로렐린, 렉사칼시톨, 리아로졸, 로바플라틴, 로메트렉솔, 로나파닙, 로속산트론, 루토테칸, 마포스파미드, 만노설판, 마리마스타트, 마소프로콜, 마이탄신, 메클로레타민, 멜렌게스트롤, 멜팔란, 메노가릴, 메피티오스탄, 메테신드, 메토미데이트, 메토프린, 메투레데파, 미보플라틴, 미프록시펜, 미소니다졸, 미틴도마이드, 미토카신, 미토크로민, 미토플락손, 미토길린, 미토구아존, 미토말신, 미토나파이드, 미노퀴돈, 미토스퍼, 미토졸로마이드, 미보불린, 미조리빈, 모파로텐, 모피다몰, 무브리티닙, 마이코페놀산, 네다플라틴, 넬자라빈, 네모루비신, 니트라크린, 노코다졸, 노갈라마이신, 놀라트렉세드, 노토픽산트론, 오마플라틴, 오타탁셀, 오터라실, 옥시서란, 옥소페나신, 파투빌론, 펠데신, 펠리오마이신, 펠리트렉솔, 페메트렉세드, 펜타머스틴, 페플로마이신, 퍼포스파마이드, 페리포신, 피코플라틴, 피나파이드, 피포설판, 퍼페니돈, 피록산트론, 픽산트론, 플레비트렉세드, 플로메스탄, 포피로마이신, 프레드니머스틴, 프로파미딘, 프로스피듐, 푸미테파, 퓨로마이신, 피라조퓨린, 라니머스틴, 리보프린, 리트로설판, 로글레티마이드, 로퀴니멕스, 루포크로모마이신, 사바루비신, 사핑골, 사트라플라틴, 세브리플라틴, 세머스틴, 심트라젠, 시조피란, 소부족산, 소라페닙, 스파포세이트, 스파포스산, 스파소마이신, 스피로게르마늄, 스피로머스틴, 스피로플라틴, 스쿠알라민, 스트렙토니그린, 스트렙토바리신, 서포스파마이드, 설로페너, 타세디날린, 탈리소마이신, 탈리머스틴, 타리퀴다, 타우로머스틴, 테코갈란, 테가퍼, 텔록산트론, 테모포핀, 테록시론, 티아미프린(Thiamiprine), 티아미프린(Tiamiprine), 티아조푸린, 틸로미솔, 틸로론, 팀코다, 티모나식, 티라파자민, 토픽산트론, 트라벡테딘, 엑테인아시딘 743, 트레스톨론, 트리시리빈, 트릴로스탄, 트리메트렉세이트, 트리플라틴 테트라니트레이트, 트립토렐린, 트로포스파마이드, 투불로졸, 우베니멕스, 우레데파, 발스포다, 바프레오타이드, 버테포핀, 빈블라스틴, 빈데신, 비네피딘, 빈플루닌, 빈포마이드, 빈글리시네이트, 빈루시놀, 빈루로신, 빈로시딘, 빈트립톨, 빈졸리딘, 보로졸, 크산토마이신 A, 구아메사이클린, 제니플라틴, 질라스콥 [2-H], 지노스타틴, 조루비신, 조수퀴다, 아세타졸아미드, 아시클로버, 아디피오돈, 알라트로플록사신, 알펜타닐, 알레르기성 추출물, 알파 1-프로테이나제 억제제, 알프로스타딜, 아미카신, 아미노산, 아미노카프로산, 아미노필린, 아미트립틸린, 아모바비탈, 암리논, 진통제, 소아마비 예방 백신, 항광견병 혈청, 항파상풍 면역글로불린, 파상풍 백신, 항트롬빈 III, 해독 혈청, 아르가트로반, 아르기닌, 아스코르브산, 아테놀롤, 아트라쿠륨, 아트로핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 아즈트레오남, 바시트라신, 바클로펜, 바실릭시맙, 벤조산, 벤즈트로핀, 베타메타손, 비오틴, 비발리루딘, 보툴리누스 중독증 항독소, 브레틸륨, 부메타나이드, 부피바카인, 부프레노르핀, 부토르파놀, 칼시토닌, 칼시트리올, 칼슘, 카프레오마이신, 카보프로스트, 카르니틴, 세파만돌, 세포페라존, 세포탁심, 세폭시틴, 세프티족심, 세푸록심, 클로람페니콜, 클로로프로카인, 클로로퀸, 클로로티아지드, 클로프로마진, 콘드로이틴황산, 코리오고나도트로핀 알파, 크로뮴, 시도포버, 시메티딘, 시프로플록사신, 시사트라쿠륨, 클로니딘, 코데인, 콜키신, 콜리스틴, 콜라겐, 코르티코렐린 양 트리플루테이트, 코르티코트로핀, 코신트로핀, 시아노코발라민, 사이클로스포린, 시스테인, 다클릭시맙, 달포프리스틴, 달테파린, 다나파로이드, 단트롤렌, 데페록사민, 데스모프레신, 덱사메타손, 덱스메데토미딘, 덱스판테놀, 덱스트란, 철 덱스트란, 디아트리조산, 디아제팜, 디아족시드, 디시클로민, 디기빈드, 디곡신, 디히드로에르고타민, 딜티아젬, 디펜히드라민, 디피리다몰, 도부타민, 도파민, 독사쿠륨, 독사프람, 독서칼시페롤, 독시사이클린, 드로페리돌, 디필린, 에데트산, 에드로포늄, 에날라프릴랏, 에페드린, 에포프로스테놀, 에르고칼시페롤, 에르고노빈, 에르타페넴, 에리스로마이신, 에스몰롤, 에스트라디올, 에스트로제닉, 에타크린산, 에탄올아민, 에탄올, 에티오디제드 오일, 에티드론산, 에토미데이트, 인자 VIII, 파모티딘, 페놀도팜, 펜타닐, 플루마제닐, 플루오레세인, 플루페나진, 폴산, 포메피졸, 포미비르센, 폰다파리눅스, 포스카르넷, 포스페니토인, 푸로세마이드, 가도테리돌, 가도베르세타마이드, 간시클로버, 젠타미신, 글루카곤, 글루코스, 글리신, 글리코피롤레이트, 고나도렐린, 고나도트로핀 코리오닉, 헤모필러스 B 다당류, 헤민, 허브(Herbal), 히스타민, 히드랄라진, 히드로코르티손, 히드로모르폰, 히드록소코발라민, 히드록시진, 히오스시아민, 이부틸리드, 이미글루세라제, 인디고 카르민, 인도메타신, 요오다이드, 이오프로마이드, 이오탈람산, 이옥사글리산, 이옥실란, 이소니아지드, 이소프로테레놀, 일본 뇌염 백신, 카나마이신, 케타민, 라베탈롤, 레피루딘, 레보부피바카인, 레보티록신, 린코마이신, 리오티로닌, 황체 형성 호르몬, 라임병 백신, 만가포디퍼, 만니톨, 수막염균 다당류 백신, 메페리딘, 메피바카인, 메소리다진, 메타라미놀, 메타돈, 메토카르바몰, 메토헥시탈, 메틸도페이트, 메틸에르고노빈, 메토클로프라미드, 메토프롤롤, 메트로니다졸, 미노사이클린, 미바쿠륨, 모루산(Morrhuic acid), 목시플록사신, 무로모납-CD3, 미코페놀레이트 모페틸, 나프실린, 날부핀, 날메펜, 날록손, 네오스티그민, 니아신아미드, 니카르디핀, 니트로글리세린, 니트로프루시드, 노르에피네프린, 오르페나드린, 옥사실린, 옥시모르폰, 옥시테트라사이클린, 옥시토신, 판쿠로늄, 판테놀, 판토텐산, 파파베린, Peg-인터페론 알파 2A, 페니실린 G, 펜타미딘, 펜타조신, 펜토바비탈, 퍼플루트렌, 퍼페나진, 페노바비탈, 펜톨아민, 페닐에프린, 페니토인, 피소스티그민, 피토나디온, 폴리믹신 b, 프랄리독심, 프릴로카인, 프로카인아미드, 프로카인, 프로클로르페라진, 프로게스테론, 프로프라놀롤, 피리도스티그민 수산화물, 피리독신, 퀴니딘, 퀴누프리스틴, 광견병 면역글로불린, 광견병 백신, 라니티딘, 레미펜타닐, 리보플라빈, 리팜핀, 로피바카인, 사마륨, 스코폴라민, 셀레늄, 세르모렐린, 신칼리드, 소마트렘, 스펙티노마이신, 스트렙토키나제, 스트렙토마이신, 숙시닐콜린, 수펜타닐, 술파메톡사졸, 타크롤리머스, 테르부탈린, 테리파라티드, 테스토스테론, 파상풍 항독소, 테트라카인, 테트라데실 설페이트, 테오필린, 티아민, 티에틸페라진, 티오펜탈, 갑상선 자극 호르몬, 틴자파린, 티로피반, 토브라마이신, 톨라졸린, 톨부타마이드, 토르세마이드, 트라넥삼산, 트레프로스티닐, 트리플루오페라진, 트리메토벤자미드, 트리메토프림, 트로메타민, 튜버쿨린, 장티푸스 백신, 유로폴리트로핀, 유로키나제, 발프로산, 바소프레신, 베큐로늄, 베라파밀, 보리코나졸, 와파린, 황열병 백신, 지도부딘, 아연, 지프라시돈 염산염, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아드리아마이신, 아자세린, 6-아자우리딘, 카지노필린, 크로모마이신, 데노프테린, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 에노시타빈, 록수리딘, 올리보마이신, 피라루비신, 피리트렉심, 프테로프테린, 타가퍼, 튜버시딘, 알테플라제, 아시투모맙, 베바시주맙, 보툴리늄 독소 A형, 보툴리늄 독소 B형, 카프로맙 펜데타이드, 다클리주맙, 도나세 알파, 드로트레코긴 알파, 임시로맙 펜테테이트, 요오드-131, 아드리아마이신, 안시타빈, 안트라마이신, 아자시티딘, 비산트렌, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카모퍼, 카머스틴, 카루비신, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이타라빈, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독시플루리딘, 독소루비신, 에다트렉세이트, 에미테퍼, 페피루비신, 플루다라빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이다루비신, 록수리딘, 메노가릴, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 페플로마이신, 플리카마이신, 포피로마이신, 퓨로마이신, 레티노산, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 타가퍼, 타목시펜, 티아미프린, 티오구아닌, 트리암시놀론, 트리메트렉세이트, 튜버시디딘, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 지노스타틴 및 조루비신, 아미노글리코시드, 암페니콜, 안사마이신, 카바세펨, 카바페넴, 세팔로스포린 또는 세펨, 세파마이신, 클라밤, 환형 리포펩티드, 디아미노피리미딘, 케톨라이드, 린코사마이드, 매크롤라이드, 모노박탐, 니트로푸란, 옥사세펨, 옥사졸리디논, 페넴, 티에나마이신 및 기타 베타락탐, 페니실린, 퀴놀론, 술폰아미드, 술폰, 테트라사이클린, 클로폭톨, 후시드산, 헥세딘, 메테나민, 니트로푸란토인, 니트록솔린, 리티페넴, 타우롤리딘, 심보몰, 항생제, 혈관신생 억제제, 백내장 및 당뇨병성 망막증 예방 물질, 탄산탈수소 효소 억제제, 산동제, 광역학 치료제, 프로스타글란딘 유사체, 성장 인자, 항신생물제, 대사길항제, 항바이러스제, 살아메바제 및 항원충제, 항결핵제 및 항나병제, 항독소 및 항사독소; 스테로이드성 항염증 약물; 듀코사노이드, 프로스타글란딘, 프로스타글란딘 유사체, 항프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 전구체, 유사분열제, 콜린성 제제 및 항콜린에스테라제, 항알레르기제, 및 제제들의 조합 중에서 선택되는 것인 조합물.
  66. 제65항에 있어서, 약리학적 또는 약학적으로 유효한 제제는 알클로메타손, 알게스톤, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로베타솔, 클로베타손, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자코르트, 데소니드, 데속시메타손, 덱사메타손, 디플루오로손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시놀론, 플루오시노니드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오메톨론, 플루페롤론, 플루프레드니덴, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀리드, 플루티카손, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로베타솔, 할로메타손, 할로프레돈, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 로테프레드놀 에타보네이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 리멕솔론, 틱소코르톨 및 트리암시놀론 중에서 선택되는 스테로이드성 항염증 약물인 조합물.
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